WO2006015996A1 - Modelo animal de enfermedades neurodegenerativas, procedimiento de obtención y aplicaciones - Google Patents

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Eva María CARRO DÍAZ
José Luis TREJO PÉREZ
Carlos Spuch Calvar
Delphine Bohl
Jean-Michel Heard
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Definitions

  • the invention relates, in general, to the treatment of neurodegenerative diseases; and, in particular, with the development of nonhuman animals useful as models of human neurodegenerative diseases.
  • Alzheimer's disease a typical case of neurodegenerative disease with dementia, is the fourth leading cause of death in industrialized countries, with around 13 million affected individuals, a number that could be greater as there are approximately 25% of cases that They are not diagnosed.
  • the prognosis for the coming years is a dizzying growth in the number of affected people that could exceed 40 million in industrialized countries where there is an aging population (Dekosky et al. (2001) Epidemiology and Pathophysiology of Alzheimer's disease, Clinical Cornestone 3 (4): 15-26).
  • There are currently few effective medications for the treatment of Alzheimer's disease and the cost of treating this disease per patient is currently quite expensive, estimated at around US $ 225,000, according to data from the American Alzheimer's Association.
  • the existence of this serious health problem with a very limited number of useful medicines has driven the development of research aimed at knowing the etiopathogenic mechanism of said neurodegenerative disease with the objective of identifying and evaluating potentially therapeutic compounds against said disease.
  • Alzheimer's disease In the case of Alzheimer's disease, one of the main advances has been precisely to identify the proteins involved in familial Alzheimer's disease, which is not associated with aging such as sporadic Alzheimer's disease, which is by far the most frequent form of the disease (Mayeux R (2003)
  • mice that express large amounts of one of the mutated forms of the human ⁇ -amyloid precursor protein (APP-Swe695) with mice expressing mutated forms of presenilins generate hybrids that have amyloid plaques along with neurofibrillar clews and Cognitive deficits (Duff K, Eckman C, Zehr C, Yu X, Prada CM, Perez-tur J, Hutton M, Buee L, Harigaya Y, Yager D, Morgan D, Gordon MN, Holcomb L, Refolo L, Zenk B, Hardy J, Younkin S (1996) Increased amyloid-beta42 (43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1.
  • Duff K Eckman C, Zehr C, Yu X, Prada CM, Perez-tur J, Hutton M, Buee L, Harigaya Y, Yager D, Morgan D, Gordon MN, Holcomb L, Refolo L, Zenk B, Hardy J, Younkin S
  • these transgenic animal models are the only ones accepted for the study of pathogenic mechanisms of Alzheimer's disease and for the pharmaceutical screening of new drugs. Given the disparity of models that have been generated in order to recreate and analyze each of the possible causes of the disease, their availability in many cases is restricted by issues of property rights and above all, by the lack of material resources needed to generate complex hybrids (Oddo S, Caccamo A, Shepherd JD, Murphy MP, Golde TE, Kayed R, Metherate R, Mattson MP, Akbari Y, LaFerla FM (2003) Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular A ⁇ and synaptic dysfunction. Neuron 39: 409-421). This means severe limitations on the widespread use of these models.
  • IGF-I insulin growth factor-I
  • IL-12-I insulin receptor
  • the invention faces the problem of providing new animal models of human neurodegenerative diseases, such as human neurodegenerative diseases that occur with dementia, among which is Alzheimer's disease.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have observed that the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the choroid plexus of the ventricles of an animal's brain allows the development of a model animal of neurodegenerative diseases, in general, and, in In particular, an animal model of human neurodegenerative diseases that occur with dementia, such as Alzheimer's disease, which has the main characteristics of this human disease, which is easy to obtain and can be used in laboratory animals with any genetic background.
  • a vector containing a mutated form of the IGF-I receptor was injected by stereotactic surgery into the lateral ventricles of the brain that eliminates the functional activity of this trophic factor at the choroid plexus level by acting as negative dominant (Example 1).
  • Alzheimer's pathology appears 3 to 6 months after the injection of the vector depending on the genetic background of the host animal, so that animals with genetic modifications that can potentially modulate the onset of Alzheimer's disease type neuropathology of this disease appears earlier (Examples 2 and 3).
  • the invention relates to a non-human animal useful as an experimental model characterized in that it presents an alteration of the biological activity of the IGF-I receptor located in the cells of the epithelium of the choroid plexus of the cerebral ventricles.
  • Said non-human animal is useful as an experimental model of neurodegenerative diseases, in particular, human neurodegenerative diseases that occur with dementia, such as Alzheimer's disease.
  • the invention relates to a method for obtaining said non-human animal useful as an experimental model comprising the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the choroid plexus of said non-human animal by A process of transgenesis.
  • the invention relates to the use of said non-human animal as an experimental model for the study of the etiopathogenic mechanism of a neurodegenerative disease or for the identification and evaluation of therapeutic compounds against said disease.
  • said disease Neurodegenerative is a human neurodegenerative disease that develops with dementia, such as Alzheimer's disease.
  • One of the advantages of the experimental model developed by this invention is that it perfectly reflects the pathology of Alzheimer's disease, so that this model represents a qualitative leap in the study of the etiopathogenic mechanism of said neurodegenerative disease as well as in the development of tools effective for the identification and evaluation of therapeutic compounds against said disease.
  • Figure 1 is a photo showing that the HIV / GFP lentiviral vector allows the expression of the transgene in the choroid plexus cells, the expression of green GFP autofluorescent protein (green) being observed in choroid plexus cells (arrows) of adult rat after intracerebroventricular (icv) injection of the HIV / GFP vector.
  • the photo shows choroid plexus cells of an animal that received, 3 months before being sacrificed, a single icv injection of the HIV / GFP lentiviral vector.
  • Figure 2 shows that administration of the HIV / IGF-IR.KR (HIV / KR) vector to cultured epithelial cells obtained from the choroid plexus of postnatal rats results in a loss of response to IGF-I. Only in cells infected with KR (HIV + KR + A ⁇ and HIV + KR + IGF + A ⁇ ), but not in those transfected with an empty HIV vector (HIV), IGF-I does not promote A ⁇ 1-40 peptide transcytosis. * P ⁇ 0.05 vs all other groups.
  • Figure 3 shows that learning (A) and spatial memorization (B) are diminished in HIV / IGF-IR.KR rats since the latter learn more slowly and worse than control rats (HIV) in the Morris test , consisting of memorizing the position of a platform covered by water in a pool where the animal swims without being able to rest more than on the platform.
  • Figure 4 shows the levels of A ⁇ in cerebral cortex (A) and cerebrospinal fluid (CSF) (B) of rats injected with the HIV / IGF-IR.KR vector (HIV / KR). While there is an increase in brain levels of A ⁇ there is a decrease in parallel in the CSF, indicative of a decrease in A ⁇ clearance.
  • the levels were determined by immunoblots densitometry using anti-A ⁇ antibodies. Representative immunoblots are shown.
  • Calbindin levels, a neuronal protein are also assessed to show that the differences are not due to the amount of total protein in each experimental group. * P ⁇ 0.05 vs control (rats injected with empty HIV).
  • Figure 5 shows the levels of hyperphosphorylated tau (HPF-tau) in the cerebral cortex of rats injected with the HIV / IGF-IR.KR vector (HIV / KR).
  • Figure 5A shows the levels of HPF-tau in the cerebral cortex of rats injected with the HIV / IGF-IR.KR vector (HIV / KR) and with the control vector (HlV-control). The levels were determined by immunoblots densitometry with anti-HPF-tau antibodies. * P ⁇ 0.05 vs control.
  • Figure 5B shows the results of a confocal microscopy analysis of the tissue location of HPF-tau deposits.
  • Figure 6 shows an Alzheimer's neuropathology in mice with modified genetic background.
  • Figure 6A shows that old LID mice (more than 15 months) treated with the HIV / IGF-IR.KR vector (HIV / KR) [LID-HIV / IGF-IR.KR] practically did not learn in the Morris test . While old control mice or LIDs that receive only the viral vector control [LID-HIV] learn and retain similarly learned, LID-HIV / IGF-IR.KR mice, where IGF-I receptor signaling in The choroid plexus has been canceled, they learn significantly worse (* P ⁇ 0.001 vs controls).
  • Figure 6B shows that LID-HIV / IGF-IR.KR animals have accumulations of A ⁇ (immunopositive for A ⁇ , marked with asterisks in the panel at higher magnification) in telencephalic areas that are barely observed in LID-HIV control mice ( bottom panel).
  • One aspect of the present invention relates to a non-human animal useful as an experimental model, hereinafter animal model of the invention, characterized in that it exhibits an alteration of the biological activity of the insulin-like growth factor receptor type I (IGF -I) located in the epithelial cells of the choroid plexus of the cerebral ventricles.
  • IGF -I insulin-like growth factor receptor type I
  • non-human animal refers to a non-human mammalian animal of any genetic background, preferably laboratory animals such as rodents, more preferably rats and mice, or non-human primates.
  • any genetic background refers to both a normal non-human animal and a transgenic non-human animal.
  • abnormal applied to animals, as used in the present invention, refers to animals that lack transgenes that could be involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases, for example, human neurodegenerative diseases that occur with dementia, such like Alzheimer's disease.
  • transgenic refers to animals that contain a transgene that could be implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases, for example, human neurodegenerative diseases that occur with dementia, such as Alzheimer's disease, and includes, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, transgenic animals of the following group: LID mice (Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B , LeRoith D (1999) Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I.
  • LID mice Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B , LeRoith D (1999) Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I.
  • the alteration of the biological activity of the function of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the choroid plexus of the cerebral ventricles of the model animal of the invention will, in general, consist in the functional cancellation of its biological activity (biological cancellation).
  • Said alteration of the biological activity of the function of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the choroid plexus of the cerebral ventricles may be due to the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor due to the expression of a polynucleotide whose Nucleotide sequence encodes a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor.
  • said polynucleotide encodes a dominant non-functional mutated form of the human IGF-I receptor.
  • said dominant non-functional mutated form of the human IGF-I receptor is selected from the non-functional mutated form of the IGF-I receptor called IGF-IR.KR which has the K1003R mutation, in which the Usina residue of position 1003 of the amino acid sequence of the human IGF-I receptor has been replaced by an arginine residue and the non-functional mutated form of the IGF-I receptor called IGF-IR.KA which presents the Kl 003 A mutation, in which the Usina residue at position 1003 of the amino acid sequence of the human IGF-I receptor has been replaced by an alanine residue (Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D ( 1993) Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (I
  • the numbering system used to number the amino acid residues of the human IGF-I receptor is the one followed by UUrich et al. (Ullrich A. et al. (1985) Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Nature 313: 756-761; Ullrich A. et al. (1986) Insulin-like growth factor I receptor primary structure: comparison with insulin receptor suggests structural determinants that define functional specificity EMBO J. 1986 Oct; 5 (10): 2503-2512).
  • said alteration of the biological activity of the function of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the choroid plexus of the cerebral ventricles may be due to the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor due to the expression of a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes an element that inhibits the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its functional activity.
  • the term "IGF-I receptor gene expression inhibitor element capable of nullifying its functional activity” refers to a protein, enzymatic activity or nucleotide sequence, RNA or DNA, chain single or double, which inhibits the translation to mRNA protein of the IGF-I receptor.
  • said polynucleotide can be a polynucleotide that encodes a specific antisense nucleotide sequence of the gene or mRNA sequence of the IGF-I receptor, or a polynucleotide encoding a specific ribozyme of the IGF-I receptor mRNA either a polynucleotide encoding a specific aptamer of the IGF-I receptor mRNA, or a polynucleotide encoding a small interference RNA (siRNA) specific for the IGF-I receptor mRNA.
  • siRNA small interference RNA
  • the model animal of the invention can have any genetic background; however, in a particular embodiment said model animal of the invention comes from a normal animal, advantageously, from a healthy normal animal, that is, lacking a diagnosed pathology, such as a healthy rat (Example 2), while in Another particular embodiment said model animal of the invention comes from a transgenic animal, such as from a LID transgenic mouse (Example 3).
  • the animal model of the invention is an animal useful as an experimental model of neurodegenerative diseases, for example, neurodegenerative diseases that occur with dementia.
  • said neurodegenerative diseases are human neurodegenerative diseases, more preferably, human neurodegenerative diseases that occur with dementia.
  • said human neurodegenerative disease that is dementia is Alzheimer's disease. Alzheimer's disease accounts for 60% of cases of dementia while microvascular or multi-infarct disease accounts for 20% of them. Other minor causes of dementia are chronic alcohol and drug abuse and very low incidence neurological diseases such as Pick and Creutzfeldt-Jacob diseases.
  • the invention relates to the use of the animal model of the invention as an experimental model of neurodegenerative diseases, such as neurodegenerative diseases that occur with dementia; preferably, said neurodegenerative diseases are human neurodegenerative diseases, such as human neurodegenerative diseases that occur with dementia, for example, Alzheimer's disease.
  • model animal of the invention for the study of the etiopathogenic mechanisms of neurodegenerative diseases, in particular, human neurodegenerative diseases and, more particularly, diseases Human neurodegeneratives with dementia, such as Alzheimer's disease, as well as the use of the model animal of the invention for the identification and evaluation of potentially therapeutic compounds against such diseases constitute additional aspects of the present invention.
  • the model animal of the invention can be obtained by a transgenesis process that allows the functional cancellation of the IGF-I receptor in the choroidal plexus epithelial cells of said model animal of the invention.
  • the invention relates to a method for obtaining the model animal of the invention, hereinafter procedure of the invention, which comprises the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the Choroid plexus of said model animal of the invention by a process of transgenesis.
  • transgenesis process refers to any technique or procedure that allows the integration into a series of cells of a living organism of an exogenous gene, or "transgene”, without affecting all of the cells of said organism, and which confers said cells and the organism that carries them a new biological property.
  • Said transgene or exogenous gene refers to a DNA that is not normally resident, nor present in the cell to be transformed.
  • the process of transgenesis to obtain the model animal of the invention can be applied to both fully developed animals and to embryos thereof provided that it allows the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the plexus. choroid of said fully developed model animal.
  • said transgenesis process leading to the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor comprises the transformation of epithelial cells of the choroid plexus of a fully developed non-human animal, so as to express a non-functional mutated form IGF-I receptor dominant.
  • This objective can be achieved by the administration to epithelial cells of the choroid plexus of said non-human animal of a gene construct comprising a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor in order to transform said cells epithelials of the choroid plexus so that they express said mutated form not dominant functional of the IGF-I receptor.
  • said gene construct is included within a vector, such as, for example, an expression vector or a transfer vector.
  • vector refers to systems used in the process of transferring an exogenous gene or an exogenous gene construct into a cell, thereby allowing the stable vehicle transport of genes and constructs.
  • exogenous gene Said vectors can be non-viral vectors or viral vectors, preferably viral vectors since transgenesis with viral vectors has the advantage of being able to direct the expression of a foreign gene in adult tissues with relative precision and is one of the reasons why raises its general use for gene therapy (Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 177-211).
  • the invention has been exemplified by the use of lentiviral vectors. These vectors are easy to use and their main advantages include their effective transduction, their genomic integration and their persistent or prolonged expression.
  • Other appropriate viral vectors include retroviral, adenoviral or adeno-associated vectors (Consiglio A, Quattrini A, Martino S, Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, Marchesini S, Cestari V, Oliver A, Bordignon C, Naldini L (2001)
  • lentiviral vectors correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.
  • lentiviral vectors include human immunodeficiency virus type 1 (HIV-I), from which numerous appropriate vectors have been developed.
  • lentiviruses suitable for use as vectors include the group of primate lentiviruses including human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), human immunodeficiency virus type 3 (HIV-3), the virus Apes immunodeficiency (SIV), Apes AIDS retrovirus (SRV-I), type 4 human T-cell lymphotropic virus (HTL V4), as well as groups of bovine lentiviruses, equine lentiviruses, feline lentiviruses, lentiviruses sheep / goats and murine lentiviruses.
  • the invention provides a vector, such as a viral vector, specifically, a lentiviral vector, useful for obtaining an animal model of the invention, which is useful as an experimental model of neurodegenerative diseases, namely, as a model of human neurodegenerative diseases in progress. with dementia, such as Alzheimer's disease. Said vector as well as its obtaining will be described in detail later.
  • the administration of said gene construct comprising a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor, or of said vector comprising said gene construct, to the epithelial cells of the choroid plexus of the non-human animal a transform can be carried out by any conventional method; however, in a particular embodiment, the administration of said vector to said choroidal plexus epithelial cells is carried out by intracerebroventricular injection (icv).
  • icv intracerebroventricular injection
  • a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor includes any mutated form of the IGF-I receptor that acts as a negative dominant by recombination with the endogenous normal IGF-I receptor. , canceling its biological function, in the course of the procedure developed by the present invention.
  • Said dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor is expressed by epithelial cells of the choroid plexus of the model animal of the invention as a consequence of its transformation with a gene construct comprising a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes said dominant non-functional mutated form. of the IGF-I receptor.
  • said polynucleotide encodes a dominant non-functional mutated form of the human IGF-I receptor.
  • said polynucleotide encodes a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor of a non-human animal species, such as a mammal, for example, a rodent or a non-human primate.
  • the dominant IGF-I receptor is selected from the non-functional mutated forms of the human IGF-I receptor called IGF-IR.KR and IGF-IR.KA in this description, previously defined.
  • the non-human animal whose epithelial cells of the choroid plexus of the cerebral ventricles are going to be transformed by transgene administration can have any genetic background.
  • the process of the invention is embodied, in a specific embodiment, in a process for obtaining a model animal of the invention in which the vector used is the HIV-I derived lentiviral vector called HIV / IGF-IR.KR ( HIV / KR) in this description, the dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor is the non-functional mutated form of the human IGF-I receptor called IGF-IR.KR and the non-human animal whose choroidal plexus epithelial cells have been transformed is a normal healthy adult rat (Example 2).
  • the process of the invention is embodied, in another specific embodiment, in a process for obtaining a model animal of the invention in which the vector used is the lentiviral vector called HIV / IGF-IR.KR (HIV / KR ), the dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor is the non-functional mutated form of the human IGF-I receptor called IGF-IR.KR and the non-human animal whose choroidal plexus epithelial cells have been transformed is a transgenic mouse LID (Example 3).
  • the alteration of the biological activity of the IGF-I receptor function in the epithelial cells of the choroid plexus of the cerebral ventricles may be due to the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor.
  • said transgenesis process of canceling the functional activity of the IGF-I receptor comprises the transformation of epithelial cells of the choroid plexus of a non-human animal by the introduction of a gene construct comprising a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes an inhibitor element of the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its biological activity, said inhibitor element being selected from: a) an antisense nucleotide sequence specific to the gene sequence or the mRNA of the receptor of IGF-I, b) a ribozyme specific to the IGF-I receptor mRNA, c) an IGF-I receptor mRNA specific aptamer, and d) an interference RNA (iRNA) specific to the IGF-I receptor mRNA.
  • said gene construct is included within a vector, such as, for example, an expression vector or a transfer vector. The characteristics of said vector have been previously defined.
  • nucleotide sequences a) -d) mentioned above prevent the expression of the gene in mRNA or mRNA in the IGF-I receptor protein, and, therefore, nullify its biological function, and can be developed by an expert in the genetic engineering sector based on existing knowledge in the state of the art on transgenesis and cancellation of gene expression (Clarke, AR (2002) transgenesis Techniques Principles and Protocols, 2nd Ed Humana Press, Cambridge University;.. Patent US20020128220 Gleave. , Martin. TRPM-2 antisense therapy; Puerta-Ferández E et al. (2003) Ribozymes: recent advances in the development of RNA tools.
  • the invention relates to a vector useful for the implementation of the method of obtaining the model animal of the invention.
  • Said vector may be a non-viral vector or, advantageously, a viral vector, as previously mentioned, and comprises a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor or a polynucleotide whose sequence nucleotide encodes an element that inhibits the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its functional activity, together with, optionally, the elements necessary to allow its expression in cells of non-human animals.
  • Such vectors may be in the form of artificial or chimeric viral particles.
  • said vector is a lentiviral vector comprising a polynucleotide whose nucleotide sequence is selected from a nucleotide sequence encoding a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor and a nucleotide sequence encoding an element.
  • IGF-I receptor gene expression inhibitor capable of canceling its functional activity.
  • the nucleotide sequence encoding a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor is selected from non-functional mutated forms of the human IGF-I receptor designated IGF-IR.KR and IGF-IR.KA in this description, previously defined.
  • the nucleotide sequence encoding an inhibitor of the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its functional activity is selected from a sequence encoding: a) a sequence-specific antisense nucleotide sequence of the IGF-I receptor mRNA gene, b) a specific ribozyme of the IGF-I receptor mRNA, c) a specific IGF-I receptor mRNA aptamer, and d) a specific interference RNA (iRNA) of the IGF-I receptor mRNA.
  • iRNA specific interference RNA
  • the invention provides, in a specific embodiment, a lentiviral vector obtainable by transient transfection in packaging cells of: a plasmid (i) comprising a nucleotide sequence selected from: - a nucleotide sequence encoding a dominant non-functional mutated form of the receptor of IGF-I, and
  • nucleotide sequence encoding an element that inhibits the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its functional activity a plasmid (ii) comprising the nucleotide sequence encoding the Rev protein; a plasmid (iii) comprising the nucleotide sequence encoding the Rev response element (RRE); and a plasmid (iv) comprising the nucleotide sequence encoding the heterologous vector envelope.
  • Plasmid (i) is a vector, such as a transfer or expression vector, that carries a gene construct comprising the transgene in question and a functional promoter in the packaging cells that allows the vector to be transcribed to be generated in a manner Efficient in packaging cells.
  • said plasmid (i) comprises a nucleotide sequence encoding a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor selected from the non-functional mutated forms of the human IGF-I receptor called IGF-IR.KR and IGF-IR.KA in this description, previously defined.
  • said plasmid (i) comprises a nucleotide sequence encoding an element that inhibits the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its selected functional activity from a sequence encoding: a) a nucleotide sequence specific antisense of the sequence of the gene or mRNA of the IGF-I receptor, b) a ribozyme specific of the mRNA of the IGF-I receptor, c) a specific aptamer of the mRNA of the IGF-I receptor, and d) an RNA of specific interference (iRNA) of the IGF-I receptor mRNA.
  • a nucleotide sequence specific antisense of the sequence of the gene or mRNA of the IGF-I receptor b) a ribozyme specific of the mRNA of the IGF-I receptor, c) a specific aptamer of the mRNA of the IGF-I receptor, and d) an RNA of specific interference (iRNA) of the IGF-I
  • Plasmid (ii) is a non-overlapping vector that can virtually contain the nucleotide sequence encoding any Rev protein, which promotes cytoplasmic accumulation of viral transcripts; however, in a particular embodiment, said plasmid (ii) is the plasmid identified as RSV-Rev, which comprises the nucleotide sequence encoding the Rev protein of Rous sarcoma virus (RSV).
  • RSV-Rev Rous sarcoma virus
  • Plasmid (iii) is a conditional packaging vector, and contains the nucleotide sequence encoding any appropriate Rev response element (RRE), to which it binds, so that the gene is expressed and new particles are produced. viral.
  • RRE Rev response element
  • Plasmid (iv) contains the nucleotide sequence that encodes the heterologous vector envelope, so it may contain the nucleotide sequence that encodes any envelope protein of an appropriate virus, with the proviso that said virus is not a lentivirus. ; however, in a particular embodiment, said plasmid is called p-VSV, which comprises the nucleotide sequence encoding the envelope of the vesicular stomatitis virus (VSV).
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • Said lentiviral vector can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art.
  • said lentiviral vector is called HTWIGF-
  • IGF-IR.KR HAV / KR
  • Example 1 that allows the expression of the non-functional mutated form of the IGF-I receptor called IGF-IR.KR that has the K1003R mutation in the amino acid sequence of the human IGF-I receptor , in animal cells not human, and the biological cancellation of the IGF-I receptor and the development of a non-human animal useful as an experimental model of human neurodegenerative diseases that occur with dementia, such as Alzheimer's disease.
  • said transgenesis process leading to the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor in the choroidal plexus epithelial cells of the model animal of the invention comprises a conventional transgenesis process in the embryonic phase of said animal. such that the future choroid plexus cells of said animal are genetically transformed and lose the ability to respond to IGF-I.
  • the development of this type of transgenic animal can be carried out by an expert in the genetic engineering sector based on the existing knowledge in the state of the art on transgenic animals (Bedell MA, Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of human disease Part I: techniques and resources for genetic analysis in mice Genes Dev. 1997 Jan 1; 11 (1): 1- 10. Bedell MA, Longsword DA, Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of human disease Part II: recent progress and future directions Genes Dev. 1997 Jan 1; 11 (1): 11-43).
  • One possibility of the present invention is a conventional transgenesis method by which the expression of a transgene comprising a tissue specific promoter (such as the promoter of the transthyretin gene, Ttr 1 ) is directed (Schreiber, G. The evolution of transthyretin synthesis in the choroid plexus Clin. Chem. Lab Med. 40, 1200-1210 (2002)) and a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes a dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor. In this way the dominant non-functional mutated form of the IGF-I receptor will only be expressed in the choroid plexus cells thus obtaining the model animal of the present invention.
  • a tissue specific promoter such as the promoter of the transthyretin gene, Ttr 1
  • said polynucleotide encodes a dominant non-functional mutated form of the human IGF-I receptor.
  • said dominant non-functional mutated form of the human IGF-I receptor is selected from the non-functional mutated form of the IGF-I receptor called IGF-IR.KR which has the K1003R mutation, in which the Usina residue of position 1003 of the amino acid sequence of the human IGF-I receptor has been replaced by an arginine residue and the non-functional mutated form of the IGF-I receptor called IGF-IR.KA which presents the Kl 003 A mutation, wherein the Usina residue of position 1003 of the amino acid sequence of the receptor of Human IGF-I has been replaced by an alanine residue (Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (Kato H, Faria
  • said alteration of the biological activity of the function of the IGF-I receptor in the epithelial cells of the choroid plexus of the cerebral ventricles of said transgenic animals can be obtained by canceling the functional activity of the IGF-I receptor due to the expression of a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes an element that inhibits the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its functional activity.
  • a polynucleotide whose nucleotide sequence encodes an element that inhibits the expression of the IGF-I receptor gene capable of canceling its functional activity.
  • the term "element that inhibits the expression of the IGF-1 receptor gene capable of canceling its functional activity” refers to a protein, enzymatic activity or nucleotide sequence.
  • said polynucleotide can be a polynucleotide that encodes a specific antisense nucleotide sequence of the gene or mRNA sequence of the IGF-I receptor, or a polynucleotide encoding a specific ribozyme of the IGF-I receptor mRNA either a polynucleotide encoding a specific aptamer of the IGF-I receptor mRNA, or a polynucleotide encoding a small interference RNA (siRNA) specific for the IGF-I receptor mRNA.
  • siRNA small interference RNA
  • a model animal of the invention can be obtained by conventional transgenesis in which the cancellation of the functional activity of the IGF-I receptor can be regulated by different mechanisms which would allow a better control and use of the animal.
  • a technique of regulated transgenesis may consist in the use of the "Cre / Lox” system by crossing animals with Lox-IGF-IR transgenic sequences ("knock in” systems) that replace the endogenous IGF-IR sequence.
  • An exemplary embodiment of the present invention will consist of a Lox-IGF-IR mouse that intersects with a Tre-Cre mouse - where Tre is the promoter adjustable by the Tta protein (tetracycline- controlled transactivator protein); subsequently this hybrid is crossed with a Ttr-Tta mouse such that the resulting mouse: Lox-IGF-IR / Tre-Cre / Ttr-Tta will eliminate the IGF-IR function in response to tetracycline administration , a compound that eliminates the action of the Tta protein.
  • the invention relates to the use of a vector of the invention in a method for obtaining a non-human animal useful as an experimental model, such as an experimental model of neurodegenerative diseases, in particular, human neurodegenerative diseases, especially as a disease model.
  • a non-human animal useful as an experimental model
  • an experimental model of neurodegenerative diseases in particular, human neurodegenerative diseases, especially as a disease model.
  • Human neurodegeneratives with dementia such as Alzheimer's disease.
  • EXAMPLE 1 Generation of a viral vector for sustained transgenic expression
  • IGF-IR.KR mutated form of the IGF-I receptor
  • That mutated form of the IGF-I receptor, IGF-IR.KR presents the K1003R mutation in which the Usina residue at position 1003 has been replaced by an arginine residue, and acts as a negative dominant by recombination with the receptor normal endogenous, canceling its function
  • a lentiviral vector has been used that has prolonged expression characteristics (Consiglio A, Quattrini A, Martino S, Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, Marchesini S, Cestari V, Oliver A, Bordignon C, Naldini L (2001 )
  • HIV-I human immunodeficiency virus type 1
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • RSV-Rev a non-overlapping vector, RSV-Rev, comprising the nucleotide sequence encoding the Roux sarcoma virus (RSV) Rev protein;
  • p-RRE conditional packaging vector, comprising the nucleotide sequence encoding the Rev response element (RRE);
  • a vector, p-VSV comprising the nucleotide sequence encoding the heterologous envelope of the vector, specifically, the envelope of the vesicular stomatitis virus (VSV); Y
  • a transfer vector which carries a gene construct for the transgene in question, in this case, the IGF-IR.KR, and the promoter of the phosphoglycerokinase, which allows the vector that is transcribed to be efficiently generated in the packaging cells (293T).
  • the first three vectors [1) -3)] are known (see references mentioned previously).
  • the construction of this last vector was carried out by introducing a HincII-Xbal fragment of the IGF-I receptor cDNA encoding a mutated form of the IGF-I receptor, specifically the mutated form of the receptor called IGF-IR.KR containing the K1003R mutation in which the Usina residue from position 1003 has been replaced by an arginine residue (Kato H, Faria TN,
  • the cDNA encoding the mutated form of the IGF-I receptor that has the K1003R mutation was introduced into HlV-lacZ, by exchanging the lacZ cassette for the cDNA encoding IGF-IR.KR according to the described methodology (Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, by Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156).
  • the HlV-lacZ vector was cut with Smal / Xbal to remove the lacZ cDNA and ligated with the cDNA encoding IGF-IR.KR cut with HincII / Xbal. Restriction sites are homologous. In this way the transfer vector carrying the IGF-IR.KR transgene was obtained.
  • the lentiviral vector designated HIV / IGF-IR.KR or HTWKR in this description, was obtained by transient transfection in 293T cells.
  • Plasmids RSV-Rev, p-RRE, p-VSV and the transfer vector carrying the IGF-IR.KR transgene are episomal packed in said 293T cells (Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, by Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156).
  • the 293T cell line (commercially available through the American Type Culture Collection) is a line of transformed human renal epithelial cells expressing the SV40 T antigen which It allows episomal replication of plasmids and promoter region. Previously, said cells were seeded, at a density of 1-5 x 10 6 in 10 cm diameter plates 24 hours before transfection in a DMEM medium with 10% fetal serum and penicillin (100 IU / ml).
  • a total of 32.75 ⁇ g of plasmid DNA per plate was used in the transfection: 3 ⁇ g of the plasmid p-VSV, 3.75 ⁇ g of the plasmid RSV-Rev and 13 ⁇ g of both the plasmid p -RRE and the transfer plasmid that carries the IGF-IR.KR transgene.
  • the precipitate was obtained by adding said plasmids to 250 ⁇ l of H 2 O and 250 ⁇ l of 0.5M CaCl 2 , mixing well and adding dropwise to 500 ⁇ l of saline buffer-2X HEPES (280 mM NaCl, 100 mM HEPES, Na 2 HPO 4 1.5 mM, pH 7.12).
  • the precipitate was immediately added to each culture dish. 10 ml of medium was changed at 24 hours and finally collected after another 24 hours, being cleaned with low speed centrifugation and passed through cellulose acetate filters (0.22 ⁇ m). Finally, after a series of ultracentrifugations, the lentiviral particles or vectors, HIV / IGF-IR.KR (HIV / KR), were resuspended in saline phosphate buffer (PBS / BSA) for later use. Briefly, the culture medium of the plates was filtered first with the 293T cells through a 0.45 ⁇ m filter. That medium was centrifuged at 4 ° C for 1 hour and a half at 19,000 rpm.
  • PBS / BSA saline phosphate buffer
  • the precipitate was resuspended in 1% PBS / BSA, left 1 hour on ice and centrifuged again at 4 ° C for 1 hour and a half at 19,000 rpm. It was resuspended in 1% PBS / BSA, left another hour on ice and centrifuged at 4 ° C for 5 minutes at 14,000 rpm. The final supernatant was immediately frozen and stored at -8O 0 C. This same methodology was used to purify empty HIV particles and HIV / GFP particles.
  • an HFV7GFP lentiviral vector containing the GFP coding gene as a transgene was constructed. Briefly, the cDNA of the GFP protein (Clontech) gene was subcloned into an HIV-I [(pHR'CMV) -PGK transfer vector in Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Thrush N, Perrin P, Schwartz O, by Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156], at the BamHI / Sall restriction sites, following the detailed description of Example 1, whereby the lentiviral vector called HIV / GFP was obtained.
  • the animal was perfused transcardially with 4% paraformaldehyde.
  • the brain was cut in vibratome in 50 ⁇ m sections, the sections were then mounted on gelatinized slides and the fluorescence of the GFP protein was observed directly under the fluorescence microscope (Leica).
  • EXAMPLE 3 Transformation of cells of the epithelium of zeroidic plexus with the lentiviral vector HIV / IGF-IR.KR (HIV / KR)
  • the epithelial cell monolayer was obtained by a protocol already described (Strazielle, N. & Ghersi-Egea, J.F. (1999) Demonstration of a coupled metabolism-efflux process at the choroid plexus as a mechanism of brain protection toward xenobiotics. J.
  • Rats between 5 and 7 days were sacrificed and the choroid plexuses of the lateral and fourth ventricles were quickly removed by placing in DMEM culture medium on ice. Thereafter, enzymatic digestion was carried out with 1 mg / ml pronase (Sigma) and 12.5 ⁇ g / ml DNase I (Boehringer Mannheim), with simultaneous mechanical dispersion for 15 minutes.
  • the medium was changed to fresh DMEM containing the virus (at least 50 ⁇ g / ml, diluted between 10 "2 and 10 " 3 ) and 8 ⁇ g / ml of polybrene (Sigma).
  • This infectious medium was replaced at 24 hours, the cells were maintained for another day and, finally, after aspirating the medium, the cells were lysed and processed.
  • HIV / IGF-IR.KR HIV / KR
  • IGF-I trophic factor
  • Transcytosis was quantified by determining the amount of A ⁇ l-40 that passes from the upper chamber of the culture to the lower one, for which it has to pass through a monolayer of epithelial cells (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres -German I (2002) Serum insulin- like growth factor I regulates brain amyloid-beta levéis. Nat Med 8: 1390-1397).
  • EXAMPLE 4 Development of Alzhcimcr type neuropathology in healthy adult rats Healthy adult rats of the Wistar strain were infected with the HIV / IGF-IR.KR vector
  • HIV / KR HIV / KR
  • 6 ⁇ l of the HIV / IGF-IR.KR vector was injected by stereotactic surgery with Hamilton syringe, under anesthesia with tribromoethanol, into male rats 5-6 months of age in each lateral ventricle (stereotactic coordinates: 1 mm posterior to bregma, 1.2 mm lateral and 4 mm deep), at 1 ⁇ l per minute.
  • Control animals received, under the same conditions, equal amount of empty HIV viral vector (HIV).
  • Neurosci Biobehav Rev 26: 753-759 which is one of the characteristic deficits of Alzheimer's disease.
  • a ⁇ and CSF cerebrospinal fluid
  • HIV / IGF-IR.KR HIV / IGF-IR.KR
  • animals injected with the extended expression lentiviral vector HIV / IGF-IR.KR presented neuropathological characteristics associated with Alzheimer's disease: high brain levels of amyloid, presence of intracellular and extracellular aggregates of hyperphosphorylated tau and ubiquitin and cognitive deficits.
  • Another example of the invention consisted in generating pathological Alzheimer-type changes in mice of transgenic origin.
  • the mice chosen are, in addition, old, to better mimic the normal conditions where Alzheimer's disease develops in humans.
  • HIV / IGF-IR.KR (HIV / KR) vector was injected into LID transgenic mice of more than 15 months and with manipulated genotype.
  • the transgenic mice used in this example are deficient in serum IGF-I because the liver gene of IGF-I has been canceled by the Cre / Lox system (LID mice) (Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D , Sauer B, LeRoith D (1999) Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I.
  • LID mice already have, per se, some of the characteristics of Alzheimer's disease since the IGF-I deficit generates amyloidosis and gliosis (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres-Alemán I ( 2002) Serum insulin-like growth factor I regulates brain amyloid-beta levéis. Nat Med 8: 1390-1397). Furthermore, being old, they present cognitive deficits and amyloidosis (Bronson RT, Lipman RD, Harrison DE (1993) Age-related gliosis in the white matter of mice.

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Abstract

Se describe un animal no humano útil como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas. Este modelo animal presenta una alteración de la actividad biológica del receptor del factor trófico IGF-I localizada en las células del epitelio del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales. Dicho modelo animal puede obtenerse mediante un proceso de transgénesis. Este modelo animal es útil para el estudio de los mecanismos etiopatogénicos de enfermedades neurodegenerativas, entre ellas las que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer, o para la identificación y evaluación de compuestos terapéuticos frente a dichas enfermedades.

Description

TÍTULO
MODELO ANIMAL DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS,
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona, en general, con el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas; y, en particular, con el desarrollo de animales no humanos útiles como modelos de enfermedades humanas neurodegenerativas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El desarrollo de modelos experimentales de enfermedades neurológicas es de gran importancia para la investigación biomédica (Cenci MA, Whishaw IQ, Schallert T (2002) Animal models of neurological déficits: how relevant is the rat? Nat Rev Neurosci 3: 574-579). Para el caso de las enfermedades neurodegenerativas el desarrollo de modelos que se aproximan a las características de la enfermedad en seres humanos ha supuesto un gran avance metodológico. Sin embargo, al ser todos ellos obtenidos por manipulación genética convencional, los recursos económicos, de personal, y de instalaciones necesarios suelen ser muy elevados. Aunque a pesar de ello su uso se está generalizando, su alto coste genera una enorme carga en los recursos dedicados a la investigación.
La enfermedad de Alzheimer, un caso típico de enfermedad neurodegenerativa que cursa con demencia, es la cuarta causa de mortalidad en los países industrializados, con alrededor de 13 millones de individuos afectados, número que podría ser mayor al existir aproximadamente un 25% de casos que no se diagnostican. El pronóstico para los próximos años es un crecimiento vertiginoso de la cifra de afectados que podría superar los 40 millones en los países industrializados donde se observa un envejecimiento de la población (Dekosky et al. (2001) Epidemiology and Pathophysiology of Alzheimer's disease, Clinical Cornestone 3 (4): 15-26). Actualmente existen pocos medicamentos efectivos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y el coste del tratamiento de esta enfermedad por paciente es bastante caro actualmente, estimándose entorno a los 225.000 dólares US, según datos de la Asociación Americana de Alzheimer. La existencia de este grave problema de salud con un número muy limitado de medicamentos útiles ha impulsado el desarrollo de investigación encaminada a conocer el mecanismo etiopatogénico de dicha enfermedad neurodegenerativa con el objetivo de identificar y evaluar compuestos potencialmente terapéuticos frente a dicha enfermedad.
En el caso de la enfermedad de Alzheimer, uno de los principales avances ha venido precisamente al poderse identificar las proteínas implicadas en el Alzheimer familiar, que no está asociado con el envejecimiento como el Alzheimer esporádico, que es con mucho, la forma más frecuente de la enfermedad (Mayeux R (2003)
Epidemiology of neurodegeneration. Annu Rev Neurosci 26: 81-104).
Se han desarrollado modelos transgénicos portadores de las distintas mutaciones encontradas en pacientes de Alzheimer familiar, tales como presenilinas y β amiloide (Hock BJ, Jr., Lamb BT (2001) Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Trends Genet 17: S7-12). Un inconveniente muy importante es que si bien estos animales imitantes presentan varios de los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, ninguno de ellos exhibe todo el espectro de cambios patológicos asociados a la misma (Richardson JA, Burns DK (2002) Mouse models of Alzheimer's disease: a quest for plaques and tangles. ILAR J 43: 89-99). En un intento de solucionar este problema se han cruzado entre sí cepas de ratones transgénicos con las distintas mutaciones que recrean cada una distintos aspectos de la enfermedad para así lograr un modelo que se asemeje mejor a la patología humana (Phinney AL, Horne P, Yang J, Janus C, Bergeron C, Westaway D (2003) Mouse models of Alzheimer's disease: the long and filamentous road. Neurol Res 25: 590-600). Por ejemplo, el cruce de ratones que expresan grandes cantidades de una de las formas mutadas de la proteína precursora de β amiloide humano (APP-Swe695) con ratones que expresan formas mutadas de presenilinas generan híbridos que presentan placas de amiloide junto con ovillos neurofibrilares y déficits cognitivos (Duff K, Eckman C, Zehr C, Yu X, Prada CM, Perez-tur J, Hutton M, Buee L, Harigaya Y, Yager D, Morgan D, Gordon MN, Holcomb L, Refolo L, Zenk B, Hardy J, Younkin S (1996) Increased amyloid-beta42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature 383: 710-713; Richards JG, Higgins GA, Ouagazzal AM, Ozmen L, Kew JN, Bohrmann B, Malherbe P, Brockhaus M, Loetscher H, Czech C, Huber G, Bluethmann H, Jacobsen H, Kemp JA (2003) PS2APP Transgenic Mice, Coexpressing hPS2mut and hAPPswe, Show Age-Related Cognitive Déficits Associated with Discrete Brain Amyloid Deposition and Inflammation. J Neurosci 23: 8989-9003). A continuación se indican, a título ilustrativo, algunas de las patentes relacionadas con modelos animales de enfermedad de Alzheimer: US20030229907, Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease; US20030167486, Double transgenic mice overexpressing human beta secretase and human APP-London; US20030145343, Transgenic animáis expressing human p25; US20030131364, Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animáis produced therefrom; US20030101467, Transgenic animal model for Alzheimer disease; US20030093822, Transgenic animal model of neurodegenerative disorders; US6,717,031, Method for selecting a transgenic mouse model of Alzheimer's disease; US6,593,512, Transgenic mouse expressing human tau gene; US6,563,015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; US6,509,515, Transgenic mice expressing mutant human APP and forming congo red staining plaques; US6,455,757, Transgenic mice expressing human APP and TGF-beta demónstrate cerebrovascular amyloid deposits; US6,452,065, Transgenic mouse expressing non-native wild-type and familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 nuil background; WO03053136, Triple transgenic model of Alzheimer disease; WO03046172, Disease model; US6563015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; WOO 120977, Novel animal model of Alzheimer disease with amyloid plaques and mitochondrial dysfunctions; EPl 285578, Transgenic animal model of Alzheimer's disease.
En la actualidad estos modelos animales transgénicos son los únicos aceptados para el estudio de mecanismos patogénicos de la enfermedad de Alzheimer y para el cribaje a nivel farmacéutico de nuevas drogas. Dada la disparidad de modelos que se han generado con el fin de recrear y analizar cada una de las posibles causas de la enfermedad, la disponibilidad de los mismos en muchos casos está restringida por cuestiones de derechos de propiedad y sobretodo, por la falta de los recursos materiales necesarios para generar híbridos complejos (Oddo S, Caccamo A, Shepherd JD, Murphy MP, Golde TE, Kayed R, Metherate R, Mattson MP, Akbari Y, LaFerla FM (2003) Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Aβ and synaptic dysfunction. Neuron 39: 409-421). Esto significa limitaciones severas en el uso generalizado de estos modelos. Merece la pena destacar, además, que los medicamentos existentes actualmente para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer son poco eficaces y que los modelos basados en animales transgénicos existentes presentan carencias al no reflejar perfectamente la patología de la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, sigue existiendo un grave problema de salud con un muy limitado número de medicamentos útiles por lo que existe la necesidad de desarrollar modelos experimentales alternativos a los existentes que permitan estudiar el mecanismo etiopatogénico de dicha enfermedad neurodegenerativa y/o identificar y evaluar compuestos potencialmente terapéuticos frente a dicha enfermedad. Por otro lado, el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I
(IGF-I) es una proteína de membrana perteneciente a la familia de receptores con actividad enzimática tirosín-quinasa, muy similar al receptor de insulina (Ullrich A, Gray A, Tam AW, Yang-Feng T, Tsubokawa M, Collins C, Henzel W, Le Bon T, Kathuria S, Chen E. (1986) Insulin-like growth factor I receptor primary structure: comparison with insulin receptor suggests structural determinants that define functional specificity. EMBO J 5: 2503-2512). Sus amplias y muy relevantes funciones biológicas han hecho que sea intensamente estudiado de forma que la ruta de señalización intracelular se conoce relativamente bien (LeRoith D, Werner H, Beitner- Johnson D, Roberts CT, Jr. (1995) Molecular and cellular aspects of the insulin-like growth factor I receptor. Endocr Re v 16:143-163). Su papel en patologías como cáncer, diabetes y neurodegeneración le hacen diana en la búsqueda de moduladores farmacológicos de utilidad clínica, aunque no se conoce el papel etiopatogénico, en patologías como la enfermedad de Alzheimer, que su alteración funcional puede inducir.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevos modelos animales de enfermedades neurodegenerativas humanas, tales como enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, entre las que se encuentra la enfermedad de Alzheimer. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales de los plexos coroideos de los ventrículos del cerebro de un animal permite el desarrollo de un animal modelo de enfermedades neurodegenerativas, en general, y, en particular, animal modelo de enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer, que reúne las principales características de dicha enfermedad humana, que es sencillo de obtener y que se puede utilizar en animales de laboratorio con cualquier fondo genético. Para ello, y entre otras posibilidades técnicas, se inyectó mediante cirugía estereotáxica en los ventrículos laterales del cerebro un vector que contenía una forma mutada del receptor de IGF-I que elimina la actividad funcional de este factor trófico a nivel del plexo coroideo al actuar como dominante negativo (Ejemplo 1). Pocos meses después el animal presentaba todos los síntomas asociados a la enfermedad de Alzheimer: acumulo de péptido amiloide en el cerebro, depósitos de proteína tau hiperfosforilada junto con ubiquitina, pérdida de proteínas sinápticas y déficits cognitivos severos (aprendizaje y memoria). El desarrollo de la patología tipo Alzheimer aparece de 3 a 6 meses después de la inyección del vector dependiendo del fondo genético del animal huésped, de tal forma que los animales con modificaciones genéticas que potencialmente pueden modular la aparición de la enfermedad de Alzheimer la neuropatología tipo de dicha enfermedad aparece más temprana (Ejemplos 2 y 3).
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un animal no humano útil como modelo experimental caracterizado porque presenta una alteración de la actividad biológica del receptor de IGF-I localizada en las células del epitelio del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales. Dicho animal no humano es útil como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas, en particular, enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la Enfermedad de Alzheimer.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de dicho animal no humano útil como modelo experimental que comprende la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de dicho animal no humano mediante un proceso de transgénesis. Para ello, es necesario el desarrollo de construcciones génicas y vectores los cuales, junto con sus aplicaciones, constituyen aspectos adicionales de la presente invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicho animal no humano como modelo experimental para el estudio del mecanismo etiopatogénico de una enfermedad neurodegenerativa o para la identificación y evaluación de compuestos terapéuticos frente a dicha enfermedad. En una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad neurodegenerativa humana que cursa con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer.
Una de las ventajas del modelo experimental desarrollado por esta invención radica en que refleja perfectamente la patología de la enfermedad de Alzheimer, por lo que dicho modelo representa un salto cualitativo en el estudio del mecanismo etiopatogénico de dicha enfermedad neurodegenerativa así como en el desarrollo de herramientas eficaces para la identificación y evaluación de compuestos terapéuticos frente a dicha enfermedad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una foto que muestra que el vector lentiviral HIV/GFP permite la expresión del transgén en las células del plexo coroideo, observándose la expresión de proteína autofluorescente verde GFP (verde) en células del plexo coroideo (flechas) de rata adulta tras inyección intracerebroventricular (icv) del vector HIV/GFP. La foto muestra células del plexo coroideo de un animal que recibió, 3 meses antes de ser sacrificado, una única inyección icv del vector lentiviral HIV/GFP.
La Figura 2 pone de manifiesto que la administración del vector HIV/IGF- IR.KR (HIV/KR) a células epiteliales en cultivo obtenidas del plexo coroideo de ratas postnatales genera una pérdida de respuesta al IGF-I. Sólo en células infectadas con KR (HIV+KR+Aβ y HIV+KR+IGF+Aβ), pero no en las transfectadas con un vector HIV vacío (HIV), el IGF-I no promueve transcitosis de péptido Aβl-40. *P<0,05 vs todos los demás grupos.
La Figura 3 muestra que el aprendizaje (A) y la memorización espacial (B) se encuentran disminuidos en ratas HIV/IGF-IR.KR ya que estas últimas aprenden más despacio y peor que las ratas control (HIV) en el test de Morris, consistente en memorizar la posición de una plataforma cubierta por el agua en una piscina donde el animal nada sin poder reposar más que en la plataforma. Ratas HIV/IGF-IR.KR: 1^=0,8516 vs ratas control r2=0,9884, *P<0,05.
La Figura 4 muestra los niveles de Aβ en corteza cerebral (A) y en líquido cefalorraquídeo (LCR) (B) de ratas inyectadas con el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR). Mientras que se produce un incremento en los niveles cerebrales de Aβ hay un decremento en paralelo en el LCR, indicativo de una disminución en el aclaramiento de Aβ. Los niveles se determinaron por densitometría de inmunoblots utilizando anticuerpos anti-Aβ. Se muestran inmunoblots representativos. Se valoran también niveles de calbindina, una proteína neuronal, para mostrar que las diferencias no se deben a la cantidad de proteína total en cada grupo experimental. *P<0,05 vs control (ratas inyectadas con HIV vacío). La Figura 5 muestra los niveles de tau hiperfosforilado (HPF-tau) en la corteza cerebral de ratas inyectadas con el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR). La Figura 5A muestra los niveles de HPF-tau en la corteza cerebral de ratas inyectadas con el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) y con el vector control (HlV-control). Los niveles se determinaron por densitometría de inmunoblots con anticuerpos anti-HPF-tau. *P<0,05 vs control. La Figura 5B muestra los resultados de un análisis por microscopía confocal de la localización tisular de los depósitos de HPF-tau. Los animales HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) (panel derecho), pero no los control (tratados con HIV, panel izquierdo), presentan acúmulos de HPF-tau (rojo) tanto dentro (flecha) como fuera (asterisco) de las neuronas (inmunopositivas para β tubulina, en verde) en zonas del telencéfalo. La señal intracelular amarilla-roja delata la colocalización de HPF-tau en neuronas. La Figura 5C muestra que los acúmulos extracelulares de HPF-tau contienen también ubiquitina. Se produce una colocalización (acúmulos amarillos, flecha) de depósitos HPF-tau (rojo) con ubiquitina (verde). Los animales control no presentan estos depósitos (datos no mostrados). La Figura 6 muestra una neuropatología tipo Alzheimer en ratones con fondo genético modificado. La Figura 6A muestra que los ratones LID viejos (más de 15 meses) tratados con el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) [LID-HIV/IGF-IR.KR] prácticamente no aprendieron en el test de Morris. Mientras que ratones control viejos o LID que reciben sólo el vector viral control [LID-HIV] aprenden y retienen lo aprendido de forma similar, los ratones LID-HIV/IGF-IR.KR, donde la señalización del receptor de IGF-I en el plexo coroideo ha quedado anulada, aprenden significativamente peor (*P<0,001 vs controles). LID-HIV/IGF-IR.KR (n=5): r2= 0,6320, LID-HIV (n=7): T1= 0,7379, Controles de la misma edad (n=6), T1= 0,7909. La Figura 6B muestra que los animales LID-HIV/IGF-IR.KR presentan acúmulos de Aβ (inmunopositivos para Aβ, marcados con asteriscos en el panel a mayor aumento) en zonas telencefálicas que apenas se observan en los ratones controles LID-HIV (panel inferior). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de la presente invención se relaciona con un animal no humano útil como modelo experimental, en adelante animal modelo de la invención, caracterizado porque presenta una alteración de la actividad biológica del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I (IGF-I) localizada en las células del epitelio del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "animal no humano" se refiere a un animal mamífero no humano de cualquier fondo genético, preferentemente animales de laboratorio como roedores, más preferentemente ratas y ratones, o primates no humanos.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "cualquier fondo genético" se refiere tanto a un animal no humano normal como a un animal no humano transgénico.
El término "normal", aplicado a animal, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a animales que carecen de transgenes que podrían estar implicados en la etiopatogenia de enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer.
El término "transgénico", aplicado a animal, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a animales que contienen un transgén que podría estar implicado en la etiopatogenia de enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer, e incluye, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a animales transgénicos del siguiente grupo: ratones LID (Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B, LeRoith D (1999) Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I. Proc Nati Acad Sci USA 96:7324-7329), animales transgénicos portadores de mutaciones en presenilinas y β amiloide (Hock BJ, Jr., Lamb BT (2001) Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Trends Genet 17: S7-12), animales portadores de otras mutaciones y alteraciones (US20030229907, Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease; US20030145343, Transgenic animáis expressing human p25; US20030131364, Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animáis produced therefrom; US20030101467, Transgenic animal model for Alzheimer disease; US20030093822, Transgenic animal model of neurodegenerative disorders; US6,717,031, Method for selecting a transgenic mouse model of Alzheimer's disease; US6,593,512, Transgenic mouse expressing human tau gene; US6,563,015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; US6,509,515, Transgenic mice expressing mutant human APP and forming congo red staining plaques; US6,455,757, Transgenic mice expressing human APP and TGF-beta demónstrate cerebrovascular amyloid deposits; US6,452,065, Transgenic mouse expressing non-native wild-type and familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 nuil background; WO03053136, Triple transgenic model of Alzheimer disease; WO03046172, Disease model; US6563015, Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof; WOO 120977, Novel animal model of Alzheimer disease with amyloid plaques and mitochondrial dysfunctions; EPl 285578, Transgenic animal model of Alzheimer's disease) y animales transgénicos obtenidos mediante el cruce de cepas de ratones transgénicos con las distintas mutaciones que tienen lugar en la enfermedad de Alzheimer (Phinney AL, Horne P, Yang J, Janus C, Bergeron C, Westaway D (2003) Mouse models of Alzheimer's disease: the long and filamentous road. Neurol Res 25: 590-600; Duff K, Eckman C, Zehr C, Yu X, Prada CM, Perez-tur J, Hutton M, Buee L, Harigaya Y, Yager D, Morgan D, Gordon MN, Holcomb L, Refolo L, Zenk B, Hardy J, Younkin S (1996) Increased amyloid-beta42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature 383: 710-713; Richards JG, Higgins GA, Ouagazzal AM, Ozmen L, Kew JN, Bohrmann B, Malherbe P, Brockhaus M, Loetscher H, Czech C, Huber G, Bluethmann H, Jacobsen H, Kemp JA (2003) PS2APP Transgenic Mice, Coexpressing hPS2mut and hAPPswe, Show Age-Related Cognitive Déficits Associated with Discrete Brain Amyloid Deposition and Inflammation. J Neurosci 23: 8989-900; US20030167486 Double transgenic mice overexpressing human beta secretase and human APP-London).
La alteración de la actividad biológica de la función del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales del animal modelo de la invención consistirá, en general, en la anulación funcional de su actividad biológica (anulación biológica). Dicha alteración de la actividad biológica de la función del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales puede ser debida a la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I debido a la expresión de un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I. En una realización particular, dicho polinucleótido codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I humano. A modo ilustrativo, dicha forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I humano se selecciona entre la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KR que presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de arginina y la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KA que presenta la mutación Kl 003 A, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de alanina (Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR- 3). J Biol Chem 268: 2655-2661). El sistema de numeración utilizado para numerar los residuos de aminoácidos del receptor de IGF-I humano es el seguido por UUrich et al. (Ullrich A. et al. (1985) Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Nature 313:756-761; Ullrich A. et al. (1986) Insulin-like growth factor I receptor primary structure: comparison with insulin receptor suggests structural determinants that define functional specificity. EMBO J. 1986 Oct; 5(10): 2503-2512). Alternativamente, dicha alteración de la actividad biológica de la función del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales puede ser debida a la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF- I debido a la expresión de un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional. Tal como se utiliza en la presente invención el término "elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF- I capaz de anular su actividad funcional" se refiere a una proteína, actividad enzimática o secuencia de nucleótidos, RNA o DNA, de cadena sencilla o doble, que inhibe la traducción a proteína del mRNA del receptor de IGF-I. A modo ilustrativo, dicho polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, o bien un polinucleótido que codifica una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, o bien un polinucleótido que codifica un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, o bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia ("small interference RNA" o siRNA ) específico del mRNA del receptor de IGF-I.
El animal modelo de la invención puede tener cualquier fondo genético; no obstante, en una realización particular dicho animal modelo de la invención proviene de un animal normal, ventajosamente, de un animal normal sano, es decir, que carece de una patología diagnosticada, tal como una rata sana (Ejemplo 2), mientras que en otra realización particular dicho animal modelo de la invención proviene de un animal transgénico, tal como de un ratón transgénico LID (Ejemplo 3).
El animal modelo de la invención es un animal útil como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas que cursan con demencia. Preferentemente, dichas enfermedades neurodegenerativas son enfermedades neurodegenerativas humanas, más preferentemente, enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia. En una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa humana que cursa con demencia es la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer representa el 60% de los casos de demencia mientras que la enfermedad microvascular o multi-infarto representa un 20% de los mismos. Otras causas menores de demencia son el abuso crónico de alcohol y drogas y enfermedades neurológicas de muy baja incidencia como las enfermedades de Pick y Creutzfeldt-Jacob. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del animal modelo de la invención como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedades neurodegenerativas que cursan con demencia; preferentemente, dichas enfermedades neurodegenerativas son enfermedades neurodegenerativas humanas, tales como enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.
Asimismo, el uso del animal modelo de la invención para el estudio de los mecanismos etiopatogénicos de enfermedades neurodegenerativas, en particular, enfermedades neurodegenerativas humanas y, más particularmente, enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer, así como el uso del animal modelo de la invención para la identificación y evaluación de compuestos potencialmente terapéuticos frente a dichas enfermedades constituyen aspecto adicionales de la presente invención. El animal modelo de la invención puede obtenerse mediante un proceso de transgénesis que permite la anulación funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de dicho animal modelo de la invención.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención del animal modelo de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de dicho animal modelo de la invención mediante un proceso de transgénesis.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "proceso de transgénesis" se refiere a cualquier técnica o procedimiento que permita la integración en una serie de células de un organismo vivo de un gen exógeno, o "transgén", sin afectar a la totalidad de las células de dicho organismo, y que confiere a dichas células y al organismo que las porta una nueva propiedad biológica. Dicho transgén o gen exógeno se refiere a un ADN normalmente no residente, ni presente en la célula que se pretende transformar. Por otro lado, el proceso de transgénesis para obtener el animal modelo de la invención puede ser aplicado tanto a animales completamente desarrollados como a embriones del mismo siempre que permita la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de dicho animal modelo completamente desarrollado. En una realización particular, dicho proceso de transgénesis que conduce a la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I comprende la transformación de células epiteliales del plexo coroideo de un animal no humano completamente desarrollado, de manera que expresen una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I. Este objetivo puede conseguirse mediante la administración a células epiteliales del plexo coroideo de dicho animal no humano de una construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I con el fin de transformar dichas células epiteliales del plexo coroideo de manera que expresen dicha forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I. Ventajosamente, dicha construcción génica está incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el proceso de transferencia de un gen exógeno o de una construcción génica exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo la vehiculación estable de genes y construcciones génicas exógenas. Dichos vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales, preferentemente, vectores virales ya que la transgénesis con vectores virales tiene la ventaja de poder dirigir con relativa precisión la expresión de un gen foráneo en tejidos adultos y es una de las razones por las que se plantea su uso general para terapia génica (Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 177-211).
La invención se ha ejemplificado mediante el empleo de vectores lentivirales. Estos vectores son de fácil manejo y entre sus principales ventajas destaca su eficaz transducción, su integración genómica y su expresión persistente o prolongada. Otros vectores virales apropiados incluyen vectores retrovirales, adenovirales o adenoasociados (Consiglio A, Quattrini A, Martino S, Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, Marchesini S, Cestari V, Oliverio A, Bordignon C, Naldini L (2001) In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nat Med 7: 310-316; Kordower JH, Emborg ME, Bloch J, Ma SY, Chu Y, Leventhal L, McBride J, Chen EY, Palfi S, Roitberg BZ, Brown WD, Holden JE, Pyzalski R, Taylor MD, Carvey P, Ling Z, Trono D, Hantraye P, Deglon N, Aebischer P (2000) Neurodegeneration prevented by lentiviral vector delivery of GDNF in primate models of Parkinson's disease. Science 290: 767-773). Ejemplos de vectores lentivirales incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HIV-I), del que se han desarrollado numerosos vectores apropiados. Otros lentivirus adecuados para su empleo como vectores incluyen el grupo de lentivirus de primates incluyendo el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2 (HIV-2), el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 3 (HIV-3), el virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV), el retrovirus del SIDA de los simios (SRV-I), el virus linfotrópico de células T humanas tipo 4 (HTL V4), así como los grupos de lentivirus bovinos, lentivirus equinos, lentivirus felinos, lentivirus ovinos/caprinos y lentivirus murinos. La invención proporciona un vector, tal como un vector viral, específicamente, un vector lentiviral, útil para obtener un animal modelo de la invención, el cual es útil como un modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas, concretamente, como modelo de enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer. Dicho vector así como su obtención se describirá de forma detallada más adelante.
La administración de dicha construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I, o de dicho vector que comprende dicha construcción génica, a las células epiteliales del plexo coroideo del animal no humano a transformar puede llevarse a cabo por cualquier método convencional; no obstante, en una realización particular, la administración de dicho vector a dichas células epiteliales del plexo coroideo se lleva a cabo mediante inyección intracerebroventricular (icv).
Tal como se utiliza en la presente invención el término "una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I" incluye cualquier forma mutada del receptor de IGF-I que actúe como dominante negativo por recombinación con el receptor de IGF-I normal endógeno, anulando su función biológica, en el curso del procedimiento desarrollado por la presente invención. Dicha forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I es expresada por células epiteliales del plexo coroideo del animal modelo de la invención como consecuencia de su transformación con una construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótido codifica dicha forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I. En una realización particular, dicho polinucleótido codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I humano. En otras realizaciones particulares, dicho polinucleótido codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I de una especie animal distinta a la humana, tal como un mamífero, por ejemplo, un roedor o un primate no humano.
Aunque prácticamente cualquier forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I puede ser utilizada con el fin de conseguir la anulación funcional de la actividad biológica (anulación biológica) del receptor de IGF-I, en una realización particular, dicha forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I se selecciona entre las formas mutadas no funcionales del receptor de IGF-I humano denominadas IGF-IR.KR e IGF-IR.KA en esta descripción, definidas previamente. El animal no humano cuyas células epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales van a ser transformadas mediante la administración del transgén puede tener cualquier fondo genético.
El procedimiento de la invención se materializa, en una realización concreta, en un procedimiento para la obtención de un animal modelo de la invención en el que el vector utilizado es el vector lentiviral derivado de HIV-I denominado HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) en esta descripción, la forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I humano denominada IGF- IR.KR y el animal no humano cuyas células epiteliales del plexo coroideo han sido transformadas es una rata normal adulta sana (Ejemplo 2).
Adicionalmente, el procedimiento de la invención se materializa, en otra realización concreta, en un procedimiento para la obtención de un animal modelo de la invención en el que el vector utilizado es el vector lentiviral denominado HIV/IGF- IR.KR (HIV/KR), la forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I humano denominada IGF-IR.KR y el animal no humano cuyas células epiteliales del plexo coroideo han sido transformadas es un ratón transgénico LID (Ejemplo 3).
Alternativamente, tal como se mencionó previamente, la alteración de la actividad biológica de la función del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales puede ser debida a la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I debido a la expresión de un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional.
Por tanto, en otra realización particular, dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I comprende la transformación de células epiteliales del plexo coroideo de un animal no humano mediante la introducción de una construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad biológica, seleccionándose dicho elemento inhibidor entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, b) una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, c) un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, y d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del receptor de IGF-I. Ventajosamente, dicha construcción génica está incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia. Las características de dicho vector han sido definidas previamente.
Las secuencias de nucleótidos a)-d) mencionadas previamente impiden la expresión del gen en mRNA o del mRNA en la proteína del receptor de IGF-I, y, por tanto, anulan su función biológica, y pueden ser desarrolladas por un experto en el sector de ingeniería genética en función del conocimiento existente en el estado del arte sobre transgénesis y anulación de la expresión génica (Clarke, A.R. (2002) Transgenesis Techniques. Principies and Protocols, 2a Ed. Humana Press, Cardiff University; Patente US20020128220. Gleave, Martin. TRPM-2 antisense therapy; Puerta-Ferández E et al. (2003) Ribozymes: recent advances in the development of RNA tools. FEMS Microbiology Reviews 27: 75-97; Kikuchi, et al., 2003. RNA aptamers targeted to domain II of Hepatitis C virus IRES that bind to its apical loop región. J. Biochem. 133, 263-270; Reynolds A. et al., 2004. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology 22 (3): 326-330).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector útil para la puesta en práctica del procedimiento de obtención del animal modelo de la invención. Dicho vector puede ser un vector no viral o, ventajosamente, un vector viral, tal como se ha mencionado previamente, y comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I o bien un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional, junto con, opcionalmente, los elementos necesarios para permitir su expresión en células de animales no humanos. Dichos vectores pueden estar en forma de partículas virales artificiales o quiméricas.
En una realización particular, dicho vector, es un vector lentiviral que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos se seleccionada entre una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I y una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional. En una realización particular, la secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I se selecciona entre las formas mutadas no funcionales del receptor de IGF-I humano denominadas IGF-IR.KR e IGF- IR.KA en esta descripción, definidas previamente. En otra realización particular, la secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional se selecciona entre una secuencia que codifica: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, b) una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, c) un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, y d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del receptor de IGF-I.
La invención proporciona, en una realización concreta, un vector lentiviral obtenible mediante transfección transitoria en células empaquetadoras de: un plásmido (i) que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: - una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I, y
- una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional; un plásmido (ii) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rev; un plásmido (iii) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE); y un plásmido (iv) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector.
Aunque prácticamente cualquier célula empaquetadora apropiada puede ser utilizada, en una realización particular, dichas células empaquetadoras pertenecen a la línea celular 293T, una línea de células epiteliales renales humanas transformadas disponibles comercialmente. El plásmido (i) es un vector, tal como un vector de transferencia o de expresión, que lleva una construcción génica que comprende el transgén en cuestión y un promotor funcional en las células empaquetadoras que permite que el vector que se transcribe se genere de forma eficiente en las células empaquetadoras. En una realización particular, dicho plásmido (i) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I seleccionada entre las formas mutadas no funcionales del receptor de IGF-I humano denominadas IGF-IR.KR e IGF- IR.KA en esta descripción, definidas previamente. En otra realización particular, dicho plásmido (i) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional seleccionada entre una secuencia que codifica: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, b) una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, c) un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, y d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del receptor de IGF-I.
El plásmido (ii) es un vector no solapante que, virtualmente, puede contener la secuencia de nucleótidos que codifica cualquier proteína Rev, la cual promueve la acumulación citoplasmática de los transcritos virales; no obstante, en una realización particular, dicho plásmido (ii) es el plásmido identificado como RSV -Rev, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rev del virus del sarcoma de Rous (RSV).
El plásmido (iii), es un vector de empaquetado condicional, y contiene la secuencia de nucleótidos que codifica cualquier elemento de respuesta a Rev (RRE) apropiado, al que se une, de forma que el gen se exprese y se produzcan las nuevas partículas virales.
El plásmido (iv) contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector, por lo que puede contener la secuencia de nucleótidos que codifica cualquier proteína de la envuelta de un virus apropiada, con la condición de que dicho virus no sea un lentivirus; no obstante, en una realización particular, dicho plásmido es el denominado p-VSV, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSV).
Dicho vector lentiviral puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. En una realización particular, dicho vector lentiviral es el denominado HTWIGF-
IR.KR (HIV/KR) (Ejemplo 1) que permite la expresión de la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KR que tiene la mutación K1003R en la secuencia de aminoácidos del receptor IGF-I humano, en células animales no humanas, y la anulación biológica del receptor de IGF-I y el desarrollo de un animal no humano útil como modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer.
En otra realización particular, dicho proceso de transgénesis que conduce a la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo del animal modelo de la invención comprende un proceso de transgénesis convencional en la fase embrionaria de dicho animal de tal forma que las futuras células del plexo coroideo de dicho animal son transformadas genéticamente y pierden la capacidad de responder al IGF-I. El desarrollo de este tipo de animal transgénico puede ser llevado a cabo por un experto en el sector de ingeniería genética en función del conocimiento existente en el estado del arte sobre animales transgénicos (Bedell MA, Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of human disease. Part I: techniques and resources for genetic analysis in mice. Genes Dev. 1997 Jan 1; 11(1): 1- 10. Bedell MA, Largaespada DA, Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of human disease. Part II: recent progress and future directions. Genes Dev. 1997 Jan 1; 11(1): 11- 43).
Una posibilidad de la presente invención es un procedimiento de transgénesis convencional por la cual se dirige la expresión de un transgén que comprende un promotor específico de tejido (como por ejemplo el promotor del gen de la transtirretina, Ttr1) (Schreiber,G. The evolution of transthyretin synthesis in the choroid plexus. Clin. Chem. Lab Med. 40, 1200-1210 (2002)) y un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I. De esta forma la forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I únicamente se expresará en las células del plexo coroideo obteniéndose así el animal modelo de la presente invención. En una realización particular, dicho polinucleótido codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I humano. A modo ilustrativo, dicha forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I humano se selecciona entre la forma mutada no funcional del receptor de IGF- I denominada IGF-IR.KR que presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de arginina y la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KA que presenta la mutación Kl 003 A, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de alanina (Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR- 3). J Biol Chem 268: 2655-2661).
Alternativamente, dicha alteración de la actividad biológica de la función del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales de dichos animales transgénicos puede ser obtenida por la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I debido a la expresión de un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional. Tal como se utiliza en la presente invención y, se ha comentado anteriormente, el término "elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF- 1 capaz de anular su actividad funcional" se refiere a una proteína, actividad enzimática o secuencia de nucleótidos, RNA o DNA, de cadena sencilla o doble, que inhibe la traducción a proteína del mRNA del receptor de IGF-I. A modo ilustrativo, dicho polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, o bien un polinucleótido que codifica una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, o bien un polinucleótido que codifica un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, o bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia ("small interference RNA" o siRNA ) específico del mRNA del receptor de IGF-I.
Igualmente, se puede obtener un animal modelo de la invención por transgénesis convencional en el que la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I pueda ser regulada por distintos mecanismos lo que permitiría un mejor control y uso del animal. Así, una técnica de transgénesis regulada, puede consistir en el uso del sistema "Cre/Lox" mediante el cruce de animales con secuencias transgénicas Lox-IGF- IR (sistemas de "knock in") que sustituyan a la secuencia IGF-IR endógena, con animales que tengan a la recombinasa bacteriana Cre dirigida por un promotor específico de tejido, de nuevo por ejemplo el de la transtirretina (Isabelle Rubera, Chantal Poujeol, Guillaume Bertin, Lilia Hasseine, Laurent Counillon, Philippe Poujeol and Michel Tauc (2004) Specific Cre/Lox Recombination in the Mouse Proximal Tubule. J Am Soc Nephrol. 15 (8): 2050-6; Ventura A, Meissner A, Dillon CP, McManus M, Sharp PA, Van Parijs L, Jaenisch R, Jacks T. (2004) Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. Proc Nati Acad Sci USA. 101 (28): 10380-5). Otro ejemplo para generar otro modelo animal transgénico regulable consistiría en el uso del sistema "tet-off '(Rennel E, Gerwins P. (2002) How to make tetracycline-regulated transgene expression go on and off. Anal Biochem. 309 (1): 79- 84; Schonig, K, Bujard H. (2003) Generating conditional mouse mutants via tetracycline-controlled gene expression. In: Transgenic Mouse Methods and Protocols, Hoíker, M, van Deursen, J (eds.) Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 69-104). Una realización ejemplarizante de la presente invención consistirá en un ratón Lox-IGF-IR que se cruza con un ratón Tre-Cre - donde Tre es el promotor regulable por la proteína Tta (tetracycline-controlled transactivator protein); posteriormente este híbrido se cruza con un ratón Ttr-Tta de tal manera que el ratón resultante: Lox-IGF-IR/Tre-Cre/Ttr-Tta eliminará la función IGF-IR en respuesta a la administración de tetraciclina, compuesto que elimina la acción de la proteína Tta. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un vector de la invención en un procedimiento para la obtención de un animal no humano útil como modelo experimental, tal como un modelo experimental de enfermedades neurodegenerativas, en particular, enfermedades neurodegenerativas humanas, especialmente, como modelo de enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia, tal como la enfermedad de Alzheimer.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1.- Generación de un vector viral para expresión transgέnica sostenida
Se generó un vector viral como vehículo genético para introducir en las células epiteliales del plexo coroideo la forma mutada del receptor de IGF-I denominada IGF- IR.KR. Esa forma mutada del receptor de IGF-I, IGF-IR.KR, presenta la mutación K1003R en la que el residuo de Usina en la posición 1003 ha sido sustituido por un residuo de arginina, y actúa como dominante negativo por recombinación con el receptor normal endógeno, anulando su función (Kato H, Faria TN, Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR-3). J Biol Chem 268: 2655-2661).
Se ha utilizado un vector lentiviral que presenta características de expresión prolongada (Consiglio A, Quattrini A, Martino S, Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, Marchesini S, Cestari V, Oliverio A, Bordignon C, Naldini L (2001) In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vector s: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nat Med
7: 310-316; Kordower JH, Emborg ME, Bloch J, Ma SY, Chu Y, Leventhal L, McBride
J, Chen EY, PaM S, Roitberg BZ, Brown WD, Holden JE, Pyzalski R, Taylor MD, Carvey P, Ling Z, Trono D, Hantraye P, Deglon N, Aebischer P (2000)
Neurodegeneration prevented by lentiviral vector delivery of GDNF in primate models of Parkinson's disease. Science 290: 767-773), derivado del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-I), utilizando como envoltura viral la del virus de la estomatitis vesicular (VSV), producido por transfección transitoria y empaquetado de vectores plasmídicos en células 293T seguido de la concentración de dichas partículas virales mediante ultracentrifugación. Se ha generado un virus HIV de tercera generación mediante modificaciones de métodos ya publicados (DuIl HB (1988) Behind the AIDS mailer. Am J Prev Med 4: 239-240). Para ello se emplearon cuatro construcciones de forma similar a lo descrito anteriormente (Bosch A, Perret E, Desmaris N, Trono D, Heard JM. Reversal of pathology in the entire brain of mucopolysaccharidosis type VII mice after lentivirus-mediated gene transfer. Hum Gen
Ther 8: 1139-1150, 2000):
(i) un vector no solapante, RSV-Rev, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rev del virus del sarcoma de Roux (RSV);
(ii) un vector de empaquetado condicional, p-RRE, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE);
(iii) un vector, p-VSV, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector, en concreto, la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSV); y
(iv) un vector de transferencia, que lleva una construcción génica para el transgén en cuestión, en este caso, el IGF-IR.KR, y el promotor de la fosfogliceroquinasa, que permite que el vector que se transcribe se genere de forma eficiente en las células empaquetadoras (293T).
Los tres primeros vectores [l)-3)] son conocidos (véanse las referencias mencionadas previamente). La construcción de este último vector se llevó a cabo introduciendo un fragmento HincII-Xbal del cDNA del receptor de IGF-I que codifica una forma mutada del receptor de IGF-I, concretamente la forma mutada del receptor denominada IGF-IR.KR que contiene la mutación K1003R en la que el residuo de Usina de la posición 1003 ha sido sustituido por un residuo de arginina (Kato H, Faria TN,
Stannard B, Roberts CT, Jr., LeRoith D (1993) Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR- 3). J Biol Chem 268: 2655-2661), en el vector HlV-lacZ (Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D (1996) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272: 263-267). Brevemente, el cDNA que codifica la forma mutada del receptor de IGF-I que tiene la mutación K1003R (IGF-IR.KR) se introdujo en HlV-lacZ, mediante un intercambio del cassette lacZ por el cDNA que codifica IGF-IR.KR según metodología descrita (Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, de Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156). Para ello, el vector HlV-lacZ se cortó con Smal/Xbal para eliminar el cDNA de lacZ y se ligó con el cDNA que codifica IGF-IR.KR cortado con HincII/Xbal. Los sitios de restricción son homólogos. De este modo se obtuvo el vector de transferencia que lleva el transgén IGF-IR.KR. El vector lentiviral, denominado HIV/IGF-IR.KR o HTWKR en esta descripción, se obtuvo por transfección transitoria en las células 293T. Los plásmidos RSV-Rev, p- RRE, p-VSV y el vector de transferencia que lleva el transgén IGF-IR.KR son empaquetados de forma episomal en dichas células 293T (Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, de Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156). La línea celular 293T (obtenible comercialmente a través de American Type Culture Collection) es una línea de células epiteliales renales humanas transformadas que expresan el antigeno T de SV40 lo que permite la replicación episomal de los plásmidos y de la región del promotor. Previamente, se sembraron dichas células, en una densidad de 1-5 x 106 en placas de 10 cm de diámetro 24 horas antes de la transfección en un medio DMEM con 10% de suero fetal y penicilina (100 IU/ml). En la transfección se utilizó un total de 32,75 μg de DNA plasmídico por plato: 3 μg del plásmido p-VSV, 3,75 μg del plásmido RSV-Rev y 13 μg tanto del plásmido p -RRE como del plásmido de transferencia que lleva el transgén IGF-IR.KR. El precipitado se obtuvo añadiendo dichos plásmidos a 250 μl de H2O y 250 μl de CaCl2 0,5M, mezclando bien y añadiendo gota a gota a 500 μl de tampón salino-HEPES 2X (NaCl 280 mM, HEPES 100 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,12). A la vez que se agitaba, inmediatamente se añadió el precipitado a cada plato de cultivo. Se cambiaron 10 mi de medio a las 24 horas y finalmente se recogió al cabo de otras 24 horas, limpiándose con una centrifugación de baja velocidad y pasándose por filtros de acetato de celulosa (0,22 μm). Finalmente, y tras una serie de ultracentrifugaciones las partículas o vectores lentivirales, HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR), se resuspendieron en tampón salino-fosfato (PBS/BSA) para su posterior uso. Brevemente, en primer lugar se filtró el medio de cultivo de las placas con las células 293T a través de un filtro de 0,45 μm. Ese medio se centrifugó a 4°C durante 1 hora y media a 19.000 rpm. El precipitado se resuspendió en 1% de PBS/BSA, se dejó 1 hora en hielo y se centrifugó de nuevo a 4°C durante 1 hora y media a 19.000 rpm. Se volvió a resuspender en 1% de PBS/BSA, se dejó otra hora en hielo y se centrifugó a 4°C durante 5 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante final se congeló inmediatamente y se almacenó a -8O0C. Esta misma metodología se utilizó para purificar las partículas de HIV vacías y las partículas de HIV/GFP. Las partículas de HIV vacías (o vector HIV vacío), que corresponden a HlV-lacZ cortado con Smal/Xbal, y las partículas de HIV/GFP ya han sido descritas previamente (Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, de Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156). EJEMPLO 2.- Expresión del vector lentiviral en células epiteliales del plexo ceroideo
Para analizar la expresión de vectores lentiviral en células epiteliales del plexo coroideo se procedió a construir un vector lentiviral HFV7GFP que contenía el gen codificante de la GFP como transgén. Brevemente, el cDNA del gen de la proteína GFP (Clontech) fue subclonado en un vector de transferencia HIV-I [(pHR'CMV)-PGK en Desmaris N, Bosch A, Salaun C, Petit C, Prevost MC, Tordo N, Perrin P, Schwartz O, de Rocquigny H, Heard JM (2001) Production and neurotropism of lentivirus vectors pseudotyped with lyssavirus envelope glycoproteins. Mol Ther 4: 149-156], en los sitios de restricción BamHI/Sall, siguiendo la descripción detallada del Ejemplo 1, con lo que se obtuvo el vector lentiviral denominado HIV/GFP.
A continuación, los animales, ratas macho de 5-6 meses de edad (n=7), se sometieron a una inyección mediante cirugía estereotáxica con jeringa Hamilton, bajo anestesia con tribromoetanol, de 6 μl del vector HIV/GFP en cada ventrículo lateral (coordenadas estereotáxicas: 1 mm posterior al bregma, 1,2 mm lateral y 4 mm de profundidad), a un 1 μl por minuto. A los 6 meses se les sacrificó y se observó la presencia del transgén mediante fluorescencia. Para ello, el animal se perfundió transcardialmente con 4% de paraformaldehído. Posteriormente, el cerebro se cortó en vibratomo en cortes de 50 μm, los cortes se montaron seguidamente sobre portas gelatinizados y la fluorescencia de la proteína GFP se observó directamente al microscopio de fluorescencia (Leica).
De este modo se determinó que la administración en ratas adultas mediante inyección intracerebroventricular (icv) del vector lentiviral HIV/GFP (vector usado en la invención con el gen codificante de la proteína autofluorescente GFP como transgén) resulta en la expresión sostenida de la proteína GFP en el plexo coroideo (Figura 1).
EJEMPLO 3.- Transformación de células del epitelio de plexos ceroideos con el vector lentiviral HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR)
La monocapa de células epiteliales se obtuvo mediante un protocolo ya descrito (Strazielle,N. & Ghersi-Egea,J.F. (1999) Demonstration of a coupled metabolism-efflux process at the choroid plexus as a mechanism of brain protection toward xenobiotics. J.
Neurosci. 19: 6275-6289). Se sacrificaron ratas de entre 5 y 7 días y los plexos coroideos de los ventrículos laterales y cuarto se extrajeron rápidamente colocándose en un medio DMEM de cultivo sobre hielo. Seguidamente se procedió a su digestión enzimática con 1 mg/ml pronasa (Sigma) y 12,5 μg/ml DNase I (Boehringer Mannheim), con dispersión mecánica simultánea durante 15 minutos. Finalmente, se centrifugó (1.000 rpm) y las células se resuspendieron en DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 10 ng/ml de EGF (Epidemial Growth Factor) (Sigma), 5 ng/ml de FGF (Fibroblast Growth Factor) (Boehringer Mannheim) y gentamicina. Estas células se transformaron con el vector lentiviral HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) y con el vector HIV vacío, de la forma que se indica a continuación. Brevemente, tras 24 horas en cultivo, se cambió el medio por DMEM fresco conteniendo el virus (al menos 50 μg/ml, diluido entre 10"2 y 10"3) y 8 μg/ml de polybrene (Sigma). Este medio infectivo se remplazó a las 24 horas, se mantuvieron las células durante un día más y, finalmente, tras aspirar el medio, las células se lisaron y procesaron.
De este modo se observó que la administración del vector lentiviral HIV/IGF- IR.KR (HIV/KR) a células epiteliales en cultivo obtenidas del plexo coroideo de ratas postnatales generó una pérdida de respuesta al factor trófico IGF-I. Sólo en células infectadas con el vector HIV/KR, pero no en las transfectadas con el vector HIV vacío, el IGF -I no promovió transcitosis del péptido Aβl-40 (Figura 2). La transcitosis se cuantificó determinando la cantidad de Aβl-40 que pasa desde la cámara superior del cultivo a la inferior, para lo cual tiene que atravesar una monocapa de células epiteliales (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres-Alemán I (2002) Serum insulin- like growth factor I regulates brain amyloid-beta levéis. Nat Med 8: 1390-1397).
EJEMPLO 4.- Desarrollo de ncuropatología tipo Alzhcimcr en ratas adultas sanas Se infectaron ratas adultas sanas de la cepa Wistar con el vector HIV/IGF-IR.KR
(HIV/KR). Para ello, se inyectó mediante cirugía estereotáxica con jeringa Hamilton, bajo anestesia con tribromoetanol, 6 μl del vector HIV/IGF-IR.KR en ratas macho de 5- 6 meses de edad en cada ventrículo lateral (coordenadas estereotáxicas: 1 mm posterior al bregma, 1,2 mm lateral y 4 mm de profundidad), a 1 μl por minuto. Los animales controles recibieron, en las mismas condiciones, igual cantidad de vector viral HIV vacío (HIV). A los 5 meses se les analizó su capacidad cognitiva mediante el test de Morris de aprendizaje espacial en el que participa el hipocampo, estructura típicamente afectada en Alzheimer (Clark CM, Karlawish JH (2003) Alzheimer disease: current concepts and emerging diagnostic and therapeutic strategies. Ann Intern Med 138: 400- 410), siguiendo metodología estandarizada (Trejo JL, Carro E, Torres-Alemán I (2001) Circulating insulin-like growth factor I mediates exercise-induced increases in the number of new neurons in the adult hippocampus. J Neurosci 21: 1628-1634). Este test, conocido como "laberinto acuático" (o test de Morris) determina la memorización espacial (van der Staay FJ (2002) Assessment of age-associated cognitive déficits in rats: a tricky business. Neurosci Biobehav Rev 26: 753-759), que es uno de los déficits característicos de la enfermedad de Alzheimer. Al finalizar el test se les sacrificó (6 meses después de la inyección del vector viral) y se perfundieron a través de la arteria aorta con tampón salino, e, inmediatamente, se extrajo el cerebro, conservándose a - 800C un hemisferio para su posterior procesamiento por "western blot" y el otro hemisferio se fijó mediante inmersión 24 horas en 4% de paraformaldehido para su estudio inmunohistoquímico.
Se determinaron los niveles de amiloide (Aβ) cerebral y en el líquido cefalorraquídeo (LCR) por técnicas de western blot, ELISA y por inmunocitoquímica, siguiendo metodología ya descrita (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres- Alemán I (2002) Serum insulin-like growth factor I regulates brain amyloid-beta levéis. Nat Med 8: 1390-1397) y niveles de tau hiperfosforilada (HPF-tau) en corteza también por western blot e inmunocitoquímica (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres-Alemán I (2002) Serum insulin-like growth factor I regulates brain amyloid-beta levéis. Nat Med 8: 1390-1397). Asimismo, se evaluó la presencia de depósitos de HPF-tau y de amiloide por técnicas inmunocitoquímicas (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres-Alemán I (2002) Serum insulin-like growth factor I regulates brain amyloid-beta levéis. Nat Med 8: 1390-1397). Los animales con la señalización de IGF-I bloqueada en el plexo coroideo por administración del vector HIV/IGF-IR.KR presentaron déficits cognitivos significativos en el aprendizaje y en memorización espacial (Figuras 3A y 3B).
Además, se observó un incremento significativo en los niveles de Aβ del parénquima cerebral comparado con los animales controles y en paralelo, una disminución de los niveles de Aβ en el LCR (Figuras 4 A y 4B). Ambas alteraciones son típicas de la enfermedad de Alzheimer (Selkoe DJ (2001) Clearing the Brain's Amyloid Cobwebs. Neuron 32: 177-180; Sunderland T, Linker G, Mirza N, Putnam KT, Friedman DL, Kimmel LH, Bergeson J, Manetti GJ, Zimmermann M, Tang B, Bartko JJ, Cohén RM (2003) Decreased beta-amyloidl-42 and increased tau levéis in cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer disease. JAMA 289: 2094-2103). Junto a esta amiloidosis se apreció un acumulo intra y extracelular de HPF-tau en regiones telencefálicas (Figura 5). Los acúmulos extracelulares contienen también ubiquitina (Figura 5C) y son también característicos de la enfermedad de Alzheimer (Clark CM, Karlawish JH (2003) Alzheimer disease: current concepts and emerging diagnostic and therapeutic strategies. Ann Intern Med 138: 400-410). Además, los animales padecieron alteraciones celulares tipo Alzheimer ya que presentaron gliosis reactiva en asociación a los depósitos proteicos y déficits significativos de proteínas sinápticas (Masliah E, Mallory M, Alford M, DeTeresa R, Hansen LA, McKeel DW, Jr., Morris JC (2001) Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease. Neurology 56: 127-129).
En resumen, los animales inyectados con el vector lentiviral de expresión prolongada HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) presentaron características neuropatológicas asociadas a la enfermedad de Alzheimer: altos niveles cerebrales de amiloide, presencia de agregados intra y extracelulares de tau hiperfosforilado y ubiquitina y déficits cognitivos.
EJEMPLO 5.- Desarrollo de neuropatología tipo Alzheimer en ratones con fondo genético modificado (ratones LID)
Otro ejemplo de la invención consistió en generar cambios patológicos tipo Alzheimer en ratones de origen transgénico. Los ratones elegidos son, además, viejos, para imitar mejor las condiciones normales donde se desarrolla la patología de Alzheimer en seres humanos. Se inyectó el vector HIV/IGF-IR.KR (HIV/KR) a ratones transgénicos LID de más de 15 meses y con genotipo manipulado. Los ratones transgénicos empleados en este ejemplo son deficientes en IGF-I sérico por haber sido anulado el gen hepático del IGF-I por el sistema Cre/Lox (ratones LID) (Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B, LeRoith D (1999) Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I. Proc Nati Acad Sci U S A 96: 7324-7329). Los ratones LID ya presentan, per se, algunas de las características de la enfermedad de Alzheimer ya que el déficit de IGF-I genera amiloidosis y gliosis (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres-Alemán I (2002) Serum insulin-like growth factor I regulates brain amyloid-beta levéis. Nat Med 8: 1390-1397). Además, al ser viejos, presentan déficits cognitivos y amiloidosis (Bronson RT, Lipman RD, Harrison DE (1993) Age-related gliosis in the white matter of mice. Brain Res 609: 124-128; van der Staay FJ (2002) Assessment of age-associated cognitive déficits in rats: a tricky business. Neurosci Biobehav Rev 26: 753-759). El objetivo de este ensayo fue obtener unas condiciones más favorables a la producción de amiloidosis con el fin de determinar si el sistema proporcionado por esta invención llega a generar depósitos de amiloide, una de las características de la enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos y reactivos utilizados se describen en los ejemplos anteriores. Los animales fueron sacrificados a los 3 meses de la inyección de los vectores virales.
Tan sólo 3 meses después de la administración del vector HIV/KR los ratones LID viejos presentan déficits cognitivos severos (Figura 6A), y amiloidosis y taupatia similares a los observados en ratas adultas tras 6 meses de exposición al vector viral (resultados similares a los descritos en Figuras 4 y 5, datos no mostrados). Lo importante es que en este modelo se consigue un estado más avanzado de la enfermedad: los animales presentan acúmulos de amiloide, que aún no siendo congofílicos (no se tifien con el marcador de placas insolubles "Rojo Congo") presentan características típicas de placas difusas (Figura 6B).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un animal no humano útil como modelo experimental caracterizado porque presenta una alteración de la actividad biológica del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I (IGF-I) localizada en las células del epitelio del plexo coroideo de los ventrículos cerebrales.
2. Animal según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha alteración de la actividad biológica del receptor de IGF-I consiste en su anulación biológica.
3. Animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque es un mamífero.
4. Animal según la reivindicación 3, caracterizado porque se selecciona entre un roedor y un primate.
5. Animal según la reivindicación 4, caracterizado porque es una rata o un ratón.
6. Animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha alteración de la función del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo es debida a la expresión de una forma mutada no funcional dominante de dicho receptor IGF-I.
7. Animal según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KR que presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de arginina.
8. Animal según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KA que presenta la mutación Kl 003 A, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de alanina.
9. Animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un animal normal.
10. Animal según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho animal es una rata normal sana.
11. Animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un animal transgénico.
12. Animal según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho animal transgénico es un ratón transgénico LID.
13. Animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, útil como modelo experimental de una enfermedad neurodegenerativa.
14. Animal según la reivindicación 13, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la Enfermedad de Alzheimer.
15. Un procedimiento para la obtención de un animal no humano útil como modelo experimental según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende la anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo de dicho animal no humano mediante un proceso de transgénesis.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I comprende la administración a células epiteliales del plexo coroideo de un animal no humano desarrollado de una construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I, o de un vector que comprende dicha construcción génica, para transformar dichas células epiteliales del plexo coroideo de manera que expresen dicha forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la administración de dicha construcción génica o de dicho vector a dichas células epiteliales del plexo coroideo se lleva a cabo mediante inyección intracerebroventricular (icv).
18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho vector se selecciona entre un vector viral y un vector no viral.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho vector viral es un vector lentiviral.
20. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KR que presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de arginina.
21. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KA que presenta la mutación Kl 003 A, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de alanina.
22. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho animal no humano es un animal no humano normal.
23. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho animal no humano es un animal no humano transgénico.
24. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I comprende la transformación de células epiteliales del plexo coroideo de un animal no humano mediante la introducción de una construcción génica que comprende un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad biológica, o un vector que comprende dicha construcción génica, en donde dicho elemento inhibidor se selecciona entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, b) una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, c) un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, y d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del receptor de IGF-I.
25. Un vector lentiviral obtenible mediante transfección transitoria en células empaquetadoras de : un plásmido (i) que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
- una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I, y
- una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional; un plásmido (ii) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rev; un plásmido (iii) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE); y un plásmido (iv) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la envoltura heteróloga del vector.
26. Vector según la reivindicación 25, en el que dicho plásmido (i) es un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutada no funcional del receptor de IGF-I seleccionada entre la secuencia de nucleótidos que codifica la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KR que presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de arginina y la secuencia de nucleótidos que codifica la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KA que presenta la mutación Kl 003 A, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de alanina.
27. Vector según la reivindicación 25, en el que dicho plásmido (i) es un plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad funcional seleccionada entre una secuencia de nucleótidos que codifica: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, b) una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, c) un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, y d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del receptor de IGF-I.
28. Vector viral según la reivindicación 25, en el que: dichas células empaquetadoras son células 293T; dicho plásmido (i) es el plásmido definido en la reivindicación 27 ó 28; dicho plásmido (ii) es el plásmido identificado como RSV-Rev, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rev del virus del sarcoma de Rous (RSV); dicho plásmido (iii) es el plásmido identificado como p-RRE, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de respuesta a Rev (RRE); y dicho plásmido (iv) es el plásmido identificado como pVSV, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSV).
29. Uso de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en un procedimiento para la obtención de un animal no humano útil como modelo experimental según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24.
30. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo comprende la administración de una construcción génica que comprende promotor específico de plexo coroideo y un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica una forma mutada no funcional dominante del receptor de IGF-I, o de un vector que comprende dicha construcción génica, a células embrionarias de dicho animal no humano.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KR que presenta la mutación K1003R, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de arginina.
32. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que dicha forma mutada no funcional dominante del receptor IGF-I es la forma mutada no funcional del receptor de IGF-I denominada IGF-IR.KA que presenta la mutación Kl 003 A, en la que el residuo de Usina de la posición 1003 de la secuencia de aminoácidos del receptor de IGF-I humano ha sido sustituido por un residuo de alanina.
33. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho proceso de transgénesis de anulación de la actividad funcional del receptor de IGF-I en las células epiteliales del plexo coroideo comprende la administración de una construcción génica que comprende promotor específico de plexo coroideo y un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos codifica un elemento inhibidor de la expresión del gen del receptor de IGF-I capaz de anular su actividad biológica, o un vector que comprende dicha construcción génica a células embrionarias de dicho animal no humano, en donde dicho elemento inhibidor se selecciona entre: a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA del receptor de IGF-I, b) una ribozima específica del mRNA del receptor de IGF-I, c) un aptámero específico del mRNA del receptor de IGF-I, y d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA del receptor de IGF-I.
34. Procedimiento según la reivindicaciones 30 a la 33, en el que dicho promotor específico de tejido es el promotor del gen transtirretina.
35. Procedimiento según la reivindicaciones 30 a la 34, en el que dicho proceso de transgénesis es inducible.
36. Uso de un animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como modelo para el estudio del mecanismo etiopatogénico de una enfermedad neurodegenerativa o para la identificación y evaluación de compuestos terapéuticos frente a dicha enfermedad.
37. Uso, según la reivindicación 36, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad neurodegenerativa que cursa con demencia.
38. Uso, según la reivindicación 36 ó 37, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad neurodegenerativa humana.
39. Uso, según la reivindicación 36, de un animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como modelo para el estudio de los mecanismos etiopatogénicos de la enfermedad de Alzheimer o para la identificación y evaluación de compuestos terapéuticos frente a dicha enfermedad.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999873A (zh) * 2021-12-31 2022-02-01 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2067858A1 (en) 2007-12-07 2009-06-10 Universidad de Sevilla Animal models for neurodegenerative diseases
AU2009307677C1 (en) * 2008-10-20 2022-09-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
RU2498415C1 (ru) * 2012-07-24 2013-11-10 Государственное бюджетное учреждение "Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней Академии наук Республики Башкортостан" Способ моделирования диабетического макулярного отека
CN113423828A (zh) * 2018-11-15 2021-09-21 埃斯蒂维制药有限公司 粘多糖累积病iva型的动物模型

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997037010A1 (en) * 1996-04-01 1997-10-09 Apoptosis Technology, Inc. Active survival domains of igf-ir and methods of use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0212303D0 (en) * 2002-05-28 2002-07-10 Isis Innovation Molecular targetting of IGF-1 receptor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997037010A1 (en) * 1996-04-01 1997-10-09 Apoptosis Technology, Inc. Active survival domains of igf-ir and methods of use

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHODOBSKI A ET AL: "Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis.", MICROSCOPY RESEARCH AND TECHNIQUE., vol. 52, no. 1, January 2001 (2001-01-01), pages 65 - 82, XP008113952 *
KALEBIC ET AL: "Expression of a kinase-deficient IGF-I-R suppresses tumorigenicity of rhabdomyosarcoma cells constitutively expressing a wild type IGF-I-R.", INT J CANCER., vol. 76, 1998, pages 223 - 227, XP008113951 *
KATO H ET AL: "Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR-3).", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., vol. 268, no. 4, February 1993 (1993-02-01), pages 2655 - 2661, XP008114108 *
SCHREIBER ET AL: "The evolution of transthyretyn synthesis in the chrodoid plexus.", CLIN CHEM LAB MED., vol. 40, no. 12, 2002, pages 1200 - 1210, XP008114032 *
See also references of EP1808070A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999873A (zh) * 2021-12-31 2022-02-01 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用
CN113999873B (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用

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