WO2006038405A1 - 細胞の処理方法及び細胞の処理装置 - Google Patents

細胞の処理方法及び細胞の処理装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2006038405A1
WO2006038405A1 PCT/JP2005/016206 JP2005016206W WO2006038405A1 WO 2006038405 A1 WO2006038405 A1 WO 2006038405A1 JP 2005016206 W JP2005016206 W JP 2005016206W WO 2006038405 A1 WO2006038405 A1 WO 2006038405A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
magnetic field
specific
container
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/016206
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Onodera
Satoru Kon
Susumu Chida
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Publication of WO2006038405A1 publication Critical patent/WO2006038405A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/06—Magnetic means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Definitions

  • the present invention relates to a cell processing method and a cell processing apparatus for processing a cell by applying a magnetic field to a cell group in which different types of cells are mixed.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-49105
  • a magnetic bead Ba having an antibody capable of specifically binding to an antigen of this target cell on a target cell Sa such as a cancer cell in a cell group in which different types of cells are mixed.
  • a pulse magnetic field of at least one of a single pulse and a multipulse is applied to this cell group to selectively kill the target cell Sa.
  • the principle of this death is that when magnetic beads Ba are stimulated by a pulsed magnetic field, the magnetic beads Ba move instantaneously, and the target cell Sa is pulled by the magnetic beads more strongly than Ba, and is physically crushed and killed. Being
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-49105
  • the force that kills the target cell Sa using the magnetic beads Ba is not always the target cell in such cell processing using magnetism.
  • the goal is to survive without the purpose of dying, and in that case, there was a problem that the method could not be used.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems.
  • the magnetic beads can be used not for the purpose of killing but for the purpose of survival, and by using the magnetic beads, the survival rate of specific cells can be improved. It is an object of the present invention to provide a cell processing method and a cell processing apparatus that can perform magnetic field treatment on a cell.
  • the cell processing method of the present invention uses different types of cells.
  • a method for treating cells by applying a magnetic field to a group of cells mixed with a magnetic field a magnetic bead having an antibody capable of specifically binding to the antigen of the specific cell in a specific cell of the cell group.
  • a sinusoidal fluctuating magnetic field is applied to the cell group, and the survival rate of the specific cells is increased from the survival rate of non-specific cells other than the specific cells.
  • the inventors of the present application in the condition of a variable magnetic field, in particular, in a sinusoidal variable magnetic field, bind the magnetic beads to specific cells, so that the magnetic beads are rather reversed. It was found that inactivation of specific cells was suppressed compared to cells without binding.
  • the mechanism is that in cells placed in a sinusoidal fluctuating magnetic field, the nuclear matter mainly composed of ions undergoes a magnetic force repeatedly when moving in the fluctuating magnetic field, thereby deviating from the normal division process.
  • the cell division ends abnormally and the cell dies, or the structural abnormality of the cell membrane is induced, or the DNA synthesis is disturbed.
  • the sinusoidal magnetic field is characterized by the sudden reversal of the direction of the magnetic field lines, making it difficult for the magnetic bead to follow the movement. It is thought to be caused by the suppression of these injuries to absorb (or buffer) the effects of the direct magnetic field of the cells and reduce the magnetic field damage effects on the cells. That.
  • magnetic beads are bound to specific cells other than malignant cells such as cancer cells having a relatively high division rate, and magnetic beads are not bound to non-specific cells of malignant cells.
  • a sinusoidal fluctuating magnetic field to increase the survival rate of specific cells, it becomes possible to inactivate the division ability of non-specific cells and promote death or reduction. Is expected to be used.
  • the applied magnetic field intensity is set to 0.01 ⁇ T (Tesla) ⁇ 1.
  • the frequency of the sine wave-like fluctuating magnetic field is set to 1 to 300 ⁇ . Desirably, 5 to: LOOHz. Within this range, the survival rate of specific cells is effective Can be increased.
  • the cell temperature t is set to 4 ° C ⁇ t ⁇ 37 ° C. Desirably, the cell temperature t was set to 25 ° C ⁇ t ⁇ 37 ° C.
  • the magnetic field is applied for 5 min to 240 min. In this case, if the time is shorter than 5 minutes, sufficient effects cannot be obtained. On the other hand, if the time is longer than 240 min, the effect on specific cells increases.
  • a mitotic rate promoter for accelerating the mitotic rate of the non-specific cells is added.
  • non-specific cells are activated (cell division is stimulated), and the viability of non-specific cells can be reduced more powerfully and effectively.
  • PHA phytohemagglutinin
  • ConA concanavalin A
  • lymphocyte-specific peptide lymphocyte-specific monoclonal antibody
  • galactosylceramide ceramide
  • ganglioside ganglioside
  • diacylglyceol tetradecanol phorbol acetate
  • TP ⁇ substance of lymphocyte-specific monoclonal antibodies
  • each immune cell (T cell or NK cell) is activated by a specific molecule (peptide, protein, antibody or sugar, lipid), but is hardly activated by other molecules. Therefore, by activating specific immune cells (cells) that have malfunctioned and applying a variable magnetic field (providing split growth stimulation), only abnormal immune cells can be selected without damaging normal immune cells. Therefore, it can be removed without side effects.
  • the cell processing apparatus of the present invention for solving the above-mentioned problems has an antibody capable of specifically binding to an antigen of the specific cell in a specific cell among a group of cells in which different types of cells are mixed.
  • ⁇ T (Tesla) ⁇ 1, 1 to 300 ⁇
  • the configuration includes a dynamic magnetic field generator. Thereby, a sinusoidal fluctuating magnetic field can be reliably applied to the cells.
  • variable magnetic field generation unit is disposed and rotated with a container held by the container holding unit interposed therebetween, and a rotation plate provided on each of the rotation plates by rotation.
  • a permanent magnet that generates a sinusoidal magnetic field and a motor that rotationally drives the rotating disk are provided.
  • the apparatus can be made relatively simple and not expensive, the processing can be simplified and simplified, and the versatility can be improved.
  • the survival rate of specific cells can be increased by increasing the survival rate of non-specific cells. Therefore, for example, a magnetic bead is bound to a specific cell other than a malignant cell, and a magnetic bead is not bound to a non-specific cell of a malignant cell, and a sinusoidal variable magnetic field is applied to increase the survival rate of the specific cell. In this way, it becomes possible to inactivate the ability to divide non-specific cells and promote death or reduction, and it can be expected to be applied to medical fields such as purification of blood for transfusion. .
  • FIG. 1 is a perspective view showing a cell processing apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing a configuration of a container and a container holding part in the cell processing apparatus according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows the configuration of the rotating disk of the fluctuating magnetic field generator in the cell processing apparatus according to the embodiment of the present invention, where (a) is a view in FIG. 1 and (b) is in FIG. FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between specific cells and magnetic beads.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between specific cells and magnetic beads in experimental examples.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of an experiment on the effect of magnetic beads on T cells in a sinusoidal magnetic field application environment, and showing the increase or decrease in the number of cells with the number of cells in the control group as 100%.
  • FIG. 7 is a diagram showing the relationship between target cells and magnetic beads for the purpose of conventional killing.
  • the processing apparatus can process, for example, cells in blood collected from a human body as a processed product.
  • the cells include various cancer cells such as leukemia and cells containing malignant cells such as virus-infected cells.
  • the processing apparatus K includes a container 1 that stores a processed product including a cell group in which different types of cells to be processed are mixed.
  • a container 1 that stores a processed product including a cell group in which different types of cells to be processed are mixed.
  • a test tubular resin body 2 having a lid 3 integrally provided with a resin hinge 4 is used as the container 1, for example, as shown in FIG. 2, a test tubular resin body 2 having a lid 3 integrally provided with a resin hinge 4 is used.
  • a magnetic bead B having an antibody capable of specifically binding is bound to an antigen of a specific cell S in a cell group.
  • the magnetic beads B appropriate ones are used depending on the specific cells.
  • the container 1 is held by a container holding unit 10 made of resin.
  • the container holding unit 10 includes a base 11 that is detachably fixed to the machine base 5 with screw means 14 (FIG. 1), and a base 11 that is erected and holds the container 1
  • a plurality of recesses 12 are provided on a predetermined circumference (four in the embodiment), and the holding plate 13 is detachably attached to both sides of the holding plate 13 with clips 15 or the like and fitted into the recesses 12.
  • a pair of presser plates 16 that prevent the container 1 from falling off.
  • a recess 17 is formed in which one end through which a rotating shaft 22 of a variable magnetic field generating unit 20 described later is inserted is opened.
  • the machine base 5 is provided with a variable magnetic field generation unit 20.
  • Fluctuating magnetic field generator 20 has a magnetic field strength of 0.01 ⁇ T (Tesla) ⁇ 1 in the processed material in container 1 held in container holder 10, and 0.5 ⁇ ⁇ , 1 to 300 ⁇ in the embodiment. Then, a 50Hz sinusoidal fluctuation magnetic field is applied.
  • variable magnetic field generation unit 20 includes a pair of rotating disks 21A and 21B that are disposed and rotated with the container 1 held by the container holding unit 10 interposed therebetween.
  • the turntables 21A and 21B are supported by one rotary shaft 22. Both ends of the rotating shaft 22 are rotatably supported by bearing stands 23 and 24.
  • each rotating disk 21A, 21B generates a sinusoidal fluctuating magnetic field by rotation.
  • a permanent magnet 25 is provided.
  • the magnetic poles are alternately varied at an equiangular relationship on the circumference corresponding to the circumference where the concave portion 12 is provided on the side facing the container holding portion 10 of one of the turntables 21A.
  • Six permanent magnets 25 are provided.
  • the magnetic poles are alternately different at an equiangular relationship on the circumference corresponding to the circumference where the concave portion 12 is provided, and the one rotating plate 21A
  • the six permanent magnets 25 are provided in a positional relationship that is one phase shifted from the permanent magnet 25. That is, six pairs of permanent magnets 25 having different magnetic poles are alternately arranged across the holding plate 13.
  • One bearing stand 24 is provided with a motor 26 that rotationally drives the rotary shafts 22 of the rotary disks 21A and 21B.
  • the number of rotations of the motor 26 is 1000 RPM, so that a 50 Hz sinusoidal magnetic field can be applied.
  • the processing apparatus K is placed in a thermostatic bath (not shown) that keeps the temperature in the container 1 within a certain range.
  • the container 1 is held by the container holding unit 10 by the processing device K, and the holding plate 13 of the container holding unit 10 is positioned between the rotary plates 21A and 21B of the variable magnetic field generating unit 20, and 5 min to 240 min.
  • a sinusoidal fluctuating magnetic field is applied. In the embodiment, for example, it is set to 120 min.
  • the speed of division is relatively high, and the magnetic beads B are applied to specific cells S other than malignant cells such as cancer cells.
  • the magnetic beads B are not bound to non-specific cells of malignant cells. That is, as shown in FIG. 4, the magnetic beads B having an antibody capable of specifically binding to the antigen of the specific cell S are bound in advance. Then place the cell population in Container 1. Then, the container 1 is held by the container holding unit 10, the holding plate 13 of the container holding unit 10 is positioned between the rotating plates 21A and 21B of the variable magnetic field generating unit 20, the motor 26 is operated, and the magnetic field is changed for a predetermined time. Hold in.
  • a mitotic rate accelerator for accelerating the division rate of non-specific cells as necessary.
  • PHA phytohemagglutinin
  • ConA concanavalin A
  • PHA phytohemagglutinin
  • TPA tetradecanol phorbol acetate
  • each immune cell (T cell or NK cell) is activated by a specific molecule (peptide, protein, antibody or sugar, lipid), but is mostly activated by other molecules. I do not receive it. Therefore, by activating specific immune cells (cells) that have malfunctioned and applying a variable magnetic field (providing split growth stimulation), only abnormal immune cells can be selected without damaging normal immune cells. Therefore, it can be removed without side effects. Therefore, by adding this mitotic rate accelerator, cells are activated (stimulation of cell division), and abnormal cells can be removed more powerfully and effectively.
  • a specific molecule peptide, protein, antibody or sugar, lipid
  • a deactivation auxiliary agent that deactivates non-specific cells.
  • vitamin A thyroid hormone
  • darcocorticoid cyclophosphamide
  • azathioprine adriamycin
  • bleomycin antimetabolite
  • alkylating agent plant alkaloid
  • plant alkaloid It is effective to use at least one substance (bin alkaloid) or cytoskeletal disorder drug.
  • drugs used for the treatment of cancer and the addition of these substances makes it possible to mainly inactivate cancer cells with high efficiency. That is, in addition to cell inactivation by a magnetic field, inactivation by an inactivation auxiliary agent is also performed, so the effect is Synergistically, the cell removal efficiency is further improved.
  • CD8′T cells and CD4′T cells were used as cells.
  • the magnetic bead B a CD3 antibody-bound one was used.
  • one with magnetic beads B bound and one without magnetic beads B are prepared, a mitotic rate accelerator is added (PHA is applied), and the above processing device K is used under a sinusoidal magnetic field. The survival rate of each cell was compared.
  • test conditions were:
  • binding of magnetic beads B may reduce cell damage.
  • a substance that specifically recognizes a target cell using a substance (drug or monoclonal antibody) that recognizes a specific cell prepare a complex in which magnetic beads are bound to (anti-CD3 monoclonal antibody in the experiment), and bind the CD3 antibody magnetic bead complex to leukocytes prepared from human peripheral blood.
  • the CD3 antibody binds only to T lymphocytes (CD4 lymphocytes and CD8 lymphocytes)
  • only T lymphocytes are affected by the magnetic field and magnetic beads. Therefore, it is possible to protect the cells against the target cells by adjusting the magnetic field strength (variable magnetic field). Under strong magnetic field, the survival rate of T lymphocytes decreases However, the survival rate of sputum lymphocytes with magnetic beads is improved.
  • any cells other than blood may be appropriately changed.
  • the cell processing method and cell processing apparatus of the present invention can be used in medical fields such as purification of blood for transfusion.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　種類の異なる細胞が混在する細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズを結合させてなる当該細胞群を含む処理物が入れられる容器と、容器を保持する容器保持部（１０）と、容器保持部（１０）に保持された容器内の処理物に磁場強度０．０１≦Ｔ（テスラ）≦１，１～３００Ｈｚの正弦波状の変動磁場を印加する変動磁場発生部（２０）とを備え、容器内の細胞群に正弦波状の変動磁場を印加して、特定細胞の生存比率を該特定細胞以外の非特定細胞の生存比率より増加させて処理する。

Description

明 細 書
細胞の処理方法及び細胞の処理装置
技術分野
[0001] 本発明は、種類の異なる細胞が混在する細胞群に磁場を印加して細胞を処理する 細胞の処理方法及び細胞の処理装置に関する。
背景技術
[0002] 従来、この種の細胞の処理方法としては、例えば、特許文献 1 (特開 2004— 4910 5号公報）に掲載されたものが知られている。
これは、図 7に示すように、種類の異なる細胞が混在する細胞群のうち癌細胞等の 標的細胞 Saに、この標的細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビー ズ Baを結合させ、この細胞群に、シングルパルス及びマルチパルスの少なくともいず れかのパルス磁場を印加し、この標的細胞 Saを選択的に死滅させようとするものであ る。
この死滅の原理は、磁気ビーズ Baはパルス磁場の刺激を受けると磁気ビーズ Baが 瞬時に移動し、標的細胞 Saが磁気ビーズに Baより表面が強く引っ張られ、物理的に 破砕されて死滅すると考えられて 、る。
[0003] 特許文献 1 :特開 2004— 49105号公報
[0004] ところで、この従来の細胞の処理技術にぉ 、ては、磁気ビーズ Baを用いて標的細 胞 Saを死滅させている力 このような磁気を用いた細胞処理においては、必ずしも標 的細胞の死滅を目的とせずに、生存させることを目的としたい場合もあり、その場合 には、当該方法をでは対応ができな 、と 、う問題があった。
[0005] 本発明は、上記の問題点に鑑みなされたもので、磁気ビーズを死滅目的ではなく、 生存目的に利用できるようにし、磁気ビーズを用いて特定細胞の生存率を向上させ て細胞群を磁場処理できるようにする細胞の処理方法及び細胞の処理装置を提供 することを目的とする。
発明の開示
[0006] このような課題を解決するため、本発明の細胞の処理方法は、種類の異なる細胞 が混在する細胞群に磁場を印加して処理する細胞の処理方法にお!、て、上記細胞 群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビ ーズを結合させ、該細胞群に正弦波状の変動磁場を印加して、上記特定細胞の生 存比率を該特定細胞以外の非特定細胞の生存比率より増加させて処理する構成と している。
[0007] 本願発明者らは、変動磁場の条件、特に、正弦波状の変動磁場においては、磁気 ビーズを特定細胞に結合させることにより、上記従来のパルス磁場とは逆に、むしろ、 磁気ビーズを結合させな 、細胞に比較して、特定細胞の失活が抑制されることをつ きとめた。
そのメカニズムとしては、正弦波状の変動磁場に置かれた細胞においては、イオン を主体とする核内物質が変動磁場中で移動する際に繰り返し磁気力を受けることに より、正規の分裂過程から外れ、細胞分裂が異常終了して細胞が死に至り、あるいは 、細胞膜の構造異常の誘導が行なわれ、あるいはまた DNA合成の障害が生じる等 の影響が少な力もず生じるが、磁気ビーズを結合させた特定細胞においては、正弦 波状の磁場の特徴として、急激に磁力線の方向が繰り返し反転することから磁気ビ ーズの移動が追従しにくくなると考えられ、そのため、磁場の細胞内小器官あるいは 細胞骨格タンパクへの直接の磁場の影響を吸収 (あるいは緩衝)して細胞への磁場 障害効果を軽減するため、これらの傷害が抑制されることに起因すると考えられる。
[0008] この構成により、例えば、分裂の速度が比較的速い癌細胞等の悪性細胞以外の特 定細胞に磁気ビーズを結合させ、悪性細胞の非特定細胞には磁気ビーズを結合さ せないで、正弦波状の変動磁場を印加し、特定細胞の生存率を増加させるようにし て、非特定細胞の分裂能を失活させ、死滅あるいは減少を促進させることができるよ うになり、医療の分野での利用が期待される。
[0009] そして、必要に応じ、上記印加する磁場強度を、 0. 01≤T (テスラ）≤1としている。
望ましくは、 0. 05≤Τ (テスラ）≤0. 7である。この範囲で、特定細胞の生存比率を有 効に増加させることができる。
[0010] また、必要に応じ、上記正弦波状の変動磁場の周波数を、 1〜300Ηζにした構成 としている。望ましくは、 5〜： LOOHzである。この範囲で、特定細胞の生存比率を有効 に増カロさせることができる。
[0011] 更に、必要に応じ、上記細胞の温度 tを、 4°C≤t≤37°Cとした構成としている。望ま しくは、上記細胞の温度 tを、 25°C≤t≤37°Cとした。これにより、細胞が、人体の血 液などと一緒に処理される場合には、良質細胞に与える影響が低減される。即ち、温 度が 4°Cより低い、あるいは、 37°Cより高いと、特定細胞への影響が大きくなる。
[0012] 更にまた、 5min〜240min間、磁場を印加する構成としている。この場合、時間が 5minより短いと、十分な効果が得られない。一方、時間が 240minより長いと、特定 細胞への影響が大きくなる。
[0013] そして、必要に応じ、上記非特定細胞の分裂速度を促進する分裂速度促進剤を添 加する構成としている。これにより、非特定細胞が活性化 (細胞分裂が刺激)され、よ り強力かつ効果的に非特定細胞の生存率を低下させることができるようになる。
[0014] 上記分裂速度促進剤として、 phytohemagglutinin(PHA) , concanavalin A( ConA) ,リンパ球特異的ペプチド，リンパ球特異的モノクローナル抗体，ガラクトシル セラミド，セラミド，ガンクリオシド，ジァシルグリセオール，テトラデカノィル ホルボー ルアセテート (TP Α)の少なくとも 1つの物質を用いることが有効である。これらの物質 は、主に免疫系の細胞を刺激する物質であり、通常は必ずしも悪い作用を持つわけ ではなぐ例えば、リンパ球特異的モノクローナル抗体は白血病の治療薬としても用 いられている。
一般に、それぞれの免疫細胞 (T細胞や NK細胞）は特定の分子 (ペプチド，たん ばく質，抗体あるいは糖，脂質)より活性化されるものの他の分子による活性化をほと んど受けない。そのため、異常をきたした特定の免疫細胞 (細胞)を活性化させて (分 裂増殖刺激を与える）変動磁場を負荷すれば、正常の免疫細胞に障害を与えること なく異常な免疫細胞のみを選択的に、副作用なく取り除くことが可能となる。
[0015] また、上記課題を解決するための本発明の細胞の処理装置は、種類の異なる細胞 が混在する細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体 を有した磁気ビーズを結合させてなる当該細胞群を含む処理物が入れられる容器と 、該容器を保持する容器保持部と、該容器保持部に保持された容器内の処理物に 磁場強度 0. 01≤T (テスラ）≤1, 1〜300Ηζの正弦波状の変動磁場を印加する変 動磁場発生部とを備えた構成にしている。これにより、細胞に正弦波状の変動磁場を 確実に印加することができる。
[0016] そして、必要に応じ、上記変動磁場発生部を、上記容器保持部に保持された容器 を挟んで配置され回転させられる一対の回転盤と、該各回転盤に設けられ回転によ り正弦波状の変動磁場を発生させる永久磁石と、該回転盤を回転駆動するモータと を備えて構成している。装置を比較的簡易で高価にならないようにすることができ、処 理も容易で簡素化でき、汎用性の向上が図られる。
[0017] 本発明の細胞の処理方法及び細胞の処理装置によれば、特定細胞の生存比率を 非特定細胞の生存比率より増加させて処理できる。そのため、例えば、悪性細胞以 外の特定細胞に磁気ビーズを結合させ、悪性細胞の非特定細胞には磁気ビーズを 結合させないで、正弦波状の変動磁場を印加し、特定細胞の生存率を増カロさせるよ うにして、非特定細胞の分裂能を失活させ、死滅あるいは減少を促進させることがで きるようになり、輸血用血液の精製など医学分野などへの応用が期待できるようにな る。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]本発明の実施の形態に係る細胞の処理装置を示す斜視図である。
[図 2]本発明の実施の形態に係る細胞の処理装置において容器及び容器保持部の 構成を示す斜視図である。
[図 3]本発明の実施の形態に係る細胞の処理装置において、変動磁場発生部の回 転盤の構成を示し、（a)は図 1中 A視図、（b)は図 1中 B視図である。
[図 4]特定細胞と磁気ビーズとの関係を示す図である。
[図 5]実験例における特定細胞と磁気ビーズとの関係を示す図である。
[図 6]正弦波状の磁場印加環境ィヒにおいて T細胞に与える磁気ビーズの影響を実験 した結果を示し、対照群の細胞数を 100%として、細胞数の増減を示すグラフ図であ る。
[図 7]従来の死滅を目的とした標的細胞と磁気ビーズとの関係を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、添付図面に基づいて本発明の実施の形態に係る細胞の処理方法及び細胞 の処理装置について説明する。
実施の形態に係る細胞の処理方法は、実施の形態に係る細胞の処理装置によつ て実現されるので、その作用において説明する。この実施の形態に係る処理装置は 、例えば、処理物として人体から採取された血液中の細胞を処理できる。細胞として は、白血病等の各種癌細胞，ウィルス感染細胞等の悪性細胞を含んだ細胞等を対 象とすることができる。
[0020] 図 1乃至図 3に示すように、この処理装置 Kは、処理する種類の異なる細胞が混在 する細胞群を含む処理物を収納する容器 1を備えている。容器 1としては、例えば、 図 2に示すように、試験管状の榭脂製本体 2に蓋 3が榭脂ヒンジ 4で一体に設けられ たものが用いられる。図 4に示すように、細胞群のうち特定細胞 Sの抗原には、特異 的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズ Bが結合させられて ヽる。磁気ビーズ Bとし ては、特定細胞に応じて、適宜のものが用いられる。
[0021] 容器 1は、榭脂製の容器保持部 10に保持される。容器保持部 10は、図 2に示すよ うに、機台 5にネジ手段 14 (図 1)などで着脱可能に固定されるベース 11と、ベース 1 1に立設され容器 1が嵌合保持される複数の凹部 12が所定の円周上に複数 (実施の 形態では 4つ)設けられた保持板 13と、保持板 13の両面にクリップ 15などで着脱可 能に付設され凹部 12に嵌合された容器 1の脱落を阻止する一対の押え板 16とを備 えて構成されている。保持板 13及び押え板 16の中央には、後述の変動磁場発生部 20の回転軸 22が挿通される一端が開放した凹所 17が形成されている。
[0022] また、機台 5には、変動磁場発生部 20が設けられている。変動磁場発生部 20は、 容器保持部 10に保持された容器 1内の処理物に磁場強度 0. 01≤T (テスラ）≤1、 実施の形態では 0. 5Τ, 1〜300Ηζ、実施の形態では 50Hzの正弦波状の変動磁 場を印加する。
詳しくは、変動磁場発生部 20は、容器保持部 10に保持された容器 1を挟んで配置 され回転させられる一対の回転盤 21A, 21Bを備えている。回転盤 21A, 21Bは、 1 つの回転軸 22に支持されている。回転軸 22の両端部は、軸受けスタンド 23, 24に 回転可能に支持されている。
[0023] 各回転盤 21A, 21Bには、図 3に示すように、回転により正弦波状の変動磁場を発 生させる永久磁石 25が設けられている。具体的には、一方の回転盤 21Aの容器保 持部 10に面する側に、上記凹部 12が設けられる円周に対応した円周上に等角度関 係で、磁極を交互に異にする永久磁石 25が 6個設けられている。他方の回転盤 21B の容器保持部 10に面する側に、上記凹部 12が設けられる円周に対応した円周上に 等角度関係で、磁極を交互に異にし、かつ、一方の回転盤 21Aの永久磁石 25とは 1 つ位相をずらした位置関係で、永久磁石 25が 6個設けられている。即ち、保持板 13 を挟んで、交互に磁極の異なる永久磁石 25の組力 6対配置されている。
[0024] 一方の軸受けスタンド 24には、回転盤 21A, 21Bの回転軸 22を回転駆動するモ ータ 26が設けられている。モータ 26の回転数は、 1000RPMであり、これにより、 50 Hzの正弦波状の変動磁場を印加することができる。
[0025] 更に、処理装置 Kは、容器 1内の温度を一定範囲に保持する恒温槽（図示せず）内 に置かれる。恒温槽内の温度は、例えば、 4°C≤t≤37°Cの範囲、望ましくは、 25°C ≤t≤37°Cに保持される。実施の形態では、例えば、 t= 25°Cに設定される。
[0026] そして、処理装置 Kにより、容器 1を容器保持部 10に保持し、容器保持部 10の保 持板 13を変動磁場発生部 20の回転盤 21A, 21B間に位置させ、 5min〜240min 間、正弦波状の変動磁場を印加する。実施の形態では、例えば、 120minに設定し てある。
[0027] 従って、この実施の形態に係る処理装置 Kにより、細胞群を処理するときは、例え ば、分裂の速度が比較的速 、癌細胞等の悪性細胞以外の特定細胞 Sに磁気ビーズ Bを結合させ、悪性細胞の非特定細胞には磁気ビーズ Bを結合させないでおく。即ち 、図 4に示すように、予め、特定細胞 Sの抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁 気ビーズ Bを結合させる。そして細胞群を容器 1に入れる。それから、容器 1を容器保 持部 10に保持し、容器保持部 10の保持板 13を変動磁場発生部 20の回転盤 21A, 21B間に位置させ、モータ 26を作動させて、所定時間変動磁場中に保持する。
[0028] これにより、分裂速度の速い悪性細胞に対して変動磁場が作用すると、細胞群に 正弦波状の変動磁場が印加され、悪性細胞の死滅あるいは減少が促進される。即ち 、悪性細胞の分裂刺激時には核の分裂を伴う細胞の分ィ匕が行なわれるが、イオンを 主体とする核内物質が磁場中で移動する際に磁場から磁気力を受け、正規の分裂 過程力も外れるようになって、細胞障害が生じ、これにより、分裂能が失活していくの である。そして、悪性細胞は分裂速度が速ぐ分裂時の磁場刺激の機会が多くなるこ とから、悪性細胞は死滅しあるいは無秩序な分裂増加が妨げられて減少して!/、く。 一方、悪性細胞以外の特定細胞 Sにおいては、磁気ビーズ Bの作用により、特定細 胞 Sの生存率が増加させられる。即ち、免疫機能変化，細胞障害性などの影響が防 止される。
[0029] また、上記の実施の形態にお!、ては、必要に応じ、非特定細胞の分裂速度を促進 する分裂速度促進剤を添加することが有効である。例えば、免疫系の細胞において 、異常をきたした特定の免疫細胞 (細胞）があって、これを除去したい場合に、分裂速 度促進剤として、 phytohemagglutinin (PHA) , concanavalin A(ConA) ,リン パ球特異的ペプチド，リンパ球特異的モノクローナル抗体，ガラクトシルセラミド，セラ ミド，ガンクリオシド，ジァシルグリセオール，テトラデカノィル ホルボールアセテート（ TPA)の少なくとも 1つの物質を用 、ることが有効である。
[0030] 一般に、それぞれの免疫細胞 (T細胞や NK細胞）は特定の分子 (ペプチド，たん ばく質，抗体あるいは糖，脂質)より活性化されるものの他の分子による活性化をほと んど受けない。そのため、異常をきたした特定の免疫細胞 (細胞)を活性化させて (分 裂増殖刺激を与える）変動磁場を負荷すれば、正常の免疫細胞に障害を与えること なく異常な免疫細胞のみを選択的に、副作用なく取り除くことが可能となる。従って、 この分裂速度促進剤の添加により、細胞が活性化 (細胞分裂が刺激)され、より強力 かつ効果的に異常細胞を除去することができるようになる。
[0031] そしてまた、上記の実施の形態にお!ヽては、非特定細胞を失活させる失活補助剤 を添加することが有効である。例えば、癌細胞を除去したい場合に、失活補助剤とし て、ビタミン A, 甲状腺ホルモン，ダルココルチコイド，シクロフォスフアミド，ァザチォ プリン，アドリアマイシン，ブレオマイシン，代謝拮抗薬，アルキル化薬，植物アルカロ イド (ビンアルカロイド)，細胞骨格障害薬の少なくとも 1つの物質を用いることが有効 である。これらは、癌の治療に用いられる薬物として知られており、これらの物質の添 加により、主に、癌細胞の失活処理を高効率で行なうことができるようになる。即ち、 磁場による細胞の失活に加えて、失活補助剤による失活も行なわれるので、効果が 相乗的になり、より一層細胞の除去効率が向上させられる。
[実験例]
[0032] 次に、実験例を示す。
図 5に示すように、細胞として、 CD8 'T細胞と、 CD4'T細胞を用いた。磁気ビーズ Bとして、 CD3抗体を結合させたものを用いた。これらの細胞において、磁気ビーズ B を結合させたものと、結合させないものとを作成し、分裂速度促進剤を添加 (PHA投 与)して、上記処理装置 Kを用い、正弦波状の磁場下での、各細胞の生存比率を比 較した。
[0033] 試験条件は、
周波数： 50Hz
磁場強度: 0. 5T
保持温度: t= 25°C
磁場印加時間： 120minとした。
[0034] 結果を図 6に示す。 CD4'T細胞においては、磁気ビーズ Bを結合させないものは、 生存率が 65%であるのに対し、磁気ビーズ Bを結合したものは 86%となり、生存率の 増加が顕著に見られた。
また、 CD8 'T細胞においては、磁気ビーズ Bを結合させないものは、生存率が 83 %であるのに対し、磁気ビーズ Bを結合したものは 91%となり、これにおいても、生存 率の増加が見られた。
[0035] このように，磁気ビーズ Bを結合させると細胞障害が軽減する可能性があることが分 かる。即ち、従来，特定の細胞の機能のみを変調させることは困難であつたが、特定 の細胞を認識する物質 (薬物あるいはモノクローナル抗体)を用いて、標的とする細 胞を特異的に認識する物質 (実験では抗 CD3モノクローナル抗体）に磁気ビーズを 結合させた複合体を準備して、 CD3抗体 磁気ビーズ複合体をヒト末梢血カゝら調製 した白血球に結合させる。この場合 CD3抗体は Tリンパ球 (CD4リンパ球及び CD8リ ンパ球)のみに結合するので、 Tリンパ球のみが磁場と磁気ビーズの影響を受ける。 そのため、磁場強度 (変動磁場)の調節によって、標的とする細胞に対して細胞の保 護を図ることが可能になる。強力な変動磁場の下では， Tリンパ球の生存率が低下す るが，磁気ビーズを結合させた Τリンパ球では生存率が向上する。
[0036] 尚、細胞としては、血液以外にどのような細胞でもよぐ適宜変更して差支えない。
産業上の利用可能性
[0037] 本発明の細胞の処理方法及び細胞の処理装置は、輸血用血液の精製など医学分 野などに利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] 種類の異なる細胞が混在する細胞群に磁場を印加して処理する細胞の処理方法 において、
上記細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有 した磁気ビーズを結合させ、該細胞群に正弦波状の変動磁場を印加して、上記特定 細胞の生存比率を該特定細胞以外の非特定細胞の生存比率より増加させて処理す ることを特徴とする細胞の処理方法。
[2] 上記印加する磁場強度を、 0. 01≤T (テスラ）≤1としたことを特徴とする請求項 1 記載の細胞の処理方法。
[3] 上記正弦波状の変動磁場の周波数を、 1〜300Ηζにしたことを特徴とする請求項
1または 2記載の細胞の処理方法。
[4] 上記特定細胞の温度 tを、 4°C≤t≤37°Cとしたことを特徴とする請求項 1, 2または
3記載の細胞の処理方法。
[5] 5min〜240min間、磁場を印加することを特徴とする請求項 1, 2, 3または 4記載 の細胞の処理方法。
[6] 上記非特定細胞の分裂速度を促進する分裂速度促進剤を添加することを特徴とす る請求項 1, 2, 3, 4または 5記載の細胞の処理方法。
[7] 上記分裂速度促進剤として、 phytohemagglutinin(PHA) , concanavalin A(
ConA) ,リンパ球特異的ペプチド，リンパ球特異的モノクローナル抗体，ガラクトシル セラミド，セラミド，ガンクリオシド，ジァシルグリセオール，テトラデカノィル ホルボー ルアセテート (TP Α)の少なくとも 1つの物質を用いることを特徴とする請求項 6記載 の細胞の処理方法。
[8] 種類の異なる細胞が混在する細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異 的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズを結合させてなる当該細胞群を含む処理 物が入れられる容器と、該容器を保持する容器保持部と、該容器保持部に保持され た容器内の処理物に磁場強度 0. 01≤T (テスラ）≤1, 1〜300Ηζの正弦波状の変 動磁場を印加する変動磁場発生部とを備えたことを特徴とする細胞の処理装置。
[9] 上記変動磁場発生部を、上記容器保持部に保持された容器を挟んで配置され回 転させられる一対の回転盤と、該各回転盤に設けられ回転により正弦波状の変動磁 場を発生させる永久磁石と、該回転盤を回転駆動するモータとを備えて構成したこと を特徴とする請求項 8記載の細胞の処理装置。
PCT/JP2005/016206 2004-09-30 2005-09-05 細胞の処理方法及び細胞の処理装置 Ceased WO2006038405A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004286388A JP3936714B2 (ja) 2004-09-30 2004-09-30 細胞の処理方法
JP2004-286388 2004-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006038405A1 true WO2006038405A1 (ja) 2006-04-13

Family

ID=36142488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/016206 Ceased WO2006038405A1 (ja) 2004-09-30 2005-09-05 細胞の処理方法及び細胞の処理装置

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP3936714B2 (ja)
WO (1) WO2006038405A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019121423A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Cell harvesting and isolation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002153268A (ja) * 2000-09-05 2002-05-28 Fuyuki Mitsuyama 細胞機能亢進方法と細胞機能抑制方法とこれらに用いる薬剤および機械器具
JP2004049105A (ja) * 2002-07-19 2004-02-19 Terutake Ueno 細胞破砕装置及び細胞破砕方法、治療装置並びに細胞成分の選択的分離方法
JP2004097007A (ja) * 2002-09-04 2004-04-02 Japan Science & Technology Corp 機械的振動による生物機能の制御方法とその装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002153268A (ja) * 2000-09-05 2002-05-28 Fuyuki Mitsuyama 細胞機能亢進方法と細胞機能抑制方法とこれらに用いる薬剤および機械器具
JP2004049105A (ja) * 2002-07-19 2004-02-19 Terutake Ueno 細胞破砕装置及び細胞破砕方法、治療装置並びに細胞成分の選択的分離方法
JP2004097007A (ja) * 2002-09-04 2004-04-02 Japan Science & Technology Corp 機械的振動による生物機能の制御方法とその装置

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019121423A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Cell harvesting and isolation

Also Published As

Publication number Publication date
JP3936714B2 (ja) 2007-06-27
JP2006094802A (ja) 2006-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Immunogenic effect of hyperthermia on enhancing radiotherapeutic efficacy
Edelson Light-activated drugs
Nie et al. Tumor microenvironment mediated spermidine-metal-immunopeptide nanocomplex for boosting ferroptotic immunotherapy of lymphoma
Hays et al. Nitric oxide-mediated enhancement and reversal of resistance of anticancer therapies
US20030093028A1 (en) Appararus and method for magnetic induction of therapeutic electric fields
Escoffre et al. Bubble-assisted ultrasound: application in immunotherapy and vaccination
Schirrmacher et al. Long‑term remission of prostate cancer with extensive bone metastases upon immuno‑and virotherapy: A case report
KR102065237B1 (ko) 자성 입자를 이용한 능동형 약물 전달 시스템
DE3854856T2 (de) Verfahren und System zur Erzielung einer lokalen Mössbauer-Absorption in einem organischen Medium
AU2005295261A1 (en) Methods and compositions for protecting cells from ultrasound-mediated cytolysis
WO2012009603A2 (en) Transcranial magnetic stimulation for altering susceptibility of tissue to pharmaceuticals and radiation
Zheng et al. Multifunctional nanomodulators regulate multiple pathways to enhance antitumor immunity
Huang et al. Stimuli-responsive nanoadjuvant rejuvenates robust immune responses to sensitize cancer immunotherapy
EP3139964A1 (en) Magnetoenzymatic carrier system for imaging and targeted delivery and release of active agents
WO2006038405A1 (ja) 細胞の処理方法及び細胞の処理装置
Sen et al. A review on platinum (II/IV) complexes of Schiff base ligands and application in biological activity
Ghannam et al. Targeting doxorubicin encapsulated in stealth liposomes to solid tumors by non thermal diode laser
Tariq et al. An insight into the role of bee venom and melittin against tumor cells: a review of breast cancer therapy
Ou et al. Potential synergistic anti‐tumor activity between lenalidomide and sorafenib in hepatocellular carcinoma
Thuning et al. Synergistic effect of combined hyperthermia and a nitrosourea in treatment of a murine ependymoblastoma
WO1996015829A9 (en) Apparatus for inducing dc electric fields in biological material and method of using it
WO1996015829A2 (en) Apparatus for inducing dc electric fields in biological material and method of using it
JP4190223B2 (ja) 細胞破砕装置及び細胞破砕方法、治療装置並びに細胞成分の選択的分離方法
Zhao et al. ROS-responsive bola-lipid nanoparticles as a codelivery system for gene/photodynamic combination therapy
JP2005350396A (ja) 特定細胞の処理方法及び特定細胞の処理装置

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05781584

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1