WO2005062044A1 - Method of bence-jones protein calibration - Google Patents

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WO2005062044A1
WO2005062044A1 PCT/JP2004/017645 JP2004017645W WO2005062044A1 WO 2005062044 A1 WO2005062044 A1 WO 2005062044A1 JP 2004017645 W JP2004017645 W JP 2004017645W WO 2005062044 A1 WO2005062044 A1 WO 2005062044A1
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ratio
bjp
electrophoresis
chain
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Japanese (ja)
Inventor
Takanari Nakano
Atsuo Nagata
Original Assignee
Yamasa Corporation
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments

Definitions

  • the present invention relates to an efficient method for assaying urinary vents joint protein using urine protein electrophoresis and Immnothase together.
  • Monoclonal free light chain which is dissociated from the immunoglobulin heavy chain, is a monoclonal protein found in blood diseases such as plasma cell abnormalities, particularly in multiple myeloma and macroglobulinemia. (M protein) (Br. J. Haematol., 1969, 16, 599-606).
  • BJP is a useful clinical marker such as multiple myeloma, and its test is performed as an item of routine clinical examination.
  • BJP has a small molecular weight, easily passes through glomeruli, and most of it is transferred into urine. Therefore, in actual clinical tests, BJP in urine is detected by electrophoresis ( DRG / PPS Compatible Clinical Laboratory Guidelines Second Draft, 2000, pp. 78-82).
  • Urine protein electrophoresis is widely used as a screening method for BJP, but its detection sensitivity and specificity depend on the analysis system and the degree of urine preconcentration before testing. However, it is not always a satisfactory method. For example, cellulose acetate membrane, which is widely used as a support for electrophoresis, has poor resolution of imnoglobulin, and its detection sensitivity also changes depending on the type of staining dye for protein detection after electrophoresis. The electrophoresis method must have low sensitivity. Furthermore, since urine is used as a sample, it is necessary to concentrate urine in advance, but the degree of concentration in that case is not clearly defined.
  • the BJP screening method using electrophoresis has a large difference in test accuracy between facilities, and has various problems inherent in clinical tests. In fact, a recent control survey between facilities revealed that 60 mg Bd of Zd1 was overlooked in about 30% of the facilities, which is a problem.
  • the immunophenotype (subclass) of immunoglobulin cannot be identified by the above-mentioned electrophoresis, the subclass (BJP, IgGG) of the M protein detected using the immunofixation (or immunoelectrophoresis) method Type M protein or IgM type M protein).
  • the results of the electrophoresis method, the immunoassay, and the immunofixation method were compared, and the urinary / c-type light chain, including the light chain bound to intact immunoglobulin, was BJP-negative can be determined if there is no abnormality in the total (total) amount with the type I light chain and its ratio (to the total amount) and no abnormal band is observed by electrophoresis. Suggest that.
  • the sensitivity was 100%, but it is not necessarily BJP-specific. That is, the total (total) of the / c-type light chain and the ⁇ -type light chain in urine, including the light chain bound to the intact immunoglobulin, is quantified, and the amount and ratio are calculated.
  • an intact immunoglobulin M protein for example, IgG- ⁇ M protein
  • the amount and ratio of the immunoglobulin which is not FLC-specific and measures the total amount of light chain, is inevitable. It becomes abnormal. This abnormality in the amount and ratio is due to the presence of an immunoglobulin M protein other than BJP and is not necessarily BJP-specific.
  • the sensitivity refers to a percentage (%) of a urine sample with BJP that showed a positive result (see Example (4)).
  • the present inventors have conducted intensive studies on a more realistic and efficient BJP test method. (1) Based on the ratio (K ⁇ ⁇ ratio) of the KC and ⁇ chains of FLC in Imnoassay. (2) The use of both electrophoresis and Imnoassay to determine the presence or absence of the M protein in electrophoresis and the / c chain of FLC in Imnoassay The present inventors have found that BJ ⁇ ⁇ ⁇ can be tested efficiently by making a judgment based on a constant processing procedure (algorithm) based on the ratio of ⁇ chains ( ⁇ / ratio), and completed the present invention.
  • algorithm constant processing procedure
  • the present invention includes the following contents.
  • step 1 The method described in [1] above, in which step 1, step 2, and step 3 are performed in this order.
  • step 2 step 1, and step 3 are performed in this order.
  • the step to judge BJP positive If the M protein is confirmed, and the ratio is less than 0.2 ⁇ 0.1 or 1.67 ⁇ 0.84 or more, the step to judge BJP positive
  • step 2 step 1, and step 3 are performed in this order.
  • the M protein was confirmed, and the ratio was 0.2 ⁇ 0.1 or less or 1.67 / 0.84 or more.
  • the M protein was confirmed, and the ⁇ L ratio was more than 0.2 ⁇ 0.1 and less than 1.67 ⁇ 0.84.
  • the 1: 1 ratio was 0.2 or less, 0.1 or less, or 1.67 ⁇ 0.84 or more.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a standard curve of an FLC measurement method in Imnoassy.
  • FIG. 2 is a view showing an example of a measurement result of urine FLC.
  • Two lines in the figure indicate the cut-off value of the ⁇ / ⁇ ratio determined by ROC analysis.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a BJP test method (algorithm) when the FLC measurement method and the electrophoresis method are combined.
  • the sample used in the present invention is not particularly limited as long as it is a urine sample.
  • a urine collection form (urine with preservatives, daily urine, early morning urine, etc.) collected clinically is used as a sample. Can be used.
  • the present invention provides a method for assaying BJP positivity by Imnoassay (Method 1), and a method for assaying BJP in a urine sample by specific steps using electrophoresis and Imnoassay (Method 2). Encompasses the two methods of
  • the content of the FLC / c chain and the FLCA chain in the urine sample is measured by the Imnoassay, and the amount ratio ( ⁇ ratio) is obtained, and the ⁇ specific power SO. 1 ⁇ If it is 0.05 or less or 5.5 ⁇ 2.75 or more, it is a BJP test method that determines that BJP is positive.
  • the immunoassay used in the present invention is not particularly limited as long as it can measure the free imnoglobulin K chain and the free immunoglobulin I chain in urine.
  • the quantitative ratio ( ⁇ ratio) was calculated based on the measured values of the K chain and the I chain of FLC, and the ⁇ / 1 ratio was 0.1 ⁇ 0.05 or less or 5.5 soil. 2. If it is 75 or more, it is judged as BJP positive.
  • the ratio used as an indicator is determined by the operating characteristics of the patient (ROC) analysis (Clin. Chem., 1993, 39, 561-577). Therefore, even when compared with the results of the immunofixation method, the positive predictive value of the BJP test is 80% or more, so that it is 0.1 ⁇ 0.05 or less or 5.5 ⁇ 2.75 or more, preferably By using the criteria of 0.1 ⁇ 0.03 or less or 5.5 ⁇ 1.65 or more, diagnosis can be performed with high accuracy.
  • the positive prediction rate refers to the percentage (%) of the sample that showed a BJP positive result actually associated with BJP (see Example (4)).
  • this ratio may vary depending on the target patient group, it is necessary to set a clinically appropriate ratio each time within the above range.
  • the method for testing BJP in a urine sample by using both electrophoresis and Immonoassay is preferably performed in the following order of step 1, step 2, and step 3, but steps 1 and 2 are reversed. It does not matter.
  • Step 1 is a step for confirming the presence of M protein in the urine sample by electrophoresis.
  • the electrophoresis method used in the present invention is a known method.
  • Step 2 is a step of measuring the respective contents of the free immunoglobulin ⁇ chain and the free immunoglobulin; chain in the urine sample in the same manner as in the above-described Imuno-Assy, and obtaining the amount ratio ( ⁇ ratio). .
  • Step 3 is a step for judging that there is a suspicion of BJP negative, BJP positive, and / or BJP positive for each case, using the presence or absence of ⁇ protein and the ⁇ ratio as indices.
  • 0.1 ⁇ 0.05 or less or 5.5 ⁇ 2.75 or more, preferably 0.1 ⁇ 0.03 or less A value of 5 ⁇ 1.65 or more was adopted as the ⁇ / ⁇ ratio, the M protein was confirmed in step 1, and the ⁇ ratio obtained in step 2 was 0.1 ⁇ 0.05 or less or 5.5. If it is ⁇ 2.75 or more, it can be determined that BJJ is positive.
  • the diagnostic accuracy of the BJ ⁇ test is at least 80%, preferably at least 90%, specifically, as shown in the Examples below. , 0.2 ⁇ 0.1 and 1.67 ⁇ 0.84, preferably 0.2 ⁇ 0.03 and 1.67 A numerical value within the soil 0.5 range can be adopted as the ⁇ ratio.
  • the determination of BJP is based on the presence or absence of the M protein Judgment is made in the following four cases from the result of the ⁇ ratio. In other words, in case ⁇ , it is determined that BJP is positive, and in case: B and C, it is determined that BJP is suspected, and the presence or absence of BJP is further confirmed by the immunofixation method. Judge as negative.
  • the M protein was confirmed, and the / 1/1 ratio was 0.2 ⁇ 0.1 or less or 1.67 ⁇ 0.84 or more.
  • the M protein was confirmed, and the ⁇ I ratio was more than 0.2 ⁇ 0.1 and less than 1.67 ⁇ 0.84.
  • the ⁇ ratio was 0.2 ⁇ 0.1 or less or 1.67 ⁇ 0.84 or more.
  • ⁇ No protein was confirmed, and the ⁇ ratio was more than 0.2 ⁇ 0.1 and less than 1.67 ⁇ 0.84.
  • the immunofixation method was performed using a Helena kit.
  • the antiserum used for the immunoassay was purchased from Dako. Urine samples were concentrated up to 100-fold as needed.
  • the FLC assay was performed according to the literature (J. Immunol. Methods, 2003, 275, 9-17). That is, a sample or a standard concentration solution was added every 100 1 to a 96-well microplate (Nunc) coated with a monoclonal antibody, and reacted at room temperature for 2 hours. After washing, 100 ⁇ of each of the anti- ⁇ light chain antibodies and 100 ⁇ of horseradish peroxidase-labeled anti-light chain antibodies were added as secondary antibodies and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, wash with PBS containing 0.05% Tween 20,
  • the diagnostic accuracy was evaluated using a calculation method generally used in the field of clinical testing. That is, the presence or absence of BJP is used as a control, and is classified as shown in Table 1 by the immunoassay method as a reference method and the method of the present invention as an evaluation object.
  • Sensitivity Calculated by the formula a / (a + b) x 100, and means the proportion of samples that showed a positive test result among BJP positive samples.
  • Positive prediction rate calculated by the formula a / (a + C ) x 100, means the proportion of samples that actually have BJP among the samples that show BJP-positive test results.
  • Accuracy Calculated by the formula (a + d) (a + b + c + d) x 100, and means the proportion of samples tested positive or negative for BJP correctly.
  • the statistical analysis software package (StatF1ex) was used for the analysis of the patient's operating characteristics (ROC).
  • Table 3 shows the results of the immunofixation method for the immunoassay and electrophoresis methods.
  • BJP was identified in 58 cases by immunofixation, and intact immunoglobulin M protein was detected in 14 cases.
  • M band was observed in 50 of 58 BJP-positive cases.
  • d Number of specimens in which abnormalities in ⁇ / ⁇ ratio were observed (c: ratio is 0.2 or less or 1.67 or more).
  • BJP Benth Jones protein.
  • the method of the present invention using the cutoff value as described above allows It is clear that the assay can be performed with a sensitivity of 89.7% (52 of 58 samples), a specificity of 81.6% (187 of 229), and an accuracy of 84.3% (242 of 287). It has become possible to easily extract highly-reactive samples.
  • the method of the present invention it is possible to provide, for the first time, a simple and highly reliable BJP test method by performing determination by a fixed processing procedure (algorithm) by combining ImnoAssy alone or by combining ImnoAssy and electrophoresis. It becomes.
  • the BJP subclass can be identified at the same time by measuring the contents of urinary free immunoglobulin K chain and urinary free immunoglobulin; I chain, and determining the amount ratio. It is possible, and it is possible to reduce the number of inspections under the fixed duty method, which is a confirmation inspection, to about 1-6.

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Abstract

A method of calibrating a Bence-Jones protein (BJP) in a urine sample by employing a combination of electrophoresis with immunoassay and performing the following steps: (1) step 1: the step of confirming the presence of M protein in the urine sample by electrophoresis; (2) step 2: the step of quantifying free immunoglobulin κ chain and free immunoglobulin λ chain in the urine sample by immunoassay and determining the content ratio (κ/λ ratio) thereof; and (3) step 3: the step of judging as BJP-positive in the case where the presence of M protein is confirmed and the κ/λ ratio is not more than 0.1±0.05 or not less than 5.5±2.75.

Description

明細書  Specification
ベンスジヨーンズ蛋白質の検定法 技術分野  Assay method for Benth Dijons protein
本発明は、 尿蛋白電気泳動法とィムノアツセィとを併用した尿中ベンスジョ一 ンズ蛋白質の効率的な検定法に関するものである。 背景技術  TECHNICAL FIELD The present invention relates to an efficient method for assaying urinary vents joint protein using urine protein electrophoresis and Immnothase together. Background art
ィムノグロプリン重鎖と解離した状態のモノクロ一ナルな遊離ィムノグロブリ ン軽鎖 （Free light chain： F L C ) は、 形質細胞異常などの血液疾患、 特に多 発性骨髄腫やマクログロプリン血症に見い出されるモノクローナル蛋白質 （M蛋 白質） の 1つである （Br. J. Haematol. , 1969， 16, 599-606)。  Monoclonal free light chain (FLC), which is dissociated from the immunoglobulin heavy chain, is a monoclonal protein found in blood diseases such as plasma cell abnormalities, particularly in multiple myeloma and macroglobulinemia. (M protein) (Br. J. Haematol., 1969, 16, 599-606).
1 8 4 7年、 Henry Bence Jones は患者尿の特異な熱凝集反応を発見し、 その 原因となったタンパク質をべンスジヨーンズ蛋白質（Bence Jones protein： B J P ) と命名した （Lancet, 1847, 2, 88-92)。 その本態は尿中のモノクローナルな F L Cであることが、 後に明らかとなった。  In 1847, Henry Bence Jones discovered a specific thermal agglutination reaction in patient urine, and named the protein responsible for it as Bence Jones protein (BJP) (Lancet, 1847, 2, 88). -92). It was later revealed that the substance was monoclonal FLC in urine.
B J Pは多発性骨髄腫などの有用な臨床マーカーであり、 その検定は日常の臨 床検査の 1つの項目として実施されている。 B J Pは、 分子量が小さく、 糸球体 を容易に通過し、 そのほとんどが尿中に移行するため、 実際の臨床検査の場にお いては、尿中の B J Pを電気泳動法で検出している （DRG/PPS対応 臨床検査ガイ ドライン 第 2次案， 2000， p. 78- 82)。  BJP is a useful clinical marker such as multiple myeloma, and its test is performed as an item of routine clinical examination. BJP has a small molecular weight, easily passes through glomeruli, and most of it is transferred into urine. Therefore, in actual clinical tests, BJP in urine is detected by electrophoresis ( DRG / PPS Compatible Clinical Laboratory Guidelines Second Draft, 2000, pp. 78-82).
電気泳動法による B J Pの測定を、 一般に "スクリーニングアツセィ" もしく は単に "スクリーニング" と称している。 通常、 ヒト検体中のィムノグロプリン はポリクローナルな組成であるため、 電気泳動を実施した場合、 検体中のィムノ グロブリンはブロードなパンドを示す。 一方、 M蛋白質は単一な電荷を持ち、 シ ングルパンド （Mパンド） を示すため、 電気泳動法により両者を識別することが 可能である。  The measurement of BJP by electrophoresis is commonly referred to as "screening" or simply "screening." Normally, immunoglobulin in a human sample has a polyclonal composition, so when electrophoresis is performed, the immunoglobulin in the sample shows a broad band. On the other hand, since the M protein has a single charge and shows a single band (M band), it is possible to distinguish between the two by electrophoresis.
尿蛋白の電気泳動法は B J Pのスクリーニング方法として広く採用されている ものの、 その検出感度や特異性は分析システムや尿の検査前濃縮の程度等に依存 し、 必ずしも満足できる方法とは言えない。 たとえば、 電気泳動の支持体として 広く用いられているセルロースァセテ一ト膜はィムノグロプリンの分解能が悪く 、 また、 泳動後の蛋白検出用染色色素の種類によってもその検出感度は変化し、 結果として電気泳動法は低感度とならざるを得ない。 さらに、 尿をサンプルとし て使用するため、 予め尿を濃縮する必要があるが、 その場合の濃縮の程度も明確 に定められていない。 Urine protein electrophoresis is widely used as a screening method for BJP, but its detection sensitivity and specificity depend on the analysis system and the degree of urine preconcentration before testing. However, it is not always a satisfactory method. For example, cellulose acetate membrane, which is widely used as a support for electrophoresis, has poor resolution of imnoglobulin, and its detection sensitivity also changes depending on the type of staining dye for protein detection after electrophoresis. The electrophoresis method must have low sensitivity. Furthermore, since urine is used as a sample, it is necessary to concentrate urine in advance, but the degree of concentration in that case is not clearly defined.
したがって、 電気泳動法を用いた B J Pのスクリーニング方法は、 施設間での 検査精度の差が大きく、 臨床検査としては様々な問題を内在している。 実際、 近 年行われた各施設間のコントロールサーベイでは、 6 0 m g Z d 1の B J Pがお よそ 3 0 %の施設で見逃されていることが明らかとなり、 問題となっている。 加えて、 上記電気泳動法ではィムノグロプリンの免疫表現型 （サブクラス） を 同定することができないため、 免疫固定法 （もしくは免疫電気泳動法） を用いて 検出された M蛋白質のサブクラス （B J P、 I g G型 M蛋白質、 又は I g M型 M 蛋白質等） を確認する必要がある。 また、 これらの確認検査で用いる免疫固定法 は、 非常に煩雑で、 かつ検査単価が高額であるため、 臨床検査の場においては、 最初に電気泳動法で M蛋白質をスクリーニングし、 次いで免疫固定法で B J Pを 確定する手法をとらざるを得ないのが現状である。 発明の開示  Therefore, the BJP screening method using electrophoresis has a large difference in test accuracy between facilities, and has various problems inherent in clinical tests. In fact, a recent control survey between facilities revealed that 60 mg Bd of Zd1 was overlooked in about 30% of the facilities, which is a problem. In addition, since the immunophenotype (subclass) of immunoglobulin cannot be identified by the above-mentioned electrophoresis, the subclass (BJP, IgGG) of the M protein detected using the immunofixation (or immunoelectrophoresis) method Type M protein or IgM type M protein). In addition, since the immunofixation method used in these confirmation tests is very complicated and the cost of the test is high, in a clinical test setting, the M protein is first screened by electrophoresis, and then the immunofixation method is used. At present, it is necessary to take a method to determine BJP. Disclosure of the invention
このような現状を克服し、 電気泳動法とィムノアッセィとの 2種類の方法を使 用し、 検査の信頼性を向上させ、 また確定検査にあたる免疫固定法の実施回数を 少なくすることができるか否かに関し、 検討した報告がある （Clin. Chim. Acta ， 1997， 262, 121- 130)。 すなわち、 上記報告においては、 電気泳動法、 ィムノア ッセィ、 免疫固定法のそれぞれの結果を対比し、 インタタトなィムノグロブリン に結合している軽鎖も含めた、尿中の/ c型軽鎖と； I型軽鎖との全体（total) 量及 びその量比 （total 量と 比） に異常がなく、 かつ電気泳動法で異常なパン ドが認められない場合には、 B J P陰性と判断可能なことを示唆している。  Overcoming this situation, whether two methods, electrophoresis and Imnoassay, can be used to improve the reliability of the test and to reduce the number of times the immunofixation method, which is a definitive test, must be performed There are reports that have been considered (Clin. Chim. Acta, 1997, 262, 121-130). That is, in the above report, the results of the electrophoresis method, the immunoassay, and the immunofixation method were compared, and the urinary / c-type light chain, including the light chain bound to intact immunoglobulin, was BJP-negative can be determined if there is no abnormality in the total (total) amount with the type I light chain and its ratio (to the total amount) and no abnormal band is observed by electrophoresis. Suggest that.
しかし、 上記検討には以下に示すような種々の問題があり、 実際の臨床検査の 場に置いて使用するに当たり、 必ずしも信頼性できる結論とはなっていない。 ( 1 ) 感度の問題 However, the above study has various problems as described below, and is not always a reliable conclusion when used in actual clinical laboratory settings. (1) Sensitivity problem
上記検討の結果、 感度は 1 0 0 %であると結論付けているが、 必ずしも B J P 特異的とは言えない。 すなわち、 インタタトなィムノグロブリンに結合している 軽鎖も含めた、尿中の/ c型軽鎖と λ型軽鎖の全体 （total) を定量し、 その量と比 を算出しているが、 インタタトなィムノグロブリン M蛋白質 （例えば I g G— κ 一 M蛋白質など） が尿中に存在する場合、 F L C特異的でなく、 軽鎖全量を測定 するィムノアッセィではその量と比が必然的に異常となる。 この量及ぴ比の異常 は B J P以外のィムノグロブリン M蛋白質の存在に由来する異常であり、 必ずし も B J P特異的とは言えない。 ここで感度とは B J Pを伴う尿検体のうち、 陽性 の結果を示した検体の割合 （％) をいう （実施例 （4 ) を参照）。  As a result of the above examination, it was concluded that the sensitivity was 100%, but it is not necessarily BJP-specific. That is, the total (total) of the / c-type light chain and the λ-type light chain in urine, including the light chain bound to the intact immunoglobulin, is quantified, and the amount and ratio are calculated. However, if an intact immunoglobulin M protein (for example, IgG-κM protein) is present in urine, the amount and ratio of the immunoglobulin, which is not FLC-specific and measures the total amount of light chain, is inevitable. It becomes abnormal. This abnormality in the amount and ratio is due to the presence of an immunoglobulin M protein other than BJP and is not necessarily BJP-specific. Here, the sensitivity refers to a percentage (%) of a urine sample with BJP that showed a positive result (see Example (4)).
また、 上記検討で採用したィムノアツセィの測定感度は悪く、 試験に供したサ ンプルの約半数は測定感度以下となって、 以後の検討がなされておらず、 信頼性 のあるデータとはいえない。  In addition, the measurement sensitivity of Imnoatssey used in the above study was poor, and about half of the samples subjected to the test were below the measurement sensitivity, and no further studies were conducted, so it cannot be said that the data is reliable.
( 2 ) 確認検查回数削減の問題  (2) Problem of reducing the number of confirmation inspections
上記検討の結果、 免疫固定法による確認検査の回数を 5 2 %削減できると結論 付けているが、 電気泳動法とィムノアッセィとの 2種類の方法を組み合わせたメ リットが全く示されていない。 すなわち、 上記報告では電気泳動法による検查結 果をィムノアツセィで単に確かめただけであって、 電気泳動で M蛋白質を示す検 体はィムノアツセィの結果に係わらず、 免疫固定法の確認検査を必要としており 、 従来の手法と変わるところがない。 なぜ確認検査を 5 2 %削減できることの根 拠が示されていない。  The above study concludes that the number of confirmation tests by immunofixation can be reduced by 52%, but there is no indication of the advantage of combining the two methods, electrophoresis and Imnoassay. In other words, in the above report, the results of the electrophoresis test were simply confirmed by Immonoassay, and the samples showing the M protein by electrophoresis require confirmation tests by immunofixation regardless of the results of Imnoassay. There is no difference from the conventional method. There is no rationale for reducing confirmation testing by 52%.
また、 免疫固定法による確認検査において、 電気泳動法で M蛋白質が検出され ない場合であっても B J P陽性であるケースがあり、 M蛋白質が確認されない場 合、 ィムノアツセィの結果に係わらず、 すべて B J P陰性 （N O B J P ) と結 論付けるのは強引に過ぎ、 科学的な信頼性も低い。  In addition, in the confirmation test using the immunofixation method, there are cases where BJP is positive even if the M protein is not detected by electrophoresis, and if the M protein is not confirmed, all BJP is irrespective of the results of the immunoassay. Negative (NOBJP) conclusions are too aggressive and have low scientific credibility.
本発明者らは、 より現実的で、 効率的な B J Pの検定法に関し、 鋭意検討を重 ねた結果、 （1 ) ィムノアッセィにおける F L Cの K鎖と λ鎖の比 （κ Ζ λ比） を 基に、 B J P陽性を判定できること、 （2 )電気泳動法とィムノアツセィとを併用 し、 電気泳動における M蛋白質の有無とィムノアッセィにおける F L Cの/ c鎖と λ鎖の比 （κ/ 比） を基に、 一定の処理手順 （アルゴリズム） により判断する ことで、 効率的に B J Ρを検定することができることを見出し、 本発明を完成さ せた。 The present inventors have conducted intensive studies on a more realistic and efficient BJP test method. (1) Based on the ratio (K と λ ratio) of the KC and λ chains of FLC in Imnoassay. (2) The use of both electrophoresis and Imnoassay to determine the presence or absence of the M protein in electrophoresis and the / c chain of FLC in Imnoassay The present inventors have found that BJ で き る can be tested efficiently by making a judgment based on a constant processing procedure (algorithm) based on the ratio of λ chains (κ / ratio), and completed the present invention.
すなわち、 本発明は、 以下の内容を包含する。  That is, the present invention includes the following contents.
[1] 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することに より尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。  [1] A method that uses the combined use of electrophoresis and Immnothassy to perform the following steps to test for venjiziones protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロブリン κ鎖と遊離ィムノグロ プリン; I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求めるステップ The step of measuring the content of free immunoglobulin κ chain and free immunoglobulin; I chain in a urine sample by an immunoassay and determining the ratio (κΖλ ratio)
(3) ステップ 3  (3) Step 3
Μ蛋白質が確認され、 κ/λ j;匕力 S0， 1 ±0. 05以下又は 5. 5 ±2. 75 以上である場合には B J P陽性と判断するステップ ス テ ッ プ Step to judge BJP positive if protein is confirmed and κ / λ j; dangling force S0, 1 ± 0.05 or less or 5.5 ± 2.75 or more
[2] ステップ 1、 ステップ 2、 ステップ 3の順で行う、 上記 [1] 記載の方法  [2] The method described in [1] above, in which step 1, step 2, and step 3 are performed in this order.
[3] ステップ 2、 ステップ 1、 ステップ 3の順で行う、 上記 [1] 記載の方法 [3] The method described in [1] above, in which step 2, step 1, and step 3 are performed in this order.
[4] 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することに より尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。 [4] A method that uses a combination of electrophoresis and ImmonoAssy to perform the following steps to assay for ventilated dionez protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン κ鎖と遊離ィムノグロ プリン; I鎖との含有量を測定し、 その量比 / 比) を求めるステップ The step of measuring the content of free immunoglobulin κ chain and free immunoglobulin; I chain in urine sample by immunoassay and determining the amount ratio / ratio)
(3) ステップ 3 (3) Step 3
M蛋白質が確認され、 《ノ；1比が0. 2±0. 1以下又は 1. 67±0. 84 以上である場合には B J P陽性と判断するステップ  If the M protein is confirmed, and the ratio is less than 0.2 ± 0.1 or 1.67 ± 0.84 or more, the step to judge BJP positive
[5] 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することに より尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。 [5] Using the electrophoresis method and Imnoattsie together, A method to test for Benth Diones protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン κ鎖と遊離ィムノグロ ブリン； I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κ/λ比） を求めるステップThe step of measuring the content of the free imnoglobulin κ chain and the free imnoglobulin; I chain in the urine sample by the immunoassay and obtaining the amount ratio (κ / λ ratio)
(3) ステップ 3 (3) Step 3
Μ蛋白質が確認され、 比が 0. 2±0. 1超かつ 1. 67±0. 84未 満である場合には B J P陽性の疑いありと判断するステップ  ス テ ッ プ If the protein is confirmed and the ratio is more than 0.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84, it is judged that BJP positive is suspected.
[6] 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することに より尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。  [6] A method for assaying for venjiziones protein (BJP) in urine samples by using electrophoresis in combination with Immunity and performing the following steps.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロブリン κ鎖と遊離ィムノグロ ブリン; L鎖との含有量を測定し、 その量比 （κ/λ比） を求めるステップThe step of measuring the content of free immunoglobulin κ chain and free immunoglobulin; light chain in a urine sample by an immunoassay and determining the ratio (κ / λ ratio)
(3) ステップ 3 (3) Step 3
Μ蛋白質が確認されず、 « ；1比が0. 2±0. 1以下又は 1. 67±0. 8 4以上である場合には B J P陽性の疑いありと判断するステップ  ス テ ッ プ If protein is not confirmed and «; 1 ratio is 0.2 ± 0.1 or less or 1.67 ± 0.84 or more, the step of determining that BJP positive is suspected
[7] 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することに より尿試料中の B J Pを検定する方法。  [7] A method for testing BJP in urine samples by using the following steps, in combination with electrophoresis and Imnoassy.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン κ鎖と遊離ィムノグロ ブリン I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求めるステップ A step of measuring the content of free imnoglobulin κ chain and free imnoglobulin I chain in a urine sample using an imnoassay and determining the ratio (κΖλ ratio)
(3) ステップ 3 (3) Step 3
Μ蛋白質が確認されず、 《 1比が0. 2±0. 1超かつ 1. 67±0. 84 未満である場合には B J P陰性と判断するステップ [8] ステップ 1、 ステップ 2、 ステップ 3の順で行う、 上記 [4] 〜 [7] の いずれかに記載の方法。 ス テ ッ プ No protein is confirmed, << Step for determining BJP negative if the ratio is more than 0.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84 [8] The method according to any one of [4] to [7], wherein step 1, step 2, and step 3 are performed in this order.
[9] ステップ 2、 ステップ 1、 ステップ 3の順で行う、 上記 [4] 〜 [7] の いずれかに記載の方法。  [9] The method according to any one of [4] to [7], wherein step 2, step 1, and step 3 are performed in this order.
[10] 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施すること により尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。  [10] A method that uses the combined use of electrophoresis and ImmonoAssy to perform the following steps to test for venjiziones protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロブリン κ鎖と遊離ィムノグロ ブリン; I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求めるステップ  The step of measuring the content of free immunoglobulin κ chain and free immunoglobulin; I chain in a urine sample by an immunoassay and determining the ratio (κΖλ ratio)
(3) ステップ 3  (3) Step 3
Μ蛋白質の有無と κΖλ比を指標に、 ケース Αの場合には B J P陽性と判断し 、 ケース Bと Cの場合には B J P陽性の疑いありと判断し、 免疫固定法で B J P の有無をさらに確認し、 ケース Dの場合には B J P陰性と判断するステップ (ケース A)  に Based on the protein presence and the κΖλ ratio as indicators, in case Α it is determined that BJP is positive.In cases B and C, it is determined that BJP is positive, and the presence or absence of BJP is further confirmed by immunofixation. Step of determining BJP negative in case D (Case A)
M蛋白質が確認され、 《 ； 比が0. 2±0. 1以下又は 1. 67士0. 84 以上である。  The M protein was confirmed, and the ratio was 0.2 ± 0.1 or less or 1.67 / 0.84 or more.
(ケース  (Case
M蛋白質が確認され、 κノ L比が 0. 2±0. 1超かつ 1. 67±0. 84未 満である。  The M protein was confirmed, and the κ L ratio was more than 0.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84.
(ケース C)  (Case C)
M蛋白質が確認されず、 1? / 1比が0. 2士 0. 1以下又は 1. 67±0. 8 4以上である。  No M protein was found, and the 1: 1 ratio was 0.2 or less, 0.1 or less, or 1.67 ± 0.84 or more.
(ケース D)  (Case D)
M蛋白質が確認されず、 κ,λ比が 0. 2±0. 1超かつ 1. 67±0. 84 未満である。  No M protein was identified, and the κ, λ ratio was more than 0.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84.
[11] ステップ 1、 ステップ 2、 ステップ 3の順で行う、 上記 [10] 記載の 方法。 [12] ステップ 2、 ステップ 1、 ステップ 3の順で行う、 上記 [10] 記載の 方法。 [11] The method according to [10], wherein step 1, step 2, and step 3 are performed in this order. [12] The method according to [10], wherein step 2, step 1, and step 3 are performed in this order.
[13] ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロブリン κ鎖と遊離ィム ノグロプリン I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求め、 比 が 0. 1 ±0. 05以下又は 5. 5 ±2. 75以上である場合には B J Ρ陽性と 判断するべンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) の検定法。 図面の簡単な説明  [13] Using the immunoassay, the content of the free immunoglobulin κ chain and the free immunoglobulin I chain in the urine sample was measured, and the ratio (κΖλ ratio) was determined. The ratio was 0.1 ± 0.05 or less. Or, if it is 5.5 ± 2.75 or more, a method for testing Benz Dijons protein (BJP), which is judged to be positive for BJΡ. Brief Description of Drawings
図 1は、 ィムノアッセィにおける F LC測定法の標準曲線の一例を示す図であ る。  FIG. 1 is a diagram showing an example of a standard curve of an FLC measurement method in Imnoassy.
図 2は、 尿中 F LCの測定結果の一例を示す図である。 図中、 〇； B J P κ陽 性検体、 △； B J P λ陽性検体、 X； B J P陰性検体をそれぞれ示し、 図中の線 2本は ROC解析で決定した κ/λ比のカツトオフ値を示す。  FIG. 2 is a view showing an example of a measurement result of urine FLC. In the figure, 〇; BJP κ-positive sample, Δ: BJP λ-positive sample, X: BJPP-negative sample, respectively. Two lines in the figure indicate the cut-off value of the κ / λ ratio determined by ROC analysis.
図 3は、 F L C測定法と電気泳動法の組み合わせ時の B J P検定手法 （ァルゴ リズム） の一例を示す図である。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 3 is a diagram showing an example of a BJP test method (algorithm) when the FLC measurement method and the electrophoresis method are combined. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明で使用する試料は、 尿検体であれば特に限定されず、 具体的には臨床に て採取される尿採取形態 （保存剤添加尿、 1日尿、 早朝第一尿など） を試料とし て使用することができる。  The sample used in the present invention is not particularly limited as long as it is a urine sample. Specifically, a urine collection form (urine with preservatives, daily urine, early morning urine, etc.) collected clinically is used as a sample. Can be used.
本発明は、 上述したように、 ィムノアッセィにより B J P陽性を検定する方法 (方法 1) と、 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 特定のステップにより 尿試料中の B J Pを検定する方法 （方法 2) の 2つの方法を包含するものである  As described above, the present invention provides a method for assaying BJP positivity by Imnoassay (Method 1), and a method for assaying BJP in a urine sample by specific steps using electrophoresis and Imnoassay (Method 2). Encompasses the two methods of
(方法 1) (Method 1)
ィムノアッセィにより B J P陽性を検定する方法としては、 ィムノアツセィに より尿試料中の FLC /c鎖と FLCA鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ 比） を求め、 κΖλ比力 SO. 1 ±0. 05以下又は 5. 5 ±2. 75以上である 場合には、 B J P陽性と判断する B J Pの検定法である。 本発明で採用するィムノアッセィは、 尿中の遊離ィムノグロプリン K鎖と遊離 ィムノグロブリン I鎖とを測定できる方法であれば特に制限はない。 具体的には 、 尿において微量に存在する FLCに対して十分な測定感度を有し、 インタタト なィムノグロブリンに対する交差反応性をほとんど示さず（例えば 1 %以下）、尿 中の F L C以外の成分の影響を受けない方法が好適であり、 好ましくは本発明者 らが開発した酵素免疫測定法を例示することができる （J. Immunol. Methods, 2 003, 275, 9—17)。 As a method of testing for BJP positivity by the Imnoassay, the content of the FLC / c chain and the FLCA chain in the urine sample is measured by the Imnoassay, and the amount ratio (κΖλ ratio) is obtained, and the κΖλ specific power SO. 1 ± If it is 0.05 or less or 5.5 ± 2.75 or more, it is a BJP test method that determines that BJP is positive. The immunoassay used in the present invention is not particularly limited as long as it can measure the free imnoglobulin K chain and the free immunoglobulin I chain in urine. Specifically, it has sufficient measurement sensitivity for FLC present in a trace amount in urine, shows little cross-reactivity to intact immunoglobulin (for example, 1% or less), and contains components other than FLC in urine. A method which is not affected by the above is suitable, and preferably an enzyme immunoassay developed by the present inventors can be exemplified (J. Immunol. Methods, 2003, 275, 9-17).
測定後、 測定された FLCの K鎖と； I鎖との値を基に、 その量比 （κΖλ比） を算出し、 《/ 1比が0. 1±0. 05以下又は 5. 5土 2. 75以上である場 合には B J P陽性と判断する。 After the measurement, the quantitative ratio (κΖλ ratio) was calculated based on the measured values of the K chain and the I chain of FLC, and the << / 1 ratio was 0.1 ± 0.05 or less or 5.5 soil. 2. If it is 75 or more, it is judged as BJP positive.
B J P陽性検体は 比が大きく変動していることから、 後述実施例に示す ように、 指標として用いる 比は、 受診者動作特性 （ROC) 分析 （Clin. Chem. , 1993, 39, 561 - 577) により、 免疫固定法の結果と比較した場合でも B J P検定の陽性予測率が 80%以上の数値となるように、 0. 1 ±0. 05以下又 は 5. 5±2. 75以上、 好ましくは 0. 1 ±0. 03以下又は 5. 5± 1. 6 5以上という基準を用いて判定することで、 高い精度で診断することが可能とな る。 なお、 陽性予測率とは B J P陽性結果を示した検体が実際に B J Pを伴って いる割合 （％) をいう （実施例 （4) を参照のこと）。  Since the ratio of BJP-positive samples fluctuates greatly, as shown in the examples below, the ratio used as an indicator is determined by the operating characteristics of the patient (ROC) analysis (Clin. Chem., 1993, 39, 561-577). Therefore, even when compared with the results of the immunofixation method, the positive predictive value of the BJP test is 80% or more, so that it is 0.1 ± 0.05 or less or 5.5 ± 2.75 or more, preferably By using the criteria of 0.1 ± 0.03 or less or 5.5 ± 1.65 or more, diagnosis can be performed with high accuracy. The positive prediction rate refers to the percentage (%) of the sample that showed a BJP positive result actually associated with BJP (see Example (4)).
また、 対象となる患者群によってこの比は変動する事があり得るため、 上記範 囲内を目安に、 その都度臨床的に適切な比を設定する必要がある。  In addition, since this ratio may vary depending on the target patient group, it is necessary to set a clinically appropriate ratio each time within the above range.
(方法 2 ) (Method 2)
電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 尿試料中の B J Pを検定する方法は 、 以下のステップ 1、 ステップ 2、 ステップ 3の順で行うことが好ましいが、 ス テツプ 1とステップ 2は順序が逆であつてもかまわない。  The method for testing BJP in a urine sample by using both electrophoresis and Immonoassay is preferably performed in the following order of step 1, step 2, and step 3, but steps 1 and 2 are reversed. It does not matter.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
ステップ 1は、 電気泳動により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ である。  Step 1 is a step for confirming the presence of M protein in the urine sample by electrophoresis.
本発明で採用する電気泳動法とは、 公知の方法であり、 具体的には、 セルロー スァセテート膜ゃァガロースゲルなどを支持体とし、 検体に含まれる蛋白質を電 気的に泳動し、 泳動された蛋白質を染色法並びに物理化学的に検出する方法をいThe electrophoresis method used in the present invention is a known method. A method in which a protein contained in a sample is electrophoresed on a support such as a acetate membrane agarose gel or the like, and the electrophoresed protein is detected by staining and physicochemically.
Ό (High-Resolution Electrophoresis and Immunof ixation, 1994, 第 2章、 Bu tterworth-Heinemann)。 泳動後、 Mパンドの有無により M蛋白質の有無を判断す る。 Ό (High-Resolution Electrophoresis and Immunofixation, 1994, Chapter 2, Butterworth-Heinemann). After electrophoresis, the presence or absence of the M protein is determined based on the presence or absence of the M band.
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ステップ 2は、 上述したィムノアツセィと同様の方法により尿試料中の遊離ィ ムノグロプリン κ鎖と遊離ィムノグロブリン； 鎖とのそれぞれの含有量を測定し 、 その量比 （κΖ 比） を求めるステップである。 Step 2 is a step of measuring the respective contents of the free immunoglobulin κ chain and the free immunoglobulin; chain in the urine sample in the same manner as in the above-described Imuno-Assy, and obtaining the amount ratio (κΖ ratio). .
(3) ステップ 3  (3) Step 3
ステップ 3は、 Μ蛋白質の有無と κΖλ比とを指標に、 それぞれのケース毎に B J P陰性、 B J P陽性、 及び/または B J Ρ陽性の疑いありと判断するステツ プである。  Step 3 is a step for judging that there is a suspicion of BJP negative, BJP positive, and / or BJP positive for each case, using the presence or absence of Μ protein and the κΖλ ratio as indices.
B J P陽性のみを判定する目的では、 上記ィムノアツセィの時と同じ、 0. 1 ± 0. 0 5以下又は 5. 5 ± 2. 7 5以上、 好ましくは 0. 1 ± 0. 0 3以下又 は 5. 5 ± 1. 6 5以上という数値を κ/λ比として採用し、 ステップ 1で M蛋 白質が確認され、 ステップ 2で求めた κΖλ比が 0. 1 ±0. 0 5以下又は 5. 5 ± 2. 7 5以上である場合には、 B J Ρ陽性と判断することができる。  For the purpose of judging only BJP positivity, the same as in the case of the above-mentioned immortality, 0.1 ± 0.05 or less or 5.5 ± 2.75 or more, preferably 0.1 ± 0.03 or less A value of 5 ± 1.65 or more was adopted as the κ / λ ratio, the M protein was confirmed in step 1, and the κΖλ ratio obtained in step 2 was 0.1 ± 0.05 or less or 5.5. If it is ± 2.75 or more, it can be determined that BJJ is positive.
なお、 B J P陽性のみの判定は、 上述したようにィムノアッセィ単独 （方法 1 ) でも可能であるものの、 ステップ 1の電気泳動による M蛋白質の確認を追加し 、 これを加味して判断することで、 より確実な判定を行うことができる。  Although the determination of only BJP positivity can be performed by using Imnoassay alone (method 1) as described above, the addition of the confirmation of the M protein by electrophoresis in step 1 and the determination taking this into account, A reliable determination can be made.
次に、 B J P陽' 14のみならず、 陰性及ぴノ又は B J P陽性の疑いありまで判定 する目的では、 受診者動作特性 （ROC) 分析 （Clin. Chem. , 1993, 39, 561-5 77) により、 免疫固定法の結果と比較した場合でも B J Ρ検定の診断正確度が 8 0%以上、 好ましくは 9 0%以上の数値、 具体的には、 後述の実施例で示されて いるような、 B J Ρ陰性検体の測定値を効率よく排除できる数値である、 0. 2 ± 0. 1と 1. 6 7 ± 0. 84、 好適には 0. 2 ± 0. 0 3と 1. 6 7土 0. 5 範囲内の数値を κΖλ比として採用することができる。  Next, for the purpose of determining not only BJP positive 14 but also negative, positive, or suspected BJP positive, the operating characteristics of the examinee (ROC) analysis (Clin. Chem., 1993, 39, 561-577) Therefore, even when compared with the results of the immunofixation method, the diagnostic accuracy of the BJΡ test is at least 80%, preferably at least 90%, specifically, as shown in the Examples below. , 0.2 ± 0.1 and 1.67 ± 0.84, preferably 0.2 ± 0.03 and 1.67 A numerical value within the soil 0.5 range can be adopted as the κΖλ ratio.
この場合の B J Pの判定は、 ステップ 1の M蛋白質の有無とステップ 2の λ比との結果から以下の 4つのケースで判断する。 すなわち、 ケース Αの場合に は B J P陽性と判断し、 ケース: Bと Cの場合には B J P陽性の疑いありと判断し 、 免疫固定法で B J Pの有無を更に確認し、 ケース Dの場合に B J P陰性と判断 する。 In this case, the determination of BJP is based on the presence or absence of the M protein Judgment is made in the following four cases from the result of the λ ratio. In other words, in case Α, it is determined that BJP is positive, and in case: B and C, it is determined that BJP is suspected, and the presence or absence of BJP is further confirmed by the immunofixation method. Judge as negative.
(ケース A)  (Case A)
M蛋白質が確認され、 /€ 1比が0. 2 ± 0. 1以下又は 1. 6 7 ± 0. 84 以上である。  The M protein was confirmed, and the / 1/1 ratio was 0.2 ± 0.1 or less or 1.67 ± 0.84 or more.
(ケース  (Case
M蛋白質が確認され、 κノ I比が 0. 2 ± 0. 1超かつ 1. 6 7 ± 0. 8 4未 満である。  The M protein was confirmed, and the κI ratio was more than 0.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84.
(ケース C)  (Case C)
M蛋白質が確認されず、 κΖλ比が 0. 2 ± 0. 1以下又は 1. 6 7 ± 0. 8 4以上である。  No M protein was confirmed, and the κΖλ ratio was 0.2 ± 0.1 or less or 1.67 ± 0.84 or more.
(ケース D)  (Case D)
Μ蛋白質が確認されず、 κΖλ比が 0. 2 ± 0. 1超かつ 1. 6 7 ± 0. 84 未満である。  ΜNo protein was confirmed, and the κΖλ ratio was more than 0.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84.
[実施例] [Example]
以下、 実施例に基づき本発明を更に具体的に説明するが、 本発明は以下の実施 例に何ら限定されるものではない。  Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples, but the present invention is not limited to the following examples.
(実施例）  (Example)
(1) 尿検体  (1) Urine specimen
B J Pが疑われた患者 2 8 7例より採取された尿 2 8 7検体を用いた。 すべて の検体について日本臨床検査医学会のガイドライン （臨床病理， 20 0 2， 5 0 ; 4 3 8 -4 3 9) に従い、 連結不可能匿名化を行った。  287 urine samples collected from 287 patients with suspected BJP were used. All specimens were anonymized according to the guidelines of the Japanese Society of Clinical Laboratory Medicine (Clinical Pathology, 202, 50; 438-39).
(2) 電気泳動法ならびに免疫固定法  (2) Electrophoresis and immunofixation
電気泳動法ならぴに免疫固定法はへレナ社のキットを用いて実施した。 免疫固 定法に用いる抗血清はダコ社より購入した。 尿検体は必要に応じて最大 1 0 0倍 まで濃縮した。 (3) FLC測定法 For the electrophoresis method, the immunofixation method was performed using a Helena kit. The antiserum used for the immunoassay was purchased from Dako. Urine samples were concentrated up to 100-fold as needed. (3) FLC measurement method
F LC測定法については文献 （J. Immunol. Methods, 2003, 275, 9-17) に従 つて行った。 すなわち、 モノクローナル抗体をコートした 96穴マイクロプレー ト （Nu n c) に検体あるいは標準濃度溶液を 100 1毎加え、 室温で 2時間 反応させた。 洗浄した後、 二次抗体として抗 κ軽鎖型抗体ならぴに抗 軽鎖型抗 体の西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識体を各 100 1加え、 37°C、 30分反 応させた。 反応後、 0. 05% Twe e n 20を含む PB Sで洗浄し、 発色液 The FLC assay was performed according to the literature (J. Immunol. Methods, 2003, 275, 9-17). That is, a sample or a standard concentration solution was added every 100 1 to a 96-well microplate (Nunc) coated with a monoclonal antibody, and reacted at room temperature for 2 hours. After washing, 100 各 of each of the anti-κ light chain antibodies and 100 抗 of horseradish peroxidase-labeled anti-light chain antibodies were added as secondary antibodies and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, wash with PBS containing 0.05% Tween 20,
(OPD、 S i gma) を 100 μ 1毎分注し発色させた。 1 Ν硫酸にて発色を 停止後、 492 nmでの吸光度を測定した。 なお、 アツセィ用の緩衝液としては(OPD, Sigma) was dispensed every 100 μl to develop color. After stopping color development with 1 1 sulfuric acid, the absorbance at 492 nm was measured. As a buffer for Atsushi,
1%ゥシ血清アルブミンを含む 5 OmMトリス塩酸 （pH 7. 5) を使用した。 また、 スタンダードとしては、 尿中から単離精製した FLCを使用した。 標準曲 線の例を図 1に示す。 5 OmM Tris-HCl (pH 7.5) containing 1% serum albumin was used. FLC isolated and purified from urine was used as a standard. Figure 1 shows an example of a standard curve.
(4) 診断精度の評価  (4) Evaluation of diagnostic accuracy
診断精度の評価は臨床検査分野において一般的に用いられている計算方法を用 いた。 すなわち、 B J Pの有無を対照とし、 リファレンスの方法としての免疫固 定法と評価対象としての本発明法により表 1のように区分される。  The diagnostic accuracy was evaluated using a calculation method generally used in the field of clinical testing. That is, the presence or absence of BJP is used as a control, and is classified as shown in Table 1 by the immunoassay method as a reference method and the method of the present invention as an evaluation object.
[表 1]  [table 1]
表 1. 診断精度評価方法の例  Table 1. Examples of diagnostic accuracy evaluation methods
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Figure imgf000012_0001
この区分に基づき、 感度、 特異度、 陽性予想値、 正確度を以下のように定義し た。  Based on this classification, sensitivity, specificity, expected positive value, and accuracy were defined as follows.
感度：式 a/ (a + b) x 100で算出され、 B J P陽性検体の中で、 陽性の 検查結果を示した検体の割合を意味する。  Sensitivity: Calculated by the formula a / (a + b) x 100, and means the proportion of samples that showed a positive test result among BJP positive samples.
特異度：式 (c + d) x 100で算出され、 B J P陰性検体の中で、 陰性 の検査結果を示した検体の割合を意味する。  Specificity: Calculated by the formula (c + d) x 100, and means the proportion of samples that showed a negative test result among BJP negative samples.
陽性予測率：式 a / (a + C) X 100で算出され、 B J P陽性の検査結果を 示した検体の中で、 実際に B J Pを伴う検体の割合を意味する。 正確度：式 （a + d) （a + b + c + d) x 100で算出され、 検査された 検体のうち、 B J Pの陽性と陰性が正しく診断された検体の割合を意味する。 Positive prediction rate: calculated by the formula a / (a + C ) x 100, means the proportion of samples that actually have BJP among the samples that show BJP-positive test results. Accuracy: Calculated by the formula (a + d) (a + b + c + d) x 100, and means the proportion of samples tested positive or negative for BJP correctly.
(5) 統計解析  (5) Statistical analysis
受診者動作特性 （ROC) 分析には統計解析ソフトウェアパッケージ （S t a t F 1 e x) を用いた。  The statistical analysis software package (StatF1ex) was used for the analysis of the patient's operating characteristics (ROC).
(6) 結果  (6) Result
ィムノアツセィの測定結果より、 《/ぇ比0. 1又は 5. 5をカットオフとし た場合、 表 2に示すように、 該当する検体は 287例中 56例存在した。 その中 で、 κΖλ比 5. 5以上に該当する全 18例あり、 そのうち 16例が B J Ρ κ陽 性で、 B J P以外の 2例のうち 1例は、 免疫固定法でも分析不可能であった。 一 方、 κΖλ比 0. 1以下で該当する全 38例あり、 そのうち 29例が B J Ρλ陽 性であった。 残りの 9例のうち、 5例はインタクトイムノグロブリン Μ蛋白陽性 、 3例は B J Ρ陰性、 1例は免疫固定法で解析不能の検体であった。 このように 、 κΖλ比 0. 1又は 5. 5を基準として評価することにより、 免疫固定法で解 析不能だった 2検体を除いて計算すると、 83. 3%の陽性予測率 （54例中 4 5例） で B J Ρ陽性と判定できる。  Based on the results of the Imnoassesse measurement, when the << / ぇ ratio of 0.1 or 5.5 was used as the cutoff, as shown in Table 2, there were 56 of the 287 samples that were relevant. Among them, there were a total of 18 cases with a κΖλ ratio of 5.5 or more, 16 of which were BJΡκ positive, and one of the two cases other than BJP could not be analyzed by the immunofixation method. . On the other hand, there were a total of 38 cases with a κΖλ ratio of 0.1 or less, of which 29 cases were BJΡλ-positive. Of the remaining 9 cases, 5 were intact immunoglobulin Μ protein positive, 3 were BJ J negative, and 1 was a sample that could not be analyzed by immunofixation. In this way, the evaluation based on the κ 比 λ ratio of 0.1 or 5.5 excluding two samples that could not be analyzed by the immunofixation method yielded a positive predictive rate of 83.3% (out of 54 cases). 4 5 cases) can be judged as BJ Ρ positive.
[表 2]  [Table 2]
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0001
a：インタクト Mタンパク質 a: Intact M protein
b： ND, not detected (免疫固定法で感度以下であった検体） b: ND, not detected (Specimen whose sensitivity was lower than that of immunofixation)
次に、 ィムノアツセィ、 電気泳動法ならぴに免疫固定法の結果を表 3に示す。 表 3から明らかなように、 287臨床尿検体のうち免疫固定法により 58例に B J Pが同定され、 14例にインタクトイムノグロプリン Mタンパク質が検出され た。 また、 尿蛋白の電気泳動法では B J P陽性の 58例中 50例に Mパンドが観 察された。  Next, Table 3 shows the results of the immunofixation method for the immunoassay and electrophoresis methods. As is clear from Table 3, out of 287 clinical urine samples, BJP was identified in 58 cases by immunofixation, and intact immunoglobulin M protein was detected in 14 cases. In the urine protein electrophoresis method, M band was observed in 50 of 58 BJP-positive cases.
[表 3] 表 3. 尿中 Mタンパク質の分析結果 [Table 3] Table 3. Results of urinary M protein analysis
同定 a N Mハ'ンド c 異常 Κ / λ比 d Identification a NM Hand c Abnormal Κ / λ ratio d
BJP陽性 58 50 52  BJP positive 58 50 52
BJP κ 22 19 20  BJP κ 22 19 20
BJP λ 36 31 32  BJP λ 36 31 32
BJP陰性 229 12 42  BJP negative 229 12 42
インタクト Mタンパク質 14 12 7  Intact M protein 14 12 7
Mタンパク質陰性 132 0 23  M protein negative 132 0 23
不明11 81 0 12 Unknown 11 81 0 12
合計 287 62 94  Total 287 62 94
a：免疫固定法による解析結果。 a: Analysis results by immunofixation.
b：免疫固定法で軽鎖の染色像が見えず、 解析不能であった検体。 b: Specimen that could not be analyzed by immunofixation with no visible light chain staining image.
°： Mパンドが検出された検体数。  °: Number of samples for which M band was detected.
d : κ/λ比の異常が観察された検体数 ( cノ; 比が 0.2以下又は 1.67以上）。 BJP：ベンスジヨーンズタンパク質。 d: Number of specimens in which abnormalities in κ / λ ratio were observed (c: ratio is 0.2 or less or 1.67 or more). BJP: Benth Jones protein.
また、 図 2に示すように、 B J P陽性検体の κΖλ比の中央値は B J P κ型で As shown in Fig. 2, the median κΖλ ratio of BJP-positive
55. 5、 8】卩 1型で0. 0012であった。 一方、 8 ？陰性検体では0.55.5, 8] It was 0.0012 for the kurun type 1. On the other hand, 8? 0 for negative samples.
63であった。 63.
これらのデータを基に、 ROC分析によりカットオフ値を 1. 67 (B J P κ 用） と 0. 2 (B J P A用） とに定め、 図 3に示すアルゴリズムにより電気泳動 と κΖλ比を組み合わせ、 287尿検体について解析を試みた。 その結果を表 4 に示す。  Based on these data, the cutoff values were determined to be 1.67 (for BJP κ) and 0.2 (for BJPA) by ROC analysis, and the electrophoresis and κΖλ ratio were combined using the algorithm shown in Fig. An attempt was made to analyze the specimen. The results are shown in Table 4.
表 4から明らかなように、 尿蛋白の電気泳動法で Μパンドが検出された 62例 のうち、 53例をケース Αと判断し、 そのうち 46検体 （86. 8%) が B J P 陽性であった。  As is evident from Table 4, out of 62 cases in which Μ was detected by urinary protein electrophoresis, 53 cases were judged to be case 46, of which 46 (86.8%) were BJP-positive .
また、 Mパンドが検出されなかった 225例のうち、 183例に ノ 1比の異 常は見られなかった。 このうち 98. 9% (183例中 181例） が B J P陰性 であった。  In addition, out of 225 cases in which M band was not detected, 183 cases showed no abnormalities in the no-1 ratio. Of these, 98.9% (181/183) were BJP negative.
さらに、 287例のうち 50例は Mパンドまたは 比の異常のどちらかを 示した。 このうち 10例は B J Ρ陽性であった。  In addition, 50 of the 287 patients showed either M band or abnormal ratios. Of these, 10 were BJΡ-positive.
このように、 上記のようなカットオフ値を用いた本発明方法により、 B J Pを 感度 89. 7% (58検体中 52例）、 特異度 81. 6 % ( 229例中 187例) 、 正確度 84. 3% (287例中 242例） で検定できることが明らかとなり、 B J Pの可能性の高い検体を容易に抽出する事が可能となった。 Thus, the method of the present invention using the cutoff value as described above allows It is clear that the assay can be performed with a sensitivity of 89.7% (52 of 58 samples), a specificity of 81.6% (187 of 229), and an accuracy of 84.3% (242 of 287). It has become possible to easily extract highly-reactive samples.
[表 4]  [Table 4]
表 4. κ,λ比と尿蛋白電気泳動法の組み合わせによる BJP診断結果  Table 4. BJP diagnosis results by combination of κ, λ ratio and urine protein electrophoresis
免疫固定法結果  Immunofixation results
インタタト  Intertart
ク トフ。 Mハ'ンド /lit N BJP 陰性 NDb 診断 Kutov. M hand / lit N BJP negative ND b diagnosis
Igsa Igs a
A 陽性 ≤0.2 or ≥1.67 53 46 7 0 0 BJP陽性 A positive ≤0.2 or ≥1.67 53 46 7 0 0 BJP positive
B 陽性 >0.2 and< 1.67 9 4 5 0 0 BJPの疑い c B positive> 0.2 and <1.67 9 4 5 0 0 Suspected BJP c
C 陰性 ≤0.2 or ≥1.67 41 6 0 23 12 BJPの疑い c C negative ≤0.2 or ≥1.67 41 6 0 23 12 BJP suspected c
D 陰性 〉0.2 and<l.67 184 2 2 109 71 BJP陰性 a：ィンタクト Mタンパク質。 D negative> 0.2 and <l.67 184 2 2 109 71 BJP negative a : Contact M protein.
b : ND， not detected (免疫固定法で感度以下であった検体）。 b: ND, not detected (samples that were less than sensitive by immunofixation).
c：免疫固定法で検討する必要あり。 産業上の利用可能性 c: Need to be examined by immunofixation. Industrial applicability
本発明の方法によれば、 ィムノアッセィ単独、 もしくはィムノアツセィと電気 泳動法を組み合わせ、 一定の処理手順 （アルゴリズム） により判断することで、 簡便かつ信頼性の高い B J Pの検定法を初めて提供することが可能となる。  According to the method of the present invention, it is possible to provide, for the first time, a simple and highly reliable BJP test method by performing determination by a fixed processing procedure (algorithm) by combining ImnoAssy alone or by combining ImnoAssy and electrophoresis. It becomes.
また、 本発明の方法では、 尿中の遊離ィムノグロプリン K鎖と尿中遊離ィムノ グロブリン; I鎖との含有量を測定し、 その量比を求めることによって、 B J Pサ ブクラスの同定も同時に行うことが可能で、 確認検査である免役固定法の検査数 を約 1ノ 6程度に削減することが可能である。 In addition, in the method of the present invention, the BJP subclass can be identified at the same time by measuring the contents of urinary free immunoglobulin K chain and urinary free immunoglobulin; I chain, and determining the amount ratio. It is possible, and it is possible to reduce the number of inspections under the fixed duty method, which is a confirmation inspection, to about 1-6.
なお、 本出願は、 日本で出願された特願 2003— 38861 7を基礎として おり、 その内容は本明細書にすべて包含されるものである。  This application is based on a patent application No. 2003-388617 filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することによ り尿試料中のベンスジョ一ンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。  1. A method for assaying Bence Jones protein (BJP) in urine samples by performing the following steps by using both electrophoresis and Imnoassy.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン κ鎖と遊離ィムノグロ ブリン; I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求めるステップ  Step of measuring the content of free imnoglobulin κ chain and free imnoglobulin; I chain in urine sample by Imnoassay and calculating the ratio (κΖλ ratio)
(3) ステップ 3  (3) Step 3
Μ蛋白質が確認され、 /€ノ 1比が0. 1±0. 05以下又は 5. 5士 2. 75 以上である場合には B J P陽性と判断するステップ  ス テ ッ プ If protein is confirmed and the ratio is less than 0.1 ± 0.05 or 5.5 or more than 2.75, the step to judge BJP positive
2. ステップ 1、 ステップ 2、 ステップ 3の順で行う、 請求項 1に記載の方法。 2. The method according to claim 1, wherein step 1, step 2, and step 3 are performed in this order.
3. ステップ 2、 ステップ 1、 ステップ 3の順で行う、 請求項 1に記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein step 2, step 1, and step 3 are performed in this order.
4. 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することによ り尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。 4. A method that uses the combined use of electrophoresis and ImnoAssy to perform the following steps to test for venjiziones protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン κ鎖と遊離ィムノグロ プリン; I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求めるステップ  The step of measuring the content of the free imnoglobulin κ chain and the free imnoglobulin; I chain in the urine sample by the immunoassay and determining the ratio (κΖλ ratio)
(3) ステップ 3  (3) Step 3
Μ蛋白質が確認され、 《 1比が0. 2±0. 1以下又は 1. 67±0. 84 以上である場合には B J P陽性と判断するステップ  ス テ ッ プ Protein is confirmed, << The step to judge BJP positive if the ratio is 0.2 ± 0.1 or less or 1.67 ± 0.84 or more
5. 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することによ り尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。  5. A method that uses the combination of electrophoresis and ImnoAssy to perform the following steps to test for Bence Diones protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロブリン/ c鎖と遊離ィムノグロ プリン; l鎖との含有量を測定し、 その量比 {κ/λ比) を求めるステップ (3) ステップ 3 Free immunoglobulin / c chain and free immunoglobulin in urine samples by Imnoassay. Step of measuring the content of purine and l-chain and determining the ratio (κ / λ ratio) (3) Step 3
Μ蛋白質が確認され、 κΖ 比力 SO. 2土 0. 1超かつ 1. 6 7±0. 84未 満である場合には B J P陽性の疑いありと判断するステップ  ス テ ッ プ If protein is confirmed and κΖ specific power SO.2 soil is more than 0.1 and less than 1.67 ± 0.84, it is judged that BJP positive is suspected
6. 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することによ り尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。  6. A method that uses the combination of electrophoresis and ImnoAssy to perform the following steps to test for Bence Diones protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステツプ  Step to confirm the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン c鎖と遊離ィムノグロ ブリン λ鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求めるステップ  A step of measuring the content of free imnoglobulin c-chain and free imnoglobulin λ-chain in a urine sample by an imnoassay and determining the ratio (κΖλ ratio)
(3) ステップ 3  (3) Step 3
Μ蛋白質が確認されず、 比が 0. 2±0. 1以下又は 1. 67±0. 8 Μ No protein was confirmed and the ratio was less than 0.2 ± 0.1 or 1.67 ± 0.8
4以上である場合には B J P陽性の疑いありと判断するステップ If the number is 4 or more, the step to judge that BJP positive is suspected
7. 電気泳動法とィム アツセィとを併用し、 次のステップを実施することによ り尿試料中のベンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。  7. A method that uses the combination of electrophoresis and immortality to perform the following steps to assay for ventilated dione protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロブリン κ鎖と遊離ィムノグロ プリン; I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κ_ λ比） を求めるステップ The step of measuring the content of free immunoglobulin κ chain and free immunoglobulin; I chain in a urine sample by the immunoassay and determining the ratio (κ_λ ratio)
(3) ステップ 3 (3) Step 3
Μ蛋白質が確認されず、 κΖλ比力 SO. 2±0. 1超かつ 1. 67±0. 84 未満である場合には B J P陽性と判断するステップ  ス テ ッ プ If protein is not confirmed and κΖλ specific power is more than SO.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84, step to judge BJP positive
8. ステップ 1、 ステップ 2、 ステップ 3の順で行う、 請求項 4〜 7のいずれか 一項に記載の方法。  8. The method according to any one of claims 4 to 7, wherein step 1, step 2, and step 3 are performed in this order.
9. ステップ 2、 ステップ 1、 ステップ 3の順で行う、 請求項 4〜7のいずれか 9. Any of Claims 4 to 7, which is performed in the order of Step 2, Step 1, and Step 3
—項に記載の方法。 —The method described in the section.
10. 電気泳動法とィムノアツセィとを併用し、 次のステップを実施することに より尿試料中のベンスジョ一ンズ蛋白質 （B J P) を検定する方法。 10. Combine the electrophoresis method and Imnoassy to perform the next step. A method for assaying Bence Jones protein (BJP) in urine samples.
(1) ステップ 1  (1) Step 1
電気泳動法により尿試料中の M蛋白質の存在を確認するステップ  Step of confirming the presence of M protein in urine sample by electrophoresis
(2) ステップ 2  (2) Step 2
ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン κ鎖と遊離ィムノグロ ブリン I鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖ 比） を求めるステップ  Step of measuring the content of free imnoglobulin κ chain and free imnoglobulin I chain in urine sample by Imnoassay and determining the ratio (κΖ ratio)
(3) ステップ 3  (3) Step 3
Μ蛋白質の有無と κΖλ比を指標に、 ケース Αの場合には B J P陽性と判断し 、 ケース Bと Cの場合には B J P陽性の疑いありと判断し、 免疫固定法で B J P の有無をさらに確認し、 ケース Dの場合には B J P陰性と判断するステップ (ケース A)  に Based on the protein presence and the κΖλ ratio as indicators, in case Α it is determined that BJP is positive.In cases B and C, it is determined that BJP is positive, and the presence or absence of BJP is further confirmed by immunofixation. Step of determining BJP negative in case D (Case A)
M蛋白質が確認され、 《ノ 1比が0. 2±0. 1以下又は 1. 67±0. 84 以上である。  The M protein was confirmed, and the ratio was less than 0.2 ± 0.1 or more than 1.67 ± 0.84.
(ケース B)  (Case B)
M蛋白質が確認され、 κ/λ比力 SO. 2±0. 1超かつ 1. 67±0. 84未 満である。  The M protein was confirmed, and the κ / λ specific power was more than SO.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84.
(ケース C)  (Case C)
M蛋白質が確認されず、 κ/λ比が 0. 2±0. 1以下又は 1. 67±0. 8 4以上である。  No M protein was confirmed, and the κ / λ ratio was 0.2 ± 0.1 or less or 1.67 ± 0.84 or more.
(ケース D)  (Case D)
Μ蛋白質が確認されず、 ；1比が0. 2±0. 1超かつ 1. 67±0. 84 未満である。  ΜNo protein was identified; 1 ratio was more than 0.2 ± 0.1 and less than 1.67 ± 0.84.
1 1. ステップ 1、 ステップ 2、 ステップ 3の順で行う、 請求項 10記載の方法  1 1. The method according to claim 10, wherein step 1, step 2, and step 3 are performed in this order.
12. ステップ 2、 ステップ 1、 ステップ 3の順で行う、 請求項 10記載の方法 12. The method according to claim 10, wherein step 2, step 1, and step 3 are performed in this order.
13. ィムノアッセィにより尿試料中の遊離ィムノグロプリン/ c鎖と遊離ィムノ グロブリン; L鎖との含有量を測定し、 その量比 （κΖλ比） を求め、 比が 0. 1 ±0. 05以下又は 5. 5 ±2. 75以上である場合には B J Ρ陽性と判 断するべンスジヨーンズ蛋白質 （B J P) の検定法。 13. Measure the content of free immunoglobulin / c chain and free immunoglobulin; L chain in urine sample by immunoassay, and determine the ratio (κΖλ ratio), and the ratio is 0.1 ± 0.05 or less. 5 ± 2. If it is 75 or more, it is judged as BJ Ρ positive. Assay method for Benz Jones protein (BJP)
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