WO2005053768A1 - Revetements organiques bioactifs applicables sur des endoprotheses vasculaires - Google Patents

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WO2005053768A1
WO2005053768A1 PCT/FR2004/003018 FR2004003018W WO2005053768A1 WO 2005053768 A1 WO2005053768 A1 WO 2005053768A1 FR 2004003018 W FR2004003018 W FR 2004003018W WO 2005053768 A1 WO2005053768 A1 WO 2005053768A1
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coating
layer
matrix
pentoxifylline
alpha
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PCT/FR2004/003018
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Férial HAROUN
Christophe Bureau
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Alchimer
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    • A61L2300/606—Coatings

Definitions

  • the present invention relates to organic bioactive coatings applicable to stents in order to improve their performance in terms of reduction in the rate of restenosis. It relates in particular to polymer coatings containing a combination of pentoxifylline and at least one antioxidant, to their preparation process and to their uses.
  • bioactive that is, ie coated with an organic layer allowing better control of the biological consequences of stenting in a living organism.
  • sirolimus and paclitaxel have currently benefited from a large multiple clinical validation program which has led to a CE marking process.
  • These include for example the products today available on the market for coated stents - the stent Cypher 11 marketed by Cordis society in which the active molecule rapamycin (sirolimus, Rapamune *), an immunosuppressant used so far as anti-rejection treatment but also having a powerful power antiproliferative on vascular smooth muscle cells.
  • the polymer matrix used on this stent is a mixture of polyethylene vinyl acetate (PEVA) and polybutyl methacrylate (PBM ⁇ ) - the NIRx ® stent sold by the company Boston Scientific: this bioactive stent is coated with a matrix composed of a triblock copolymer which prolongs the release of a powerful anticancer drug: paclitaxel.
  • Other pharmacological approaches. not cytostatic. were also assessed.
  • the bioactive molecules concerned can be grouped into the following categories: - anti-neoplastic agents such as for example paclitaxel (Taxol ®). actinomycin D. vincristine. methotrexate. angiopeptin, etc. - anti-thrombotics such as for example hirudin, iloprost. and heparin, - immunosuppressants such as for example sirolimus
  • Restenosis following the placement of a stent is a complex phenomenon due mainly to intimal hyperplasia.
  • the thickening of the intima as a result of the vascular injury law of stent implantation is the result of both the migration and proliferation of smooth muscle cells as well as the accumulation of matrix proteins extracellular (collagen. elastin, proteoglycans).
  • 1 he main current strategy adopted to fight restenosis is to prevent intimal hyperplasia by inhibiting cell proliferation smooth muscles by cytostatic and antineoplastic agents or their migration by anti-metalloproteases.
  • Pentoxifylline is a peripheral vasodilator commonly used in the treatment of arteritis of the lower limbs (especially intermittent claudication), circulatory insufficiency cerebral and peripheral vasomotor disturbances (NY Kim el al .. Gen. Pharmacof, 2000, 35 ( 4), 205-21 1).
  • pentoxifylline has many interesting biological effects which can help prevent restenosis. Indeed, pentoxifylline inhibits in vitro the proliferation of human vascular smooth muscle cells (Chen YM et al ..
  • Pentoxifylline also has a protective effect against endothelial cells (Sobottka-Ventura AC and Bôhnke M .., Br. J. Ophtalmol., 2001, 85, 1 1 10-1 1 14). In addition, it has been shown that this compound protects the HDL-alpha- tocopherol oxidation by f anion superoxide released by the neutrophils (Cogny A. et al .. Eur. J. Biochem., 1999, 259. 32 -39).
  • alpha tocopherol also called vitamin F
  • alpha tocopherol is a potent antioxidant and has, in the same way as pentoxifylline, of interesting biological properties that can participate in preventing the occurrence of restenosis
  • alpha tocopherol is particularly an inhibitor of proliferation of vascular smooth muscle cells (1 asinato A. and have Proc Natl Acad Sci USA alone, 92, 12190-12194); - it is anti-inflammatory: it reduces adhesion to endothelial cells ncutrophiles during the inflammatory process by decreasing the expression of certain adhesion molecules on the surface of these cell types (Yoshikawa T. et al. Biofactors, 1998, 7.
  • pentoxifylline in a formulation administered systemically (Patent Application FR-A-2,779,063).
  • the administration of a composition containing the association of pentoxifylline and alpha-tocopherol in given proportions makes it possible, when the lesion is young and inflammatory (phase of constitution), to prevent the occurrence of sclerosis, and when the lesion is old and constituted (late phase), to reduce the fibrous block, even, in certain cases, to make it disappear. Because it acts in synergy with alpha tocopherol.
  • pentoxifylline is used in relatively low doses, compared to the original prescriptions, which minimizes the side effects. However, it can be noted that these two molecules have very diflerent pharmacokinetics. due in particular to their different chemical natures. When pentoxifylline is taken orally, it reaches a maximum blood level in thirty minutes and its plasma peak is close to
  • alpha-tocopherol When alpha-tocopherol is administered orally, it is absorbed by fats in the gastrointestinal tract and 35% of the administered dose passes into the circulation, the rest being eliminated by the faeces.
  • Alpha-tocopherol is bound to plasma lipoprotein cell membranes and shows a tropism for adipose tissue, pituitary, adrenal, uterus and testis (Data Bank drugs: B1AM); its half-life varies from a few days to 3 months depending on the tissue.
  • the subject of the present invention is an organic coating based on a polymer, characterized in that it comprises at least one layer of matrix of synthetic polymer (s) having a thickness greater than or equal to 1 ⁇ m, said matrix containing a combination: - of pentoxifylline, in an amount greater than or equal to 0.036 nmol / mm 2 of surface of said matrix and - d '' at least one antioxidant, in an amount greater than or equal to 0.042 nmol / mm 2 of the surface of said matrix.
  • s synthetic polymer
  • the coating in accordance with the invention can be used to cover vascular stents so that the pentoxifylline and the antioxidant agent are released in situ simultaneously and for a prolonged period once the endoprosthesis in place.
  • the coating according to the invention allows in particular a prolonged and simultaneous release of the two molecules over a period ranging from 4 to 8 weeks approximately.
  • pentoxifylline is present within the polymer matrix in an amount of between 1 8 and 54 nmolcs / mm 2 approximately of surface of said matrix (ie between 5 and 1 5 ⁇ g / mm 2 approximately), the value of 36 nmoles / mm 2 (or 10 ⁇ g / mm 2 ) being very particularly preferred.
  • the antioxidant agent is preferably present within the polymer matrix in an amount of between 32 and 53 nmol / mm 2 approximately of surface of said matrix (ie between 1 5 and 25 ⁇ g / mm 2 approximately in the case of alpha-tocopherol), the value of approximately 42 nmol / mm 2 (ie 20 ⁇ g / mm 2 in the case of alpha-tocopherol) being very particularly preferred.
  • the thickness of the coating according to the invention is preferably greater than or equal to 5 ⁇ m, and even more preferably between 10 ⁇ m and 100 ⁇ m inclusive.
  • antioxidant (s) which may be incorporated into the polymer matrix of the coating in accordance with the present invention, mention may be made most particularly of alpha-tocopherol and its physiologically acceptable salts such as alpha-tocopherol acetate, antioxidant enzymes such as superoxide dismutases (SODs) and glutathione peroxidases, ascorbic acid, beta-carotene, flavonoids, ubiquinone, probucol, glutathione and lipoic acid and their mixtures; alpha-tocopherol and its salts being very particularly preferred.
  • the antioxidant agent (s) represent from 5 to 60% by weight approximately relative to the total weight of the coating and even more preferably from 10 to 50% by weight approximately.
  • polymer shall mean "biodegradable” means polymers which disintegrate in biological medium, in particular by hydrolysis with kinetics such that about 20% of polymer (by weight) is degraded in a time of the order of or greater than the time necessary for the complete release of the active substances as defined above. In this example, the release time is typically of the order of 4 to 8 weeks.
  • the biodegradable polymers are preferably chosen from biodegradable polyesters such as, for example, polymers of lactic acid (PLA) or glycolic acid (PGA). copolymers of lactic acid and glycolic acid (PLGA), polymers of ⁇ -caprolactone. alkyl cyanoacrylate. hydroxybutyrate, or hydroxyvalerate, polyanhydrides, poly-orthoesters. poly (imido carbonates) and poly ( ⁇ -malic acid): poly (phosphazenes); poly (ethcrs). polysaccharides and their mixtures.
  • biodegradable polyesters such as, for example, polymers of lactic acid (PLA) or glycolic acid (PGA). copolymers of lactic acid and glycolic acid (PLGA), polymers of ⁇ -caprolactone. alkyl cyanoacrylate. hydroxybutyrate, or hydroxyvalerate, polyanhydrides, poly-orthoesters. poly (imido carbonates) and poly ( ⁇ -
  • the non-biodegradable polymers are preferably chosen from non-biodegradable polyesters such as polyethyleneterephthalate, polyacrylates and polymethacrylates: polyamides; polyvinyl chloride; polyethylene vinyl acetates; polyurethanes: polysiloxanes; polyvinylpyrrolidone (PVP) and their mixtures.
  • the polymer matrix (s) preferably consists of one or more biodegradable biocompatible polymers chosen from biodegradable polyesters and even more preferably from PLA, PGA, their copolymers (PLGA) and their mixtures.
  • each of the layers of polymer matrix can contain the pentoxifylline and the antioxidant agent in respective proportions varying from layer to layer.
  • the outer (upper) layer is enriched with anti-oxidizing agent, particularly in acetate alpha-tocopherol, so that the latter molecule is relarg ⁇ ée preferably, easily adjustable amount, so as to enjoy, the time short, anti-oxidant and anti-inflammatory alpha-tocopherol in the fight against inflammatory effects due to the laying of the stent.
  • the present invention also relates to the use of at least one coating as defined above for covering stents.
  • Another object of the invention is a method for preparing a stent characterized in that it comprises at least one step during which the surface of said stent is covered with at least one coating layer in accordance with the invention.
  • the coating layer according to the invention can be applied to the surface of said stent in a conventional manner according to the methods conventionally used for this purpose by those skilled in the art.
  • the polymer or polymers constituting the matrix, in solution in a solvent are mixed with a solution of pentoxifylline and at least one antioxidant, then the resulting mixture is applied (for example by soaking or spraying ) on the surface to be coated and finally dried to form a film.
  • said method preferably comprises a step preliminary to the step of applying the coating according to the invention during which the surface of the stent is first covered with a first layer of adhesion primers in order to facilitate the subsequent fixing of the coating according to the invention.
  • adhesion primer layers can be attached, generally covalently. on the surface of the stent and provide outside one polarity and / or functional groups having affinity for the polymer matrix to be fixed.
  • adhesion primers mention may, for example, be made of siloxanes (R-Si (OH) 3 ) and chlorosilanes (R-SiCl 3 ).
  • diazonium salts R- ⁇ - N 2 + , X ⁇ where X- is a salt such as for example a tetrafluoroborate or a tosylate).
  • II. CI I 3.
  • CN and R is a carboxylic acid group. or an amide group).
  • Methods leading to the formation of a layer of adhesion primers are in particular described in international application WO 98/44172 and in US patent 6,517,858, respectively, and allow in particular to lead to covalent electrografting an organic layer over the entire conductive surface or semiconductive electricity.
  • the production of a layer of adhesion primers by an electro-grafting process constitutes a particular and preferred embodiment of the invention.
  • the interfaces between the polymer layers are solid (adhesion primers and polymer matrix) and in particular resist delamination and detachment of coatings in pieces.
  • the invention also relates to a stent characterized in that its surface is covered by at least one layer of the organic coating based on polymer according to the invention and as described above.
  • Stents comprising a coating consisting of at least one layer of synthetic polymer matrix (s) and one layer of electro-grafted adhesion primers are particularly preferred. In addition to the above provisions.
  • the invention further comprises other provisions which will emerge from the description which follows, which refers to an example of the examples of preparation of coatings in accordance with the invention, to studies of the release of pentoxifylline and of acetate d alpha-tocopherol from coatings according to the invention, to a release study of pentoxifylline and alpha-tocopherol acetate from a stent coated with poly (lactic acid) fixed by a layer of primary adhesion, to a study of the effect of the pentoxifylline / alpha-tocopherol acetate association on in vitro migration of human smooth muscle cells, to a study of the effect of the pentoxifylline / acetate d combination alpha-tocopherol on the in vitro proliferation of human vascular smooth muscle cells as well as in the attached FIGS.
  • FIG. 1 represents the release profiles of pentoxifylline (diamonds) and of acet ate of alpha-tocopherol (squares) from a matrix of poly (lactic acid), expressed in ⁇ g / cm 2 of coating surface as a function of time (days);
  • - Figure 2 shows the release profiles of pentoxifylline (diamonds) and alpha-tocopherol acetate (squares) from a matrix of poly (lactic acid) attached to a stent via a layer of polybutylmethacrylate adhesion primer, expressed in ⁇ g / stent of coating surface as a function of time (days);
  • - Figure 3 shows the inhibition (in%) of the migration of human vascular smooth muscle cells after incubation in culture media containing different concentrations of pentoxifylline and / or alpha-tocopherol acetate;
  • - Figure 4 represents the number of human vascular smooth muscle cells / cm 2 after culture in media containing different concentrations
  • FIG. 5 represents the number of human vascular smooth muscle cells / cm 2 after culture in media containing different concentrations of pentoxifylline and / or tocopherol acetate as a function of time in days for a second series of manipulations (J l ( black bananas) .12 (white bars). J9 (gray bars). J15 (cross-hatched bars).. 121 (checkered bars) and J27 (dotted bars)).
  • EXAMPLE 1 PREPARATION OF A BIODECRADABLE POLYMER MATRIX OF POLYLACT ACID CONTAINING PENTOXIFYLLINE AND ALPHA TOCOPHEROL ACETATE.
  • a polymer matrix is produced allowing the release of pentoxifylline and alpha-tocopherol acetate. Both molecules are contained in the same polymeric matrix, made of polylactic acid, and it is shown that this embodiment provides that these molecules are present concurrently in the matrix.
  • a 10% (w / v) solution of poly (lactic acid) in chloroform is mixed with a solution of pentoxifylline and alpha tocopherol acetate in chloroform, so that each of the pentoxifylline / polymer ratios and alpha tocopherol acetate / polymer, ie 30% in the end.
  • a film of this release matrix is deposited on a blade of 316L stainless steel by dipping, round-trip of the blade in the solution containing the dissolved matrix. The film is dried at room temperature, then the composition is analyzed by secondary ionization mass spectrometry (TOF-SIMS: Timc-Of-Hight-Secondary lonization Mass Spectrometry).
  • the graphs obtained shows the mass peaks characteristic acetate alpha-tocopherol (1) and pentoxifylline (P). which demonstrates that these two molecules are present in the matrix and that their structure has been preserved.
  • polymer matrices for the release of pentoxifylline and acetate of alpha-tocopherol were performed under the same conditions as those described above in Example 1 but starting from a mixture a 500 mg / ml solution of pentoxifylline in chloroform and a 500 mg / ml solution of alpha-tocopherol acetate in the same solvent on the one hand, and chloroform solutions of various copolymers lactic acid and glycolic acid (PLGA 85/15, PLGA 75/25, PLGA 65/35 and PLGA 50/50).
  • polymer matrices allowing rclargage pentoxifylline acetate and alpha-tocopherol were performed under the same conditions as those described above in Example 1 but starting from a solution containing the two active molecules each at a rate of 500 mg / ml in chloroform, and of a solution in chloroform of a poly orthoester, namely poly ([10-3.9-diethyl-9- (nonyloxy) -2.4. 8.10-tetraoxa-spiro [5, 5] undec-3-yloxy] -) decan-l -ol.
  • the TOF-SIMS analysis allows, as in Example 1 to show that the two active molecules are present homogeneously in the polymer film serving as a release matrix.
  • EXAMPLE 4 BIODEGRADABLE POLYMERIC MATRIX OF POLYLAC I ACID CONTAINING PENTOXIFYLLINE AND ALPHA TOCOPHEROL ACETATE.
  • a polymer matrix is produced allowing the release of pentoxifylline and of alpha-tocopherol acetate composed of two successive layers of polymer matrix, in which the respective proportions of the two molecules are different.
  • the upper layer is enriched acetate alpha-tocopherol.
  • each layer the two molecules are contained in the same polymeric matrix, made of poly lactic acid.
  • a 10% (w / v) solution of poly (lactic acid) is produced on the one hand in chloroform and on the other hand two solutions of pentoxifylline and alpha tocopherol acetate in chloroform: - a first solution in which the weight ratio of alpha tocopherol acetate / pentoxifylline is equal to 4 and - a second solution in which the weight ratio of alpha tocopherol acetate / pentoxifylline is equal to 1.
  • a first layer of polymer matrix is deposited on a 316L stainless steel blade by dipping, round-trip, of the blade in solution B.
  • the film obtained is dried at ambient temperature, then a first layer of polymer matrix is deposited on second layer matrix by dipping, round-trip of the blade into the solution A.
  • the composition analysis of the complete coating was carried out by TOF-SIMS. The study of the profiles (not shown) towards concentration of each of the molecules shows that the resulting coating is enriched surface acetate alpha-tocopherol.
  • EXAMPLE 5 STUDY OF THE RELARGAGE OF PENTOXIFYLLIN AND ALPHA TOCOPHEROL ACETATE FROM A POLY (LACTIC ACID) COATING FIXED WITH A POLY (BUTYL METHACRYLATE) ADHESION PRIMER LAYER illustrates the fixing, on a surface of stainless steel 316L. a coating consisting of a biodegradable polymer matrix containing pentoxifylline and acetate of alpha-tocopherol. This fixation is carried out thanks to an electro-grafted underlay of poly butyl methacrylate (PBMA). which serves as an adhesion primer for the biodegradable polymer matrix.
  • PBMA poly butyl methacrylate
  • Electrogrcffage of the PBMA sublayer A 316L stainless steel blade 10 cm long and 1 cm wide is dipped in a solution of dimethylformamide (DMF) containing 3.125 mol / 1 of butyl methacrylate (BUMA) ). 10 "2 mol / 1 of 4-nitrophenyl diazonium tetrafluoroborate and 2.5.10 " mol / 1 of sodium nitrate. This plate serves as a working electrode in a three-electrode assembly.
  • DMF dimethylformamide
  • BUMA butyl methacrylate
  • the other two electrodes of the device are a large-sized platinum electrode, which serves as a counter electrode and a silver wire, used as a reference electrode.
  • This blade is subjected to a series of 50 potential scans under voltammetric conditions. between - 0.1 and - 3.0 V / (Ag + / ⁇ g), at a speed of 100 mV / s.
  • the slide is then rinsed with DMF. then with acetone, and finally dried under a stream of nitrogen.
  • PBMA is obtained a film of about 300 nm thick.
  • 2) -Synthesis and the polymer matrix deposition are mixed, as described above in Example 1.
  • the deposition of the release of charged polymer molecules is conducted by dipping the blades of stainless 316L previously coated with PBMA electro-grafted according to step 1 above.
  • Electrografting of the DC12 sublayer A 3 I 6L stainless steel blade 10 cm long and 1 cm wide is dipped in an acetonitrile solution containing 2.10 " mol / 1 of 4- tetrafluoroborate dodecane diazonium and 5.10 " mol / 1 of tetraethylammonium perchlorate.
  • This blade serves as the working electrode in a three-electrode assembly.
  • the other two electrodes of the device are a large carbon electrode, which serves as a counter electrode, as well as a silver wire, used as a reference electrode.
  • This blade is subjected to a series of 10 potential scans in voltammetric conditions, between - 0.33 and - 1.8 V / (Ag / Ag). at a speed of 20 mV / s.
  • the slide is then rinsed with acetonitrile. then with acetone, and finally dried under a stream of nitrogen. A film of DC12 is obtained. with characteristic infrared bands.
  • this blade is subjected to 100 scans potential between - 0.3 and - 1.2 volts, at a rate of 100 mV / s the slide is then rinsed with DMF and then with acetone, and finally dried under a stream. nitrogen. There was obtained a film of poly (Fiema) about 1 micron thick.
  • Example 5 After drying, the slides are put to soak in 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 and subjected to gentle stirring at 37 ° C (these conditions mimicking those of the physiological medium, in which we want to assess the release of active molecules) . Dosages of pentoxifylline and acetate of alpha-tocopherol released in the release bath are performed regularly. It is observed, as in Example 5, that the two molecules are released simultaneously. The same appearance of release kinetics (not shown) as those obtained above in Example 5 (FIG. 1) were obtained.
  • EXAMPLE 8 STUDY OF THE RELARGAGE OF PENTOXIFYLLIN AND ALPHA TOCOPHEROL ACETATE FROM A POLY (LACTIC ACID) COATED STENT FIXED BY A PBMA-BASED ADHESION PRIMER 1) Electrografting of the sublayer of PBMA A 316L stainless steel stent is covered with a layer of electro-grafted PBMA, using the stent as working electrode in the same assembly and with the same protocol as in step 1 of Example 5 set forth above.
  • the diameter of the orifice is 0.040 inches or 1.6 mm.
  • the nozzle is entirely made of stainless steel and supplied by a micro-pump. Spraying is discontinuous because it is provided by a micro-pump, the chamber of which alternately fills and empties.
  • the control is performed by a module that adjusts 0.1 .mu.l near the volume of atomized spray solution and the flow rate of the solution at 0.1 .mu.l per second.
  • the stent in rotation in front of the nozzle jet so that its entire outer surface sees the jet, is held vertically at a distance of 6 to 12 cm from the nozzle.
  • the air pressure is adjusted in order to obtain a pressure of 4 psi or approximately 200 mbar.
  • hVSMCs human vascular smooth muscle cells
  • ATCC-2571 (6 passing ee) are seeded at 5000 cells / cm in Petri dishes 35 mm in diameter in complete culture medium ("Dulbecco's Modified Essential Medium”: DMEM containing 5% fetal calf serum (SFV) and antibiotics (Penicillin: 10,000 ⁇ g / ml, U-Streptomycin 10,000 ⁇ g / ml and Amphotericin 25 ⁇ g / ml) at 0.5%) added by the different concentrations of pentoxifylline (PTX), alpha-tocopherol acetate (TOC), or of the combination of the two (combination).
  • PTX pentoxifylline
  • TOC alpha-tocopherol acetate
  • concentrations tested were as follows: PTX: 250; 500 and 750 ⁇ g / ml; TOC: 500; 1000 and 2000 ⁇ g / ml; PTX / TOC association: 500/500; 500/1000 and 200/2000 ⁇ g / ml.
  • a negative control containing neither pentoxifylline nor alpha-tocopherol acetate is run in parallel.
  • b) Cell Migration The pre-incubated cells are trypsinized, rinsed in the culture medium, then suspended in a migration medium consisting of DMEM supplemented at 2% (w / v) with bovine albumin (BAS) (fraction V ).
  • rhPDGF-AB Human recombinant Platelet Derivated Growth Factor- heterodimer AB
  • migration medium 20 ng / ml
  • inserts with a diameter of 1 cm and a porosity of 8 ⁇ m are added to each well.
  • - 50 ⁇ l of the cell suspension containing 10,000 cells are deposited inside each insert, - the plates are closed and left to incubate at 37 ° C. in a humid atmosphere for 4 hours.
  • the inserts are removed: - the upper surface of the membrane of the insert is scraped in order to eliminate the adherent cells; - the membrane and the cells adhering to the underside are fixed in 500 ⁇ l of mcthanol. the cells are stained with Giemsa and counted under the microscope on 10 consecutive fields (X200).
  • a negative control is produced: in the insert, the cells are incubated in the presence of 30 ⁇ l of migration medium in the culture well.
  • - a positive control in the insert, the cells are incubated in the presence of 30 ⁇ l of Migration Medium supplemented with rhPDGF-AB at 20 ng / ml.
  • EXAMPLE 10 STUDY OF THE EFFECT OF THE PENTOXIFYLLIN / ALPHA TOCOPHEROL ACETATE ASSOCIATION ON THE IN VITRO PROLIFERATION OF SMOOTH VASCULAR HUMAN MUSCLE CELLS.
  • the purpose of this example was evaluated by a standard test the effect of the combination of pentoxifylline / ethyl alpha-tocopherol on the proliferation of CMLVFI.
  • the culture medium is removed and replaced with culture medium containing different combinations of pentoxifylline Association / acetate alpha- tocopherol (first series of manipulations: PTX 100 micrograms / ml / TOC 1000 mcg / ml; PTX 500 mcg / ml / TOC 1000 ⁇ g / ml; PTX 1000 ⁇ g / ml / TOC 1000 and second series of manipulations: PTX 500 ⁇ g / ml / TOC 500 ⁇ g / ml; PTX 500 ⁇ g / ml / TOC 1000 ⁇ g / ml; PTX 500 ⁇ g / ml / TOC 2000 ⁇ g / ml).
  • first series of manipulations PTX 100 micrograms / ml / TOC 1000 mcg / ml; PTX 500 mcg / ml / TOC 1000 ⁇ g /
  • the number of cells / cm 2 is expressed as a function of each of the doses of PTX and / or TOC tested and this at .11 (black bananas). .12 (white bars). D9 (gray bars). J 15 (cross-hatched bars), .121 (checkered bars) and .127 (dotted bars).

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Abstract

La présente invention est relative à des revêtements organiques bioactifs applicables sur des endoprothèses vasculaires. Elle est en particulier relative à des revêtements polymères renfermant une association de pentoxifylline et d'au moins un antioxydant, à leur procédé de préparation et à leurs utilisations.

Description

REVETEMENTS ORGANIQUES BIOACTIFS APPLICABLES SUR DES ENDOPROTHESES VASCULAIRES La présente Invention est relative à des revêtements organiques bioactifs applicables sur des endoprothèses vasculaires (" stents " en anglais) afin d'améliorer leur performances en terme de réduction du taux de resténose. Elle est en particulier relative à des revêtements polymères renfermant une association de pentoxifylline et d'au moins un antioxydant, à leur procédé de préparation et à leurs utilisations. La lutte contre la resténose consécutive à la pose d'une endoprothèse vasculaire a franchi une étape d'innovation importante avec la mise au point, le développement, et - récemment - la commercialisation de stents dits " bioactifs ", c'est-à-dire revêtus d'une couche organique permettant une meilleure maîtrise des conséquences biologiques de la pose d'une endoprothèse dans un organisme vivant. 11 semble aujourd'hui admis une préférence pour la mise en place. sur le stent, de revêtements contenant une molécule active qui est libérée de manière contrôlée. Sans entrer dans le détail des différents modes de réalisation de ces revêtements, il apparaît que de nombreux travaux s'orientent vers une incorporation de principes actifs dans des matrices polymères que l'on solidarise sur la surface du stent par un moyen ou un autre. Actuellement, de nombreux travaux visant le développement de stents à libération de substances cytostatiques utilisent l'endoprothèse comme un système de délivrance locale régulée, le plus souvent par les propriétés du polymère qui la recouvre. Actuellement 7 substances antiprolifératives ont été ou sont utilisées à l'occasion d'études cliniques de validation de sécurité et/ou d'efficacité : le sirolimus, un analogue du sirolimus codé ABT 578, le paclitaxel, l'actinomycine D, le tacrolimus et l'everolimus. Seuls le sirolimus et le paclitaxel ont actuellement bénéficié d'un large programme de validation clinique multiple ayant conduit à un processus de marquage CE. On peut notamment citer en exemple les produits aujourd'hui disponibles sur le marché des stents revêtus : - le stent Cypher11 commercialisé par la société Cordis dans lequel la molécule active est la rapamycine (sirolimus, Rapamune*), un immunosuppresseur utilisé jusque là comme traitement anti-rejet mais ayant aussi un puissant pouvoir antiprolifératif sur les cellules musculaires lisses vasculaires. La matrice polymérique utilisée sur ce stent est un mélange de polyéthylcncvinyl acétate (PEVA) et de polybutylméthacrylatc (PBMΛ) - le stent NIRx ® commercialisé par la société Boston Scientific : ce stent bioactif est revêtu d'une matrice composée d'un copolymère tribloc qui libère de manière prolongée un puissant anticancéreux : le paclitaxel. D'autres approches pharmacologiques. non cytostatiqυes. ont également été évaluées. Globalement, les molécules bioactives concernées peuvent être regroupées dans les catégories suivantes : - les anti-néoplasiques tels que par exemple le paclitaxel (Taxol ®). l'actinomycine D. la vincristine. le méthotrexate. l'angiopeptine, etc .. - les anti-thrombotiques tels que par exemple l'hirudine, l'iloprost. et l'héparine, - les immunosuppresseurs tels que par exemple le sirolimus
(Rapamycine ®). le tacrolimus. le tranilast. la dexaméthasone. le méthylpredisolone. l'interféron gamma l b, le lefiunomide et la ciclosporine, - les inhibiteurs de la migration et les modulateurs de la matrice extracellulaire tels que par exemple l'halofuginone, l'inhibiteur de la propylhydroxylase, l'inhibiteur de la proléinase C. les inhibiteurs des métalloprotéases et le batimastat. - les agents favorisant la ré-endothélialisation tels que les facteurs de croissance comme le "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF). le 17-β-œstradiol et les inhibiteurs de l'HydroxyiVléthylGlutharyl (HMG) CoΛ réductasc. La resténose consécutive à la pose d'un stent est un phénomène complexe dû principalement à l'hyperplasie intimale. L'épaississement de l'intima à la suite de la blessure vasculaire loi s de l'implantation du stent est le résultat à la fois de la migration et de la prolifération des cellules musculaires lisses ainsi que de l'accumulation de protéines de la matrice extracellυlaire (collagène. élastine, protéoglycanes). 1 a stratégie principale actuelle adoptée pour lutter contre la resténose est de prévenir l'hyperplasie intimale en inhibant la prolifération des cellules musculaires lisses par des agents cytostatiqυes et antinéoplasiques ou leur migration par les anti-métalloprotéases. Cependant, la resténose étant un phénomène particulièrement complexe et multifactoriel, les réalisations de l'art antérieur présentent l'inconvénient de considérer principalement une cible particulière à l'origine d'une étape du processus, alors qu'il est préférable, de pouvoir viser différentes cibles moléculaires impliquées dans l'initiation et l'évolution de la resténose. La pentoxifylline est un vasodilatateur périphérique communément utilisé dans le traitement des artérites des membres inférieurs (en particulier la claudication intermittente), de l'insuffisance circulatoire cérébrale et des troubles vasomoteurs périphériques (Kim N.Y. el al.. Gen. Pharmacof, 2000, 35 (4), 205-21 1 ). En plus de ses propriétés pharmacologiqucs connues, la pentoxifylline possède de nombreux effets biologiques intéressants susceptibles de participer à la prévention de la resténose. En effet, la pentoxifylline inhibe in vitro la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires humaines ( Chen Y. M. et al..
J. Mol. Cell. Cardiof, 1999. 31 , 773-783) : c'est un puissant inhibiteur de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires telles que EIL I 2, le TNF-alpha et l'interferon- gamma (Lazarczyk M. et ai. Oncology Reports. 2002. 9. 423-426). La pentoxifylline potentialise la production de monoxyde d'azote (NO) par les cellules musculaires lisses vasculaires et l'expression du gène de la NO-synthase inductible (Kim N.Y. et al.. 2000. précité). Dans un modèle de cellules musculaires lisses de rat, il a été montré que cette molécule inhibe la synthèse du collagène de type 1 induite par le TGF-béta (Chen Y.M. et al., 1999, précité). La pentoxifylline possède également un effet protecteur vis-à-vis des cellules endothéliales (Sobottka-Ventura A. C. et Bôhnke M.., Br. J. Ophtalmol., 2001 , 85, 1 1 10- 1 1 14). De plus, il a été montré que cette molécule protège le HDL-alpha- tocophérol de l'oxydation par f anion superoxyde libéré par les polynucléaires neutrophiles (Cogny A. et al.. Eur. J. Biochem., 1999, 259. 32-39). Par ailleurs, l'alpha tocophérol (également dénommé vitamine F.) est un puissant antioxydant et possède, de la même façon que la pentoxifylline, des propriétés biologiques intéressantes pouvant participer à prévenir l'apparition de la resténose : - l'alpha tocophérol est en particulier un inhibiteur de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (1 asinato A. et ai. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 12190-12194) ; - c'est un anti-inflammatoire : il diminue l'adhérence des ncutrophiles aux cellules endothéliales durant le processus inflammatoire en diminuant l'expression de certaines molécules d'adhésion à la surface de ces deux types de cellules (Yoshikawa T. et al.. Biofactors. 1998. 7. 15-19) ; - c'est un anti-agrégant plaqυettaire : il inhibe l'agrégation plaqυettaire in vitro (Freedman J. E. et ai. Circulation. 1996, 94, 2434-2440.), diminue l'adhésion plaquettaire m vivo en réduisant la concentration plasmatique de la P-sélectine (Davi G. et al.. Circulation. 1998. 97. 953-957). On connaît par ailleurs des travaux qui ont été réalisés dans le domaine de la lutte contre la lîbrose. cicatrice anormale après agression tissulaire, et processus qui présente de nombreuses analogies avec celui de la resténose : inflammation, synthèse de cvtokines, prolifération cellulaire, remodelage de la matrice cxtracellulaire et qui ont proposé d'associer la pentoxifylline avec un anti- inflammatoire, et notamment l'alpha-tocophérol. dans une formulation administrée par voie systémique (Demande de brevet FR-A-2 779 063). L'administration d'une composition renfermant l'association de la pentoxifylline et d'alpha-tocophérol dans des proportions données permet, lorsque la lésion est jeune et inflammatoire (phase de constitution), de prévenir la survenue d'une sclérose, et lorsque la lésion est ancienne et constituée (phase tardive), de réduire le bloc fibreux, voire, dans certains cas, de le faire disparaître. Parce qu'elle agit en synergie avec l'alpha tocophérol. la pentoxifylline est utilisée à des doses relativement faibles, par rapport aux prescriptions d'origines, ce qui permet d'en minimiser les effets secondaires. Cependant, on peut remarquer que ces deux molécules ont des pharmacocinétiques très diflérentes. dues notamment à leurs natures chimiques différentes. En effet, lorsque la pentoxifylline est absorbée par voie orale, elle atteint un taux sanguin maximal en trente minutes et son pic plasmatique est voisin de
1 μg/ml après une prise orale de 200 mg ; sa demi-vie est de 2 heures et l'élimination de plus de 90 % de la close absorbée sous forme métabolisée (Banque de données sur les médicaments : B1AM) Lorsque l'alpha-tocophérol est administré par voie orale, il est résorbé par les graisses dans le tractus gastro-intestinal et 35 % de la dose administrée passe dans la circulation, le reste étant éliminé par les fèces. L'alpha-tocophérol se lie aux lipoprotéines plasmatiques des membranes cellulaires et montre un tropisme pour le tissu adipeux, l'hypophyse, les surrénales, l'utérus et le testicule (Banque de données sur les médicaments : B1AM) ; son temps de demi-vie varie de quelques jours à 3 mois selon les tissus. Il est donc probable que lors d'une absorption orale simultanée de pentoxifylline et d'alpha-tocophérol dans le traitement des fibroses. l'efficacité de ces deux molécules soit liée à leur mode d'action séquentiel et que les concentrations présentes in situ dépendent du tissu concerné. Ce type de composition n'a cependant jamais été préconisé dans le cadre de la resténose. Dans le cas particulier de la resténose et contrairement à ce qui est observé pour le traitement de la fibrose. les Inventeurs ont maintenant découvert de façon surprenante, qu'il est nécessaire que ces deux types de molécules soient présents localement au même moment car leurs activités biologiques sont complémentaires et qu'il n'est donc pas possible d'utiliser les compositions à base de pentoxifylline et d'alpha tocophérol proposées par l'art antérieur et destinées à l'administration par voie orale. Les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à un revêtement organique bioactif applicable sur des endoprothèses vasculaires et permettant le relargage local et simultané de pentoxifylline el d'au moins un agent anti-oxydant afin d'améliorer leur performances en terme de réduction du taux de resténose. Ainsi la présente Invention a pour objet un revêtement organique à base de polymère caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une couche de matrice de polymère(s) synthétiqυe(s) présentant une épaisseur supérieure ou égale à 1 μm, ladite matrice renfermant une association : - de pentoxifylline, en une quantité supérieure ou égale à 0,036 nmole/mm2 de surface de ladite matrice et - d'au moins un agent anti-oxydant, en une quantité supérieure ou égale à 0,042 nmole/mm2 de surface de ladite matrice. Ainsi que cela est démontré dans les exemples qui suivent, le revêtement conforme à l'Invention peut être utilisé pour recouvrir des cndoprothèses vasculaires afin que la pentoxifylline et l'agent anti-oxydant soient relargués in situ simultanément et de manière prolongée une fois l'endoprothèse mise en place. Le revêtement conforme à l'Invention permet en particulier un relargage prolongé et simultané des deux molécules sur une période allant de 4 à 8 semaines environ. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, la pentoxifylline est présente au sein de la matrice polymère en une quantité comprise entre 1 8 et 54 nmolcs/mm2 environ de surface de ladite matrice (soit entre 5 et 1 5 μg/mm2 environ), la valeur de 36 nmoles/mm2 (soit 10 μg/mm2) étant tout particulièrement préférée. De même, l'agent anti-oxydant est de préférence présent au sein de la matrice polymère en une quantité comprise entre 32 et 53 nmoles/mm2 environ de surface de ladite matrice (soit entre 1 5 et 25 μg/mm2 environ dans le cas de l'alpha- tocophérol), la valeur de 42 nmoles/mm2 environ (soit 20 μg/mm2 dans le cas de l'alpha-tocophérol) étant tout particulièrement préférée. L'épaisseur du revêtement conforme à l'Invention est de préférence supérieure ou égale à 5 μm, et encore plus préférentiellement comprise entre 10 μm et 100 μm inclusivement. Parmi le ou les agents anti-oxydants pouvant être incorporés dans la matrice polymère du revêtement conforme à la présente Invention, on peut tout particulièrement citer l'alpha-tocophérol et ses sels physiologiquement acceptables tels que l'acétate d'alpha-tocophérol, les enzymes anti-oxydantes telles que les superoxyde dismutases (SODs) et les glutathion peroxydases, l'acide ascorbique, le béta-carotène, les flavonoïdes, l'ubiquinone, le probucol, le glutathion et l'acide lipoïque et leurs mélanges ; l'alpha-tocophérol et ses sels étant tout particulièrement préférés. Selon une forme de réalisation préférée, le ou les agents antioxydants représentent de 5 à 60 % en poids environ par rapport au poids total du revêtement et encore plus préférentiellement de 10 à 50 % en poids environ. La nature du ou des polymères synthétiques utilisables pour former la ou les couches de matrice du revêtement conforme à la présente Invention n'est pas critique. Ils peuvent être choisis parmi les polymères biodégradables ou non biodégradables et leurs mélanges. Selon l'Invention, on préfère cependant utiliser des polymères biocompatibles biodégradables ou non et connus pour être disponibles sous la qualification de "médical grade". Selon l'Invention, on entend par polymères "biodégradables", des polymères pouvant se désagréger en milieu biologique, notamment par hydrolyse, avec une cinétique telle qu'environ 20 % du polymère (en poids) est dégradé dans un temps de l'ordre de ou supérieur au temps nécessaire au relargage complet des substances actives telles que définies précédemment. Dans le présent exemple, le temps de relargage est typiquement de l'ordre de 4 à 8 semaines. Les polymères biodégradables sont de préférence choisis parmi les polyesters biodégradables tels que par exemple les polymères d'acide lactique (PLA) ou d'acide glycoliqυe (PGA). les copolymères d'acide lactique et d'acide glycolique (PLGA), les polymères d'ε-caprolactone. d'alkyle cyanoacrylate. d'hydroxybutyrate, ou d'hydroxyvalérate, les polyanhydrides, les poly-orthoesters. les poly (imido carbonates) et les poly (β-acide malique) : les poly(phosphazèncs) ; les poly(éthcrs). les polysaccharides et leurs mélanges. Les polymères non biodégradables sont de préférence choisis parmi les polyesters non biodégradables tels que le polyéthylèneterephtalate, les polyacrylates et les polyméthacrylates: les poly(amides) ; le polychlorure de vinyle ; les polyéthylène vinyle acétates ; les polyuréthanes : les polysiloxanes ; la polyvinylpyrrolidone (PVP) et leurs mélanges. Selon l'Invention, la ou les matrices polymères sont de préférence constituée(s) par un ou plusieurs polymères biodégradables biocompatibles choisis parmi les polyesters biodégradables et encore plus préférentiellement parmi les PLA, PGA, leurs copolymères (PLGA) et leurs mélanges. Lorsque le revêtement conforme à l'Invention est constitué de plusieurs couches de matrice polymères, identiques ou différentes entre elles du point de vue de la nature des polymères, alors chacune des couches de matrice polymère peut renfermer la pentoxifylline et l'agent anti-oxydant dans des proportions respectives variant d'une couche à l'autre. Il est par exemple possible de prévoir un revêtement comportant au moins deux couches de matrice polymère et dans lequel la couche externe (supérieure) est enrichie en agent anti-oxydant, notamment en acétate d'alpha-tocophérol, de manière à ce que cette dernière molécule soit relargυée de façon préférentielle, en quantité facilement ajustable, de manière à profiter, aux temps courts, des propriétés anti-oxydantes et anti-inflammatoires de l'alpha-tocophérol dans la lutte contre les effets inflammatoires dus à la pose de l'endoprothèse vasculaire. Il est également possible d'envisager un revêtement comportant au moins deux couches de matrice polymère (une couche externe et une couche interne) et dans lequel la couche externe ne comprend ni pentoxifylline ni agent anti-oxydant. ces deux molécules étant par contre uniquement contenues dans la couche interne : la couche externe laissant par contre diffuser ces deux molécules vers l'extérieur du revêtement. La présente invention à également pour objet l'utilisation d'au moins un revêtement tel que défini ci-dessus pour recouvrir des endoprothèses vasculaires. Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'une endoprothèse vasculaire caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une étape au cours de laquelle la surface de ladite endoprothèse est recouverte d'au moins une couche de revêtement conforme à l'invention. La couche de revêtement conforme à l'Invention peut être appliquée à la surface de ladite endoprothèse de manière conventionnelle selon les méthodes classiquement utilisées à cet effet par l'homme de l'art. A titre d'exemple, le ou les polymères constituant la matrice, en solution dans un solvant sont mélangé à une solution de pentoxifylline et d'au moins un agent anti-oxydant, puis le mélange résultant est appliqué (par exemple par trempage ou pulvérisation) sur la surface à revêtir et enfin séché pour former un film. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, ledit procédé comprend de préférence une étape préliminaire à l'étape d'application du revêtement conforme à l'invention au cours de laquelle la surface de l'endoprothèse est d'abord recouverte d'une première couche de primaires d'adhésion afin de faciliter la fixation ultérieure du revêtement conforme à l'Invention. De telles couches de primaires d'adhésion peuvent être fixées, en général de manière covalente. sur la surface de l'endoprothèse et offrir à l'extérieur une polarité et/ou des groupements fonctionnels présentant une affinité pour la matrice polymère à fixer. Parmi ces primaires d'adhésion, on peut par exemple citer les siloxanes (R-Si(OH)3), les chlorosilanes (R-SiCl3). les sels de diazonium (R-Φ- N2 +,X\ où X- est un sel tel que par exemple un tétrafluoroborate ou un tosylate). ainsi que les produits de réduction électrochimique des sels de diazonium et des monomères vinyliqυes (H2C=C(R|)R2- où R| = II. CI I3. CN et R est un groupement acide carboxylique. un groupement ester ou un groupement amide). Des procédés conduisant à la formation d'une couche de primaires d'adhésion sont en particulier décrits dans la demande internationale WO 98/44172 et dans le brevet US 6,517.858, respectivement, et permettent en particulier d'aboutir à l'électro-greffage covalent d'une couche organique sur toute surface conductrice ou semi-conductrice de l'électricité. La réalisation d'une couche de primaires d'adhésion par un procédé d'électro-greffage constitue une forme de réalisation particulière et préférée de l'Invention. Les interfaces entre les couches polymères sont solides (primaires d'adhésion et matrice polymère) et résistent notamment à la délamination et au décrochage des revêtements par morceaux. En effet, si les interfaces entre la première couche de primaires d'adhésion et l'endoprothèse d'une part, et entre la couche de primaires d'adhésion et la matrice de polymères du revêtement conforme à l'Invention d'autre part, sont solides, alors ladite matrice de polymères biodégradables se dégradera "par sa surface externe", permettant ainsi une biodégradation progressive assurant la production de relargages contrôlés. On peut choisir la nature des groupements R des primaires d'adhésion mentionnés ci-dessus de manière à ce qu'ils présentent une bonne affinité chimique pour le polymère biocompatible à fixer, et/ou assurent une bonne maîtrise de l'énergie de surface (hydrophile / hydrophobe) de manière à favoriser les meilleures interactions. Enfin, l'Invention a également pour objet une endoprothèse vasculaire caractérisée par le fait que sa surface est recouverte par au moins une couche du revêtement organique à base de polymère conforme à l'Invention et tel que décrit précédemment. Les endoprothèses vasculaires comportant un revêtement constitué d'au moins une couche de matrices de polymèrc(s) synthétique(s) et d'une couche de primaires d'adhésion électro-greffée sont particulièrement préférées. Outre les dispositions qui précèdent. l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple des exemples de préparation de revêtements conformes à l'Invention, à des études du relargage de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol à partir de revêtements conformes à l'invention, à une étude de relargage de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol à partir d'un stent revêtu de poly (acide lactique) fixé par une couche de primaire d'adhésion, à une étude de l'effet de l'association pentoxifylline/acétate d'alpha-tocophérol sur la migration in vitro des cellules musculaires lisses humaines, à une étude de l'effet de l'association pentoxifylline/acétate d'alpha-tocophérol sur la prolifération in vitro des cellules musculaires lisses vasculaires humaines ainsi qu'aux figures 1 à 5 annexées dans lesquelles : - la figure 1 représente les profils de relargage de la pentoxifylline (losanges) et de l'acétate d'alpha-tocophérol (carrés) à partir d'une matrice de poly(acide lactique), exprimés en μg/cm2 de surface de revêtement en fonction du temps (jours) ; - la figure 2 représente les profils de relargage de la pentoxifylline (losanges) et de l'acétate d'alpha-tocophérol (carrés) à partir d'une matrice de poly(acide lactique) fixé sur un stent par l'intermédiaire d'une couche de primaire d'adhésion de poly butylméthacrylate, exprimés en μg/stent de surface de revêtement en fonction du temps (jours) ; - la figure 3 représente l'inhibition (en %) de la migration de cellules musculaires lisses vasculaires humaines après incubation dans des milieux de culture renfermant différentes concentrations de pentoxifylline et/ou d'acétate d'alpha- tocophérol ; - la figure 4 représente le nombre de cellules musculaires lisses vasculaires humaines/cm2 après culture dans des milieux renfermant différentes concentrations de pentoxifylline et/ou d'acétate de tocophérol en fonction du temps en jours pour une première série de manipulations (.11 (barres noires). .12 (barres blanches), J9 (barres grises). .115 (barres hachurées en diagonale). .121 (barres à damiers) et J27 (barres à pointillés)) ; - la figure 5 représente le nombre de cellules musculaires lisses vasculaires humaines/cm2 après culture dans des milieux renfermant différentes concentrations de pentoxifylline et/ou d'acétate de tocophérol en fonction du temps en jours pour une deuxième série de manipulations (J l (banes noires). .12 (barres blanches). J9 (barres grises). J15 (barres hachurées en diagonale). .121 (barres à damiers) et J27 (barres à pointillés)).
EXEMPLE 1 : PREPARATION D'UNE MATRICE POLYMERE BIODECRADABLE D'ACIDE POLYLACT1QUE CONTENANT DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL. Dans cet exemple, on réalise une matrice polymère permettant le relargagc de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol. Les deux molécules sont contenues dans la même matrice de polymère, faite d'acide poly lactique, et l'on montre que ce mode de réalisation permet d'obtenir que ces molécules soient présentes de façon concomitante dans la matrice. On mélange une solution de poly(acide lactique) à 10 % (p/v) dans du chloroforme avec une solution de pentoxifylline et d'acétate d'alpha tocophérol dans le chloroforme, de manière à ce que chacun des rapports pentoxifylline/polymère et acétate d'alpha tocophérol/polymèrc soit au final de 30 %. Un film de cette matrice de relargage est déposé sur une lame d'inox 316L par trempage, aller-retour, de la lame dans la solution contenant la matrice dissoute. Le film est séché à température ambiante, puis on en analyse la composition par spectrométrie de masse à ionisation secondaire (TOF-SIMS : Timc-Of-Hight-Secondary lonization Mass Spectrometry). Les graphiques obtenus (non représentés) montrent les pics de masse caractéristiques de l'acétate d'alpha-tocophérol ( 1 ) et de la pentoxifylline (P). ce qui démontre que ces deux molécules sont présentes dans la matrice et que leur structure a été préservée. En combinant l'analyse TOF-SIMS et l'abrasion du film de polymère à l'aide d'un faisceau d'ions gallium focalisé sur la surface de l'échantillon à partir d'un canon auxiliaire présent sur l'appareil et synchronisé a\ ec le faisceau d'ions primaires, on peut réaliser le suivi des intensités de pics caractéristiques de chacune des deux molécules en fonction du temps d'abrasion. Le tracé des intensités de ces pics en fonction du temps d'abrasion
(non représenté) montre des plateaux, qui illustrent le fait que la concentration des molécules actives reste constante dans l'épaisseur du film, ce qui démontre une bonne répartition des deux molécules au sein de la matrice polymèie pour effectuer le relargage continu de celles-ci de façon concomitante. EXEMPLE 2 : MATRICE POLYMERE BIODEGRADABLE D'UN COPOLYMERE DE L'ACIDE LACTIQUE ET DE L'ACIDE GLYCOLIQUE CONTENANT DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL. Dans cet exemple, des matrices de polymère permettant le relargage de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol ont été réalisées dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus à l'exemple 1. mais en partant d'un mélange d'une solution à 500 mg/ml de pentoxifylline dans le chloroforme et d'une solution d'acétate d'alpha-tocophérol à 500 mg/ml dans le même solvant d'une part, et de solutions dans le chloroforme de divers copolymères de l'acide lactique et de l'acide glycolique (PLGA 85/15, PLGA 75/25, PLGA 65/35 et PLGA 50/50). L'analyse TOF-SIMS des différentes matrices obtenues a permis, comme dans l'exemple 1 ci-dessus, de montrer que les deux molécules actives sont présentes, de façon homogène, dans le film de copolymère servant de matrice de relargage (résultats non représentés). EXEMPLE 3 : MATRICE POLYMERE BIODEGRADABLE DE POLY ORTHO ESTER (POE) CONTENANT DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL. Dans cet exemple, des matrices polymères permettant le rclargage de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol ont été réalisées dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus à l'exemple 1. mais en partant d'une solution contenant les deux molécules actives à raison chacune de 500 mg/ml dans le chloroforme, et d'une solution dans le chloroforme d'un poly orthoester, à savoir le poly ([ 10-3.9-diéthyl-9-(nonyloxy)-2.4.8.10-tetraoxa-spiro[5, 5]undec-3- yloxy]-)decan-l -ol. L'analyse TOF-SIMS (non représentée) permet, comme dans l'exemple 1. de montrer que les deux molécules actives sont présentes, de façon homogène, dans le film de polymère servant de matrice de relargage. EXEMPLE 4 : MATRICE POLYMERE BIODEGRADABLE D'ACIDE POLYLAC I IQUE CONTENANT DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL. Dans cet exemple, on réalise une matrice polymère permettant le relargage de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol composée de deux couches de matrice polymère successives, dans lesquelles les proportions respectives des deux molécules sont différentes. On illustre en particulier le cas où la couche supérieure est enrichie en acétate d'alpha-tocophérol. Dans chaque couche, les deux molécules sont contenues dans la même matrice de polymère, faite d'acide poly lactique. Pour ce faire, on réalise d'une part une solution de poly(acide lactique) à 10 % (p/v) dans du chloroforme et d'autre part deux solutions de pentoxifylline et d'acétate d'alpha tocophérol dans le chloroforme : - une première solution dans laquelle le rapport pondéral acétate d'alpha tocophérol / pentoxifylline est égal à 4 et - une deuxième solution dans laquelle le rapport pondéral acétate d'alpha tocophérol / pentoxifylline est égal à 1. Chacune de ces deux solutions est mélangée avec la solution de polymère à 10 % dans le chloroforme de manière à obtenir une solution A (rapport = 4) et une solution B (rapport ~ 1 ). Une première couche de matrice polymère est déposée sur une lame d'inox 316L par trempage, aller-retour, de la lame dans la solution B. Le film obtenu est séché à température ambiante, puis on dépose sur la première couche de matrice polymère une seconde couche de matrice par trempage, aller-retour, de la lame dans la solution A. L'analyse de la composition du revêtement complet a été effectuée par TOF-SIMS. L'étude des profils (non représentés) de concentration en profondeur de chacune des deux molécules montre que le revêtement obtenu est enrichi en surface en acétate d'alpha-tocophérol.
EXEMPLE 5 : ETUDE DU RELARGAGE DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL A PARTIR D'UN REVETEMENT DE POLY (ACIDE LACTIQUE) FIXE PAR UNE COUCHE DE PRIMAIRE D'ADHESION A BASE DE POLY (BUTYL METHACRYLATE) Dans cet exemple, on illustre la fixation, sur une surface d'inox 316L. d'un revêtement constitué d'une matrice de polymère biodégradable contenant de la pentoxifylline et d'acétate d'alpha-tocophérol. Cette fixation est réalisée grâce à une sous-couche électro-greffée de poly méthacrylate de butyle (PBMA). qui sert de primaire d'adhésion pour la matrice polymère biodégradable. Les deux molécules sont contenues dans la même matrice de polymère, et l'on montre que ce mode de réalisation permet d'obtenir que ces molécules soient relarguées de façon concomitante. 1-) Electrogrcffage de la sous-couche de PBMA : On trempe une lame d'acier inoxydable 316L de 10 cm de longueur sur 1 cm de large dans une solution de diméthylformamide (DMF) renfermant 3.125 mol/1 de méthacrylate de butyle (BUMA). 10"2 mol/1 de tétrafluoroborate de 4- nitrophényl diazonium et 2,5.10" mol/1 de nitrate de sodium. Cette lame sert d'électrode de travail dans un montage à trois électrodes. Les deux autres électrodes du dispositif sont une électrode de platine de grande dimension, qui sert de contre- électrode, ainsi qu'un fil d'argent, utilisé comme électrode de référence. On soumet cette lame à une série de 50 balayages de potentiel en conditions voltamétriques. entre - 0,1 et - 3,0 V/(Ag+/Λg), à une vitesse de 100 mV/s. La lame est ensuite rincée à la DMF. puis à l'acétone, et enfin séchée sous courant d'azote. On obtient un film de PBMA d'environ 300 nm d'épaisseur. 2)-Synthèse et dépôt de la matrice polymère On mélange, comme décrit ci-dessus à l'exemple 1. une solution de poly(acide lactique) à 10 % (p/v) dans du chloroforme avec une solution de pentoxifylline et d'acétate d'alpha tocophérol réalisée dans le même solvant de manière à ce que chacun des rapports pentoxifylline/polymère et acétate d'alpha tocophérol/polymère soit au final de 30 % en poids. Le dépôt du polymère de relargage chargé en molécules est réalisé par trempage des lames d'inox 316L préalablement revêtues de PBMA électro-greffé selon l'étape 1 précédente. Après séchage, les lames sont mises à tremper dans du tampon phosphate 0.1 M de pli 7.4 et soumises à une agitation douce (50 tours/min) sur un plateau rotatif à 37°C (ces conditions mimant celles du milieu physiologique, dans lequel on veut έλ aluer le relargage des molécules actives). Des dosages de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol libérés dans les bains de rclargage sont effectués à intervalles réguliers, par la mesure des spectres d'absorption des bains de relargage au contact des lames. Les deux molécules actives présentent en effet une absorption optique caractéristique dans le domaine UV, à 270 nm et 285 nm. pour la pentoxifylline et l'acétate d'alpha- tocophérol en tampon phosphate à pli = 7.4. respectivement. La mesure des mêmes absorptions optiques sur des solutions ne contenant respectivement que de la pentoxifylline ou de l'alpha-tocophérol en concentrations croissantes permet préalablement d'établir des droites d'étalonnage pour chacune des deux molécules. Ces droites d'étalonnage permettent, de mesurer les concentrations de pentoxifylline et d'acétate d'alpha-tocophérol. respectivement, libérées dans les bains de relargage. Ces bains de rclargage sont changés à chaque dosage, et leur volume est connu. Le produit de la concentration mesurée par le volume du bain de relargage est égal à la quantité relarguée depuis le dosage précédent. La somme des quantités rclarguées depuis le démarrage du relargage (t = 0) est égale à la quantité relarguée cumulée. Un exemple de profils de relargage, présentant l'allure de la quantité relarguée cumulée en fonction du temps, est représenté sur la figure 1 annexée sur laquelle les quantités cumulées de pentoxifylline (losanges) et d'acétate d'alpha- tocophérol (carrés) relarguées sont exprimées en μg/cm2 de surface de revêtement en fonction du temps (en jours). Ces résultats montrent que si les deux molécules sont bien relarguées de façon concomitante, on observe cependant que le rapport de leurs concentrations dans l'éluat varie en fonction du temps. On observe en particulier que le rapport de la concentration en pentoxifylline sur celle de l'acétate d'alpha- tocophérol (CPTχ / Ca-TOco) est proche de 1 , voire inférieur à 1 , aux temps courts, jusqu'à un temps d'environ 48 heures. Ce résultat est intéressant, car il montre qu'aux temps courts, c'est la molécule présentant des propriétés anti-oxydantes qui est relarguée en plus grande quantité : ceci présente un effet a priori favorable pour lutter plus efficacement contre l'inflammation, prépondérante aux temps courts après mise en place du stent. Après ce délai, ce rapport tend vers une valeur constante, approximativement égale à deux, qui est précisément le rapport de concentrations (CpTχ / Ca-Toco) dans le mélange initial ayant servi à concevoir la matrice de polymère. Le relargage s'enrichit donc progressivement en pentoxifylline, dont on peut montrer qu'elle possède des propriétés anti-prolifératives et anti-migratoires intéressantes dans la lutte contre la resténose.
EXEMPLE 6 : ETUDE DU RELARGAGE DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL A PARTIR D'UN REVETEMENT DE POLY (ACIDE LACTIQUE) FIXE PAR UNE COUCHE DE PRIMAIRE D'ADHESION CONSTITUEE PAR UN FILM DE TETRAFLU OROBORATE DE 4-DODECANE DIAZONIUM. Dans cet exemple, on illustre la fixation, sur une surface d'inox 316L, d'un revêtement constitué d'une matrice de polymère biodégradable contenant de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol. Cette fixation est réalisée grâce à une sous-couche électro-greffée obtenue par électro-réduction de tétrafluoroborate de 4-docécane diazonium (DCT 2), qui sert de primaire d'adhésion pour la matrice polymère biodégradable. Les deux molécules actives sont contenues dans la même matrice de polymère, et l'on montre que ce mode de réalisation permet d'obtenir que ces molécules soient relarguées de façon concomitante. 1-) Electrogreffage de la sous-couche de DC12 : On trempe une lame d'acier inoxydable 3 I 6L de 10 cm de longueur sur 1 cm de large dans une solution d'acétonitrile renfermant 2.10" mol/1 de tétrafluoroborate de 4-dodécane diazonium et 5.10" mol/1 de perchlorate de tétraéthylammonium. Cette lame sert d'électrode de travail dans un montage à trois électrodes. Les deux autres électrodes du dispositif sont une électrode de carbone de grande dimension, qui sert de contre-électrode, ainsi qu'un fil d'argent, utilisé comme électrode de référence. On soumet cette lame à une série de 10 balayages de potentiel en conditions voltammétriques, entre - 0.33 et - 1 ,8 V/(Ag /Ag). à une vitesse de 20 mV/s. La lame est ensuite rincée à l'acétonitrile. puis à l'acétone, et enfin séchée sous courant d'azote. On obtient un film de DC12. présentant les bandes infrarouges caractéristiques.
2)-Synthèse et dépôt de la matrice polymère On îéalise la matrice de polymère, ainsi que son dépôt, dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 5 ci-dessus, étape 2). Après séchage, les lames sont mises à tremper dans les mêmes conditions que dans l'exemple 5, et le suivi du relargage est effectué de la même manière. On observe, comme dans l'exemple 5, un relargage concomitant des deux molécules actives, avec - aux temps courts - un relargage préférentiel de l'alpha-tocophérol. EXEMPLE 7 : ETUDE DU RELARGΛGE DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL A PARTIR D'UN REVETEMENT A BASE DE POLY (ACIDE LACTIQUE)CO(ACIDE GLYCOLIQUE) FIXE PAR UNE COUCHE DE PRIMAIRE D'ADHESION A BASE DE POLY HYDROXYETHYL-METHACRYLATE (POLY(HEMA)). 1) Electrogreffage de la sous-couche de poly(HEMA) On trempe une lame d'acier inoxydable 316L de 10 cm de longueur sur 1 cm de large dans une solution constituée d'un mélange (5/95 : v/v) de DMF et d'eau distillée renfermant 3.5 mol/1 de méthacrylate d'hydroxyéthyle (FILMA). 10"2 mol/1 de tétrafluoroborate de 4-nitrophényl diazonium et 2,5.10" mol/1 de nitrate de sodium. Cette lame sert d'électrode de travail dans un montage à deux électrodes. L'autre électrode est une électrode de platine de grande dimension. On soumet cette lame à 100 balayages de potentiel, entre - 0,3 et - 1.2 Volts, à une vitesse de 100 mV/s. La lame est ensuite rincée à la DMF, puis à l'acétone, et enfin séchée sous courant d'azote. On obtient un film de poly(FIEMA) d'environ 1 micron d'épaisseur. 2) Synthèse et dépôt de la matrice polymère On mélange une solution de poly(acide lactique)co(glycolique) (75/25) à 10 % (p/v) dans du chloroforme avec une solution de pentoxifylline et d'acétate d'alpha tocophérol réalisée dans le même solvant de manière à ce que chacun des rapports pentoxifylline/polymère et acétate d'alpha-tocophérol/polymère soit au final de 20 % en poids. Le dépôt du polymère de relargage chargé en molécules est réalisé par trempage des lames d'inox 316L préalablement revêtues de poly (IIEMA) selon le protocole de l'étape 1 dυ présent exemple. Après séchage, les lames sont mises à tremper dans du tampon phosphate 0.1 M. pH 7,4 et soumises à une agitation douce à 37°C (ces conditions mimant celles du milieu physiologique, dans lequel on veut évaluer le relargage des molécules actives). Des dosages de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol libérés dans les bains de relargage sont effectués intervalles réguliers. On observe, comme dans l'exemple 5. que les deux molécules sont relarguées de façon concomitante. Les mêmes allures de cinétiques de relargages (non représentées) que celles obtenues ci-dessus à l'exemple 5 (figure 1 ) ont été obtenues. EXEMPLE 8 : ETUDE DU RELARGAGE DE LA PENTOXIFYLLINE ET DE L'ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL A PARTIR D'UN STENT REVETU DE POLY (ACIDE LACTIQUE) FIXE PAR UN PRIMAIRE D'ADHESION A BASE DE PBMA 1) Electrogreffage de la sous-couche de PBMA On recouvre un stent en inox 316L d'une couche de PBMA électro- greffée, en utilisant le stent comme électrode de travail dans le même montage et avec le même protocole que dans l'étape 1 de l'exemple 5 exposé précédemment. 2) Synthèse et dépôt de la matrice polymère On mélange une solution de poly(acide lactique) à 2 % (p/v) dans du chloroforme avec une solution de pentoxifylline et d'acétate d'alpha tocophérol réalisée dans le même solvant de manière à ce que chacun des rapports pentoxifylline/polymère et acétate d'alpha-tocophérol/polymère soit au final de 50 % en poids. Le dépôt du polymère de relargagc chargé en molécules est réalisé par pulvérisation (spray) sur les stents préalablement revêtus de la sous-couche de PBMA électro-greffé selon le protocole de l'étape 1 . La buse d'atomisation utilisée est une buse à mélange interne c'est-à- dire que le mélange entre l'air sous pression et le liquide à pulvériser a lieu à l'intérieur de la buse. Le diamètre de l'orifice est de 0.040 inches soit 1.6 mm. La buse est entièrement constituée d'acier inox et alimentée grâce à une micro-pompe. La pulvérisation est discontinue car assurée par une micro-pompe dont la chambre se remplit et se vide alternativement. Le contrôle est effectué par un module qui permet d'ajuster à 0,1 μl près le volume de solution atomisée par pulvérisation ainsi que le débit de la solution à 0.1 μl par seconde près. Le stent, en rotation devant le jet de la buse de façon à ce que toute sa surface extérieure voit le jet, est maintenu verticalement à une distance de 6 à 12 cm de la buse. On ajuste la pression d'air afin d'obtenir une pression de 4 psi soit environ 200 mbars. 5 pulvérisations successives avec 15 secondes d'intervalle entre chaque pulvérisation, sont nécessaires pour obtenir une épaisseur d'acide polylactique homogène de 10 microns sur l'ensemble de la surface du stent. Après séchage, les stents sont mis à tremper dans 1 ml en tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4 et soumises à une agitation douce à 37°C. Des dosages par chromatographie liquide haute performance (HPLC), de la pentoxifylline et de l'acétate d'alpha-tocophérol libérés dans les bains de relargage sont effectués à intervalles réguliers selon la méthode décrite ci-dessus à l'exemple 5. Un exemple de profil de relargage est illustré par la Figure 2 annexée sur laquelle les quantités cumulées de chacune des deux molécules relarguées (pentoxifylline : losanges ; acétate d'alpha-tocophérol : carrés) exprimées en μg/stent est fonction du temps en jours. Ces résultats montrent que l'on observe des profils favorisant le relargage initial de l'acétate d'alpha-tocophérol aux temps courts, avant de favoriser le relargage de pentoxifylline aux temps plus longs. EXEMPLE 9 : ETUDE DE L'EFFET DE L'ASSOCIATION PENTOXIFYLLINE/ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL SUR LA MIGRATION IN VITRO DES CELLULES MUSCULAIRES LISSES VASCULAIRES HUMAINES. Le but de cet exemple était d'évaluer, par un test standard, l'effet de l'association de la pentoxifylline/acétate d'alpha-tocophérol sur la migration des cellules musculaires lisses vasculaires humaines (CMLVH). 1) Mode opératoire a) Pré-incubation des cellules Des CMLVH (cellules d'aorte humaine AoSMC, n° ATCC-2571 ) (6e e passage) sont ensemencées à raison de 5 000 cellules/cm dans des boites de Pétri de 35 mm de diamètre dans du milieu de culture complet ("Dulbecco's Modified Essential Médium" : DMEM contenant 5 % de sérum de veau fœtal (SFV) et des antibiotiques (Pénicilline : 10000 μg/ml, U-Streptomycine 10 000 μg/ml et Amphotéricine 25 μg/ml) à 0,5%) additionné par les différentes concentrations de pentoxifylline (PTX), d'acétate d'alpha-tocophérol (TOC), ou de l'association des deux (association). Les concentrations testées ont été les suivantes : PTX : 250 ; 500 et 750 μg/ml ; TOC : 500 ; 1000 et 2000 μg/ml ; association PTX/TOC : 500/500 ; 500/1000 et 200/2000 μg/ml. Un témoin négatif ne contenant ni pentoxifylline ni acétate d'alpha-tocophérol est mené en parallèle. b) Migration cellulaire Les cellules pré-incubées sont trypsinées, rincées dans le milieu de culture, puis suspendues dans un milieu de migration constitué de DMEM supplémenté à 2 % (p/v) par de l'albumine bovine (BAS) (fraction V). puis : - 30 μl de "recombinant human Platelet Derivated Growth Factor- hétérodimère AB (rhPDGF-AB) à 20 ng/ml de Milieu de migration sont déposés sur un fond de puit d'une plaque mυltipuits (24 puits de 15.5 mm de diamètre) et des inserts de 1 cm de diamètre et de porosité 8 μm sont ajoutés dans chaque puits. - 50 μl de la suspension cellulaire contenant 10 000 cellules sont déposés à l'intérieur de chaque insert, - les plaques sont fermées et laissées à incuber à 37°C en atmosphère humide pendant 4 heures. A la fin de l'incubation, les inserts sont prélevés: - la face supérieure de la membrane de l'insert est grattée afin d'éliminer les cellules adhérentes ; - la membrane et les cellules adhérentes à la face inférieure sont fixées dans 500 μl de mcthanol. les cellules sont colorées au Giemsa et dénombrées au microscope sur 10 champs consécutifs (X200). En parallèle, on réalise : - un témoin négatif : dans l'insert. les cellules sont incubées en présence de 30 μl de Milieu de migration dans le puit de culture. - un témoin positif : dans l'insert, les cellules sont incubées en présence de 30 μl de Milieu de Migration supplémenté par le rhPDGF-AB à 20 ng/ml. Les résultats de la migration sont exprimés en pourcentage d'inhibition 1 (%) selon la formule (1 ) suivante : 1 (%) = [1 - (Nombre de cellules pré-traitées ayant migré /Nombre de cellules non pré-traitées ayant migré] X 100 ( 1)
2) Résultats Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 3 annexée. Sur cette figure l'inhibition de la migration (en %) a été exprimée pour chacune des concentration de pentoxifylline et/ou d'acétate d'alpha-tocophérol testée. Ces résultats montrent que a pentoxifylline et l'acétate d'alpha- tocophérol inhibent la migration des cellules musculaires lisses de manière dose- dépendante avec des IC50 (concentration inhibant 50 % de la migration cellulaire) respectives de l'ordre de 700 μg/ml et 1500 μg/ml. Us montrent également que l'association des 2 molécules conserve leur effet inhibiteur et permet, pour un même résultat, de diminuer les doses: pour inhiber 50 % de la migration cellulaire il suffit d'associer 500 μg/ml de pentoxifylline et 1000 μg/ml d'acétate d'alpha-tocophérol. ce qui permet d'utiliser des doses très inférieures aux doses cytotoxiques (respectivement 1000 μg/ml et 2000 μg/ml pour la pentoxifylline et l'acétate d'alpha-tocophérol).
EXEMPLE 10 : ETUDE DE L'EFFET DE L'ASSOCIATION PENTOXIFYLLINE/ACETATE D'ALPHA TOCOPHEROL SUR LA PROLIFERATION IN VITRO DES CELLULES MUSCULAIRES LISSES VASCULAIRES HUMAINES. Le but de cet exemple était d'évaluer par un test standard l'effet de l'association de la pentoxifylline/acétate d'alpha-tocophérol sur la prolifération des CMLVFI. 1) Mode opératoire : Des CMLVH identiques à celles utilisées ci-dessus à l'exemple 9 (6e e passage) sont ensemencées à raison de 5 000 cellules/cm dans des plaques de 24 puits (15,5 mm de diamètre) avec du milieu de culture complet (DMEM supplémenté de SVF à 5 % (v/v) et d'antibiotiques à 0.5% (v/v) tel que décrit ci-dessus à l'exemple 9) et mises à incuber en atmosphère humide contenant 5 % de CO2. Au bout de 24 heures de culture, le bon état des cellules est vérifié au microscope. Le milieu de culture est prélevé et remplacé par le milieu de culture contenant différentes combinaisons de l'association pentoxifylline/acétate d'alpha- tocophérol (première série de manipulations : PTX 100 μg/ml/TOC 1000 μg/ml ; PTX 500 μg/ml/TOC 1000 μg/ml ; PTX 1000 μg/ml/TOC 1000 et deuxième série de manipulations : PTX 500 μg/ml/TOC 500 μg/ml ; PTX 500 μg/ml/TOC 1000 μg/ml ; PTX 500 μg/ml/TOC 2000 μg/ml). Des témoins négatifs sans PTX ni TOC ainsi que des témoins positifs ont été réalisés en parallèle : - Témoin négatif: milieu de culture contenant 0,5 % (v/v) d'éthanol absolu ; - Témoin positif : rh PDGF-AB (Sigma. P3326) Les milieux de culture sont ensuite changés tous les trois jours dans les différentes séries (traitement en continu). Aux temps d'incubation 1 , 3, 9, 1 5, 21 et 27 jours, les cellules (n = 4) sont comptées en cellule de Malassez, après trypsinisation en présence de bleu Trypan. 2) Résultats Les résultats obtenus sont reportés sur les figures 4 (première série de manipulations) et 5 (deuxième série de manipulations) annexées. Sur ces figures, le nombre de cellules/cm2 est exprimé en en fonction de chacune des doses de PTX et/ou de TOC testées et ce à .11 (banes noires). .12 (barres blanches). J9 (barres grises). J 15 (barres hachurées en diagonale), .121 (barres à damiers) et .127 (barres à pointillés). Ces résultats montrent que l'association pentoxifylline/acétate d'alpha tocophérol possède un effet inhibiteur sur la croissance in vitro des cellules musculaires lisses humaines. Cet effet est principalement dû à l'activité de la pentoxifylline Des taux d'inhibition de la croissance compris entre 80 et 100 % sont obtenus au bout de 15 jours de traitement, quelles que soient les concentrations utilisées. L'ensemble de ces résultats montre que le revêtement conforme à l'invention peut être utilisé pour recouvrir des endoprothèse vasculaires dans le but de pourvoir à des prothèses bioactives empêchant ou diminuant les phénomènes de resténose.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Revêtement organique à base de polymère caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une couche de matrice de polymère(s) synthétique(s) présentant une épaisseur supérieure ou égale à 1 μm. ladite matrice renfermant une association : - de pentoxifylline. en une quantité supérieure ou égale à 0,036 nmole/mm2 de surface de ladite matrice et - d'au moins un agent anti-oxydant, en une quantité supérieure ou égale à 0.042 nmole/mm2 de surface de ladite matrice.
2. Revêtement selon la revendication 1. caractérisé par le fait que la pentoxifylline est présente au sein de la matrice polymère en une quantité comprise entre 18 et 54 nmoles/mm2 de surface de ladite matrice.
3. Revêtement selon la revendication 1 ou 2. caractérisé par le fait que l'agent anti-oxydant est présent au sein de la matrice polymère en une quantité comprise entre 32 et 53 nmoles/mm2 de surface de ladite matrice.
4. Revêtement selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il présente une épaisseur supérieure ou égale à 5 μm.
5. Revêtement selon la revendication 5. caractérisé par le fait qu'il présente une épaisseur comprise entre 10 μm et 100 μm inclusivement.
6. Revêtement selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le ou les agents anti-oxydants sont choisis parmi l'alpha-tocophérol et ses sels physiologiquement acceptables, les enzymes anti- oxydantes, l'acide ascorbique, le béta-carotène. les flavonoïdes. l'ubiquinone, le probucol. le glutathion. l'acide lipoïque et leurs mélanges.
7. Revêtement selon la revendication 6. caractérisé par le fait que le ou les agents antioxydants sont choisis parmi l'alpha-tocophérol et ses sels physiologiquement acceptables.
8. Revêtement selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le ou les agents antioxydants représentent de 5 à 60 % en poids par rapport au poids total du revêtement.
9. Revêtement selon la revendication 8. caractérisé par le fait que le ou les agents antioxydants représentent de 10 à 50 % en poids par rapport au poids total du revêtement.
10. Revêtement selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le ou les polymères synthétiques sont choisis parmi les polymères biodégradables ou non biodégradables et leurs mélanges.
1 1 . Revêtement selon la revendication 10. caractérisé par le fait que les polymères biodégradables sont choisis parmi les polyesters biodégradables, les poly(phosphazènes), les poly(éthers). les polysaccharides et leurs mélanges.
12. Revêtement selon la revendication 1 1. caractérisé par le fait que les polyesters biodégradables sont choisis parmi les polymères d'acide lactique (PLA) ou d'acide glycolique (PGA). les copolymères d'acide lactique et d'acide glycolique (PLGA). les polymères d'ε-caprolactone. d'alkyle cyanoacrylate. d'hydroxybutyrate. ou d'hydroxyvalérate. les poly anhydrides, les poly-orthoesters. les poly (imido carbonates) et les poly (β-acide malique).
13. Revêtement selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que les polymères non biodégradables sont choisis parmi les polyesters non biodégradables, les poly(amides). le polychlorure de vinyle. les polyéthylène vinyle acétates. les poh uréthanes. les polysiloxanes, la polyvinylpyrrolidone et leurs mélanges.
14. Revêtement selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend plusieurs couches de matrice polymères, identiques ou différentes entre elles du point de vue de la nature des polymères.
15. Revêtement selon la revendication 13. caractérisé par le fait qu'il comporte au moins deux couches de matrice polymère et dans lequel la couche externe (supérieure) est enrichie en agent anti-oxydant.
16. Revêtement selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins deux couches de matrice polymère, à savoir une couche externe et une couche interne, dans lequel la couche externe ne comprend ni pentoxifylline ni agent anti-oxydant, ces deux molécules étant par contre uniquement contenues dans la couche interne.
17. Utilisation d'au moins un revêtement tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes pour recouvrir des endoprothèses vasculaires.
1 8. Procédé de préparation d'une endoprothèse vasculaire caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une étape au cours de laquelle la surface de ladite endoprothèse est recouverte d'au moins une couche de revêtement tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16.
1 9. Procédé selon la revendication 1 8, caractérisé par le fait qu'il comprend une étape préliminaire à l'étape d'application du revêtement au cours de laquelle la surface de l'endoprothèse est d'abord recouverte d'une première couche de primaires d'adhésion.
20. Procédé selon la revendication 19. caractérisé par le fait que les primaires d'adhésion sont choisis panni les siloxanes, les chlorosilanes. les sels de diazonium. ainsi que les produits de réduction électrochimique des sels de diazonium et des monomères vinyliques.
21 . Procédé selon la revendication 19 ou 20. caractérisé par le fait que la couche de primaire d'adhésion est appliquée par électro-greffage.
22. Endoprothèse vasculaire caractérisée par le fait que sa surface est recouverte par au moins une couche de revêtement organique à base de polymère tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16.
23. Endoprothèse vasculaire caractérisée par le fait que sa surface est recouverte par au moins une couche de revêtement tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16 et qu'elle est susceptible d'être obtenue par le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 8 à 21 .
24. Endoprothèse vasculaire selon la revendication 22 ou 23, caractérisée par le fait qu'elle comporte un revêtement d'au moins une couche de matrices de polymère(s) synthétique(s) et une couche de primaires d'adhésion électro- greffée.
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