FR2863499A1

FR2863499A1 - Vaccine for treating or preventing infection by Echinococcus, useful especially for control of hydatid cysts and alveolar echinococcosis, comprises a specific parasite protein or its fragments

Info

Publication number: FR2863499A1
Application number: FR0314614A
Authority: FR
Inventors: Georges Bosquet; Anne Francoise Petavy; Didier Saboulard; Sania Lahmar; Elisabeth Sarciron; Fraize Marion Guinet
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; ECOLE NATIONALE DE MEDECINE VE
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; ECOLE NATIONALE DE MEDECINE VE
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2005-06-17
Also published as: WO2005058350A1

Abstract

Vaccine (A) for treatment or prevention of infection by Echinococcus, especially E. granulosus or E. multilocularis, in humans or animals contains as an active agent: (a) a protein sequence (S1; 601 amino acids (aa)); (b) immunologically equivalent fragments of (1); or (c) immunologically equivalent variants of (a) or (b), modified by insertion, substitution or deletion of one or more aa. Independent claims are also included for the following: (1) polypeptides with sequences (S2; 215 aa), (S3; 413 aa), (S4; 384 aa) or (S5; 174 aa), all given in the specification, and their variants; (2) nucleic acid sequences (I) that encode the polypeptides and variants of (1); (3) an expression vector transformed with (I) and including expression sequences; (4) microorganisms and host cells transformed with the vector of (3); (5) antibodies (Ab) directed against the polypeptides or variants of (1); and (6) an in vitro method for diagnosis of Echinococcus infection by detecting presence of antibodies that can bind to the peptides or variants of (1). ACTIVITY : Anthelmintic. MECHANISM OF ACTION : Vaccine.

Description

La présente invention a pour objet des nouveaux vaccins destinés auThe subject of the present invention is new vaccines intended for

traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier Echinococcus (E.) granulosus et donc de l'hydatidose. treatment or prevention of parasite infections of the family Echinococcus, and in particular Echinococcus (E.) granulosus and therefore hydatidosis.

L'hydatidose est une zoonose à distribution mondiale provoquée par le cestode E. granulosus. La forme larvaire du parasite infecte les bovins, les ovins, les camelidés, cervidés, etc., et l'homme; elle forme des kystes hydatiques dont les localisations principales mais non exclusives sont le foie et les poumons. Ces kystes bourgeonnent sur leur face interne les larves proprement dites, les protoscolex, qui assureront l'infection des hôtes définitifs du parasite. La forme adulte se développe dans l'intestin des canidés au niveau du duodénum à partir des protoscolex ingérés; les oeufs produits par le parasite adulte sont évacués et disséminés avec les fèces. En zone d'endémie, la prévalence peut être très importante à la fois chez le bétail ( jusqu'à 95% des moutons dans certains districts en Tunisie et au Maroc) et chez le chien (70% des animaux dans la région de Fès, au Maroc) Le parasite est la source de pertes économiques considérables (par exemple, plus de la moitié des abats nobles doivent être détruits au Maroc; les brebis atteintes présentent des phénomènes d'émaciation et de perte en production de laine). Hydatidosis is a worldwide zoonotic disease caused by E. granulosus cestode. The larval form of the parasite infects cattle, sheep, camelids, deer, etc., and man; it forms hydatid cysts whose main but not exclusive locations are the liver and lungs. These cysts bud on their inner side the larva proper, the protoscolex, which will ensure the infection of the final hosts of the parasite. The adult form develops in the intestines of canines in the duodenum from protoscolex ingested; the eggs produced by the adult parasite are evacuated and disseminated with the feces. In endemic areas, the prevalence can be very important both in cattle (up to 95% of sheep in some districts in Tunisia and Morocco) and in dogs (70% of animals in the region of Fes, in Morocco) The parasite is the source of considerable economic losses (for example, more than half of the noble offal must be destroyed in Morocco, the affected sheep show signs of wasting and loss in wool production).

Le parasite est également à l'origine d'un problème de santé humaine important: la prévalence chez l'homme atteint 1,43/1000 en zone rurale de la province du Rio Negro, en Argentine, 1,97/1000 dans le Xinjiang en Chine, 2,2/1000 dans le district du Turkana au Kenya, et des valeurs de 20 % ont été relevées localement dans des villages des Andes péruviennes. A titre d'exemple, la moitié des interventions chirurgicales hépatiques au Maroc sont liées à ce parasite. The parasite is also at the origin of an important human health problem: the prevalence in humans reaches 1.43 / 1000 in rural area of the Rio Negro province, in Argentina, 1.97 / 1000 in Xinjiang in China, 2.2 / 1000 in the Turkana district of Kenya, and values of 20% were found locally in villages in the Peruvian Andes. For example, half of liver surgery in Morocco is related to this parasite.

Les moyens de lutte actuels se situent essentiellement à 2 niveaux: - la modification des pratiques d'élevage, incluant la surveillance stricte des chiens, vecteurs de dissémination, qui se nourrissent des abats d'animaux d'élevage contaminés et rejetés; ces changements de pratique rencontrent souvent des difficultés d'application notamment dans les pays en voie de développement; - l'utilisation de vermifuges type Praziquantel ou Arécoline, qui ne sont cependant pas ovicides. Un vaccin pour ovins a été mis au point à partir de protéines recombinantes exprimées par l'embryon (Lightowlers M.W., 1996, Int. J. Parasitol., 26, pp836-842), mais son application se révèle lourde car si l'efficacité est satisfaisante, la durée de protection est courte et le nombre d'animaux à traiter, donc à manipuler, important (l'ensemble du cheptel pour un éleveur). The current control methods are essentially at two levels: - modification of rearing practices, including strict surveillance of the dogs, vectors of dissemination, which feed on offal of infected and discarded farm animals; these changes in practice often encounter difficulties of application, particularly in developing countries; the use of Praziquantel or Arecoline dewormers, which are however not ovicidal. A vaccine for sheep has been developed from recombinant proteins expressed by the embryo (Lightowlers MW, 1996, Int.J. Parasitol., 26, pp836-842), but its application is cumbersome because if the efficacy is satisfactory, the duration of protection is short and the number of animals to be treated, so to handle, important (the entire livestock for a breeder).

On comprend aisément qu'il est urgent de trouver de nouveaux vaccins contre cette maladie. Pour cela, les inventeurs ont réalisés leurs essais chez le chien. En effet, La disparition ou la forte réduction du nombre de chiens disséminant les oeufs serait un moyen d'interrompre le cycle de vie du parasite, et donc de réduire ou de supprimer la contamination du bétail et de l'homme. Le choix du chien comme cible du traitement conduit à avoir un nombre d'animaux à traiter considérablement plus réduit que si la cible est le bétail lui même. It is understandable that it is urgent to find new vaccines against this disease. For this, the inventors have carried out their tests in dogs. Indeed, the disappearance or the strong reduction of the number of dogs spreading the eggs would be a way to interrupt the life cycle of the parasite, and thus reduce or eliminate the contamination of livestock and humans. The choice of the dog as the target of the treatment leads to having a considerably smaller number of animals to be treated than if the target is the cattle itself.

Dans un travail antérieur (Fu et coll., Mol. Biochem. Parasitol., 102, p. 43 52, 1999), une protéine du parasite détectée en raison de son immunogénicité très importante lors des infections naturelles ou expérimentales chez le chien a été identifiée et préparée. Une banque ADNc d'Echinococcus granulosus dans le vecteur d'expression lambda gt22 avait été criblée à l'aide de sérum de chiens infectés par le parasite (3 mois en élevage protégé). L'ensemble des clones ADNc exprimant les protéines reconnues par les anticorps avaient été analysés une seconde fois avec les sérums individuels de chiens infectés et les intensités des réactions comparées: le clone fournissant la réaction la plus forte avec les sérums de tous les chiens avait été retenu et dénommé EgA31. Cette publication permet donc de mettre en évidence l'existance d'anticorps circulants dirigés contre la protéine EgA31 chez des chiens infectés par le parasite E. granulosus. In a previous work (Fu et al., Mol Biochem Parasitol., 102, p 43, 52, 1999), a parasite protein detected due to its very high immunogenicity during natural or experimental infections in dogs was identified and prepared. A cDNA library of Echinococcus granulosus in the lambda gt22 expression vector was screened with serum from dogs infected with the parasite (3 months in protected breeding). All the cDNA clones expressing the proteins recognized by the antibodies had been analyzed a second time with the individual sera of infected dogs and the intensities of the compared reactions: the clone providing the strongest reaction with the sera of all the dogs had been analyzed. retained and referred to as EgA31. This publication thus makes it possible to demonstrate the existence of circulating antibodies directed against the EgA31 protein in dogs infected with the E. granulosus parasite.

Cet ADNc code pour une protéine riche en leucine, de structure putative hélicoïdale, comportant un domaine riche en proline de type SH3 (Sarc Homology 3 type 1) proche de la région C terminale de la protéine; ces domaines sont impliqués notamment dans des interactions protéine protéine. Par ailleurs, 28 sites de phosphorylation et 4 sites de myristylation putatifs peuvent être repérés grâce au logiciel PROSITE. La séquence SEQ ID N 1 de EgA31 a été déposée (SwissProt) sous le numéro AF 067 807. This cDNA encodes a leucine-rich protein of helical putative structure, comprising a proline-rich domain of SH3 type (Sarc Homology 3 type 1) close to the C-terminal region of the protein; these domains are involved especially in protein protein interactions. In addition, 28 phosphorylation sites and 4 putative myristylation sites can be identified using PROSITE software. The sequence SEQ ID No. 1 of EgA31 has been filed (SwissProt) under number AF 067 807.

Dans Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000, on montre la stimulation de la proliferation cellulaire dans les ganglions poplités et préscapulaires du chien naïf après sensiblisation à la protéine EgA31. In Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000, the stimulation of cell proliferation in popliteal and prescapular ganglia of the naive dog after sensiblization to EgA31 protein is shown.

Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que la protéine de séquence SEQ ID N 1 nommée EgA31, ainsi que certains de ses fragments ou variants, présentent une activité immunogène d' E. granulosus et entraînent, notamment chez le chien, une modification de la réponse du duodénum à l'infection ultérieure par E. granulosus et peut donc de ce fait faire l'objet de vaccins contre les infections dûes à ce type de parasites. Aucune des deux précédentes publications (Molecular and Biochemical Parasitology 102, 43-52, 1999 et Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000) ne laissaient présager les résultats présentés dans la présente demande de brevet à savoir: une réponse inflammatoire et une hypertrophie des organes de l'immunité strictement localisées au site de fixation des parasites chez des chiens immunisés avec un fragment de EgA31, puis infectés, la présence d'anticorps chez des chiens infectés, en quantité plus importante contre un des domaines de la protéine de séquence SEQ ID N 2, l'échec de l'infection expérimentale d'un chien présentant des anticorps circulants contre ce domaine, avant cette infection expérimentale. The inventors have now demonstrated that the protein of SEQ ID No. 1 sequence named EgA31, as well as some of its fragments or variants, exhibit an immunogenic activity of E. granulosus and cause, especially in dogs, a modification of the response. duodenum to subsequent infection with E. granulosus and can therefore be vaccinated against infections caused by this type of parasite. None of the two previous publications (Molecular and Biochemical Parasitology 102, 43-52, 1999 and Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000) foreshadowed the results presented in the present patent application, namely: an inflammatory response and hypertrophy of the immunity organs strictly localized at the parasite binding site in dogs immunized with a fragment of EgA31, then infected, the presence of antibodies in infected dogs, in greater quantity against one of the domains of the protein sequence SEQ ID N 2, failure of experimental infection of a dog with circulating antibodies against this area, before this experimental infection.

Ces différents résultats vont au soutien de l'activité immunogène protectrice de la protéine EgA31 et de ses fragments étudiés dans la présente invention. These various results support the protective immunogenic activity of the EgA31 protein and its fragments studied in the present invention.

La présente invention a donc pour objet des nouveaux vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, dont l'agent vaccinant est (a) la protéine de séquence SEQ ID N 1, ou (b) un de ses fragments ayant une activité immunogène au moins équivalente à la protéine SEQ ID N 1, ou (c) un variant de (a) ou de (b) qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunogène au moins équivalente à ce dernier. The subject of the present invention is therefore new vaccines intended for the treatment or prevention of parasite infections of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, of which vaccinating agent is (a) the protein of sequence SEQ ID No. 1, or (b) one of its fragments having an immunogenic activity at least equivalent to the protein SEQ ID No. 1, or (c) a variant of (a) or of (b) which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunogenic activity at least equivalent to the latter.

De préférence, les vaccins de l'invention sont destinés au traitement ou à la prévention de l'hydatidose ou de l'échinococcose alvéolaire. L'hydatidose est préférée. En effet, la protéine EgA31 d'Echinococcus granulosus est présente chez la larve (protoscolex, membrane germinative) mais surtout chez l'adulte du parasite. A ce stade, elle est la plus abondante dans le tégument, au niveau des microtriches, zones d'échanges trophiques entre le parasite et son hôte. Elle est aussi présente chez Echinococcus multilocularis, espèce parasitaire très proche de E. granulosus, et responsable dans l'hémisphère nord de l'échinococcose alvéolaire dont la transmission à l'homme s'effectue également par les canidés. Preferably, the vaccines of the invention are intended for the treatment or prevention of hydatidosis or alveolar echinococcosis. Hydatidose is preferred. Indeed, the EgA31 protein of Echinococcus granulosus is present in the larva (protoscolex, germinal membrane) but especially in the adult of the parasite. At this stage, it is the most abundant in the integument, at the level of microtriches, areas of trophic exchange between the parasite and its host. It is also present in Echinococcus multilocularis, a parasitic species very close to E. granulosus, and responsible in the northern hemisphere for alveolar echinococcosis, which is also transmitted to humans by canines.

Selon l'invention, il a été démontré que les polypeptides ci-dessus mentionnés sont capables de générer une réponse immunogène face à une infection par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier d'E. granulosus, chez un hôte sensible. Par hôte sensible, on entend par exemple l'homme ou un animal, par exemple un chien. Par polypeptide présentant une activité immunogène , il faut comprendre au sens de l'invention, un polypeptide reconnu par des anticorps circulants produits chez un hôte sensible infectés par parasites de la famille Echinococcus. Il a également été démontré que les polypeptides ci-dessus mentionnés modifier la potentialité de réponse de l'intestin d'un hôte sensible, face à une infection par parasites de la famille Echinococcus. According to the invention, it has been demonstrated that the above-mentioned polypeptides are capable of generating an immunogenic response to parasite infection of the Echinococcus family, and in particular of E. coli. granulosus, in a susceptible host. By sensitive host is meant for example the man or an animal, for example a dog. By polypeptide having an immunogenic activity, it is to be understood within the meaning of the invention, a polypeptide recognized by circulating antibodies produced in a susceptible host infected parasite family Echinococcus. It has also been demonstrated that the above-mentioned polypeptides modify the response potential of the intestine of a susceptible host, in the face of parasite infection of the Echinococcus family.

Les fragments (b) et les variants (c) ci-dessus mentionnés ne peuvent bien entendu pas englober la protéine de SEQ ID N 1 dans son entier. Par une une activité immunogène au moins équivalente à ce dernier , on entend un fragment ou un variant tel que défini ci-dessus qui possède la même, voire une meilleure, réponse immunogène à une infection par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier d'E. granulosus, chez un hôte sensible. Cette équivalence peut notamment être mesurée avec la méthode Elisa, par exemple selon le protocole décrit plus loin au paragraphe 1.2 de la partie expérimentale. The fragments (b) and the variants (c) mentioned above can not, of course, encompass the protein of SEQ ID No. 1 as a whole. By an immunogenic activity at least equivalent to the latter is meant a fragment or a variant as defined above which has the same or even a better immunogenic response to parasite infection of the family Echinococcus, and particularly of E. granulosus, in a susceptible host. This equivalence can in particular be measured with the Elisa method, for example according to the protocol described later in section 1.2 of the experimental part.

L'invention a notamment pour objet des nouveaux vaccins tels que définis ci-dessus dont l'agent vaccinant est un fragment ayant une activité immunologique au moins équivalente au polypeptide de SEQ ID N 1 choisi parmi: les polypeptides de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et les variants de l'un de ces polypeptides qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunogène au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. Le polypeptide de SEQ ID N 2 et ses variants ci-dessus définis, qui présentent la plus grande activité immunogène, sont particulièrement préférés en tant qu'agent vaccinant. The subject of the invention is in particular new vaccines as defined above, the vaccinating agent of which is a fragment having an immunological activity at least equivalent to the polypeptide of SEQ ID No. 1 chosen from: the polypeptides of SEQ ID No. 2, SEQ ID N 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and variants of one of these polypeptides which has been modified by insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has immunogenic activity. at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant. The polypeptide of SEQ ID No. 2 and its variants defined above, which exhibit the greatest immunogenic activity, are particularly preferred as a vaccinating agent.

L'agent vaccinant est associé à un ou plusieurs adjuvants appropriés et pharmaceutiquement acceptables. En tant qu'agent adjuvant acceptable, on peut citer les saponines et leurs dérivés, le muramyldipeptide, le dimycollate trehalose, l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, d'autres émulsions eau dans huile, les doubles émulsions, le dextran,le diéthylaminoéthyl-dextran, les sels minéraux tels que le potassium alum, le phosphate d'aluminium, l'hydroxide d'aluminium, la bentonite, zymosan, polyelectrolytes, rétinol, phosphate de calcium, protamine, sarcosine, glycérol, sorbitol, propylène glycol... Les adjuvants dotés de propriétés immunostimulantes seront particulièrement préférés. The vaccinating agent is combined with one or more suitable and pharmaceutically acceptable adjuvants. As an acceptable adjunct, mention may be made of saponins and their derivatives, muramyldipeptide, dimycollate trehalose, Freund's complete adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, other water-in-oil emulsions, double emulsions, dextran, diethylaminoethyl-dextran, mineral salts such as potassium alum, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, bentonite, zymosan, polyelectrolytes, retinol, calcium phosphate, protamine, sarcosine, glycerol, sorbitol propylene glycol ... Adjuvants with immunostimulatory properties will be particularly preferred.

Dans les vaccins selon l'invention, il est possible d'associer plusieurs agents vaccinants. In the vaccines according to the invention, it is possible to associate several vaccinating agents.

Le vaccin peut contenir directement le polypeptide immunogène ou bien la séquence ADN codant pour ce polypeptide, alors produit in vivo au sein de l'hôte. Ces derniers types de vaccins sont notamment décrits dans US 4603112 et Brochier et al. Nature, 1991, 354, 520. The vaccine may directly contain the immunogenic polypeptide or the DNA sequence encoding that polypeptide, then produced in vivo within the host. The latter types of vaccines are described in US 4603112 and Brochier et al. Nature, 1991, 354, 520.

Le vaccin selon l'invention peut être administré selon toute technique connue par l'homme de l'art, notamment orale ou parentérale. L'administration parentérale est néanmoins préférée pour l'administration de vaccins contenant le polypeptide immunogène. Dans le cas de vaccins contenant l'ADN codant, on utilisera de façon avantageuse la voie orale. La dose de vaccin qui doit être administrée dépend du type, du poids, de la taille de l'homme ou de l'animal à qui le vaccin doit être administrée et du degré d'immunogénicité de l'agent vaccinant. De préférence, le vaccin sera formulé de façon à ce que des doses de l'ordre de 1 à 5 ml soient suffisantes pour obtenir un effet protecteur immunogène. The vaccine according to the invention may be administered according to any technique known to those skilled in the art, in particular oral or parenteral. Parenteral administration is nevertheless preferred for administration of vaccines containing the immunogenic polypeptide. In the case of vaccines containing the coding DNA, the oral route will advantageously be used. The dose of vaccine to be administered depends on the type, weight, size of man or animal to which the vaccine is to be administered and the degree of immunogenicity of the vaccine agent. Preferably, the vaccine will be formulated so that doses of the order of 1 to 5 ml are sufficient to obtain an immunogenic protective effect.

L'invention a également pour objet les polypeptides de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5, ainsi que leurs variants qui correspond à l'un de ces polypeptides modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. Ces variants contiennent au moins un épitope responsable de l'activité immunogène du polypeptide initial et qui reste donc fonctionnellement équivalent. Ils peuvent être obtenus à partir du polypeptide natif selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, par exemple par mutagenèse sur site spécifique (Adelman et al. DNA, 2, 183, 1983) et seront alors appelés mutant. Par exemple, il est possible par une telle technique de substituer dans une séquence des amino acides par d'autres amino acides équivalents. Les groupes d'amino acides ci-après sont généralement reconnus comme équivalents: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly Asn, Asp, Glu, Gln, His, Arg, Lys, Met, Leu, Ife, Val, and - Phe, Tyr, Trp. The subject of the invention is also the polypeptides of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5, as well as their variants, which corresponds to one of these polypeptides modified by the insertion, the substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant. These variants contain at least one epitope responsible for the immunogenic activity of the initial polypeptide and which therefore remains functionally equivalent. They can be obtained from the native polypeptide according to techniques well known to those skilled in the art, for example by site-specific mutagenesis (Adelman et al., DNA, 2, 183, 1983) and will then be called mutant. For example, it is possible by such a technique to substitute in one amino acid sequence with other equivalent amino acids. The following amino acid groups are generally recognized as being equivalent: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly Asn, Asp, Glu, Gln, His, Arg, Lys, Met, Leu, Ife, Val, and-Phe, Tyr, Trp.

De préférence, ces variants présentent un degré d'homologie avec le polypeptide dont ils sont le variant, au moins égal à 80 %. Ce degré d'homologie est, au sens de l'invention, déterminé par les techniques de comparaison de séquences protéiques ou nucléiques, et par exemple la technique BLAST telle que décrite par ALTSCHUL S.F. et al. dans Nucleic Acid Research 1997, 25, 3389-3402. Preferably, these variants have a degree of homology with the polypeptide of which they are the variant, at least equal to 80%. This degree of homology is, within the meaning of the invention, determined by the protein or nucleic sequence comparison techniques, and for example the BLAST technique as described by ALTSCHUL S.F. et al. in Nucleic Acid Research 1997, 25, 3389-3402.

La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomique, les séquences d'ADNc ou d'ARNm qui comprennent ou sont constituées par un enchaînement de nucléotides codant pour le polypeptide de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment. Ces séquences nucléotidiques peuvent être définies comme: al) les séquences d'ADNc codant pour le polypeptide ou l'un de ses variants tels que définis ci-dessus; b 1) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec les séquences ci-dessus; cl) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, résultent des séquences al) et b1) ci-dessus et codent pour ledit polypeptide ou ledit variant; et dl) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. The subject of the present invention is also the nucleic acid sequences, namely the genomic DNA sequences, the cDNA or mRNA sequences which comprise or consist of a sequence of nucleotides coding for the polypeptide of SEQ ID N 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5, or one of their variants as defined above. These nucleotide sequences may be defined as: a1) the cDNA sequences coding for the polypeptide or one of its variants as defined above; b) DNA sequences hybridizing under strict conditions with the above sequences; cl) DNA sequences which, because of degeneracy of the genetic code, result from sequences a1 and b1) above and encode said polypeptide or variant; and d1) the corresponding mRNA and DNA sequences.

En particulier, on pourra citer les séquences d'ADN correspondant à SEQ ID 30 N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8 et SEQ ID N 9. In particular, mention may be made of the DNA sequences corresponding to SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 and SEQ ID No. 9.

Les polypeptides, fragments et variants peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de: culture d'un microorganisme transformé ou de cellules eucaryotes transformées à l'aide d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention et récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit par le dit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. The polypeptides, fragments and peptide variants according to the invention may be obtained by the genetic engineering technique which comprises the steps of: culturing a transformed microorganism or eukaryotic cells transformed using a nucleic acid sequence according to the invention and recovery of the protein or peptide fragment produced by said microorganism or eukaryotic cells.

Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après: Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York Academy of Sciences, volume 646, 1991. Cette méthode comprend, par exemple, l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression. This technique is well known to those skilled in the art. For more details about it, we can refer to the following work: Recombinant DNA Technology I, Ales Prokop Editors, Raskesh K Bajpai; Annals of the New York Academy of Sciences, volume 646, 1991. This method comprises, for example, the insertion of a DNA sequence coding for a peptide sequence according to the invention into an expression vector such as a plasmid and the transformation of cells with this expression vector.

Ils peuvent également être préparés par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme du métier, par utilisation de la méthode Applied Biosystems. They can also be prepared by conventional peptide syntheses well known to those skilled in the art, using the Applied Biosystems method.

Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique, ou par génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans SAMBROOK et al. (supra). The nucleic acids according to the invention can be prepared by chemical synthesis, or by genetic engineering using the techniques well known to those skilled in the art and described for example in SAMBROOK et al. (Supra).

La présente invention a également pour objet des vecteurs d'expression tel qu'un plasmide comprenant une séquence d'ADN codant pour le polypeptide de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, ainsi que les cellules hôtes transformées avec ce vecteur d'expression. The subject of the present invention is also expression vectors such as a plasmid comprising a DNA sequence coding for the polypeptide of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5, or a of their variants as defined above, as well as the host cells transformed with this expression vector.

Ces cellules hôtes peuvent être des microorganismes procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, outre la séquence d'ADN de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des microorganismes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du microorganisme à transformer, les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. These host cells may be prokaryotic microorganisms and eukaryotic cells transformed using an expression vector containing a DNA sequence according to the invention. This expression vector, which may for example be in the form of a plasmid, must comprise, in addition to the DNA sequence of the invention, the means necessary for its expression, such as in particular a promoter, a transcription terminator. , an origin of replication and preferably a selection marker. The transformation of microorganisms and eukaryotic cells is a technique well known to those skilled in the art that can easily determine, depending on the microorganism to be transformed, the means necessary for the expression of the DNA sequence according to the invention.

Le microorganisme préféré aux fins de l'invention est E. coli alors qu'on utilise de préférence Saccharomyces cerevisiae comme levure. A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules COS, CHO, SF9 Jurkat, etc., toutes étant répertoriées à l'ATCC. The preferred microorganism for the purpose of the invention is E. coli whereas Saccharomyces cerevisiae is preferably used as yeast. Examples of eukaryotic cells that are suitable for the purposes of the invention include COS, CHO, SF9 Jurkat cells, etc., all of which are listed with the ATCC.

La présente invention a également pour objet des anticorps dirigés contre un polypeptide de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment. The subject of the present invention is also antibodies directed against a polypeptide of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5, or one of their variants as defined above.

Ces anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus par le procédé bien connu de KOHLER et MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975) ou des anticorps polyclonaux obtenus selon les procédés classiques d'immunisation d'animaux (Antibodies, a laboratory manual. E. Harlow & D. Lane. Cold Spring Harbor laboratory press, 1988). These antibodies may be monoclonal antibodies obtained by the well-known method of KOHLER and MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975) or polyclonal antibodies obtained according to conventional methods of animal immunization (Antibodies, a laboratory manual. E. Harlow & D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, par mise en évidence des anticorps dirigés contre un polypeptide immunogène de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, dans lequel on met en contact le ou lesdits polypeptides ou variants immunogènes tels que définis, avec un prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal pouvant contenir lesdits anticorps et on prélève la présence des anticorps fixés. De préférence, les procédés de diagnostic de l'invention sont destinés au diagnostic de l'hydatidose ou de l'échinococcose alvéolaire. L'hydatidose est préférée. According to another of its aspects, the subject of the present invention is also a process for the in vitro diagnosis of parasite infections of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, by detecting antibodies directed against an immunogenic polypeptide of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5, or one of their variants as defined above, in which the or said polypeptides or immunogenic variants as defined, with a biological sample of humans or animals that may contain said antibodies and the presence of bound antibodies is taken. Preferably, the diagnostic methods of the invention are intended for the diagnosis of hydatidosis or alveolar echinococcosis. Hydatidose is preferred.

Le procédé de révélation peut être basé sur une méthode radioimmunologique 25 de type RIA, RIPA, IRMA ou une méthode de type immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de type ELISA. The method of revelation may be based on a radioimmunological method of the RIA, RIPA, IRMA type or a Western-BLOT immunoenzymatic method on strips or ELISA type.

Les éléments de l'invention relatifs au polypeptide de SEQ ID N 2 et ses variants sont préférés. The elements of the invention relating to the polypeptide of SEQ ID No. 2 and its variants are preferred.

L'invention va maintenant être décrite en détails à l'aide de l'exposé expérimental ci-après s'appuyant sur les figures lA à 5 présentées en annexe: Les Fig. lA à lE présentent la méthode de sous clonage des 4 fragments de restriction Sall-Hind3, Pstl-Hind3, Pstl- Dral, Sall-Pstl. Les éléments de séquences surlignées en noir dans les constructions correspondent à la séquence de pQE80L. Plus précisément, la Fig.1A représente le vecteur pQE-80 ( 475 lpb) (Qiagen) : Région du site de clonages multiples; la Fig.1B représente l'insertion de EgA31 [Sal I Hind III] dans pQE80L; Clone Sal/Hind 2A (CSD1) ; la Fig.1C représente l'insertion de EgA31 [Pst I Hind III] dans pQE80L; Clone Pst/Hind D (CSD2) ; la Fig.1D représente l'insertion de EgA31 [Pst I Dra I] dans pQE80L; Clone Pst/Dra 9 (CSD12) ; la Fig.1E représente l'insertion de EgA31 [Sal I - Pst I] dans pQE80L; Clone Sal /Pst. The invention will now be described in detail with the aid of the following experimental description based on FIGS. 1A to 5 presented in the appendix: FIGS. 1A to 1E show the method of subcloning the 4 SalI-Hind3, PstI-Hind3, PstI-DraI, SalI-PstI restriction fragments. The sequence elements highlighted in black in the constructions correspond to the sequence of pQE80L. More precisely, FIG. 1A represents the vector pQE-80 (475 lpb) (Qiagen): Region of the multiple cloning site; Fig.1B shows the insertion of EgA31 [Sal I Hind III] in pQE80L; Clone Sal / Hind 2A (CSD1); Fig.1C shows the insertion of EgA31 [Pst I Hind III] in pQE80L; Clone Pst / Hind D (CSD2); Fig.1D shows the insertion of EgA31 [Pst I Dra I] in pQE80L; Clone Pst / Dra 9 (CSD12); Fig.1E shows the insertion of EgA31 [Sal I-Pst I] in pQE80L; Clone Sal / Pst.

La Fig. 2 représente le positionnement des domaines ADNc correspondant aux 10 4 polypeptides de SEQ ID N 2 à 5 à produire. Fig. 2 represents the positioning of the cDNA domains corresponding to the 4 polypeptides of SEQ ID N 2 to 5 to be produced.

La Fig. 3 résume de façon synoptique les étapes de l'obtention des polypeptides recombinants de SEQ ID N 2 à 5. Fig. 3 summarizes the steps of obtaining the recombinant polypeptides of SEQ ID N 2 to 5.

La Fig. 4 représente les résultats de dosage au spectrophotomètre des anticorps anti EgA31. Fig. 4 shows the spectrophotometer assay results of the anti EgA31 antibodies.

La Fig. 5 représente les résultats d'absorption après test Elisa. Fig. 5 represents the results of absorption after Elisa test.

1. Comparaison de l'immunogénicité des différents domaines de la protéine. 1. Comparison of the immunogenicity of the different domains of the protein.

1.1 Production de polypeptides correspondants à des domaines différents de EgA3 1 La détermination de la structure putative de la protéine par la méthode GOR (Garnier J., Osguthorpe DJ., Robson B., 1978, J Mol Biol, 120, pp 97-120) suggère l'existence de plusieurs domaines sur cette protéine (Fig. 2 et 3). L'ADNc de SEQ ID N 10, initialement cloné dans le plasmide pSK+ de Stratagène où il constitue un insert Sal-Notl de 1836 paires de bases a été sous cloné en 4 fragments d'ADN correspondant chacun approximativement aux domaines protéiques putatifs retenus. 1.1 Production of polypeptides corresponding to domains other than EgA3 1 Determination of the putative structure of the protein by the GOR method (Garnier J., Osguthorpe DJ., Robson B., 1978, J. Mol Biol, 120, pp 97-120 ) suggests the existence of several domains on this protein (Figs 2 and 3). The cDNA of SEQ ID No. 10, initially cloned into the Stratagene plasmid pSK +, where it constitutes a 1836 base pair Sal-NotI insert, was subcloned into 4 DNA fragments each corresponding approximately to the putative protein domains retained.

Ces polypeptides sont dénommés dans la suite du texte par les initiales des endonucléases de restriction qui déterminent les bornes du fragment d'ADN qui permet de les générer ([Sal-Pst], [Sal-Hind], [Pst-Hind], [PstDra] ). Les constructions ont été effectuées (Fig. lA à lE et Fig. 3) dans le plasmide pQE80L de Qiagen qui permet l'expression de l'insert sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG (promoteur Lac z) ; le polypeptide recombinant obtenu porte à son extrémité N terminale une série de 6 histidines codées par les séquences du plasmide qui suivent le codon initiateur de traduction. Les constructions ont été faites en respectant la phase de lecture de LADNc originel (contrôle par séquençage sur Séquenceur Mégabace). Les plasmides recombinants ont été utilisés pour transformer la souche bactérienne BL21 (Fig. 3). These polypeptides are referred to hereinafter by the initials of the restriction endonucleases which determine the bounds of the DNA fragment which makes it possible to generate them ([Sal-Pst], [Sal-Hind], [Pst-Hind], [ PstDra]). Constructs were performed (Figs 1A to 1E and Fig. 3) in Qiagen plasmid pQE80L which allows expression of the insert under the control of an IPTG inducible promoter (Lac z promoter); the recombinant polypeptide obtained carries at its N-terminus a series of 6 histidines coded by the sequences of the plasmid which follow the translation initiation codon. The constructs were made respecting the reading phase of original LADNc (sequencing control on Sequencer Megabace). Recombinant plasmids were used to transform bacterial strain BL21 (Fig. 3).

Les étapes de la préparation des polypeptides sont alors: culture en masse des bactéries recombinantes en présence de chloramphénicol et ampicilline (100 microgrammes/ml chacun) ; addition d'isopropyl RD thiogalactoside (Sigma), à la concentration de 1 mM finale, lorsque la D. O. de la culture atteint 0,5 à 600nm; 3 heures de culture à 37 C sous agitation vigoureuse; centrifugation des cellules, lyse du culot dans un tampon pH 8,0 dénaturant (urée 8M) ; élution lente du surnageant de lyse sur des colonnes de billes d'agarose couplée au nickel acide nitriloacétique (Qiagen) qui retiennent les polypeptides portant les résidus histidine en N terminal; gradation de tampons de pH 6,3 puis 5,9 et 4,5 contenant de l'urée à la concentration de 8M pour éliminer les protéines retenues de façon non sélective par la colonne, puis libérer (pH 4,5) le polypeptide d'intérêt (résumé des étapes Fig. 3). Une électrophorèse en SDS PAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie R250 permet de s'assurer de la taille et de la pureté du matériel synthétisé. The steps in the preparation of the polypeptides are then: mass culture of the recombinant bacteria in the presence of chloramphenicol and ampicillin (100 micrograms / ml each); addition of isopropyl RD thiogalactoside (Sigma), at the final concentration of 1 mM, when the D.O. of the culture reaches 0.5 to 600 nm; 3 hours of culture at 37 C with vigorous stirring; centrifugation of the cells, lysis of the pellet in a pH 8.0 denaturing buffer (8M urea); slow elution of the lysis supernatant on columns of nitriloacetic acid-coupled nickel-bearing agarose beads (Qiagen) which retain the N-terminal histidine-bearing polypeptides; gradation of pH 6,3 and then 5,9 and 4,5 buffers containing 8M urea to remove non-selectively retained proteins from the column, then release (pH 4,5) the polypeptide of interest (summary of steps Fig. 3). SDS PAGE electrophoresis followed by staining with Coomassie blue R250 ensures the size and purity of the synthesized material.

Plus précisément, on opère comme suit: L'ADNc EgA31 (ref AF 067807) avait été initialement cloné dans le plasmide BlueScript II SK+ (Stratagène) et multiplié dans la souche DH5 alpha de Escherichia coli. Afin de préparer les sous clones envisagés, une production en masse de l'ADNn plasmidien a été effectuée à partir d'une culture dans 30 ml de milieu LB contenant 100 microgrammes par ml d'ampicilline. La culture ensemencée avec la souche bactérienne transformée est maintenue une nuit à 37 C sous agitation. L'extraction de l'ADN plasmidien est faite à l'aide du kit MaxiPrep Qiagen Plasmid Midi Kit , selon les instructions du fournisseur. Le matériel préparé est stocké dans un tampon Tris HC1 10mM, pH 8,5 et conservé à -80 C. Le rapport des absorptions de l'ADN préparé mesurées à 260 et 280 nanomètres est de 1,91, ce qui atteste d'une qualité satisfaisante pour la suite des opérations. Specifically, the procedure is as follows: The EgA31 cDNA (ref AF 067807) was originally cloned into the BlueScript II SK + plasmid (Stratagene) and multiplied in the DH5 alpha strain of Escherichia coli. In order to prepare the envisaged subclones, bulk production of the plasmid DNA was made from a culture in 30 ml of LB medium containing 100 micrograms per ml of ampicillin. The culture seeded with the transformed bacterial strain is kept overnight at 37 ° C. with stirring. Extraction of the plasmid DNA is done using the MaxiPrep Qiagen Plasmid Midi Kit, according to the supplier's instructions. The prepared material is stored in 10 mM Tris HCl buffer, pH 8.5 and stored at -80 ° C. The ratio of the absorptions of the prepared DNA measured at 260 and 280 nanometers is 1.91, which is indicative of satisfactory quality for subsequent operations.

111. Ouverture du plasmide recombinant pSK+EgA31 aux sites Sali ou Pstl. 111. Opening of the recombinant plasmid pSK + EgA31 at the SalI or PstI sites.

Environ 10 microgrammes de plasmide recombinant sont linéarisés en 1 heure à 37 C avec 20 unités d'endonucléase de restriction Sali (Roche) ou d'endonucléase de restriction Pstl (Roche) dans le tampon préparé par le fournisseur et selon ses instructions. L'ADN linéarisé est ensuite purifié (Kit Qiagen) pour éliminer l'enzyme résiduelle et le tampon de digestion, puis mis en solution dans le tampon Tris HC1 10 mM, pH 8,5. About 10 micrograms of recombinant plasmid are linearized in 1 hour at 37 C with 20 units of SalI restriction endonuclease (Roche) or PstI restriction endonuclease (Roche) in the buffer prepared by the supplier and according to his instructions. The linearized DNA is then purified (Qiagen Kit) to remove the residual enzyme and the digestion buffer, and then dissolved in 10 mM Tris HCl buffer, pH 8.5.

112. Préparation des fragments d'ADNc Sall Hind III et Sali Pstl Pour chaque préparation, environ 5 microgrammes de l'ADN linéarisé ci-dessus avec Sali sont digérés pendant 1 heure à 37 C par 20 unités d'endonucléase de restriction Pstl ou Hind III dans le tampon préparé par le fournisseur. Les produits de digestion sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% dans le tampon TAE x 0,5; 2 microlitres de bleu de bromophénol à 0,01% dans du glycérol à 50% sont ajoutés à chacun des échantillons analysés; la migration dure 30 minutes à 100 volts en présence de bromure d'éthidium dans le tampon. En fin d'électrophorèse, les fragments sont visualisés en UV sur un transilluminateur (Biorad) et des bandes d'agarose contenant le fragment d'intérêt sont très rapidement découpées à la lame de rasoir. 112. Preparation of Hind III and SalI PstI SalI cDNA Fragments For each preparation, about 5 micrograms of the above linearized DNA with SalI are digested for 1 hour at 37C with 20 units of PstI or Hind restriction endonuclease. III in the buffer prepared by the supplier. The digests are then separated by electrophoresis on 1% agarose gel in TAE buffer x 0.5; 2 microliters of 0.01% bromophenol blue in 50% glycerol are added to each of the analyzed samples; the migration lasts 30 minutes at 100 volts in the presence of ethidium bromide in the buffer. At the end of electrophoresis, the fragments are visualized in UV on a transilluminator (Biorad) and agarose bands containing the fragment of interest are very quickly cut with the razor blade.

113. Préparation des fragments d'ADNc Pstl Hind III et Pstl Dral Environ 5 microgrammes de plasmide recombinant pSK+EgA31 linérarisés par Pst1 comme décrit en 111 sont digérés soit par 20 unités d'endonucléase de restriction Hind III, soit par 20 unités d'endonucléase de restriction Dral dans les tampons adaptés préparés par le fournisseur. Les fragments d'ADN digérés sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% comme supra. En fin d'électrophorèse, des bandes d'agarose contenant les fragments d'intérêt sont très rapidement découpées sur le gel. 113. Preparation of PstI Hind III and PstI DraI cDNA Fragments About 5 micrograms of Pst1-linearized recombinant plasmid pSK + EgA31 as described in III are digested with either 20 units of Hind III restriction endonuclease or 20 units of Hind III restriction endonuclease. restriction endonuclease Dral in suitable buffers prepared by the supplier. The digested DNA fragments are separated by electrophoresis on 1% agarose gel as above. At the end of electrophoresis, agarose strips containing the fragments of interest are very rapidly cut on the gel.

114. Purification des 4 fragments d'ADN correspondant respectivement aux 25 séquences SEQ ID N 6, 7, 8 et 9. 114. Purification of the 4 DNA fragments corresponding respectively to SEQ ID N 6, 7, 8 and 9.

Les préparations décrites ci-dessus sont effectuées 3 fois et les bandes d'agarose contenant respectivement les séquences SEQ ID N 6, 7, 8 ou 9 sont regroupées. L'ADN en est extrait en utilisant le kit Cleanup Qiagen Gel Extraction selon les instructions du fournisseur. L'ADN est collecté et conservé dans le tampon Tris HC1 10mM, pH 8,5 à -80 C. The preparations described above are carried out 3 times and the agarose bands respectively containing the sequences SEQ ID N 6, 7, 8 or 9 are grouped together. The DNA is extracted using the Qiagen Gel Extraction Cleanup Kit according to the supplier's instructions. The DNA is collected and stored in 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5 at -80 ° C.

115. Insertion des fragments d'ADN préparés dans le plasmide pQE80L (Qiagen), vecteur d'expression procaryotique. 115. Insertion of DNA fragments prepared in plasmid pQE80L (Qiagen), prokaryotic expression vector.

Ce plasmide permet la transcription de l'insert sous le contrôle d'un promoteur inductible à l'IPTG; le polypeptide produit comporte dans sa région N terminale une série de 6 histidines consécutives codées par les séquences du plasmide qui permettent sa séparation ultérieure par chromatographie d'affinité. Le site de clonage multiple comporte notamment les sites Sall, Pstl et Hind III. Les étapes de préparation des plasmides recombinants sont les suivantes: Digestion de 1 microgramme environ d'ADN plasmidien pour chaque construction souhaitée avec respectivement: Sali et Pstl; ou Sali et Hind III; ou Pstl et Hind III, dans les conditions décrites supra, pour les séquences d'ADNc SEQ ID N 6, 7, 8 ou 9. This plasmid allows the transcription of the insert under the control of an inducible promoter with IPTG; the polypeptide produced comprises in its N-terminal region a series of 6 consecutive histidines encoded by the plasmid sequences which allow its subsequent separation by affinity chromatography. The multiple cloning site comprises in particular the SalI, PstI and Hind III sites. The steps for preparing the recombinant plasmids are as follows: Digestion of about 1 microgram of plasmid DNA for each desired construct with SalI and PstI, respectively; or Sali and Hind III; or PstI and Hind III, under the conditions described above, for cDNA sequences SEQ ID N 6, 7, 8 or 9.

- Séparation des produits de digestion sur gel d'agarose 1% en tampon TAE 0,5 et récupération des fragments d'agarose contenant les plasmides ouverts aux 2 enzymes sous UV sur transilluminateur Biorad. L'ADN plasmidien ouvert est purifié avec le kit Cleanup Qiagen Gel Extraction . Separation of digestion products on 1% agarose gel in TAE 0.5 buffer and recovery of agarose fragments containing plasmids open to both enzymes under UV light on Biorad transilluminator. The open plasmid DNA is purified with the Qiagen Gel Extraction Cleanup Kit.

- Déphosphorylation des extrémités des plasmides linéarisés à la phosphatase alcaline (Roche) selon les instructions du fournisseur. - Dephosphorylation of the ends of linearized plasmids with alkaline phosphatase (Roche) according to the supplier's instructions.

- Ligation des inserts correspondant aux séquences SEQ ID N 6, 8 et 9 dans les plasmides ouverts. Les plasmides pQE80L ouverts et les fragments d'ADNc digérés par les mêmes endonucléases sont incubés pendant 1 heure a 37 C dans 32 microlitres de tampon Tris HC1, 10 mM, pH = 8,5, 4 microlitres de tampon de ligation 10x préparé par le fournisseur, et 4 microlitres de ligase T4 (Roche) . Les proportions d'ADNc et de plasmide ouvert sont les suivantes: Pstl Hind III (SEQ ID N 6) 74 nanogrammes (ng) pQE80L ouvert ng Sali Hind III (SEQ ID N 8) 136 ngpQE80L ouvert 200ng Sali Pstl(SEQ ID N 9) 60 ngpQE80L ouvert 200ng Ligation de l'insert Pstl Dral (SEQ ID N 7) : il n'existe pas de site Dral dans le plasmide pQE80L; celui-ci a donc été ouvert avec Pstl et Hind III comme ci dessus. L'extrémité 3 < rentrante de la coupure à Hind III a ensuite été comblée par copie de l'extrémité 5' du brin complémentaire par action du fragmentde Klenow de l'ADN polymérase (tampon de réaction x10: 4 microlitres, les 4 déoxynucléotides triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 1 microlitre chacun, enzyme 1 microlitre, (réactifs du kit DNA labeling kit ) tampon Tris HC1 10 mM, pH 8,5, qsp 40 microlitres). Après 30 minutes à 37 C, le plasmide est purifié sur kit Qiagen (mini extraction kit). L'extrémité Hind III est alors devenue une extrémité franche qui permet la ligation d'un fragment terminé par Dra 1 selon le protocole indiqué pour les autres fragments d'ADN. Ligation of the inserts corresponding to the sequences SEQ ID Nos. 6, 8 and 9 in the open plasmids. The open pQE80L plasmids and the cDNA fragments digested with the same endonucleases are incubated for 1 hour at 37 ° C. in 32 microliters of 10 mM Tris HCl buffer, pH = 8.5, 4 microliters of 10x ligation buffer prepared by the supplier, and 4 microliters of T4 ligase (Roche). The proportions of cDNA and open plasmid are as follows: PstI Hind III (SEQ ID No. 6) 74 nanograms (ng) pQE80L open ng SalI Hind III (SEQ ID No. 8) 136 ngpQE80L open 200ng SalI PstI (SEQ ID N 9 ) 60 ngpQE80L open 200ng Ligation of the Pstl Dral insert (SEQ ID N 7): there is no Dral site in the plasmid pQE80L; this one was thus opened with Pstl and Hind III as above. The reentrant end of the Hind III cleavage was then filled by copying the 5 'end of the complementary strand by action of the Klenow fragment of the DNA polymerase (reaction buffer x10: 4 microliters, the 4 deoxynucleotides triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 1 microlitre each, 1 microliter enzyme, (DNA labeling kit reagents) 10 mM Tris HCl buffer, pH 8.5, qsp 40 microliters). After 30 minutes at 37 ° C., the plasmid is purified on a Qiagen kit (mini extraction kit). The Hind III end then became a blunt end which allows the ligation of a fragment completed by Dra 1 according to the protocol indicated for the other DNA fragments.

Pour toutes les constructions, l'efficacité de la ligation est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose et visualisation sous UV sur transilluminateur (disparition ou diminution des bandes correspondant aux fragments libres, apparition d'une nouvelle bande). For all the constructions, the efficiency of the ligation is controlled by electrophoresis on agarose gel and visualization under UV on transilluminator (disappearance or decrease of the bands corresponding to the free fragments, appearance of a new band).

117. Transformation des bactéries On utilise les bactéries BL21 Gold (DE3) pLysS compétentes préparées par Stratagène, selon les préconisations du fournisseur (1 à 50 ng de plasmide recombinant pour 100 microlitres de bactéries compétentes). Les bactéries sont ensuite étalées sur boite de milieu solide LB contenant 100 microgrammes/ml d'ampicilline pour la sélection des bactéries transformées. 117. Bacterial transformation The competent BL21 Gold (DE3) pLysS bacteria prepared by Stratagene are used according to the supplier's recommendations (1 to 50 ng of recombinant plasmid per 100 microliters of competent bacteria). The bacteria are then spread on a box of LB solid medium containing 100 micrograms / ml of ampicillin for the selection of the transformed bacteria.

118. Contrôle des fragments d'ADN insérés Les constructions ont été dessinées en respectant les phases de lecture originelles des inserts; un contrôle est cependant fait. L'ADN plasmidien recombinant est préparé (kit Qiagen, mini prep) à partir d'une culture de 5 ml de chacun des clones retenus et séquencé sur séquenceur Megabace en utilisant les amorces universelles du plasmide pQE80L définies par Qiagen. Seuls les clones dont l'insert n'a subi aucune modification sont conservés. 118. Control of the inserted DNA fragments The constructions were drawn respecting the original reading phases of the inserts; however, a check is made. The recombinant plasmid DNA is prepared (Qiagen kit, mini prep) from a culture of 5 ml of each of the clones retained and sequenced on Megabace sequencer using the universal primers of the plasmid pQE80L defined by Qiagen. Only clones whose insert has not been modified are preserved.

1.2 Comparaison Des tests ELISA ont été réalisés sur, dans un premier temps, les sérums de 3 chiens (chiens A, B et C) dont l'infection par Echinococcus granulosus a été confirmée par nécropsie, et le sérum de 1 chien (chien D) jamais infecté. La réaction est faite dans des plaques 96 puits dont la paroi est recouverte par le fabricant de nickel-agarose (Ni NTA HisSorb, Qiagen). Chacun des 4 polypeptides recombinants de SEQ ID N 2 à 5 est dilué dans un tampon carbonate bicarbonate, pH 9,6, de façon à ce que les quantités finales qui seront déposées dans les puits soient de 1 g, 0,214, 40ng, 8 ng. Les plaques sont incubées 18 heures environ à 4 C, ce qui permet la fixation du polypeptide sur les parois des puits par l'interaction nickel-histidines. Les puits sont ensuite lavés doucement 5 fois de suite avec du PBS contenant 1% de tween 20 (Sigma) et la saturation des sites non spécifiques est faite par incubation d'albumine bovine à 3% dans du PBS pendant 2 heures. Après élimination de l'albumine, des dilutions au 1/1000 de chacun des sérums de chiens testés dans du PBS + 0,3% d'albumine bovine sont incubées dans les puits pendant 1 heure à 37 C. 2 rangées de puits contiennent un tampon PBS + albumine bovine au lieu de sérum et servent de témoins. Les puits sont ensuite lavés 5 fois doucement (tampon PBS tween 1%) puis un anticorps anti IgG de chien (produit chez le lapin, Sigma) couplé à la peroxydase de raifort est ajouté et maintenu à 37 C pendant 1 heure (concentration 1/3000 dans du PBS). Les puits sont ensuite lavés délicatement plusieurs fois et le substrat chromogène de la peroxydase ajouté (o-phénylènediamine dihydrochlorure, Dako). La réaction est arrêtée après 30 minutes avec de l'acide sulfurique 0,5N et la D.O. mesurée immédiatement à 492nm sur un spectrophotomètre lecteur de plaques (Dynatech MR 500). Tous les essais sont faits en triple exemplaires, la valeur retenue étant la moyenne des 3 essais. L'ensemble de l'expérience est répété 2 fois. 1.2 Comparison ELISA tests were performed on, at first, the sera of 3 dogs (dogs A, B and C) whose Echinococcus granulosus infection was confirmed by necropsy, and the serum of 1 dog (dog D ) never infected. The reaction is made in 96-well plates whose wall is covered by the nickel-agarose manufacturer (Ni NTA HisSorb, Qiagen). Each of the 4 recombinant polypeptides of SEQ ID N 2 to 5 is diluted in a carbonate bicarbonate buffer, pH 9.6, so that the final quantities that will be deposited in the wells are 1 g, 0.214, 40 ng, 8 ng . The plates are incubated for approximately 18 hours at 4 ° C., which allows the polypeptide to be fixed on the walls of the wells by the nickel-histidine interaction. The wells are then washed gently 5 times in succession with PBS containing 1% tween 20 (Sigma) and the saturation of the non-specific sites is made by incubation of 3% bovine albumin in PBS for 2 hours. After removal of the albumin, 1/1000 dilutions of each of the sera of dogs tested in PBS + 0.3% bovine albumin are incubated in the wells for 1 hour at 37 ° C. 2 rows of wells contain a PBS buffer + bovine albumin instead of serum and serve as controls. The wells are then washed 5 times gently (PBS buffer tween 1%) then an anti-dog IgG antibody (produced in the rabbit, Sigma) coupled with horseradish peroxidase is added and maintained at 37 C for 1 hour (concentration 1 / 3000 in PBS). The wells are then gently washed several times and the chromogenic substrate of the added peroxidase (o-phenylenediamine dihydrochloride, Dako). The reaction was stopped after 30 minutes with 0.5N sulfuric acid and the OD immediately measured at 492 nm on a plate-reading spectrophotometer (Dynatech MR 500). All tests are done in triplicate, the value chosen being the average of the 3 trials. The whole experience is repeated 2 times.

La Fig. 4 montre que tous les domaines de la protéine EgA31 produits sont reconnus par les anticorps présents dans le sérum des chiens infectés mais pas par celui du témoin: les régions correspondantes de la protéine EgA31 des parasites ont donc toutes stimulé les réponses immunitaires des chiens pendant l'infection. Les anticorps ne sont pas présents avant l'infection (cette dernière propriété avait été observée sur des lots importants de chiens en utilisant la protéine entière, Fu et coll, 1999 supra). Toutefois, la région de la protéine native de SEQ ID N 2 correspondant au domaine recombinant [Pst-Hind] de EgA31 est systématiquement la plus immunogène. Fig. 4 shows that all the domains of the EgA31 protein produced are recognized by the antibodies present in the serum of the infected dogs but not by that of the control: the corresponding regions of the parasite EgA31 protein therefore all stimulated the immune responses of the dogs during the 'infection. Antibodies are not present before infection (the latter property was observed on large batches of dogs using the entire protein, Fu et al, 1999 supra). However, the region of the native protein of SEQ ID N 2 corresponding to the recombinant domain [Pst-Hind] of EgA31 is systematically the most immunogenic.

La même expérience a été reprise en utilisant 13 chiens infectés expérimentalement et 9 chiens témoins. Le protocole a été le même que cidessus, mais seul le polypeptide de SEQ ID N 2 correspondant au domaine recombinant [Pst-Hind] de EgA31 a été utilisé. La Fig. 5 montre qu'aucun sérum de chien non infecté ou avant infection (sauf 1, le chien n 15, voir plus loin) ne contient d'anticorps contre ce polypeptide. Les anticorps sont présents chez tous les chiens 28 jours après l'infection et les réponses des différents chiens sont homogènes. Le chien 15 qui contenait déjà des anticorps anti [Pst-Hind] avant l'infection est un chien dit de ferme , âgé de 3 ans et demi environ, recruté dans la campagne tunisienne en zone d'endémie pour E. granulosus. Après nécropsie, il est apparu que ce chien était le seul de tous les chiens infectés expérimentalement à n'avoir aucun parasite dans l'intestin. Chez cet animal, la résistance à l'infection est donc corrélée à une forte immunité, préalable à l'infection, contre EgA31, en particulier contre le domaine [Pst-Hind]. The same experiment was repeated using 13 experimentally infected dogs and 9 control dogs. The protocol was the same as above, but only the polypeptide of SEQ ID N 2 corresponding to the recombinant domain [Pst-Hind] of EgA31 was used. Fig. 5 shows that no uninfected or preinfected dog serum (except 1, dog # 15, see below) contains antibodies against this polypeptide. The antibodies are present in all dogs 28 days after infection and the responses of the different dogs are homogeneous. The dog which already contained anti [Pst-Hind] antibodies prior to infection is a farm dog, about 3.5 years old, recruited from the Tunisian countryside in an endemic area for E. granulosus. After necropsy, it appeared that this dog was the only one of all dogs experimentally infected to have no parasites in the intestine. In this animal, the resistance to infection is therefore correlated with a high immunity, prior to infection, against EgA31, in particular against the [Pst-Hind] domain.

En conclusion, toutes les régions de la protéine EgA31 étudiées (polypeptides de SEQ ID N 2, 3, 4 et 5 correspondant respectivement aux domaines [Pst-Hind], [Pst-Dra], [Sal-Hind] et [Sal-Pst] de l'ADNc codant pour EgA31) provoquent la formation d'anticorps lors d'une infection naturelle ou expérimentale par le parasite. In conclusion, all the regions of the EgA31 protein studied (polypeptides of SEQ ID N 2, 3, 4 and 5 respectively corresponding to the domains [Pst-Hind], [Pst-Dra], [Sal-Hind] and [Sal-Pst ] of the cDNA coding for EgA31) cause the formation of antibodies during a natural or experimental infection by the parasite.

Ces régions sont donc toutes immunogènes. Toutefois, le polypeptide de SEQ ID N 2 correspondant au domaine [Pst-Hind] de l'ADNc est plus immunogène que les autres. These regions are therefore all immunogenic. However, the polypeptide of SEQ ID N 2 corresponding to the [Pst-Hind] domain of the cDNA is more immunogenic than the others.

2. Réaction de l'intestin de chiens immunisés contre le fragment SEQ ID N 3 à une infection expérimentale par des protoscolex d'Echinococcus granulosus. 2. Reaction of the intestine of dogs immunized against the fragment SEQ ID No. 3 to an experimental infection with protoscolex of Echinococcus granulosus.

La potentialité conceptuelle d'obtenir une protection des chiens et des canidés en général par la stimulation, avant infection, des défenses immunitaires locales (ici l'intestin) est étayée par les observations déjà anciennes de Gemmel et coll. (1986, Parasitol. 92, pp 599-620; 1986, Biology of Echinococcus and hydatid disease, Thomson edit., pp 189-216) : après plusieurs cycles d'infection vermifugation, certains chiens deviennent résistants à une nouvelle infection. The conceptual potential for protection of dogs and canines in general by stimulating, before infection, the local immune defenses (here the intestine) is supported by the already ancient observations of Gemmel et al. (1986, Parasitol 92, pp 599-620, 1986, Biology of Echinococcus and Hydatid Disease, Thomson edit., Pp. 189-216): After several cycles of infection deworming, some dogs become resistant to a new infection.

Nous avons donc analysé la réponse de l'intestin à l'infection par des protoscolex chez des chiens préalablement immunisés contre le fragment SEQ ID N 3 ou contre un mélange de 3 polypeptides en quantités équipondérales, fragment SEQ ID N 3, EgTM (une tropomyosine d'Echinococcus; Esteves A., Senorale M., Ehrlich R. A tropomyosin gene is differentially expressed in the larval stage of Echinococcus granulosus. Parasitol. Res. 89: 501-502, 2003), FABP1 (Fatty Acid Binding Protein d'Echinococcus; Esteves A, Portillo V, Ehrlich R. Genomic structure and expression of a gene coding for a new fatty acid binding protein from Echinococcus granulosus. Biochem Biophys Acta 65:2402-2412, 1997). Le travail a été effectué à l'Ecole Vétérinaire de Sidi Thabet (Tunisie) afin de se situer en zone d'endémie. Dans une première expérience, 7 chiens ont été utilisés, 1 témoin, 3 chiens recevant le mélange des 3 protéines et 3 chiens injectés avec le fragment SEQ ID N 3 seul. We therefore analyzed the response of the intestine to protoscolex infection in dogs previously immunized against the fragment SEQ ID No. 3 or against a mixture of 3 polypeptides in even-weight quantities, fragment SEQ ID No. 3, EgTM (a tropomyosin of Echinococcus, Esteves A., Senorale M., Ehrlich R. A tropomyosin is differentially expressed in the larval stage of Echinococcus granulosus, Parasitol Res 89: 501-502, 2003), FABP1 (Fatty Acid Binding Protein). Echinococcus, Esteves A, Portillo V, Ehrlich R. Genomic structure and expression of a gene coding for a new fatty acid binding protein from Echinococcus granulosus, Biochem Biophys Acta 65: 2402-2412, 1997). The work was done at the Veterinary School of Sidi Thabet (Tunisia) in order to be in an endemic zone. In a first experiment, 7 dogs were used, 1 control, 3 dogs receiving the mixture of the 3 proteins and 3 dogs injected with the fragment SEQ ID N 3 alone.

2.1 Production des polypeptides Le fragment [Pst-Dra] de EgA31 de SEQ ID N 3 a été produit en masse comme indiqué préalablement. La pureté du produit fabriqué est vérifiée à chaque production par électrophorèse et la quantité de protéine produite est déterminée avec le Biorad Protein Assay après les étapes de désalinisation et de concentration sur colonne Amicon Ultra 10 000 (Millipore). La protéine recombinante de SEQ ID N 3 est conservée à -80 C en solution dans du sérum physiologique stérile jusqu'à utilisation. Les polypeptides EgTM et FABP1 nous ont été fournis respectivement par A. Esteves (laboratoire de biochimie, Pr R. Ehrlich, Montevideo) et F. Schreiber (à l'époque du travail, laboratoire de microbiologie, Newcastle, Pr C. Hormaeche). Ces polypeptides ont été désalinisés, concentrés, dosés et conservés comme ci dessus. 2.1 Production of polypeptides The [Pst-Dra] fragment of EgA31 of SEQ ID No. 3 was mass-produced as indicated previously. The purity of the manufactured product is checked at each electrophoresis production and the amount of protein produced is determined with the Biorad Protein Assay after the desalination and concentration steps Amicon Ultra 10,000 (Millipore). The recombinant protein of SEQ ID No. 3 is stored at -80 ° C. in solution in sterile saline until use. The EgTM and FABP1 polypeptides were provided to us respectively by A. Esteves (biochemistry laboratory, Pr R. Ehrlich, Montevideo) and F. Schreiber (at the time of the work, microbiology laboratory, Newcastle, Pr C. Hormaeche). These polypeptides were desalinated, concentrated, assayed and stored as above.

2.2 Protocole expérimental L'immunisation des chiens est obtenue par 3 injections intramusculaires aux jours 0, 75 et 97 de l'expérience. Les animaux sont infectés 15 jours après la dernière injection par ingestion de 150 000 protoscolex collectés la veille dans les abattoirs voisins et dont la viabilité a été contrôlée; la totalité des parasites est d'abord regroupée en un seul lot avant d'être répartie entre les chiens afin d'assurer une homogénéité de l'infection. L'infection est interrompue après 21 jours ( durée de sécurité qui permet de n'avoir aucun oeuf mature formé) par euthanasie des chiens (injection de Dolethal, laboratoires Vétoquinol). L'état de l'intestin est observé et le nombre de protoscolex dans le duodénum est déterminé. 2.2 Experimental Protocol Immunization of dogs is obtained by 3 intramuscular injections on days 0, 75 and 97 of the experiment. The animals are infected 15 days after the last injection by ingestion of 150 000 protoscolex collected the day before in the neighboring slaughterhouses and whose viability has been checked; all the parasites are first grouped in a single batch before being distributed between the dogs to ensure homogeneity of the infection. The infection is interrupted after 21 days (safety period that allows no mature egg formed) by euthanasia of dogs (Dolethal injection, Vétoquinol laboratories). The state of the intestine is observed and the number of protoscolex in the duodenum is determined.

Chaque injection correspond à 500 g au total de polypeptide(s) recombinant(s) en solution dans 0,8 ml de sérum physiologique; juste avant l'injection, 0,2 ml de Montanide (adjuvant, SEPPIC France) sont ajoutés et la solution est homogénéisée lentement pendant 10 minutes puis filtrée sur membrane (Millex, 0,22 m) sous hotte stérile. L'injection intramusculaire (1 ml) est faite immédiatement, après désinfection du pelage à l'alcool. Les injections faites au chien témoin ne contiennent aucun des 3 antigènes recombinants mais incluent l'adjuvant. Each injection corresponds to 500 g total of recombinant polypeptide (s) dissolved in 0.8 ml of physiological saline; just before the injection, 0.2 ml of Montanide (adjuvant, SEPPIC France) are added and the solution is homogenized slowly for 10 minutes and then filtered on membrane (Millex, 0.22 m) in a sterile hood. The intramuscular injection (1 ml) is done immediately, after disinfection of the coat with alcohol. The injections made to the control dog do not contain any of the 3 recombinant antigens but include the adjuvant.

2.3 Résultats Les nécropsies ont été effectuées après 21 jours d'infection. Les résultats bruts sont les suivants: Témoin 3 chiens immunisés 3 chiens avec les immunisés avec 3 polypeptides SEQ ID N 3 seul Quantité 0 166 g SEQ ID N 3 500 g SEQ ID d'antigène +166 g EgTM N 3 injectée +166 g FABP1 Nombre de 2500 22 2160 2800 6040 3340 5 parasites dans le duodénum après 21 jours Etat du normal inflammation, entérite sans rupture des duodénumnormal vaisseaux Reste de l'intestin normal Normal normal Etat des plaques normales hypertrophie considérable; pas d'aspect de Peyer hémorragique Il est donc possible de conclure que: - le duodénum, région exclusive de fixation des protoscolex puis des adultes, est la seule région de l'intestin à présenter un aspect différent entre chiens immunisés et chien témoin. 2.3 Results Necropsies were performed after 21 days of infection. The crude results are as follows: Control 3 immunized dogs 3 dogs with immunized with 3 polypeptides SEQ ID N 3 alone Quantity 0 166 g SEQ ID N 3 500 g SEQ ID antigen +166 g EgTM N 3 injected +166 g FABP1 Number of 2500 22 2160 2800 6040 3340 5 parasites in the duodenum after 21 days State of normal inflammation, enteritis without rupture of the duodenumormal vessels Rest of the normal intestine Normal normal Condition of the normal plates considerable hypertrophy; no appearance of Peyer haemorrhagic It is therefore possible to conclude that: - the duodenum, exclusive region of fixation of protoscolex and adults, is the only region of the intestine to have a different appearance between immunized dogs and control dog.

- les plaques de Peyer, organes de l'immunité de cette région de l'organisme, sont très hypertrophiées en réponse à l'infection chez les chiens immunisés; elles ne le sont pas chez le chien infecté mais non immunisé préalablement: la réponse différentielle est donc liée à l'immunisation préalable, non à l'infection parasitaire seule. Plusieurs centaines de nécropsies de chiens infectés par Echinococcus granulosus, pratiquées dans la même région d'endémie par l'un des déposants (S. Lahmar), n'ont jamais conduit à observer les phénomènes d'inflammation localisés au duodénum et d'hypertrophie des organes immunitaires rapportés ici pour les chiens préalablement immunisés. L'immunisation du chien contre SEQ ID N 3 entraîne une modification de la réponse du duodénum à l'infection ultérieure par Echinococcus granulosus, jamais observée jusqu'à ce jour. Cette modification de réponse implique une forte stimulation des organes de l'immunité locale. - Peyer's patches, organs of immunity of this region of the body, are very hypertrophied in response to infection in immunized dogs; they are not in the infected dog but not previously immunized: the differential response is thus linked to the previous immunization, not to the parasitic infection alone. Several hundred necropsies of dogs infected with Echinococcus granulosus, practiced in the same endemic area by one of the applicants (S. Lahmar), never led to the observation of localized inflammation of the duodenum and hypertrophy immune organs reported here for previously immunized dogs. Immunization of the dog against SEQ ID No. 3 causes a change in the response of the duodenum to subsequent infection with Echinococcus granulosus, never observed to date. This modification of response implies a strong stimulation of the organs of local immunity.

- L'immunisation avec SEQ ID N 3 seul suffit à obtenir cette réponse: les 2 autres polypeptides ne sont donc ni indispensables, ni antagonistes. Immunization with SEQ ID No. 3 alone is sufficient to obtain this response: the other 2 polypeptides are therefore neither essential nor antagonistic.

Claims

1 - Vaccines for the treatment or prevention of parasite infections of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or animals, the vaccinating agent of which is (a) protein of SEQ ID No. 1, or (b) one of its fragments having an immunogenic activity at least equivalent to the polypeptide of SEQ ID No. 1, or (c) a variant of (a) or (b) which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to the latter.

2 - Vaccines according to claim 1 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of E. granulosus parasitic infections.

3 - Vaccines according to claim 2 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of hydatidose.

4 - Vaccines according to claim 1 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of E. multilocularis parasite infections.

5 - Vaccines according to claim 4 characterized in that they are intended for the treatment or prevention of alveolar echinococcosis.

6 - Vaccines according to one of claims 1 to 5 characterized in that the vaccinating agent is a fragment having an immunological activity at least equivalent to the polypeptide of SEQ ID N 1 selected from: the polypeptides of SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or a variant of one of these polypeptides which has been modified by the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at less equivalent to the polypeptide of which it is the variant.

7 - Vaccines according to claim 6 characterized in that the vaccinating agent is the polypeptide of SEQ ID N 2 or one of its variants as defined above.

8 - Polypeptides of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5, and variants thereof corresponding to one of these polypeptides modified by insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and which has an immunological activity at least equivalent to that of the polypeptide of which it is the variant.

9 - Polypeptides according to claim 8 characterized in that they are chosen from the polypeptide of SEQ ID N 2 and its variants as defined above.

Nucleic acid sequences encoding a polypeptide or a variant thereof as defined in claim 8 or 9.

11 - Sequences of nucleic acids according to claim 10 characterized in that they consist of: a1) cDNA sequences encoding a polypeptide or a variant thereof as defined in claim 8 or 9; b1) DNA sequences hybridizing under strict conditions with the above sequences; cl) DNA sequences which, because of the degeneracy of the genetic code, result from sequences a1) and b1) above and encode said polypeptide or variant; and d1) the corresponding mRNA and DNA sequences.

Expression vectors transformed with a nucleic acid sequence as defined in claim 10 or 11 and comprising the means necessary for its expression.

13 - Microorganisms or host cells transformed with an expression vector according to claim 12.

14 - Antibodies directed against a polypeptide or a variant thereof as defined in claim 8 or 9.

Antibody according to Claim 14, characterized in that it is monoclonal.

16 - Method for the in vitro diagnosis of parasite infections of the Echinococcus family, and in particular E. granulosus and E. multilocularis, in humans or in animals, by demonstrating antibodies directed against an immunogenic polypeptide of SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5, or one of their variants as defined above, in which the at least one immunogenic polypeptide or variant as defined above is brought into contact with a sample. biology of the human or animal that may contain said antibodies and the presence of bound antibodies is removed.