WO2006000693A1 - Procede pour determiner la sensibiliter ou la resistance d’isolats de retrovirus aux traitements therapeutiques retroviraux a base d’inhibiteurs de la protease virale, et kit de diagnostic issu de la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

Procede pour determiner la sensibiliter ou la resistance d’isolats de retrovirus aux traitements therapeutiques retroviraux a base d’inhibiteurs de la protease virale, et kit de diagnostic issu de la mise en oeuvre de ce procede Download PDF

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Didier Raoult
Najoua Ben M'barek
Gilles Audoly
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV

Definitions

  • a method for determining the sensitivity or resistance of retrovirus isolates to retroviral therapeutic treatments based on viral protease inhibitors, and diagnostic kit resulting from the implementation of this method is a method for determining the sensitivity or resistance of retrovirus isolates to retroviral therapeutic treatments based on viral protease inhibitors, and diagnostic kit resulting from the implementation of this method.
  • the invention relates to a method for determining the sensitivity or resistance of retroviruses such as HIV to therapeutic therapies based on viral protease inhibitors by the use of yeasts.
  • the invention relates to the use of yeast to determine the resistance or sensitivity of the viral protease to the chemical molecules used in the context of therapeutic protocols.
  • the invention also relates to a diagnostic kit comprising the elements necessary for the implementation of said method.
  • the method according to the invention makes it possible to rapidly and inexpensively determine the HIV-2 protease resistance phenotype in infected patients.
  • the method according to the invention also allows a "high-throughput" search for new chemical molecules having a viral protease inhibitory activity, with a view to the development of new therapeutic treatments.
  • the etiologic agents of AIDS are the human immunodeficiency viruses type 1 and 2. These viruses, which share certain clinical and biological characteristics, show major differences, particularly with regard to the modes of infection of the host. .
  • HIV-2 infection is more difficult than HIV-1 infection (Ancelle, R., O. Bletry, AC Baglin, F. Brun-Vezinet, MA Rey, and P. Godeau, 1987, Long incubation period for HIV-2 infection, Lancet 1: 688-9, Marlink, R., Kanki, P., I. Thior, K. Travers, G. Eisen, T. Siby, I. Traore, CC Hsieh, MC Dia , and EH Gueye, 1994.
  • the plasma viral load of individuals infected with HIV-2 is lower than that of HIV-1 infected individuals (Andersson, S., Norrgren, H., Z. da Silva, A. Biague, S. Bamba, S. Kwok, C. Christopherson, G. Biberfeld, and J. Albert 2000.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HIV-2 was identified for the first time in West Africa in 1986 (Clavel, F., D. Guetard, F. Brun-Vezinet, S. Chamaret, MA Rey, MO Santos-Ferreira, Laurent AG, C. Dauguet, C. Katlama, and C. Rouzioux, 1986. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS, Science 233: 343-6). In this region, the prevalence of HIV-2 infections ranges from 1% to 10% (Langley, C.L., E. Benga-De, CW Critchlow, I.Ndoye, MD Mbengue-Ly, J. Kuypers, G. Woto-Gaye, S. Mboup, C.
  • results obtained in the various studies conducted on HIV-2 are not sufficiently consistent to allow to formulate a correlation between a particular mutation of the HIV-2 protease, and a resistance phenotype.
  • the progression of the disease being slower in HIV-2 infected individuals than in those infected with HIV-1, the counting of CD4 + T cells, as well as the determination of plasma viral load do not account for in a rapid manner the emergence of resistant strains in patients undergoing treatment.
  • the invention proposes to meet this requirement by allowing the rapid and low cost definition of the HIV-2 protease resistance phenotype in infected patients, through the use of yeast.
  • the method developed in this invention can also be implemented to define the resistance phenotype of the HIV-1 protease, or the protease of any other retrovirus.
  • the method according to the invention thus makes it possible to determine, in the cellular context of yeast, the sensitivity phenotype of the viral retrovirus protease such as HIV-2, to drugs with inhibitory activity.
  • retrovirus isolates such as HIV (human immunodeficiency virus)
  • HIV human immunodeficiency virus
  • of the viral protease characterized by the use for this purpose, of at least one yeast whose cell lysis is induced by the expression of the protease of the retrovirus.
  • the method according to the invention comprises an expression vector, the choice of the cellular system, the expression mode of proteases of infected individuals and the drug susceptibility test.
  • nucleic acids DNA or RNA
  • cells blood or other taken from the individual or the animal infected with the retrovirus
  • any appropriate means - amplification of the sequences coding for the protease protease of the retrovirus to be studied - recombination of the DNA fragment, final product of the amplification, and an expression vector allowing the expression of the retrovirus protease coding sequence to be studied under the control of an inducible promoter known, and co-transformation of the recombinant vector with at least one cell of yeast whose cell lysis is induced by the expression of the retrovirus protease - culture of the co-transformed yeast cell (s) in order to obtain a sufficient number of transformants to carry out the sensitivity or resistance tests, and recovery transformants derived from the co-transformed cell, on any suitable support - incubation of the transformants in the presence of increasing concentration of each viral protease inhibitor to be tested - counting of living cells - deduction of
  • the sequences encoding the therapeutic targets are located inside a common polypeptide precursor. called Gag-Pol, encoded by the viral gag-pol gene (Clavel F, Guyader M, Guetard D, Room M, Montagnier L, Alizon M. 1986. Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 324 : 691-5).
  • a side chain at position 48 of the human immunodeficiency virus type-1 protease flap provides additional specificity determining.
  • Virology. 207: 475-85 Boross P, Bagossi P, Copeland TD, Oroszlan S, Louis JM, Tozser J. 1999. Effect of substrate residues on the P2 of preference of retroviral proteinases. Eur J Biochem. 264: 921-9)..
  • sequences of the protease amplified according to the method of the invention are those of those encoding the isolated protein or those encoding the protein and comprising all or part of the amino acid sequences located upstream and downstream of the cleavage of the protein precursor in which they are located.
  • the protocols used in the laboratory to obtain yeast transformants coding for an exogenous gene generally start with a first step making it possible to obtain the DNA fragment coding for the gene of interest, either by gene amplification (PCR technique ), or by release of said gene through the action of restriction enzymes, which will cut I 1 DNA containing the sequence of interest.
  • This first step is equivalent to half a day of work.
  • the released DNA fragment is then subcloned into an expression vector by the action of the enzyme Ligase DNA (overnight operation), and the reaction product is amplified in a bacterium after its transformation (1 day to obtain bacteria having incorporated the plasmid DNA, and 1 day and a half to obtain and characterize the desired transformant, containing the plasmid encoding the gene of interest).
  • the bacterial clone obtained in the previous step was amplified (overnight) and the plasmids were purified by conventional and known methods (1 day).
  • the purified plasmid obtained is then used to transform the selected yeast strain (1/2 day).
  • the time elapsing between the preparation of the DNA fragment coding for the gene of interest and obtaining the yeast strain expressing it is at least 8 days.
  • several techniques must be implemented.
  • the authors of the present invention therefore had to think about an innovative technology, allowing easy management of a large number of samples, in the In particular, it aims to quickly and efficiently test a large quantity of proteases from different patients undergoing treatment.
  • the minimum size of the homologous sequences to be present in the two DNA molecules for the recombination event to take place is about 40 base pairs.
  • This technique very advantageously makes it possible to simplify the obtaining of the transformants, in particular by reducing the number of manipulations, which implies a significant reduction in the necessary experimentation time (about half of the known protocols) as well as production costs.
  • the implementation of this technique also allows the manipulation of a large number of samples at a time.
  • This example of implementation is used in a privileged way when the protease expressed is the isolated protein.
  • the protease is expressed with all or part of the amino acid sequences located upstream and downstream of the cleavage of the protein precursor that contains it, the primers and nucleotide fragments set out below will be modified accordingly.
  • the purpose of the modification is to be able to subclone the protease gene of each individual studied and transform the yeast with the plasmid obtained by a simple and fast procedure ("a single step procedure").
  • the gene is expressed when the cells transformed with this vector are in the presence of Galactose, and the gene is not expressed when the transformed cells are in the presence of Glucose as a carbon source.
  • the vector In order for the amplified viral DNA fragment to be inserted by homologous recombination into the expression vector, the vector must be modified by adding, just after the inducible promoter sequence, a 5 'primer of approximately 40 base pairs followed by a unique restriction site (in order to linearize the vector), and a 3 'primer of approximately 40 base pairs. Although this modified and linearized vector is a good substrate for the homologous recombination event, the sequence introduced at the 5 'position (between the gene and the promoter) must not inhibit the transcription of the gene.
  • sequence of this fragment is as follows: ⁇ 'GGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGCGGCCGCAGTAG AGCCAATAAAAATAATGCTAAAGCGAGCTC 3 '
  • the expression vector pRS316-Ga11 / 10 thus modified is named pRS316-Gal1 / 10M.
  • the DNA sequence encoding the HIV-2 protease is amplified by the PCR technique 1 twice.
  • the first is to produce a sufficient amount of DNA. This reaction is made from DNA extracted from peripheral blood lymphocytes of infected individuals.
  • the nucleotide primers used are of the type: • sense primer: 5'GAAAGAAGCCCCGCAACTTC3 '• antisense primer: 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3'
  • the purpose of the second amplification is to frame the protease of a transcription initiation codon (ATG) as well as a transcription termination codon (TAA) and to add sequences of about forty nucleotides that we brought to the vector when it was modified.
  • This PCR reaction is carried out on the product of the first PCR with the primers of the type: • sense primer: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGC GGCCGCGCCATGCCTCAATTC3 '• antisense primer: 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG CGGCCGCTTAA GATT3'
  • the framework of the protease by the initiation and termination codons is that of the isolated protease or of the protein comprising all or part of the amino acid sequences located upstream and downstream of the precursor cleavage site in which it is located.
  • the co-transformation of the vector pRS316-Gal1 / 10M cleaved with the restriction enzyme NotI with the product of the second PCR makes it possible, by the homologous recombination event that takes place in the cell, to obtain a transformed yeast cell. carrying the HIV-2 protease sequence under the control of the inducible GaI promoter (FIGS. 1 and 2)
  • a peripheral blood sample is taken from the individual infected with HIV-2.
  • the lymphocytes from this sample are purified or not, and their DNA extracted by known methods.
  • This DNA undergoes the two aforementioned PCR reactions to create the DNA fragment, carrying the protease sequence with or without the or a portion of the amino acid sequences located upstream and downstream of the precursor cleavage site. which it is located, and compatible with the expression vector for inducing the homologous recombination phenomenon in the transformed cell.
  • a yeast strain having a genotype ura3 is cotransformed with the linear vector pRS316Gal1 / 10M (by its NotI site).
  • transformants potentially producing the protease are recovered on any appropriate support, such as, for example, agar, composed of agar, glucose as a carbon source, and a synthetic uracil-deficient medium.
  • the living cells are counted by a densitometric reading at 600 nm (FIG. 3).
  • the time interval between the blood test and the definition of the resistance profile is only one week.
  • a diagnostic kit for carrying out the method according to the invention, for determining the sensitivity or resistance of retrovirus isolates to retroviral therapeutic treatments based on protease inhibitors comprising:
  • nucleotide primers and for example nucleotide primers as previously described for carrying out the amplification of the DNA encoding the retrovirus protease by the PCR technique, namely: for the first amplification, primers of the type: Primer sense: 5'GAAAGAAGCCCCGCAACTTC3 'Antisense primer: 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3' • for the second amplification, primers of the type: Primer meaning: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAG CGGCCGCGCCATGCCTCAATTC3 'Antisense primer: 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG CGGCCGCTTAA GATT3'
  • At least one expression vector for example the plasmid modified and linearized according to the method of the invention and as described above, at least one yeast strain with the auxothrophy markers necessary to allow the selection of the transformant expressing viral protease, and preferably a strain of Saccharomyces cerevisiae - at least one multiwell plate or any other suitable carrier.
  • the gene coding for the viral protease is amplified by an RT-PCR reaction with the primers described in the process according to the invention and provided in the kit.
  • Amplification of the viral protease gene from cellular DNA is also possible.
  • the amplified product and the linearized modified vector are used to transform a yeast strain, also provided in the kit, into a multiwell plate.
  • the cell suspension is transferred to a new plate, supplied in the kit, containing increasing concentrations of each active ingredient. used in therapy.
  • 300 microliters of the selective medium containing galactose are added to each well, before being incubated at 30 ° C. in a drying oven for 36-48 hours.
  • the living cells are enumerated by a densitometric reading at 600 nm.
  • the dose required to halve cell growth, relative to cell growth of the yeast strain not expressing the viral protease, will define ICs 0 for each inhibitor.
  • the comparison between the IC 50 obtained and those of a wild-type reference protease makes it possible to determine the possible phenotype of resistance.
  • the time interval between the blood test and the definition of the resistance profile is one week only.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance de rétrovirus tel que le VIH aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, par l'utilisation de levures. Autrement dit, l'invention vise l'utilisation de la levure pour déterminer la résistance ou la sensibilité de la protéase virale aux molécules chimiques utilisées dans le cadre des protocoles thérapeutiques. L'invention est également relative à un kit de diagnostic comprenant les éléments nécessaires à la mise en oeuvre dudit procédé.

Description

Procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus aux traitements thérapeutiques rétroviraux à base d'inhibiteurs de la protéase virale, et kit de diagnostic issu de la mise en œuvre de ce procédé.
L'invention concerne un procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance de rétrovirus tel que le VIH aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, par l'utilisation de levures. Autrement dit, l'invention vise l'utilisation de la levure pour déterminer la résistance ou la sensibilité de la protéase virale aux molécules chimiques utilisées dans le cadre des protocoles thérapeutiques. L'invention est également relative à un kit de diagnostic comprenant les éléments nécessaires à la mise en œuvre dudit procédé.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet de déterminer rapidement et à bas coût, le phénotype de résistance de la protéase du VIH-2 chez des patients infectés.
Le procédé selon l'invention permet également une recherche à "haut débit" de nouvelles molécules chimiques ayant une activité inhibitrice de la protéase virale, en vue de la mise au point de nouveaux traitements thérapeutiques.
Les agents étiologiques du SIDA sont les virus de l'immunodéficience humaine du type 1 et 2. Ces virus, qui partagent certaines caractéristiques cliniques et biologiques, présentent des différences majeures, notamment en ce qui concerne les modalités de l'infection de l'hôte. Ainsi, l'infection par le VIH-2 est plus difficile que celle par le VIH-1 ( Ancelle, R., O. Bletry, A. C. Baglin, F. Brun- Vezinet, M. A. Rey, and P. Godeau, 1987, Long incubation period for HIV-2 infection. Lancet. 1:688-9 ; Marlink, R., P. Kanki, I. Thior, K. Travers, G. Eisen, T. Siby, I. Traore, C. C. Hsieh, M. C. Dia, and E. H. Gueye. 1994. Reduced rate of disease development after HIV-2 infection as compared to HIV-1. Science. 265:1587-90 ;. Adjorlolo- Johnson, G., K. M. De Cock, E. Ekpini, K. M. Vetter, T. Sibailly, K. Brattegaard, D. Yavo, R. Doorly, J. P. Whitaker, and L. Kestens. 1994. Prospective comparison of mother-to-child transmission of HIV-1 and HIV-2 in Abidjan, Ivory Coast. JAMA. 272:462-6 ; Marlink, R. 1996. Lessons from the second AIDS virus, HIV-2. AIDS. 10:689-99.), la charge virale plasmatique des individus infectés par le VIH-2 est moins élevée que celle des individus infectés par le VIH-1 ( Andersson, S., H. Norrgren, Z. da Silva, A. Biague, S. Bamba, S. Kwok, C. Christopherson, G. Biberfeld, and J. Albert. 2000. Plasma viral load in HIV-1 and HIV-2 singly and dually infected individuals in Guinea-Bissau, West Afήca: significantly lower plasma virus set point in HIV-2 infection than in HIV-1 infection. Arch. Intern. Med. 160:3286-93 ; Popper, S. J., A. D. Sarr, K. U. Travers, A. Gueye-Ndiaye, S. Mboup, M. E. Essex, and P. J. Kanki. 1999. Lower human immunodeficiency virus (HIV) type 2 viral load reflects the différence in pathogenicity of HIV-1 and HIV-2. J. Infect. Dis. 180:1116-21.), et les individus infectés par le VIH-2 présentent une évolution vers la maladie plus lente (Vittinghoff, E., S. Scheer, P. O'Malley, G. Col fax, S. D. HoIm berg, and S. P. Buchbinder. 1999. Combination antiretroviral therapy and récent déclines in AIDS incidence and mortality. J. Infect. Dis. 179:717-20 ; Blanco, R., Carrasco, L, and Ventoso, I. 2003. CeII killing by HIV-1 protease. J. Biol. Chem. 278:1086-93 ; Liu.H., Krizek,J. and Bretscher,A. 1992. Construction of a GAL1-regulated yeast cDNA expression library and its application to the identification of gènes whose overexpression causes lethality in yeast. Genetics 132:665-673).
Le VIH-2 a été identifié pour la première fois en Afrique de l'Ouest en 1986 (Clavel, F., D. Guetard, F. Brun-Vezinet, S. Chamaret, M. A. Rey, M. O. Santos-Ferreira, A. G. Laurent, C. Dauguet, C. Katlama, and C. Rouzioux. 1986. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 233:343-6). Dans cette région, la prévalence d'infections à VIH-2 varie entre 1% et 10% ( Langley, C. L, E. Benga-De, C. W. Critchlow, I. Ndoye, M. D. Mbengue-Ly, J. Kuypers, G. Woto-Gaye, S. Mboup, C. Bergeron, K. K. Holmes, and N. B. Kiviat 1996. HIV-1, HIV-2, human papillomavirus infection and cervical neoplasia in high-risk African women. AIDS. 10:413-7 ; Poulsen, A. G., B. Kvinesdal, P. Aaby, K. Molbak, K. Frederiksen, F. Dias, and E. Lauritzen. 1989. Prevalence of and mortality from human immunodeficiency virus type 2 in Bissau, West Africa. Lancet. 1:827-31 ; Wilkins, A., D. Ricard, J. Todd, H. Whittle, F. Dias, and A. Paulo Da Silva. 1993. The epidemiology of HIV infection in a rural area of Guinea-Bissau. AIDS. 7:1119-22). La majorité des cas d'infections par le VIH-2, en dehors de l'Afrique occidentale, se trouve dans les pays européens et plus particulièrement au Portugal où les individus infectés par le VIH-2 représentent 13% de la population infectée par les virus de lïmmunodéficience humaine ( Soriano, V., P. Gomes, W. Heneine, A. Holguin, M. Doruana, R. Antunes, K. Mansinho, W. M. Switzer, C. Araujo, V. Shanmugam, H. Lourenco, J. Gonzalez-Lahoz, and F. Antunes. 2000. Human immunodeficiency virus type 2 (HN -2) in Portugal: clinical spectrum, circulating subtypes, virus isolation, and plasma viral load. J. Med. Virol. 61:111-6). En France il a été estimé que 1% de la population infectée par le VIH l'est par le virus du type 2.
Dans les pays développés, les individus infectés par le VIH-1 et/ou par le VIH- 2 sont traités par une thérapie chimique, composées de molécules ayant une activité inhibitrice pour l'une ou l'autres des deux enzymes virales : la Transcriptase Inverse et la Protéase.
Bien que ce traitement ait contribué significativement à réduire la morbidité et la mortalité causée par l'infection à VIH (PaIeIIa, F. J., Jr., K. M. Delaney, A. C. Moorman, M. O. Loveless, J. Fuhrer, G. A. Satten, D. J. Aschman, and S. D. Holmberg. 1998. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient Study Investigators. N. Engl. J. Med. 338:853-60 ; Vittinghoff, E., S. Scheer, P. O'Malley, G. Col fax, S. D. Holmberg, and S. P. Buchbinder. 1999. Combination antiretroviral therapy and récent déclines in AIDS incidence and mortality. J. Infect. Dis. 179:717-20), certains cas d'échec thérapeutique ont été observés.
La possibilité d'amplifier, à partir de I1ARN plasmatique ou de l'ADN cellulaire des individus infectés par le VIH-1 et en échec thérapeutique, a permis de comprendre au niveau moléculaire, l'inefficacité spontanée ou progressive des traitements thérapeutiques. La détermination notamment de la séquence nucléique des deux enzymes virales Transcriptase Inverse et Protéase, a montré l'apparition d'un certain nombre de mutations. Les résultats obtenus lors des études in vitro, dans lesquelles une souche virale sauvage (donc sensible aux traitements) portait lesdites mutations, ont clairement démontré l'implication de ces mutations dans la résistance du virus aux traitements.
Les chercheurs ont donc mené un certain nombre de travaux sur ces mutations ainsi que sur les résistances qu'elles génèrent, afin d'orienter et guider le choix du traitement thérapeutique et d'optimiser son efficacité.
Malheureusement, les stratégies économiques des laboratoires ont conduit la plupart du temps au désintéressement général de la communauté scientifique quant au traitement des patients infectés par le VIH-2 (les populations les plus touchées par le VIH-2 étant principalement celles des pays en voie de développement), ou ont conduit à des solutions inadaptées : traitements, tests et analyses trop coûteux, diagnostics trop longs ou impossibles à mettre en œuvre sur place, absence de structures compétentes dans le pays concerné, etc.
Ainsi, les résultats obtenus lors des différentes études menées sur le VIH-2, ne sont pas suffisamment consistants pour permettre de formuler une corrélation entre une mutation particulière de la protéase du VIH-2, et un phénotype de résistance. Par ailleurs, la progression de la maladie étant plus lente chez les individus infectés par le VIH-2 que chez ceux infectés par le VIH-1 , le décomptage de cellules T CD4, ainsi que la détermination de la charge virale plasmatique ne rendent pas compte d'une manière rapide de l'émergence de souches résistantes chez les patients sous traitement.
Il existe aujourd'hui trois compagnies qui fournissent le profil de résistance d'une souche de VIH isolée d'un patient infecté. Conceptuellement les trois tests se ressemblent et sont basés sur la capacité de chaque inhibiteur de protéase à inhiber la libération de virus recombinant infectieux comportant la protéase du virus infectant le patient. Les compagnies sont : Viralliance (France), qui produit Phenoscript™, Virco (Belgique) qui produit Antiviogram™, et Virologie (Etats Unis) qui produit PhenoSense™. Dans les trois cas, la réalisation de ces tests requiert une organisation logistique importante, du personnel spécialisé en biologie moléculaire et en virologie, et des infrastructures lourdes du type laboratoire sécurisé P3 (il semblerait qu'un profil complet coûterait actuellement entre 800 et 1000 euros par échantillon ). Le délai existant entre le moment où le matériel biologique arrive aux Laboratoires et le moment où le profil de résistance est établi, varie, pour chaque souche de VIH-1 , entre deux et trois semaines. Les informations sur ces tests se trouvent aux adresses internet suivantes : http://www.vircolab.com http://www.phenosense.com/professional/213a.html http://www.viralliance.com/html/phenoscript1.html
Dans ces conditions, la mise sur le marché d'un test fidèle, rapide, simple à mettre en œuvre et peu onéreux est devenue impérative. Un tel test permettrait d'aider les médecins traitant à suivre l'apparition de souches résistantes chez les patients infectés par des rétrovirus, notamment le VIH 1 ou 2, en particulier pour les populations démunies. Par ailleurs, ce test pourrait également être utilisé pour une recherche à "haut débit" de nouvelles molécules ayant une activité inhibitrice de la protéase du rétrovirus.
L'invention propose de répondre à cette exigence en permettant la définition rapide et à bas coût du phénotype de résistance de la protéase du VIH-2 chez les patients infectés, grâce à l'utilisation de la levure.
Le procédé mis au point dans cette invention peut aussi être mis en œuvre pour définir le phénotype de résistance de la protéase du VIH-1 , ou de la protéase de tout autre rétrovirus.
Un article scientifique apparu en 2003 avait démontré que l'expression de la protéase du VIH-1 par la levure Saccharomyces cerevisiae induisait la mort de celle-ci par un mécanisme encore méconnu, ayant pour conséquence la lyse cellulaire de la levure en question (Blanco, R., Carrasco, L., and Ventoso, I. 2003. CeII killing by HIV-1 protéase. J. Biol. Chem. 278:1086-93).
Nous avons démontré dans notre laboratoire, que le même phénomène se produisait quand les levures exprimaient la protéase du VIH-2.
En conséquence, en inhibant l'activité enzymatique virale par modification de son site catalytique, nous avons réussi à empêcher l'apparition de cet événement cellulaire.
De plus, Blanco et collaborateurs (Blanco, R., Carrasco, L., and Ventoso, I. 2003. CeII killing by HIV-1 protéase. J. Biol. Chem. 278:1086-93) ont montré aussi que l'inhibition de la protéase du VIH-1 par un des inhibiteurs utilisés en thérapie anti-VIH inhibait la mort cellulaire de la levure, induite par l'expression de la protéase virale. De ce fait, il est possible de mesurer d'une manière quantitative la sensibilité et la résistance de la protéase d'individus infectés aux différentes molécules inhibitrices.
Le procédé selon l'invention permet donc de déterminer, dans le contexte cellulaire de la levure, le phénotype de sensibilité de la protéase virale de rétrovirus tel que le VIH-2, aux drogues à activité inhibitrice.
Autrement dit, il permet de déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus tel que le VIH (virus de l'immunodéficience humaine), aux molécules chimiques ayant une activité inhibitrice sur la protéase virale ou aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, caractérisé par l'utilisation à cette fin, d'au moins une levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus.
Les buts, caractéristiques et avantages ci-dessus du procédé selon l'invention ressortiront mieux encore de la description qui suit.
De façon schématique, le procédé selon l'invention comporte un vecteur d'expression, le choix du système cellulaire, le mode d'expression de protéases d'individus infectés et le test de susceptibilité aux drogues.
Il comprend les étapes suivantes : - extraction des acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir de cellules (sanguines ou autres) prélevées sur l'individu ou l'animal infecté par le rétrovirus, par tout moyen approprié - amplification des séquences codant pour la protéase du rétrovirus à étudier - recombinaison du fragment d'ADN, produit final de l'amplification, et d'un vecteur d'expression permettant l'expression de la séquence codant pour la protéase du rétrovirus à étudier sous contrôle d'un promoteur inductible connu, et co-transformation du vecteur recombiné avec au moins une cellule de levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus - culture de la ou des cellules de levure co-transformées afin d'obtenir un nombre de transformants suffisant pour effectuer les tests de sensibilité ou de résistance, et récupération des transformants issus de la cellule co- transformée, sur tout support approprié - incubation des transformants en présence de concentration croissante de chaque inhibiteur de protéase virale à tester - comptage des cellules vivantes - déduction du phénotype de résistance
Les séquences codant les cibles thérapeutiques (transcriptase inverse et protéase), ainsi que les protéines dites de structure (la matrice, la capside, la nucléocapside), et l'activité enzymatique Intégrase, se situent à l'intérieur d'un précurseur polypeptidique commun appelé Gag-Pol, codé par le gène viral gag-pol (Clavel F, Guyader M, Guetard D, Salle M, Montagnier L, Alizon M. 1986. Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 324: 691-5). C'est l'action de la Protéase virale qui, par l'hydrolyse de liaisons peptidiques spécifiques, appelées sites de clivage, encadrant les séquences primaires des différents constituants du précurseur, est responsable de la libération de ces protéines (Oroszlan S, and Luftig RB. 1990. Retroviral proteinases. Curr Top Microbiol Immunol. 157:153-85). Il a été montré que pour la Protéase du VIH-1 , les séquences en acides aminés se situant en amόnt et en aval du site de clivage jouent un rôle important dans l'événement de reconnaissance de l'enzyme pour son substrat, donc déterminant pour son activité protéolytique (Pettit SC, Simsic J, Loeb DD, Everitt L, Hutchison CA 3rd, Swanstrom R. 1991. Analysis of retroviral protéase cleavage sites reveals two types of cleavage sites and the structural requirements of the P1 amino acid. J.Biol.Chem. 266:14539-47, Pettit SC, Moody MD, Wehbie RS, Kaplan AH, Nantermet PV, Klein CA, Swanstrom R. 1994. The p2 domain of human immunodeficiency virus type 1 Gag régulâtes sequential proteolytic processing and is required to produce fully infectious virions. J Virol. 68:8017-27, Moody MD, Pettit SC, Shao W, Everitt L, Loeb DD, Hutchison CA 3rd, Swanstrom R. 1995. A side chain at position 48 of the human immunodeficiency virus type-1 protease flap provides an additional specificity déterminant. Virology. 207:475-85, Boross P, Bagossi P, Copeland TD, Oroszlan S, Louis JM, Tozser J. 1999. Effect of substrate residues on the P2' préférence of retroviral proteinases. Eur J Biochem. 264:921-9.).
Les séquences de la protease amplifiées selon le procédé de l'invention s'entendent de celles codant pour la protéine isolée ou de celles codant pour la protéine et comprenant tout ou partie des séquences d'acides aminés situées en amont et en aval du site de clivage du précurseur protéique dans lequel elles se situent.
Les protocoles utilisés en laboratoire en vue d'obtenir des transformants de levure codant pour un gène exogène débutent généralement par une première étape permettant d'obtenir le fragment d'ADN codant pour le gène d'intérêt, soit par amplification génique (technique de PCR), soit par libération dudit gène grâce à l'action des enzymes de restrictions, lesquelles couperont I1ADN contenant la séquence d'intérêt. Cette première étape équivaut en temps, à une demi-journée de travail.
Le fragment d'ADN libéré est ensuite sous clone dans un vecteur d'expression par l'action de l'enzyme ADN Ligase (opération durant une nuit), et le produit de la réaction est amplifié dans une bactérie, après sa transformation (1 jour pour obtenir des bactéries ayant incorporé l'ADN plasmidique, et 1 jour et demi pour obtenir et caractériser le transformant recherché, contenant le plasmide codant pour le gène d'intérêt). D'autre part, afin de produire des quantités suffisantes du plasmide contenant le gène d'intérêt en vue de la transformation de la levure, le clone bactérien obtenu dans l'étape précédente a été amplifié (une nuit) et les plasmides ont été purifiés par des méthodes conventionnelles et connues (1 journée).
Le plasmide purifié obtenu est ensuite utilisé pour transformer la souche de levure sélectionnée (1/2 journée).
L'obtention de la souche de levure transformée intervient environ 4 jours après l'événement de transformation.
En conséquence, en utilisant les protocoles classiques et bien connus de l'homme de l'art permettant d'obtenir une quantité suffisante de transformants de levure pour une étude ultérieure d'un gêne d'intérêt, par exemple pour la mise au point d'un test de sensibilité ou de résistance, le temps qui s'écoule entre la préparation du fragment d'ADN codant pour le gène d'intérêt et l'obtention de la souche de levure l'exprimant est au minimum de 8 jours. D'autre part, comme exposé ci-dessus, plusieurs techniques doivent être mises en œuvre.
L'importance de ces délais et la multiplicité des techniques utilisées engendrent nécessairement des coûts de production importants, incompatibles avec la mise au point d'un test de sensibilité ou de résistance rapide, simple à mettre en œuvre et peu onéreux.
En d'autres termes, les protocoles proposés par l'état de l'art en ce qui concerne l'obtention de transformants de levure ne peuvent répondre à l'exigence posée par l'invention.
Les auteurs de la présente invention ont donc dû réfléchir à une technologie innovante, permettant une gestion facile d'un grand nombre d'échantillons, dans le but notamment de tester rapidement, efficacement et à moindre coût, une grande quantité de protéases issues de différents patients sous traitement.
Considérant les études sur la capacité de la levure à réparer des « ADN cassés » (nicked DNA) par le mécanisme de la recombinaison homologue, il a été relevé que lors de cet événement cellulaire, une molécule d'ADN est réparée à un endroit précis de sa séquence, par la mise en place de séquences homologues au site de « cassure », et prises au sein d'une autre molécule d'ADN. En utilisant ce phénomène physiologique, il est possible d'introduire une séquence définie à l'intérieur de l'ADN « cassé », à condition que la séquence définie soit encadrée de part et d'autre, par des séquences identiques à celles situées autour du site de « cassure ».
La taille minimale des séquences homologues devant être présentes dans les deux molécules d'ADN pour que l'événement de recombinaison puisse avoir lieu est d'environ 40 paires de bases.
Cette technique permet très avantageusement de simplifier l'obtention des transformants, en réduisant notamment le nombre de manipulations, ce qui implique une diminution significative du temps d'expérimentation nécessaire (environ de moitié par rapport aux protocoles connus) ainsi que des coûts de production. La mise en œuvre de cette technique permet également la manipulation d'un grand nombre d'échantillons à la fois.
Description détaillée d'un exemple préféré de mise en œuvre du procédé selon l'invention :
Cet exemple de mise en œuvre est utilisé de façon privilégiée lorsque la protéase exprimée est la protéine isolée. Lorsque la protéase est exprimée avec tout ou partie des séquences d'acides aminés situées en amont et en aval du site de clivage du précurseur protéique qui la contient, les amorces et les fragments nucléotidiques exposés ci-dessous seront modifiés en conséquence.
1- Préparation et modification du vecteur d'expression :
Le but de la modification est de pouvoir sous-cloner le gène de la protéase de chaque individu étudié et de transformer la levure avec le plasmide obtenu par une procédure simple et rapide (« a single step procédure »).
Nous avons créé une version modifiée du vecteur pRS316-Gal1/10, qui comporte le promoteur inductible Gal1/10 en position 5' du site de clonage du gène à exprimer (Liu,H., Krizek,J. and Bretscher,A. 1992. Construction of a GAL1-regulated yeast cDNA expression library and its application to the identification of gènes whose overex pression causes lethality in yeast. Genetics 132:665-673).
De ce fait, le gène est exprimé quand les cellules transformées avec ce vecteur sont en présence de Galactose, et le gène n'est pas exprimé lorsque les cellules transformées sont en présence de Glucose comme source de carbone.
Pour que le fragment d'ADN viral amplifié puisse être inséré par recombinaison homologue dans le vecteur d'expression, le vecteur doit être modifié en lui ajoutant, juste après la séquence du promoteur inductible, une amorce 5' d'environ 40 paires de bases, suivi par un site unique de restriction (afin de pouvoir linéariser le vecteur), et une amorce 3' d'environ 40 paires de bases. Bien que ce vecteur modifié et linéarisé soit un bon substrat pour l'événement de recombinaison homologue, la séquence introduite en position 5' (entre le gène et le promoteur) ne doit pas inhiber la transcription du gène. Pour réaliser la version modifiée du vecteur d'expression pRS316-Gal 1/10, nous avons échangé le fragment BamHI-Sacl de ce site par un autre fragment d'ADN encadré lui aussi par les sites de restriction BamHI-Sacl qui contient (de 5' à 3') : • le site de restriction BamHI, unique dans le vecteur, suivi par • les 35 à 45 nucléotides de la séquence du VIH-2 situés juste en amont de la protéase, suivis par • un site de restriction Notl, unique dans le vecteur, suivi par • les 35 à 45 nucléotides de la séquence du VIH-2 situés juste en aval de la protéase, suivis par • le site de restriction Sacl, unique dans le vecteur.
Des modifications de la taille de ce fragment d'environ 80-90 paires de bases ont été effectuées afin d'optimiser le système expérimental de clonage, transformation, et expression. Un seul fragment modifié, parmi 10 différents qui ont été testés, a été suffisamment optimal pour la recombinaison homologue et pour l'expression de la protéase virale.
La séquence de ce fragment est la suivante : δ'GGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGCGGCCGCAGTAG AGCCAATAAAAATAATGCTAAAGCGAGCTC 3'
Le vecteur d'expression pRS316-Ga11/10 ainsi modifié est nommé pRS316- Gal1/10M.
2- Choix du système cellulaire :
Toute souche de levures avec les marqueurs d'auxothrophie nécessaires afin de permettre la sélection du transformant exprimant la protéase virale, et de préférence toute souche de Saccharomyces cerevisiae. 3- Sous-clonage des protéases d'individus infectés par le rétrovirus, et transformation de levures dans un seul « step ».
La séquence d'ADN codant la protéase du VIH-2 est amplifiée par la technique de PCR1 deux fois.
La première a pour objet de produire une quantité suffisante d'ADN. Cette réaction se fait à partir d'ADN extraits de lymphocytes du sang périphérique d'individus infectés. Les amorces nucléotidiques utilisées sont du type : • Amorce sens: 5'GAAAGAAGCCCCGCAACTTC3' • Amorce antisens : 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3'
La deuxième amplification a pour objet d'encadrer la protéase d'un codon d'initialisation de la transcription (ATG) ainsi que d'un codon de terminaison de la transcription (TAA) et ajouter de part et d'autre les séquences d'environ quarante nucléotides que nous avons apportées au vecteur lors de sa modification. Cette réaction de PCR se fait sur le produit de la première PCR avec les amorces du type : • Amorce sens: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGC GGCCGCGCCATGCCTCAATTC3' • Amorce antisens : 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG CGGCCGCTTAA GATT3'
L'encadrement de la protéase par les codons d'initiation et de terminaison est celui de la protéase isolée ou de la protéine comprenant tout ou partie des séquences d'acides aminés situées en amont et en aval du site de clivage du précurseur dans lequel elle se situe. La co-transformation du vecteur pRS316-Gal1/10M clivé par l'enzyme de restriction Notl avec le produit de la deuxième PCR permet, par l'événement de recombinaison homologue qui a lieu dans la cellule, d'obtenir une cellule de levure transformée, portant la séquence de la protéase du VIH-2 sous contrôle du promoteur inductible GaI (figures 1 et 2)
4- Le test
On prélève un échantillon de sang périphérique de l'individu infecté par le VIH- 2. Les lymphocytes issus de ce prélèvement sont purifiés ou non, et leur ADN extrait par les méthodes connues.
Cet ADN subi les deux réactions de PCR précitées afin de créer le fragment d'ADN, portant la séquence de la protéase avec ou non les ou une partie des séquences d'acides aminés situées en amont et en aval du site de clivage du précurseur dans lequel elle se situe, et compatible avec le vecteur d'expression pour induire le phénomène de recombinaison homologue dans la cellule transformée.
Après purification du produit de la deuxième PCR une souche de levure ayant un génotype ura3 est co-transformée avec le vecteur pRS316Gal1/10M linéaire (par son site Notl).
Les transformants produisant potentiellement la protéase sont récupérés sur tout support approprié, tel que par exemple la gélose, composée d'agar, de glucose comme source de carbone, et d'un milieu synthétique carence en uracile.
Environ 105 cellules, issues d'un seul transformant, sont déposées et réparties dans douze puits d'une plaque à 96 puits, et incubées en galactose en présence de 11 concentrations croissantes de chaque inhibiteur à tester. Le douzième puits ne contient pas d'inhibiteur.
Après 36-48 heures à 300C, les cellules vivantes sont dénombrées par une lecture densitométrique à 600nm (figure 3).
La dose nécessaire pour inhiber de moitié la croissance cellulaire dans ces conditions, par rapport à la croissance cellulaire en absence de drogues et en présence de glucose (IC5o) définie la susceptibilité ou résistance de cette souche spécifique.
L'intervalle de temps entre la prise de sang et la définition du profil de résistance est seulement d'une semaine.
Kit de diagnostic de résistance aux rétrovirus
Entre également dans le cadre de l'invention, un kit de diagnostic pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, pour déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus aux traitements thérapeutiques rétroviraux à base d'inhibiteurs de la protéase virale caractérisé en ce qu'il comprend :
- des amorces nucléotidiques, et par exemple des amorces nucléotidiques telles que précédemment exposées pour la mise en œuvre de l'amplification de l'ADN codant pour la protéase du rétrovirus par la technique de PCR, à savoir : • pour la première amplification, amorces du type : Amorce sens: 5'GAAAGAAGCCCCGCAACTTC3' Amorce antisens : 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3' • pour la seconde amplification, amorces du type : Amorce sens: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAG CGGCCGCGCCATGCCTCAATTC3' Amorce antisens : 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG CGGCCGCTTAA GATT3'
- au moins un vecteur d'expression et par exemple le plasmide modifié et linéarisé selon le procédé de l'invention et tel que précédemment décrit - au moins une souche de levures avec les marqueurs d'auxothrophie nécessaires afin de permettre la sélection du transformant exprimant la protéase virale, et de préférence une souche de Saccharomyces cerevisiae - au moins une plaque multipuits ou tout autre support approprié.
Il est entendu que lorsque l'amplification est effectuée sur I1ADN codant pour la protéase du rétrovirus avec tout ou partie des séquences d'acides aminés situées en amont et en aval du site de clivage du précurseur protéique qui la contient, les amorces et les fragments nucléotidiques seront modifiés en conséquence.
Le principe du kit, également illustré en figure 4, est le suivant :
A partir du sang du patient, le gène codant pour la protéase virale est amplifié par une réaction de RT-PCR avec les amorces décrites dans le procédé selon l'invention et fournies dans le kit.
L'amplification du gène de la protéase virale à partir de l'ADN cellulaire est également possible. l'
Le produit amplifié et le vecteur modifié et linéarisé (également fourni dans le kit) sont utilisés pour transformer une souche de levure, aussi fourni dans le kit, dans une plaque multipuits.
De façon préférée quoique nullement limitative, après une incubation à 300C en étuve sèche en milieu sélectif contenant du Glucose, 2 microlitres de la suspension cellulaire sont transférés à une nouvelle plaque, fourni dans le kit, contenant des concentrations croissantes de chaque principe actif utilisé en thérapie. 300 microlitres du milieu sélectif contenant du galactose sont ajoutés à chaque puits, avant d'être incuber à 300C en étuve sèche pendant 36-48 heures.
A la fin de l'incubation, les cellules vivantes sont dénombrées par une lecture densitométrique à 600nm. La dose nécessaire pour inhiber de moitié la croissance cellulaire, par rapport à la croissance cellulaire de la souche de levure n'exprimant pas la protéase virale, définira ICs0 pour chaque inhibiteur. La comparaison entre les IC50 obtenus et ceux d'une protéase sauvage de référence permet de déterminer l'éventuel phénotype de résistance.
L'intervalle de temps entre la prise de sang et la définition du profil de résistance est d'une semaine seulement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus tel que le VIH (virus de l'immunodéficience humaine), aux molécules chimiques ayant une activité inhibitrice sur la protéase virale ou aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, caractérisé par l'utilisation à cette fin, d'au moins une levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus
2. Procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus tel que le VIH, aux molécules chimiques ayant une activité inhibitrice sur la protéase virale ou aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - extraction des acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir de cellules (sanguines ou autres) prélevées sur l'individu ou l'animal infecté par le rétrovirus, par tout moyen approprié - amplification des séquences codant pour la protéase du rétrovirus à étudier, avec ou non les ou une partie des séquences d'acides aminés situées en amont et en aval du site de clivage du précurseur dans lequel elles se situent - recombinaison du fragment d'ADN, produit final de l'amplification, et d'un vecteur d'expression permettant l'expression de la séquence codant pour la protéase du rétrovirus à étudier sous contrôle d'un promoteur inductible connu, et co-transformation du vecteur recombiné avec au moins une cellule de levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus - culture de la ou des cellules de levure co-transformées afin d'obtenir un nombre de transformants suffisant pour effectuer les tests de sensibilité ou de résistance, et récupération des transformants issus de la cellule co- transformée sur tout support approprié - incubation des transformants en présence de concentration croissante de chaque inhibiteur de protéase virale à tester - comptage des cellules vivantes - déduction du phénotype de résistance
3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'amplification des séquences codant pour la protéase du rétrovirus à étudier consiste en : a. une première amplification par la technique de PCR à partir d'ADN extraits de lymphocytes du sang périphériques d'individus infectés, en utilisant les amorces nucléiques du type : • Amorce sens: 5OAAAGAAGCCCCGCAACTTC3' • Amorce antisens : 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3' b. une seconde amplification par la technique de PCR à partir des produits de la première amplification, en utilisant les amorces nucléiques du type : • Amorce sens: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGC GGCCGCGCCATGCCTCAATTCS1 • Amorce antisens : 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG CGGCCGCTTAA GATT3'
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que le vecteur d'expression utilisé est le plasmide pRS316-Gal1/10
5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le vecteur d'expression utilisé est le plasmide pRS316-Gah/10, comportant le promoteur inductible Gal1/10 en position 5' du site de clonage du gène à exprimer, et dans lequel le fragment BamHI-Sacl est remplacé par un autre fragment d'ADN consistant en (de 5' à 3') : • le site de restriction BamHI, unique dans le vecteur, suivi par • les 35 à 45 nucléotides de la séquence du retrovirus situés juste en amont de la protéase, suivis par • un site de restriction Notl, unique dans le vecteur, suivi par • les 35 à 45 nucléotides de la séquence du retrovirus situés juste en aval de la protéase, suivis par • le site de restriction Sacl, unique dans le vecteur.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que les 35 à 45 nucléotides de la séquence du retrovirus situés juste en amont de la protéase et inclus dans le vecteur d'expression modifié pRS316-Gal1/10M, sont du type : 5'GGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGCGGCC S' et les 35 à 45 nucléotides de la séquence du retrovirus situés juste en aval de la protéase et inclus dans le vecteur d'expression modifié pRS316-Gal1/10M, sont du type : 5' GCAGTAGAGCCAATAAAAATAATGCTAAAGCGAGCTC 3'
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la levure utilisée est du genre Saccharomyces cerevisiae
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 caractérisé en ce que le milieu de culture des cellules de levure co-transformées est carence en glucose
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 caractérisé en ce que l'incubation des transformants est en galactose
10. Kit de diagnostic pour la mise en œuvre du procédé selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend : - des amorces nucléotidiques, et par exemple des amorces nucléotidiques selon la revendication 3, à savoir : • pour la première amplification, amorces du type : Amorce sens: 5'GAAAGAAGCCCCGCAACTTC3' Amorce antisens : 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3' • pour la seconde amplification, amorces du type : Amorce sens: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAG CGGCCGCGCCATGCCTCAATTC3' Amorce antisens : 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG CGGCCGCTTAA GATT3'
- au moins un vecteur d'expression et par exemple le plasmide modifié et linéarisé selon les revendications 4 à 6 - au moins une souche de levures avec les marqueurs d'auxothrophie nécessaires afin de permettre la sélection du transformant exprimant la protéase virale, et de préférence une souche de-Saccharomyces cerevisiae - au moins une plaque multipuits ou tout autre support approprié
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