WO2005071415A1 - Metodo inmunologico para el diagnostico de la ascaridiasis aviar - Google Patents

Metodo inmunologico para el diagnostico de la ascaridiasis aviar Download PDF

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José Ramón MARTIN PACHO
Teresa Aranguena Rodriguez
Carlos Toro
Martha Nelly Montoya
Javier Ramirez Villaescusa
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    • G01N2333/465—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates from birds

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro diagnostic method, in particular a method for the in vitro diagnosis of avian ascaridiasis.
  • Avian ascaridiasis is a disease caused by nematodes of the genus Ascaridia galli, one of the most common intestinal parasites in poultry farming. This nematode affects the intestine of both poultry (chicken, turkey, goose) and wild birds (partridge, capercaillie, duck, pheasant and common vulture), developing in the mucosa and intestinal lumen of the bird.
  • the period of preparation time that passes from the bird ingesting the embryonic eggs of the parasite until it reaches the adult state and produce eggs that appear in the feces of the birds, is approximately 50 days.
  • the females of this parasite produce a large number of eggs (about 5,000 per day), which are expelled, without embryo, along with the feces.
  • the larva, inside the egg reaches its infective state in a period of 2 to 3 weeks, in environmental conditions of good humidity and high temperature.
  • the symptoms and signs of the disease are enteritis, diarrhea and anemia, symptoms that are associated with the presence of worms in the digestive tract, but other symptoms such as the decrease of glycogen and proteins contained in muscles, indicate the ability of parasites to modify the metabolism of their host, and the consequences are reduced growth and weight loss of affected birds.
  • the large concentrations of laying hens and chickens on farms facilitate the spread of the parasite among birds, since they are infected by the ingestion of parasite eggs present in land or garbage, or eating worms, which act as deposits of parasites
  • the methods of detection, at present, of ascaridiasis are performed by stool analysis to identify the eggs of the parasite. This implies that when the infection is detected, the damage caused by the parasite is already occurring. In addition, the eggs expelled by the infected host constitute a risk for the rest of the birds that live with it.
  • Ascaris suum adult verme antigen complexes can be used as antigens in ligand enzyme immunosorbent assay (ELISA) techniques for the diagnosis of avian ascaridiasis.
  • ELISA ligand enzyme immunosorbent assay
  • a new method for the detection of avian ascaridiasis comprising the use of Ascaris suum antigen complexes, as antigens in ligand enzyme immunosorbent assay (ELISA) techniques.
  • ELISA ligand enzyme immunosorbent assay
  • the ELISA method allows the simultaneous analysis of numerous serum or blood samples, therefore, both the diagnostic method and the kit of the present invention imply an improvement in terms of diagnostic time and performance, where the antigens used are obtained. industrially of standardized manner, increasing the sensitivity and specificity of the diagnosis of the infection caused by Ascaridia galli.
  • the diagnostic method according to the invention is performed "in vitro" by means of the ELISA technique on serum or whole blood from the animal suspected of suffering from avian ascaridiasis, and comprises, in a preferred embodiment, the steps of: a. upholster the wells of a polystyrene plate with the antigenic extract of adult worms of Ascaris suum, by incubating the plate with a solution of the antigens diluted in PBS (phosphate buffered saline); b. poststap with BSA (bovine serum albumin) in PBS; c. add the serum or whole blood test sample diluted in diluent buffer and incubate; d.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • an enzyme generally used in a diagnostic immunoenzymatic analysis selected from the group consisting of peroxidase, alkaline phosphatase and glucoxidase, diluted in the diluent buffer of section (c) and incubate; and. revealing the reaction by adding a colorless substrate solution specific for the conjugate enzyme used in the previous step and incubating; F. read the absorbance at 492 nm.
  • step (b) is post-taped with 1% BSA
  • step (c) the test sample is diluted 1/200 in diluent buffer and said Diluent buffer is composed of 1.7 g NaCl, Na 2 HP0 4 0.426 gr, NaH 2 P0 4 0.078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0.05 ml and H 2 0 distilled 200 ml
  • step (d) the secondary antibody is diluted 1: 8000 in the diluent buffer.
  • the diagnostic method of the invention comprises the steps of: a. upholstering the wells of a polystyrene plate with the antigen extract adult worms Ascaris suum, by incubating the plate at a temperature of 4 C for 16 hours with 200 ul / well of a solution of 0.8 ug / well of the antigen diluted in PBS (pH 7.2); wash the plate 3 times with PBS (pH 7.2), to separate unbound antigens; b. posttap with 1% BSA in PBS (pH 7.2), for 1 hour at 37 ' r elave again as in the previous stage; c.
  • an enzyme generally used in a diagnostic immunoenzymatic analysis selected from the group consisting of peroxidase, alkaline phosphatase and glucoxidase, diluted 1: 8000 in the diluent buffer of section ( c) and incubate 2 hours at 37 ° C
  • the diagnostic method of the invention comprises:
  • step (a) of the method of the present invention the polystyrene microtiter plate is previously treated by generally known methods.
  • 0.8 ⁇ g / well of the antigen extract is dissolved in PBS buffer (0.01 M sodium phosphate, 0.15 M sodium chloride, pH 7.2). 200 ⁇ l / well of said solution being introduced into all the wells of a microtiter plate.
  • the plates were incubated for 16 hours at a temperature of 4 ° C, the time necessary for the antigens to be absorbed in the well walls.
  • the plates are washed with PBS buffer to separate unbound antigens.
  • Post-capping with 1% BSA in PBS buffer pH 7.2 is carried out for 1 hour at 37 ° C.
  • the samples used may be serum or blood.
  • the samples are diluted in proportion 1/200 in diluent buffer consisting of NaCl 1.7 gr, Na 2 HP0 4 0.426 gr, NaH 2 P0 4 0.078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0.05 mi and Distilled H 2 0 me and incubate for 1 hour.
  • the plates are washed with the 0.05% PBS / Tween 20 mixture. In In general, 3 washes are performed.
  • the Ascaridia galli antibodies if present in the sera, will bind to the antigen fixed on the plate.
  • step (d) the secondary anti-chicken IgG antibody labeled with an enzyme suitable for the purposes of the present invention is added to each well, in general any enzyme generally used in a diagnostic immunoenzymatic analysis such as for example is valid peroxidase, alkaline phosphatase and glucoxidase.
  • the peroxidase labeled anti-chicken IgG antibody diluted 1/8000 is used in the diluent buffer of section (c). Plates treated in this way are incubated for 2 hours at a temperature of 37 ° C. The plates are then washed with 0.05% PBS / Tween 20.
  • the enzyme-anti-IgG conjugate By adding the enzyme-anti-IgG conjugate, it binds to any anti-Ascaridia galli antibody that could have bound to the plate-bound antigen. If the serum sample does not contain any anti-A antibody. Galli, the conjugate will remain free or in suspension and will be removed during washing.
  • a colorless substrate solution specific for the conjugate enzyme used in step (d) is added to each well.
  • the substrate solution used when the enzyme is peroxidase has the following composition: OPD buffer (orthophenylenediamine) 10 ml (citric acid 2.14 gr, Na 2 HP0 4 x 12 H 2 0 6.54 gr, H 2 0 distilled 400 mi adjust at pH 7.5) + OPD 0.0028 gr + H 2 0 2 4 ⁇ l.
  • the presence of the immobilized enzyme within the bound conjugate is revealed by the addition of the specific substrate, producing a reaction that occurs with a color change.
  • the plate is read in an ELISA reader to measure the absorbance (A) for each well at a wavelength that is specific for each type of enzyme substrate, in the case of the peroxidase and the substrate described above, The measurement is made at 492 nm. Serums with an optical density (D.O.) equal to or greater than 0.85 are considered positive. This limit of positivity has been established by analyzing a wide series of sera from healthy animals from a non-endemic exploitation of ascaridiasis (normal sera) and adding to their D.O. 3 times its standard deviation.
  • D.O. optical density
  • Another aspect of the invention is an ELISA diagnostic kit for detecting avian ascaridiasis in an animal serum or blood sample, characterized in that it comprises: a. a polystyrene plate previously treated with Ascaris suum adult vermes extract for binding to the anti-Ascaridia galli antibodies present in serum samples or whole blood to be analyzed. b. a secondary anti-chicken IgG antibody labeled with an enzyme generally employed in a diagnostic immunoenzymatic analysis selected from the group consisting of peroxidase, alkaline phosphatase and glucoxidase. c. a colorless substrate solution specific for the conjugate enzyme used in the previous step (b). DESCRIPTION OF THE GRAPH
  • FIG. 1 the results of optical density (D.O.), obtained in the analysis carried out by the ELISA method on blood samples from seven farms of laying hens (Exp.), are graphically presented.
  • the dark rectangle corresponds to the range of optical density (D.O.) of the blood samples analyzed in each holding.
  • the line that divides it into two represents the arithmetic mean of these optical densities (D.O.).
  • the upper and lower dimensions of the rectangles are the standard deviations of the optical densities (D.O.) of the blood samples analyzed.
  • the black dots correspond to values of optical density (D.O.) of blood samples analyzed that leave the standard deviation.
  • a sampling of the faeces of the hens in each of the farms was also carried out, analyzing the abundance of ascaridia galli eggs by the flotation method in zinc sulfate.

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Abstract

Método inmunológico para el diagnóstico de la ascaridiasis aviar. Método para el diagnóstico in vitro de la ascaridiasis aviar mediante el empleo de complejos antigénicos de Ascaris suum, como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbente de enzima ligando (ELISA) y kit de diagnóstico.

Description

MÉTODO INMUNOLOGICO PARA EL DIAGNOSTICO DE LA ASCARIDIASIS AVIAR
La presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro, en concreto un método para el diagnóstico in vitro de la ascaridiasis aviar.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La ascaridiasis aviar es una enfermedad producida por nematodos del género Ascaridia galli, uno de los parásitos intestinales más comunes en avicultura. Este nematodo afecta al intestino tanto de aves de corral (pollo, pavo, ganso) como de aves silvestres (perdiz, urogallo, pato, faisán y buitre común) , desarrollándose en la mucosa y luz intestinal del ave.
El período de prepatencia, tiempo que pasa desde que el ave ingiere los huevos embrionados del parásito hasta que este alcanza el estado adulto y producen huevos que aparecen en las heces de las aves, es aproximadamente de 50 días.
Las hembras de este parásito producen gran cantidad de huevos (unos 5.000 por día), los cuales son expulsados, sin embrionar, junto con las heces. La larva, dentro del huevo, alcanza su estado infectivo en un período de 2 a 3 semanas, en unas condiciones ambientales de buena humedad y alta temperatura.
Los síntomas y signos de la enfermedad son enteritis, diarrea y anemia, síntomas que están asociados a la presencia de los gusanos en el tubo digestivo, pero otros síntomas como el descenso de glucógeno y proteínas contenidas en músculos, nos indican la capacidad de los parásitos de modificar el metabolismo de su huésped, y las consecuencias son la reducción del crecimiento y perdida de peso de las aves afectadas . Las grandes concentraciones de las gallinas ponedoras y los pollos existentes en las explotaciones facilitan la difusión del parásito entre aves, ya que éstas son infectadas por la ingestión de huevos de parásitos presentes en tierras o basuras, o comiendo lombrices, las cuales actúan como depósitos de parásitos.
De este modo la ascariadisis es considerada, en la actualidad, como un importante problema económico. Varios estudios, de diferentes partes del mundo, sobre la epidemiología del Ascaris galli han sido publicados en años recientes indicando esta problemática. (Eshetu et al., Rev. Sci . Tech . 2001; 20: 791-796 ; Gauly et al., Vet. Parasi tol . 2000; 96: 301-307; Magwisha et al., Trop . Anim . Heal th Prod . 2002; 34: 205-214; Mpoame δ. Agbede, .Rev. Elev. Med . Vet . Pays Trop . 1995; 48: 147-151 ; Permin et al., J. Helminth . 1997 ; 71: 233- 240. Permin et al., Br. Poul t . Sci . 1999; 40: 439-443; Poulsen et al., Prev. Vet . Med . 2000; 45: 237-245; ilson et al., Avian Dis . 1994; 38: 158-160.)
Los métodos de detección, en la actualidad, de la ascaridiasis se realizan mediante el análisis de heces para identificar los huevos del parásito. Esto implica que cuando se detecta la infección, ya se están produciendo los daños que causa el parásito. Además, los huevos expulsados por el hospedador infectado constituyen un riesgo para el resto de las aves que conviven con ella.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, existe la necesidad de un método de análisis que permita detectar la presencia del parásito antes de que los vermes adultos comiencen a producir huevos. Tomándose así medidas preventivas en las explotaciones afectadas y evitar, al menos en parte, los daños causados por el parásito a nivel intestinal.
Tras laboriosa investigación, los autores de la presente invención han descubierto que complejos antigénicos de vermes adultos de Ascaris suum, pueden ser empleados como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbentes con enzima ligando (ELISA) para el diagnóstico de la ascaridiasis aviar.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo método para la detección de la ascaridiasis aviar que comprende el uso de complejos antigénicos de Ascaris suum, como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbente de enzima ligando (ELISA) . Estos complejos antigénicos procedentes de extractos completos de vermes adultos de Ascaris suum comparten numerosos antígenos con Ascaridia galli, permitiendo el diagnóstico de la ascaridiasis aviar antes de que los huevos del parásito comiencen a ser eliminados a través de las heces de las aves infectadas. Esto permitirá tomar medidas preventivas en las explotaciones afectadas y evitar los daños causados por el parásito a nivel intestinal.
El método de ELISA permite el análisis simultáneo de numerosas muestras de suero o sangre, por lo cual, tanto el método de diagnóstico como el kit de la presente invención supone una mejora en términos de tiempo y rendimiento de diagnóstico, donde los antígenos utilizados sean obtenidos industrialmente de manera estandarizada, aumentando la sensibilidad y especificidad del diagnóstico de la infección producida por la Ascaridia galli.
El método de diagnóstico según la invención se realiza "in vitro" mediante la técnica de ELISA sobre suero o sangre completa procedente del animal sospechoso de padecer ascaridiasis aviar, y comprende, en una realización preferida, las etapas de: a. tapizar los pocilios de una placa de poliestireno con el extracto antigénico de vermes adultos de Ascaris suum, por incubación de la placa con una solución de los antígenos diluidos en PBS (tampón salino fosfato) ; b. postapizar con BSA (albúmina de suero bovino) en PBS; c. añadir la muestra problema de suero o sangre total diluido en tampón diluyente e incubar; d. añadir el anticuerpo secundario anti-IgG anti- gallina marcada con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionada entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa, diluido en el tampón diluyente del apartado (c) e incubar; e. revelar la reacción mediante la adicción de una solución de sustrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa anterior e incubar; f. leer la absorbancia a 492 nm.
El método de diagnóstico de la invención se lleva a cabo preferentemente de forma que la etapa (b) se postapiza con BSA 1%; en la etapa (c) la muestra problema se diluye 1/200 en tampón diluyente y dicho tampón diluyente está compuesto por NaCl 1,7 gr, Na2HP04 0,426 gr, NaH2P04 0,078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0,05 mi y H20 destilada 200 mi; en la etapa (d) el anticuerpo secundario se diluye 1:8000 en el tampón diluyente.
En otra realización preferida, el método de diagnóstico de la invención comprende las etapas de: a. tapizar los pocilios de una placa de poliestireno con el extracto antigénico de vermes adultos de Ascaris suum, por incubación de la placa a una temperatura de 4CC durante 16 horas, con 200 μl/pocillo de una solución de 0,8 μg/pocillo del antígeno diluido en PBS (pH 7,2); lavar 3 veces la placa con PBS (pH 7,2), para separar los antígenos que no se hayan ligado; b. postapizar con BSA 1% en PBS (pH 7,2), durante 1 hora a 37 'relavar de nuevo como en la etapa anterior; c. añadir 100 μl/pocillo de muestra problema de suero o sangre total problema diluida 1/200 en tampón diluyente (constituido por NaCl 1,7 gr, Na2HP04 0,426 gr, NaH2P04 0,078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0,05 mi y H20 destilada 200 mi) e incubar durante 1 hora; lavar las placas con mezcla PBS/Tween 20 al 0,05% 3 veces, d. añadir 100 μl/pocillo del anticuerpo secundario anti-IgG anti-gallina marcada con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionada entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa, diluido 1:8000 en el tampón diluyente del apartado (c) e incubar 2 horas a 37 °C; lavar las placas con mezcla PBS/Tween 20 al 0,05% 3 veces . revelar la reacción mediante la adicción de una solución de sustrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa (g) , e incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente de 22 a 25°C; detener la reacción enzimática con ácido sulfúrico 1 N y leer la absorbancia a 492 nm.
Según otra forma preferida de realización, el método de diagnóstico de la invención comprende:
Etapas (a) - (b)
En la etapa (a) del método de la presente invención, la placa de microvaloración de poliestireno se trata previamente por métodos en general conocidos . En la práctica, 0,8 μg/pocillo del extracto antigénico se disuelven en tampón PBS (0.01 M fosfato sódico, 0,15 M cloruro sódico, pH 7,2). Introduciéndose 200 μl/pocillo de dicha solución en todos los pocilios de una placa de microvaloración. Las placas con incubadas durante 16 horas a una temperatura de 4°C, tiempo necesario para que los antígenos se absorban en las paredes de los pocilios. Las placas se lavan con tampón PBS para separar los antígenos que no se hayan ligado.
Se realiza un post -tapizar con BSA 1% en tampón PBS pH 7,2, durante 1 hora a 37 °C.
Etapa (c) Las muestras empleadas pueden ser suero o sangre. Las muestras se diluyen en proporción 1/200 en tampón diluyente constituido por NaCl 1,7 gr, Na2HP04 0,426 gr, NaH2P04 0,078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0,05 mi y H20 destilada 200 mi y se incuba durante 1 hora. Las placas son lavadas con la mezcla PBS/Tween 20 al 0,05%. En general, se llevan a cabo 3 lavados. Al añadir sobre las placas tapizadas con los antígenos la muestra problema de suero o sangre, los anticuerpos de la Ascaridia galli, si es que están presentes en los sueros, se unirán al antígeno fijado en la placa.
Etapa (d)
En la etapa (d) se añade a cada pocilio el anticuerpo secundario anti-IgG anti-gallina marcada con un enzima adecuado para los fines de la presente invención, en general es válida cualquier enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico como por ejemplo peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se emplea el anticuerpo anti- IgG anti-gallina marcado con peroxidasa diluido 1/8000 en el tampón diluyente del apartado (c) . Las placas tratadas de este modo son incubadas durante 2 horas a una temperatura de 37 °C. Las placas se lavan después con PBS/Tween 20 al 0,05%. Al añadir el conjugado enzima-anti-IgG, éste se une a cualquier anticuerpo anti -Ascaridia galli que podría haberse unido al antígeno fijado a la placa. Si la muestra de suero no contiene ningún anticuerpo anti-A. Galli, el conjugado permanecerá libre o en suspensión y será eliminado durante el lavado.
Etapas (e) - (f)
En estas etapas, se añade a cada pocilio una solución de sustrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa (d) . La solución del sustrato utilizado cuando el enzima es peroxidasa tiene la siguiente composición: tampón OPD (ortofenilendiamina) 10 mi (ácido cítrico 2,14 gr, Na2HP04 x 12 H20 6,54 gr, H20 destilada 400 mi, ajusfar a pH 7,5) + OPD 0,0028 gr + H202 4 μl .
La presencia del enzima inmovilizada dentro del conjugado unido se pone de manifiesto mediante la adición del sustrato específico, produciendo una reacción que cursa con un cambio de color.
Para una determinación cuantitativa, la placa es leída en un lector ELISA para medir la absorbancia (A) para cada pocilio a una longitud de onda que es específica para cada tipo de sustrato enzimático, en el caso de la peroxidasa y el sustrato descrito anteriormente, la medición se hace a 492 nm. Se consideran positivos los sueros con una densidad óptica (D.O.) igual o superior a 0.85. Este límite de positividad se ha establecido analizando una serie amplia de sueros de animales sanos provenientes de una explotación no endémica de ascaridiasis (sueros normales) y sumando a su D.O. media 3 veces su desviación estándar.
Otro aspecto de la invención es un kit de diagnóstico ELISA para detectar la ascaridiasis aviar en una muestra de suero o sangre animal, caracterizado porque comprende : a. una placa de poliestireno tratada previamente con extracto de vermes adultos de Ascaris suum para la unión a los anticuerpos anti-Ascaridia galli presentes en muestras de suero o sangre completa a analizar. b. un anticuerpo secundario anti-IgG anti-gallina marcado con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionado entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa. c. una solución de sustrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa anterior (b) . DESCRIPCIÓN DEL GRÁFICO
En la FIG. 1 se exponen gráficamente los resultados de densidad óptica (D.O.), obtenidos en el análisis efectuado por el método ELISA sobre muestras de sangre procedentes de siete explotaciones de gallinas ponedoras (Exp.) . Donde el significado de los símbolos es el siguiente: El rectángulo oscuro corresponde al rango de densidad óptica (D.O.) de las muestras de sangre analizadas en cada explotación. Donde la línea que lo divide en dos representan la media aritmética de dichas densidades ópticas (D.O. ) . Las acotaciones superior e inferior de los rectángulos son las desviaciones estándar de las densidades ópticas (D.O.) de las muestras de sangre analizadas. Los puntos negros corresponden a valores de densidad óptica (D.O.) de muestras de sangre analizadas que se salen de la desviación estándar.
EJEMPLOS
Los siguientes ensayos experimentales ilustran la invención realizada por los inventores y pone de manifiesto la especificidad del método. Para estos ejemplos se estudiaron 7 explotaciones de gallinas ponedoras .
Ejemplo 1
Se realizó un muestro en cada una de las siete granjas o explotaciones estudiadas, en las cuales se tomaron en total 140 muestras de sangre. Estas muestras fueron analizadas por el método ELYSA para anticuerpos IgG. La tabla 1 nos indica la cantidad de muestras analizadas en cada granja; el tiempo de vida de los animales analizados; y el número de muestras que han dado positivo en el ensayo, dando una densidad óptica (D.O.) superior a 0.85, calculándose la prevalencia (% de muestras positivas en las muestras ensayadas) en cada una de las explotaciones.
En la Fig. 1, según se ha descrito anteriormente, se representan gráficamente los resultados de densidad óptica (D.O.) obtenidos en las muestras de sangre analizadas en cada explotación (Exp.) .
Tabla 1
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Ejemplo 2
También se realizó un muestreo de las heces de las gallinas en cada una de las explotaciones, analizando la abundancia de huevos de ascaridia galli por el método de flotación en sulfato de zinc.
Debido a la naturaleza de las muestras a analizar, en cuatro de las siete explotaciones analizadas (N° 1, 4,
5 y 7) , las muestras eran conjuntas y en cada una de estas heces conjuntas se analizan 10 muestras de 1 gr cada una, en diferentes zonas de la masa fecal. Se comprobó que las explotaciones N° 1 y 2 eran no endémicas de ascaridiasis, no encontrándose huevos del parásito en las muestras analizadas.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de diagnóstico in vitro de la ascaridiasis aviar caracterizado por el empleo de complejos antigénicos de Ascaris suum, como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbente de enzima ligando (ELISA) .
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas de: a. tapizar los pocilios de una placa de poliestireno con el extracto completo de Ascaris suum, por incubación de la placa con una solución de los antígenos diluidos en PBS; b. postapizar con BSA en PBS; c. añadir la muestra problema de suero o sangre total diluida en tampón diluyente e incubar; d. añadir el anticuerpo secundario anti-IgG anti- gallina marcada con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionada entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa, diluido en el tampón diluyente del apartado (c) e incubar; e. revelar la reacción mediante la adicción de una solución de sustrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en. la etapa anterior, e incubar ; f. leer la absorbancia a 492 nm.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa (b) se postapiza con BSA 1%; en la etapa (c) la muestra problema se diluye 1/200 en tampón diluyente y dicho tampón diluyente está compuesto por NaCl 1,7 gr, Na2HP04 0,426 gr, NaH2P04 0,078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0,05 mi y H20 destilada 200 mi; en la etapa d) el anticuerpo secundario se diluye 1:8000 en el tampón diluyente .
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el enzima empleada es peroxidasa.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución del sustrato utilizado tiene la siguiente composición: tampón OPD 10 mi (ácido cítrico 2,14 gr, Na2HP04 x 12 H20 6,54 gr, H20 destilada 400 mi, ajusfar a pH 7,5) + OPD 0,0028 gr + H202 4 μl .
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la reacción se considera positiva cuando la densidad óptica registrada supera el valor de 0,85.
7. Un kit de diagnóstico para la detección in vitro de la ascaridiasis aviar en una muestra de suero o sangre completa por el método ELISA, caracterizado porque comprende : a. una placa de poliestireno tratada previamente con extracto completo de Ascaris suum para la unión a los anticuerpos anti-Ascaridia galli presentes en muestras de suero o sangre completa a analizar. b. Un anticuerpo secundario anti-IgG anti-gallina marcado con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionado entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa. c. Una solución de sustrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa anterior (b) .
8. Un kit de diagnóstico ELISA según la reivindicación 7 caracterizado porque el enzima empleado es peroxidasa.
9. Un kit de diagnóstico ELISA según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque la solución del sustrato utilizado tiene la siguiente composición: tampón OPD 10 mi (ácido cítrico 2,14 gr, Na2HP04 x 12 H20 6,54 gr, H20 destilada 400 mi, ajusfar a pH 7,5) + OPD 0,0028 gr + H202 4 μl .
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2323113A1 (es) * 2007-06-29 2009-07-06 Bioseguridad Y Analisis Inmunologicos J.A.F., S.L. Fraccion antigenica de ascaridia galli, anticuerpos especificos frente a la misma y metodos de deteccion del patogeno.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRONTERA E. ET AL: "Serological responses to Ascaris suum adult worm antigens in Iberian finisher pigs", JOURNAL OF HELMINTHOLOGY, vol. 77, 2003, pages 167 - 172 *
KAUSHIK R.K.K. ET AL: "Some studies on serodiagnosis of experimental ascaridiasis in poultry", INDIAN J. ANIM. SCI., vol. 48, no. 3, March 1978 (1978-03-01), pages 202 - 207 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2323113A1 (es) * 2007-06-29 2009-07-06 Bioseguridad Y Analisis Inmunologicos J.A.F., S.L. Fraccion antigenica de ascaridia galli, anticuerpos especificos frente a la misma y metodos de deteccion del patogeno.
CN108761065A (zh) * 2018-05-21 2018-11-06 苏州佑君环境科技有限公司 一种稀释碱性磷酸酶标识抗原用溶液及其制备方法

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