WO2005085416A1 - 糸状菌特異的抗菌剤のスクリーニング方法及びそのためのキット - Google Patents

糸状菌特異的抗菌剤のスクリーニング方法及びそのためのキット Download PDF

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histidine kinase
fungus
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Toshiaki Kudo
Takayuki Motoyama
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Riken
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a new screening method for a fungus-specific antibacterial agent, for example, a fungus-specific pesticide or an antifungal drug. More specifically, the present invention relates to a method for screening a drug targeting a filamentous fungus-specific enzyme.
  • the test performed for the purpose is usually a primary test on a culture medium in a laboratory. Such a test for the target pathogen on the culture medium will catch all the different drugs that are effective against the target pathogen. Therefore, there is a high possibility that non-target organisms will pick up drugs that exhibit bactericidal properties.
  • Non-Patent Document 1 a disease control test using plant pots in a part of the crop body or in a greenhouse requires growing and preparing the crop, which requires cost and labor. It is said to be about 1 / 10,000 of the compound (Non-Patent Document 1;), which is inappropriate for testing a very large number of test compounds.
  • organic mercury agents have been used as important control agents for rice blast, but their use has been discontinued due to their toxicity to animals.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-294949.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-124424 discloses screening of firetrexin for a blast control agent, one week after dropping a test sample on the tip of a rice leaf. A method is described in which leaves are cut and extracted to confirm the presence or absence of firetrexin by HPLC.
  • 0s-1 family histidine kinase (also referred to as 0s-1 lamily; also described as 0s-1 subfamily) is a histidine kinase derived from a fungus (filamentous fungus) that performs hyphal growth.
  • a hybrid-type histidine kinase having a domain and a response regulator domain which is a hybrid histidine kinase Os-1 of Akapan ikibi (SEQ ID NO: 17; also referred to as Nik-1; Non-Patent Document 8).
  • amino acid repeat 1 (17, 260, 90 aa), amino acid repeat 2 (261-352, 92 aa), amino acid repeat 3 (353-444, 92 aa) N amino acid repeat 4 (445-536, 92 aa), amino acid It means a region having a region showing 50% or more homology with the entire length of the region containing repeat 5 (537-628, 92 aa) and amino acid repeat 6 (629-700, 72 aa). A similar problem exists with pharmaceutical screening.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-2949 995
  • Patent Document 2 JP-A-9-1-204 4 1 1
  • Non-Patent Document 1 Encyclopedia of Plant Pathology Yokendo March 19, 2005 March 30, P. 7 8 3-7 8 4
  • Non-Patent Document 3 Ochiai, N., Fujimura, M., Oshima, M., Motoyama, T.,
  • Non-Patent Document 4 Zhang, Y., Lamm, R., Pillonel, C., Xu, J. -R., And Lam, S. 1999.
  • the hyper-osmotic stress response pathway of Neu ospora crassa is the target of phenylpyrrole fungicides Proc. 20th Fungal Genetics Conference, Asi lomar, USA, p. 72
  • Non-Patent Document 7 Oshima, M., Fujimura, M., Banno, S., Hashimoto, C., Motoyama, T., Ichiishi, A., and Yamagucni, I. 2002.A point mutation in the two-component histidine kinase BeOS-1 gene confers dicarboximide resistance in field isolates of Botrytis cinerea. Phytopathology, 92, 75-80.
  • Non-Patent Document 8 Alex et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3416-3421
  • An object of the present invention is to provide an efficient screening method for an agricultural chemical candidate or a pharmaceutical candidate. Specifically, it is an object of the present invention to efficiently screen for pesticide candidate compounds that do not use plants and that do not adversely affect other organisms such as plants.
  • the inventors of the present application have conducted intensive studies on a method of screening for a pesticide that specifically acts on a pathogenic fungus that causes a plant disease.As a result, the present inventors have found that an enzyme existing only in a plant disease fungus or an information transmission pathway involving the enzyme is targeted. By screening pesticide candidates, we thought that it would be possible to specifically search for plant pesticides and to search for pesticides that would not affect other organisms. Therefore, taking as an example the control of filamentous fungi, it was examined whether an enzyme existing only in filamentous fungi or an information transmission system via the enzymes could be used.
  • Fig. 1 phenylpyrroles, dicarboximide dicarboximides, and aromatic hydrocarbons
  • Fig. 1 which are pesticides for controlling filamentous fungi
  • the present inventors first developed an agricultural chemical weather screening method and kit using this information transmission system.
  • the inventors of the present invention have proposed a gene expression vector encoding these filamentous fungus-specific enzymes, which is a yeast which is biologically closely related to a filamentous fungus but does not have the enzyme. Transformed and apply the pesticide candidate sample to control yeast (a yeast that does not express a filamentous fungus-specific enzyme) and to a transformant that expresses a filamentous fungus-specific enzyme.
  • the present invention has been completed by successfully developing a screening method for selecting a pesticide candidate sample showing a growth inhibition or bactericidal action specifically to a specific enzyme-expressing transformant as a pesticide candidate.
  • the present screening method can be similarly used for screening drug candidates.
  • Figure 1 shows three groups of drugs that target filamentous fungi: the structure of the drug and the organisms that the drug uses to control pathogenic fungi.
  • Figure 2 is a conceptual diagram of batidine and eukaryotic histidine kinase.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram of histidine kinase of 0s-1 familly and histidine kinase of budding yeast.
  • Fig. 4 shows a comparison of the signal transduction systems between filamentous fungi and S. cerevisiae. In parentheses with akapan rikibi protein Those that are homologous to the yeast protein but have not been confirmed to be complementary.
  • Figure 5 shows the results of a drug susceptibility test of S. cerevisiae harboring rice blast fungus HIK1:
  • Figure 6 shows drug sensitivity by HIK1 and the presence or absence of histidine kinase domain and response regulator domain:
  • the yeast cell suspension with pYES2 introduced at the top On a 90 mm diameter plate containing various drugs, the yeast cell suspension with pYES2 introduced at the top, the yeast cell suspension with pYES2—HIK1 introduced at the second top, 3 from the top
  • the yeast cell suspension into which pYES2-hikl-H736V has been introduced is shown at the top, and the yeast cell suspension into which pYES2-hikl-D1153E has been introduced is placed at 9 mm intervals at the bottom (10 7 from the left). (10 6 , 10 5 , 10 4 / ml) After dropping 5 ⁇ l each, the cells were cultured at 30 ° C. for 72 hours. Note that each plate, in order from the left plate, SG medium alone, 25 ppm Fludioxonil, drug is contained so as to 25ppm Iprodione s 50ppm Chloroneb, or 0. 5M NaCl.
  • Figure 7 shows drug sensitivity by HIK1 and the presence or absence of SSK1 and H0G1:
  • A. sskl mutant and hogl mutant show no drug sensitivity even when HIK1 is introduced.
  • (Top row) Cell suspension with pYES2-HIK1 introduced into control yeast, top (top) Cells with pYES2-HIK1 introduced into hogl mutant strain, in order from top to bottom, on a 90 mm diameter plate containing various drugs Suspension, (3rd stage) cell suspension obtained by introducing pYES2—HIK1 into sskl mutant, (4th stage) stell mutant Cell suspension in which pYES2—HIKl has been introduced into the cell, (fifth stage) Cell suspension in which pYES2 has been introduced into the control yeast, (stage 6) cell suspension in which pYES2—HIK1 has been introduced into the hogl mutant Turbidity,
  • Figure 8 shows the interaction between the rice blast fungus Hikl and the budding yeast Ypdl CytoTrap two-hybrid system. Interaction between the target and bait allows hSos to translocate to the cell membrane and activate Ras, allowing the cdc25H strain to grow at 37 ° C. Here, we looked at whether the target Hikl could eat the Ypdl or Sskl bait.
  • B Interaction of Hikl and Ypdl. After 5 ⁇ l of the cell suspension (10 7 , 10 6 , 10 5 , 10 4 / ml from the left) was dropped, the cells were cultured at each temperature for 5 days.
  • the present invention relates to a gene expression vector encoding an enzyme specific to a pathogenic filamentous fungus causing a disease in a plant or an animal, and other microorganisms which are biologically related to the diseased fungus but do not have the enzyme.
  • Control microorganisms such as those derived from the same host that do not express filamentous fungi-specific enzymes
  • filamentous fungi Applied to transformants expressing heterologous enzymes without affecting the control microorganisms, such as side effects, etc.
  • pesticide candidate or medicinal drug showing growth inhibition or bactericidal action specifically to only the fungal-specific enzyme expressing transformants And a transformant therefor and a kit therefor.
  • the disease fungi targeted by the present invention include filamentous fungi, for example, rice blast for plant diseases, and Candida, Aspergillus, athlete's foot (Trichophyton) for animal diseases such as humans. Is done.
  • Filamentous fungal disease-specific enzymes include filamentous fungus-specific histidine kinases (Os-1 family).
  • yeast preferably budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) is used as a host microorganism for introducing a filamentous fungus-specific enzyme gene. Can be mentioned.
  • the present invention provides a kit comprising a combination of a yeast expressing a filamentous fungus-specific histidine kinase gene (expressing yeast) and a non-expressing yeast (non-expressing yeast), and A pesticide candidate screening method using the kit is included.
  • filamentous fungi fungal pesticides specific to filamentous fungi have been known as pesticides peculiar to plant diseases.
  • pesticides specific to the filamentous fungi flupyoxinole and fenpiclonil as phenylpyrroles, and iprodione and vinclozolin as dicarboximides are described.
  • Chloroneb and PCNB are known as aromatic hydrocarbons.
  • filamentous fungus-specific pesticides are filamentous fungus-specific histidine kinases, for example, in the above-mentioned Patent Documents 2 to 7.
  • Intracellular signaling involves reversible phosphorylation including modification of the signal proteins serine, threinine, aspartic acid, histidine and tyrosine.
  • Histidine kinase is a signaling factor that exists in bacteria, yeast, filamentous fungi, and plants. One.
  • prokaryotes In prokaryotes, it is a two-component signal transduction system consisting of autophosphorylating histidine kinase as a basic signal transduction factor and a response regulator that receives phosphate from it and transmits information downstream.
  • histidine kinases are hybrid histidine kinases that have both a histidine kinase domain and a response regulator domain (Figure 2) (Ota, I. ⁇ ⁇ , and Varshavsky, A. 1993. Science 262). Urao et al. 1999. Plant Cell 11: 1743-1754., Pott et al., 2000 Fungal Genet. Biol. 31: 55-67 .; Virginia et al., 2000 Curr. Genet. 37: 364-372 .; West and Stock, 2001 Trends Biochem. Sci. 26: 369-376.).
  • the eukaryotic histidine kinase-mediated signal transduction system consists of three components: a hybrid histidine kinase, a histidine-phosphotransferred protein, and a response regulator.
  • hybrid-type histidine kinases 0s-1 found from Apacanthus
  • Hybrid histidine kinase (Os-1 family) having such characteristics is a fungi (filamentous fungi) such as rice blast fungus (Pyricularia oryzae:?), All of which show hyphal growth such as Magnaporthe grisea and Aspergillus ni dulans. ).
  • V ⁇ Alex et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Os-1 family has been found only in filamentous fungi, and it is thought that Os-1 family is the target enzyme for filamentous fungus-specific drugs.
  • yeast which is also a eukaryotic microorganism like filamentous fungi, Os-
  • a gene for a protein belonging to 0s-1 family was introduced into a yeast having no 0s-1 family protein gene to prepare a filamentous fungus-specific drug-sensitive yeast.
  • Os-1 family histidine kinase is a hybrid type histidine kinase having a histidine kinase domain and a response regulator domain derived from a mycelia-type growing fungus (filamentous fungus).
  • 6 amino acid repeats (amino acid repeat 1 (171-260, 90 aa), amino acid repeat 2 (261-352, 92 aa), and amino acid repeat 3 (353 —444, 92 aa), amino acid repeat 4 (445-536, 92 aa), amino acid repeat 5 (537-628, 92 aa), amino acid repeat 6 (629-700, 72 aa)) And a region having a homology of 50 to 0 or more.
  • proteins belonging to the Os-1 family include, for example, the rice blast fungus 0s-1 family histidine kinase Hikl (DDBJ / EMBL / GenBank accession number AB041647-1) and the bacterium 0s-1 funami. Lihistidine kinase Nik-l / Os-1 (Proc. Natl. Acd. Sci. Vol. 93, pp. 3416-3421, accession number
  • Botryotinia fuckeliana Botrytis cinerea
  • Bosl Botryotinia fuckeliana
  • Bosl Botryotinia fuckeliana
  • Hk4 accession number AY282750-1
  • Emericella nidulans Aspergillus ni dulans
  • Bmhkl accession number from Cochl iobolus heterostrophus
  • amino acids in which some amino acids are deleted, substituted, and / or added to the peptide represented by the amino acid sequence encoded by the Os-1 family histidine kinase gene or the amino acid sequence can also be included.
  • some amino acids refer to 1 to 200 amino acids, preferably 1 to 100 amino acids, more preferably 1 to 50 amino acids, more preferably 1 to 20 amino acids, and still more preferably 1 to 20 amino acids. Means from 9 amino acids.
  • these Os-1 family histidine kinase genes are compared with the above-mentioned os-1 family genes under ordinary default conditions, and have a homology of 80% or more, preferably 85% or more, More preferably, a polypeptide having histidine kinase activity (having a histidine kinase domain and a response regulator domain functioning) having a homology of 90%, and more preferably a homology of 95% or more, is used. Encoding genes can also be included.
  • HIK1 derived from the rice blast fungus and the peptide represented by the amino acid sequence represented by control U number 16 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 have one to several amino acids deleted.
  • a polypeptide represented by a lost, substituted, and / or depleted amino acid sequence and having histidine kinase activity (the histidine kinase domain and the response regulator domain function).
  • Organisms into which these 0s-1 family histidine kinase genes are introduced include microorganisms and cultured plant cells.
  • the 0s-1 downstream signal transduction system (including histidine phosphorylation protein) is used.
  • Protein, response regulator, and others are used.
  • An organism with a MAPKKK, MAPKK, and MAPkinase signaling system is desirable.
  • the mother particularly preferably a budding yeast and a microorganism belonging to the genus Saccharomyces.
  • a gene belonging to the Os-1 family for example, H1K1 can be introduced into a target organism into which the gene is to be introduced by recombining the gene with a known expression vector.
  • a target organism for example, pYES2, pYEp51, YEp62, pBM150, pLGDSD5, pAM82, pYE4, pAAh5, pMA56, pAH9 / 10/21, pMA230, pMA91, pG-1 / 2 and the like can be used.
  • yeast transformation is performed using the lithium acetate method (Ito et al., 1983 J Bacteriol. 153: 163-168). .) Can be used force S.
  • the kit for screening a pesticide candidate or a drug candidate compound of the present invention includes:
  • a kit containing a control organism preferably
  • the kit may further include a measuring reagent used for the screening described below.
  • the method for screening a pesticide candidate or a drug candidate compound of the present invention comprises:
  • a transformant prepared by transforming a host organism such as a yeast with a vector expressing a filamentous fungus-specific gene such as the Os-1 family histidine kinase gene.Expressing a filamentous fungus-specific gene in the same host. Administering a candidate pesticide or drug candidate to a control organism that does not
  • An agrochemical candidate sample is administered to a transformant prepared by transforming a yeast with the 0s-l family histidine kinase gene expression vector and to a control yeast prepared by transforming a host organism with a vector only.
  • the number of grown or viable cells of the transformed yeast and the control yeast expressing the family histidine kinase gene is, for example, visual observation, 0D 6 . .
  • it can be measured by measuring the oxygen consumption of yeast, measuring the decrease in sugar concentration in the culture medium, or a yeast-specific labeled antibody by labeling with a fluorescent or chromogenic enzyme, or The measurement can be performed by a well-known appropriate method, such as measurement using a yeast-specific antibody labeled with biotin or the like.
  • the same amount of cell-containing solution (for example, 5 ⁇ L) is added dropwise to a plate (for example, 90 plates) containing a fixed amount of a candidate pesticide, and then, for an appropriate time, for example, Culture for 5 hours or more, 300 hours or less, preferably 48 to 72 hours, at a culture temperature of 25 ° C. to 37 ° C., preferably 30 ° C., and the Os-1 family in a plate.
  • the growth conditions of the histidine kinase gene-expressing transformed yeast and the control yeast were visually checked, and the growth conditions (survival numbers) of the control yeast and the 0s-1 family histidine kinase gene-transformed transformant were different from each other.
  • Sample or A drug candidate sample is selected as a pesticide candidate or a drug candidate.
  • 0D 6 at regular time intervals within the range of 0% time. . Is measured.
  • 0D6Q is used at 3 hour intervals. Is measured. From this measurement, a growth curve is created and the doubling time is calculated.
  • Os-1 family histidine kinase gene-expressing transformant has a doubling time of at least 20%, preferably at least 50%, more preferably at least 100%, more preferably at least a boost of control yeast over control yeast.
  • the selected agricultural chemical candidate or pharmaceutical candidate sample is selected as an agricultural chemical candidate or pharmaceutical candidate.
  • a pesticide candidate or a drug candidate screened by the above-described method targeting the 0s-1 family histidine kinase of 5fe from a certain filamentous fungus is usually used for other filamentous fungi having the 0s-1 family amyl histidine kinase.
  • it can be considered as a pesticide or a drug trap.
  • yeast strains and plasmids used are shown in Table 1 below.
  • the complete medium is YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose), and the minimum medium is SD (0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids 2% glucose, IX Dropout solution (Clontech)) Agarium: SG (0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids, 2% galactose 1% raff inose IX dropout solution (Clontech)) was used.
  • SG 0.7% yeast nitrogen base w / o amino acids, 2% galactose 1% raff inose IX dropout solution (Clontech)
  • Example 1 Expression and analysis of histidine kinase in filamentous fungi in yeast
  • Drug sensitivity was analyzed by plate culture and liquid culture. For culture in plates, 5 ml SD / - and one ⁇ cultured in Ura, cells were collected, 10 ml SG / - washed with Ura, 10ml SG / - After culturing for 10 hours to 8 hours at Ura, the 0D 6M Then, dilute to 10 7 cells / ml, 10 6 cells / ml, 10 5 cells / ral, 10 4 cells / ml, and drop 5 ⁇ l of each on a SG / -Ura plate containing various drugs, and then for 60 hours For 240 hours.
  • Hikl was expressed under the control of the GALl promoter by introducing pYES2-HIK1
  • the pYES2-HIKl transformant did not show growth inhibition under the condition of suppression of GAL1 promoter expression (data not shown).
  • cycloheximide having a different structure from these three groups of drugs there was no difference in sensitivity between pYES2-HIK1 transformants and pYES2 transformants under expression-inducing conditions. .
  • the pYES2-HIK1 transformant is specifically sensitized to the three drugs only under the conditions that induce the expression of the GAL1 promoter, and this sensitivity is specifically induced by the introduced HIK1. It is thought that there is.
  • Table 2 H77 of rice blast fungus confer drug-sensitivity to budding yeast
  • Mutated HIK1 is a synthetic DNA for mutagenesis (HK-H736V: 5 '
  • Plasmid for expressing PYES2-hikl-H736V and D1153, which receives phosphate in the phosphate relay of the response regulator domain, by mutating this domain (Hikl-D1153E) pYES2-hikl-D1153E was created and similarly introduced into ATCC201388 strain (Fig. 6A). Unlike the strain into which pYES2-HIK1 has been introduced, the strain into which pYES2_hikl-H736V and the strain into which pYES2-hikl-D1153E have been introduced are all three types (J (25 ppm fludioxonil N 25 ppm iprodione, 50 ppm chloroneb; almost susceptible to 50 ppm chloroneb)!
  • Hikl in budding yeast The most likely explanation for the expression of Hikl in budding yeast to impart drug sensitivity is that the drug acts on Hikl and disrupts the signaling system leading to Hogl MAP kinase in budding yeast and grows. Cause inhibition.
  • pYES2-HIK1 was introduced into each mutant using hogl mutant, sskl mutant and stell mutant, which are mutants of this signaling element. Then, it was examined whether or not expression was induced to show drug sensitivity (FIG. 7A).
  • Plasmids pCLA-H0G1 and pCLA-SSK1 for complementation of yeast mutations were prepared by cloning H0G1 or SSK1 from ATCC201388 strain into the Hindlll site of pCLA, which was prepared by digesting pCLl (Clontech) with Hindlll and self-ligating. did.
  • H0G1 is amplified by 5 '-TTTAAGCTTATCGATTGAAGGAAATAAGAGGAATAGC-3' (sequence number 8) and 5, -TTTAAGCTTGGGTGAGACAGCTATTTAGCAAGTTC-3 '(Hai ⁇ [J No.
  • SSK1 is 5, - TTTAAGCTTCCCACTGCTGGATCGACCATTC - 3 5 (sequence number 10) and 5, -TTTAAGCTTTAGTTGCCAGTCAAGATTTCCC-3 '(SEQ ID NO: 11).
  • SSK1 is 5, - TTTAAGCTTCCCACTGCTGGATCGACCATTC - 3 5 (sequence number 10) and 5, -TTTAAGCTTTAGTTGCCAGTCAAGATTTCCC-3 '(SEQ ID NO: 11).
  • CytoTrap XR ibrary construction kit (tratagene) the interaction between proteins by the CytoTrap two-hybrid system was analyzed.
  • This system consists of a vector pSos for expressing one protein as a fusion protein with human Sos, a vector pMyr for expressing the other protein as a fusion protein with a myristin oxidation signal, and a Sos homolog Cdc25 in yeast. And a yeast strain cdc25H that contains a temperature-sensitive mutation in its gene.
  • human Sos moves to the membrane at the site of myristate modification, complements the yeast cdc25 mutation, and can grow at high temperatures (37 ° C) ( Figure 8A).
  • pMyr-HIK1 was constructed by cloning HIK1 cDNA into the Smal site of pMyr.
  • pSos-YPDl is derived from ATCC201388 strain digested with Smal and Xhol to pSos digested with Srfl and Sail
  • YPD1 is 5'-TTTCCCGGGATATGTCTACTATTCCCTCAGAAATC-3 '(SEQ ID NO: 12) and Amplify with 5'-TTTCTCGAGTTATAGGTTTGTGTTGTAATATTTAGAT-3 '(Torumi column number 13), SSK1 is 5, -TTTTCGCGGGATATGCTCAATTCTGCGTTACTGTGG-3, (SEQ ID NO: 14) and 5' -TTTCTCGAGTCACAATTCTATTTGAGTGGGCG-3 '(SEQ ID NO: 1) Amplified.
  • the absence of mutation in the amplified gene was confirmed by DNA sequencing.
  • the steps from the transformation of the yeast to the dropping of the transformed yeast were performed in the same manner as in the aforementioned drug sensitivity analysis. However, the culture up to the dropping was all performed at 25 ° C, and the culture was performed at 25 ° C and 37 ° C after the dropping.
  • Hikl interacts with Ypdl, a signaling factor upstream of yeast Hogl
  • the S. cerevisiae cdc25H strain used in this system cannot grow at high temperatures (37 ° C) due to the temperature-sensitive mutation of the CDC25 gene and cannot grow at high temperatures (37 ° C), and can grow at the permissive temperature of 25 ° C.
  • the target is expressed as a fusion protein with the myris phosphorylation signal
  • the prey is expressed as a fusion protein with human Sos (a homolog of yeast Cdc25). If there is an interaction between the target and the prey, the human phosphorylation signal translocates human Sos to the cell membrane, activating the Ras pathway and allowing the cdc25H strain to grow even at 37 ° C. The effect can be detected.
  • the prey was converted to Ypdl (expressed in pSos-YPDl) and Sskl (expressed in pSos-SSK1) to analyze whether the target rice blast Hikl (expressed in pMyr-HIKl) binds (Fig. 8B).
  • Ypdl Expressed in pSos-YPDl
  • Sskl Expressed in pSos-SSK1
  • Fig. 8B Fig. 8B
  • the permissible temperature of 25 ° C growth was observed in all combinations.
  • the combination of the positive control showing the interaction pSos-MAFB + pMyr-MAFB
  • the combination of the negative control showing no interaction pSos-Col + pMyr-MAFB
  • 3 7 ° C growth is a combination of Posit ive Control is observed, not observed growth in the combination of negatives Control, showed no problem in the experimental system.
  • the candidate of the pharmaceutical agent which specifically acts on a filamentous fungus can be obtained selectively using a filamentous fungus-specific enzyme as a target which was impossible by the conventional method. Furthermore, in the screening method and kit of the present invention, since yeast belonging to the same fungus and closely related to filamentous fungi is used for screening, drugs that act on yeast (cause side effects) are excluded at the same time as selection of drug candidates. It is possible to greatly reduce the development of pesticides and pharmaceuticals, which is an excellent effect.
  • the present invention can be used in the technical city field of agricultural chemical development and pharmaceutical development.

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Abstract

　本願発明は、農薬候補又は医薬候補の効率的なスクリーニング方法を提供することを課題としている。具体的には、農薬については、植物体を用いることなく、しかも、植物など他の生物に弊害を及ぼすことのない農薬候補化合物を、効率的にスクリーニングすることを課題としている。　本願発明者等は、糸状菌特異的酵素をコードする遺伝子発現ベクターで糸状菌と生物学的に近縁であるが当該酵素を有しない酵母を形質転換し、農薬候補試料をコントロール酵母（糸状菌特異的酵素を発現しない酵母）及び糸状菌特異的酵素発現形質転換体に適用し、コントロール酵母に副作用などの影響を与えず、糸状菌特異的酵素発現形質転換体のみに特異的に成長阻害又は殺菌作用を示す農薬候補試料を、農薬候補として選択するスクリーニング方法を開発することに成功し、本願発明を完成させた。　なお、本スクリーニング方法は、医薬候補のスクリーニングにも同様に用いることができる。

Description

糸状菌特異的抗菌剤のスクリーニング方法及びそのためのキット
技術分野
本願発明は、 糸状菌特異的抗菌剤、 例えば、 糸状菌特異的農薬又は抗糸状菌医 薬の新たなスク リーニング法に関する。 より具体的には、 本願発明は、 糸状菌特 異的酵素をターゲットとした薬剤をスクリーニングする方法に関する。
明 背景技術
従来からの、農薬として有用な物質の探索食を！目的として行われる試験としては、 実験室内での培地上で一次試験とすることが通常である。 培地上での標的病害菌 に対するこのような試験では、 標的病害菌に対して効果がある様々な薬剤が全て 引つかかってくる。 そのため、 非ターゲット生物に対しても殺菌性を示してしま う薬剤を拾ってしまう可能性が高い。
他方、 作物体の一部又は温室内での植木鉢を用いた病害防除試験は、 作物の育 成、 調製が欠かせず、 費用及び労力を要するところ、 現在新機能薬となる化合物 は、 供試化合物の 1万分の 1程度といわれており （非特許文献 1 ； )、 非常に'多数 の供試化合物の検査には、 不適切であった。
さらに、 このような方法では、 植物体、 人体への副作用などについては、 十分 検討できないものであった。
たとえば、 有機水銀剤は、 イネいもち病の重要な防除剤として使用されてきた が、 動物への毒性に鑑み、 使用が中断されている。
また、 農薬の植物毒性を簡便に調査する方法としては、 植物培養細胞を用いる 方法が提案されている （特許文献 1 ：特開平 5— 2 9 4 9 9 5 )。 さらに、 特許文 献 2 (特開平 9— 1 2 4 4 1 1 ) では、 いもち病害防除剤のためのファイアトレ キシンのスクリーニングを、試験試料をイネの葉先端に滴下施用後、 1週間後に、 葉を裁断し抽出してファイアトレキシンの生成の有無を H P L Cで確認する方法 が記載されている。 —方、 各種糸状菌病に有効な農薬と して知られているフエ二ルビロール phenylpyrroles、 ンカノレホ シィ ト dicarboximides、 杳跌炭ィ匕水素 aromatic hydrocarbonsの薬剤の作用点の解析から（非特許文献 2— 7 ： Pi llonel and Meyer : 1997 ; Zhang et al. , 1999； Fujimura et al. , 2000； Ochiai et al. ， 2001； Ochiai et al. , 2002； Oshima et al. , 2002)、 多くの糸状菌特異的農薬のターゲッ トが 糸状菌特異的ヒスチジンキナーゼ（ここでは 0s - 1フア ミ リーヒスチジンキナーゼ と呼ぶ） であることが解明されつつある。本願明細書中では 0s - 1フアミ リーヒス チジンキナーゼ (0s - lフアミリーとも表記する。 0s- lサブファミリ一とも表記 された。） は、 菌糸型生長を行う菌類 （糸状菌） 由来の、 ヒスチジンキナーゼドメ インとレスポンスレギュレータードメインを持つハイブリ ッ ド型ヒスチジンキナ ーゼであって、 ァカパン力ビのハイブリ ッド型ヒスチジンキナーゼ Os- 1 (配列番 号 17 ； Nik- 1 とも言う ；非特許文献 8： Alex et al. , 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93 : 3416-3421) に存在するお互いに相同性を示す 6つのアミノ酸リピート
(アミノ酸リピート 1 (17卜 260, 90 aa)、 アミノ酸リピート 2 (261-352， 92 aa)、 アミノ酸リピート 3 (353-444, 92 aa) N アミノ酸リピート 4 (445-536, 92 aa)、 アミノ酸リ ピート 5 (537-628, 92 aa)、 アミノ酸リ ピート 6 (629-700, 72 aa) ) を含む領域の全長と 50%以上の相同性を示す領域を有するものを意味する。 医薬のスクリ一二ングについても同様の問題が存在している。
特許文献 1 特開平 5— 2 9 4 9 9 5
特許文献 2 特開平 9— 1 2 4 4 1 1
非特許文献 1 植物病理学事典 養賢堂 1 9 9 5年 3月 3 0日、 P. 7 8 3 - 7 8 4
非特許文献 2 Pillonel, C. , and Meyer, T. 1997. Effect of phenylpyrroles on glycerol accumulation and protein kinase activi ty of Neurospora crassa. Pestic. Sci. 49： 229-236
非特許文献 3 Ochiai, N. , Fujimura, M. , Oshima, M. , Motoyama, T. ,
Ichi i shi, A. , Yamada - Okabe, H. and Yaraaguchi, I. 2002. Effects of iprodione and I丄 udioxoni l on glycerol synthesis and hyphal development in Candida albicans. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66.: 2209-2215.
非特許文献 4 Zhang, Y.， Lamm, R.， Pillonel, C.， Xu, J. -R. , and Lam, S. 1999. The hyper-osmotic stress response pathway of Neu ospora crassais the target of phenylpyrrole fungicides. Proc. 20th Fungal Genetics Conference, Asi lomar, USA, p. 72
非特言午文献 5 Fujimura, M. , Ochiai, N. , Ichi ishi, A. , Usami, R.， Horikoshi, K. , and Yamaguchi, I. 2000. Sensitivity to phenylpyrrole fungicides and abnormal glycerol accumulation in os and cut mutant strains of Neurospora crassa. J. Pestic. Sci. 25 : 31 - 3り
非特百千文献 6 Ochiai, N.， Fujimura, M. , Motoyama, T. , Ichi ishi, A.， Usami, R.， Horikosni, K. , and Yamaguchi, 丄. 2001. Characterization of mutations in the two-component histidine kinase gene that confer f ludioxoni l resistance and osmotic sensitivity in the os_l mutants of Neurospora crassa. Pest Manag. Sci. 57 : 437 - 442.
非特許文献 7 Oshima, M. , Fujimura, M. , Banno, S. , Hashimoto, C. , Motoyama, T.， Ichiishi, A.， and Yamagucni, I. 2002. A point mutation in the two-component histidine kinase BeOS - 1 gene confers dicarboximide resistance in field isolates of Botrytis cinerea. Phytopathology, 92, 75—80.
非特許文献 8 Alex et al.， 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93： 3416-3421
発明の開示 ·
本願発明は、 農薬候補又は医薬候補の効率的なスクリーニング方法を提供する ことを課題としている。具体的には、農薬については、植物体を用いることなく、 しかも、 植物など他の生物に弊害を及ぼすことのない農薬侯補化合物を、 効率的 にスクリーニングすることを課題としている。
本願発明者等は、 植物病害を起こす病害菌に特異的に作用する農薬をスクリー ングする方法を鋭意研究した結果、 植物病害菌にのみ存在する酵素又は該酵素 が関与する情報伝達経路を標的とする農薬候補をスク リーニングすることで、 植 物病害菌を特異的に抑え、他の生物に影響をしない、農薬を探査できると考えた。 そこで、 糸状菌防除を例とし、 糸状菌にのみ存在する酵素又は酵素を介する情 報伝達系を利用できないか検討した。 上述したように、 糸状菌を防除するための 農薬である三種のグループ （フエ-ルビロール phenylpyrroles、 ジカルボキシィ ミ ド dicarboximides、 芳香 ¾¾灰ィ匕水素 aromatic hydrocarbons) (図 1) の薬剤の 作用点の解析から、 フエ二ルビロールに属するフノレジオキソニルをはじめとする 多くの糸状菌特異的農薬のターゲットが糸状菌特異的ヒスチジンキナーゼ （0s - 1ファミリー） を介した情報伝達系であることが明らかになりつつある。 本発明 者らは、 まず、 この情報伝達系を利用し、 農薬候ネ甫スクリーニング方法及ぴキッ トを開発した。
具体的には、 本願発明者等は、 これら糸状菌特異的酵素をコードす.る遺伝子発 現べクタ一で糸状菌と生物学的に近縁であるが当該酵素を有しな 、酵母を形質転 換し、 農薬候補試料をコントロール酵母 （糸状菌特異的酵素を発現しない酵母） 及ぴ糸状菌特異的酵素発現形質転換体に適用し、 コントロール酵母に副作用など の影響を与えず、 糸状菌特異的酵素発現形質転換体のみに特異的に成長阻害又は 殺菌作用を示す農薬候補試料を、 農薬候補として選択するスクリーニング方法を 開発することに成功し、 本願発明を完成させたものである。
なお、 本スクリーニング方法 、 医薬候補のスクリーニングにも同様に用いる ことができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004- 061273号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 糸状菌を標的とした三種のグループの薬剤：薬剤の構造と、 その薬剤 が病原糸状菌防除に用いられる生物を示す。
図 2は、 バタテリァ及ぴ真核生物のヒスチジンキナーゼの概念図。
図 3は、 0s- 1フアミリ一のヒスチジンキナーゼ及ぴ出芽酵母のヒスチジンキナ ーゼの概念図。
図 4は、 糸状菌と出芽酵母の情報伝達系の比較 出芽酵母とァカパンカビで 共通と推定される部分を網掛けした。 ァカパン力ビのタンパク質で括弧に入って いるのは酵母のタンパク質と相同性はあるが相補性が確認されていないものであ る。
図 5は、イネいもち病菌の HIK1を導入した出芽酵母の薬剤感受性試験結果： A. HIK1 を GAL1プロモーターの制御下で発現させることができるプラスミ ドを酵母 に導入して、 発現誘導条件で各種薬剤への感受^ ¾をみた。 ： B. 各種薬剤を含む 90mm径プレート上に、 プレートの上段には pYES2 - HIK1を導入した酵母細胞懸濁 液、 下段には PYES2を導入した酵母細胞 （コントロール）、 それぞれを 9删間隔で (左から 107、 106、 105、 104 /ml) 5μ1ずつ滴下後 30° Cで 60時間培養した。 左 プレー卜より、プレー卜ごとに、 S G培地のみ、 Fludioxoni l, Iprodine, Chloroneb, 又は Cycloheximideが添加されている。 薬剤濃度は、 Fludioxonil, Iprodine, 及 び Chloronebについては、最上段のプレートが 5ppm、 2段目のプレートが 25ppm, 更に、 Iprodine及び Chloroneb については、 3段目が 50ppm、 4段目が lOOppm である。 Cycloheximideについては、 0. 25ppmで、 2 4 0時間培養した。
図 6は、 HIK1による薬剤感受性とヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレ ギュレータードメィンの有無： A. ヒスチジンキナーゼドメィンが機能しない Hikl- H736V あるいはレスポンス レギュ レーター ドメ ィ ンが機能しない Hikl - D1153Eを発現する酵母を作成した。 ： B. 各種薬剤を含む 90舰径プレート 上に、 最上段には pYES2を導入した酵母細胞懸濁液、 上から 2段目には pYES2— HIK1 を導入した酵母細胞懸濁液、 上から 3段目には pYES2-hikl-H736Vを導入し た酵母細胞懸濁液、 最下段には pYES2- hikl- D1153Eを導入した酵母細胞懸濁液そ れぞれを 9mm間隔で （左から 107、 106、 105、 104 /ml) 5μ1ずつ滴下後 30° Cで 72 時間培養した。 なお、 各プレートには、 左のプレートから順に、 S G培地のみ、 25ppm Fludioxonil, 25ppm Iprodiones 50ppm Chloroneb, 又は 0. 5M NaClとなる ように薬剤が含有されている。
図 7は、 HIK1による薬剤感受性と SSK1 と H0G1の有無： A. sskl変異株と hogl 変異株では HIK1を導入しても薬剤感受性を示さない。 各種薬剤を含む 90mm径プ レート上に、 上段から、 順に、 （最上段） コントロール酵母に pYES2— HIK1を導入 した細胞懸濁液、（ 2段目） hogl変異株に pYES2— HIK1を導入した細胞懸濁液、 ( 3 段目） sskl変異株に pYES2— HIK1を導入した細胞懸濁液、 （4段目） stel l変異株 に pYES2— HIKlを導入した細胞懸濁液、 （ 5段目） コント口ール酵母に pYES2を導 入した細胞懸濁液、（6段目） hogl変異株に pYES2— HIK1 を導入した細胞懸濁液、
( 7段目） sskl変異株に pYES2— HIK1を導入した細胞懸濁液、又は（最下段） stel l 変異株に pYES2— HIK1を導入した細胞懸濁液それぞれを 9mm間隔で（左から 107、 106、 105、 lOVml) 5μ1ずつ滴下後 30° Cで 60時間 （NaClのみ 9 6時間） 培養し た。 なお、 左のプレートから順に、 各プレートには、 S G培地のみ、 25ppm Fludioxonil、 25ppm Iprodione 50ppm Chloroneb、 又は 0. 5M NaCl と るよつに 薬剤が含有されている。 ： B. sskl変異株と hogl変異株にそれぞれ SSK1と H0G1 を導入すると HIK1存在下で薬剤感受性を示すようになった。各種薬剤を含む 90mm 径プレート上に、 上段から順に、 （最上段） hogl変異株に pCL A - H0G1及び pYES2 -HIK1 を導入した細胞懸濁液、 （2段目） hogl変異株に pCL A及ぴ pYES2— HIK1 を導入した細胞懸濁液、 （ 3段目） sskl変異株に pCLA- SSK1及ぴ pYES2— HIK1を 導入した細胞懸濁液、 又は （最下段） sskl変異株に pCLA及び pYES2— HIK1 を導 入した細胞懸濁液それぞれを 9mm間隔で （左から 107、 106、 105、 104 /ml) 5μ1滴 下後 30° Cで 60時間 （NaClのみ 9 6時間） 培養した。 なお、 左のプレートから J噴に、 各プレートには、 S G培地のみ、 25ppm Fludioxoni l、 25ppm Iprodione, 50ppm Chloroneb, 又は 0. 5M NaClとなるように薬剤が含有されている。
図 8は、イネいもち病菌の Hiklと出芽酵母の Ypdlとの相互作用 CytoTrap two - hybrid systemの概要。 ターゲットと餌（bait)の間で相互作用があると hSos が細胞膜に移行し Rasを活性化して、 cdc25H株が 37° Cでも生育できるようにな る。 ここでは、餌の Ypdlあるいは Ssklにターゲットの Hiklが 「食いつくかどう か」 をみた。 B. Hikl と Ypdlの相互作用。 細胞懸濁液 （左から 107、 106、 105、 104 /ml) を 5μ1滴下後それぞれの温度で 5 日間培養した。 発明を実施するための最良の形態
本願発明は、 植物又は動物に病害を起こす病原糸状菌-に特異的な酵素をコード する遺伝子発現ベクターで当該病害菌と生物学的に近縁であるが当該酵素を有し ない他の微生物等の生物を形質転換し、 農薬又は医薬の候補試料をコントロール 微生物 （同じ宿主由来で糸状菌特異的酵素を発現しないものなど） 及び糸状菌特 異的酵素発現形質転換体に適用し、 コントロール微生物に副作用等の影響を与え ず、 糸状菌特異的酵素発現形質転換体のみに特異的に成長阻害又は殺菌作用を示 す農薬候補又は医薬候捕を選択するスクリ一二ング方 ¾及びそのための形質転換 体並びにそのためのキットを包含する。
本願発明が対象とする病害菌には、 糸状菌、 例えば、 植物病について言えばィ ネいもち病菌が、ヒ トなどの動物病について言えば、カンジダ、ァスペルギルス、 水虫菌 （白癬菌） 等が包含される。 糸状菌病害菌特異的酵素としては、 糸状菌特 異的ヒスチジンキナーゼ （Os- 1ファミリー） が包含される。 又、 糸状菌を対象と する農薬又は医薬をスクリ一二ングする場合に置いては、 糸状菌特異的酵素遺伝 子を導入する宿主微生物としては、 酵母、 好適には出芽酵母 （Saccharomyces cerevi siae) を挙げ、ることができる。
さらに具体的には、 本願発明には、 糸状菌由来の糸状菌特異的ヒスチジンキナ ーゼ遺伝子を発現する酵母 （発現酵母） と発現しない醇母 （非発現酵母） の組み 合わせからなるキット、 及び当該キットを用いる農薬候補スクリーニング方法が 包含される。
[病害菌特異的薬剤とその標的酵素、 植物病害を例と して]
現在までに、植物病害菌特異的農薬として、糸状菌特異的農薬が知られている。 糸状菌特異的農薬としては、 フエ-ルビロール（phenylpyrroles)としてフルジォ キソニノレ (Fludioxoni l) 及ぴフェンピクロニル (Fenpi cloni l) が、 ジカノレボキ シイミ ド (dicarboximides) としてィプロジオン（iprodi one)及びビンクロゾリン (vinclozol in)力 並びに芳香族炭化水素（aromatic hydrocarbons)としてはクロ 口ネブ（Chloroneb)及び P C N Bが知られている。
最近の研究により、 上記した多くの糸状菌特異的農薬のターゲットが糸状菌特 異的ヒスチジンキナーゼであることが、 例えば、 上記 !≡特許文献 2〜 7により解 明されてきている。
[ヒスチジンキナーゼ及ぴその情報伝達系]
細胞内情報伝達には、シグナル蛋白質のセリン、スレ才ニン、ァスパラギン酸、 ヒスチジン及びチロシンの修飾を含む可逆的なリン酸ィ匕が関与している。 ヒスチ ジンキナーゼは、 バクテリアから酵母、 糸状菌、 植物に存在する情報伝達因子の 1つである。
原核生物では、 基本的な情報伝達因子として自己リン酸化ヒスチジンキナーゼ 及ぴそこからリン酸を受け取り下流に情報を伝えるレスポンスレギュレーターの 二つの成分からなり 2成分情報伝達システムである。
真核生物のヒスチジンキナーゼは、 ほとんどヒスチジンキナーゼドメインとレ スポンスレギュレータードメィンをともに持つハイブリッド型ヒスチジンキナー ゼである (図 2) (Ota, I. Μ·， and Varshavsky, A. 1993. Sci ence 262： 566—569.； Urao et al. 1999. Plant Cell 11 : 1743-1754. ,； Pott et al.， 2000 Fungal Genet. Biol. 31 : 55-67.； Virginia et al. , 2000 Curr. Genet. 37： 364-372.； West and Stock, 2001 Trends Biochem. Sci. 26： 369 - 376. )。
真核生物型のヒスチジンキナーゼを介する情報伝達系は、 ハイプリ ッ ド型ヒス チジンキナーゼ、 含ヒスチジンリン酸転移タンパク質及びレスポンスレギュレー ターの三成分からなる。
ところでハイブリッ ド型ヒスチジンキナーゼの一つでァパカンカビから見出さ れた 0s- 1は N-末端側に 92アミノ酸から 72ァミノ酸のお互!/ヽに相同性を持つ繰 り返し配列を 6つ持つという特徴を持つ （図 3) (Alex et al . , 1996； Schumacher et al . , 1997)。 このような特徴を持つハイブリッド型ヒスチジンキナーゼ (Os- 1ファミ リー） はイネいもち病菌 （Pyricularia oryzae：？ έ全世代名 Magnaporthe grisea) や Aspergi l lus ni dulans等の菌糸型生長を示す菌類 （糸状菌） からしか 見つ力 つてレヽな Vヽ （Alex et al. , 1996 Proc. Natl . Acad. Sci. U S A 93 : 3416-3421.； Schumacher et al .， 1997 Curr. Mi crobiol. 34： 340-347.； Alex et al. , 1998 Proc. Natl . Acad. Sci . USA 95： 7069-7073. ; Nagahashi et al. , 1998 Microbiology 144： 425-432. )。
[糸状菌特異的薬剤感受性酵母の調製]
0s- 1ファミ リ一は、 糸状菌でしか見つかっておらず、 しかも、 Os - 1 ファミ リー が糸状菌特異的薬剤の対象酵素であると考えられている。 他方、 糸状菌と同じく 真核微生物である酵母においては、 生物学的に近縁であるにもかかわらず、 Os -
1ファミ リ一は存在しない。 例えば、 S. cerevi s iae においては全ゲノム配列が 決定されているが、 ヒスチジンキナーゼは一つしか存在せず、 Os- 1フアミリーの ものとは異なる特徴を持つもの （Slnl， 図 3参照） である （Slnlは、 N末端側の 6つのアミノ酸リ ピートを持たず、 2つの膜貫通領域を持つ）。 しかしながら、 興 味深いことに、 糸状菌の Os- 1ファミリーの情報伝達系の下流因子は、 出芽酵母 Saccharomyces cerevisiaeで 多 カ共通してレヽる (図 4) (Maeda et al. , 1995 Science 269 : 554-558； Posas et al.， 1996 Cel l 86 : 865-875. ； Fuj i匿 a et al. , 2003 Biosci . Biotechnol. Biochem. 67： 186 - 191 (2003) . )。
そこで、 0s- 1 フアミリーに属するタンパク質の遺伝子を 0s- 1 フアミ リータン パク質の遺伝子を有しない酵母に導入して、 糸状菌特異的薬剤感受性酵母を調製 した。
Os-1 フアミリーヒスチジンキナーゼとしては、菌糸型生長をする菌類（糸状菌） 由来の、 ヒスチジンキナーゼドメインと、 レスポンスレギュレータードメインを 持つハイブリッ ド型ヒスチジンキナーゼであって、 ァカパンカビのハイプリッ ド 型ヒスチジンキナーゼ 0s- 1 (配列番号 17) に存在するお互いに相同性を示す 6 つのアミノ酸リピート （アミノ酸リピート 1 (171 - 260, 90 aa) , アミノ酸リピー ト 2 (261-352, 92 aa)、 アミノ酸リピート 3 (353—444， 92 aa)、 アミノ酸リピー ト 4 (445-536, 92 aa) , アミノ酸リピート 5 (537-628， 92 aa)、 アミノ酸リビー ト 6 (629-700, 72 aa) ) を含む領域の全長と 50ヅ0以上の相同性を示す領域を有す るものがあげられる。
具体的には、 Os-1ファミリーに属するタンパク質としては、 例えば、 イネいも ち病菌の 0s- 1 フア ミ リーヒスチジンキナーゼ Hikl ( DDBJ/EMBL/GenBank accession number AB041647 - 1)、 ァカパンカビの 0s- 1 フアミ リーヒスチジンキ ナーゼ Nik-l/Os-1 (Proc. Natl. Acd. Sci. vol. 93， pp. 3416 - 3421、 accession number
U50263 - 1)、 Gibberella moni liformis <) Nikl (accession number AY456038 - 1)、
Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) の Bosl (Phytpathology, 92, 75 - 80、 accession number AF435%4 - 1)、 Nectria haematococcaの Fik (accession number
U61838 - 1 )、 Emericella nidulans (Aspergillus ni dulans) の Hk4 (accession number AY282750 - 1)、 Cochl iobolus heterostrophusの Bmhkl (accession number
AB095748-1) . Alternaria brassicicolaの AbNIKlp (accession number AY700092 - 1)、 カンジダ酵母 Candida albicans の CaNIKl (a ccession number AB006363 - 1)、 Yarrowia lipolyti caの CaNIKl類似タンパク質（accession number CR382131- 129) Cryptococcus neoformans の 疋 ヒ スチン zキナーセ 、 accession number AE017343-338) を挙げることができる。
さらに、 これら Os- 1ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子のコードするアミ ノ酸配列で表されるぺプチド又は該ァミノ酸配列に対して、 いくつかのァミノ酸 が欠失、 置換、 及びノ又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであって ヒスチジンキナーゼ活性 （ヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレー タードメインが機能している） を有するポリべプチドをコ一ドする遺伝子も含め ることができる。 ここで、 いくつかのアミノ酸とは、 1 から 200アミノ酸、 好適 には、 1から 100アミノ酸、 さらに好適には、 1力 ら 50アミノ酸、 より好適には、 1から 20アミノ酸、 さらに好適には 1から 9アミノ酸を意味する。
また、 これら Os- 1ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子は、 上記した os- 1フ アミリー遺伝子に対して、 通常のデフォルト条件で比較し、 80%以上の相同性、 好適には、 85%以上の相同性、 さらに好適には、 9 0 %の相同性、 より好適には、 95%以上の相同性を有するヒスチジンキナーゼ活性 （ヒスチジンキナーゼドメィ ンとレスポンスレギュレータードメインが機能している） を有するポリぺプチド をコードする遺伝子も含めることができる。
好適には、 イネいもち病菌由来の HIK1及び配歹 U番号 16で示されるアミノ酸配 列で表されるペプチド又は配列番号 1 6 で示されるアミノ酸配列に対して、 1乃 至数個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び/又は付カロされたアミノ酸配列で表される ぺプチドであってヒスチジンキナーゼ活性 (ヒスチジンキナーゼドメインとレス ポンスレギュレータードメインが機能している） を有するポリべプチドをコ一ド する遺伝子を挙げることができる。
これら 0s - 1フアミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝子を導入する生物体としては、 微生物、 植物培養細胞が挙げられ、 好適には、 0s— 1の下流の情報伝達系 （含ヒス チ ジ ン リ ン酸転移 タ ン パ ク 質 、 レ ス ポ ン ス レ ギ ュ レ ー タ ー 、
MAPKKK, MAPKK, MAPkinaseからなる情報伝達系） を備えた生物体が望ましい。 具体 的には、 含ヒスチジンリン酸転移タンパク質として Ypdl、 レスポンスレギュレー ターとして Sskl、 MAP kinaseとして Hoglを内生的に有する微生物、 好適には酵 母、 特に好適には出芽酵母、 サッカロミセス属に属する微生物を挙げることがで さる。
Os- lフアミリーに属する遺伝子、 例えば H1K1は、 該遺伝子を導入する対象生 物における、 周知の発現ベクターに組み換えて、 当該対象生物に導入することが できる。 例えば、 酵母に導入するのであれば、 pYES2、 pYEp51、 YEp62、 pBM150、 pLGDSD5、 pAM82、 pYE4、 pAAh5、 pMA56、 pAH9/10/21、 pMA230、 pMA91、 pG-1/2 等 を用いることができる。
組み換えベクターの宿主生物 （対象生物） への導入方法としては周知の手段を 用いることができるが、 例えば、 酵母の形質転換は酢酸リチウム法 （Ito et al. , 1983 J Bacteriol. 153： 163-168. ) を用いること力 Sできる。
[スクリ一ユング方法及びそのためのキット]
[ I ] 本発明の農薬候補又は医薬候補化合物スクリーング用キットとしては、
( 1 ) 0s- 1フアミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子などの糸状菌特異的遺伝子発現 ベクターで酵母などの宿主生物を形質転換して調製された形質転換体おょぴ同じ 宿主で糸状菌特異的遺伝子を発現しないコントロール生物を含むキット、 好適には、
( 2 ) ( 1 ) 0s - 1フアミリーヒスチジンキナーゼ遣伝子発現ベクターで酵母を形 質転換して調製された形質転換体および宿主酵母をべクターのみで形質転換して 作成したコントロール酵母を含むキットが挙げら; る。
上記キットには、 更に、 以下で説明するスクリーニングに用いる計測用試薬な どを含めることができる。
[II] 本発明の農薬候補又は医薬候補化合物スク リーング方法は、
( 1 ) Os- 1 フアミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝子などの糸状菌特異的遺伝子発現 ベクターで酵母などの宿主生物を形質転換して調製された形質転換体おょぴ同じ 宿主で糸状菌特異的遺伝子を発現しないコントロール生物に農薬候補試料又は医 薬候補試料を投与する工程
( 2 ) 農薬候補試料又は医薬候補試料を投与された上記糸状菌特異的遺伝子発現 形質転換体及びコントロール生物を一定時間培養する工程、 及ぴ
( 3 ) 一定時間培養後、 糸状菌特異的遺伝子発現形質転換体及びコントロール生 物の生存量 （又は生存細胞数） を計測する工程を含んでいる。
好適には、
( 1 ) 0s- lフアミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで酵母を形質転換 して調製された形質転換体および宿主生物をべクタ一のみで形質転換して作成し たコントロール酵母に農薬候補試料を投与する工程
( 2 ) 農薬候補試料を投与された上記 Os- 1ファミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝 子発現形質転換体及びコントロール酵母を一定時間培養する工程、 及ぴ
( 3 )一定時間培養後、 0s- 1フアミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換 体及びコントロール酵母の増殖（又は生存細胞数）を計測する工程を含んでいる。 以下具体的には、 酵母を形質転換して用いる場合を例示して説明するが、 他の 微生物又は生物体であっても同様にスクリ一二ングなし得る。
0s- 1 フアミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換酵母とコントロール 酵母の増殖又は生存細胞数は、 例えば、 目視ゃ、 0D6。。を測定することにより計測 することもできるが、 これ以外にも、 酵母の酸素消費量を計測、 培地中の糖濃度 減少を計測する、 蛍光又は発色酵素などの標識により酵母特異的標識抗体、 又は ビォチン等ラベルされた酵母特異的抗体を用いて計測する等、 周知の適宜の方法 で計測することができる。
( i ) プレート法
0s- 1 フアミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで形質転換した形質 転換体とコントロール酵母を適当な細胞数、 例えば、 107細胞/ ml、 106細胞/ ml、 105細胞/ ηύ、及び 104細胞 1となるように希釈し、 1定量の農薬候補試料を含む プレート （例えば、 90誦プレート） に、 同じ量の細胞含有溶液 （例えば、 5 μリ ッ トル） を滴下し、 適宜な時間、 例えば、 5時間以上、 3 0 0時間以下、 好適に は、 48から 72時間、 培養温度は 25° C-37° C、 好適には、 3 0 °Cで培養し、 プレ 一トにおける Os- lフアミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換酵母とコ ントロール酵母の増殖状況を目視により確認し、 コントロール酵母と 0s- 1ファ ミリ一ヒスチジンキナーゼ遺伝子努現形質転換体で増殖状況 （生存数） が異なつ た農薬候捕試料又は医薬候補試料を、 農薬候補又は医薬候補として選抜する。 (i i) 液体培養法 0s- 1 フアミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで形質転換した形質 転換体とコントロール酵母をそれぞれ、 8 時間から 10 時間培養した後に、 0D6。。 を測定する。次に、 1定量の農薬候補試料又は医薬候補試料を含む培地に例えば、 OD600= 0. 01 になるように加える。 適温、 例えば、 27° C で培養、 好適には、 振と う培養し、 160 rpm で旋回振とうし、 適宜の時間後から、 一定時間間隔、 好適に はコントロール酵母の倍加時間の +一 5 0 %時間の範囲内の一定時間間隔で 0D6。。を計測する。コントロール酵母として A T C C 2 0 1 3 8 8にベクター pYES2 を形質転換したものを用いた場合には、 例えば、 3時間間隔で 0D6Q。を計測する。 この計測から、増殖曲線を作り、倍化時間を計算する。コントロール酵母に対し、 Os- 1 ファミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換体で倍加時間に 2 0 % 以上、 好適には 5 0 %以上、 更に好適には 1 0 0以上の倍力 [I時間の増加した農薬 候補試料又は医薬候補試料を、 農薬候補又は医薬候補として選抜する。
更に、 次のような方法を採用することもできる。
(i i i) .それぞれの酵母をプレーティングしたプレート上でペーパーディスク.に しみこませて薬剤を投与し、 30° C 程度で静置培養し、 目視等により生育阻止部 分を評価する。
なお、従来より fludioxonil と iprodioneについては、ァカノヽ。ンカビ（Ochiai et al. , 2001. Pest Manag Sci. 57 : 437-442. ) とイネいもち病菌以外にも、 カンジ ダ SEの炳原囷 Candida albicans (Ochiai et al . , 2002. Biosci . Biotechnol. Biochem. 66： 2209-2215. ) . Alternaria alternata (Dry et al.， 2004. Fungal Genet Biol. 41：102-108. ) においては 0s- 1フアミリーヒスチジンキラ "一ゼがターグ ットであることが示唆されている。 同様に、 ある糸状菌由 5feの 0s - 1ファミリー ヒスチジンキナーゼを標的として上記方法でスクリーニングされた農薬候補又は 医薬候補は、通常、 0s- 1フアミリーヒスチジンキナーゼを有する他の糸状菌に対 しても、 農薬又は医薬候捕として検討対象とすることができる。
材料
使用した酵母菌株とプラスミ ドを以下の表 1に示す。
表 1 菌株とプラスミド
genotype ongm
S. cerevisiae strain
ATCC201388 ΜΑΤΆ MS3M Μ2Δ0 metl5A0 uraJAO ATCC*
ATCC O02724 hogJL ofATCC201388 ATCC
ATCC4001561 Δοί'ΑΤ(Χ20】388 ATCC
ATCC4005271 .rfi-HAof ATCC201388 ATCC
ATCC4000993 5//2AofATCC201388 ATCC cdc25H MAla ade2-J01 his3-200 ku2-3112 lys2-801 trpl-901 Stralagene ura3-52 cdc25-2 Gal* plasmid
pYES2 . 2μιη URA3 Invitrogen pYES2-HIKl H1K1 in pYES2 this study pYES2-hikl.-H736V /7»i-H736Fin YES2 this study pYES2-hikl-D'1153E i-£>775J£inpYES2 this study pCLA CENLEU2 this study pCLA-SSKl SSK1 in pCLA this study pCLA-HOGl HOG1 in pCLA this study pSos 2μηι LEU2 Stratagene pSos-SS l SSK1 in pSos this study pSos-YPDl YPD1 in pSos •this study pMyr 2μιη URA3 Stratagene pMyr-HIKl H1K1 in pMyr ' this study
* ATCC, American type culture collection 薬剤は和光純薬から入手した。 培地成分は特に断らない限り Difcoから購入し たものを用いた。 なお、遺伝子操作は一般的方法を用いた（Sambrook et al.， 1989
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed. , し old Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ΝΥ·)。 酵母の培養は特に断らない限り
30° Cで行った。 完全培地は YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) を用い、 最小培地は選択に必要な栄養源を抜いた SD (0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids 2% glucose、 IX dropout so丄 ution(Clontech) )あ όレヽ^： SG (0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids、 2% galactose 1% raff inose IX dropout solution (Clontech)) を用いた。 プレートを作る場合は 2%になるように寒天を 加えた。 イネいもち病菌 P- 2株の cDNAは以前報告した (Motoyama et al. , 1998 Biosci. Biotech. Biochem. 62 : 564-566. ) のと同様にして作成した。
[実施例 1 ] 酵母での糸状菌のヒスチジンキナーゼの発現と解析
( 1 ) イネいもち病菌の 0s- 1フアミ リ一ヒスチジンキナーゼ遺伝子 HIK1 (DDBJ/EMBL/GenBank accession number AB041647；酉己歹 IJ番号 1 ) の cDNAを酵母 用発現ベクター PYES2の BamHI部位に揷入し、 pYES2- HIK1を得た。 pYES2- HIK1は GALl promoterの制御下で Hiklの全長をタグなしで突現できる。 GALl promoter の発現抑制条件での培養はゥラシルを抜いたグルコースを炭素源とした合成培地 (SD/- Ura)、 発現誘導条件での培養はゥラシルを抜いたガラク トースを炭素源と した合成培地（SG/- Ura)で行つた。酵母の形質転換は 乍酸リチウム法（Ito et al. , 1983 ibid) を用いた。
薬剤感受性は、 プレート上での培養と液体培養によ り解析した。 プレートでの 培養の場合、 5ml SD/ - Uraで一晚前培養し、 集菌し、 10ml SG/ - Uraで洗浄し、 10ml SG/- Uraで 8時間から 10時間培養した後に、 0D6Mを测定し、 107細胞/ ml、 106細 胞 /ml、 105細胞/ ral、 104細胞/ ml に希釈し、 各種薬剤を加えた SG/- Ura プレート 上に 5μ1ずつ滴下し、 60時間から 240時間培養した。液体培養の場合、 5 ml SD/- Ura でー晚前培養し、 集菌し、 10 ml SG/ - Uraで洗浄し、 10 ml SG/ - Uraで 8時間から 10時間培養した後に、 0D6。。を測定し、 各種薬剤を含む SG/-Uraが 50 ml 入った 300 ml 三角フラスコに OD6。。=0. 01になるように加え广こ。 27° C 160 rpmで旋回振 とうし、 12、 15、 18、 21、 24、 33、 36、 39時間後にサンプリングし、 0D6。。を測定 し、 増殖曲線を作り、 倍化時間を計算した。
(結果)
0s- 1フアミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子 HIK1の酵母での発現による薬剤感受 性の付与
ゲノム中に 0s - 1ファミリ一のヒスチジンキナーゼを持たない出芽酵母 S. cerevisiae に、 ィネいもち病菌由来の 0s - 1 フアミ リーのヒスチジンキナーゼ
Hiklを pYES2 - HIK1を導入することにより GALl promoterの制御下で発現させた
(図 5 A)。 GALl promoterの発現誘導条件で、 薬剤非存在下では pYES2- HIK1形質 転換体は pYES2形質転換体と同様の生育を示したが、 本来感受性を示さない糸状 菌特異的農薬 （フルジォキソニル、 ィプロジオン、 クロロネブ、 図 1参照） の存 在下では、 pYES2- HIK1形質転換体のみが生育阻害を示した （図 5B)。 フルジォキ ソ-ルに対する効果は 5ppmで飽和し、ィプロジオンに対する効果は 25ppmで飽和 し、 クロロネブに対する効果は 50ppraで飽和した。 また、 pYES2-HIKl形質転換体 でも GAL1 promoterの発現抑制条件下では生育阻害を示さなかった （データ示さ ず）。 なお、 このような三種のグループの薬剤とは構造の違うシクロへキシミ ドに 対しては pYES2- HIK1形質転換体と pYES2形質転換体の間で発現誘導条件でも感受 性の差は認められなかった。 以上のように、 pYES2- HIK1 形質転換体で GAL1 promoterの発現誘導条件でのみ特異的に、 3種の薬剤に対する感受性が付与され ることから、この感受性は導入した HIK1によって特異的に引き起こされていると 考えられる。
同様の実験を液体培養で行った場合（表 2)、 pYES2形質転換体の GAL1 promoter 発現誘導条件では薬剤の有無（0、 25ppmフルジォキソ二/レ、 25ppmィプロジオン、 25ppmクロロネブ） にかかわらず同様の生育速度を示し、 倍化時間は 2. 2時間前 後になった。 pYES2- HIK1形質転換体では、 薬剤の影響を受け、 薬剤非存在下では 倍化時間が 2. 19時間で pYES2形質転換体の場合とほとんど変わらなかったが、 25ppm フルジォキソニル存在下では 4. 25 時間、 25ppm ィプロジオン存在下では 3. 12時間、 25ppmクロロネブ存在下では 2. 90時間、 と明らかに生育速度の低下が 言忍められた。
表 2
表 2 イネいもち病菌の H7 7は出芽酵母に薬剤感受†生を付与する
yeast strain reagent doubling time*
ATCC201388 [pYES2] - 2.17士 0.05
ATCC201388 [pYES2] 25ppm Fludioxonil 2.25 ± 0.06
ATCC201388 [pYES2] 25ppm Iprodione 2.12 ±0·06
ATCC201388 [pYES2] 25ppm Chloroneb 2·17± 0.08
ATCC201388 [pYES2-HIKl] - 2.19 ± 0.06
ATCC201388 [pYES2-HIKl] 25ppm Fludioxonil 4.25 + 0.20
ATCC201388 [pYES2-HIKl] 25ppm Iprodione 3.12 ± 0.10
ATCC201388 [pYES2-HIKl] 25ppm Chloroneb 2·90 ±0.11
* average士 standard deviation
( 2 ) 変異導入した HIK1 は変異導入用合成 DNA ( HK-H736V : 5 '
-CCTCGCTAACATGTCCGTCGAAATCCGCACACC-3 ' (酉 S歹 U番号 2 ) , HK- D1153E : 5 '
-GATGTGATCCTGATGGAGGTTCAAATGCCTGTCATG-3 , (酉己歹 ll番号 3 ) ) を使用 し、
Mutan- Express Km kit (宝酒造） により作成した。 それぞれの変異導入 HIK1 を
PYES2 の BamHI 部位にクローニングすることによ り、 pYES2- hikl - H736V と pYES2-hikl-D1153Eを作成した。
(結果） Hiklによる薬剤感受性の付与にヒスチジンキナーゼの機能に必要とさ れるドメィンが関わっているかどうかをみるため、 ヒスチジンキナーゼドメィン の機能に必要な自己リン酸化される H736 に変異を入れてこのドメインが機能し なく なるよ うにしたもの （ Hikl_H736V ) を発現させるためのプラスミ ド
PYES2 - hikl- H736V と、 レスポンスレギュレータードメインのリ ン酸リ レーにおい てリン酸を受け取る D1153に変異を入れてこのドメインが機能しなくなるように したもの（Hikl- D1153E) を発現させるためのプラスミ ド pYES2- hikl- D1153Eを作 成して同様に ATCC201388株に導入した（図 6A)。 pYES2- HIK1を導入した株と異な り、 pYES2_hikl- H736V導入株と pYES2- hikl- D1153E導入株はいずれも、 3種の薬 斉 (J (25ppm fludioxonilN 25ppm iprodione、 50ppm chloroneb; にほとんど感受'! "生 を示さなくなり （図 6B)、 ヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレー タードメィンの両方が薬剤感受性の付与に必要とさ; ることが示唆された。なお、 pYES2-hikl-H736V 導入株では薬剤の有無にかかわらずやや生育阻害効果が認め られた。 また、 浸透圧 （0. 5M NaCl) 感受性には特に変化は言 められなかった。
[参考例 1 ] Hiklによる薬剤感受性の付与には酵母の Hogl MAPKを介する経路 が必要である。
( 1 ) 糸状菌において、 0s_ lファミリーヒスチジンキナ1 ~ ~ I の下流には、 出芽 酵母の Hogl MAP kinaseのホモログ（ァカパン力ビの場合 0s 2 (Zhang et al . , 2002 Appl. Environ. Microbiol. 68 : 532-538. ) で、 イネいもち病菌の場合 Osml (Dixon et al. , 1999 Plant Cel l 11 : 2045-2058. ) ) を介した情報伝達系が働いている
(図 4)。
Hikl を出芽酵母で発現させて薬剤感受性が付与された結果の解釈として最も 可能性が高いのが、 Hiklに薬剤が作用して、 出芽酵母の Hogl MAP kinaseに至る 情報伝達系を攪乱して生育阻害を引き起こすというものである。 この可能性を明 らかにするため、 この情報伝達系の因子の変異株である hogl 変異株と sskl変異 株と stel l変異株を用いて、それぞれの変異株に pYES2- HIK1を'導入して、発現を 誘導した場合に薬剤感受性を示すかどうかをみた （図 7A)。 hogl 変異株と sskl 変異株では、 pYES2- HIK1を導入して発現を誘導しても、薬剤（25ppm fludioxoni l , 25ppm iprodione 50ppm chloroneb) にメすする感 十生を示さな ¾ つに。一方、 stel l 変異株の場合は野生型株と同様に、 PYES2 - HIK1を導入して発現を誘導すると、 薬 斉 !J (25ppm f ludioxoni l N 25ppm iprodione 50ppm chloroneb) に ¾ "する感受个生を 示した。 なお、 pYES2 導入株ではいずれの株も薬剤に対する感受性を示さなかつ たことから、 ここでの薬剤感受性は HIK1特異的であることが示唆される。 また、 Hikl の発現は浸透圧 （0. 5M NaCl) 感受性には影響を与えな力 つた。 以上の結果 から、 Ssklと Hoglが薬剤感受性の付与に必要で、 Stel lは必要でないことが示唆 さ Lる。
( 2 ) この段階では、 hogl変異株と sskl変異株で pYES2 - HIK1を導入して発現 を誘導しても、 薬剤に対する感受性を示さなかったのは、 hog l変異や sskl変異 とは関係がない変異のためである可能性が否定できない。 そこで、 hogl変異株と sskl変異株にそれぞれ、無傷の H0G1遺伝子及び SSK1遺伝子を導入した場合に薬 剤感受性が回復するかどう力 言い換えると、 hogl変異や ss kl変異が薬剤感受 性を示さなくなった原因であるかどうかを明らかにするための実験を行った （図 7B)。
酵母の変異相補用のプラスミ ド pCLA - H0G1 と pCLA- SSK1は、 pCLl (Clontech) を Hindlll消化し自己連結して作成した pCLAの Hindlll部位に ATCC201388株由 来の H0G1 あるいは SSK1 をクローニングすることにより作成した。 H0G1 は 5 ' -TTTAAGCTTATCGATTGAAGGAAATAAGAGGAATAGC-3 ' ( 配 列 番 号 8 ) と 5 ， -TTTAAGCTTGGGTGAGACAGCTATTTAGCAAGTTC-3 ' (配歹 [J番号 9 ) で増幅し、 SSK1は 5， - TTTAAGCTTCCCACTGCTGGATCGACCATTC - 3 5 ( 配 列 番 号 1 0 ) と 5 , -TTTAAGCTTTAGTTGCCAGTCAAGATTTCCC-3' (配列番号 1 1 ) で増幅した。 なお、 增幅 した遺伝子に変異が入っていないことを DNA塩基配列決定により確認した。
hogl変異株に pCLA- H0G1を導入し H0G1遺伝子を発現させた場合、 薬剤に対す る感受性が回復した。 同様に、 sskl変異株に pCLA- SSK1を導入し H0G1遺伝子を 発現させた場合も、薬剤に対する感受性が回復した。 なお、 ベクターのみ （pCLA) を導入したコントロールでは両変異株とも薬剤感受性の回復は認められなかった, 以上の結果から、 Hogl MAPK を介した情報伝達系の因子の中で、 Sskl と Hogl が Hiklによる薬剤感受性の付与に必要で、 Stel lは必要でないことが示された。 「参考例 2 ] Hiklと Ypdlの相互作用の解析
CytoTrap XR l ibrary construction kit ( tratagene)を用レヽて、 CytoTrap two-hybrid system によるタンパク質間相互作用を解析した。 このシステムは、 一方のタンパク質をヒ ト Sosとの融合蛋白として発現させるためのベクター pSos と、 もう一方のタンパク質をミリスチン酸化シグナルとの融合タンパク質として 発現させるためのベクター pMyrと、酵母における Sosホモログ Cdc25の遺伝子に 温度感受性変異が入った酵母株 cdc25Hとからなる。二つのタンパク質の間で相互 作用があるとヒ ト Sosがミ リスチン酸修飾部位により膜に移行し、 酵母の cdc25 変異を相補し、 高温 （37度） でも生育できるようになる （図 8A)。 pMyr- HIK1は pMyrの Smal部位に HIK1 cDNAをクローニングすることにより構築した。 pSos-YPDl は Srflと Sailで消化した pSosに Smalと Xholで消化した ATCC201388株由来の
YPD1を連結することにより構築した。 pSos - Ssklは Srflと Sailで消化した pSos に Smalと Xholで消化した ATCC201388株由来の SSK1を連結することにより構築 した。 YPD1は 5' -TTTCCCGGGATATGTCTACTATTCCCTCAGAAATC-3 ' (配列番号 1 2 ) と 5 ' -TTTCTCGAGTTATAGGTTTGTGTTGTAATATTTAGAT-3' (酉己列番号 1 3 )で増幅し、 SSK1 は 5， - TTTCCCGGGATATGCTCAATTCTGCGTTACTGTGG- 3， （配列番号 1 4 ) と 5 ' -TTTCTCGAGTCACAATTCTATTTGAGTGGGCG-3 ' (配列番^ · 1 5 ) で増幅した。 なお、 增 幅した遺伝子に変異が入っていないことを DNA塩基配列決定により確認した。 酵 母の形質転換から、 形質転換酵母の滴下までは、 前述の薬剤感受性の解析の場合 と同様に行った。 ただし、 滴下までの培養は全て 25° Cで行い、 滴下後は 25° C と 37° Cで培養した。
(結果）
Hiklは酵母の Hoglの上流の情報伝達因子 Ypdlとネ目互作用する
さらに、 Hiklの酵母における作用点を明らかにするために、 Hiklと酵母側の相 互作用因子の候補 Ypdlや Sskl との間の相互作用を yeast two- hybrid system (図
8A、 材料と方法参照） で解析した。 本システムで用いる S. cerevisiae cdc25H 株は CDC25遺伝子の温度感受性変異により高温（37° C) では Ras経路を活性化で きないために生育できず、 許容温度の 25° Cでは生育できる。 ターゲットをミリ スリン酸化シグナルとの融合タンパク質、 獲物 （bait) をヒ ト Sos (酵母の Cdc25 のホモログ） との融合タンパク質として発現させる。 ターゲットと獲物との間に 相互作用があるとミ リスリン酸化シグナルにより ヒ ト Sosが細胞膜に移行し、 Ras 経路を活性化して 37° Cでも cdc25H株が生育でできるようになることにより、相 互作用が検出できる。
ここでは獲物を Ypdl (pSos-YPDlで発現） と Sskl (pSos- SSK1で発現） にして、 ターゲットのイネいもち病菌の Hikl (pMyr-HIKlで 現) が結合するかどうかを 解析した（図 8B)。許容温度の 25° Cでは全ての組み合わせで生育が認められた。 ただし、相互作用を示す positive controlの組み合わせ（pSos- MAFB + pMyr- MAFB) と相互作用を示さない negative controlの組み合わせ (pSos-Col l + pMyr-MAFB) ではやや生育阻害が認められた。 37° Cでは、 posit ive controlの組み合わせで は生育が認められ、 negative controlの組み合わせでは生育が認められず、 実験 系に問題がないことが示された。 Hikl が相互作用を示したのは Ypdl であり
(pSos-YPDl + pMyr-HIKl ) , Sskl とは相互作用を示さなかった （pSos- SSK1 + pMyr-HIKl ) 0 なお、 Ypdl のみでもわずかに 37° C での生育が認められたが (pSos-YPDl + pMyr)、 これは Ypdlの通常の酵母内での相互作用の相手である膜 結合領域を持つ Slnl (図 3、 4) との相互作用によるものと考えられる。 以上の結 果から、 出芽酵母内において、 イネいもち病菌の Hiklは出芽酵母の Ypdlを介し て薬剤感受性を付与している可能性が高いことが示された。 産業上の利用可能性
本願発明により、 従来の方法では不可能であった、 糸状菌特異的酵素をターグ ットとして糸状菌に特異的に作用する薬剤の候補を選択的に得ることが出来る。 更に本願発明のスクーニング方法及びキットでは、 同じ菌類に属し、 糸状菌に近 縁である酵母をスクリーニングに用いているため、 酵母にも作用する （副作用を 起こす） 薬剤を薬剤候補の選択と同時に除外することも可能であり、 農薬及び医 薬の開発を大幅に短縮できるという優れた効果を奏するものである。
本願発明は、 農薬開発及び医薬開発の技街分野で利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許おょぴ特許出願をそのまま引用により 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1. 糸状菌の Os-1ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子で形質転換した酵 母。
2. 糸状菌の Os-1ファミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝子が、 HIK1遺伝子で ある請求項 1記載の形質転換酵母。
3. 酵母が出芽酵母 （Saccharomyces cerevisiae) である請求項 1又は 2項 記載の形質転換酵母。
4. ( 1 ) 糸状菌由来の Os-lファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現べ クタ一で形質転換した酵母及び （2 ) コントロール酵母 （糸状菌特異的酵素を発 現しない酵母）を含む糸状菌特異的農薬候補又は医薬候補スクリーユングキット。
5. 糸状菌由来の 0s_lファミリ一ヒスチジンキナーゼ遺伝子が HIK1遺伝子 である請求項 4記載の糸状菌特異的農薬候補又は医薬候補スクリーニングキット。
6. 酵母が出芽酵母 （Saccharomyces cerevisiae) である請求項 4又は 5記 載の糸状菌特異的農薬候補又は医薬候補スクリーニングキット。
7. 以下の （1 ) から （3) の工程を含む糸状菌特異的農薬候補又は糸状菌 特異的医薬候補のスクリー-ング方法。
(1 ) 糸状菌由来 Os-1ファミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝子組み換え発現べク ターにより酵母を形質転換した形質転換体及ぴコントロール酵母（Os-1ファミ リ 一ヒスチジンキナーゼを発現しない酵母） に農薬候補試料又は医薬候補試料を投 与する工程
(2) 農薬候補試料又は医薬候補試料を投与された上記 Os-1ファミ リーヒスチ ジンキナーゼ発現形質転換体及びコントロール酵母を一定時間培養する工程、 及 ぴ
(3)一定時間培養後、 0s- 1フアミ リーヒスチジンキナーゼ発現形質転換体及ぴ コントロール酵母の増殖率又は生存細胞数を計測する工程。
8. 形質転換体及ぴコントローノレ酵母の増殖率又は生存細胞数の計測を、 0s-
1フアミリーヒスチジンキナーゼ発現形質転換体及びコントロール酵母の培養液 の 0Dを計測することにより行う請求項 7記載の方法。
9. 0s- 1フアミリーヒスチジンキナーゼ発現形質転換体及ぴコントロール酵 母の増殖率又は生存細胞数の計視 I」を酵母特異的抗体を用いて行う請求項 7記載の 方法。
1 0. 糸状菌由来 0s- 1フア ミ リーヒスチジンキナーゼ遺伝子が HIK1遺伝子 である請求項 7から 9いずれか 1項に記載のスクリ一二ング方法。
1 1. 酵母が出芽酵母 （Saccharomyces cerevisiae) である請求項 7から 1 0いずれか 1項に記載のスクリー-ング方法。
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