WO2006003022A2 - Method for evaluating biochips - Google Patents

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WO2006003022A2 PCT/EP2005/007429 EP2005007429W WO2006003022A2 WO 2006003022 A2 WO2006003022 A2 WO 2006003022A2 EP 2005007429 W EP2005007429 W EP 2005007429W WO 2006003022 A2 WO2006003022 A2 WO 2006003022A2
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Werner Schössler
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    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label

Definitions

  • the invention relates to a method for the evaluation of biochips according to the preamble of claim 1.
  • the invention has for its object to provide a method for the evaluation of biochips, which is dispensed with the hitherto customary laser scanner systems and in the visible light a quantitative evaluation is possible.
  • the method for the evaluation of spots located on biochips after carrying out immunological reactions with the biomacromolots spotted on surface carriers is characterized in that the spots on the surface carrier are incubated simultaneously with a medium after completion of the immunological reactions the immunological reaction products cause a dye-forming reaction, wherein the dye is visible in visible light, and that the spots thus stained are measured with an incident-light scanner operating in visible light and the color intensities obtained as gray values are evaluated.
  • the method is characterized in that proteins, nucleic acids, nucleotides, peptides or other biologically active compounds are spotted onto surface carriers, subsequently reacted with complementary reaction partners and then detected in an enzyme-containing or gold-labeled detection system become.
  • antigens or antibodies are spotted onto a surface support and subsequently reacted with an antibody or antigen which is then detected directly or indirectly by the enzymes peroxidase or alkaline phosphatase or by gold labeling.
  • a further embodiment of the invention provides that the bound to an antibody or antigen enzyme is reacted with precipitating substrate, wherein the intensity of the dye but also the color intensity of the gold-labeled antigens or antibodies of the strength of the antigen-antibody reaction are proportional.
  • surface carriers made of plastic, glass or preferably nitrocellulose verwen ⁇ det.
  • Another embodiment of the invention provides that the precipitated dyes are measured with a simple scanner or a digital camera and evaluated densitometrically.
  • FIG. 2 shows an illustration of an example of an intensity measurement for a multiparameter chip
  • FIG 3 is an illustration of an example of the prior art relating to an intensity measurement for a fluorescence chip.
  • a dilution is made with a suitable coating buffer, for example carbonate buffer, with a final concentration of 100-250 ⁇ g / ml.
  • a spot array is applied to a suitable carrier with a piezo mouse. Per spot about 2 nl solution are measurementsspottet.
  • the biochips thus produced are dried at room temperature and, in the case of the membranous support materials, cut and blocked with a suitable protein solution. The blocked chips are washed three times and dried in air.
  • Example 2 Coating of the multiparameter chip
  • This arrangement of up to 30 different antigens on a multiparameter chip allows the simultaneous determination of the antigens in a single examination run with the lowest consumption of patient serum and minimal expenditure on consumables.
  • a patient or control serum to be tested is prediluted by a factor of 100 by means of a suitable dilution buffer. From this pre-dilution, an aliquot is placed in an incubation tray. In this tub, the chip is submerged with the serum at room temperature for 0.25 -
  • the chips are digitized by scanning with a commercial light scanner operating in visible light (cost about 200-1,000 €) at a minimum resolution of 600 dpi in color.
  • the usual duration of such digitization is 5-10 seconds for up to 8 chips. ⁇ .
  • an array software is used for evaluation. The picture
  • FIG. 10 contains the information on the intensities of the spots and load with an appropriate software evaluate.
  • FIG. 2 shows a typical intensity profile of the spot coloring for a biochip according to the invention. For better comparability, the intensities are shown in false colors.
  • the intensity chart clearly shows that the • intensity falls between the spots to zero. A background intensity is therefore advantageously not to be observed.
  • a patient or blood donor serum to be examined is prediluted by a factor of 100 by means of a suitable dilution buffer. From this predilution, an aliquot is placed on the biochip. In a humid chamber, the chip is incubated with the serum at room temperature for 30 min. The unbound serum components are removed from the chip in three washing steps with a suitable washing buffer and ultrapure water. It is followed by incubation for 30 min at room temperature in a moist chamber with a fluorescently-labeled (eg Cy3) conjugate which binds specifically to human IgG, E, M or A. In three more washing Unbound conjugate is removed, after which the chips are dried.
  • a fluorescently-labeled (eg Cy3) conjugate which binds specifically to human IgG, E, M or A.
  • the chips are digitized by exciting the fluorescence conjugates with a laser scanner, the fluorescence intensities are recorded with a photomultiplier tube.
  • the chip is scanned in single steps with a resolution of 10 ⁇ m.
  • the usual duration of such digitization is 25-35 minutes per chip.
  • the initial cost of a laser scanner disadvantageously amounts to 50,000 - 80,000 €.
  • FIG. 3 shows a typical intensity profile of an antigen after development with a fluorescence chip and digitization by means of a laser scanner. Is clearly visible disadvantageously the large background signal, sometimes up to 50% of the intensity 'the actual antigen spots • may be.
  • a patient or blood donor serum to be examined is prediluted by a factor of 100 by means of a suitable dilution buffer. From this pre-dilution, an aliquot is placed in an incubation tray. In this bath the • chip is incubated with gentle shaking submerged h with the serum examples room temperature for 1 hour. The unbound Serumbe ⁇ constituents are removed in several five-minute washes with a suitable washing buffer from the chip. This is followed by incubation for 30 min at room temperature with a gold-labeled secondary antibody which binds specifically to human IgG, E, M or A. After 5 minutes the. Dried chips. The digitization of the chips is carried out by scanning with egg "NEM in the visible light operating commercial up light scanner (cost approx. 200 - 1,000 €) at a minimum resolution of 600 dpi in color or visually. For evaluation an array software is used. The image contains information about the intensities of the spots and can be evaluated with suitable software.

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Abstract

The invention relates to a method for evaluating spots located on biochips. The aim of the invention is to provide a method for the evaluation of biochips, which obviates the need for conventional laser scanner systems and allows quantitative evaluation in the visible light range. To this end, a method is disclosed for evaluating spots located on biochips after having carried out immunological reactions with biomacromolecules spotted on the flat supports. The method is characterized in that, after completion of the immunological reactions, the spots located on the flat support are simultaneously incubated with a medium which induces a dye-forming reaction with the immunological reaction products, the dye being recognizable in the visible light range. The method is further characterized in that the spots dyed in this manner are measured by means of an incident-light scanner operating in the visible light range and that the colour intensities obtained as grayscale values are evaluated.

Description

Verfahren zur Auswertung von BiochipsMethod for evaluating biochips
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Auswertung von Biochips entsprechend dem Oberbegriff des Anspruches 1.The invention relates to a method for the evaluation of biochips according to the preamble of claim 1.
Die heute bekannten Biochips, also Microarrays zur Untersu¬ chung von DNA- und Proteinwechselwirkungen, dienen häufig •parallelen vergleichenden Studien auf einem Chip. Hierzu ist es nötig, mehrere Reaktionen gleichzeitig auf einem Chip durchzuführen, die dann allerdings getrennt voneinan¬ der ausgewertet werden. Dieses wird mit der Benutzung von Fluoreszenzkonjugaten mit unterschiedlichen Absorptions¬ und Emissionsmaxima erreicht. Die Auswertung erfolgt durch Anregung der Fluoreszenzkonjugate in monochromatischem Licht. Bei den derzeit bekannten Messapparaturen wird die¬ ses Licht mittels eines Laserstrahls erzeugt. Zur Auswer¬ tung der fluoreszenzmarkierteh Biochips werden hochkomplexe Laserscanner eingesetzt, was nachteiligerweise mit hohen Kosten verbunden ist.The currently known biochips, so microarrays for Untersu¬ monitoring of DNA and protein interactions are often parallel • comparative studies on a chip. For this purpose, it is necessary to carry out several reactions simultaneously on one chip, which are then evaluated separately voneinan¬. This is achieved with the use of fluorescence conjugates with different absorption and emission maxima. The evaluation is carried out by excitation of the fluorescence conjugates in monochromatic light. In the currently known measuring apparatuses, this light is generated by means of a laser beam. For evaluating the fluorescence-labeled biochips, highly complex laser scanners are used, which is disadvantageously associated with high costs.
Weiterhin sind viele- dieser Laserscahner auf eine Chipform adaptiert, die sich an mikroskopischen Glasobjektträgern anlehnt.Furthermore, many of these laser scrapers are adapted to a chip shape that is based on microscopic glass slides.
Andere bekannte Möglichkeiten der Auswertung von Biochips beruhen auf der Messung eines Chemolumineszenzkonjugates, welches durch die Freisetzung von Lichtquanten eine Auswer¬ tung der Reaktionen auf dem Chip ermöglicht. Ebenso wie bei dem laserbasierten Scannersystem sind zur Auswertung dieser' Chips hochempfindliche - und dementsprechend teure - Detek- tionssysteme notwendig.Other known possibilities of evaluating biochips are based on the measurement of a chemiluminescent conjugate, which makes it possible to evaluate the reactions on the chip by the release of light quanta. As with the laser-based scanner system of this' chips for evaluating highly sensitive - and therefore expensive - Detek- information systems necessary.
Bei immunologischen Untersuchungen von Seren werden zumeist nur einzelne Immunglobulinklassen .untersucht. Insofern ist die .komplexe Technologie der Laserscanner für immunologi¬ sche Untersuchungen zu kompliziert und steht, auch bedingt durch die hohen Investitionskosten, einer weiteren Verbrei¬ tung im Bereich der klinischen Diagnostik im Wege.In immunological examinations of sera, only single immunoglobulin classes are usually examined. In this respect, the .komplexe technology of the laser scanner for immunological examinations is too complicated and is too limited due to the high investment costs, a further spread in the field of clinical diagnostics in the way.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Auswertung von Biochips anzubieten, bei dem auf die bislang üblichen Laserscanner-Systeme verzichtet wird und im sicht¬ baren Licht eine quantitative Auswertung möglich wird.The invention has for its object to provide a method for the evaluation of biochips, which is dispensed with the hitherto customary laser scanner systems and in the visible light a quantitative evaluation is possible.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit den Merkmalen des An- Spruches 1.The solution of the task is carried out with the features of claim 1.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.Advantageous developments are specified in the subclaims.
Das Verfahren zur Auswertung von auf Biochips befindlichen Spots nach Durchführung von immunologischen Reaktionen mit den auf Flächenträgern gespotteten Biomakromolekülen, ist dadurch gekennzeichnet, dass die auf dem Flächenträger be¬ findlichen Spots nach Abschluss der immunologischen Reakti- onen gleichzeitig mit einem Medium inkubiert werden, das mit den immunologischen Reaktionsprodukten eine farbstoff¬ bildende Reaktion herbeiführt, wobei der Farbstoff in sichtbarem Licht erkennbar ist, und dass die so angefärbten Spots mit einem im sichtbaren Licht arbeitenden Auflicht- Scanner gemessen und die als Grauwerte erhaltenen Farbin¬ tensitäten ausgewertet werden.The method for the evaluation of spots located on biochips after carrying out immunological reactions with the biomacromolots spotted on surface carriers is characterized in that the spots on the surface carrier are incubated simultaneously with a medium after completion of the immunological reactions the immunological reaction products cause a dye-forming reaction, wherein the dye is visible in visible light, and that the spots thus stained are measured with an incident-light scanner operating in visible light and the color intensities obtained as gray values are evaluated.
So ist es überraschenderweise gelungen, die Verwendung der bislang üblichen Laserscanner-Systeme überflüssig zu ma- chen, indem anstelle von Glas-Chips auch übliche membranöse Trägermaterialien mit Microspots beschichtet werden und an¬ stelle eines bislang gebräuchlichen fluoreszenz- oder che- moluminiszenzbasierenden Nachweissystems ein solches tritt, welches einen sichtbaren Farbstoff (Wellenlänge 300 bis 800 nm) generiert und dadurch eine densitometrische Auswer- tung in sichtbarem Licht und eine quantitative Auswertung ermöglicht. Nach der digitalen Erfassung der auf Biochips befindlichen Spots erfolgt mittels des im sichtbaren Licht arbeitenden Auflichtscanners oder aber auch mit einer Digi- talkamera. Anschließend wird eine densitometrische Auswer¬ tung durchgeführt.Surprisingly, it has thus been possible to obviate the need to use the hitherto customary laser scanner systems by coating conventional membrane-like carrier materials with microspots instead of glass chips and instead of a hitherto conventional fluorescence- or chemiluminescent detection system which generates a visible dye (wavelength 300 to 800 nm), thereby producing a densitometric evaluation. tion in visible light and a quantitative evaluation. After the digital recording of the spots located on biochips takes place by means of the incident light scanner operating in visible light or else with a digital camera. Subsequently, a densitometric evaluation is carried out.
In einer Weiterbildung der Erfindung erfolgt die Erzeugung eines sichtbaren Farbstoffes mittels Enzymreaktion oder Goldmarkierung.In one development of the invention, the production of a visible dye by means of enzyme reaction or gold labeling takes place.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist das Verfahren da¬ durch gekennzeichnet, dass Proteine, Nukleinsäuren, Nukleo¬ tide, Peptide oder andere biologisch aktive Verbindungen auf Flächenträger gespottet, nachfolgend mit komplementären Reaktionspartnern zur Reaktion gebracht und dann in einem enzymhaltigen oder goldmarkierten Detektionssystem nachge¬ wiesen werden.In one embodiment of the invention, the method is characterized in that proteins, nucleic acids, nucleotides, peptides or other biologically active compounds are spotted onto surface carriers, subsequently reacted with complementary reaction partners and then detected in an enzyme-containing or gold-labeled detection system become.
In einer weiteren Ausgestaltung werden Antigene oder Anti¬ körper auf einen Flächenträger gespottet und nachfolgend mit einem Antikörper oder Antigen zur Reaktion gebracht, die dann direkt oder indirekt mit den Enzymen Peroxidase oder Alkalische Phosphatase oder durch Goldmarkierung de- tektiert werden.In a further embodiment, antigens or antibodies are spotted onto a surface support and subsequently reacted with an antibody or antigen which is then detected directly or indirectly by the enzymes peroxidase or alkaline phosphatase or by gold labeling.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass das an einen Antikörper oder Antigen gebundene Enzym mit präzipitierendem Substrat zur Reaktion gebracht wird, wobei die Intensität des Farbstoffes aber auch die Farbintensität der goldmarkierten Antigene oder Antikörper der Stärke der Antigen-Antikörper-Reaktion proportional sind. In einer weiteren Ausgestaltung werden Flächenträger aus Kunststoff, Glas oder vorzugsweise Nitrozellulose verwen¬ det.A further embodiment of the invention provides that the bound to an antibody or antigen enzyme is reacted with precipitating substrate, wherein the intensity of the dye but also the color intensity of the gold-labeled antigens or antibodies of the strength of the antigen-antibody reaction are proportional. In a further embodiment, surface carriers made of plastic, glass or preferably nitrocellulose verwen¬ det.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die präzipitierten Farbstoffe mit einem einfachen Scanner oder einer Digitalkamera gemessen und densitometrisch aus¬ gewertet werden.Another embodiment of the invention provides that the precipitated dyes are measured with a simple scanner or a digital camera and evaluated densitometrically.
Die Erfindung wird an Hand von Ausführungsbeispielen sowie von Abbildungen bzw. graphischen Darstellungen näher erläu¬ tert. Es zeigenThe invention will be explained in more detail with reference to embodiments as well as illustrations and graphical representations. Show it
Fig. 1 eine Darstellung eines Spot-Schemas,1 is a representation of a spot scheme,
Fig. 2 eine Darstellung eines Beispieles einer Intensi¬ tätsmessung für einen Multiparameter-Chip und2 shows an illustration of an example of an intensity measurement for a multiparameter chip and FIG
Fig. 3 eine Darstellung eines Beispieles des Standes der Technik bezüglich einer Intensitätsmessung für einen Fluoreszenz-Chip.3 is an illustration of an example of the prior art relating to an intensity measurement for a fluorescence chip.
Beispiel 1: Beschichtung des BiochipsExample 1: Coating of the biochip
Von dem Antigen dsDNA wird mit einem geeigneten Beschich- tungspuffer, beispielsweise Carbonatpuffer, eine Verdünnung mit einer Endkonzentration von 100 - 250 μg/ml hergestellt. Von dieser Beschichtungslösung wird mit einem Piezospotter ein Spotarray auf einen geeigneten Träger aufgebracht. Pro Spot werden ca. 2 nl Lösung aufgespottet. Die so erzeugten Biochips werden bei Raumtemperatur getrocknet und, im Falle der membranösen Trägermaterialien, geschnitten und mit ei¬ ner geeigneten Proteinlösung blockiert. Die blockierten Chips werden dreimal gewaschen und an der Luft getrocknet. Beispiel 2 : Beschichtung des Multiparameter-ChipsFrom the antigen dsDNA, a dilution is made with a suitable coating buffer, for example carbonate buffer, with a final concentration of 100-250 μg / ml. From this coating solution, a spot array is applied to a suitable carrier with a piezo mouse. Per spot about 2 nl solution are aufgespottet. The biochips thus produced are dried at room temperature and, in the case of the membranous support materials, cut and blocked with a suitable protein solution. The blocked chips are washed three times and dried in air. Example 2: Coating of the multiparameter chip
In ähnlicher Art und Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, werden für einen Multiparameter-Chip in einem genau defi¬ nierten Muster bis zu 30 Antigene unterschiedlichster bio¬ chemischer Natur auf den Biochip gespottet. Das Schema für die auf den Multiparameter-Biochip aufgetragenen Antigene ist in Fig. 1 wiedergegeben.In a manner similar to that described in Example 1, up to 30 antigens of very different biochemical nature are spotted on the biochip for a multiparameter chip in a precisely defined pattern. The scheme for the antigens applied to the multiparameter biochip is shown in FIG.
Diese Anordnung von bis zu 30 unterschiedlichen Antigenen auf einem Multiparameter-Chip erlaubt die simultane Bestim¬ mung der Antigene in einem einzigen Untersuchungslauf unter geringstem Verbrauch von Patientenserum und minimalem Auf- wand an Verbrauchsmaterialien.This arrangement of up to 30 different antigens on a multiparameter chip allows the simultaneous determination of the antigens in a single examination run with the lowest consumption of patient serum and minimal expenditure on consumables.
Beispiel 3: Entwicklung eines Multiparameter-Chips mit SerumExample 3: Development of a multiparameter chip with serum
Ein zu untersuchendes Patienten- oder Kontrollserum wird mittels eines geeigneten Verdünnungspuffers um den Faktor 100 vorverdünnt. Von dieser Vorverdünnung wird ein Aliquot in eine Inkubationswanne gefüllt. In dieser Wanne wird der Chip submers mit dem Serum bei Raumtemperatur für 0,25 -A patient or control serum to be tested is prediluted by a factor of 100 by means of a suitable dilution buffer. From this pre-dilution, an aliquot is placed in an incubation tray. In this tub, the chip is submerged with the serum at room temperature for 0.25 -
1 h unter leichtem Schwenken inkubiert. Die nichtgebundenen Serumbestandteile werden in mehreren fünfminütigen Wasch¬ schritten mit einem geeigneten Waschpuffer vom Chip ent¬ fernt. Es folgt eine Inkubation für 15 - 30 min bei Raum- temperatur mit einem enzymmarkierten Konjugat, welches spe¬ zifisch an humanes IgG, E, M oder A bindet. In einem weite¬ ren Waschschritt wird nichtgebundenes Konjugat entfernt. Es erfolgt die Zugabe eines präzipitierenden Substrates bei Raumtemperatur. Die Enzymreaktion wird nach 10 min durch Zugabe von 0,1 M H2SO4 gestoppt. Nach weiteren 5 min werden die Chips getrocknet.Incubated for 1 h with gentle swirling. The unbound serum components are removed from the chip in several five-minute washes with a suitable washing buffer. This is followed by incubation for 15-30 min at room temperature with an enzyme-labeled conjugate which binds specifically to human IgG, E, M or A. In a further washing step unbound conjugate is removed. There is the addition of a precipitating substrate at room temperature. The enzyme reaction is carried out after 10 min Addition of 0.1 MH 2 SO 4 stopped. After another 5 minutes, the chips are dried.
Die Digitalisierung der Chips erfolgt durch Scannen mit ei¬ nem im sichtbaren Licht arbeitenden handelsüblichen Auf- 5 lichtscanner (Kosten ca. 200 - 1.000 €) bei einer Minimal¬ auflösung von 600 dpi in Farbe. Die übliche Dauer einer derartigen Digitalisierung beträgt 5 - 10 Sekunden für bis zu 8. Chips. ■ . Zur Auswertung wird eine Arraysoftware benutzt. Das BildThe chips are digitized by scanning with a commercial light scanner operating in visible light (cost about 200-1,000 €) at a minimum resolution of 600 dpi in color. The usual duration of such digitization is 5-10 seconds for up to 8 chips. ■ . For evaluation an array software is used. The picture
10 enthält die Informationen über die Intensitäten der Spots und last sich mit einer geeigneten Software auswerten. Fig. 2 zeigt einen typischen Intensitätsverlauf der Spot¬ färbung für einen erfindungsgemäßen Biochip. Zur besseren Vergleichbarkeit sind die Intensitäten in Falschfarben dar-10 contains the information on the intensities of the spots and load with an appropriate software evaluate. FIG. 2 shows a typical intensity profile of the spot coloring for a biochip according to the invention. For better comparability, the intensities are shown in false colors.
15 gestellt. Das Intensitätsdiagramm zeigt deutlich, dass die • Intensität zwischen den Spots auf Null fällt. Eine Hinter- .grundintensität ist vorteilhafterweise also nicht zu beo¬ bachten.15 asked. The intensity chart clearly shows that the • intensity falls between the spots to zero. A background intensity is therefore advantageously not to be observed.
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Beispiel 4: Entwicklung eines Fluoreszenz-Chips mit Serum (Vergleichsbeispiel, Stand der Technik)Example 4 Development of a Fluorescence Chip with Serum (Comparative Example, Prior Art)
Ein zu untersuchendes Patienten- oder .Blutspenderserum wird 25 mittels eines geeigneten Verdünnungspuffers um den Faktor 100 vorverdünnt. Von dieser •Vorverdünnung wird ein Aliquot auf den Biochip gegeben. In einer feuchten- Kammer wird der Chip mit dem Serum bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Die nichtgebundenen Serumbestandteile werden in drei Wasch- 30 schritten mit einem geeigneten Waschpuffer und Reinstwasser vom Chip entfernt. Es •folgt eine Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit einem fluores¬ zenzmarkierten (z.B. Cy3 ) Konjugat, welches spezifisch an humanes IgG, E, M oder A bindet. In drei weiteren Wasch- schritt wird nichtgebundenes Konjugat entfernt, danach wer¬ den die Chips getrocknet.A patient or blood donor serum to be examined is prediluted by a factor of 100 by means of a suitable dilution buffer. From this predilution, an aliquot is placed on the biochip. In a humid chamber, the chip is incubated with the serum at room temperature for 30 min. The unbound serum components are removed from the chip in three washing steps with a suitable washing buffer and ultrapure water. It is followed by incubation for 30 min at room temperature in a moist chamber with a fluorescently-labeled (eg Cy3) conjugate which binds specifically to human IgG, E, M or A. In three more washing Unbound conjugate is removed, after which the chips are dried.
Die Digitalisierung der Chips erfolgt durch Anregung der Fluoreszenzkonjugate mit einem Laserscanner, die Aufnahme der Fluoreszenzintensitäten erfolgt mit einem Photomul- tiplier. Der Chip wird dabei in Einzelschritten mit einer Auflösung von 10 μm abgetastet. Die übliche Dauer einer derartigen Digitalisierung beträgt 25 -• 35 min pro Chip. Die Anschaffungskosten eines Laserscanners belaufen sich nachteiligerweise auf 50.000 - 80.000 €.The chips are digitized by exciting the fluorescence conjugates with a laser scanner, the fluorescence intensities are recorded with a photomultiplier tube. The chip is scanned in single steps with a resolution of 10 μm. The usual duration of such digitization is 25-35 minutes per chip. The initial cost of a laser scanner disadvantageously amounts to 50,000 - 80,000 €.
Zur Auswertung wird eine Arraysoftware benutzt. Fig. 3 zeigt einen typischen Intensitätsverlauf eines Antigens nach Entwicklung mit einem Fluoreszenz-Chip und Digitali¬ sierung mittels eines Laserscanners. Deutlich sichtbar ist nachteiligerweise das große Hintergrundsignal, das mitunter bis zu 50% der Intensität' der eigentlichen Antigenspots • betragen kann.For evaluation an array software is used. FIG. 3 shows a typical intensity profile of an antigen after development with a fluorescence chip and digitization by means of a laser scanner. Is clearly visible disadvantageously the large background signal, sometimes up to 50% of the intensity 'the actual antigen spots • may be.
Beispiel 5: Entwicklung eines Chips mit GoldkonjugatExample 5: Development of a chip with gold conjugate
Ein zu untersuchendes Patienten- oder Blutspenderserum wird mittels eines geeigneten Verdünnungspuffers um den Faktor 100 vorverdünnt. Von dieser Vorverdünnung wird ein Aliquot in eine Inkubationswanne gefüllt. In dieser Wanne wird der • Chip submers mit dem Serum bei- Raumtemperatur für 1 h unter leichtem Schwenken inkubiert. Die nichtgebundenen Serumbe¬ standteile werden in mehreren fünfminütigen Waschschritten mit einem geeigneten Waschpuffer vom Chip entfernt. Es folgt eine Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur mit ei¬ nem goldmarkierten Sekundärantikörper, welcher spezifisch an humanes IgG, E, M oder A bindet. Nach 5 min werden die . Chips getrocknet. Die Digitalisierung der Chips erfolgt durch Scannen mit ei- " nem im sichtbaren Licht arbeitenden handelsüblichen Auf- lichtscanner (Kosten ca. 200 - 1.000 €) bei einer Minimal- auflösung von 600 dpi in Farbe oder visuell. Zur Auswertung wird eine Arraysoftware benutzt. Das Bild enthält die Informationen über die Intensitäten der Spots und lässt sich mit einer geeigneten Software auswerten. A patient or blood donor serum to be examined is prediluted by a factor of 100 by means of a suitable dilution buffer. From this pre-dilution, an aliquot is placed in an incubation tray. In this bath the • chip is incubated with gentle shaking submerged h with the serum examples room temperature for 1 hour. The unbound Serumbe¬ constituents are removed in several five-minute washes with a suitable washing buffer from the chip. This is followed by incubation for 30 min at room temperature with a gold-labeled secondary antibody which binds specifically to human IgG, E, M or A. After 5 minutes the. Dried chips. The digitization of the chips is carried out by scanning with egg "NEM in the visible light operating commercial up light scanner (cost approx. 200 - 1,000 €) at a minimum resolution of 600 dpi in color or visually. For evaluation an array software is used. The image contains information about the intensities of the spots and can be evaluated with suitable software.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Auswertung von auf Biochips befindlichen 5 Spots nach Durchführung von immunologischen Reaktionen mit den auf Flächenträgern gespotteten Biomakromolekü¬ len, dadurch gekennzeichnet, dass die auf dem Flächenträger befindlichen Spots nach Ab- 10 Schluss der immunologischen Reaktionen gleichzeitig mit einem Medium inkubiert werden, das mit den immunologi¬ schen Reaktionsprodukten eine farbstoffbildende Reakti¬ on herbeiführt, wobei der Farbstoff in sichtbarem Licht erkennbar ist,1. Method for the evaluation of 5 spots located on biochips after carrying out immunological reactions with the biomacromolecules spotted on surface carriers, characterized in that the spots located on the surface carrier are incubated simultaneously with a medium after completion of the immunological reactions, the reaction with the immunological reaction products brings about a dye-forming reaction in which the dye is recognizable in visible light,
15 und dass die so angefärbten Spots mit einem im sichtba¬ ren Licht arbeitenden Auflichtscanner gemessen und die als Grauwerte erhaltenen Farbintensitäten ausgewertet werden.15 and that the spots thus stained are measured with an incident-light scanner operating in the visible light and the color intensities obtained as gray values are evaluated.
20. 20th
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung eines sichtbaren Farbstoffes mittels En¬ zymreaktion oder Goldmarkierung erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that the production of a visible dye by En¬ zymreaktion or gold marking takes place.
25 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass25 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that
Proteine, Nukleinsäuren, Nukleotide, Peptide oder ande¬ re- biologisch aktive Verbindungen auf Flächenträgern gespottet, nachfolgend mit komplementären Reaktions- 0 partnern zur Reaktion gebracht und dann 'in einem enzym- haltigen oder goldmarkierten Detektionssystem nachge¬ wiesen werden. Proteins, nucleic acids, nucleotides, peptides or andre biologically active compounds spotted on surface carriers, subsequently reacted with complementary reaction 0 partners and then ' nachge¬ proven in an enzyme-containing or gold-labeled detection system.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene oder Antikörper auf einen Flächenträger gespottet und nachfolgend mit einem Antikörper oder An- tigen zur Reaktion gebracht werden, die dann direkt o- der indirekt mit dem Enzym Peroxidase oder Alkalische Phosphatase oder durch Goldmarkierung detektiert wer¬ den.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the antigens or antibodies are spotted onto a surface carrier and subsequently reacted with an antibody or antigen, which then directly or indirectly with the enzyme peroxidase or alkaline Phosphatase or by gold marking wer¬ detected.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das an einen Antikörper oder ein Antigen gebundene En¬ zym mit präzipitierendem Substrat unter Bildung eines Farbstoffes, dessen Farbintensität der Stärke der Anti- gen-Antikörper-Reaktion proportional ist, zur. Reaktion gebracht wird.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the bound to an antibody or an antigen En¬ enzyme with precipitating substrate to form a dye whose color intensity of the strength of the antigen-antibody reaction is proportional to , Reaction is brought.
■ 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Flächenträger Kunststoff, Glas oder vorzugsweise Nitrozellulose verwendet wird. ■ 6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that plastic, glass or, preferably, nitrocellulose is used as the surface support.
7. Verfahren zur Auswertung von auf Biochips befindlichen Spots, dadurch gekennzeichnet, dass nach Durchführung von biochemischen oder immunologi¬ schen Reaktionen mit den auf membranöse Träger gespot¬ tete Biomakromoleküle auf den Spots ein sichtbarer Farbstoff erzeugt und - dieser Farbstoff mit einem Auflichtscanner oder einer. Digitalkamera gemessen und densitometrisch ausgewertet wird. 7. A method for the evaluation of spots located on biochips, characterized in that generated after performing biochemical or immunologi¬'s reactions with the spotted on membranous carrier biomaterials on the spots a visible dye and - this dye with a reflected light scanner or a. Digital camera is measured and evaluated densitometrically.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung eines sichtbaren Farbstoffes mittels En¬ zymreaktion oder Goldmarkierung erfolgt. A method according to claim 7, characterized in that the production of a visible dye by En¬ zymreaktion or gold marking takes place.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet/ dass9. The method according to claim 7 or 8, characterized in that /
Proteine, Nukleinsäuren, Nukleotide, Peptide oder ande- re biologisch aktive Verbindungen auf Flächenträgern gespottet, nachfolgend mit komplementären Reaktions¬ partnern zur Reaktion gebracht und dann in einem enzym- haltigen oder goldmarkierten Detektionssystem nachge¬ wiesen werden.Proteins, nucleic acids, nucleotides, peptides or other biologically active compounds spotted on surface carriers, subsequently reacted with complementary Reaktions¬ partners and then be nachge¬ proven in an enzyme-containing or gold-labeled detection system.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, .dass die Antigene oder Antikörper auf einen Flächenträger gespottet und nachfolgend mit einem Antikörper oder An¬ tigen zur Reaktion gebracht werden, die dann- direkt .o- der indirekt mit dem Enzym Peroxidase oder Alkalische Phosphatase oder durch Goldmarkierung detektiert wer¬ den,10. The method according to any one of claims 7 to 9, characterized in that the antigens or antibodies are spotted onto a surface carrier and subsequently reacted with an antibody or An¬, the then-. Directly der- indirectly with the enzyme Peroxidase or alkaline phosphatase or detected by gold labeling wer¬,
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, .dass das an einen Antikörper oder ein Antigen gebundene En- zym mit präzipitierendem Substrat unter Bildung eines11. The method according to any one of claims 7 to 10, characterized in that the enzyme bound to an antibody or an antigen with precipitating substrate to form a
Farbstoffes, dessen Farbintensität der Stärke der Anti- gen-Antikörper-Reaktion proportional ist, zur Reaktion gebracht wird. Dye whose color intensity of the strength of the antigen-antibody reaction is proportional, is reacted.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Flächenträger Kunststoff, Glas oder vorzugsweise Nitrozellulose verwendet wird.12. The method according to any one of claims 7 to 11, characterized in that is used as a surface carrier plastic, glass or preferably nitrocellulose.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die präzipitierten Farbstoffe mit einem einfachen Scan¬ ner oder einer Digitalkamera gemessen und densito- metrisch ausgewertet werden. 13. The method according to any one of claims 7 to 12, characterized in that the precipitated dyes are measured with a simple Scan¬ ner or a digital camera and densitometrically evaluated.
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