WO2006027468A2 - Epitopes t cd4+ du vih restreints a hla-dp4 et leurs applications - Google Patents

Epitopes t cd4+ du vih restreints a hla-dp4 et leurs applications Download PDF

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WO2006027468A2
WO2006027468A2 PCT/FR2005/002152 FR2005002152W WO2006027468A2 WO 2006027468 A2 WO2006027468 A2 WO 2006027468A2 FR 2005002152 W FR2005002152 W FR 2005002152W WO 2006027468 A2 WO2006027468 A2 WO 2006027468A2
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hiv
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epitope
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Gaétan MUNIER
Bernard Maillere
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
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    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to antigenic peptides of the human immunodeficiency virus (HIV) comprising at least one CD4 + T epitope which is restricted to an HLA-DP4 molecule, and to their vaccine and diagnostic applications.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • CD4 + T cells play an essential role in controlling HIV infection as evidenced by the high frequency of HIV-specific CD4 + T cells in non-progressing individuals who have been infected for more than 12 years and do not develop disease (AIDS) in the absence of any antiviral treatment; in contrast, low or undetectable levels of HIV-specific CD4 + T cells are observed in the majority of individuals with recent seroconversion or chronic HIV infection who are untreated.
  • CD4 + T lymphocytes play a major role in the induction and maturation of humoral and cellular immunity. Via cellular contacts and the secretion of many cytokines, they induce the activation of antigen presenting cells (APCs for Antigen Presenting CeIl) which in turn recruit HIV-specific CD8 + T cells. They are also involved in the maturation of effector cells that are cytotoxic T lymphocytes. Finally, they can themselves play the role of effectors by producing anti-viral lymphokines such as IFN- ⁇ and TNF- ⁇ . Thus, a decrease in the level of CD4 + T cells that reduces the effectiveness of the immune system is a major cause of progression to the disease during HIV infection.
  • APCs for Antigen Presenting CeIl antigen presenting cells
  • IFN- ⁇ and TNF- ⁇ antigen presenting cells
  • CD4 + T lymphocytes The activation of CD4 + T lymphocytes is due to the presence of antigenic peptides by the major histocompatibility complex type II molecules carried by the antigen presenting cells; in humans, they are called HLA II molecules for Human Leucocyte Antigen type IL
  • These antigenic peptides, called T epitopes result from the proteolytic degradation of the antigens by the antigen presenting cells. They have variable lengths, generally from 13 to 25 amino acids and have a sequence that makes them capable of binding to HLA II molecules. It is well known that, like the native antigen, a peptide comprising a CD4 + T epitope is capable of to stimulate specific CD4 + T lymphocytes in vitro or to recruit them in vivo. It is therefore sufficient to induce a CD4 + T response.
  • Such peptides that are recognized by HIV-specific CD4 + T cells are also useful as reagents in a diagnostic test of infection or treatment follow-up in humans, based on direct detection (lymphocyte proliferation assay) or indirect (production of antibodies, cytokines, etc.) of said CD4 + T lymphocytes.
  • HLA II molecules are heterodimers consisting of a polymorphic alpha ( ⁇ ) chain and a beta ( ⁇ ) chain.
  • ⁇ alpha
  • ⁇ beta
  • the HLA-DR molecule is very polymorphic.
  • the beta ( ⁇ ) chain encoded by the DRB1 gene which is the most expressed, currently has 458 alleles.
  • the two chains ( ⁇ and ⁇ ) that constitute them are polymorphic but they have fewer alleles.
  • the combination of the two ⁇ and ⁇ chains encoded by these alleles gives rise to numerous HLA-DQ and HLA-DP molecules.
  • a peptide capable of stimulating an HIV-specific CD4 + T response in some individuals may be inactive in the majority of other individuals because they do not recognize HIV proteins by the same epitopes.
  • Most of the HIV CD4 + T epitopes already described are localized in Gag, Env, PoI and Nef proteins (Gag: Wilson et al., J. Virol., 2001, 75, 4195-4207, Malhotra et al., J. Clin., Invest, 2001, 107, 505-517, Venturini et al., J. Virol., 2002, 76, 6987-6999, Boritz et al., J. Immunol., 2003, 170, 1107-1116, Kaufmann et al.
  • CD4 + T epitopes are restricted to one HLA DR or DQ molecule, excluding that carried by the peptide Nef 180-193 which is restricted to HLA-DP5, a non-dominant molecule in the Caucasian population (allele frequency of 1.3%).
  • HLA-DR molecules a dozen alleles are necessary to cover more than 60% of the gene frequency found in the Caucasian population and therefore affect more than 85% of this population (International Application WO 02/062834).
  • a peptide carrying a HLA-DR restricted epitope is generally not recognized by all the predominant HLA-DR molecules in the population (see, in particular, Table 4 of Kaufmann et al., Supra, and Table VII. of International Application WO 02/062834).
  • each peptide carrying an HLA-DR restricted epitope must be tested against a tens of HLA-DR molecule to select the peptides recognized by the majority of these molecules, and it is generally necessary to use a mixture of at least two or three different peptides to obtain an effective vaccine in the majo ⁇ rity individuals from the population to be vaccinated.
  • the inventors have identified other CD4 + T epitopes derived from the HIV PoI (RT), Env, Vpr and Vif proteins, which are restricted to an HLA-DP4 molecule and are capable of inducing, by themselves, a CD4 + T response. specificity of HIV, in the majority of vaccinated individuals.
  • HLA-DP4 molecules are very common, especially in the Caucasian population.
  • two DP4 molecules DP401 and DP402 alone cover the majority of the HLA-DP allelic frequency in the Caucasian population (around 50% in Europe and 80% in North America) and are also present at non-negligible frequencies in the other populations (allelic frequency of the order of 60% in South America, 60% in India, 25% in Africa and 15% in Japan).
  • Each of these DP4 molecules comprises an alpha chain coded, either by Pallele DPAl * 0103 which is the most frequent (78.2%), or by the DPAl * 0201 allele (20.2%) and a beta chain encoded by allele DPB1 * 0401 (molecule HLA-DP401) or DPB1 * 0402 (molecule HLA-DP402).
  • the subject of the present invention is therefore an HIV peptide comprising a CD4 + T epitope capable of being presented by an HLA-DP4 molecule and inducing HIV-specific CD4 + T cells, selected from the group consisting of: a) fragments of 13 consecutive amino acids of the Env, RT, Vpr and Vif proteins located between the following positions:
  • the peptides according to the invention have the following properties:
  • HLA-DP4 binding activity the peptides according to the invention have a high affinity for HLA-DP4 (binding activity ⁇ 1000 nM); the binding activity can be measured by an HLA-DP4 / peptide binding test, in competition, with immunoenzymatic revelation, according to the principle described in PCT International Application WO 03/040299,
  • the peptides according to the invention are recognized by CD4 + T lymphocytes in the majority of individuals because of the preponderance of the HLA-DP4 molecule in the Caucasian population but also in populations of South America and India, and to a lesser extent those in Africa and Japan. These peptides are also capable of efficiently inducing HIV-specific CD4 + T cells from the precursors present in the majority of naive or infected individuals, or to stimulate such HIV-specific lymphocytes present in the majority of infected individuals.
  • the CD4 + T lymphocytes induced by these peptides recognize the epitope of the native antigen naturally presented by the dendritic cells as well as natural variants of said peptides.
  • such peptides represent potential candidates for prophylactic or therapeutic vaccination against HIV infection, particularly of interest because they can induce an HIV-specific CD4 + T response in the majority of individuals in the population.
  • peptides whose sequence is conserved in natural variants of HIV or which cross-react with CD4 + T epitopes recognized by natural variants of HIV are capable of inducing a CD4 + T response to variants of HIV.
  • the immunogenicity of the peptides can be determined, in particular from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), by any appropriate assay.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • a cell proliferation assay an ELISPOT assay (cytokine-producing cell assay) or an intracellular cytokine assay (IFN-gamma, IL-2, IL-2). 4 and IL-10).
  • a cell proliferation assay an ELISPOT assay (cytokine-producing cell assay) or an intracellular cytokine assay (IFN-gamma, IL-2, IL-2). 4 and IL-10).
  • the invention encompasses peptides whose sequence corresponds to that of a fragment of the Env, RT, Vpr and Vif protein of any HIV isolate (HIV-1 or HIV-2) including natural variants of HIV, isolated from individuals infected with HIV.
  • HIV-I isolates are classified into three groups (M, N (non-M, non-O) and O) which are divided into subtypes or clades according to their genetic similarity (Env gene); group M comprises at least 9 subtypes (subtypes A to I), subtype B being predominant in western countries.
  • NCBI " http://www.ncbi.nlm.nih.gov " ) or LANL (Los Alamos National Laboratory). http: //www.hiv.lanl.govy NCBI access numbers K03455 and AF075719 include, respectively, the HIV-I group M subtype B subunit sequence, designated HXB2, corresponding to the LAI isolate.
  • the invention also encompasses variants obtained from the preceding sequences by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the peptide sequence, since said variant retains a high affinity for HLA-DP4 (activity ⁇ 1000 nM) and is immunogenic.
  • the amino acid residues involved in the binding to HLA-DP4 anchor residues P1, P4, P6 and P9 and the effect of the modifications of these residues on the binding to HLA-DP4 are known to those skilled in the art;
  • PCT International Application WO 03/040299 teaches in particular that the residues at P6, P1 and / or P9 must be almost exclusively aromatic or hydrophobic whereas the residue at P4 may be any amino acid residue.
  • variants mention may be made of those in which the anchoring residues P6, P1 and / or P9 are unchanged, and at least one of the other amino acid residues is modified.
  • These variants are in particular the peptides comprising the sequence of 9 consecutive amino acids of the proteins Env, RT, Vpr and Vif including the anchoring residues P1, P4, P6 and P9, which sequence corresponds to residues located at positions +3 to +11 , relative to the sequence of peptides of 13 amino acids as defined above.
  • peptides of 13 to 15 amino acids including at least the sequence which is located between the following positions: 34 to 42, 391 to 399, 486 to 494, 623 to 631, 673 to 681, 680 to 688, 687 at 695, 752 to 760 and 763 to 771 of the Env protein; 341 to 349, 159-167, 266 to 274, 349 to 357, 406 to 414, and 411 to 419 of the RT protein; 18 to 26 and 64 to 72 of the Vpr protein; 64-72 of the Vif protein.
  • the invention also encompasses modified peptides derived from the foregoing by introduction of any modification at amino acid residue (s), peptide bond or peptide ends, as long as said modified peptide retains a high affinity for HLA.
  • -DP4 binding activity ⁇ 1000 nM
  • modifications which are introduced into the peptides by conventional methods known to those skilled in the art, include, without limitation: the substitution of an amino acid by a non-proteinogenic amino acid (amino acid D or the like of an acid amine); adding a chemical group (lipid, oligo or polysaccharide) at a reactive function, in particular the side chain R; modification of the peptide bond (-CO-NH-), in particular by a retro-type or retro-inverso bond (-NH-CO-) or a bond different from the peptide bond; cyclization; the fusion of a peptide (epitope of interest for vaccination, label useful for the purification of the peptide, especially in cleavable form with a protease); the fusion of the sequence of said peptide with that of a protein, in particular an ⁇ or ⁇ chain of an HLA-DP4 molecule or the extracellular domain of said chain; coupling to a suitable molecule, in particular a marker, for example a fluoroch
  • said peptide is selected from the group consisting of peptides RT 338-352, 339-351, 346-360, 347-361, 403-417, 404-416, Env 31-45 , 32-44, 388-402, 389-401, 483-497, 484-496, 620-634, 621-633, 677-691, 678-690, 684-698, 685-697 and Vpr 15-29, 16-28, 61-75 and 62-74.
  • said peptide is selected from the group consisting of peptides RT 338-352, 339-351, Env 31-45, 32-44, 388-402, 389- 401, 620-634, 621-63 and Vpr 15-29, 16-28, 61-75 and 62-74.
  • said peptide is selected from the group consisting of peptides RT 338-352, Env 31-45, 388-402, and 620-634. Even more preferably, said peptide is selected from the group consisting of peptides RT 338-352 and Env 31-45.
  • said peptide its sequence corresponds to that of a type 1 HIV isolate, preferably of the M group, preferably said sequence corresponds to the reference sequence of the subtype B, called HXB2. (NCBI access number K03455).
  • said peptide is selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 2 to 7, 16 to 20, 22, 24 to 29, 38 to 42, 44 to 48 and 50 to 56 .
  • said peptide is labeled or complexed; it can in particular be complexed with labeled (biotinylated) HLA-DP4 molecules to form HLA-DP4 / peptide complexes, in particular multimeric complexes such as tetramers.
  • said DP4 molecule comprises a ⁇ chain encoded by the DPB1 * 0401 allele (HLA-DP401 molecule) or DPB1 * 0402 (HLA-DP402 molecule); the ⁇ chain being encoded by the DPAl * 0103 or DPAl * 0201 allele.
  • the present invention also relates to a polyepitopic fragment comprising the concatenation of at least two identical or different epitopes, at least one of which is a peptide as defined above, for a antigen in prophylactic or therapeutic vaccination, or the diagnosis of HIV infection.
  • said polyepitopic fragment has a length of 20 to 1000 amino acids, preferably 20 to 100 amino acids.
  • Said polyepitopic fragment advantageously comprises a label fused at one of its ends for the purification or detection of said fragment.
  • the tag especially a polyhistidine sequence or a B epitope of another virus, is preferably separated from the polyepitope sequence by a protease cleavage site so as to isolate the polyepitopic sequence from the fusion.
  • said polyepi ⁇ topical fragment comprises the concatenation of at least one CD4 + T epitope as defined above and an epitope selected from the group consisting of:
  • a CD4 + T epitope of the HIV Nef protein in particular an epitope binding to at least one predominant HLA DR molecule in the Caucasian population, as defined in PCT International Application WO 02/062834 (Nef 1-36, 66- 94, 74-88, 77-91, 137-168, 139-153, 175-190, 182-198, 178-192, 181-195, 183-197, 187-201 and 189-203),
  • T epitope universal natural or synthetic such as the peptide of the tetanus toxin TT 830-846 (.. O 1 SULLIVAN et al, J. Immunol, 1991, 147, 2663-2669), the haemagglutinin peptide virus HA 307-319 (O'SULLIVAN et al, supra), PADRE peptide (KXV AA WTLKAA, Alexander et al., Immunity, 1994, 1, 751-761), peptide 45-69 of HIV Nef protein And peptides derived from Plasmodium falciparum antigens such as the CS.T3 peptide (SINIGAGLIA et al., Nature, 1988, 336, 778-780) and the CSP, SSP2, LSA-I and EXP-I peptides (DOOLAN et al., J. Immunol., 2000, 165, 1123-1137),
  • an epitope B constituted by a sugar (ALEXANDER et al., cited above), said epitope B preferably being in the form of a glycopeptide, and an epitope B of an HIV protein specifically recognized by antibodies directed against HIV; Sequences of HIV B epitopes are available in the LANL database (http://www.hiv.lanl.gov/content/imrnunology/rnaps/ab/ab.pdf).
  • the combination of the CD4 + T epitope with at least one of the epitopes as defined above advantageously makes it possible to trigger or modulate an anti-HIV immune response.
  • the present invention also relates to a lipopeptide comprising a peptide or a polyepitopic fragment as defined above, for use as an antigen in prophylactic and therapeutic vaccination or the diagnosis of HIV infection.
  • Said lipopeptide is especially obtained by adding a lipid on an ⁇ -amino function or on a reactive function of the side chain of an amino acid of said peptide or polyepitopic fragment; it may comprise one or more chains derived from C 4-20 fatty acids, optionally branched or unsaturated (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, 2-amino hexadecanoic acid, pimelautide, trimetauxide) or a derivative thereof of a steroid.
  • the preferred lipid portion is in particular represented by a N ⁇ -acetyl-lysine N ⁇ (palmitoyl) group, also called Ac-K (Pam).
  • the present invention also relates to a fusion protein consisting of a protein or a fragment of protein, fused with a peptide or a polyepitopic fragment as defined above, for use as an antigen in prophylactic and therapeutic vaccination or the diagnosis of HIV infection.
  • the peptide or polyepitopic fragment may be fused with the NH 2 or COOH end of said protein or inserted into the sequence of said protein.
  • said fusion protein consists of an HIV peptide as defined above, fused with one of the chains of an HLA-DP4 molecule, preferably the beta chain, or with a fragment thereof. to a soluble HLA-DP4 molecule, in particular a fragment corres ⁇ coping with the extracellular domain preceded by the homologous signal peptide or a heterologous signal peptide.
  • Said HIV peptide is advantageously inserted between the signal peptide and the NH 2 end of the extracellular domain of the ⁇ chain, as described for the HLA-DR molecule (Kolzin et al., PNAS, 2000, 97, 291-296).
  • said HIV peptide or said polyepitic fragment are fused with a protein facilitating their purification or detection, known to those skilled in the art such as in particular Glutathione-S-Transferase (GST) and fluorescent proteins (GFP and derivatives ).
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • GFP and derivatives fluorescent proteins
  • sequence of the peptide or polyepitopic fragment of interest is preferably separated from the rest of the protein by a protease cleavage site, to facilitate the purification of said peptide or said polyepitopic fragment.
  • the subject of the present invention is also an expression vector comprising a polynucleotide encoding a peptide, a polyepitopic fragment or a fusion protein as defined above, for use as an antigen in the prophylactic or therapeutic vaccination of the subject. HIV infection.
  • the sequence of said polynucleotide is that of the cDNA encoding said peptide or polyepitopic fragment or said fusion protein. Said sequence may advantageously be modified in such a way that codon usage is optimal in the host in which it is expressed.
  • said polynucleotide may be linked to at least one heterologous sequence.
  • hetero ⁇ logical sequence in relation to a nucleic acid sequence encoding an HIV peptide, any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said sequence of nucleic acid sequences. nucleic acid encoding said HIV peptide.
  • said recombinant vector comprises an expression cassette including at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and possibly translational sequences (promoter, activator, intron, codon of (ATG), stop codon, polyadenylation signal).
  • promoter, activator, intron, codon of (ATG), stop codon, polyadenylation signal are known.
  • an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form, or integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses, AAVs and baculoviruses, in which the sequence of interest has been inserted beforehand; said sequence (isolated or inserted in a plasmid vector) may also be associated with a substance enabling it to cross the membrane of the host cells, such as a transporter such as a nanotransporter or a preparation of liposomes, or of cationic polymers, or the to introduce into said host cell using physical methods such as electroporation or microinjection.
  • these methods can advantageously be combined, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • the subject of the present invention is also an immunogenic or vaccinal composition, characterized in that it comprises at least one HIV peptide, a polyepitopic fragment, a lipopeptide or a vector as defined above, and a pharmaceutically acceptable vehicle, and or a carrier substance, and / or an adjuvant.
  • the immunogenic composition according to the invention is in a galenic form suitable for parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous), enteral (oral, sublingual), or local (rectal, vaginal) administration.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles, the carrier substances and the adjuvants are those conventionally used.
  • the adjuvants are advantageously chosen from the group consisting of: oily emulsions, mineral substances, bacterial extracts, saponin, alumina hydroxide, monophosphoryl lipid A and squalene.
  • the carrier substances are advantageously selected from the group consisting of: unilamellar or multilamellar liposomes, ISCOMS, virosomes, viral pseudoparticles, saponin micelles, solid microspheres of saccharide nature (poly (lactide-co-glycolide)) or auriferous, and nanoparticles.
  • said immunogenic composition comprises at least one HIV peptide including an HLA-DP4 restricted CD4 + T epitope as defined above and another HIV peptide including a CD8 + T epitope, in the form of a mixture of peptides, a polyepitopic fragment or an expression vector encoding said peptides or said fragment.
  • said composition also comprises at least one other peptide including an epitope selected from the group consisting of: a CD4 + T epitope of the HIV Nef protein, a universal CD4 + T epitope, a B epitope consisting of a sugar and a HIV B epitope as defined above.
  • the present invention also relates to the use of a peptide, a polyepitopic fragment, a lipopeptide or a vector as defined above, for the preparation of a vaccine intended for the prevention and / or or the treatment of HIV infection in an HLA-DP4 positive individual.
  • the subject of the present invention is also the use of a peptide as defined above, for the preparation of a reagent for diagnosing the immune status of a HLA-DP4 positive individual, with respect to the HIV.
  • the term "diagnosis of the immune status of an individual with respect to HIV” means the detection of the presence in said individual of CD4 + T cells specific for an HIV antigen. This detection makes it possible to monitor the evolution of the HIV-specific CD4 + T response during natural infection or antiviral treatment or HIV vaccination.
  • the detection is carried out from a biological sample containing CD4 + T lymphocytes, in particular a sample of mononuclear cells isolated from a peripheral blood sample (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood sample
  • the subject of the present invention is also a kit for detecting the immune status of an individual with respect to HIV, characterized in that it comprises at least one peptide as defined above, associated with a means for detection of CD4 + T lymphocyte cells specific for an HIV antigen.
  • the detection of antigen-specific CD4 + T lymphocytes is carried out by any means, known in themselves.
  • direct means such as flow cytometry in the presence of multimeric complexes
  • indirect means such as lymphocyte proliferation assays and cytokine assays such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma
  • ELISA immunoenzymatic techniques
  • RIA RIA
  • ELISPOT immunoenzymatic techniques
  • flow cytometry intracellular cytokine assay
  • a cell suspension (PBMC, PBMC depleted in CD8 + cells, T cells previously enriched by an in vitro culture step with the peptides as defined above or cloned T lymphocytes) is cultured for 3 to 5 days in the presence of said peptides. and if necessary appropriate screening cells, such as dendritic cells, autologous or heterologous PBMCs, lymphoblastoid cells such as those obtained after infection with EBV or genetically modified cells.
  • the presence of HIV-specific CD4 + T cells in the initial suspension is detected using the HIV peptides, using one of the following methods: * Proliferation test:
  • the ELISPOT test makes it possible to reveal the presence of secretory T cells of cytokines (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma), specific for a peptide such as as defined above.
  • cytokines IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma
  • the principle of this test is described in Czerkinsky et al., J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121 and Schstoff et al, J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167-174, and its implementation is illustrated in International Application WO 99/51630 or Gahéry-Ségard et al., J. Virol., 2000, 74, 1694-1703.
  • detection of cytokines IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma
  • cytokines such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ The presence of HIV-specific T cells secreting cytokines such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN- ⁇ is detected, either by assaying the cytokines present. in the culture supernatant, by an immunoenzymatic test, in particular using a commercial kit, or by detection of intracellular cytokines in flow cytometry.
  • the principle of detection of intracellular cytokines is described in Goulder et al. , J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832 and Maecker et al., J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40 and its implementation is illustrated in Draenert et al., J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19-29. * multimeric complexes.
  • a biological sample preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • marked multimeric complexes in particular with a fluorochrome, formed by the binding between soluble HLA-DP4 molecules and HIV peptides, such as defined above, and the cells labeled with said multimeric complexes are analyzed, in particular by flow cytometry.
  • HLA-DP4 / peptide multimeric complexes can be prepared from native molecules extracted from cells expressing HLA-DP4 or from recombinant molecules produced in appropriate host cells as specified, for example in NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) or in KURODA et al. (J. Viral., 2000, 74, 18, 8751-8756).
  • HLA-DP4 molecules can in particular be truncated (deletion of the transmembrane domain) and their sequence can be modified in order to make them soluble or to facilitate the pairing of alpha and beta chains (Novak et al., Cited above).
  • the loading of HLA-DP4 molecules with the peptide can be done by contacting a preparation of HLA-DP4 molecules as above, with the peptide.
  • soluble and biotinylated HLA-DP4 molecules are incubated, for 72 hours at 37 ° C., with a 10-fold excess of HIV peptides as defined above, in a 10 mM phosphate-citrate buffer, NaCl 0.15M to a pH of between 4.5 and 7.
  • the peptide sequence can be introduced into one of the chains of the DP4 molecule in the form of a fusion protein which allows the preparation of HLA-DP4 / peptide multimeric complexes from appropriate host cells expressing said protein of fusion. Said complexes can then be labeled, in particular with biotin.
  • the multimeric complexes of tetramer type are obtained in particular by adding to the HLA-DP4 loaded molecules, streptavidin labeled with a fluorochrome in a quantity four times lower (mole to mole) relative to HLA-DP4 molecules. The assembly is then incubated for a sufficient time, for example overnight at room temperature.
  • the multimeric complexes can also be formed, either by incubation of HLA-DP4 monomers / peptides with streptavidin-coupled magnetic beads as described for the HLA I molecules (Bodinier et al., Nature, 2000, 6, 707-710), or by inserting HLA-DP4 / peptide monomers into lipid vesicles as described for murine class II MHC molecules (Prakken, Nature Medicine, 2000, 6, 1406-1410).
  • a suspension of cells (PBMC, PBMC depleted in CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with HIV peptides such as defined above or cloned T lymphocytes) with multimeric HLA-DP4 / peptide complexes at a suitable concentration (for example of the order of 10 to 20 ⁇ g / ml), for a time sufficient to allow the binding between the complexes. and HIV-specific CD4 + T cells (e.g., on the order of 1 to 3 hours). After washing, the suspension is analyzed by flow cytometry: the labeling of the cells is visualized by the multimeric complexes which are fluorescent.
  • Flow cytometry makes it possible to separate the cells labeled with the HLA-DP4 / peptide multimeric complexes from the unlabeled cells and thus perform cell sorting.
  • the present invention thus also relates to a method for sorting CD4 + T lymphocytes specific for an HIV antigen, characterized in that includes at least the following steps:
  • HLA-DP4 / peptide multimeric complexes in particular with a fluorochrome, said complexes being formed by the binding of soluble HLA-DP4 molecules with at least one HIV peptide as defined herein; above, and
  • the present invention further relates to a peptide as defined above, excluding peptides RT 338-352, 403-417, Env 483-497, 684-698 and Vpr 15-29.
  • the present invention further relates to a polyepitopic fragment, a lipopeptide, a polynucleotide, an expression cassette, a recombinant vector derived from the preceding peptides.
  • the invention encompasses in particular: a) expression cassettes comprising at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and optionally translational sequences (promoter, activator, intron, initiation codon (ATG), stop codon, polyadenylation signal), and b) recombinant vectors comprising a polynucleotide according to the invention.
  • these vectors are expression vectors comprising at least one expression cassette as defined above.
  • the polynucleotides, the recombinant vectors and the trans ⁇ formed cells as defined above are particularly useful for producing the peptides, polyepitopic fragments and fusion proteins according to the invention.
  • the polynucleotides according to the invention are obtained by conventional methods, known per se, according to the standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick A. USUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or by total or partial chemical synthesis.
  • the recombinant vectors are constructed and introduced into host cells by conventional methods of recombinant DNA and genetic engineering, which are known per se.
  • Peptides and their derivatives are prepared by standard techniques known to those skilled in the art, in particular by solid phase synthesis or liquid or by expression of a recombinant DNA in a suitable cellular system (eukaryotic or prokaryotic).
  • the peptides and their derivatives can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Merrifield et al. (J. Am Chem Soc., 1964, 85: 2149-) and purified by reverse phase high performance liquid chromatography,
  • the lipopeptides may especially be prepared according to the process described in International Applications WO 99/40113 or WO 99/51630.
  • the peptides and derivatives such as the variants, the poly ⁇ epitopic fragments and the fusion proteins can also be produced from the corresponding cDNAs, obtained by any means known to those skilled in the art; the cDNA is cloned into a eukaryotic or prokaryotic expression vector and the protein or fragment produced in the cells modified with the recombinant vector are purified by any appropriate means, in particular by affinity chromatography.
  • FIG. 1 illustrates the in vitro immunogenicity of 6 HIV-1 peptides
  • FIG. 2 illustrates the analysis of the recognition of the native antigen and of the peptides Env 31-45 and RT 338-352 by four lines of CD4 + T lymphocytes specific for said peptides (line 156.66 specific for Env 31-45 and lines 157.49 , 157.53 and 157.13 specific for RT 338-352)), by an IFN- ⁇ assay ELISPOT assay.
  • FIG. 3 illustrates the analysis of the recognition of variants by three lines of CD4 + T lymphocytes specific for Env 31-45 or RT 338 peptides.
  • EXAMPLE 1 BINDING ACTIVITY OF HIV PEPTIDES IN RELATION TO HLA-DP401 MOLECULES AND DP402 1) Materials and Methods a) Peptides 13 and 15 amino acid peptides (13-mer and 15-mer) representative of proteins p24, RT, Vif, Vpr and Env of HIV-I were selected according to the presence of several aromatic or hydrophobic residues which are the main anchoring residues for the HLA-DP molecules.
  • sequences of the selected peptides are presented in the attached sequence listing and Tables II and III. All peptides correspond to the HXB2 reference sequence (NCBI accession number K03455) excluding the sequences Env 749-763 (SEQ ID NO: 9) and Env 750-762 (SEQ ID No. NO: 31) which correspond to those of the isolate MN (accession number NCBI AF075719), as well as sequences SEQ ID NO: 5 (Vif 61-75) and 27 (Vif 62-74) in which the residues G70 and W71 were reversed with respect to the HXB2 sequence which has the WG and non-GW sequence, at positions 70 and 71 of the Vif protein sequence. This inversion was corrected in the sequences SEQ ID NO: 57 (Vif 61-75) and SEQ ID NO: 58 (Vif 62-74).
  • variants of the amino acid peptides RT 338-352 and Env 31-45 correspond to naturally occurring variants of the group M of HIV-I, which are frequently isolated, the sequence of which is available in the LANL database ( http://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/map), were also synthesized [SEQ ID NO: 45-52 (Table VIII) and SEQ ID NO: 53-56 (Table IX)].
  • the peptides were synthesized according to the Fmoc strategy in solid phase parallel synthesis, purified by HPLC and controlled by mass spectrometry (ES-MS). b) HLA-DP4 / peptide binding assay
  • the binding assays for HLA-DP4 molecules encoded by the DPB1 * 0401 and DPB1 * 0402 alleles, designated DP401 and DP402, respectively, are binding assays in competition with enzyme immunoassay disclosed in PCT International Application WO 03/040299. More specifically, the peptide Oxy 271-287
  • the majority (39 out of 44) of the peptides derived from the HIV-I group M refer ence sequence bind to a good affinity (IC 50 ⁇ 1000 nM) at one end. at least DP4 molecules (Table II and III).
  • IC 50 ⁇ 1000 nM IC 50 ⁇ 1000 nM
  • DP4 molecules Table II and III.
  • 15-mer 17 peptides bind with good affinity to DP401, 15 peptides bind with good affinity to DP402 and 14 peptides bind with good affinity to both DP4 molecules.
  • the 13-mer and the 15-mer bind to DP401 and DP402 with comparable binding activities.
  • Table III Binding activities of 13-mer against HLA-DP4 molecules (IC 50 in nM)
  • HLA-DP4 to induce in vitro stimulation of specific T lymphocytes was evaluated from blood samples of HIV-negative people. The aim is to evaluate the ability to recruit CD4 + precursor are in a na ⁇ ve individual at a very low frequency, that is to say to perform an in vitro immunization using these peptides.
  • PBMC Mononuclear peripheral blood cells
  • the adherent cells were incubated for 5 days in AIM-V medium containing 100 ⁇ / ml of GM-CSF and 100 ⁇ / ml of recombinant IL-4 (R & D SYSTEMS), then the cells differentiated into dendritic cells (immature dendritic cells). ) were then cultured for 2 days, in the presence of 1 ⁇ g / ml of LPS, 1000 U / ml of IL-4 and 1000 U / ml of GM-CSF, so as to induce their maturation.
  • the mature dendritic cells (10,000 cells / well) were then incubated with the peptide mixture (10 ⁇ g of each peptide in IMDM medium (IN VITROGEN) supplemented with glutamine (24 mM, SIGMA), asparagine (55 mM, SIGMA), arginine (150 mM, SIGMA), penicillin (50 IU / ml, IN VITROGEN), streptomycin (50 ⁇ g / ml, IN VITROGEN) and 10% human serum) for 4 hours at 37 ° C.
  • IMDM medium IN VITROGEN
  • the mature dendritic cells were then washed and then incubated, in the presence of the previously thawed CD4 + T lymphocytes (100,000 cells / well), in medium containing 1000 U / ml of IL-6 and 10 ng / ml of IL-12. After 7 days (J7), the culture was restimulated a first time, using mature dendritic cells previously thawed and loaded with the peptide mixture, in medium containing IL-2 (10 U / ml) and IL-7 (5 ng / ml). After two additional stimulations (J14 and J21), under the above conditions, the cells were tested in ELISPOT, at least 6 days after the last stimulation. c) Analysis of the specificity of ELISPOT lines
  • Anti-IFN-gamma antibodies (1-D1K, MABTECH) diluted to 1 ⁇ g / ml in PBS buffer were adsorbed onto nitrocellulose (MILLIPORE) plates for 1 hour at 37 ° C. The plates were then washed with PBS and then saturated with ISCOVE medium containing 10% human serum of the AB group (100 ⁇ l / well), for 2 h at 37 ° C.
  • the antigen presenting cells are either cells immature autologous dendritics prepared as specified above, namely HLA-DP4 positive cells (L-DP4 line of fibroblasts transfected with the cDNA coding for a DP402 molecule; Yu et al., Hum Immunol., 1990, 27, 132- 135) which makes it possible to check the specificity of the peptides with respect to the HLA-DP4 molecule.
  • the recombinant HIV proteins RT of HIV-I isolate HXB2 or HIV-IIB GP 120, NIBSC, United Kingdom
  • immature dendritic cells for 4 h at 37 ° C. and the dendritic cells are washed. before being used.
  • Peptides are added directly to the plates.
  • the dendritic cells (2x10 4 cells / well) or the L-DP4 cells (3 ⁇ 10 4 cells / well) are added to the plates with CD4 + T lymphocytes (2x10 3 to 10 4 cells / well) and incubated overnight at 37 ° C. C, in the presence or absence of a single peptide, a mixture of peptides or recombinant HIV protein.
  • HIV-specific and HLA-DP4 restricted lines were demonstrated when the mixture of seven and six peptides, respectively, for stimulation was used; these lines are stimulated by the mixture of peptides (mix) presented by HLA-DP4 but not in the absence of the mixture or HLA-DP4 (Tables V and VI, Figure 1).
  • Each line responds to at least one of the peptides of each of the mixtures.
  • Five peptides are recognized by at least one of the lines (RT 338-352, Env 031-045, Env 388-402, Env 620-634 and mutant Vif 061-075 (SEQ ID NO: 5)), indicating that at least five of the seven peptides tested are immunogenic in an HLA-DP4 context (Tables V and VI).
  • CD4 + T lymphocyte lines specific for the Env 31-45 or RT 338-352 peptides were analyzed by an ELISPOT assay for PIFN- ⁇ assay, in the presence of immature autologous dendritic cells loaded with 1 native antigen (Gp 120 or recombinant RT) or the derivative peptide (Env 31-45 or RT 338-352), or uncharged.
  • ELISPOT assay for PIFN- ⁇ assay, in the presence of immature autologous dendritic cells loaded with 1 native antigen (Gp 120 or recombinant RT) or the derivative peptide (Env 31-45 or RT 338-352), or uncharged.
  • Three CD4 + T lymphocyte lines are specific for the RT 338-352 peptide (lines 157.49, 157.53 and 157.13, FIG.
  • a CD4 + T cell line is specific for the Env 31-45 peptide (line 156.66, Figure 2A); this line is stimulated by dendritic cells loaded with envelope protein (Env or Gp120) but is not stimulated by dendritic cells loaded with reverse transcriptase (RT) or derivative peptide (RT 338-352).
  • concentration of peptide making it possible to obtain a stimulation of the lines equal to 50% of the maximum stimulation is of the order of 10 -8 to 10 -7 M (FIG. 2B).
  • the HLA-DP4 ligand peptides are immunogenic as they induce HIV-specific CD4 + T cell lines capable of
  • Table VIII Binding activities of the variants * of the RT 338-352 peptide with respect to the HLA-DP4 molecules (IC 50 in nM)
  • Two variants are capable of stimulating both CD4 + T cell lines specific for the HXB2 sequence
  • four variants are able to stimulate one of them (Figure 3).
  • Overall analysis of the Env 31-45 peptide sequence indicates that it is not conserved since the HXB2 sequence is present in only 3.9% of the isolates analyzed. However, a more detailed analysis shows that the central region of this peptide (positions 34-42) which comprises the sequence located between the anchoring residues P1 and P9 is highly conserved and present in 80% of the isolates analyzed.
  • RT338-352 and Env 31-45 peptides are capable of inducing CD4 + T cells capable of recognizing HIV variants.

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Abstract

La présente Invention est relative à des peptides antigéniques du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) comprenant au moins un épitope T CD4+ qui est restreint à une molécule HLA-DP4, et à leurs applications vaccinales et diagnostiques.

Description

EPITOPES T CD4+ DU VIH RESTREINTS A HLA-DP4 ET LEURS APPLICATIONS
La présente Invention est relative à des peptides antigéniques du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) comprenant au moins un épitope T CD4+ qui est restreint à une molécule HLA-DP4, et à leurs applications vaccinales et diagnostiques.
Les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle essentiel dans le contrôle de l'infection par le VIH comme l'atteste la fréquence élevée de lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH chez les individus non-progresseurs qui sont infectés depuis plus de 12 ans et ne développent pas la maladie (SIDA) en l'absence de tout traitement antiviral ; à l'opposé, on observe des taux faibles ou indétectables de lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH chez la majorité des individus présentant une séro- conversion récente ou une infection chronique par le VIH, et qui ne sont pas traités.
En effet, les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle majeur dans l'induction et la maturation de l'immunité humorale et cellulaire. Par l'intermédiaire de contacts cellulaires et la sécrétion de nombreuses cytokines, ils induisent l'activation des cellules présentatrices d'antigène (APC pour Antigen Presenting CeIl) qui à leur tour recrutent des cellules T CD8+ spécifiques du VIH. Ils interviennent également dans la maturation des cellules effectrices que sont les lymphocytes T cytotoxiques. Enfin, ils peuvent jouer eux-mêmes le rôle d'effecteurs en produisant des lymphokines anti-virales comme PIFN-γ et le TNF-α. Ainsi, la diminution du taux de lymphocytes T CD4+ qui réduit l'efficacité du système immunitaire, est une cause majeure de progression vers la maladie lors de l'infection par le VIH.
L'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la pré- sentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur d'histo- compatibilité de type II que portent les cellules présentatrices d'antigène ; chez l'homme, elles sont dénommées molécules HLA II pour Human Leucocyte Antigen type IL Ces peptides antigéniques, appelés épitopes T, résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par les cellules présentatrices d'antigène. Ils ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA II. Il est bien connu qu'au même titre que l'antigène natif, un peptide comprenant un épitope T CD4+ est capable de stimuler in vitro des lymphocytes T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les recruter in vivo. Il est donc suffisant pour induire une réponse T CD4+.
Ces observations sont en faveur de l'utilisation de tels peptides antigéniques spécifiques du VIH et capables de stimuler une forte réponse T CD4+, pour la préparation d'une composition vaccinale anti-VIH chez l'Homme, notamment en association avec d'autres épitopes B ou T CD8+ du VIH.
En effet, même si les progrès considérables dans le domaine de la chimiothérapie permettent d'espérer le rétablissement d'une immunité normale chez les patients infectés par le virus, l'induction d'une réponse antivirale protectrice nécessite, dans la majorité des cas, un traitement spécifique tel qu'un vaccin.
De tels peptides qui sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH sont également utiles comme réactifs dans un test de diagnostic de l'infection ou de suivi du traitement chez l'Homme, reposant sur la détection directe (test de prolifération lymphocytaire) ou indirecte (production d'anticorps, de cyto- kines...) desdits lymphocytes T CD4+.
Toutefois, un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides comme antigène est l'identification des épitopes T CD4+, étant donné que leur séquence varie d'un individu à l'autre en raison du polymorphisme des molécules HLA IL En effet, les molécules HLA II sont des hétérodimères constitués d'une chaîne alpha (α) et d'une chaîne béta (β) polymorphes. Il existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP), dénommées en fonction de l'allèle codant la chaîne béta qui est la plus polymorphe. La molécule HLA-DR est très polymorphe. En effet, alors que sa chaîne alpha ne compte que 3 allèles, la chaîne béta (β) codée par le gène DRBl, qui est la plus exprimée, compte à ce jour 458 allèles. Pour les molécules HLA-DQ et HLA-DP, les deux chaînes (α et β) qui les constituent sont polymorphes mais elles présentent moins d'allèles. On a dénombré 8 allèles DQAl (chaîne α de HLA-DQ), 56 allèles DQBl (chaîne β de HLA-DQ), 20 allèles DPAl (chaîne α de HLA-DP) et 110 allèles DPBl (chaîne β de HLA-DP). Cependant, la combinaison entre les deux chaînes α et β codées par ces allèles donne naissance à de nombreuses molécules HLA-DQ et HLA-DP. Du fait de ce poly¬ morphisme, ces isoformes possèdent des propriétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Ainsi, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II qui le caractérisent. Comme il existe un grand nombre d'allèles HLA II, il existe donc dans une séquence donnée un répertoire important d'épitopes T de séquences très différentes, chacun spécifique d'un allèle différent.
Ainsi, un peptide capable de stimuler une réponse T CD4+ spécifique du VIH chez quelques individus peut être inactif chez la majorité des autres individus, parce que ces derniers ne reconnaissent pas les protéines du VIH par les mêmes épitopes. La plupart des épitopes T CD4+ du VIH déjà décrits sont localisés dans les protéines Gag, Env, PoI et Nef (Gag : Wilson et al., J. Virol., 2001, 75, 4195- 4207 ; Malhotra et al., J. Clin., Invest, 2001, 107, 505-517 ; Venturini et al., J. Virol., 2002, 76, 6987-6999 ; Boritz et al, J. Immunol., 2003, 170, 1107-1116 ; Kaufmann et al, J. Virol., 2004, 78, 4463-4477 ; Demandes Internationales WO 98/32456 et WO 01/24810 ; Eny_: Malhotra et al, J. Virol., 2003, 77, 2663-2674 ; Lekutis et al., J. Immunol., 1997, 159, 2049-2057 ; Demandes Internationales WO 98/32456 et WO 01/24810 ; PoI : Manca et al., J. Acquir. Immun. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 1995, 9, 227-237 ; Van der Burg et al., J. Immunol., 1999, 162, 152-160 ; Demandes Internationales WO 98/32456 et WO 01/24810 ; Nef : Wentworth et al, Vaccine, 1994, 12, 117- ; Kaufmann et al., précité ; Demandes Internationales WO 02/062834 et WO 01/24810).
Tous ces épitopes T CD4+ sont restreints à une molécule HLA DR ou DQ, à l'exclusion de celui porté par le peptide Nef 180-193 qui est restreint à HLA-DP5, une molécule non-prépondérante dans la population caucasienne (fréquence allélique de 1,3 %). Pour les molécules HLA-DR, une dizaine d'allèles sont nécessaires pour couvrir plus de 60 % de la fréquence génique retrouvée dans la population caucasienne et donc concerner plus de 85 % de cette population (Demande Internationale WO 02/062834). Ainsi, un peptide portant un épitope restreint à HLA- DR n'est généralement pas reconnu par l'ensemble des molécules HLA-DR prépondé- rantes dans la population (voir notamment le Tableau 4 de Kaufmann et al., précité et le Tableau VII de la Demande Internationale WO 02/062834). En conséquence, chaque peptide portant un épitope restreint à HLA-DR doit être testé vis-à-vis d'une dizaine de molécule HLA-DR afin de sélectionner les peptides reconnus par la majo¬ rité de ces molécules, et il est généralement nécessaire d'utiliser un mélange d'au moins deux ou trois peptides différents pour obtenir un vaccin efficace chez la majo¬ rité des individus de la population à vacciner. Les inventeurs ont identifié d'autres épitopes T CD4+ issus des protéines PoI (RT), Env, Vpr et Vif du VIH, qui sont restreints à une molécule HLA- DP4 et sont susceptibles d'induire, à eux seuls, une réponse T CD4+ spécifique du VIH, chez la majorité des individus vaccinés. En effet, les molécules HLA-DP4 sont très fréquentes, notamment dans la population caucasienne. Ainsi, deux molécules DP4 (DP401 et DP402) couvrent à elles seules la majorité de la fréquence allélique d'HLA-DP dans la population caucasienne (de l'ordre de 50 % en Europe et 80 % en Amérique du Nord) et sont également présentes à des fréquences non négligeables dans les autres populations (fréquence allélique de l'ordre de 60 % en Amérique du Sud, 60 % en Inde, 25 % en Afrique et 15 % au Japon). Chacune de ces molécules DP4 comprend une chaîne alpha codée, soit par Pallèle DPAl *0103 qui est le plus fréquent (78,2 %), soit par l'allèle DPAl*0201 (20,2 %) et une chaîne béta codée par l'allèle DPBl*0401 (molécule HLA-DP401) ou DPBl*0402 (molécule HLA-DP402).
La présente invention a en conséquence pour objet, un peptide du VIH comprenant un épitope T CD4+ apte à être présenté par une molécule HLA-DP4 et à induire des lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH, sélectionné dans le groupe constitué par : a) les fragments de 13 acides aminés consécutifs des protéines Env, RT, Vpr et Vif situés entre les positions suivantes :
- 339 à 351, 264 à 276, 347 à 359, 404 à 416, et 409 à 421 de la protéine RT,
- 32 à 44, 389 à 401, 484 à 496, 621 à 633, 671 à 683, 678 à 690, 685 à 697, 750 à 762 et 761 à 773 de la protéine Env,
- 16 à 28 et 62 à 74 de la protéine Vpr, et
- 62 à 74 de la protéine Vif, b) les fragments de 14 ou 15 acides aminés consécutifs desdites protéines RT, Env, Vif et Vpr, qui incluent les positions définies en a), et notamment les peptides RT 338-352, 263-277, 346-360, 403-417, 408-422 ; Env 31-45, 388-402, 483-497, 620-634, 670-684, 677-691, 684-698, 749-763 et 760-774, Vpr 15-29, 61-75 et Vif 61-75, et c) les variants des peptides définis en a) ou b), qui présentent une longueur identique et une activité de liaison à une molécule HLA-DP4 inférieure ou égale à 100O nM, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophylactique ou théra¬ peutique, ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH.
Les peptides selon l'invention présentent les propriétés suivantes :
- activité de liaison à HLA-DP4 : les peptides selon l'invention possèdent une forte affinité pour HLA-DP4 (activité de liaison < 1000 nM) ; l'activité de liaison peut être mesurée par un test de liaison HLA-DP4/peptide, en compétition, avec une révélation immuno-enzymatique, selon le principe décrit dans la Demande Internationale PCT WO 03/040299,
- immunogénicité : les peptides selon l'invention sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ chez la majorité des individus du fait de la prépondérance de la molécule HLA-DP4 dans la population caucasienne mais aussi dans les popula¬ tions d'Amérique du Sud et d'Inde, et dans une moindre mesure, dans celles d'Afrique et du Japon. Ces peptides sont également capables d'induire de façon efficace des lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH à partir des précurseurs présents chez la majorité des individus naïfs ou infectés, ou bien de stimuler de tels lymphocytes spécifiques du VIH présents chez la majorité des individus infectés. En outre, les lymphocytes T CD4+ induits par ces peptides reconnaissent l'épitope de l'antigène natif naturellement présenté par les cellules dendritiques ainsi que des variants naturels desdits peptides. En conséquence, de tels peptides représentent des candidats potentiels pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique contre l'infection par le VIH, particulièrement intéressants du fait qu'ils peuvent induire une réponse T CD4+ spécifique du VIH chez la majorité des individus de la population. En outre, les peptides dont la séquence est conservée dans les variants naturels du VIH ou qui présentent une réaction croisée avec des épitopes T CD4+ reconnus par des variants naturels du VIH sont capables d'induire une réponse T CD4+ vis-à-vis de variants naturels du VIH. L 'immunogénicité des peptides peut être déterminée, notamment à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs), par tout essai appro- prié connu de l'Homme du métier comme par exemple : un test de prolifération cellu¬ laire, un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou un test de dosage des cytokines intracellulaires (IFN-γ, IL-2, IL-4 et IL-IO).
L'invention englobe les peptides dont la séquence correspond à celle d'un fragment de la protéine Env, RT, Vpr et Vif de n'importe quel isolât de VIH (VIH-I ou VIH-2) incluant les variants naturels de VIH, isolés à partir d'individus infectés par le VIH. Les isolats de VIH-I sont classés en trois groupes (M, N (non-M, non-0) et O) qui sont divisés en sous-types ou clades en fonction de leur similarité génétique (gène Env) ; le groupe M comprend aux moins 9 sous-types (sous-types A à I), le sous-type B étant prédominant dans les pays occidentaux. Les séquences du génome et des protéines correspondantes des différents isolats de VIH sont disponibles dans les banques de données, notamment dans celle du NCBI ("http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ou du LANL (Los Alamos National Laboratory ; http://www.hiv.lanl.govy Les numéros d'accès NCBI K03455 et AF075719 comprennent respectivement, la séquence de référence du sous-type B du groupe M du VIH-I, dénommée HXB2, correspondant à l'isolât LAI, et la séquence de l'isolât MN. En outre, des séquences consensus définies à partir des variants naturels des différents isolats de VIH-I sont également disponibles dans les banques de données, notamment pour le sous-type B du groupe M du VIH-I (http://hiv.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M GROUP/Consensus.html).
Les positions des peptides issus des protéines RT, Vif, Vpr ou Env sont indiquées relativement à la séquence de référence HXB2. A partir de ces indica¬ tions, l'Homme du métier est en mesure de déterminer facilement les positions correspondantes dans les protéines d'autres isolats de VIH, qui peuvent varier de quelques acides aminés du fait de courtes insertions et/ou délétions dans la séquence en acides aminés desdites protéines.
L'invention englobe également les variants obtenus à partir des séquences précédentes par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du peptide, dès lors que ledit variant conserve une forte affinité pour HLA-DP4 (activité de liaison < 1000 nM) et est immunogène. Les résidus d'acides aminés impliqués dans la liaison à HLA-DP4 (rési¬ dus d'ancrage Pl, P4, P6 et P9) et l'effet des modifications de ces résidus sur la liaison à HLA-DP4 sont connus de l'Homme du métier ; la Demande Internationale PCT WO 03/040299 enseigne notamment que les résidus en P6, Pl et/ou P9 doivent être presque exclusivement aromatiques ou hydrophobes alors que le résidu en P4 peut être n'importe quel résidu d'acide aminé. Parmi ces variants, on peut citer ceux dans lesquels les résidus d'ancrage P6, Pl et/ou P9 sont inchangés, et au moins un des autres résidus d'acide aminé est modifié. Ces variants sont notamment les peptides comprenant la séquence de 9 acides aminés consécutifs des protéines Env, RT, Vpr et Vif incluant les résidus d'ancrage Pl, P4, P6 et P9, laquelle séquence correspond aux résidus situés des positions +3 à +11, relativement à la séquence des peptides de 13 acides aminés telle que définie ci-dessus. Il s'agit des peptides de 13 à 15 acides aminés incluant au moins la séquence qui est située entre les positions suivantes : 34 à 42, 391 à 399, 486 à 494, 623 à 631, 673 à 681, 680 à 688, 687 à 695, 752 à 760 et 763 à 771 de la protéine Env ; 341 à 349, 159-167, 266 à 274, 349 à 357, 406 à 414, et 411 à 419 de la protéine RT ; 18 à 26 et 64 à 72 de la protéine Vpr ; 64 à 72 de la protéine Vif.
L'invention englobe également les peptides modifiés dérivés des précédents par introduction de toute modification au niveau de résidu(s) d'acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides, dès lors que ledit peptide modifié conserve une forte affinité pour HLA-DP4 (activité de liaison < 1000 nM) et est immunogène. Ces modifications qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon non- limitative : la substitution d'un acide aminé par un acide aminé non-protéinogénique (acide aminé D ou analogue d'acide aminé) ; l'addition de groupement chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d'une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (-CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion d'un peptide (épitope d'intérêt pour la vaccination ; étiquette utile pour la purification du peptide, notamment sous forme clivable par une protéase) ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d'une protéine, notamment une chaîne α ou β d'une molécule HLA-DP4 ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne ; le couplage à une molécule appropriée, notamment un marqueur, par exemple un fluorochrome. Ces modifications sont destinées en particu- lier à augmenter la stabilité, la solubilité, l'immunogénicité ou à faciliter la purifica¬ tion ou la détection, soit du peptide selon l'invention, soit de cellules CD4+ spécifiques dudit peptide.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il est sélec- tionné dans le groupe constitué par les peptides RT 338-352, 339-351, 346-360, 347- 361, 403-417, 404-416, Env 31-45, 32-44, 388-402, 389-401, 483-497, 484-496, 620- 634, 621-633, 677-691, 678-690, 684-698, 685-697 et Vpr 15-29, 16-28, 61-75 et 62- 74. De préférence, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les peptides RT 338-352, 339-351, Env 31-45, 32-44, 388-402, 389-401, 620-634, 621- 633 et Vpr 15-29, 16-28, 61-75 et 62-74. De manière préférée, ledit peptide est sélec¬ tionné dans le groupe constitué par les peptides RT 338-352, Env 31-45, 388-402, et 620-634. De manière encore plus préférée, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les peptides RT 338-352 et Env 31-45.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide, sa séquence correspond à celle d'un isolât de VIH de type 1, de préférence du groupe M, de manière préférée ladite séquence correspond à la séquence de référence du sous- type B, dénommée HXB2 (numéro d'accès NCBI K03455).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2 à 7, 16 à 20, 22, 24 à 29, 38 à 42, 44 à 48 et 50 à 56.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide, il est marqué ou complexé ; il peut être notamment complexé à des molécules HLA-DP4 marquées (biotinylées) pour former des complexes HLA-DP4/peptides, en particulier des complexes multimériques comme des tétramères. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide, ladite molécule DP4 comprend une chaîne β codée par l'allèle DPBl * 0401 (molécule HLA-DP401) ou DPBl*0402 (molécule HLA-DP402) ; la chaîne α étant codée par l'allèle DPAl *0103 ou DPAl*0201.
La présente invention a également pour objet un fragment poly- épitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un peptide tel que défini ci-dessus, pour une utilisa- tion comme antigène dans la vaccination prophylactique ou thérapeutique, ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH.
De préférence, ledit fragment polyépitopique présente une longueur de 20 à 1000 acides aminés, de préférence de 20 à 100 acides aminés. Ledit fragment polyépitopique comprend avantageusement une étiquette fusionnée à l'une de ses extrémités, pour la purification ou la détection dudit fragment. L'étiquette, notamment une séquence polyhistidine ou un épitope B d'un autre virus, est de préférence séparée de la séquence polyépitopique par un site de clivage d'une protéase de façon à isoler la séquence polyépitopique, à partir de la fusion.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment polyépi¬ topique, il comprend la concaténation d'au moins un épitope T CD4+ tel que défini ci- dessus et un épitope sélectionné dans le groupe constitué par :
- un épitope T CD8+ d'une protéine de VIH présenté par une molécules HLA I et reconnu par des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du VIH ; les séquences des épitopes T CD 8+ du VIH sont disponibles dans la banque de données du LANL (http://www.hiv.lanl.gov/content/immunologv/maps/ctl/ctl.pdf),
- un épitope T CD4+ de la protéine Nef de VIH, notamment un épitope se liant à au moins une molécule HLA DR prépondérante dans la population caucasienne, tel que défini dans la Demande Internationale PCT WO 02/062834 (Nef 1-36, 66-94, 74-88, 77-91, 137-168, 139-153, 175-190, 182-198, 178-192, 181-195, 183-197, 187-201 et 189-203),
- un épitope T CD4+ universel naturel ou synthétique tel que le peptide de la toxine tétanique TT 830-846 (O1SULLIVAN et al., J. Immunol., 1991, 147, 2663-2669), le peptide de Phémagglutinine du virus de la grippe HA 307-319 (O'SULLIVAN et al, précité), le peptide PADRE (KXV AA WTLKAA; Alexander et al, Immunity, 1994, 1, 751-761), le peptide 45-69 de la protéine Nef du VIH-I et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falciparum tels que le peptide CS.T3 (SINIGAGLIA et al., Nature, 1988, 336, 778-780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-I et EXP-I (DOOLAN et al., J. Immunol., 2000, 165, 1123-1137),
- un épitope B constitué par un sucre (ALEXANDER et al., précité), ledit épitope B étant de préférence sous la forme d'un glycopeptide, et - un épitope B d'une protéine du VIH reconnu spécifiquement par des anticorps dirigés contre le VIH ; les séquences des épitopes B du VIH sont dispo¬ nibles dans la banque de données du LANL (http://www.hiv.lanl.gov/content/imrnunology/rnaps/ab/ab.pdf). La combinaison de l'épitope T CD4+ avec l'un au moins des épitopes tels que définis ci-dessus permet avantageusement de déclencher ou de moduler une réponse immunitaire anti-VIH.
La présente invention a également pour objet un lipopeptide comprenant un peptide ou un fragment polyépitopique tels que définis ci-dessus, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophylactique et thérapeutique ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH.
Ledit lipopeptide est notamment obtenu par addition d'un lipide sur une fonction α-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé dudit peptide ou fragment polyépitopique ; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexa- décanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d'un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe Nα-acétyl-lysine Nε(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam). La présente invention a également pour objet une protéine de fusion constituée par une protéine ou un fragment de protéine, fusionnés avec un peptide ou un fragment polyépitopique tels que définis ci-dessus, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophylactique et thérapeutique ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH. Le peptide ou le fragment polyépitopique peuvent être fusionnés avec l'extrémité NH2 ou COOH de ladite protéine ou insérés dans la séquence de ladite protéine.
Avantageusement ladite protéine de fusion est constituée par un peptide du VIH tel que défini ci-dessus, fusionné avec l'une des chaînes d'une molécule HLA-DP4, de préférence la chaîne béta, ou bien avec un fragment de celle- ci correspondant à une molécule HLA-DP4 soluble, notamment un fragment corres¬ pondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d'un peptide signal hétérologue. Ledit peptide du VIH est avantageusement inséré entre le peptide signal et l'extrémité NH2 du domaine extracellulaire de la chaîne β, comme décrit pour la molécule HLA-DR ( Kolzin et al., PNAS, 2000, 97, 291-296).
Alternativement, ledit peptide du VIH ou ledit fragment polyépi- topique sont fusionnés avec une protéine facilitant leur purification ou leur détection, connue de l'Homme du métier comme notamment la Glutathione-S- Transférase (GST) et les protéines fluorescentes (GFP et dérivées). Dans ce cas, la séquence du peptide ou du fragment polyépitopique d'intérêt est de préférence séparée du reste de la protéine par un site de clivage d'une protéase, pour faciliter la purification dudit peptide ou dudit fragment polyépitopique.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un peptide, un fragment polyépitopique ou une protéine de fusion tels que définis ci-dessus, pour une utilisa¬ tion comme antigène dans la vaccination prophylactique ou thérapeutique de l'infection par le VIH.
Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant ledit peptide ou fragment polyépitopique ou ladite protéine de fusion. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée. En outre, ledit poly- nucléotide peut être lié à au moins une séquence hétérologue.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétéro¬ logue relativement à une séquence d'acide nucléique codant un peptide du VIH, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant ledit peptide du VIH. Conformément à l'invention ledit vecteur recombinant comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les AAV et les baculovirus, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que Pélectroporation ou la microinjec¬ tion. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utili¬ sant l'électroporation associée à des liposomes.
La présente invention a également pour objet une composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide du VIH, un fragment polyépitopique, un lipopeptide ou un vecteur tels que défini ci- dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou une substance porteuse, et/ou un adjuvant.
La composition immunogène selon l'invention se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse), entérale (orale, sublinguale), ou locale (rectale, vaginale).
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés. Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par : des émulsions huileuses, des substances minérales, des extraits bactériens, la saponine, l'hydroxyde d'alumine, le monophosphoryl -lipide A et le squalène.
Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nano- particules. De préférence, ladite composition immunogène comprend au moins un peptide du VIH incluant un épitope T CD4+ restreint à HLA-DP4 tel que défini ci- dessus et un autre peptide du VIH incluant un épitope T CD8+, sous forme d'un mélange de peptides, d'un fragment polyépitopique ou d'un vecteur d'expression codant lesdits peptides ou ledit fragment.
De manière préférée, ladite composition comprend également, au moins un autre peptide incluant un épitope sélectionné dans le groupe constitué par : un épitope T CD4+ de la protéine Nef du VIH, un épitope T CD4+ universel, un épitope B constitué par un sucre et un épitope B du VIH tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide, d'un fragment polyépitopique, d'un lipopeptide ou d'un vecteur tels que défini ci-dessus, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement de l'infection par le VIH chez un individu HLA-DP4 positif.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu HLA-DP4 positif, vis-à-vis du VIH.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic de l'état immunitaire d'un individu vis-à-vis du VIH, la détection de la présence chez ledit individu, de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène du VIH. Cette détection permet le suivi de l'évolution de la réponse T CD4+ spécifique du VIH au cours de l'infection naturelle ou bien d'un traitement antiviral ou d'une vaccination anti-VIH.
La détection est effectuée à partir d'un échantillon biologique conte¬ nant des lymphocytes T CD4+, notamment un échantillon de cellules mononucléées isolées à partir d'un prélèvement de sang périphérique (PBMCs). La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu vis-à-vis du VIH, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un peptide tel que défini ci-dessus, et - la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène du
VIH (RT, Vif, Vpr ou Env), par tout moyen approprié. La présente invention a également pour objet un kit de détection de l'état immunitaire d'un individu vis-à-vis du VIH, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide tel que défini ci-dessus, associé à un moyen de détection de lympho¬ cytes T CD4+ spécifiques d'un antigène du VIH. La détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, est effectuée par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut utiliser des moyens directs comme la cytométrie de flux en présence de complexes multimériques, ou bien des moyens indirects comme les tests de prolifération lymphocytaire et les dosages de cytokines telles que l'IL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et l'IFN-γ, notamment par des techniques immunoenzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT) ou par cytométrie de flux (dosage des cytokines intracellulaires). De manière plus précise :
Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence desdits peptides et au besoin de cellules présentatrices appro¬ priées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hétérologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La présence de lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH dans la suspension initiale est détectée à l'aide des peptides du VIH, selon l'une des méthodes suivantes : * test de prolifération :
La prolifération des lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules. * test ELISPOT :
Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécré¬ tant de cytokines (IL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et l'IFN-γ), spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus. Le principe de ce test est décrit dans Czerkinsky et al., J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121 et Schmittel et al, J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167-174, et sa mise en œuvre est illustrée dans la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al., J. Virol., 2000, 74, 1694-1703. * détection des cvtokines :
La présence de cellules T spécifiques du VIH, sécrétant des cyto- kines telles que l'IL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et PIFN-γ est détectée, soit par dosage des cytokines présentes dans le surnageant de culture, par un test immunoenzymatique, notamment à l'aide d'un kit commercial, soit par détection des cytokines intra¬ cellulaires en cytométrie de flux. Le principe de détection des cytokines intra¬ cellulaires est décrit dans Goulder et al. , J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832 et Maecker et al., J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40 et sa mise en œuvre est illustrée dans Draenert et al., J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19-29. * complexes multimériques .
- un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), est mis en contact avec des complexes multimériques marqués, notamment par un fluorochrome, formés par la liaison entre des molécules HLA-DP4 solubles et des peptides du VIH tels que définis ci-dessus, et - les cellules marquées par lesdits complexes multimériques sont analysées, notamment par cytométrie de flux.
De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec lesdits complexes, on l'enrichit en lymphocytes T CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4. Les complexes multimériques HLA-DP4/peptide peuvent être prépa¬ rés à partir de molécules natives extraites de cellules exprimant HLA-DP4 ou de molécules recombinantes produites dans des cellules hôte appropriées comme précisé, par exemple dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) ou dans KURODA et al. (J. Viral., 2000, 74, 18, 8751-8756). Ces molécules HLA-DP4 peuvent notamment être tronquées (délétion du domaine transmembranaire) et leur séquence peut-être modifiée afin de les rendre solubles ou bien de faciliter l'appariement des chaînes alpha et béta (Novak et al., précité).
Le chargement de molécules HLA-DP4 avec le peptide peut se faire par mise en contact d'une préparation de molécules HLA-DP4 comme ci-dessus, avec le peptide. Par exemple, des molécules HLA-DP4 solubles et biotinylées sont incubées, pendant 72 heures à 370C, avec un excès d'un facteur 10 de peptides du VIH tels que définis ci-dessus, dans un tampon phosphate-citrate 10 mM, NaCl 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7.
Alternativement, la séquence du peptide peut-être introduite dans l'une des chaînes de la molécule DP4 sous forme d'une protéine de fusion qui permet la préparation de complexes multimériques HLA-DP4/peptides à partir de cellules hôtes appropriées exprimant ladite protéine de fusion. Lesdits complexes peuvent ensuite être marqués, notamment par la biotine.
Les complexes multimériques de type tétramère sont notamment obtenus en ajoutant aux molécules HLA-DP4 chargées, de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mole) par rapport aux molécules HLA-DP4. L'ensemble étant ensuite incubé pendant une durée suffisante, par exemple une nuit à température ambiante.
Les complexes multimériques peuvent également être formés, soit par incubation de monomères HLA-DP4/peptides avec des billes magnétiques couplées à la streptavidine comme décrit pour les molécules HLA I (Bodinier et al., Nature, 2000, 6, 707-710), soit par insertion de monomères HLA-DP4/peptides dans des vésicules lipidiques comme décrit pour les molécules du CMH de classe II murines (Prakken, Nature Medicine, 2000,6, 1406-1410).
Pour utiliser ces complexes multimériques HLA-DP4/peptide notamment de type tétramère, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec des peptides du VIH tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) avec des complexes multimériques HLA-DP4/peptide à une concentration appropriée (par exemple de l'ordre de 10 à 20 μg/ml), pendant une durée suffisante pour permettre la liaison entre les complexes et les lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH (par exemple, de l'ordre de 1 à 3 heures). Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les complexes multimériques qui sont fluorescents.
La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les complexes multimériques HLA-DP4/peptide des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire.
La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène du VIH, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact d'un échantillon cellulaire avec des complexes multimériques HLA-DP4/peptide marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA-DP4 solubles avec au moins un peptide du VIH tel que défini ci-dessus, et
- le tri des cellules liées auxdits complexes HLA-DP4/peptide, notamment en cytométrie de flux.
La présente invention a en outre pour objet un peptide tel que défini ci-dessus, à l'exclusion des peptides RT 338-352, 403-417, Env 483-497, 684-698 et Vpr 15-29.
La présente invention a en outre pour objet un fragment poly- épitopique, un lipopeptide, un polynucléotide, une cassette d'expression, un vecteur recombinant dérivés des peptides précédents.
L' invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant au moins un poly¬ nucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et b) des vecteurs recombinants comprenant un polynucléotide conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs sont des vecteurs d'expression comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
Les polynucléotides, les vecteurs recombinants et les cellules trans¬ formées tels que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des peptides, fragments polyépitopiques et protéines de fusion selon l'invention. Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Lïbrary of Congress, USA). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.
Les peptides et leurs dérivés (variants, peptides modifiés, lipo- peptides, fragments polyépitopiques, protéines de fusion) tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote).
De manière plus précise,
- les peptides et leurs dérivés (variants, fragments polyépitopiques) peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse,
- les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. - les peptides et dérivés tels que les variants, les fragments poly¬ épitopiques et les protéines de fusion peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier ; l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention, avec référence au dessin annexé dans lequel : - la figure 1 illustre l'immunogénicité in vitro de 6 peptides du VIH-
1 (RT 338-352, Vpr 015-029, Vpr 061-075, Env 031-045, Env 388-402 et Env 602- 634) et d'un mutant du peptide Vif 061-075 du VIH-I, présentant une forte affinité pour les molécules HLA-DP401 et DP402, mesurée par un test ELISPOT, à partir de lignées de lymphocytes T CD4+ issues de trois individus séronégatifs : P51, P 123 et P48; les lymphocytes T ont été préalablement stimulés in vitro par des cellules dendritiques de ce même individu chargées par le mélange de peptides, puis le nombre de lymphocytes T sécréteurs d'IFN-γ a été mesuré en présence de cellules L-DP4 non chargées et chargées par ces peptides seuls ou en mélange (Mix) ou bien en l'absence de peptides (O). Les valeurs indiquées correspondent au nombre de lymphocytes T sécréteurs d'IFN-γ pour 5000 lymphocytes T CD4+ testés (SFC/5000 LT).
- la figure 2 illustre l'analyse de la reconnaissance de l'antigène natif et des peptides Env 31-45 et RT 338-352 par quatre lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques desdits peptides (lignée 156.66 spécifique de Env 31-45 et lignées 157.49, 157.53 et 157.13 spécifiques de RT 338-352)), par un test ELISPOT de dosage de l'IFN-γ. A : ELISPOT en présence de cellules dendritiques immatures autologues chargées avec l'antigène natif (Gpl20 ou RT recombinantes) ou le peptide dérivé (Env 31-45 ou RT 338-352 ; 10 μg/ml) ou non chargées (-). B : ELISPOT en présence de cellules L-DP4 et de concentrations croissantes de peptides (M ; 10"10 à 10"5 M) ou sans peptide (O). Chaque valeur correspond à la moyenne de deux points expérimen¬ taux. ** et * correspondent respectivement à p < O, 01 et p < 0,05.
- la figure 3 illustre l'analyse de la reconnaissance dé variants par trois lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques des peptides Env 31-45 ou RT 338-
352 (lignée 156.66 spécifique de Env 31-45 et lignées 157.53 et 157.13 spécifiques de RT 338-352)), par un test ELISPOT de dosage de l'IFN-γ, en présence de cellules L- DP4 et de l'un des variants (10 μg/ml) ou sans peptide (-). Chaque barre correspond à la moyenne de deux points expérimentaux. ** et * correspondent respectivement à p < 0, 01 et p < 0,05.
EXEMPLE 1 : ACTIVITE DE LIAISON DES PEPTIDES DU VIH VIS-A-VIS DES MOLECULES HLA-DP401 et DP402 1) Matériels et méthodes a) Peptides Des peptides de 13 et 15 acides aminés (13-mères et 15-mères) représentatifs des protéines p24, RT, Vif, Vpr et Env du VIH-I ont été sélectionnés en fonction de la présence de plusieurs résidus aromatiques ou hydrophobes qui sont les principaux résidus d'ancrage pour les molécules HLA-DP.
Les séquences des peptides sélectionnés sont présentées dans la liste de séquences jointe en annexe et les Tableaux II et III. Tous les peptides correspondent à la séquence de référence HXB2 (numéro d'accès NCBI K03455) à l'exclusion des séquences Env 749-763 (SEQ ID NO : 9) et Env 750-762 (SEQ ID NO : 31) qui correspondent à celles de l'isolât MN (numéro d'accès NCBI AF075719), ainsi que des séquences SEQ ID NO : 5 (Vif 61-75) et 27 (Vif 62-74) dans lesquelles les résidus G70 et W71 ont été inversés par rapport à la séquence HXB2 qui présente la séquence WG et non GW, aux positions 70 et 71 de la séquence de la protéine Vif. Cette inversion a été corrigée dans les séquences SEQ ID NO : 57 (Vif 61-75) et SEQ ID NO : 58 (Vif 62-74).
En outre, des variants des peptides de 15 acides aminés RT 338-352 et Env 31-45 correspondant à des variants naturels du groupe M de VIH-I fréquem¬ ment isolés, dont la séquence est disponible dans la banque de données du LANL (http://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/map), ont également été synthétisés [SEQ ID NO : 45 à 52 (Tableau VIII) et SEQ ID NO : 53 à 56 (Tableau IX)].
Les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS). b) Test de liaison HLA-DP4/peptide
Les tests de liaisons aux molécules HLA-DP4 codées par les allèles DPBl*0401 et DPBl*0402, dénommées respectivement DP401 et DP402 sont des tests de liaison en compétition avec une révélation immuno-enzymatique décrits dans la Demande Internationale PCT WO 03/040299. De manière plus précise, le peptide Oxy 271-287
(EKKYFAATQFEPLAARL, SEQ ID NO : 59) biotinylé au niveau du résidu NH2 terminal, selon le protocole décrit dans Texier et al., J. Immunol., 2000, 164, 3177-3184), est utilisé comme peptide traceur dans les conditions telles que précisées dans Ie Tableau ci-après. TABLEAU I : Conditions des tests de liaison aux molécules HLA-DP4
Allèles Traceurs Concentration du pH Temps traceur optimal d'incubation (nM) (h)
DBP 1*401 Oxy 271-287 10 5 24 DPB 1*402 Oxy 271-287 10 5 24
2) Résultats
La majorité (39 sur 44) des peptides issus de la séquence de réfé¬ rence du groupe M du VIH-I se lient avec une bonne affinité (IC50 < 1000 nM) à l'une au moins des molécules DP4 (Tableau II et III). Par exemple, pour les 15-mères : 17 peptides se lient avec une bonne affinité à DP401, 15 peptides se lient avec une bonne affinité à DP402 et 14 peptides se lient avec une bonne affinité aux deux molécules DP4. Les 13-mères et les 15-mères se lient à DP401 et DP402 avec des activités de liaison comparables.
Tableau II : Activités de liaison des 15-mères vis-à-vis des molécules HLA-DP4 (IC50 en nM)
SEQ
Fr0" ID peptide Séquence* DP DP NO : (%) 401 402
822 2739
1 21 RT 263-277 K L N W A S Q I Y P G I K V R ± 106 ± 354
34 31
2 65 RT 338-352 T Y Q I Y Q E P F K N L K T G
+ 6 ± 4
424 114
3 8 RT 346-360 F K N L K T G K Y A R M R G A + 35 ± 21
106 45
4 28 RT 403417 T E Y W Q A T W I P E W E F V ± 53 ±7
5*** - VIF 061-075 D A R L V I T T Y G W L H T G 142 140
42 52
6 0,1 VPR 061-075 I R I L Q Q L L F I H F F R I
± 16 ± 25
12 7
7 0,4 ENV 388-402 T Q L F N S T W F N S T W S T
±0 ± 2
1000 2000
8 1 ENV 670-684 W N W F N I T N W L W Y I K L ± 0 ± 0
9** ENV 749-763 V H G F L A I I W V D L R S L 794 1775
2427 3217
10 44 P24029-043 E K A F S P E V I P M F S A L ± 850 ± 1550
917 149
11 87 P24 130-144 Y K R W I I L G L N K I V R M ± 1200 ± 28
3744 3947
12 12 RT 005-019 T L N F P I S P I E T V P V K ± 2800 + 212
967 456
13 55 RT 156-170 S P A I F Q S S M T K I L E P ± 177 ± 85
27589 2569
14 58 RT 249-263 K D S W T V N D I Q K L V G K ± 17000 ± 566
630 1849
15 81 RT 408-422 A T W I P E W E F V N T P P L ± 28 + 71
62 57
16 2 VPR 015-029 H N E W T L E L L E E L K S E
± 11 ± 11
4 22
17 10 ENV 031-045 T E K L W V T V Y Y G V P W W
+ 0 ± 4
424 194
18 27 ENV 483-497 L Y K Y K V V K I E P L G V A ± 35 ± 71
305 387
19 0,1 ENV 677-691 W L W W Y I K L F I M I V G G + 216 ± 141
173 364
20 1 ENV 684-698 L F I M I V G G L V G L R I V
+ 35 ± 790
624 406
21 21 ENV 760-774 L R S L C L F S Y H R L R D L ± 35 ± 120
35 794
22 0,3 ENV 620-634 E Q I W N H T T W M E W D R E
± 15 ± 141
1332 359
57° 7 VIF 061-075 D A R L V I T T Y W G L H T G ± 20 ± 57
* les résidus d'ancrage à DP4 (Pl, P4, P6 et P9) sont indiqués en gras ** séquence de l'isolât MN
*** inversion des résidus G70 et W71 par rapport à la séquence HXB2
° séquence de l'isolât HXB2
°° Fréquence de la séquence du peptide dans les 457 séquences disponibles dans la banque de données du VIH (Los Alabamos HIV databases http://hiv-web.lanl.gov').
Tableau III: Activités de liaison des 13-mères vis-a-vis des molécules HLA-DP4 (IC 50 en nM)
SEQ Conser DP DP ID N" peptide Séquence* vation 401 402
23 RT 264-276 L N W A S Q I Y P G I K V 4/7 13000 3695
24 RT 339-351 Y Q I Y Q E P F K N L K T 5/7 92 3,5
25 RT 347-359 K N L K T G K Y A R M R G 2/7 2541 27
26 RT 404-416 E Y W Q A T W I P E W E F 7/7 2655 35
VIF 062-074 A R L V I T T Y G W L H T 3/8 96 5,0
28 VPR 062-074 R I L Q Q L L F I H F F R 6/8 275 6,5
29 ENV 389-401 Q L F N S T W F N S T W S 1/8 64 1,3
30 ENV 671-683 N W F N I T N W L W Y I K 2/8 881 537
31** ENV 750-762 H G F L A I I W V D L R S 3/6 5224 24
32 P24 030-042 K A F S P E V I P M F S A 8/9 15000 1407
33 P24 131-143 K R W I I L G L N K I V R 8/9 6618 28
34 RT 006-018 L N F P I S P I E T V P V 6/7 5514 647
35 RT 157-169 P A I F Q S S M T K I L E 6/7 2814 28
36 RT 250-262 D S W T V N D I Q K L V G in 8500 212
37 RT 409-421 T W I P E W E F V N T P P 6/7 5000 453
38 VPR 016-028 N E W T L E L L E E L K S 5/8 28 OJ
39 ENV 032-044 E K L W V T V Y Y G V P W 7/8 8,7 3,5
40 ENV 484-496 Y K Y K V V K I E P L G V 4/8 1568 68
41 ENV 678-690 L W W Y I K L F I M I V G 6/8 272 105
42 ENV 685-697 F I M I V G G L V G L R I 7/8 >10000 57
43 ENV 761-773 R s L C L F S Y H R L R D 5/8 >10000 351
44 ENV 621-633 Q I W N H T T W M E W D R 1/8 30 150
* les résidus d'ancrage à DP4 (Pl, P4, P6 et P9) sont indiqués en gras ** séquence de l'isolât MN
*** inversion des résidus G70 et W71 par rapport à la séquence HXB2
Les tests d'immunogénicité ont été réalisés avec six ou sept peptides présentant une forte affinité pour DP401 et DP402 (peptides RT 338-352, Vpr 015- 029, Vpr 061-075, Env 031-045, Env 388-402 et Env 620-634, avec ou sans le mutant de Vif 061-075 (SEQ ID NO :5)).
EXEMPLE 2 : IMMUNOGENICITE DES PEPTIDES DU VIH IN VITRO
La capacité des peptides ayant une bonne affinité pour les molécules
HLA-DP4 à induire in vitro une stimulation de lymphocytes T spécifiques a été évaluée à partir de prélèvements sanguins de personnes séronégatives pour le VIH. Il s'agit d'évaluer la capacité à recruter des lymphocytes précurseurs CD4+ alors qu'ils sont chez un individu naïf à une très faible fréquence, c'est-à-dire d'effectuer une immunisation in vitro au moyen de ces peptides. 1) Matériels et méthodes a) individus testés
Des prélèvements sanguins ont été effectués sur huit personnes HLA-DP4 positives et séronégatives pour le VIH. Les allèles du gène DPBl de ces individus sont présentés dans le Tableau IV.
Tableau IV : Allèles DPBl des individus testés
Figure imgf000024_0001
b) Obtention de lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH et restreintes à HLA-DP4
Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été séparées sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs ont ensuite été mises en culture dans du milieu AIM V (LIFE TECHNOLOGIES) et incubées dans des flasques, à l'étuve à 37°C en présence de 5% CO2. Après une nuit d'incubation, les cellules non adhérentes ont été récupérées, puis les lymphocytes T CD4+ ont été purifiés à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps anti-CD4 (colonne LS+, MYLTENYI) et congelés. Les cellules adhérentes ont été incubées pendant 5 jours, dans du milieu AIM-V contenant lOOOU/ml de GM-CSF et lOOOU/ml d'IL-4 recombinantes (R&D SYSTEMS), puis les cellules différenciées en cellules dendritiques (cellules dendritiques immatures) ont ensuite été cultivées pendant 2 jours, en présence de 1 μg/ml de LPS, 1000 U/ml d'IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF, de manière à induire leur maturation. Les cellules dendritiques matures (10 000 cellules/puits) ont alors été incubées avec le mélange de peptides (10 μg de chaque peptide dans du milieu IMDM (IN VITROGEN) supplémenté avec de la glutamine (24 mM, SIGMA), de l'asparagine (55 mM, SIGMA), de l'arginine (150 mM, SIGMA), de la pénicilline (50 Ul/ml, IN VITROGEN), de la streptomycine (50 μg/ml, IN VITROGEN) et 10 % de sérum humain), pendant 4 heures à 370C. Les cellules dendritiques matures ont ensuite été lavées puis incubées, en présence des lymphocytes T CD4+ (100 000 cellules/puits) préalablement décongelés, dans du milieu contenant 1000 U/ml d'IL-6 et 10 ng/ml d'IL-12. Après 7 jours (J7), la culture a été restimulée une première fois, au moyen de cellules dendritiques matures préalablement décongelées et chargées par le mélange de peptides, dans du milieu contenant de l'IL-2 (10 U/ml) et de l'IL-7 (5 ng/ml). Après deux stimulations supplémentaires (Jl 4 et J21), dans les conditions précédentes, les cellules ont été testées en ELISPOT, 6 jours au moins après la dernière stimulation. c) Analyse de la spécificité des lignées en ELISPOT
Des anticorps anti-IFN-γ (1-D1K, MABTECH) dilués à 1 μg/ml dans du tampon PBS ont été adsorbés sur des plaques de nitrocellulose (MILLIPORE) pendant 1 heure à 37°C. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS puis saturées avec du milieu ISCOVE contenant 10 % de sérum humain du groupe AB (100 μl/puits), pendant 2 h à 37 0C. Les cellules présentatrices d'antigène sont, soit des cellules dendritiques autologues immatures préparées comme précisé ci-dessus, soit des cellules HLA-DP4 positives (lignée L-DP4 de fibroblastes transfectés par l'ADNc codant pour une molécule DP402 ; Yu et al. Hum. Immunol., 1990, 27, 132- 135) qui permettent de vérifier la spécificité des peptides vis-à-vis de la molécule HLA-DP4. Les protéines recombinantes du VIH (RT de l'isolât HXB2 du VIH-I ou GP 120 de HIV-IIB, NIBSC, Royaume Uni) sont incubées avec les cellules dendritiques immatures pendant 4 h à 37 0C, puis les cellules dendritique sont lavées avant d'être utilisées. Les peptides sont ajoutés directement dans les plaques. Les cellules dendritiques (2x104 cellules/puits) ou les cellules L-DP4 (3x104 cellules/puits) sont ajoutées dans les plaques avec les lymphocytes T CD4+ (2x103 à 104 cellules/puits) et incubées une nuit à 37 °C, en présence ou en l'absence d'un seul peptide, d'un mélange de peptides ou bien de protéine recombinante du VIH. Après un lavage avec du tampon PBS Tween 0,05%, puis avec du PBS seul, 100 μl d'anticorps secondaire anti-IFN-γ conjugué à la biotine (7-B6-l-biotin, MABTECH), dilué à 0,25 μg/ml dans du PBS contenant 1% BSA, a été ajouté dans chaque puits. Après une heure d'incubation, les plaques ont été lavées à nouveau et incubées avec 100 μl/puits d'Extravidin-AKP (E-2636, SIGMA,), diluée au 1/6000. Après lavage des plaques en tampon PBS, 100 μl de substrat NBT/BCIP (B-5655, SIGMA) dilué dans de l'eau (1 tablette dans 10 ml d'eau) ont été distribués dans chaque puits. La révélation immunoenzymatique a été arrêtée après environ 10 minutes, par rinçage extensif des plaques dans l'eau, et les spots colorés ont été comptés à l'aide d'un automate (AID). Le contrôle de restriction comprend les lignées de lymphocytes T et l'antigène (peptide(s) ou protéine du VIH) sans les cellules L-DP4. Les points expérimentaux ont été dupliqués. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du t test. Une réponse est considérée comme positive lorsqu'elle est au moins trois fois supérieure à celle obte¬ nue avec le contrôle sans peptide. 2) Résultats a) Induction de lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH par les peptides ligands de DP4
25 et 23 lignées spécifiques du VIH et restreintes à HLA-DP4 ont été mises en évidence lorsque l'on utilise le mélange de respectivement sept et six peptides, pour la stimulation ; ces lignées sont stimulées par le mélange de peptides (mix) présenté par HLA-DP4 mais pas en l'absence du mélange ou d'HLA-DP4 (Tableaux V et VI ; figure 1).
Tableau V : Immunogénicité des peptides*
Figure imgf000026_0001
* Stimulation avec le mélange des 7 peptides : RT 338-352, Vpr 015-029, Vpr 061-075, Env 031-045, Env 388-402, Env 620-634 et mutant de Vif 061-075 (SEQ ID NO : 5) ** cinq donneurs ont été testés : P48, P51, Pl 19, P120 et P123 Tableau VI : Immunogénicité des peptides''
Figure imgf000027_0001
* Stimulation avec le mélange des 6 peptides : RT 338-352, Vpr 015-029, Vpr 061-075,
Env 031-045, Env 388-402 et Env 620-634
** huit donneurs ont été testés : P48, P51, Pl 19, P120, P123, P147, P156 et P157
Chaque lignée répond à au moins un des peptides de chacun des mélanges. Cinq peptides sont reconnus par au moins une des lignées (RT 338-352, Env 031-045, Env 388-402, Env 620-634 et mutant de Vif 061-075 (SEQ ID NO :5)), indiquant qu'au moins cinq des sept peptides testés sont immunogènes dans un contexte HLA-DP4 ( Tableaux V et VI).
Parmi ces peptides, deux sont très conservés entre les différents sous-types du groupe M du VIH-I (RT 338-352 et Env 31-45), un peptide est moyen¬ nement conservé (Vif 061-075) et les deux autres (Env 388-402 et Env 620-634) sont peu conservés ( Tableau VII).
Tableau VII : Conservation des peptides au sein du groupe M
Figure imgf000027_0002
b) reconnaissance de l'antigène natif par les lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques des peptides du VIH
La reconnaissance de l'antigène natif par les lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques des peptides Env 31-45 ou RT 338-352 a été analysée par un test ELISPOT de dosage de PIFN-γ, en présence de cellules dendritiques autologues immatures chargées avec l'antigène natif (Gp 120 ou RT recombinantes) ou le peptide dérivé (Env 31-45 ou RT 338-352), ou bien non chargées. Trois lignées de lympho¬ cytes T CD4+ sont spécifiques du peptide RT 338-352 (lignées 157.49, 157.53 et 157.13, figure 2A) ; ces lignées sont stimulées par les cellules dendritiques chargées avec la transcriptase inverse (RT) mais ne sont pas stimulées par les cellules dendritiques chargées avec la protéine d'enveloppe (Env ou Gpl20) ou le peptide dérivé (Env 31-45). En revanche, une lignée de lymphocytes T CD4+ est spécifique du peptide Env 31-45 (lignée 156.66, figure 2A) ; cette lignée est stimulée par les cellules dendritiques chargées avec la protéine d'enveloppe (Env ou Gpl20) mais elle n'est pas stimulée par les cellules dendritiques chargées avec la transcriptase inverse (RT) ou le peptide dérivé (RT 338-352). La concentration de peptide permettant d'obtenir une stimulation des lignées égale à 50 % de la stimulation maximale, est de l'ordre de 10~8 à 10"7 M (Figure 2B).
Les peptides ligands d'HLA-DP4 sont immunogènes étant donné qu'ils induisent des lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH capables
H d'être stimulées de façon efficace en leur présence et de reconnaître l'épitope de l'antigène natif naturellement présenté par les cellules dendritiques. c) reconnaissance des variants du VIH par les lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques des peptides
L'effet des mutations naturelles du VIH sur la liaison des peptides à HLA-DP4 et la stimulation des lymphocytes T CD4+ a été analysée pour les peptides RT 338-352 et Env 31-45 (Tableaux VIII et IX ; figure 3).
Tableau VIII : Activités de liaison des variants* du peptide RT 338-352 vis-à-vis des molécules HLA-DP4 (IC50 en nM)
SEQ lD
DP DP NO : Variant de
Séquence** RT 338-352 401 402
55 35
45 G352R T Y Q I Y Q E P F K N L K T R ± 23 ± 0
30 45
46 K350R T Y Q I Y Q E P F K N L R T G
± 1 ± 7
35 23
47 N348I T Y Q I Y Q E P F K I L K T G
+ 5 ± 23
160 145
48 F346Y T Y Q I Y Q E P Y K N L K T G ± 64 ± 7
49 F346H T Y Q I Y Q E P H K N L K T G >10000 > 10000
88 44
50 P345T T Y Q I Y Q E F K N L K T G ± 36 ± 27
50 58
51 P345Q T Y Q I Y Q E Q F K N L K T G ± 32 ± 5
90 56
52 Y342F T Y Q I F Q E P F K N L K T G ± 4 ± 34 * les résidus mutés sont soulignés
** les résidus d'ancrage à DP4 (Pl, P4, P6 et P9) sont indiqués en gras Tableau IX : Activités de liaison des variants* du peptide Env 31-45 vis-à-vis des molécules HLA-DP4 (IC50 en nM)
SEQ
Variant de DP DP ID NO : Séquence** Env 31-45 401 402
53 T31A,K33N,W44V A E N L W V T V Y Y G V P V W 9 32
T31A, K33Q,
54 W44V A E Q L W V T V Y Y G V P V W 4 10
T31V, E32G,
55 K33N, W44V V G N L W V T V Y Y G V P V W 10 36
T31 M, E32G,
56 K33N, W44V M G N L W V T V Y Y G V P V W 9 34
* les résidus mutés sont soulignés
** les résidus d'ancrage à DP4 (Pl, P4, P6 et P9) sont indiqués en gras Le peptide RT 338-352 est très conservé ; sur les 457 séquences analysées, 298 séquences (65 %) sont identiques à celles de l'isolât HXB2. L'analyse de l'activité de liaison à HLA-DP4 de 8 des variants les plus fréquents parmi les 47 variants répertoriés (Tableau VIII), montre que tous les variants sont susceptibles d'être présentés par une molécule HLA-DP4 à l'exclusion du variant F346H (ou 346H) qui possède un résidu d'histidine défavorable à l'ancrage dans la poche P6. Deux variants (K350R et G352R ou 350R et 352R) sont capables de stimuler les deux lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques de la séquence d'HXB2, et quatre variants (N348I, F346H, F346Y et Y342F ou 3481, 346H, 346Y et 342F) sont capables de stimuler l'une d'entre elles (figure 3). L'analyse globale de la séquence du peptide Env 31-45 indique qu'il n'est pas conservé dans la mesure où la séquence d'HXB2 n'est présente que dans 3,9 % des isolats analysés. Toutefois, une analyse plus fine montre que la région centrale de ce peptide (positions 34-42) qui comprend la séquence située entre les résidus d'ancrage Pl et P9 est très conservée et présente chez 80 % des isolats analysés. L'activité de la liaison des variants des séquences flanquant la région centrale montre que tous les variants testés (AEN, AEQ, VGN, MGN ; SEQ ID NO : 53 à 56) sont susceptibles d'être présentés par une molécule HLA-DP4 (Tableau IX) et de stimuler des lymphocytes T spécifiques de la séquence d'HXB2 (figure 3).
Ces résultats indiquent que les peptides RT338-352 et Env 31-45 sont capables d'induire des lymphocytes T CD4+ capables de reconnaître des variants du VIH.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Peptide du VIH comprenant un épitope T CD4+ apte à être pré¬ senté par une molécule HLA-DP4 et à induire des lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH, sélectionné dans le groupe constitué par : a) les fragments de 13 acides aminés consécutifs des protéines Env,
RT, Vpr et Vif situés entre les positions suivantes :
- 339 à 351, 264 à 276, 347 à 359, 404 à 416, et 409 à 421 de la protéine RT,
- 32 à 44, 389 à 401, 484 à 496, 621 à 633, 671 à 683, 678 à 690, 685 à 697, 750 à 762 et 761 à 773 de la protéine Env,
- 16 à 28 et 62 à 74 de la protéine Vpr, et
- 62 à 74 de la protéine Vif, b) les fragments de 14 ou 15 acides aminés consécutifs desdites protéines RT, Env, Vif et Vpr, qui incluent les positions définies en a), et c) les variants des peptides définis en a) ou b), qui présentent une longueur identique et une activité de liaison à une molécule HLA-DP4 inférieure ou égale à 1000 nM, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophy¬ lactique ou thérapeutique, ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH.
2°) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence correspond à celle d'un isolât de VIH de type 1.
3°) Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite séquence correspond à la séquence de référence HXB2, présentant le numéro d'accès NCBI K03455.
4°) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caracté- risé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les peptides RT 338-352, Env 31-45, Env 388-402 et Env 620-634.
5°) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caracté¬ risé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2 à 7, 16 à 20, 22, 24 à 29, 38 à 42, 44 à 48 et 50 à 56. 6°) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caracté¬ risé en ce qu'il est marqué ou complexé. 7°) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est complexé à des molécules HLA-DP4 marquées.
8°) Fragment polyépitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophylactique ou thérapeutique, ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH.
9°) Fragment polyépitopique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la concaténation d'au moins un épitope T CD4+ du VIH tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5 et un épitope sélectionné dans le groupe constitué par :
- un épitope T CD 8+ d'une protéine du VIH5
- un épitope T CD4+ de la protéine Nef du VIH, notamment Nef 1- 36, 66-94, 74-88, 77-91, 137-168, 139-153, 175-190, 182-198, 178-192, 181-195, 183-197, 187-201 ou 189-203,
- un épitope T CD4+ universel naturel ou synthétique tel que le peptide TT 830-846, PADRE, le peptide 45-69 de la protéine Nef du VIH-I et les peptides CS.T3, CSP, SSP2, LSA-I et EXP-I,
- un épitope B constitué par un sucre, de préférence sous la forme d'un glycopeptide, et/ou
- un épitope B d'une protéine du VIH.
10°) Protéine de fusion comprenant une protéine ou un fragment de protéine, fusionné à un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou un fragment polyépitopique tel que défini à la revendication 8 ou la revendica- tion 9, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophylactique ou thérapeutique ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH.
11°) Protéine de fusion selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite protéine ou ledit fragment est sélectionné dans le groupe constitué par une chaîne alpha ou béta d'une molécule HLA-DP4 ou un fragment de ladite chaîne correspondant à une molécule HLA-DP4 soluble.
12°) Lipopeptide obtenu par addition d'un lipide sur une fonction α- aminée ou une fonction réactive de la chaîne latérale d'un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'un fragment polyépitopique selon la revendication 8 ou la revendication 9, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophylactique ou thérapeutique ou bien le diagnostic de l'infection par le VIH. 13°) Vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, un fragment polyépitopique tel que défini à la revendication 8 ou la revendication 9 ou une protéine de fusion telle que définie à la revendication 10, sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduc- tion, pour une utilisation comme antigène dans la vaccination prophylactique ou thérapeutique contre l'infection par le VIH.
14°) Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 5, un fragment polyépitopique tel que défini à la revendication 8 ou la revendication 9, un lipopeptide tel que défini à la revendication 12 ou un vecteur d'expression tel que défini à la revendication 13, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou une substance porteuse, et/ou un adjuvant.
15°) Composition immunogène selon la revendication 14, caractéri¬ sée en ce qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5 et un autre peptide incluant un épitope T CD8+ du VIH, ou bien un fragment polyépitopique comprenant lesdits peptides, tel que défini à la revendica¬ tion 9 ou un vecteur d'expression codant lesdits peptides ou ledit fragment, tel que défini à la revendication 13.
16°) Composition immunogène selon la revendication 15, caractéri- sée en ce qu'elle comprend au moins un peptide incluant un épitope sélectionné dans le groupe constitué par un épitope T CD4+ de la protéine Nef du VIH, un épitope T CD4+ universel, un épitope B constitué par un sucre et un épitope B du VIH, tels que définis à la revendication 9.
17°) Utilisation d'un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, d'un fragment polyépitopique tel que défini à la revendication 8 ou la revendication 9, d'un lipopeptide tel que défini à la revendication 12 ou d'un vecteur d'expression tel que défini à la revendication 13, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection par le VIH chez un individu HLA-DP4 positif.
18°) Utilisation d'un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immuni - taire d'un individu HLA-DP4 positif, vis-à-vis du VIH.
19°) Méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu vis-à- vis du VIH, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, et - la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène du
VIH.
20°) Procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène du VIH, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact d'un échantillon cellulaire avec des complexes multimériques marqués, formés par la liaison de molécules HLA-DP4 solubles avec au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, et
- le tri des cellules liées auxdits complexes HLA-DP4/peptide.
21°) Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, à l'exclusion des peptides RT 338-352, RT 403-417, Env 483-497, Env 684-698 et Vpr 15-29.
22°) Fragment polyépitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un peptide selon la revendication 21.
23°) Protéine de fusion comprenant une protéine ou un fragment de protéine, fusionné à un peptide selon la revendication 21 ou un fragment poly¬ épitopique selon la revendication 22.
24°) Polynucléotide codant pour un peptide selon la revendication 21, un fragment polyépitopique selon la revendication 22 ou une protéine de fusion selon la revendication 23. 25°) Vecteur d'expression comprenant un polynucléotide selon la revendication 24 sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduction. 26°) Cellule hôte modifiée par un polynucléotide selon la revendi¬ cation 24 ou un vecteur d'expression selon la revendication 25.
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