WO2005058350A1 - Novel vaccines for treating or preventing infections by echinococus parasites - Google Patents

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WO2005058350A1
WO2005058350A1 PCT/FR2004/003188 FR2004003188W WO2005058350A1 WO 2005058350 A1 WO2005058350 A1 WO 2005058350A1 FR 2004003188 W FR2004003188 W FR 2004003188W WO 2005058350 A1 WO2005058350 A1 WO 2005058350A1
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WO
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seq
polypeptide
variants
polypeptides
parasites
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/003188
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French (fr)
Inventor
Georges Bosquet
Anne-Françoise PETAVY
Didier Saboulard
Samia Lahmar
Elisabeth Sarciron
Marion Guinet-Fraize
Original Assignee
Universite Claude Bernard Lyon I
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Ecole Nationale De Medecine Veterinaire
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite Claude Bernard Lyon I, Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.), Ecole Nationale De Medecine Veterinaire filed Critical Universite Claude Bernard Lyon I
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0003—Invertebrate antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/4355—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from cestodes
    • C07K14/43554—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from cestodes from Taenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Definitions

  • the subject of the present invention is new vaccines intended for the treatment or prevention of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular Echinococcus (E.) granulosus and therefore hydatidosis.
  • Hydatidosis is a zoonosis with worldwide distribution caused by the cestode E. granulosus.
  • the larval form of the parasite infects cattle, sheep, camelids, deer, etc., and humans; it forms hydatid cysts, the main but not exclusive localizations of which are the liver and the lungs. These cysts bud on their internal face the larvae proper, the protoscolex, which will infect the final hosts of the parasite.
  • the adult form develops in the intestine of canids in the duodenum from the ingested protoscolex; the eggs produced by the adult parasite are evacuated and disseminated with the faeces.
  • the prevalence can be very high both in cattle (up to 95% of sheep in certain districts in Tunisia and Morocco) and in dogs (70% of animals in the region of Fez, in Morocco)
  • the parasite is the source of considerable economic losses (for example, more than half of the noble organ meats must be destroyed in Morocco; the affected ewes present phenomena of wasting and loss in wool production).
  • the parasite is also the cause of a major human health problem: the prevalence in humans reaches 1.43 / 1000 in rural areas of the province of Rio Negro, in Argentina, 1.97 / 1000 in Xinjiang in China, 2.2 / 1000 in the Turkana district of Kenya, and values of 20% have been recorded locally in villages in the Peruvian Andes. For example, half of the liver surgeries in Morocco are linked to this parasite.
  • the current means of control are essentially at two levels: - the modification of breeding practices, including strict surveillance of dogs, vectors of dissemination, which feed on the offal of contaminated and rejected farm animals offal; these changes in practice often encounter application difficulties, particularly in developing countries; - the use of Praziquantel or Arauline dewormers, which are not, however, ovicidal.
  • a sheep vaccine has been developed from recombinant proteins expressed by the embryo (Lightowlers MW, 1996, Int. J. Parasitol., 26, pp836-842), but its application is proving cumbersome because if the efficacy is satisfactory, the duration of protection is short and the number of animals to be treated, and therefore to be handled, important (the entire herd for a breeder).
  • a cDNA library of Echinococcus granulosus in the lambda gt22 expression vector had been screened using serum from dogs infected with the parasite (3 months in protected breeding). All of the cDNA clones expressing the proteins recognized by the antibodies were analyzed a second time with the individual sera of infected dogs and the intensities of the reactions compared: the clone providing the strongest reaction with the sera of all the dogs had been retained and named EgA31. This publication therefore makes it possible to demonstrate the existence of circulating antibodies directed against the protein EgA31 in dogs infected with the parasite E. granulosus.
  • This cDNA codes for a protein rich in leucine, of putative helical structure, comprising a proline-rich domain of SH3 type (Sarc Homology 3 type 1) close to the terminal C region of the protein; these areas are involved in particular in protein-protein interactions.
  • SH3 type Sarc Homology 3 type 1
  • 28 phosphorylation sites and 4 putative myristylation sites can be identified using the PROSITE software.
  • the sequence SEQ ID No. 1 of EgA31 has been deposited (SwissProt) under the number AF 067 807.
  • Veterinary Immunology and Immunopathology 74, 195-208, 2000, the stimulation of cell proliferation in the popliteal and prescapular glands of the naive dog is shown after sensitization to the protein EgA31.
  • EgA31 protein of sequence SEQ ID No. 1
  • EgA31 protein of sequence SEQ ID No. 1
  • EgA31 protein of sequence SEQ ID No. 1
  • some of its fragments or variants exhibit an immunogenic activity of E. granulosus and cause, in particular in dogs, a modification of the response of the duodenum to subsequent infection with E. granulosus and can therefore be vaccinated against infections caused by this type of parasite.
  • the present invention therefore relates to new vaccines intended for the treatment or prevention of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, including vaccinating agent is (a) the protein of sequence SEQ ID No 1, or (b) one of its fragments having an immunogenic activity at least equivalent to the protein SEQ ID No 1, or (c) a variant of (a) or (b) which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunogenic activity at least equivalent to the latter.
  • the vaccines of the invention are intended for the treatment or prevention of hydatidosis or alveolar echinococcosis.
  • Hydatidosis is preferred. Indeed, the EgA3l protein of Echinococcus granulosus is present in the larva (protoscolex, germinal membrane) but especially in the adult of the parasite. At this stage, it is most abundant in the seed coat, at the level of microtrichs, zones of trophic exchanges between the parasite and its host. It is also present in Echinococcus multilocularis, a parasitic species very close to E. granulosus, and responsible in the northern hemisphere for alveolar echinococcosis, which can also be transmitted to humans by canids.
  • polypeptides are capable of generating an immunogenic response to infection by parasites of the Echinococcus family, and in particular of E. granulosus, in a susceptible host.
  • sensitive host is meant, for example, man or an animal, for example a dog.
  • polypeptide having an immunogenic activity it is necessary to understand within the meaning of the invention, a polypeptide recognized by circulating antibodies produced in a sensitive host infected by parasites of the family Echinococcus. It has also been shown that the above-mentioned polypeptides modify the response potential of the intestine of a sensitive host, faced with an infection by Echinococcus family parasites.
  • the fragments (b) and the variants (c) mentioned above cannot of course include the protein of SEQ ID NO: 1 as a whole.
  • an “immunogenic activity at least equivalent to the latter” is meant a fragment or a variant as defined above which has the same, or even better, immunogenic response to infection by parasites of the Echinococcus family, and particular of E. granulosus, in a susceptible host. This equivalence can in particular be measured with the Elisa method, for example according to the protocol described later in paragraph 1.2 of the experimental part.
  • the subject of the invention is in particular new vaccines as defined above, the vaccinating agent of which is a fragment having an immunological activity at least equivalent to the polypeptide of SEQ ID No.
  • polypeptides of SEQ ID No. 2 chosen from: the polypeptides of SEQ ID No. 2 , SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 4, SEQ ID N ° 5 and the variants of one of these polypeptides which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunogenic activity at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant.
  • the polypeptide of SEQ ID No. 2 and its Above defined variants, which exhibit the greatest immunogenic activity, are particularly preferred as a vaccinating agent.
  • the vaccinating agent is associated with one or more suitable and pharmaceutically acceptable adjuvants.
  • an acceptable adjuvant agent mention may be made of saponins and their derivatives, muramyldipeptide, dimycollate trehalose, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, other water-in-oil emulsions, double emulsions, dextran, diethylaminoethyl-dextran, mineral salts such as potassium alum, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, bentonite, zymosan, polyelectrolytes, retinol, calcium phosphate, protamine, sarcosine, glycerol, sorbitol , propylene glycol, etc.
  • Adjuvants with immunostimulatory properties will be particularly preferred.
  • the vaccine can directly contain the immunogenic polypeptide or the DNA sequence coding for this polypeptide, then produced in vivo within the host. These latter types of vaccines are described in particular in US 4603112 and Brochier et al. Nature, 1991, 354, 520.
  • the vaccine according to the invention can be administered according to any technique known to those skilled in the art, in particular oral or parenteral. Parenteral administration is nevertheless preferred for the administration of vaccines containing the immunogenic polypeptide. In the case of vaccines containing the coding DNA, the oral route will be advantageously used.
  • the dose of vaccine to be administered depends on the type, weight, size of the human or animal to whom the vaccine is to be administered and the degree of immunogenicity of the vaccine agent.
  • the vaccine will be formulated so that doses of the order of 1 to 5 ml are sufficient to obtain an immunogenic protective effect.
  • the subject of the invention is also the polypeptides of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 and SEQ ID No 5, as well as their variants which corresponds to one of these polypeptides modified by l insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant.
  • variants contain at least one epitope responsible for the immunogenic activity of the initial polypeptide and which therefore remains functionally equivalent. They can be obtained from the native polypeptide according to techniques well known to those skilled in the art, for example by mutagenesis on a specific site (Adelman et al. DNA, 2, 183, 1983) and will then be called mutant. For example, it is possible by such a technique to replace amino acids in a sequence with other equivalent amino acids.
  • the following amino acid groups are generally recognized as equivalent: - Ala, Ser, Thr, Pro, Gly - Asn, Asp, Glu, Gin, - His, Arg, Lys, - Met, Leu, Ile, Val, and - Phe, Tyr, Trp.
  • these variants have a degree of homology with the polypeptide of which they are the variant, at least equal to 80%.
  • This degree of homology is, within the meaning of the invention, determined by the techniques of comparison of protein or nucleic sequences, and for example the BLAST technique as described by
  • the subject of the present invention is also the nucleic acid sequences, namely the genomic DNA sequences, the cDNA or mRNA sequences which comprise or consist of a sequence of nucleotides coding for the polypeptide of SEQ ID N ° 2, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 4 or SEQ ID
  • nucleotide sequences can be defined as: a1) the cDNA sequences coding for the polypeptide or one of its variants as defined above; bl) DNA sequences hybridizing under strict conditions with the above sequences; c) the DNA sequences which, due to the degeneracy of the genetic code, result from the sequences a1 and b) above and code for said polypeptide or said variant; and dl) the corresponding mRNA and DNA sequences.
  • SEQ ID SEQ ID
  • polypeptides, fragments and peptide variants according to the invention can be obtained by the technique of genetic engineering which comprises the steps of: - culture of a transformed microorganism or of eukaryotic cells transformed using a nucleic acid sequence according to the invention and - recovery of the protein or peptide fragment produced by said microorganism or said eukaryotic cells.
  • This technique is well known to those skilled in the art. For more details concerning it, reference may be made to the following work: Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai; Armais of the New York Academy of Sciences, volume 646, 1991.
  • This method comprises, for example, the insertion of a DNA sequence coding for a peptide sequence according to the invention into an expression vector such as a plasmid and the transformation of cells with this expression vector.
  • an expression vector such as a plasmid
  • They can also be prepared by conventional peptide syntheses well known to those skilled in the art, using the Applied Biosystems method.
  • the nucleic acids according to the invention can be prepared by chemical synthesis, or by genetic engineering using techniques well known to those skilled in the art and described for example in SAMBROOK et al. (Supra).
  • the present invention also relates to expression vectors such as a plasmid comprising a DNA sequence coding for the polypeptide of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 or SEQ ID No 5, or one of their variants as defined above, as well as the host cells transformed with this expression vector.
  • These host cells can be prokaryotic microorganisms and eukaryotic cells transformed using an expression vector containing a DNA sequence according to the invention.
  • This expression vector which may for example be in the form of a plasmid, must comprise, in addition to the DNA sequence of the invention, the means necessary for its expression, such as in particular a promoter, a transcription terminator , an origin of replication and preferably a selection marker.
  • microorganisms and eukaryotic cells are a technique well known to those skilled in the art who can easily determine, in function of the microorganism to be transformed, the means necessary for the expression of the DNA sequence according to the invention.
  • the preferred microorganism for the purposes of the invention is E. coli whereas Saccharomyces cerevisiae is preferably used as yeast.
  • Saccharomyces cerevisiae is preferably used as yeast.
  • eukaryotic cells which are suitable for the purposes of the invention, mention may in particular be made of COS, CHO, SF9 Jurkat cells, etc., all of which are listed in the ATCC.
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 or SEQ ID No 5, or one of their variants as defined above.
  • These antibodies can be monoclonal antibodies obtained by the well-known method of KOHLER and MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975) or polyclonal antibodies obtained according to conventional methods of animal immunization (Antibodies, a laboratory manual. E. Harlow & D. Lane. Cold Spring Harbor laboratory press, 1988).
  • the present invention also relates to a method of in vitro diagnosis of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E.
  • the diagnostic methods of the invention are intended for the diagnosis of hydatidosis or alveolar echinococcosis.
  • Hydatidosis is preferred.
  • the revelation method can be based on a radioimmunological method of the RIA, RIPA, IRMA type or a method of the immunoenzymatic type of WESTERN-BLOT type on strips or.
  • FIGS. 1A to 5 presented in the appendix: Figs. 1A to 1E present the method of subcloning the 4 restriction fragments Sall-Hind3, Pstl-Hind3, Pstl-Dral, Sall-Pstl.
  • the sequence elements highlighted in black in the constructions correspond to the sequence of pQE80L. More precisely, FIG.
  • 1A represents the vector pQE-80 (475 lbp) (Qiagen): Region of the site of multiple cloning;
  • Fig.lB shows the insertion of EgA31 [Sal I - Hind III] in pQE80L; Clone Sal / Hind 2A (CSD1);
  • Fig.lC shows the insertion of EgA31 [Pst I - Hind III] in pQE80L; Clone Ps ⁇ / Hind D (CSD2);
  • Fig.lD shows the insertion of EgA31 [Pst I - Dra I] in PQE80L; Clone Pst / Dra 9 (CSD12);
  • Fig.lE shows the insertion of EgA31 [Sal i - Pst l] in pQE80L; Clone Sal / Pst.
  • Fig. 2 represents the positioning of the cDNA domains corresponding to the 4 polypeptides of SEQ ID No. 2 to 5 to be produced.
  • Fig. 3 summarizes in a synoptic manner the steps for obtaining the recombinant polypeptides of SEQ ID No. 2 to 5.
  • FIG. 4 shows the assay results with a spectrophotometer of anti EgA31 antibodies.
  • Fig. 5 shows the absorption results after the Elisa test. 1. Comparison of the immunogenicity of the different domains of the protein. 1.1 Production of polypeptides corresponding to different domains of EgA31
  • polypeptides are called in the rest of the text by the initials of the restriction endonucleases which determine the limits of the DNA fragment which makes it possible to generate them ([Sal-Pst], [Sal-Hind], [Pst-Hind], [ Pst-Dra]).
  • the functions were performed (FIGS. 1A to 1E and FIG. 3) in the plasmid pQE80L from Qiagen which allows expression of the insert under the control of a promoter inducible by 1TPTG (promoter Lac z); the recombinant polypeptide obtained leads to its N-terminal end a series of 6 histidines coded by the sequences of the plasmid which follow the translation initiator codon.
  • the constructions were made while respecting the reading phase of the original cDNA (control by sequencing on Megabace Sequencer).
  • the recombinant plasmids were used to transform the bacterial strain BL21 (Fig. 3).
  • the stages of the preparation of the polypeptides are then: mass culture of the recombinant bacteria in the presence of chloramphenicol and ampicillin (100 micrograms / ml each); addition of isopropyl ⁇ D thiogalactoside (Sigma), at a concentration of 1 mM final, when the D.O.
  • the procedure is as follows: The cDNA EgA31 (ref AF 067807) was initially cloned in the plasmid BlueScript II SK + (Stratagene) and multiplied in the strain DH5 alpha of Escherichia coli. In order to prepare the envisaged subclones, a mass production of the plasmid nDNA was carried out from a culture in 30 ml of LB medium containing 100 micrograms per ml of ampicillin. The culture seeded with the transformed bacterial strain is kept overnight at 37 ° C. with stirring.
  • the extraction of the plasmid DNA is carried out using the “MaxiPrep Qiagen Plasmid Midi Kit” kit, according to the supplier's instructions.
  • the prepared material is stored in a Tris HC1 10 mM buffer, pH 8.5 and stored at -80 ° C.
  • the absorption ratio of the prepared DNA measured at 260 and 280 nanometers is 1.91, which attests to a satisfactory quality for the rest of the operations.
  • the DNA is extracted from it using the “Cleanup Qiagen Gel Extraction” kit according to the supplier's instructions.
  • the DNA is collected and stored in the 10 mM Tris HC1 buffer, pH 8.5 at -80 ° C.
  • This plasmid allows transcription of the insert under the control of an IPTG-inducible promoter; the polypeptide produced comprises in its N terminal region a series of 6 consecutive histidines coded by the sequences of the plasmid which allow its subsequent separation by affinity chromatography.
  • the multiple cloning site notably includes the Sali, Pstl and Hind III sites.
  • the steps for preparing the recombinant plasmids are as follows: Digestion of approximately 1 microgram of plasmid DNA for each desired construction with respectively: SalI and Pstl; or Sali and Hind III; or Pstl and Hind III, under the conditions described above, for the cDNA sequences SEQ ID No. 6, 7, 8 or 9. - Separation of the digestion products on 1% agarose gel in TAE 0.5 buffer and recovery of the agarose fragments containing the plasmids open to the 2 enzymes under UV on a Biorad transilluminator. The open plasmid DNA is purified with the “Cleanup Qiagen Gel Extraction” kit.
  • the proportions of cDNA and open plasmid are as follows: Pstl Hind III (SEQ ID No. 6) 74 nanograms (ng) pQE80L open 200 ng Sali Hind III (SEQ ID No. 8) 136 ngpQE80L open 200ng Sali Pstl (SEQ ID N ° 9) 60 ngpQE80L open 200ng - Ligation of the Pstl Dral insert (SEQ ID No. 7): there is no Dral site in the plasmid pQE80L; it was therefore opened with Pstl and Hind III as above.
  • the 3 ′ end “inward” of the Hind III cut was then filled in by copying the 5 ′ end of the complementary strand by action of the Klenow fragment of the DNA polymerase (reaction buffer x10: 4 microliters, the 4 deoxynucleotides triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 1 microliter each, enzyme 1 microliter, (reagents of the “DNA labeling kit” kit) 10 mM Tris HC1 buffer, pH 8.5, qs 40 microliters). After 30 minutes at 37 ° C, the plasmid is purified on a Qiagen kit (mini extraction kit). The Hind III end then became a blunt end which allows the ligation of a fragment terminated with Dra 1 according to the protocol indicated for the other DNA fragments.
  • reaction buffer x10 4 microliters, the 4 deoxynucleotides triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 1 microliter each
  • the efficiency of the ligation is checked by electrophoresis on agarose gel and visualization under UV on a transilluminator (disappearance or reduction of the bands corresponding to the free fragments, appearance of a new band).
  • the competent BL21 Gold (DE3) pLysS bacteria prepared by Stratagene are used, according to the recommendations of the supplier (1 to 50 ng of recombinant plasmid per 100 microliters of competent bacteria).
  • the bacteria are then spread on a box of LB solid medium containing 100 micrograms / ml of ampicillin for the selection of the transformed bacteria.
  • the constructions were designed respecting the original reading phases of the inserts; a check is however made.
  • the recombinant plasmid DNA is prepared (Qiagen kit, mini prep) from a culture of 5 ml of each of the clones retained and sequenced on the Megabace sequencer using the universal primers of the plasmid pQE80L defined by Qiagen. Only the clones whose insert has not undergone any modification are preserved.
  • Comparison ELISA tests were carried out on, initially, the sera of 3 dogs (dogs A, B and C) whose infection with Echinococcus granulosus was confirmed by necropsy, and the serum of 1 dog (dog D ) never infected.
  • the reaction is carried out in 96-well plates, the wall of which is covered by the manufacturer of nickel-agarose (Ni - NTA HisSorb, Qiagen).
  • Ni - NTA HisSorb, Qiagen nickel-agarose
  • Each of the 4 recombinant polypeptides of SEQ ID N ° 2 to 5 is diluted in a carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6, so that the final quantities which will be deposited in the wells are l ⁇ g, 0.2 ⁇ g, 40ng , 8 ng.
  • the plates are incubated for approximately 18 hours at 4 ° C., which allows the binding of the polypeptide to the walls of the wells by the nickel-histidine interaction.
  • the wells are then washed gently 5 times in succession with PBS containing 1% of tween 20 (Sigma) and the saturation of the non-specific sites is carried out by incubation of 3% bovine albumin in PBS for 2 hours. After elimination of albumin, 1/1000 dilutions of each of the dog sera tested in PBS + 0.3% bovine albumin are incubated in the wells for 1 hour at 37 ° C. 2 rows of wells contain a PBS + bovine albumin buffer instead of serum and serve as controls.
  • the wells are then washed 5 times gently (PBS buffer - 1% tween) then an anti-dog IgG antibody (produced in rabbits, Sigma) coupled to horseradish peroxidase is added and maintained at 37 ° C for 1 hour (concentration 1/3000 in PBS).
  • the wells are then gently washed several times and the chromogenic substrate of the peroxidase added (o-phenylenediamine dihydrochloride, Dako).
  • the reaction is stopped after 30 minutes with 0.5N sulfuric acid and the OD measured immediately at 492nm on a plate reader spectrophotometer (Dynatech MR 500). All tests are carried out in triplicate, the value chosen being the average of the 3 tests. The whole experiment is repeated 2 times.
  • Fig. 4 shows that all the domains of the EgA31 protein produced are recognized by the antibodies present in the serum of the infected dogs but not by that of the control: the corresponding regions of the EgA31 protein of the parasites therefore all stimulated the immune responses of the dogs during the 'infection. Antibodies were not present before infection (the latter property had been observed in large batches of dogs using the whole protein, Fu et al, 1999 supra). However, the region of the native protein of SEQ ID No. 2 corresponding to the “[Pst-Hind]” recombinant domain of EgA31 is systematically the most immunogenic.
  • EgTM Echinococcus tropomyosin; Esteves A., Senorale M., Ehrlich R.
  • a tropomyosin gene is differentially expressed in the larval stage of Echinococcus granulosus. Parasitol. Res. 89: 501 -502, 2003), FABP1 (Fatty Acid Binding Protein Echinococcus; Esteves A, Portillo V, Ehrlich R.
  • the [Pst-Dra] fragment of EgA31 of SEQ ID No. 3 was mass produced as indicated previously. The purity of the product produced is checked at each production by electrophoresis and the quantity of protein produced is determined with the “Biorad Protein Assay” after the desalination and concentration steps on an Amicon Ultra 10,000 column (Millipore). The recombinant protein of SEQ ID No. 3 is stored at -80 ° C in solution in sterile physiological serum until use.
  • the EgTM and FABP1 polypeptides were provided to us respectively by A. Esteves (biochemistry laboratory, Pr R. Ehrlich, Montevideo) and F. Schreiber (at the time of the work, microbiology laboratory, Newcastle, Pr C. Hormaeche).
  • Each injection corresponds to 500 ⁇ g in total of recombinant polypeptide (s) in solution in 0.8 ml of physiological saline; just before injection, 0.2 ml of Montanide (adjuvant, SEPPIC France) is added and the solution is slowly homogenized for 10 minutes then filtered through a membrane (Millex, 0.22 ⁇ m) in a sterile hood.
  • the intramuscular injection (1 ml) is given immediately, after disinfection of the coat with alcohol.
  • the injections made to the control dog do not contain any of the 3 recombinant antigens but include the adjuvant.

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Abstract

The invention relates to vaccines for treating or preventing infection of a human being or animal by echinococus parasites, in particular by E. granulosus and E. multilocularis whose vaccinating agent is embodied in the form of (a) a protein of SEQ ID N°1 or (b) one of the fragments thereof exhibiting an immunogenic activity at least equivalent to a polypeptide of SEQ ID N°1, or (c) an (a) or (b) variant which is modified by insertion, substitution or deletion of one or several amino acids and exhibits an immunogenic activity at least equivalent to the activity of said polypeptide.

Description

NOUVEAUX VACCINS DESTINES AU TRAITEMENT OU A LANEW VACCINES FOR TREATMENT OR
PREVENTION DES INFECTIONS PAR PARASITES DE LA FAMILLEPREVENTION OF FAMILY PARASITE INFECTIONS
ECHLNOCOCCUS La présente invention a pour objet des nouveaux vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier Echinococcus (E.) granulosus et donc de l'hydatidose. L'hydatidose est une zoonose à distribution mondiale provoquée par le cestode E. granulosus. La forme larvaire du parasite infecte les bovins, les ovins, les camélidés, cervidés, etc., et l'homme ; elle forme des kystes hydatiques dont les localisations principales mais non exclusives sont le foie et les poumons. Ces kystes bourgeonnent sur leur face interne les larves proprement dites, les protoscolex, qui assureront l'infection des hôtes définitifs du parasite. La forme adulte se développe dans l'intestin des canidés au niveau du duodénum à partir des protoscolex ingérés ; les œufs produits par le parasite adulte sont évacués et disséminés avec les fèces. En zone d'endémie, la prévalence peut être très importante à la fois chez le bétail ( jusqu'à 95% des moutons dans certains districts en Tunisie et au Maroc) et chez le chien (70% des animaux dans la région de Fès, au Maroc) Le parasite est la source de pertes économiques considérables (par exemple, plus de la moitié des abats nobles doivent être détruits au Maroc ; les brebis atteintes présentent des phénomènes d'émaciation et de perte en production de laine). Le parasite est également à l'origine d'un problème de santé humaine important : la prévalence chez l'homme atteint 1,43/1000 en zone rurale de la province du Rio Negro, en Argentine, 1,97/1000 dans le Xinjiang en Chine, 2,2/1000 dans le district du Turkana au Kenya, et des valeurs de 20 % ont été relevées localement dans des villages des Andes péruviennes. A titre d'exemple, la moitié des interventions chirurgicales hépatiques au Maroc sont liées à ce parasite. Les moyens de lutte actuels se situent essentiellement à 2 niveaux : - la modification des pratiques d'élevage, incluant la surveillance stricte des chiens, vecteurs de dissémination, qui se nourrissent des abats d'animaux d'élevage contaminés et rejetés; ces changements de pratique rencontrent souvent des difficultés d'application notamment dans les pays en voie de développement ; - l'utilisation de vermifuges type Praziquantel ou Arécoline, qui ne sont cependant pas ovicides. Un vaccin pour ovins a été mis au point à partir de protéines recombinantes exprimées par l'embryon (Lightowlers M.W., 1996, Int. J. Parasitol., 26, pp836-842), mais son application se révèle lourde car si l'efficacité est satisfaisante, la durée de protection est courte et le nombre d'animaux à traiter, donc à manipuler, important (l'ensemble du cheptel pour un éleveur). On comprend aisément qu'il est urgent de trouver de nouveaux vaccins contre cette maladie. Pour cela, les inventeurs ont réalisés leurs essais chez le chien. En effet, La disparition ou la forte réduction du nombre de chiens disséminant les œufs serait un moyen d'interrompre le cycle de vie du parasite, et donc de réduire ou de supprimer la contamination du bétail et de l'homme. Le choix du chien comme cible du traitement conduit à avoir un nombre d'animaux à traiter considérablement plus réduit que si la cible est le bétail lui même. Dans un travail antérieur (Fu et coll., Mol. Biochem. Parasitol., 102, p.43-52, 1999), une protéine du parasite détectée en raison de son immunogénicité très importante lors des infections naturelles ou expérimentales chez le chien a été identifiée et préparée. Une banque ADNc d'Echinococcus granulosus dans le vecteur d'expression lambda gt22 avait été criblée à l'aide de sérum de chiens infectés par le parasite (3 mois en élevage protégé). L'ensemble des clones ADNc exprimant les protéines reconnues par les anticorps avaient été analysés une seconde fois avec les sérums individuels de chiens infectés et les intensités des réactions comparées : le clone fournissant la réaction la plus forte avec les sérums de tous les chiens avait été retenu et dénommé EgA31. Cette publication permet donc de mettre en évidence l'existance d'anticorps circulants dirigés contre la protéine EgA31 chez des chiens infectés par le parasite E. granulosus. Cet ADNc code pour une protéine riche en leucine, de structure putative hélicoïdale, comportant un domaine riche en proline de type SH3 (Sarc Homology 3 type 1) proche de la région C terminale de la protéine; ces domaines sont impliqués notamment dans des interactions protéine - protéine. Par ailleurs, 28 sites de phosphorylation et 4 sites de myristylation putatifs peuvent être repérés grâce au logiciel PROSITE. La séquence SEQ ID N°l de EgA31 a été déposée (SwissProt) sous le numéro AF 067 807. Dans Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000, on montre la stimulation de la prolifération cellulaire dans les ganglions poplités et préscapulaires du chien naïf après sensiblisation à la protéine EgA31. Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que la protéine de séquence SEQ ID N°l nommée EgA31, ainsi que certains de ses fragments ou variants, présentent une activité immunogène d' E. granulosus et entraînent, notamment chez le chien, une modification de la réponse du duodénum à l'infection ultérieure par E. granulosus et peut donc de ce fait faire l'objet de vaccins contre les infections dues à ce type de parasites. Aucune des deux précédentes publications (Molecular and Biochemical Parasitology 102, 43-52, 1999 et Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000) ne laissaient présager les résultats présentés dans la présente demande de brevet à savoir : une réponse inflammatoire et une hypertrophie des organes de l'immunité strictement localisées au site de fixation des parasites chez des chiens immunisés avec un fragment de EgA31 , puis infectés, la présence d'anticorps chez des chiens infectés, en quantité plus importante contre un des domaines de la protéine de séquence SEQ ID N°2, l'échec de l'infection expérimentale d'un chien présentant des anticorps circulants contre ce domaine, avant cette infection expérimentale. Ces différents résultats vont au soutien de l'activité immunogène protectrice de la protéine EgA31 et de ses fragments étudiés dans la présente invention. La présente invention a donc pour objet des nouveaux vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, dont l'agent vaccinant est (a) la protéine de séquence SEQ ID N° 1, ou (b) un de ses fragments ayant une activité immunogène au moins équivalente à la protéine SEQ ID N° 1, ou (c) un variant de (a) ou de (b) qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunogène au moins équivalente à ce dernier. De préférence, les vaccins de l'invention sont destinés au traitement ou à la prévention de l'hydatidose ou de l'échinococcose alvéolaire. L'hydatidose est préférée. En effet, la protéine EgA3l d'Echinococcus granulosus est présente chez la larve (protoscolex, membrane germinative) mais surtout chez l'adulte du parasite. A ce stade, elle est la plus abondante dans le tégument, au niveau des microtriches, zones d'échanges trophiques entre le parasite et son hôte. Elle est aussi présente chez Echinococcus multilocularis, espèce parasitaire très proche de E . granulosus, et responsable dans l'hémisphère nord de l'échinococcose alvéolaire dont la transmission à l'homme s'effectue également par les canidés. Selon l'invention, il a été démontré que les polypeptides ci-dessus mentionnés sont capables de générer une réponse immunogène face à une infection par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier d'E. granulosus, chez un hôte sensible. Par hôte sensible, on entend par exemple l'homme ou un animal, par exemple un chien. Par « polypeptide présentant une activité immunogène », il faut comprendre au sens de l'invention, un polypeptide reconnu par des anticorps circulants produits chez un hôte sensible infectés par parasites de la famille Echinococcus. Il a également été démontré que les polypeptides ci-dessus mentionnés modifier la potentialité de réponse de l'intestin d'un hôte sensible, face à une infection par parasites de la famille Echinococcus. Les fragments (b) et les variants (c) ci-dessus mentionnés ne peuvent bien entendu pas englober la protéine de SEQ ID N°l dans son entier. Par une « une activité immunogène au moins équivalente à ce dernier », on entend un fragment ou un variant tel que défini ci-dessus qui possède la même, voire une meilleure, réponse immunogène à une infection par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier d'E. granulosus, chez un hôte sensible. Cette équivalence peut notamment être mesurée avec la méthode Elisa, par exemple selon le protocole décrit plus loin au paragraphe 1.2 de la partie expérimentale. L'invention a notamment pour objet des nouveaux vaccins tels que définis ci- dessus dont l'agent vaccinant est un fragment ayant une activité immunologique au moins équivalente au polypeptide de SEQ ID N° 1 choisi parmi : les polypeptides de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5 et les variants de l'un de ces polypeptides qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunogène au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. Le polypeptide de SEQ ID N°2 et ses variants ci-dessus définis, qui présentent la plus grande activité immunogène, sont particulièrement préférés en tant qu'agent vaccinant. L'agent vaccinant est associé à un ou plusieurs adjuvants appropriés et pharmaceutiquement acceptables. En tant qu'agent adjuvant acceptable, on peut citer les saponines et leurs dérivés, le muramyldipeptide, le dimycollate trehalose, l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, d'autres émulsions eau dans huile, les doubles émulsions, le dextran,le diéthylaminoéthyl-dextran, les sels minéraux tels que le potassium alum, le phosphate d'aluminium, l'hydroxide d'aluminium, la bentonite, zymosan, polyelectrolytes, rétinol, phosphate de calcium, protamine, sarcosine, glycérol, sorbitol, propylène glycol... Les adjuvants dotés de propriétés immunostimulantes seront particulièrement préférés. Dans les vaccins selon l'invention, il est possible d'associer plusieurs agents vaccinants. Le vaccin peut contenir directement le polypeptide immunogène ou bien la séquence ADN codant pour ce polypeptide, alors produit in vivo au sein de l'hôte. Ces derniers types de vaccins sont notamment décrits dans US 4603112 et Brochier et al. Nature, 1991, 354, 520. Le vaccin selon l'invention peut être administré selon toute technique connue par l'homme de l'art, notamment orale ou parentérale. L'administration parentérale est néanmoins préférée pour l'administration de vaccins contenant le polypeptide immunogène. Dans le cas de vaccins contenant l'ADN codant, on utilisera de façon avantageuse la voie orale. La dose de vaccin qui doit être administrée dépend du type, du poids, de la taille de l'homme ou de l'animal à qui le vaccin doit être administrée et du degré d'immunogénicité de l'agent vaccinant. De préférence, le vaccin sera formulé de façon à ce que des doses de l'ordre de 1 à 5 ml soient suffisantes pour obtenir un effet protecteur immunogène. L'invention a également pour objet les polypeptides de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 et SEQ ID N°5, ainsi que leurs variants qui correspond à l'un de ces polypeptides modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. Ces variants contiennent au moins un épitope responsable de l'activité immunogène du polypeptide initial et qui reste donc fonctionnellement équivalent. Ils peuvent être obtenus à partir du polypeptide natif selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, par exemple par mutagenèse sur site spécifique (Adelman et al. DNA, 2, 183, 1983) et seront alors appelés mutant. Par exemple, il est possible par une telle technique de substituer dans une séquence des amino acides par d'autres amino acides équivalents. Les groupes d'amino acides ci-après sont généralement reconnus comme équivalents : - Ala, Ser, Thr, Pro, Gly - Asn, Asp, Glu, Gin, - His, Arg, Lys, - Met, Leu, Ile, Val, and - Phe, Tyr, Trp. De préférence, ces variants présentent un degré d'homologie avec le polypeptide dont ils sont le variant, au moins égal à 80 %. Ce degré d'homologie est, au sens de l'invention, déterminé par les techniques de comparaison de séquences proteiques ou nucléiques, et par exemple la technique BLAST telle que décrite parECHLNOCOCCUS The subject of the present invention is new vaccines intended for the treatment or prevention of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular Echinococcus (E.) granulosus and therefore hydatidosis. Hydatidosis is a zoonosis with worldwide distribution caused by the cestode E. granulosus. The larval form of the parasite infects cattle, sheep, camelids, deer, etc., and humans; it forms hydatid cysts, the main but not exclusive localizations of which are the liver and the lungs. These cysts bud on their internal face the larvae proper, the protoscolex, which will infect the final hosts of the parasite. The adult form develops in the intestine of canids in the duodenum from the ingested protoscolex; the eggs produced by the adult parasite are evacuated and disseminated with the faeces. In endemic areas, the prevalence can be very high both in cattle (up to 95% of sheep in certain districts in Tunisia and Morocco) and in dogs (70% of animals in the region of Fez, in Morocco) The parasite is the source of considerable economic losses (for example, more than half of the noble organ meats must be destroyed in Morocco; the affected ewes present phenomena of wasting and loss in wool production). The parasite is also the cause of a major human health problem: the prevalence in humans reaches 1.43 / 1000 in rural areas of the province of Rio Negro, in Argentina, 1.97 / 1000 in Xinjiang in China, 2.2 / 1000 in the Turkana district of Kenya, and values of 20% have been recorded locally in villages in the Peruvian Andes. For example, half of the liver surgeries in Morocco are linked to this parasite. The current means of control are essentially at two levels: - the modification of breeding practices, including strict surveillance of dogs, vectors of dissemination, which feed on the offal of contaminated and rejected farm animals offal; these changes in practice often encounter application difficulties, particularly in developing countries; - the use of Praziquantel or Arécoline dewormers, which are not, however, ovicidal. A sheep vaccine has been developed from recombinant proteins expressed by the embryo (Lightowlers MW, 1996, Int. J. Parasitol., 26, pp836-842), but its application is proving cumbersome because if the efficacy is satisfactory, the duration of protection is short and the number of animals to be treated, and therefore to be handled, important (the entire herd for a breeder). It is easy to understand that there is an urgent need to find new vaccines against this disease. For this, the inventors carried out their tests in dogs. Indeed, the disappearance or the strong reduction of the number of dogs disseminating the eggs would be a means of interrupting the life cycle of the parasite, and thus of reducing or eliminating the contamination of the cattle and the man. Choosing the dog as the target of treatment results in a considerably smaller number of animals to be treated than if the target is the cattle themselves. In previous work (Fu et al., Mol. Biochem. Parasitol., 102, p.43-52, 1999), a parasite protein detected due to its very high immunogenicity during natural or experimental infections in dogs has been identified and prepared. A cDNA library of Echinococcus granulosus in the lambda gt22 expression vector had been screened using serum from dogs infected with the parasite (3 months in protected breeding). All of the cDNA clones expressing the proteins recognized by the antibodies were analyzed a second time with the individual sera of infected dogs and the intensities of the reactions compared: the clone providing the strongest reaction with the sera of all the dogs had been retained and named EgA31. This publication therefore makes it possible to demonstrate the existence of circulating antibodies directed against the protein EgA31 in dogs infected with the parasite E. granulosus. This cDNA codes for a protein rich in leucine, of putative helical structure, comprising a proline-rich domain of SH3 type (Sarc Homology 3 type 1) close to the terminal C region of the protein; these areas are involved in particular in protein-protein interactions. In addition, 28 phosphorylation sites and 4 putative myristylation sites can be identified using the PROSITE software. The sequence SEQ ID No. 1 of EgA31 has been deposited (SwissProt) under the number AF 067 807. In Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000, the stimulation of cell proliferation in the popliteal and prescapular glands of the naive dog is shown after sensitization to the protein EgA31. The inventors have now demonstrated that the protein of sequence SEQ ID No. 1 called EgA31, as well as some of its fragments or variants, exhibit an immunogenic activity of E. granulosus and cause, in particular in dogs, a modification of the response of the duodenum to subsequent infection with E. granulosus and can therefore be vaccinated against infections caused by this type of parasite. Neither of the two previous publications (Molecular and Biochemical Parasitology 102, 43-52, 1999 and Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000) foreshadowed the results presented in the present patent application, namely: an inflammatory response and an enlargement of the organs of immunity strictly localized at the site of attachment of the parasites in dogs immunized with a fragment of EgA31, then infected, the presence of antibodies in infected dogs, in greater quantity against one of the domains of the protein of sequence SEQ ID No. 2, the failure of the experimental infection of a dog with circulating antibodies against this area, before this experimental infection. These various results support the protective immunogenic activity of the EgA31 protein and its fragments studied in the present invention. The present invention therefore relates to new vaccines intended for the treatment or prevention of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, including vaccinating agent is (a) the protein of sequence SEQ ID No 1, or (b) one of its fragments having an immunogenic activity at least equivalent to the protein SEQ ID No 1, or (c) a variant of (a) or (b) which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunogenic activity at least equivalent to the latter. Preferably, the vaccines of the invention are intended for the treatment or prevention of hydatidosis or alveolar echinococcosis. Hydatidosis is preferred. Indeed, the EgA3l protein of Echinococcus granulosus is present in the larva (protoscolex, germinal membrane) but especially in the adult of the parasite. At this stage, it is most abundant in the seed coat, at the level of microtrichs, zones of trophic exchanges between the parasite and its host. It is also present in Echinococcus multilocularis, a parasitic species very close to E. granulosus, and responsible in the northern hemisphere for alveolar echinococcosis, which can also be transmitted to humans by canids. According to the invention, it has been demonstrated that the above-mentioned polypeptides are capable of generating an immunogenic response to infection by parasites of the Echinococcus family, and in particular of E. granulosus, in a susceptible host. By sensitive host is meant, for example, man or an animal, for example a dog. By “polypeptide having an immunogenic activity”, it is necessary to understand within the meaning of the invention, a polypeptide recognized by circulating antibodies produced in a sensitive host infected by parasites of the family Echinococcus. It has also been shown that the above-mentioned polypeptides modify the response potential of the intestine of a sensitive host, faced with an infection by Echinococcus family parasites. The fragments (b) and the variants (c) mentioned above cannot of course include the protein of SEQ ID NO: 1 as a whole. By an “immunogenic activity at least equivalent to the latter” is meant a fragment or a variant as defined above which has the same, or even better, immunogenic response to infection by parasites of the Echinococcus family, and particular of E. granulosus, in a susceptible host. This equivalence can in particular be measured with the Elisa method, for example according to the protocol described later in paragraph 1.2 of the experimental part. The subject of the invention is in particular new vaccines as defined above, the vaccinating agent of which is a fragment having an immunological activity at least equivalent to the polypeptide of SEQ ID No. 1 chosen from: the polypeptides of SEQ ID No. 2 , SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 4, SEQ ID N ° 5 and the variants of one of these polypeptides which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunogenic activity at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant. The polypeptide of SEQ ID No. 2 and its Above defined variants, which exhibit the greatest immunogenic activity, are particularly preferred as a vaccinating agent. The vaccinating agent is associated with one or more suitable and pharmaceutically acceptable adjuvants. As an acceptable adjuvant agent, mention may be made of saponins and their derivatives, muramyldipeptide, dimycollate trehalose, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, other water-in-oil emulsions, double emulsions, dextran, diethylaminoethyl-dextran, mineral salts such as potassium alum, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, bentonite, zymosan, polyelectrolytes, retinol, calcium phosphate, protamine, sarcosine, glycerol, sorbitol , propylene glycol, etc. Adjuvants with immunostimulatory properties will be particularly preferred. In the vaccines according to the invention, it is possible to combine several vaccinating agents. The vaccine can directly contain the immunogenic polypeptide or the DNA sequence coding for this polypeptide, then produced in vivo within the host. These latter types of vaccines are described in particular in US 4603112 and Brochier et al. Nature, 1991, 354, 520. The vaccine according to the invention can be administered according to any technique known to those skilled in the art, in particular oral or parenteral. Parenteral administration is nevertheless preferred for the administration of vaccines containing the immunogenic polypeptide. In the case of vaccines containing the coding DNA, the oral route will be advantageously used. The dose of vaccine to be administered depends on the type, weight, size of the human or animal to whom the vaccine is to be administered and the degree of immunogenicity of the vaccine agent. Preferably, the vaccine will be formulated so that doses of the order of 1 to 5 ml are sufficient to obtain an immunogenic protective effect. The subject of the invention is also the polypeptides of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 and SEQ ID No 5, as well as their variants which corresponds to one of these polypeptides modified by l insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant. These variants contain at least one epitope responsible for the immunogenic activity of the initial polypeptide and which therefore remains functionally equivalent. They can be obtained from the native polypeptide according to techniques well known to those skilled in the art, for example by mutagenesis on a specific site (Adelman et al. DNA, 2, 183, 1983) and will then be called mutant. For example, it is possible by such a technique to replace amino acids in a sequence with other equivalent amino acids. The following amino acid groups are generally recognized as equivalent: - Ala, Ser, Thr, Pro, Gly - Asn, Asp, Glu, Gin, - His, Arg, Lys, - Met, Leu, Ile, Val, and - Phe, Tyr, Trp. Preferably, these variants have a degree of homology with the polypeptide of which they are the variant, at least equal to 80%. This degree of homology is, within the meaning of the invention, determined by the techniques of comparison of protein or nucleic sequences, and for example the BLAST technique as described by
ALTSCHUL S.F. et al. dans Nucleic Acid Research 1997, 25, 3389-3402. La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomique, les séquences d'ADNc ou d'ARNm qui comprennent ou sont constituées par un enchaînement de nucléotides codant pour le polypeptide de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 ou SEQ IDALTSCHUL S.F. et al. in Nucleic Acid Research 1997, 25, 3389-3402. The subject of the present invention is also the nucleic acid sequences, namely the genomic DNA sequences, the cDNA or mRNA sequences which comprise or consist of a sequence of nucleotides coding for the polypeptide of SEQ ID N ° 2, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 4 or SEQ ID
N°5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment. Ces séquences nucléotidiques peuvent être définies comme : al) les séquences d'ADNc codant pour le polypeptide ou l'un de ses variants tels que définis ci-dessus ; bl) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec les séquences ci-dessus ; cl) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, résultent des séquences al) et bl) ci-dessus et codent pour ledit polypeptide ou ledit variant ; et dl) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. En particulier, on pourra citer les séquences d'ADN correspondant à SEQ IDNo. 5, or one of their variants as defined above. These nucleotide sequences can be defined as: a1) the cDNA sequences coding for the polypeptide or one of its variants as defined above; bl) DNA sequences hybridizing under strict conditions with the above sequences; c) the DNA sequences which, due to the degeneracy of the genetic code, result from the sequences a1 and b) above and code for said polypeptide or said variant; and dl) the corresponding mRNA and DNA sequences. In particular, mention may be made of the DNA sequences corresponding to SEQ ID
N°6, SEQ ID N°7, SEQ ID N°8 et SEQ ID N°9. Les polypeptides, fragments et variants peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de : — culture d'un microorganisme transformé ou de cellules eucaryotes transformées à l'aide d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention et - récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit par le dit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Armais of the New- York Academy of Sciences, volume 646, 1991. Cette méthode comprend, par exemple, l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression. Ils peuvent également être préparés par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme du métier, par utilisation de la méthode Applied Biosystems. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique, ou par génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans SAMBROOK et al. (supra). La présente invention a également pour objet des vecteurs d'expression tel qu'un plasmide comprenant une séquence d'ADN codant pour le polypeptide de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, ainsi que les cellules hôtes transformées avec ce vecteur d'expression. Ces cellules hôtes peuvent être des microorganismes procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, outre la séquence d'ADN de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des microorganismes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du microorganisme à transformer, les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. Le microorganisme préféré aux fins de l'invention est E. coli alors qu'on utilise de préférence Saccharomyces cerevisiae comme levure. A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules COS, CHO, SF9 Jurkat, etc., toutes étant répertoriées à l'ATCC. La présente invention a également pour objet des anticorps dirigés contre un polypeptide de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment. Ces anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus par le procédé bien connu de KOHLER et MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975) ou des anticorps polyclonaux obtenus selon les procédés classiques d'immunisation d'animaux (Antibodies, a laboratory manual. E. Harlow & D. Lane. Cold Spring Harbor laboratory press, 1988). Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, par mise en évidence des anticorps dirigés contre un polypeptide immunogène de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, dans lequel on met en contact le ou lesdits polypeptides ou variants immunogènes tels que définis, avec un prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal pouvant contenir lesdits anticorps et on prélève la présence des anticorps fixés. De préférence, les procédés de diagnostic de l'invention sont destinés au diagnostic de l'hydatidose ou de l'échinococcose alvéolaire. L'hydatidose est préférée. Le procédé de révélation peut être basé sur une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA, IRMA ou une méthode de type immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de. type ELISA. Les éléments de l'invention relatifs au polypeptide de SEQ ID N° 2 et ses variants sont préférés. L'invention va maintenant être décrite en détails à l'aide de l'exposé expérimental ci- après s 'appuyant sur les figures 1A à 5 présentées en annexe : Les Fig. 1A à 1E présentent la méthode de sous clonage des 4 fragments de restriction Sall-Hind3, Pstl-Hind3, Pstl- Dral, Sall-Pstl. Les éléments de séquences surlignées en noir dans les constructions correspondent à la séquence de pQE80L. Plus précisément, la Fig.lA représente le vecteur pQE-80 ( 475 lpb) (Qiagen) : Région du site de clonages multiples ; la Fig.lB représente l'insertion de EgA31 [Sal I - Hind III] dans pQE80L ; Clone Sal/Hind 2A (CSD1) ; la Fig.lC représente l'insertion de EgA31 [Pst I - Hind III] dans pQE80L ; Clone Psτ/Hind D (CSD2) ; la Fig.lD représente l'insertion de EgA31 [Pst I - Dra I] dans PQE80L ; Clone Pst/Dra 9 (CSD12) ; la Fig.lE représente l'insertion de EgA31 [Sal i - Pst l] dans pQE80L ; Clone Sal /Pst. La Fig. 2 représente le positionnement des domaines ADNc correspondant aux 4 polypeptides de SEQ ID N°2 à 5 à produire. La Fig. 3 résume de façon synoptique les étapes de l'obtention des polypeptides recombinants de SEQ ID N°2 à 5. La Fig. 4 représente les résultats de dosage au spectrophotomètre des anticorps anti EgA31. La Fig.5 représente les résultats d'absorption après test Elisa. 1. Comparaison de l'immunogénicité des différents domaines de la protéine. 1.1 Production de polypeptides correspondants à des domaines différents de EgA31N ° 6, SEQ ID N ° 7, SEQ ID N ° 8 and SEQ ID N ° 9. The polypeptides, fragments and peptide variants according to the invention can be obtained by the technique of genetic engineering which comprises the steps of: - culture of a transformed microorganism or of eukaryotic cells transformed using a nucleic acid sequence according to the invention and - recovery of the protein or peptide fragment produced by said microorganism or said eukaryotic cells. This technique is well known to those skilled in the art. For more details concerning it, reference may be made to the following work: Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai; Armais of the New York Academy of Sciences, volume 646, 1991. This method comprises, for example, the insertion of a DNA sequence coding for a peptide sequence according to the invention into an expression vector such as a plasmid and the transformation of cells with this expression vector. They can also be prepared by conventional peptide syntheses well known to those skilled in the art, using the Applied Biosystems method. The nucleic acids according to the invention can be prepared by chemical synthesis, or by genetic engineering using techniques well known to those skilled in the art and described for example in SAMBROOK et al. (Supra). The present invention also relates to expression vectors such as a plasmid comprising a DNA sequence coding for the polypeptide of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 or SEQ ID No 5, or one of their variants as defined above, as well as the host cells transformed with this expression vector. These host cells can be prokaryotic microorganisms and eukaryotic cells transformed using an expression vector containing a DNA sequence according to the invention. This expression vector, which may for example be in the form of a plasmid, must comprise, in addition to the DNA sequence of the invention, the means necessary for its expression, such as in particular a promoter, a transcription terminator , an origin of replication and preferably a selection marker. The transformation of microorganisms and eukaryotic cells is a technique well known to those skilled in the art who can easily determine, in function of the microorganism to be transformed, the means necessary for the expression of the DNA sequence according to the invention. The preferred microorganism for the purposes of the invention is E. coli whereas Saccharomyces cerevisiae is preferably used as yeast. As examples of eukaryotic cells which are suitable for the purposes of the invention, mention may in particular be made of COS, CHO, SF9 Jurkat cells, etc., all of which are listed in the ATCC. The present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 or SEQ ID No 5, or one of their variants as defined above. These antibodies can be monoclonal antibodies obtained by the well-known method of KOHLER and MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975) or polyclonal antibodies obtained according to conventional methods of animal immunization (Antibodies, a laboratory manual. E. Harlow & D. Lane. Cold Spring Harbor laboratory press, 1988). According to another of its aspects, the present invention also relates to a method of in vitro diagnosis of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, by detecting antibodies directed against an immunogenic polypeptide of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 or SEQ ID No 5, or one of their variants as defined above, in which in contact the said polypeptide or immunogenic variants as defined, with a biological sample from man or animal which may contain said antibodies and the presence of the fixed antibodies is sampled. Preferably, the diagnostic methods of the invention are intended for the diagnosis of hydatidosis or alveolar echinococcosis. Hydatidosis is preferred. The revelation method can be based on a radioimmunological method of the RIA, RIPA, IRMA type or a method of the immunoenzymatic type of WESTERN-BLOT type on strips or. ELISA type. The elements of the invention relating to the polypeptide of SEQ ID No. 2 and its variants are preferred. The invention will now be described in detail using the following experimental description, based on FIGS. 1A to 5 presented in the appendix: Figs. 1A to 1E present the method of subcloning the 4 restriction fragments Sall-Hind3, Pstl-Hind3, Pstl-Dral, Sall-Pstl. The sequence elements highlighted in black in the constructions correspond to the sequence of pQE80L. More precisely, FIG. 1A represents the vector pQE-80 (475 lbp) (Qiagen): Region of the site of multiple cloning; Fig.lB shows the insertion of EgA31 [Sal I - Hind III] in pQE80L; Clone Sal / Hind 2A (CSD1); Fig.lC shows the insertion of EgA31 [Pst I - Hind III] in pQE80L; Clone Psτ / Hind D (CSD2); Fig.lD shows the insertion of EgA31 [Pst I - Dra I] in PQE80L; Clone Pst / Dra 9 (CSD12); Fig.lE shows the insertion of EgA31 [Sal i - Pst l] in pQE80L; Clone Sal / Pst. Fig. 2 represents the positioning of the cDNA domains corresponding to the 4 polypeptides of SEQ ID No. 2 to 5 to be produced. Fig. 3 summarizes in a synoptic manner the steps for obtaining the recombinant polypeptides of SEQ ID No. 2 to 5. FIG. 4 shows the assay results with a spectrophotometer of anti EgA31 antibodies. Fig. 5 shows the absorption results after the Elisa test. 1. Comparison of the immunogenicity of the different domains of the protein. 1.1 Production of polypeptides corresponding to different domains of EgA31
La détermination de la structure putative de la protéine par la méthode GOR (Garnier J., Osguthorpe DJ., Robson B., 1978, J Mol Biol, 120, pp 97-120) suggère l'existence de plusieurs domaines sur cette protéine (Fig. 2 et 3). L'ADNc de SEQ ID N°10, initialement clone dans le plasmide pSK+ de Stratagène où il constitue un insert « Sal-Notl » de 1836 paires de bases a été sous clone en 4 fragments d'ADN correspondant chacun approximativement aux domaines proteiques putatifs retenus. Ces polypeptides sont dénommés dans la suite du texte par les initiales des endonucléases de restriction qui déterminent les bornes du fragment d'ADN qui permet de les générer ([Sal-Pst], [Sal-Hind], [Pst-Hind], [Pst-Dra] ). Les constmctions ont été effectuées (Fig. 1A à 1E et Fig. 3) dans le plasmide pQE80L de Qiagen qui permet l'expression de l'insert sous le contrôle d'un promoteur inductible par 1TPTG (promoteur Lac z) ; le polypeptide recombinant obtenu porte à son extrémité N terminale une série de 6 histidines codées par les séquences du plasmide qui suivent le codon initiateur de traduction. Les constructions ont été faites en respectant la phase de lecture de l'ADNc originel (contrôle par séquençage sur Séquenceur Mégabace). Les plasmides recombinants ont été utilisés pour transformer la souche bactérienne BL21 (Fig. 3).The determination of the putative structure of the protein by the GOR method (Garnier J., Osguthorpe DJ., Robson B., 1978, J Mol Biol, 120, pp 97-120) suggests the existence of several domains on this protein ( Fig. 2 and 3). The cDNA of SEQ ID No. 10, initially cloned into the plasmid pSK + of Stratagene where it constitutes a “Sal-Notl” insert of 1836 base pairs was subcloned into 4 DNA fragments each corresponding approximately to the putative protein domains retained. These polypeptides are called in the rest of the text by the initials of the restriction endonucleases which determine the limits of the DNA fragment which makes it possible to generate them ([Sal-Pst], [Sal-Hind], [Pst-Hind], [ Pst-Dra]). The functions were performed (FIGS. 1A to 1E and FIG. 3) in the plasmid pQE80L from Qiagen which allows expression of the insert under the control of a promoter inducible by 1TPTG (promoter Lac z); the recombinant polypeptide obtained leads to its N-terminal end a series of 6 histidines coded by the sequences of the plasmid which follow the translation initiator codon. The constructions were made while respecting the reading phase of the original cDNA (control by sequencing on Megabace Sequencer). The recombinant plasmids were used to transform the bacterial strain BL21 (Fig. 3).
Les étapes de la préparation des polypeptides sont alors : culture en masse des bactéries recombinantes en présence de chloramphénicol et ampicilline (100 microgrammes/ml chacun) ; addition d'isopropyl βD thiogalactoside (Sigma), à la concentration de 1 mM finale, lorsque la D.O. de la culture atteint 0,5 à 600nm ; 3 heures de culture à 37°C sous agitation vigoureuse ; centrifugation des cellules, lyse du culot dans un tampon pH 8,0 dénaturant (urée 8M) ; élution lente du surnageant de lyse sur des colonnes de billes d'agarose couplée au nickel - acide nitriloacétique (Qiagen) qui retiennent les polypeptides portant les résidus histidine en N terminal ; gradation de tampons de pH 6,3 puis 5,9 et 4,5 contenant de l'urée à la concentration de 8M pour éliminer les protéines retenues de façon non sélective par la colonne, puis libérer (pH 4,5) le polypeptide d'intérêt (résumé des étapes Fig. 3). Une électrophorèse en SDS PAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie R250 permet de s'assurer de la taille et de la pureté du matériel synthétisé. Plus précisément, on opère comme suit : L'ADNc EgÀ31 (ref AF 067807) avait été initialement clone dans le plasmide BlueScript II SK+ (Stratagène) et multiplié dans la souche DH5 alpha de Escherichia coli. Afin de préparer les sous clones envisagés, une production en masse de l'ADNn plasmidien a été effectuée à partir d'une culture dans 30 ml de milieu LB contenant 100 microgrammes par ml d' ampicilline. La culture ensemencée avec la souche bactérienne transformée est maintenue une nuit à 37°C sous agitation. L'extraction de l'ADN plasmidien est faite à l'aide du kit « MaxiPrep Qiagen Plasmid Midi Kit », selon les instructions du fournisseur. Le matériel préparé est stocké dans un tampon Tris HC1 lOmM, pH 8,5 et conservé à -80°C. Le rapport des absorptions de l'ADN préparé mesurées à 260 et 280 nanomètres est de 1,91, ce qui atteste d'une qualité satisfaisante pour la suite des opérations.The stages of the preparation of the polypeptides are then: mass culture of the recombinant bacteria in the presence of chloramphenicol and ampicillin (100 micrograms / ml each); addition of isopropyl βD thiogalactoside (Sigma), at a concentration of 1 mM final, when the D.O. of the culture reaches 0.5 to 600 nm; 3 hours of culture at 37 ° C with vigorous stirring; centrifugation of the cells, lysis of the pellet in a pH 8.0 denaturing buffer (8M urea); slow elution of the lysis supernatant on columns of agarose beads coupled to nickel - nitriloacetic acid (Qiagen) which retain the polypeptides carrying the histidine residues at the N terminal; gradation of buffers of pH 6.3 then 5.9 and 4.5 containing urea at a concentration of 8M to remove the proteins retained non-selectively by the column, then release (pH 4.5) the polypeptide d interest (summary of steps Fig. 3). SDS PAGE electrophoresis followed by Coomassie R250 blue staining ensures the size and purity of the synthesized material. More specifically, the procedure is as follows: The cDNA EgA31 (ref AF 067807) was initially cloned in the plasmid BlueScript II SK + (Stratagene) and multiplied in the strain DH5 alpha of Escherichia coli. In order to prepare the envisaged subclones, a mass production of the plasmid nDNA was carried out from a culture in 30 ml of LB medium containing 100 micrograms per ml of ampicillin. The culture seeded with the transformed bacterial strain is kept overnight at 37 ° C. with stirring. The extraction of the plasmid DNA is carried out using the “MaxiPrep Qiagen Plasmid Midi Kit” kit, according to the supplier's instructions. The prepared material is stored in a Tris HC1 10 mM buffer, pH 8.5 and stored at -80 ° C. The absorption ratio of the prepared DNA measured at 260 and 280 nanometers is 1.91, which attests to a satisfactory quality for the rest of the operations.
111. Ouverture du plasmide recombinant pSK+EgA31 aux sites Sali ou Pstl . Environ 10 microgrammes de plasmide recombinant sont linéarisés en 1 heure à 37°C avec 20 unités d'endonucléase de restriction Sali (Roche) ou d'endonucléase de restriction Pstl (Roche) dans le tampon préparé par le fournisseur et selon ses instructions. L'ADN linéarisé est ensuite purifié (Kit Qiagen) pour éliminer l'enzyme résiduelle et le tampon de digestion, puis mis en solution dans le tampon Tris - HC1 10 mM, pH 8,5 .111. Opening of the recombinant plasmid pSK + EgA31 at the SalI or Pstl sites. About 10 micrograms of recombinant plasmid are linearized in 1 hour at 37 ° C. with 20 units of SalI restriction endonuclease (Roche) or Pstl restriction endonuclease (Roche) in the buffer prepared by the supplier and according to his instructions. The linearized DNA is then purified (Qiagen Kit) to remove the residual enzyme and the digestion buffer, then dissolved in the 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5.
112. Préparation des fragments d'ADNc Sali - Hind III et Sali - Pstl112. Preparation of SalI - Hind III and Sali - Pstl cDNA fragments
Pour chaque préparation, environ 5 microgrammes de l'ADN linéarisé ci-dessus avec Sali sont digérés pendant 1 heure à 37°C par 20 unités d'endonucléase de restriction Pstl ou Hind III dans le tampon préparé par le fournisseur. Les produits de digestion sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% dans le tampon TAE x 0,5 ; 2 microlitres de bleu de bromophénol à 0,01% dans du glycérol à 50% sont ajoutés à chacun des échantillons analysés ; la migration dure 30 minutes à 100 volts en présence de bromure d'éthidium dans le tampon. En fin d' électrophorèse, les fragments sont visualisés en UV sur un transilluminateur (Biorad) et des bandes d'agarose contenant le fragment d'intérêt sont très rapidement découpées à la lame de rasoir.For each preparation, approximately 5 micrograms of the DNA linearized above with SalI are digested for 1 hour at 37 ° C. with 20 units of restriction endonuclease Pstl or Hind III in the buffer prepared by the supplier. The digestion products are then separated by electrophoresis on 1% agarose gel in TAE x 0.5 buffer; 2 microliters of 0.01% bromophenol blue in 50% glycerol are added to each of the samples analyzed; the migration lasts 30 minutes at 100 volts in the presence of ethidium bromide in the buffer. At the end of the electrophoresis, the fragments are visualized in UV on a transilluminator (Biorad) and strips of agarose containing the fragment of interest are very quickly cut with a razor blade.
113. Préparation des fragments d'ADNc Pstl - Hind III et Pstl - Dral Environ 5 microgrammes de plasmide recombinant pSK+EgA31 linérarisés par Pstl comme décrit en 111 sont digérés soit par 20 unités d'endonucléase de restriction Hind III, soit par 20 unités d'endonucléase de restriction Dral dans les tampons adaptés préparés par le fournisseur. Les fragments d'ADN digérés sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% comme supra. En fin d' électrophorèse, des bandes d'agarose contenant les fragments d'intérêt sont très rapidement découpées sur le gel.113. Preparation of the Pstl - Hind III and Pstl - Dral cDNA Fragments About 5 micrograms of recombinant plasmid pSK + EgA31 linearized with Pstl as described in 111 are digested either by 20 units of Hind III restriction endonuclease, or by 20 units restriction endonuclease Dral in suitable buffers prepared by the supplier. The digested DNA fragments are separated by electrophoresis on 1% agarose gel as above. At the end of the electrophoresis, strips of agarose containing the fragments of interest are very quickly cut out of the gel.
114. Purification des 4 fragments d'ADN correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N° 6, 7, 8 et 9.114. Purification of the 4 DNA fragments corresponding respectively to sequences SEQ ID No. 6, 7, 8 and 9.
Les préparations décrites ci-dessus sont effectuées 3 fois et les bandes d'agarose contenant respectivement les séquences SEQ ID N°6, 7, 8 ou 9 sont regroupées.The preparations described above are carried out 3 times and the agarose bands containing the sequences SEQ ID No. 6, 7, 8 or 9 respectively are combined.
L'ADN en est extrait en utilisant le kit « Cleanup Qiagen Gel Extraction » selon les instructions du fournisseur. L'ADN est collecté et conservé dans le tampon Tris HC1 10mM, pH 8,5 à-80°C.The DNA is extracted from it using the “Cleanup Qiagen Gel Extraction” kit according to the supplier's instructions. The DNA is collected and stored in the 10 mM Tris HC1 buffer, pH 8.5 at -80 ° C.
115. Insertion des fragments d'ADN préparés dans le plasmide pQE80L (Qiagen), vecteur d'expression procaryo ique. Ce plasmide permet la transcription de l'insert sous le contrôle d'un promoteur inductible à l'IPTG ; le polypeptide produit comporte dans sa région N terminale une série de 6 histidines consécutives codées par les séquences du plasmide qui permettent sa séparation ultérieure par chromatographie d'affinité. Le site de clonage multiple comporte notamment les sites Sali, Pstl et Hind III. Les étapes de préparation des plasmides recombinants sont les suivantes : Digestion de 1 microgramme environ d'ADN plasmidien pour chaque construction souhaitée avec respectivement : Sali et Pstl ; ou Sali et Hind III ; ou Pstl et Hind III, dans les conditions décrites supra, pour les séquences d'ADNc SEQ ID N° 6, 7, 8 ou 9. - Séparation des produits de digestion sur gel d'agarose 1% en tampon TAE 0,5 et récupération des fragments d'agarose contenant les plasmides ouverts aux 2 enzymes sous UV sur transilluminateur Biorad. L'ADN plasmidien ouvert est purifié avec le kit « Cleanup Qiagen Gel Extraction ». - Déphosphorylation des extrémités des plasmides linéarisés à la phosphatase alcaline (Roche) selon les instructions du fournisseur. Ligation des inserts correspondant aux séquences SEQ ID N° 6, 8 et 9 dans les plasmides ouverts. Les plasmides pQE80L ouverts et les fragments d'ADNc digérés par les mêmes endonucléases sont incubés pendant 1 heure a 37 °C dans 32 microlitres de tampon Tris HC1, 10 mM, pH = 8,5 , 4 microlitres de tampon de ligation lOx préparé par le fournisseur, et 4 microlitres de ligase T4 (Roche) . Les proportions d'ADNc et de plasmide ouvert sont les suivantes : Pstl Hind III (SEQ ID N° 6) 74 nanogrammes (ng)pQE80L ouvert 200 ng Sali Hind III (SEQ ID N° 8) 136 ngpQE80L ouvert 200ng Sali Pstl (SEQ ID N° 9) 60 ngpQE80L ouvert 200ng - Ligation de l'insert Pstl Dral (SEQ ID N° 7) : il n'existe pas de site Dral dans le plasmide pQE80L ; celui-ci a donc été ouvert avec Pstl et Hind III comme ci dessus. L'extrémité 3' « rentrante » de la coupure à Hind III a ensuite été comblée par copie de l'extrémité 5' du brin complémentaire par action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase (tampon de réaction xlO : 4 microlitres, les 4 déoxynucléotides triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 1 microlitre chacun, enzyme 1 microlitre, (réactifs du kit « DNA labeling kit ») tampon Tris HC1 10 mM, pH 8,5, qsp 40 microlitres). Après 30 minutes à 37°C, le plasmide est purifié sur kit Qiagen (mini extraction kit). L'extrémité Hind III est alors devenue une extrémité franche qui permet la ligation d'un fragment terminé par Dra 1 selon le protocole indiqué pour les autres fragments d'ADN.115. Insertion of the DNA fragments prepared in the plasmid pQE80L (Qiagen), prokaryotic expression vector. This plasmid allows transcription of the insert under the control of an IPTG-inducible promoter; the polypeptide produced comprises in its N terminal region a series of 6 consecutive histidines coded by the sequences of the plasmid which allow its subsequent separation by affinity chromatography. The multiple cloning site notably includes the Sali, Pstl and Hind III sites. The steps for preparing the recombinant plasmids are as follows: Digestion of approximately 1 microgram of plasmid DNA for each desired construction with respectively: SalI and Pstl; or Sali and Hind III; or Pstl and Hind III, under the conditions described above, for the cDNA sequences SEQ ID No. 6, 7, 8 or 9. - Separation of the digestion products on 1% agarose gel in TAE 0.5 buffer and recovery of the agarose fragments containing the plasmids open to the 2 enzymes under UV on a Biorad transilluminator. The open plasmid DNA is purified with the “Cleanup Qiagen Gel Extraction” kit. - Dephosphorylation of the ends of the plasmids linearized with alkaline phosphatase (Roche) according to the supplier's instructions. Ligation of the inserts corresponding to the sequences SEQ ID No. 6, 8 and 9 in the open plasmids. The open pQE80L plasmids and the cDNA fragments digested with the same endonucleases are incubated for 1 hour at 37 ° C. in 32 microliters of Tris HC1 buffer, 10 mM, pH = 8.5, 4 microliters of lOx ligation buffer prepared by the supplier, and 4 microliters of T4 ligase (Roche). The proportions of cDNA and open plasmid are as follows: Pstl Hind III (SEQ ID No. 6) 74 nanograms (ng) pQE80L open 200 ng Sali Hind III (SEQ ID No. 8) 136 ngpQE80L open 200ng Sali Pstl (SEQ ID N ° 9) 60 ngpQE80L open 200ng - Ligation of the Pstl Dral insert (SEQ ID No. 7): there is no Dral site in the plasmid pQE80L; it was therefore opened with Pstl and Hind III as above. The 3 ′ end “inward” of the Hind III cut was then filled in by copying the 5 ′ end of the complementary strand by action of the Klenow fragment of the DNA polymerase (reaction buffer x10: 4 microliters, the 4 deoxynucleotides triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 1 microliter each, enzyme 1 microliter, (reagents of the “DNA labeling kit” kit) 10 mM Tris HC1 buffer, pH 8.5, qs 40 microliters). After 30 minutes at 37 ° C, the plasmid is purified on a Qiagen kit (mini extraction kit). The Hind III end then became a blunt end which allows the ligation of a fragment terminated with Dra 1 according to the protocol indicated for the other DNA fragments.
Pour toutes les constructions, l'efficacité de la ligation est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose et visualisation sous UV sur transilluminateur (disparition ou diminution des bandes correspondant aux fragments libres, apparition d'une nouvelle bande).For all constructions, the efficiency of the ligation is checked by electrophoresis on agarose gel and visualization under UV on a transilluminator (disappearance or reduction of the bands corresponding to the free fragments, appearance of a new band).
117. Transformation des bactéries117. Transformation of bacteria
On utilise les bactéries BL21 Gold (DE3) pLysS compétentes préparées par Stratagène, selon les préconisations du fournisseur (1 à 50 ng de plasmide recombinant pour 100 microlitres de bactéries compétentes). Les bactéries sont ensuite étalées sur boite de milieu solide LB contenant 100 microgrammes/ml d'ampicilline pour la sélection des bactéries transformées.The competent BL21 Gold (DE3) pLysS bacteria prepared by Stratagene are used, according to the recommendations of the supplier (1 to 50 ng of recombinant plasmid per 100 microliters of competent bacteria). The bacteria are then spread on a box of LB solid medium containing 100 micrograms / ml of ampicillin for the selection of the transformed bacteria.
118. Contrôle des fragments d'ADN insérés118. Control of inserted DNA fragments
Les constructions ont été dessinées en respectant les phases de lecture originelles des inserts ; un contrôle est cependant fait. L'ADN plasmidien recombinant est préparé (kit Qiagen , mini prep) à partir d'une culture de 5 ml de chacun des clones retenus et séquence sur séquenceur Megabace en utilisant les amorces universelles du plasmide pQE80L définies par Qiagen. Seuls les clones dont l'insert n'a subi aucune modification sont conservés. 1.2 Comparaison Des tests ELISA ont été réalisés sur, dans un premier temps, les sérums de 3 chiens (chiens A, B et C) dont l'infection par Echinococcus granulosus a été confirmée par nécropsie, et le sérum de 1 chien (chien D) jamais infecté. La réaction est faite dans des plaques 96 puits dont la paroi est recouverte par le fabricant de nickel-agarose (Ni - NTA HisSorb, Qiagen). Chacun des 4 polypeptides recombinants de SEQ ID N°2 à 5 est dilué dans un tampon carbonate — bicarbonate, pH 9,6, de façon à ce que les quantités finales qui seront déposées dans les puits soient de lμg, 0,2μg, 40ng, 8 ng. Les plaques sont incubées 18 heures environ à 4°C, ce qui permet la fixation du polypeptide sur les parois des puits par l'interaction nickel-histidines. Les puits sont ensuite lavés doucement 5 fois de suite avec du PBS contenant 1% de tween 20 (Sigma) et la saturation des sites non spécifiques est faite par incubation d'albumine bovine à 3% dans du PBS pendant 2 heures. Après élimination de l'albumine, des dilutions au 1/1000 de chacun des sérums de chiens testés dans du PBS + 0,3% d'albumine bovine sont incubées dans les puits pendant 1 heure à 37°C. 2 rangées de puits contiennent un tampon PBS + albumine bovine au lieu de sérum et servent de témoins. Les puits sont ensuite lavés 5 fois doucement (tampon PBS - tween 1%) puis un anticorps anti IgG de chien (produit chez le lapin, Sigma) couplé à la peroxydase de raifort est ajouté et maintenu à 37°C pendant 1 heure (concentration 1/3000 dans du PBS). Les puits sont ensuite lavés délicatement plusieurs fois et le substrat chromogène de la peroxydase ajouté (o-phénylènediamine dihydrochlorure, Dako). La réaction est arrêtée après 30 minutes avec de l'acide sulfurique 0,5N et la D.O. mesurée immédiatement à 492nm sur un spectrophotomètre lecteur de plaques (Dynatech MR 500). Tous les essais sont faits en triple exemplaires, la valeur retenue étant la moyenne des 3 essais. L'ensemble de l'expérience est répété 2 fois. La Fig. 4 montre que tous les domaines de la protéine EgA31 produits sont reconnus par les anticorps présents dans le sérum des chiens infectés mais pas par celui du témoin : les régions correspondantes de la protéine EgA31 des parasites ont donc toutes stimulé les réponses immunitaires des chiens pendant l'infection. Les anticorps ne sont pas présents avant l'infection (cette dernière propriété avait été observée sur des lots importants de chiens en utilisant la protéine entière, Fu et coll, 1999 supra). Toutefois, la région de la protéine native de SEQ ID N° 2 correspondant au domaine recombinant « [Pst-Hind] » de EgA31 est systématiquement la plus immunogène.The constructions were designed respecting the original reading phases of the inserts; a check is however made. The recombinant plasmid DNA is prepared (Qiagen kit, mini prep) from a culture of 5 ml of each of the clones retained and sequenced on the Megabace sequencer using the universal primers of the plasmid pQE80L defined by Qiagen. Only the clones whose insert has not undergone any modification are preserved. 1.2 Comparison ELISA tests were carried out on, initially, the sera of 3 dogs (dogs A, B and C) whose infection with Echinococcus granulosus was confirmed by necropsy, and the serum of 1 dog (dog D ) never infected. The reaction is carried out in 96-well plates, the wall of which is covered by the manufacturer of nickel-agarose (Ni - NTA HisSorb, Qiagen). Each of the 4 recombinant polypeptides of SEQ ID N ° 2 to 5 is diluted in a carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6, so that the final quantities which will be deposited in the wells are lμg, 0.2μg, 40ng , 8 ng. The plates are incubated for approximately 18 hours at 4 ° C., which allows the binding of the polypeptide to the walls of the wells by the nickel-histidine interaction. The wells are then washed gently 5 times in succession with PBS containing 1% of tween 20 (Sigma) and the saturation of the non-specific sites is carried out by incubation of 3% bovine albumin in PBS for 2 hours. After elimination of albumin, 1/1000 dilutions of each of the dog sera tested in PBS + 0.3% bovine albumin are incubated in the wells for 1 hour at 37 ° C. 2 rows of wells contain a PBS + bovine albumin buffer instead of serum and serve as controls. The wells are then washed 5 times gently (PBS buffer - 1% tween) then an anti-dog IgG antibody (produced in rabbits, Sigma) coupled to horseradish peroxidase is added and maintained at 37 ° C for 1 hour (concentration 1/3000 in PBS). The wells are then gently washed several times and the chromogenic substrate of the peroxidase added (o-phenylenediamine dihydrochloride, Dako). The reaction is stopped after 30 minutes with 0.5N sulfuric acid and the OD measured immediately at 492nm on a plate reader spectrophotometer (Dynatech MR 500). All tests are carried out in triplicate, the value chosen being the average of the 3 tests. The whole experiment is repeated 2 times. Fig. 4 shows that all the domains of the EgA31 protein produced are recognized by the antibodies present in the serum of the infected dogs but not by that of the control: the corresponding regions of the EgA31 protein of the parasites therefore all stimulated the immune responses of the dogs during the 'infection. Antibodies were not present before infection (the latter property had been observed in large batches of dogs using the whole protein, Fu et al, 1999 supra). However, the region of the native protein of SEQ ID No. 2 corresponding to the “[Pst-Hind]” recombinant domain of EgA31 is systematically the most immunogenic.
La même expérience a été reprise en utilisant 13 chiens infectés expérimentalement et 9 chiens témoins. Le protocole a été le même que ci-dessus, mais seul le polypeptide de SEQ ID N° 2 correspondant au domaine recombinant « [Pst-Hind] » de EgA31 a été utilisé. La Fig. 5 montre qu'aucun sérum de chien non infecté ou avant infection (sauf 1, le chien n° 15, voir plus loin) ne contient d'anticorps contre ce polypeptide. Les anticorps sont présents chez tous les chiens 28 jours après l'infection et les réponses des différents chiens sont homogènes. Le chien « 15 » qui contenait déjà des anticorps anti « [Pst-Hind] » avant l'infection est un chien dit « de ferme », âgé de 3 ans et demi environ, recruté dans la campagne tunisienne en zone d'endémie pour E. granulosus. Après nécropsie, il est apparu que ce chien était le seul de tous les chiens infectés expérimentalement à n'avoir aucun parasite dans l'intestin. Chez cet animal, la résistance à l'infection est donc corrélée à une forte immunité, préalable à l'infection, contre EgA31, en particulier contre le domaine [Pst-Hind].The same experiment was repeated using 13 experimentally infected dogs and 9 control dogs. The protocol was the same as above, but only the polypeptide of SEQ ID No. 2 corresponding to the “[Pst-Hind]” recombinant domain of EgA31 was used. Fig. 5 shows that no serum from an uninfected dog or before infection (except 1, dog No. 15, see below) does not contain antibodies against this polypeptide. Antibodies are present in all dogs 28 days after infection and the responses of the different dogs are homogeneous. The dog “15” which already contained anti “[Pst-Hind]” antibodies before the infection is a so-called “farm” dog, about 3 and a half years old, recruited in the Tunisian countryside in endemic areas to E. granulosus. After necropsy, it appeared that this dog was the only one of all experimentally infected dogs to have no parasites in the intestine. In this animal, resistance to infection is therefore correlated with strong immunity, prior to infection, against EgA31, in particular against the [Pst-Hind] domain.
En conclusion, toutes les régions de la protéine EgA31 étudiées (polypeptides de SEQ ID N°2, 3, 4 et 5 correspondant respectivement aux domaines [Pst-Hind], [Pst- Dra], [Sal-Hind] et [Sal-Pst] de l'ADNc codant pour EgA31) provoquent la formation d'anticorps lors d'une infection naturelle ou expérimentale par le parasite. Ces régions sont donc toutes immunogènes. Toutefois, le polypeptide de SEQ ID N°2 correspondant au domaine [Pst-Hind] de l'ADNc est plus immunogène que les autres.In conclusion, all the regions of the EgA31 protein studied (polypeptides of SEQ ID No. 2, 3, 4 and 5 corresponding respectively to the domains [Pst-Hind], [Pst-Dra], [Sal-Hind] and [Sal- Pst] of the cDNA coding for EgA31) cause the formation of antibodies during a natural or experimental infection by the parasite. These regions are therefore all immunogenic. However, the polypeptide of SEQ ID No. 2 corresponding to the [Pst-Hind] domain of the cDNA is more immunogenic than the others.
2. Réaction de l'intestin de chiens immunisés contre le fragment SEQ ID N°3 à une infection expérimentale par des protoscolex d' Echinococcus granulosus. La potentialité conceptuelle d'obtenir une protection des chiens et des canidés en général par la stimulation, avant infection, des défenses immunitaires locales (ici l'intestin) est étayée par les observations déjà anciennes de Gemmel et coll. (1986, Parasitol. 92, pp 599-620 ; 1986, Biology of Echinococcus and hydatid disease, Thomson edit, pp 189-216) : après plusieurs cycles d'infection - vermifugation, certains chiens deviennent résistants à une nouvelle infection.2. Reaction of the intestine of dogs immunized against the fragment SEQ ID No. 3 to an experimental infection with protoscolex of Echinococcus granulosus. The conceptual potential of obtaining protection for dogs and canids in general by stimulating, before infection, local immune defenses (here the intestine) is supported by the already old observations of Gemmel et al. (1986, Parasitol. 92, pp 599-620; 1986, Biology of Echinococcus and hydatid disease, Thomson edit, pp 189-216): after several cycles of infection - deworming, some dogs become resistant to a new infection.
Nous avons donc analysé la réponse de l'intestin à l'infection par des protoscolex chez des chiens préalablement immunisés contre le fragment SEQ ID N°3 ou contre un mélange de 3 polypeptides en quantités équipondérales, fragment SEQ ID N°3, EgTM (une tropomyosine d'Echinococcus ; Esteves A., Senorale M., Ehrlich R. A tropomyosin gène is differentially expressed in the larval stage of Echinococcus granulosus. Parasitol. Res. 89 : 501 -502, 2003), FABP1 (Fatty Acid Binding Protein d'Echinococcus ; Esteves A, Portillo V, Ehrlich R. Genomic structure and expression of a gène coding for a new fatty acid binding protein from Echinococcus granulosus. Biochem Biophys Acta 65:2402-2412, 1997). Le travail a été effectué à l'Ecole Vétérinaire de Sidi Thabet (Tunisie) afin de se situer en zone d'endémie. Dans une première expérience, 7 chiens ont été utilisés, 1 témoin, 3 chiens recevant le mélange des 3 protéines et 3 chiens injectés avec le fragment SEQ ID N°3 seul. 2.1 Production des polypeptidesWe therefore analyzed the response of the intestine to infection by protoscolex in dogs previously immunized against the fragment SEQ ID No. 3 or against a mixture of 3 polypeptides in equiponderal amounts, fragment SEQ ID No. 3, EgTM ( Echinococcus tropomyosin; Esteves A., Senorale M., Ehrlich R. A tropomyosin gene is differentially expressed in the larval stage of Echinococcus granulosus. Parasitol. Res. 89: 501 -502, 2003), FABP1 (Fatty Acid Binding Protein Echinococcus; Esteves A, Portillo V, Ehrlich R. Genomic structure and expression of a gene coding for a new fatty acid binding protein from Echinococcus granulosus. Biochem Biophys Acta 65: 2402-2412, 1997). The work was carried out at the Sidi Thabet Veterinary School (Tunisia) in order to be located in an endemic area. In a first experiment, 7 dogs were used, 1 control, 3 dogs receiving the mixture of the 3 proteins and 3 dogs injected with the fragment SEQ ID No. 3 alone. 2.1 Production of the polypeptides
Le fragment [Pst-Dra] de EgA31 de SEQ ID N°3 a été produit en masse comme indiqué préalablement. La pureté du produit fabriqué est vérifiée à chaque production par électrophorèse et la quantité de protéine produite est déterminée avec le « Biorad Protein Assay » après les étapes de désalinisation et de concentration sur colonne Amicon Ultra 10 000 (Millipore). La protéine recombinante de SEQ ID N°3 est conservée à -80°C en solution dans du sérum physiologique stérile jusqu'à utilisation. Les polypeptides EgTM et FABP1 nous ont été fournis respectivement par A. Esteves (laboratoire de biochimie, Pr R. Ehrlich, Montevideo) et F. Schreiber (à l'époque du travail, laboratoire de microbiologie, Newcastle, Pr C. Hormaeche). Ces polypeptides ont été désalinisés, concentrés, dosés et conservés comme ci dessus. 2.2 Protocole expérimental L'immunisation des chiens est obtenue par 3 injections intramusculaires aux jours 0, 75 et 97 de l'expérience. Les animaux sont infectés 15 jours après la dernière injection par ingestion de 150 000 protoscolex collectés la veille dans les abattoirs voisins et dont la viabilité a été contrôlée ; la totalité des parasites est d'abord regroupée en un seul lot avant d'être répartie entre les chiens afin d'assurer une homogénéité de l'infection. L'infection est interrompue après 21 jours ( durée de sécurité qui permet de n'avoir aucun œuf mature formé) par euthanasie des chiens (injection de Dolethal, laboratoires Vétoquinol). L'état de l'intestin est observé et le nombre de protoscolex dans le duodénum est déterminé.The [Pst-Dra] fragment of EgA31 of SEQ ID No. 3 was mass produced as indicated previously. The purity of the product produced is checked at each production by electrophoresis and the quantity of protein produced is determined with the “Biorad Protein Assay” after the desalination and concentration steps on an Amicon Ultra 10,000 column (Millipore). The recombinant protein of SEQ ID No. 3 is stored at -80 ° C in solution in sterile physiological serum until use. The EgTM and FABP1 polypeptides were provided to us respectively by A. Esteves (biochemistry laboratory, Pr R. Ehrlich, Montevideo) and F. Schreiber (at the time of the work, microbiology laboratory, Newcastle, Pr C. Hormaeche). These polypeptides were desalinated, concentrated, assayed and stored as above. 2.2 Experimental protocol Immunization of dogs is obtained by 3 intramuscular injections on days 0, 75 and 97 of the experiment. The animals are infected 15 days after the last injection by ingestion of 150,000 protoscolex collected the day before from neighboring slaughterhouses and whose viability has been checked; all the parasites are first grouped into a single batch before being distributed among the dogs to ensure homogeneity of infection. The infection is stopped after 21 days (safety period which allows to have no mature egg formed) by euthanasia of dogs (injection of Dolethal, Vétoquinol laboratories). The condition of the intestine is observed and the number of protoscolex in the duodenum is determined.
Chaque injection correspond à 500μg au total de polypeptide(s) recombinant(s) en solution dans 0,8 ml de sérum physiologique ; juste avant l'injection, 0,2 ml de Montanide (adjuvant, SEPPIC France) sont ajoutés et la solution est homogénéisée lentement pendant 10 minutes puis filtrée sur membrane (Millex, 0,22μm) sous hotte stérile. L'injection intramusculaire (1 ml) est faite immédiatement, après désinfection du pelage à l'alcool. Les injections faites au chien témoin ne contiennent aucun des 3 antigènes recombinants mais incluent l'adjuvant.Each injection corresponds to 500 μg in total of recombinant polypeptide (s) in solution in 0.8 ml of physiological saline; just before injection, 0.2 ml of Montanide (adjuvant, SEPPIC France) is added and the solution is slowly homogenized for 10 minutes then filtered through a membrane (Millex, 0.22 μm) in a sterile hood. The intramuscular injection (1 ml) is given immediately, after disinfection of the coat with alcohol. The injections made to the control dog do not contain any of the 3 recombinant antigens but include the adjuvant.
2.3 Résultats2.3 Results
Les nécropsies ont été effectuées après 21 jours d'infection. Les résultats bruts sont les suivants :Necropsies were performed after 21 days of infection. The gross results are as follows:
Témoin 3 chiens immunisés 3 chiens avec les immunisés avec 3 polypeptides SEQ ID N°3 seul Quantité 166μg SEQ ID N°3 500μg SEQ ID d'antigène +166μg EgTM N°3 injectée +166μg FABPl Nombre de 2500 22 2160 2800 6040 3340 5 parasites dans le duodénum après 21 jours Etat du normal inflammation, entérite sans rupture des duodénumnormal vaisseaux Reste de l'intestin normal Normal nonnal Etat des plaques normales hypertrophie considérable ; pas d'aspect de Peyer hémorragiqueControl 3 dogs immunized 3 dogs immunized with 3 polypeptides SEQ ID No.3 alone Quantity 166μg SEQ ID No.3 500μg SEQ ID antigen + 166μg EgTM No.3 injected + 166μg FABPl Number of 2500 22 2160 2800 6040 3340 5 parasites in the duodenum after 21 days State of normal inflammation, enteritis without rupture of the duodenumnormal vessels Rest of the normal intestine Normal normal State of normal plaques considerable enlargement; no hemorrhagic Peyer's appearance
Il est donc possible de conclure que - le duodénum, région exclusive de fixation des protoscolex puis des adultes, est la seule région de l'intestin à présenter un aspect différent entre chiens immunisés et chien témoin.It is therefore possible to conclude that - the duodenum, the exclusive region for fixing the protoscolex and then adults, is the only region of the intestine to present a different appearance between immunized dogs and control dogs.
- les plaques de Peyer, organes de l'immunité de cette région de l'organisme, sont très hypertrophiées en réponse à l'infection chez les chiens immunisés ; elles ne le sont pas chez le chien infecté mais non immunisé préalablement : la réponse différentielle est donc liée à l'immunisation préalable, non à l'infection parasitaire seule. Plusieurs centaines de nécropsies de chiens infectés par Echinococcus granulosus, pratiquées dans la même région d'endémie par l'un des déposants (S. Lahmar), n'ont jamais conduit à observer les phénomènes d'inflammation localisés au duodénum et d'hypertrophie des organes immunitaires rapportés ici pour les chiens préalablement immunisés. L'immunisation du chien contre SEQ ID N°3 entraîne une modification de la réponse du duodénum à l'infection ultérieure par Echinococcus granulosus, jamais observée jusqu'à ce jour. Cette modification de réponse implique une forte stimulation des organes de l'immunité locale.- Peyer's patches, organs of immunity in this region of the body, are very enlarged in response to infection in immunized dogs; they are not infected in dogs but not previously immunized: the differential response is therefore linked to prior immunization, not to parasitic infection alone. Several hundred necropsies of dogs infected with Echinococcus granulosus, performed in the same endemic region by one of the depositors (S. Lahmar), have never led to observing the phenomena of inflammation localized in the duodenum and hypertrophy immune organs reported here for previously immunized dogs. Immunization of the dog against SEQ ID N ° 3 leads to a modification of the response of the duodenum to subsequent infection by Echinococcus granulosus, never observed until today. This change in response involves strong stimulation of the organs of local immunity.
- L'immunisation avec SEQ ID N°3 seul suffit à obtenir cette réponse : les 2 autres polypeptides ne sont donc ni indispensables, ni antagonistes. - Immunization with SEQ ID N ° 3 alone is sufficient to obtain this response: the 2 other polypeptides are therefore neither essential nor antagonistic.

Claims

REVENDICATIONS : 1 - Vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, dont l'agent vaccinant est (a) la protéine de SEQ ID N° 1, ou (b) un de ses fragments ayant une activité immunogène au moins équivalente au polypeptide de SEQ ID N° 1, ou (c) un variant de (a) ou de (b) qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente à ce dernier. 2 - Vaccins selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites E. granulosus. 3 - Vaccins selon la revendication 2 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention de l'hydatidose. 4 - Vaccins selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites E. multilocularis. 5 - Vaccins selon la revendication 4 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention de l'échinococcose alvéolaire. 6 - Vaccins selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisés en ce que l'agent vaccinant est un fragment ayant une activité immunologique au moins équivalente au polypeptide de SEQ ID N° 1 choisi parmi : les polypeptides de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°5 ou un variant de l'un de ces polypeptides qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente au polypeptide dont il est le variant. 7 - Vaccins selon la revendication 6 caractérisés en ce l'agent vaccinant est le polypeptide de SEQ ID N°2 ou un de ses variants tels que précédemment définis. 8 - Polypeptides de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 et SEQ ID N°5, ainsi que leurs variants qui correspond à l'un de ces polypeptides modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. 9 - Polypeptides selon la revendication 8 caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi le polypeptide de SEQ ID N°2 et ses variants tels que précédemment définis. 10 - Séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide ou un de ses variants tel que défini à la revendication 8 ou 9. 11 - Séquences d'acides nucléiques selon la revendication 10 caractérisées en ce qu'elles sont constituées par : al) les séquences d'ADNc codant pour un polypeptide ou un de ses variants tel que défini à la revendication 8 ou 9 ; bl) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec les séquences ci-dessus ; cl) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, résultent des séquences al) et bl) ci-dessus et codent pour ledit polypeptide ou ledit variant ; et dl) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. 12 - Vecteurs d'expression transformés avec une séquence d'acide nucléique telle que définie à la revendication 10 ou 11 et comprenant les moyens nécessaires à son expression. 13 - Microorganismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression selon la revendication 12. 14 - Anticorps dirigés contre un polypeptide ou un de ses variants tel que défini à la revendication 8 ou 9. 15 - Anticorps selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il est monoclonal. 16 - Procédé de diagnostic in vitro des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, par mise en évidence des anticorps dirigés contre un polypeptide immunogène de SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, dans lequel on met en contact le ou lesdits polypeptides ou variants immunogènes tels que définis précédemment, avec un prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal pouvant contenir lesdits anticorps et on prélève la présence des anticorps fixés. CLAIMS: 1 - Vaccines intended for the treatment or prevention of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, the vaccinating agent of which is (a ) the protein of SEQ ID No. 1, or (b) one of its fragments having an immunogenic activity at least equivalent to the polypeptide of SEQ ID No. 1, or (c) a variant of (a) or of (b) which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to the latter. 2 - Vaccines according to claim 1 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of infections by E. granulosus parasites. 3 - Vaccines according to claim 2 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of hydatidosis. 4 - Vaccines according to claim 1 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of infections by E. multilocularis parasites. 5 - Vaccines according to claim 4 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of alveolar echinococcosis. 6 - Vaccines according to one of claims 1 to 5 characterized in that the vaccinating agent is a fragment having an immunological activity at least equivalent to the polypeptide of SEQ ID No. 1 chosen from: the polypeptides of SEQ ID No. 2, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 4 or SEQ ID N ° 5 or a variant of one of these polypeptides which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to the polypeptide of which it is the variant. 7 - Vaccines according to claim 6 characterized in that the vaccinating agent is the polypeptide of SEQ ID No. 2 or one of its variants as defined above. 8 - Polypeptides of SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 and SEQ ID No 5, as well as their variants which corresponds to one of these polypeptides modified by insertion, substitution or the deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant. 9 - Polypeptides according to claim 8 characterized in that they are chosen from the polypeptide of SEQ ID No. 2 and its variants as defined above. 10 - Nucleic acid sequences coding for a polypeptide or one of its variants as defined in claim 8 or 9. 11 - Nucleic acid sequences according to claim 10 characterized in that they consist of: a1) cDNA sequences encoding a polypeptide or a variant thereof as defined in claim 8 or 9; bl) DNA sequences hybridizing under strict conditions with the above sequences; c) the DNA sequences which, due to the degeneracy of the genetic code, result from the sequences a1 and b) above and code for said polypeptide or said variant; and dl) the corresponding mRNA and DNA sequences. 12 - Expression vectors transformed with a nucleic acid sequence as defined in claim 10 or 11 and comprising the means necessary for its expression. 13 - Microorganisms or host cells transformed by an expression vector according to claim 12. 14 - Antibodies directed against a polypeptide or one of its variants as defined in claim 8 or 9. 15 - Antibody according to claim 14 characterized in that it is monoclonal. 16 - Method for in vitro diagnosis of infections by parasites of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, by detection of antibodies directed against an immunogenic polypeptide of SEQ ID N ° 2, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 4 or SEQ ID N ° 5, or one of their variants as defined above, in which the said polypeptide or immunogenic variants or variants are brought into contact as defined above , with a biological sample from man or animal which may contain said antibodies and the presence of fixed antibodies is sampled.
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