PROCEDE DE FABRICATION D'UNE EBAUCHE DE BIOPUCE, EBAUCHE ET BIOPUCE
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'une ébauche de biopuce, à une ébauche susceptible d'être obtenue par ce procédé, ainsi qu'à une biopuce.
La biopuce est un outil d' analyse permettant de détecter des molécules biologiques sur un support solide. Elle comprend donc un support solide, appelé aussi substrat, sur lequel sont fixées des molécules biologiques, appelées sondes, capables de reconnaître et de fixer spécifiquement d' autres molécules biologiques, appelées cibles, en vue de détecter et/ou doser ces dernières. La fixation des sondes sur le substrat est appelée fonctionnalisation du substrat. L'ébauche de biopuce de la présente invention est en fait une puce non fonctionnalisée par des sondes. Cette ébauche possède des groupements silanols qui permettent aisément de la fonctionnaliser par les procédés chimiques ou électrochimiques connus de l'homme du métier dans le domaine des biopuces, et d'obtenir ainsi une biopuce.
Selon l'invention, le phénomène de reconnaissance et fixation moléculaire d'une cible par une sonde fixée sur le substrat peut être défini comme une interaction spécifique entre deux molécules plus ou moins complexes, conduisant à une liaison des deux
molécules suffisamment stable pour que leur liaison, c'est-à-dire l'ensemble sonde/cible, puisse être détecté. Il peut s'agir par exemple d'une hybridation d'acides nucléiques (ADN et/ou ARN), d'une réaction de reconnaissance de type antigène/anticorps, d'une interaction de type protéine/protéine, d'une interaction de type enzyme/substrat, etc. Des exemples sont donnés ci-dessous.
La présente invention trouve spécialement des applications dans la fabrication de puces de détection d'acides nucléiques par hybridation, notamment dans le cadre d'analyses biologiques, par exemple à des fins de recherche ou de diagnostic ; dans le cadre d'un criblage ("screening") , par exemple dans le domaine de la pharmacie pour rechercher de nouveaux principes actifs et/ou pour étudier des interactions de molécules biologiques avec leur cible dans des banques d'informations où des gènes, des séquences d'acides nucléiques, des polymorphismes, des variétés alléliques ou allotropiques renseignent sur la pertinence, l'efficacité ou la toxicité d'une molécule médicamenteuse sur des classes d'individus ; dans le cadre d'une cartographie génétique ; dans le cadre d'une mise en œuvre d'un procédé utilisant la technique de réaction en chaîne par une polymérase (PCR) , par exemple pour l'identification d'un échantillon biologique, etc.
Les molécules biologiques concernées par la présente invention sont donc notamment des acides nucléiques (ADN ou ARN) , des protéines, des sucres, des glycoprotéines, des glycolipides, etc. naturelles ou
synthétiques, et la présente invention se rapporte en particulier à la fabrication d'une ébauche de biopuce permettant d' obtenir facilement des puces biologiques qui utilisent la reconnaissance et la fixation moléculaire définie ci-dessus.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ( [ ] ) renvoient à la liste des références présentée après les exemples.
Art antérieur
Le développement d'une chimie efficace pour la fabrication de matrice de microsondes, par exemple d'ADN, sur un support solide est essentiel à la réalisation et à la validité des puces biologiques. Par exemple, dans la plupart des puces à ADN, le fonctionnement repose sur le greffage d'un brin d'ADN modifié appelé sonde, et de la mise en contact de la solution à analyser contenant potentiellement le brin complémentaire qui permettra la réaction d'hybridation. Cette réaction d'hybridation sera ensuite détectée grâce à un marquage fluorescent ou un autre type de détection approprié pour la détecter. La reproductibilité et l'intégrité des réactions d'hybridation sont fortement dépendantes de la qualité et des caractéristiques des matrices ADN, et donc aussi du support utilisé.
Ainsi, le développement d'une chimie simple et reproductible pour produire ces matrices d'ADN doit prendre en compte de nombreux paramètres dont l'accessibilité et la fonctionnalité des sondes, la densité des attaches, la stabilité de la matrice, la
reproductibilité de l'hybridation et le fait que ce soit la séquence voulue qui soit hybridée.
Aussi, de manière générale, pour la fabrication d'une biopuce, les trois aspects suivants sont considérés : la chimie de fonctionnalisation du support, ou substrat, la localisation du greffage des sondes, et la tridimensionnalité, en particulier la nanostructuration.
Il n'existe pas actuellement de procédé de fabrication qui permet d'optimiser à la fois ces trois aspects, et donc d'obtenir une biopuce extrêmement précise à l'échelle du nanomètre. Les principaux inconvénients qui en découlent, sont les défauts de précision et de reproductibilité des analyses effectuées notamment à cette échelle.
Au sujet de la chimie de fonctionnalisation, de nombreux chercheurs se sont intéressés à l'immobilisation d' oligonucléotides (ODN) modifiés sur des supports solides tel que le verre, le silicium, une membrane ou du gel (« gel-pad » en anglais) . Deux principales stratégies pour la fabrication des puces à ADN sont disponibles actuellement : la première stratégie consiste à synthétiser 1 ' oligonucléotide sur des zones localisées du support pour des immobilisations in situ, soit grâce à un procédé de lithographie, soit grâce à une technique semblable aux imprimantes jet d'encre. La seconde stratégie consiste à immobiliser sur le substrat des oligonucléotides pré¬ synthétisés . Dans toutes ces stratégies, la surface du support nécessite une fonctionnalisation s 'effectuant
avantageusement en plusieurs étapes. Par exemple, dans le cas d' oligonucléotides pré-synthétisés, la fonctionnalisation des supports passe classiquement par une création de groupements silanols qui ne peuvent pas réagir directement avec les ODN modifiés, il est donc nécessaire de fonctionnaliser la surface par une couche de silanes comportant un groupement réactif, par exemple un époxyde ou un aldéhyde. Cette fonction peut alors réagir avec le groupement terminal de 1 'ODN pré- synthétisé. Par exemple, les documents [1], [2], [3] décrivent de tels procédés de fonctionnalisation. Dans le cas d'immobilisation in situ, la condition de greffage est la présence de fonctions silanol en surface, qui seront ensuite, par exemple, photo- déprotégées.
Au sujet de la localisation des zones de greffage, elle présente de nombreux effets dans la fabrication et l'utilisation d'une biopuce. Cette localisation peut, par exemple, permettre l'optimisation de la détection d'hybridation par méthode optique.
Plusieurs techniques permettant la localisation des sondes ont été développées dans le passé pour les deux types de stratégie d'immobilisation de sondes. Dans le cas d' oligonucléotides (ODN) pré-synthétisés, une technique d'électropolymérisation permet de localiser les sondes pré-synthétisées . Cette technique est basée sur un adressage électrochimique de sondes modifiées pré-synthétisées. Dans le cadre de synthèse in situ, il est possible de déposer successivement à une position précise les quatre bases de l'ADN. La
localisation initiale est rendue possible grâce à un masquage photolitographique.
Au sujet de l'aspect tridimensionnel de la surface de greffage : cette tridimensionnalité permet d'augmenter de façon significative la surface du support, ce qui conduit à une densité de greffage plus importante et donc une amélioration du signal de fluorescence. A titre d'exemple, l'utilisation de « gel-pad » tridimensionnel décrite dans le document [4] pour l'immobilisation d'ODN offre des densités de greffage beaucoup plus importantes que les méthodes de matriçage bidimensionnel traditionnelles, du fait d'une surface beaucoup plus importante.
Récemment, l'utilisation d'un matériau nanostructuré a permis un gain de surface important pour le greffage de molécules biologiques comparativement à un substrat plan ou microstructuré, par exemple dans le cas de l'utilisation de nanoparticules de silicium [1] sur lesquels des oligonucléotides pré-synthétisés peuvent être greffés ou sur des nanotubes de carbone [5]. La précision de ces nanostructures est importante, mais pas encore satisfaisante.
Le matriçage à haute densité de matrices d' oligonucléotides est apparu comme un outil prometteur pour le décryptage du génome humain à plus faible coût et plus fort rendement que les méthodes utilisées dans le passé. Par exemple, des matrices d' oligonucléotides, appelées aussi puces à ADN, ont été utilisées pour la détection de mutation génétique, le décodage du code moléculaire et autre. La puissance de ces puces à ADN
provient du fort parallélisme, de l'adressage et de miniaturisation de la matrice qui permet des gains non négligeables en terme de coût, de travail, de vitesse, de rendement vis-à-vis des autres méthodes (type mini- éprouvettes) .
Il existe donc une demande permanente de trouver de nouveaux matériaux et de nouveaux procédés de fabrication de puces permettant d' obtenir des structurations plus fines et plus précises encore, au niveau nanométrique, que celles de l'art antérieur, afin de pouvoir augmenter encore les capacités d'analyse, de reproductibilité et de précision des nombreux procédés d' analyse sur puces biologiques développés à ce jour et futurs.
Exposé de l'invention
La présente invention permet précisément de résoudre les problèmes précités de l'art antérieur et d' améliorer encore la précision de fabrication des laboratoires sur puce, en particulier des biopuces. Elle propose une méthode de réalisation de substrats nanostructurés permettant le greffage localisé de molécules biologiques, par exemple d' oligonucléotides, notamment à des échelles supérieures à celles de l'art antérieur, et avec une précision et une reproductibilité améliorées.
En particulier, la présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'une ébauche de biopuce comprenant les étapes suivantes : (a) dépôt sur une surface d'un substrat d'une résine constituée d'un silsesquioxane ;
(b) recuit de la couche de résine déposée de manière à la figer ;
(c) structuration d'au moins un motif géométrique dans ladite couche figée par un rayonnement photonique ou un bombardement électronique ou ionique ;
(d) développement dudit, au moins un, motif géométrique structuré, et recuit dudit motif restant après développement pour le densifier ; et
(e) traitement du motif développé pour former sur celui-ci des groupements silanols afin d'obtenir ladite ébauche de biopuce.
L'ébauche de biopuce de la présente invention est définie ci-dessus.
Le substrat est le support sur lequel l'ébauche de biopuce est formée, et donc sur lequel une biopuce pourra être formée, à partir de cette ébauche. Il peut être constitué de l'un quelconque des matériaux connus de l'homme du métier et utilisés en tant que support pour la fabrication de biopuces. Le substrat peut être par exemple constitué de verre, de silicium, etc. Les documents [2] et [3] décrivent de tels supports, utilisables dans la présente invention.
La présente invention se fonde sur l'utilisation d'un matériau particulier, appelé dans la présente « résine » (de l'anglais « resist ») , par analogie avec les matériaux organiques ou minéraux utilisés pour la photolithographie, qui peut être déposé sur le substrat sous forme de couche, et qui
peut être structuré au niveau nanométrique, par modification de ses propriétés physico-chimiques, en l'exposant à un rayonnement photonique ou bombardement électronique ou ionique. Ce matériau particulier est constitué de silsesquioxane, c'est-à-dire principalement d'une matrice d'un polymère inorganique de silicium et d'oxygène. Ce matériau est également appelé « silsesquioxane oligomérique polyédrique ». Il est constitué de structures cages, comprenant généralement 8, 10, 12, 14 ou 16 atomes de silicium, le plus souvent 8 ou 10.
Par exemple, selon l'invention, le silsesquioxane peut être de formule (R-SiOi,5)n , avec n = 8, 10, 12, 14 ou 16 , dans laquelle R = H ou CH3 , et de manière plus générale, dans laquelle R peut être un alkyle en Ci à C5, un cycloalkyle en Ci à C5 ou un aryle en Ci à C5, ou un groupe réactif/ polymérisable tel qu'un groupe acrylique, α-oléfine, styrène, époxyde, acide carboxylique, isocyanate, aminé, alcool et silane. On peut citer à titre d'exemple l'hydrogène silsesquioxane (HSQ) et le méthyle silsesquioxane (MSQ) .
Ces matériaux ont en commun le fait qu'ils peuvent être déposés facilement sous forme de couche sur un substrat ; qu'ils peuvent facilement être structurés dans l'étape (c) du procédé de l'invention par exposition à un faisceau photonique, électronique ou ionique ; et qu'ils permettent de former facilement des liaisons silanols à leur surface suivant l'étape (e) du procédé de l'invention, par exemple sous traitement thermique ou sous un autre traitement.
Ces matériaux peuvent être synthétisés par hydrolyse et condensation de triméthoxyaminosilanes préalablement fonctionnalisés. Ils sont disponibles dans le commerce, par exemple auprès de la société DOW Corning Co (Etats-Unis) .
Le matériau silsesquioxane uilisé dans la présente invention est une résine négative, ce qui signifie qu'après développement ne restent que les parties ou les zones de ce matériau qui ont été exposées. Si on utilise une résine positive, il faudra exposer les zones complémentaires du motif voulu.
L'étape de dépôt (étape (a) du procédé de l'invention), appelée aussi couchage, de la couche de résine peut être réalisée par toute technique appropriée connue de l'homme du métier pour déposer un matériau en couche, de préférence uniforme, sur une surface, en particulier à l'échelle d'un laboratoire sur puce, en particulier d'une biopuce. De manière générale, il peut s'agir d'une technique d'étalement du matériau, de dépôt à la tournette, de pulvérisation, etc. Un dépôt à la tournette permet avantageusement de déposer une couche d'épaisseur uniforme sur la surface du substrat. Le couchage de la résine peut se faire à l'aide d'une tournette de manière similaire à une réserve organique classique, et permet de moduler l'épaisseur de la couche déposée.
En général, le dépôt est réalisé à partir du silsesquioxane en solution dans un solvant organique de type méthyle isobutyl cétone (MIBK) . Il peut s'agir par exemple d'un solvant du 2-pentanone, de toluène, de tétradécane, etc., par exemple, avantageusement, du 4-
méthyle-2-pentanone. La suspension du matériau dans le solvant est préparée de préférence de manière à pouvoir « coucher » le matériau de manière uniforme sur la surface du substrat. L'épaisseur de silsesquioxane déposée dépend notamment de la taille du, au moins un, motif géométrique souhaité qui sera développée. En général, l'épaisseur de la couche déposée est de quelques nanomètres, par exemple dans la gamme allant de 90 nm jusqu'à plusieurs μm en utilisant des techniques de couchage particulières telles que celles décrites dans la présente. Pour une fabrication d'une biopuce, l'épaisseur peut être par exemple de 10 à 500 nm, par exemple de 10 à 200 nm. Une fois l'étape de dépôt achevée, le procédé de l'invention met en œuvre une étape (b) de recuit du matériau silsesquioxane déposé. Cette étape permet de figer la couche de silsesquioxane déposée sur le substrat. Elle permet également d'éliminer le solvant résiduel présent dans la couche de silsesquioxane déposée. Le recuit peut être effectué par exemple à une température dans la gamme 1000C à 25O0C, ce qui n'entraîne pas de modification chimique de la couche.
La durée du recuit dépend bien entendu de l'épaisseur de la couche de matériau déposée, de la quantité et de la nature du solvant, et de la température de recuit. L'homme du métier saura aisément adapter la température et la durée du recuit pour que la couche de silsesquioxane déposée soit figée. Par exemple, pour les températures indiquées précédemment, la durée de recuit se situe généralement entre 1 et
2 minutes. Par exemple, pour une épaisseur de silsesquioxane de 100 nm, une température de 15O0C, un recuit de 120 secondes suivi d'une montée en température à 22O0C et d'un recuit de 120 secondes permet de figer la couche de matériau sur la surface du substrat .
L'étape (c) de structuration de la couche de silsesquioxane figée permet de créer au moins un motif géométrique dans ladite couche au moyen d'un rayonnement photonique ou d'un bombardement électronique ou ionique comme le montre le document [6] . Ces moyens de structuration permettent de former des motifs géométriques avec une précision à l'échelle de quelques nanomètres. Pour l'exposition, par exemple dans le cas d'un bombardement électronique, les tensions d'accélération utilisées sont par exemple 50 et 100 keV. La durée d'exposition dépend de la dose (en μC/cm2) choisie à laquelle le matériau est exposé. Concernant le HSQ, par exemple, la dose d'exposition est de l'ordre de 500 à 2000 μC/cm2 à 50 keV ; et de 2000 à 5000 μC/cm2 à 100 keV. En fonction du courant utilisé et du mode d'écriture, le temps d'exposition peut être modulé. Le diamètre du faisceau utilisable est dépendant du courant utilisé. Par exemple à 200 pA, le diamètre du faisceau est de l'ordre de 20 nm à 50 keV, et de l'ordre de 5 nm à 100 keV.
Les appareils utilisables pour appliquer ce rayonnement photonique ou ce bombardement électronique ou ionique sont ceux connus de l'homme du métier. Il s'agit avantageusement, dans la présente invention, des
faisceaux gaussien d'électron (« Gaussian beam ») . Sont également utilisables, par exemple, des faisceaux profilés (« shape beam ») qui consiste à écrire directement des motifs de forme géométrique variées ou de tout autre outils d'exposition.
La réaction suivante s'effectue lorsque la couche de silsesquioxane figée est exposée à un faisceau d'électrons (« eBeam » en anglais) lors de l'étape de structuration, comme le décrit le document [6] :
faisceau d'électrons ^Si H ^ ≡Si . fonction radicalaire
H2O ^Si . ^ ≡SiOH fonction silanol
- H2O ^SiOH *~ ≡SiOSi≡ fonction siloxane
Les liaisons SiH, moins f ortes que les liaisons SiO , sont cas sées sous le f aisceau d ' électrons . Des liaisons siloxanes sont ainsi f ormées via des liaisons silanols instables .
Par exemple , la structure cage à 8 atomes de silicium incluse dans le HSQ , se « polymérise » comme représentée ci-des sous :
dans laquelle R est tel que défini ci-dessus, par exemple H ou CH
3.
La littérature, par exemple le document [7] , indique que les liaisons SiO impliquées dans ces structures relativement contraintes ont une signature infrarouge particulière à 1130 cm"1 et 1080 cm"1 correspondant à la vibration d'élongation asymétrique de la liaison. Les liaisons SiH ont aussi leurs signatures infrarouges propres, correspondant à une vibration d'élongation à 2260-2285 cm"1, et une autre associée à la fréquence de distorsion de la liaison à 860 cm"1.
Cette étape de structuration permet donc une modification chimique intime de zones précises et déterminées de la couche de résine, ce qui permet de former dans ladite couche des motifs géométriques, motifs qui seront dégagés de la couche de résine lors de l'étape de développement qui permet de retirer la résine non exposée.
Le procédé de l'invention permet avantageusement, du fait de la résine particulière utilisée et de la technique particulière de structuration de cette résine, d'obtenir n'importe
quelle forme géométrique (forme quelconque) , de n'importe quelle hauteur, bien sûr dans la limite de l'épaisseur de la couche de résine déposée à la surface du substrat, et de n'importe quel espacement entre les motifs géométriques gravés. Les motifs géométriques de plus petites dimensions qui peuvent être obtenus dans le procédé de l'invention sont de quelques nanomètres seulement, dans toutes les directions de l'espace, et très avantageusement avec une très faible rugosité sur ses contours. En général, l'épaisseur de la couche de résine déposée est dans la gamme allant de quelques nanomètres, par exemple 5 à 20 nm, jusqu'à plusieurs μm. Pour la fabrication d'une biopuce, l'épaisseur de la couche varie en général de 20 à 500 nm. Les motifs géométriques peuvent donc avoir une hauteur par rapport à la surface du substrat équivalente à ces dimensions dans la limite de l'épaisseur de la couche de résine.
Selon l'invention, le, au moins un, motif géométrique peut être en creux par rapport à la couche de résine déposée figée ou en saillie par rapport à cette couche, et, si elle est totalement gravée, c'est- à-dire jusqu'à la surface du substrat, par rapport à la surface du substrat. Des exemples de creux ((II) (ml) et (III) (m2)) ou saillies ( (I) (m) et (II) (ml) ) formés à partir de la couche de résine sont montrés sur la figure 1 annexée.
Il peut s'agir par exemple d'une ou plusieurs cuvette (s), formée (s) dans la couche de résine, par exemple de section carrée, ronde, rectangulaire, triangulaire, polygonale, etc. ou de tout autre motif géométrique souhaité. Il peut s'agir par exemple aussi
d'une ou plusieurs saillie (s), dégagée (s) à partir de ladite couche de résine, par exemple de section carrée, ronde, rectangulaire, triangulaire, polygonale, etc. ou de tout autre motif géométrique souhaité. Il peut s'agir également d'un motif allongé, en creux et/ou en saillie, s' étendant sur tout ou partie de la surface du substrat. Selon l'invention, il est bien entendu possible de former à la fois des creux et des saillies sur un même substrat. Selon l'invention, l'étape (c) de gravure peut consister également à former une matrice ou un réseau de motifs géométriques nanométriques . Cela trouve un intérêt par exemple pour la fabrication d'une ébauche qui permettra de fabriquer une biopuce destinée à des analyses multiparamétriques . Un exemple de matrice ou réseau est montré sur la figure 6 annexée. Des motifs de l'ordre de 10 nm peuvent aisément être obtenus, ainsi que des matrices de structures de dimensions nanométriques séparées par des distances elles-mêmes nanométriques.
Les structures obtenues sont tridimensionnelles. Les distances entre les structures ainsi que la hauteur et la forme peuvent avantageusement être modulées, au besoin, en fonction par exemple de la taille des molécules biologiques à greffer, par exemple de la taille d' oligonucléotides à greffer. Afin d'augmenter la densité de greffage, la résine peut aussi être présente entre les motifs nanométriques. Dans ce cas, la gravure retire une partie seulement de l'épaisseur de la couche de
silsesquioxane autour des motifs formés (voir figure 1 (III) (m2)) .
Des exemples illustratifs et non limitatifs de motifs géométriques, matrice et réseaux qui peuvent être obtenus par le procédé de la présente invention sont fournis dans les exemples ci-dessous, sur les figures annexées, et dans le document [6] .
Le matériau silsesquioxane choisi par les inventeurs permet avantageusement que les zones non exposées au rayonnement ou bombardement précité puissent être retirées sélectivement et facilement de la surface du substrat lors de l'étape (d) de développement du procédé de l'invention, sans endommager les motifs gravés qui restent sur la surface du substrat, et sans limitation de procédé. L'étape de développement est appelée ainsi dans la présente par analogie aux procédés de photolithographie.
Ce développement consiste donc à dégager ledit, au moins un, motif géométrique gravé. Le développement peut être réalisé par exemple au moyen d'un solvant de nettoyage de la surface, qui permet de retirer sélectivement la résine pour laisser place au (x) motif (s) géométrique (s) gravé (s) . Le solvant de nettoyage peut être par exemple de l'hydroxyde de tétraméthylammonium (TMAOH) qui est un développeur basique agissant sur la résine suivant une réaction acido-basique. Il peut s'agir par exemple d'une solution aqueuse basique, par exemple d'une solution de TMAOH, par exemple à une concentration dans la gamme de 0,19 à 0,22 mol.l"1.
Après cette étape de développement, les motifs géométriques qui restent à la surface du substrat sont traités dans l'étape (e) pour former des groupements silanols en vue d'un greffage (fonctionnalisation) ultérieur, par exemple de molécules biologiques, par exemple d' oligonucléotides, pour la fabrication d'une biopuce. Le document [9] décrit un procédé utilisable pour le greffage d' oligonucléotides sur les groupes silanols de l'ébauche de la présente invention. Après les étapes de gravure et de développement, un grand nombre de liaisons SiH sont encore présentes dans résine figée. Les motifs géométriques gravés, ou nanostructures, présentent donc encore un grand nombre de liaisons SiH provenant de la résine de départ. L'étape (e) consiste à transformer ces liaisons en liaisons silanols. Tout procédé chimique connu de l'homme du métier permettant cette transformation est utilisable dans la présente invention. Par exemple, selon l'invention, l'étape (e) de traitement peut être un traitement thermique permettant d' oxyder ladite couche de résine exposée développée de manière à former les groupements silanols. En effet, les inventeurs de la présente ont remarqué qu'en jouant sur la grande sensibilité de la résine silsesquioxane utilisée à l'oxygène lors d'une élévation de température, on peut oxyder ces liaisons en groupements silanols. Ainsi, ils ont noté astucieusement que dès 3000C ces liaisons sont oxydées sous forme de silanol. Une gamme de température pratique se trouve par exemple entre 300 et 5000C. On se retrouve ainsi avec des
liaisons silanols servant au greffage direct de molécules biologiques, par exemple d' oligonucléotides, via les techniques de l'art antérieur précédemment décrites. La température de ce traitement thermique ne constitue pas une limitation du procédé de l'invention. En effet, plus les températures sont élevées, plus le nombre de groupements silanols créés sera important et plus la densité de greffage possible de molécules biologique sera importante. Par exemple aussi, selon l'invention, l'étape
(e) de traitement peut aussi être un traitement de transformation en SiO2 de la résine constituée d'un silsesquioxane gravée et développée, suivi d'une hydroxylation pour créer des liaisons silanols permettant un traitement de surface identique à celui cité dans les techniques classiques de silanisation connues de l'homme du métier. Ainsi, une deuxième voie pour former des groupements silanols est également envisageable dans l'utilisation du matériau de résine selon l'invention. Elle s'appuie par exemple sur un recuit à 400-5000C, par exemple à 45O0C, sous flux d'azote qui transforme les motifs de HSQ restants en SiO2 amorphe. Le traitement de silanisation du SiO2 peut être réalisé par les procédés de chimie connus de l'homme du métier, notamment dans le domaine technique de la fabrication des biopuces, par exemple suivant les protocoles décrits dans les documents [1] , [2] et [3] .
Le procédé de la présente invention permet donc la fabrication d'une ébauche de biopuce qui est prête à être fonctionnalisée par des molécules biologiques, car elle comporte à sa surface, outre des motifs
géométriques gravés, des fonctions silanols fonctionnalisables permettant la fixation de sondes biologiques .
Ainsi, dans cet exemple particulier où les molécules biologiques sont des oligonucléotides, la présente invention propose un procédé de fabrication d'une ébauche de biopuce dédiée au greffage localisé d' oligonucléotides, grâce à un traitement de surface approprié avant greffage. L'ébauche de biopuce de la présente invention, susceptible d'être obtenue par le procédé de l'invention, comprend donc un substrat et une couche de résine constituée d'un silsesquioxane développée comportant à sa surface des groupements silanols. La présente invention permet d'obtenir des structures dont la taille est comprise entre quelques nanomètres et plusieurs microns, voire plusieurs centimètres. Les structures obtenues peuvent être soumises à des bilans thermiques sans limitation de procédé. Les motifs gravés peuvent être localisés à des positions bien définies, positions que l'on peut modifier et qui sont contrôlées à la dizaine de nanomètres près.
Par ailleurs, l'utilisation de cette résine particulière permet une intégration technologique simple puisque toutes les étapes sont compatibles avec des salles blanches silicium et font appel à des procédés connus.
La présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication d'une biopuce comprenant : une mise en œuvre du procédé de fabrication d'une
ébauche de biopuce selon l'invention, et comprenant en outre une étape (f) de fixation de sondes ou molécules biologiques sur ladite ébauche de biopuce, via les groupements silanols fonctionnalisés. Selon l'invention, la surface de greffage peut être modifiée à souhait par modification de la forme, de la hauteur, de l'espacement et/ou de la taille des motifs ou structures gravés. La densité de greffage peut également être modifiée en fonction du traitement de l'étape (e) du procédé de l'invention en formant plus ou moins de groupements silanols comme exposé ci- dessus .
Selon l'invention, la sonde biologique peut être choisie par exemple parmi une protéine, un glucide, un lipide, une glycoprotéine, un glycolipide, une lipoprotéine, un acide ribonucléique, un acide désoxyribonucléique, un antigène, un anticorps, une enzyme, une hormone. Selon l'invention, la sonde biologique est avantageusement un acide ribonucléique ou un acide désoxyribonucléique.
La fixation des molécules biologiques sur les groupements silanols de l'ébauche peut bien entendu être réalisée par l'une quelconque des techniques connues de l'homme du métier, en particulier dans le domaine des biopuces. Les documents [1], [2], [3], [4], [5], [6] et [7] décrivent un certain nombre de protocoles utilisables, en particulier pour la fixation de sondes oligonucléotidiques . Le greffage n'a lieu que sur les structures nanométriques obtenues à partir de la résine constituée de silsesquioxane.
En outre, le procédé de fixation des sondes utilisé peut être couplé aux méthodes d'électro¬ adressage connues de l'homme du métier pour greffer localement des molécules biologiques ou sondes, ainsi qu'aux techniques « jet d'encre », etc.
La présente invention se rapporte donc également à une biopuce obtenue par le procédé de l'invention. La biopuce de la présente invention comprend une couche de résine constituée d'un silsesquioxane gravée et fonctionnalisée sur laquelle au moins une sonde biologique est immobilisée. Selon l'invention, la sonde biologique peut être par exemple une de celles précitées, avantageusement, il s'agit d'un acide ribonucléique ou d'un acide désoxyribonucléique.
La présente invention permet de s'affranchir des inconvénients des techniques de l'art antérieur présentées précédemment. En effet : - les oligonucléotides viennent se greffer sur les nanostructures,
- les greffages n'interviennent que dans les zones où sont définies les nanostructures,
- les nanostructures sont tridimensionnelles augmentant ainsi considérablement la surface et donc la densité de greffage,
- les nanostructures peuvent être localisées très précisément,
- les nanostructures peuvent avoir n'importe quel type de formes géométriques,
- toutes les dimensions géométriques des nanostructures pourront être contrôlées très précisément (à quelques nanomètres) .
En outre, la présente invention permet d'utiliser une chimie simple et reproductible, notamment pour produire des matrices d'ADN, et prend en compte de nombreux paramètres dont l'accessibilité et la fonctionnalité des sondes, la densité des attaches, et la stabilité de la matrice de sondes, et donc aussi la reproductibilité de l'hybridation, et de manière plus générale de la reconnaissance et de la fixation moléculaire.
De plus, pour la fabrication d'une biopuce, la présente invention intervient dans les trois aspects importants précités qui sont la chimie de fonctionnalisation du substrat, la localisation du greffage des sondes, et la tridimensionnalité, en particulier la nanostructuration, ce qui n'a jamais été le cas dans les procédés de l'art antérieur.
La présente invention permet d' obtenir des biopuces, notamment des puces à ADN, puissantes, du fait du fort parallélisme qui peut être obtenu dans la structuration géométrique du substrat et de la miniaturisation de la matrice qui permet des gains non négligeables en terme de coût, de travail, de vitesse, de rendement vis-à-vis des supports de l'art antérieur.
L'ensemble des applications de la présente invention, qui relèvent de l'analyse moléculaire, a également, à sa disposition, outre les molécules biologiques précitées, des sondes de synthèses, par
exemple d' oligonucléotides, correspondant à un certain nombre de séquences recherchées, ou leur mutation, qui peuvent être disposées dans ou sur des domaines connus, par exemple sous forme de matrices de sondes, à l'échelle nanométrique. En général, la méthode consiste à fixer, par des procédés variés de chimie, d' électrochimie, et/ou de micromécanique, des centaines voire des dizaines de milliers de sondes sur un substrat, par exemple de verre, de silicium, etc. L'hybridation de ces sondes déposées avec des cibles biologiques marquées permet alors, dans un volume très réduit, dans un temps plus bref et par une lecture plus facile, d'obtenir de multiples informations, par exemple sur des séquences génétiques et/ou sur des interactions telles que celles précitées.
Ainsi, par exemple, les documents [1], [2], [3], [4], [5], [6] et [7] décrivent un certain nombre d'analyses biologiques qui peuvent avantageusement être mises en œuvre sur une biopuce obtenue par le procédé de la présente invention.
Enfin, la caractérisation infrarouge du matériau après l'ensemble des étapes permet de mettre en évidence très facilement tout problème de contrefaçon : le spectre infrarouge du HSQ est facilement identifiable. Ainsi, les ébauches de biopuce et biopuces de la présente invention peuvent facilement être distinguées, ce qui peut être pratique dans des tentatives de contrefaçons de la présente invention.
Brève description des figures
- Figure 1 : représentation schématique des étapes (a), (c) et (d) du procédé de l'invention sur un substrat (S) , avec un matériau de résine silsesquioxane (r) . Trois gravures différentes (m), (ml) et (m2) sont montrées sur ce schéma respectivement (I) , (II) et (III) . Des molécules biologiques (mb) sont greffées sur ces gravures.
- Figure 2 : Graphique de l'effet de différents recuits sur une couche de silsesquioxane. On représente sur ce graphique des mesures en unité arbitraire (A) , en fonction du nombre d' onde (N) en cm"1.
- Figure 3 : Spectre infra-rouge du HSQ figé, (1) avant et (2) après exposition à un rayon électronique. On représente sur ce spectre la transmittance (T) en % en fonction du nombre d'onde (N) en cm"1.
- Figures 4 à 6 : photographies de différents motifs géométriques obtenus par le procédé de la présente invention sur une couche de silsesquioxane déposée sur un substrat.
Exemples
Exemple 1 : fabrication d'une ébauche de biopuce selon 1' invention
La figure 1 annexée représente schématiquement le procédé de l'invention, avec une étape (a) de dépôt du matériau de résine silsesquioxane, une étape (c) de
gravure, et une étape (d) de développement. L'étape (b) de recuit n'est pas représentée sur cette figure. L'étape (f) concerne l'exemple 2 ci-dessous.
Le protocole utilisé est basé sur le protocole décrit dans le document [6] .
Dans cet exemple, le substrat est une plaquette de silicium classique, utilisée pour fabriquer des biopuces .
Le matériau de résine est de 1'hydrogensilsesquioxane (HSQ) en solution dans du MIBK (vendu notamment par Dow Corning) .
Le dépôt de silsesquioxane est réalisé au moyen d'une technique classique de centrifugation à la tournette ("spinning") . Pour cela, quelques gouttes de solution HSQ sont déposées sur le substrat en rotation rapide à 1000 tour/minute pendant 90 secondes de façon à former une couche uniforme de HSQ.
Une couche uniforme de 50 ou 100 nm d'épaisseur de HSQ est ainsi déposée sur plusieurs substrats pour former différents échantillons (figure 1, (I) (a) , (II) (a) et (III) (a)) .
Pour étudier l'effet de l'étape de recuit sur la structure moléculaire de la résine HSQ déposé sur le substrat dans le procédé de l'invention, différents recuits ont été réalisés sur différents échantillons de couche de HSQ identiques au départ. La plupart de ces recuits ont été réalisés dans une gamme de températures allant de 1000C à 25O0C.
La figure 2 annexée est un graphique montrant les résultats d' absorbance mesurée entre 3900 cm"1 et
400 cm"1 sur les différents échantillons après les
différents protocoles de recuits indiqués ci-dessous. Sur cette figure :
- Courbe 1 couche vierge de toute cuisson : pas de recuit ;
- Courbe 2 couche cuite à 15O0C pendant 60 minutes ;
- Courbe 3 couche cuite à 15O0C pendant 60 minutes puis à 2000C, pendant 60 minutes ;
- Courbe 4 couche cuite à 15O0C, pendant 60, puis à 2000C, pendant 60 minutes, puis à
35O0C, pendant 60 minutes ;
- Courbe 5 couche cuite à 15O0C, pendant 60 minutes, puis à 200°, pendant 60 minutes, puis à 35O0C, pendant 60 minutes, puis à 4000C, pendant 60 minutes .
Le but du recuit est de transformer progressivement le HSQ en SiO2 amorphe. Cette transformation densifie le matériau qui présente ainsi une meilleure résistance à la gravure.
Ces recuits ont permis de densifier la couche de HSQ déposée en la transformant en SiO2 amorphe. Ils ont également permis d'éliminer le solvant résiduel qui était présent dans la couche.
L'étape d'exposition est réalisée au moyen d'un faisceau électronique (« eBeam ») de 7 nm à 100 kV avec un appareil LEICA VR6 (marque de commerce) . Le protocole utilisé est celui décrit dans le document [6] . Cet équipement présente un faisceau d'électron gaussien permettant de l'écriture directe.
Sur la figure 1, la gravure de trois motifs géométriques différents (I) (c) , (II) (cl) et (III) (c2) est montrée schématiquement .
Quand le HSQ est exposé sous faisceau d'électrons, l'intensité du pic SIH et du pic SiO à, respectivement, 860 cm"1 et 1140 cm"1 décroît légèrement, alors que l'intensité du pic SiO à 1080 cm"1 augmente légèrement. Les liaisons SiH, moins fortes que les liaisons SiO, sont cassées sous le faisceau d'électrons. Des liaisons siloxanes sont ainsi formées via des liaisons silanols instables .
La figure 3 représente le spectre infra-rouge du HSQ figé obtenu, (6) avant et (7) après exposition au rayon électronique. On représente sur ce spectre la transmittance (T) en % en fonction du nombre d'onde (N) en cm"1. Comme on peut le voir, en accord avec ce qui a été dit précédemment, le matériau se transforme dans le cadre du recuit en SiO2 amorphe avec une élimination du nombre de liaisons Si-H et une augmentation du nombre de liaisons Si-O.
Après cette phase de gravure, le développement est réalisé au moyen d'une solution alcaline de TMAOH à une concentration de 0,2 mol.l"1. Le développement consiste à tremper le support revêtu de la résine dans le développeur durant un temps défini, qui est de 60 seconde dans cet exemple. Le développeur utilisé est celui cité ci-dessus.
Ce développement a permis de retirer la résine non exposée au rayonnement électronique (développement positif) . La figure 1 montre schématiquement trois motifs géométriques différents (I) (m) , (II) (ml) et
(III) (m2) obtenus respectivement à partir des gravures (I) (C), (II) (cl) et (III) (c2) .
Les figures 4 à 6 annexées sont des photographies de différents motifs géométriques obtenus par le protocole décrit dans cet exemple :
- Sur la figure 4, on montre un motif géométrique isolé (structure isolée) en coupe transversale. La largeur de ce motif à sa base est de 20 nm, et sa hauteur de 80 nm. - Sur la figure 5, on montre un motif géométrique isolé (structure isolée) en coupe transversale. La largeur de ce motif à sa base est de 10 nm, et sa hauteur de 60 nm.
- Sur la figure 6, on montre une vue du dessus d'un réseau de motifs géométriques parallèles allongés.
La largeur de ces motifs à leur base est de 60 nm, leur hauteur de 80 nm, et ils sont séparés entre eux d'une distance régulière de 60 nm.
En jouant sur la grande sensibilité de HSQ à l'oxygène les inventeurs ont oxydé les liaisons SiH restant dans la résine figée et gravée en groupements silanols suivant deux méthodes différents, appliquées sur différents échantillons obtenus précédemment :
- Un chauffage à 3000C sous oxygène de certains des échantillons obtenus comme exposé ci- dessus au cours duquel les liaisons SiH sont oxydées sous forme de silanols ; ou
- Un recuit à 45O0C d'autres échantillons obtenus comme exposé ci-dessus sous flux d'azote qui a transformé les motifs de HSQ qui restent en SiO2
amorphe, suivi du protocole de silanisation décrit dans le document [3] .
Ainsi, dans les deux cas, des ébauches de biopuce sont obtenues. Ces ébauches présentent des groupements silanols qui permettent de greffer dessus des molécules biologiques.
D'autres matériaux non organiques à matrice silicium, par exemple le méthylsilsesquioxane MSQ, sensibles à une exposition électronique, photonique ou ionique et qui forment des liaisons silanols sous traitement thermique ou sous un autre traitement permettent d'obtenir des résultats similaires.
Exemple 2 : fabrication d'une biopuce Sur une ébauche de biopuce obtenue suivant l'exemple 1, on a greffé des oligonucléotides via les groupements silanols. Le protocole utilisé pour le greffage est celui décrit dans le document [9] . Des biopuces ont bien été obtenues. II a été possible d'hybrider des oligonucléotides complémentaires (cibles) aux oligonucléotides fixés (sondes) et de mettre en évidence l'hybridation au moyen d'un marqueur en utilisant le même procédé que celui qui a été décrit dans le document [3] .
La figure 1 montre schématiquement le résultat obtenu lorsque ces molécules biologiques (mb) sont greffées sur la couche de résine gravée dans trois exemples de motifs géométriques (I) (m) , (II) (ml) et (III) (m2) .
Liste des références
[1] L.R. Hilliard, X. Zhao, Analytica Chimica Acta 470 (2002), 51-56.
[2] E. Defrancq, A. Hoang, Bioorganic & Médicinal Chemistry Lettres 13 (2003), 2683-2686.
[3] Y.H. Rogers, P. Jiang-Baucom, Analytical Biochemistry 266, 23-30 (1999) .
[4] D. Proudnikov, E. Timofeev, Analytical Biochemistry 259, 34-41 (1998) .
[5] C.V. Nguyen, American Chemical Society 2002, vol. 2, n°10, 1079-1081.
[6] H. Namatsu, T. Yamaguchi, Microelectronic Engineering 41/42 (1998), 331-334.
[7] P. Caillât, D. David, Sensors and Actuators B 61 (1999), 154-156.
[8] K. Kurihara et al., Jnp. J. Appl . Phys. , 34, 6940 (1995) .
[9] N. Rochat, A. Troussier, A. Hoang, F. Vinet, Material Science and Engineering C23 (2003), 99- 103.