WO2005039751A1 - Microplaques en elastomere porteuses de ligands reactifs, ainsi que leur procede de preparation - Google Patents

Microplaques en elastomere porteuses de ligands reactifs, ainsi que leur procede de preparation Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the technical field of microplates, and more particularly to support for analysis cards, commonly called microplates.
  • Analysis cards allow the analysis of one or more different liquid samples, in which one seeks to identify one or more analytes, according to all the simple or complex analysis processes involving one or more different reagents depending on the nature chemical, physical or biological of the analyte (s) sought.
  • Analysis cards are not, in general, limited to a particular analyte, the only requirement is that the analyte is distributed in the sample to be analyzed in suspension or in solution.
  • the analysis process used can be carried out in homogeneous, heterogeneous or mixed form.
  • An analysis card can, for example, allow biological analysis, of one or more ligands, requiring for their detection and / or their quantification, the use of one or more anti-ligands.
  • the analysis cards present on the surface biological ligands having at least one recognition site allowing them to react with a target molecule of biological interest.
  • these analysis cards can be presented under different shapes, for example square, rectangular or circular. These cards consist of a support and possibly a cover.
  • the support also called microplate, is often provided with a plurality of wells and / or channels in which the different analysis processes are implemented.
  • the supports for analysis cards and microplates are generally produced by machining of materials chosen from glass, quartz, silicon, optionally coated with a layer of oxide or nitride or else in polymers of the polystyrene type or plastic materials of the polycarbonate or hydrocarbon polymer type such as polyolefins, having a hydrophobic surface.
  • Most often, to allow the functionalization of the support with the desired biological ligands it is necessary, beforehand, to physically or chemically modify the surface of the support. These modifications are very often cumbersome to implement and depend on the nature of the biological ligand which one wishes to graft.
  • one of the objectives of the present invention is to provide an easy, inexpensive, easily industrializable microplate manufacturing process, adapting to different types of reactive ligands.
  • Another objective of the invention is to provide a method allowing the microplate to be functionalized differently on certain localized sites.
  • the present invention relates to a process for the manufacture of an elastomer microplate having two large faces, one of which, called the active face, carries, on localized sites, at least at least one type of reactive ligand, and which comprises the following successive steps: a) depositing on an imprint intended to serve as a countermold for the large active face, according to localized sites, an aqueous solution containing: - an organic solvent whose temperature d boiling and viscosity are higher than those of water, - a salt, capable of co-crystallizing with the organic solvent during step b) later, and - micrometric particles on the surface or inside of which reactive ligands are immobilized; b) evaporating the aqueous solution, at a temperature T sufficient but lower than the boiling temperature of the organic solvent and the degradation temperature of the reactive ligands, so as to obtain on the localized sites a co-crystallization of the organic solvent and the salt around micrometric particles;
  • the present invention relates to a microplate having two large faces, one of which, called the active face, carries, on localized sites, reactive ligands accessible for subsequent reactions.
  • This microplate essentially consists of an elastomer which partially traps, at the level of the active face, micrometric particles on the surface or inside of which the reactive ligands are immobilized.
  • Fig. 2 illustrates different variants of microplates according to the invention, functionalized with different biological ligands.
  • Fig. 3 is a diagram illustrating steps (A), (B) and (C) of the manufacture of a microplate with a network of localized active fluid sites.
  • (D) is the micrograph of the network revealed by chemiluminescence.
  • Fig. 4 illustrates the performance of microplates according to the invention, functionalized with different biological ligands.
  • the microplates, produced according to the process of the invention can be of different shapes: square, rectangular, in the form of a disc. They have two large faces: one called inert which is generally planar and one called "active" on which are fixed reactive ligands accessible for subsequent reactions.
  • the first step of the process, called step a) consists in depositing on an imprint and on localized sites, an aqueous solution containing microbeads carrying reactive ligands. The impression will serve as a counter-mold for the face
  • the deposited solution contains an organic solvent and a salt intended to co-crystallize around the microbeads and thus protect them during the subsequent stages of the process.
  • the organic solvent must have a boiling point and a viscosity higher than those of water.
  • the organic solvent has a boiling temperature, at atmospheric pressure, greater than 150 ° C. Its viscosity is high and more particularly, its Brookfield viscosity measured at 20 ° C. will be greater than 100 cps (centipoise).
  • organic solvent suitable for the process of the invention mention may be made of the tween® series, in particular tween®20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), tween®80 (polyoxyethylene sorbitan monooleate), the series of triton® ( alkylarylpolyether alcohol), in particular triton®X100, polyethylene glycol diacids, glycerol, etc.
  • Glycerol is preferably used as organic solvent and sodium chloride ( ⁇ aCl) as salt.
  • ⁇ aCl sodium chloride
  • a glycerol / ⁇ aCl molar ratio of between 0.05 and 0.1 is used.
  • micrometric particles is meant particles whose average diameter is less than or equal to 1000 ⁇ m.
  • micrometric particles used have, for example, an average diameter of less than 500 ⁇ m, preferably between 1 and 150 ⁇ m.
  • the expression “micrometric particles” includes particles of nanometric size, in particular of diameter less than 1 ⁇ m.
  • These micrometric particles are advantageously made of a polymer, such as latex, polysaccharides, or any other material, such as glass for example.
  • the particles can be of any shape, the particles of spherical shape, called beads or microbeads are, however, preferred.
  • Reactive ligands are immobilized on the surface or inside these particles.
  • the reactive ligands are biological ligands.
  • biological ligand is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.
  • recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.
  • polynucleotide means a chain of at least 2 deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5- deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • This polynucleotide can also be modified at the level of the internucleotide bond, at the level of the skeleton. Each of these modifications can be taken in combination.
  • the polynucleotide can be an oligonucleotide, a natural nucleic acid or its fragment such as DNA, a ribosomal RNA, a messenger AKN, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.
  • polypeptide is meant a chain of at least two amino acids.
  • hapten designates non-immunogenic compounds, that is to say incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunization of animals in known conditions, in particular by immunization with a hapten-protein conjugate.
  • These compounds generally have a molecular mass of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and can be, for example, glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins or various drugs, nucleosides and nucleotides.
  • antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments.
  • antigen designates a compound capable of being recognized by an antibody whose synthesis it has induced by an immune response.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and both fibrous and globular glycoproteins, enzymes.
  • the term “immobilized” designates any type of interaction, such as electrostatic interactions, Van interactions Der Waals, hydrogen bonds, hydrophobic bonds, complexations, covalent chemical bonds, molecular reactions, physical adsorptions, allowing immobilization. Immobilization can therefore be carried out by any means.
  • the immobilization can be carried out so that the reactive ligands remain on the surface of the particle or else are therein, for example trapped in the pores while remaining accessible for subsequent reactions.
  • the reactive ligands can in particular be chemically grafted onto the particles, by conventional coupling, optionally preceded by an activation step.
  • the particles carry functional groups such as carboxylic, amino, thiol, aldehyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, epoxide or anhydride groups capable of grafting at least one reactive ligand.
  • functional groups such as carboxylic, amino, thiol, aldehyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, epoxide or anhydride groups capable of grafting at least one reactive ligand.
  • immobilization on the particles is most often carried out by electrostatic bonding, but can also be of a covalent nature.
  • Functionalization therefore takes place directly on the particles and not in the final stage on the microplate.
  • the deposition of the solution containing the particles is done simply by depositing drops on the desired localized sites.
  • the deposits are made, advantageously, at the level of the counterprints of the wells or microchannels. It is possible to deposit a solution containing different particles, for example, carrying different reactive ligands.
  • step b consists in depositing a solution containing particles carrying certain reactive ligands on certain localized sites and another solution containing other particles carrying other reactive ligands at other localized sites.
  • the second step of the process consists in heating the surface of the imprint on which the drops are deposited, in order to evaporate the phase aqueous and obtain the co-crystallization of the solvent and the salt.
  • the latter surround the particles, thus ensuring their protection, especially during the next step of the process.
  • the heating temperature must be sufficient to obtain this co-crystallization, but lower than the boiling point of the organic solvent and the degradation temperature of the reactive ligands, under the pressure conditions used.
  • this temperature will be of the order of 70-80 ° C, for heating carried out at atmospheric pressure.
  • a Tungsten lamp could, for example, be used for heating.
  • the third step, called step c), consists in molding the elastomer on the surface of the imprint functionalized with the particles.
  • An elastomer can be defined as a macromolecular material which, at room temperature, is able to recover its initial shape and size after being deformed by a stretching force. Its molding on a three-dimensional impression makes it possible to obtain high form factors.
  • elastomers of the polyurethane in particular marketed by A.SMA
  • polyether in particular marketed by NUTEC
  • polyester in particular marketed by Harvest
  • SU-8 photoresin or polydimethylsiloxane (PDMS) type is particularly preferred.
  • the polymerization is most often carried out by deposition on the imprint of a solution containing a prepolymer of the elastomer, in combination with a polymerization catalyst, followed by heating.
  • solutions include commercially available: one can, for example, cited in the case of PDMS, SYLGARD ® 184 marketed by Dow Corning.
  • this polymerization is carried out by heating at a temperature between 70 and 90 ° C and for a period between 20 and 30 min. Heating is preceded by degassing under reduced pressure.
  • the conditions are chosen by a person skilled in the art to obtain the polymerization of the chosen elastomer.
  • the elastomer, and in particular PDMS partially traps the particles.
  • the solvent and the salt dissolve in the PDMS.
  • the active face is a carrier, on localized sites, of ligands reagents accessible for subsequent reactions.
  • This microplate essentially consists of an elastomer which partially traps, at the level of the active face, micrometric particles on the surface of which the reactive ligands are immobilized.
  • the relief of the non-planar microplates according to the invention may include a fluid circuit based on elements such as channels or microchannels, valves or intersections of channels (T-shaped, shaped Y or cross-shaped), parts of the circuit which allow incubation (wells or meandering channels) or separation (lengths of channels equivalent to columns for example).
  • microplates constitute another aspect of the invention.
  • Their thickness preferably varies between 1 and 5 mm.
  • the micrometric particles emerge, for the most part, from the active face of the microplate at least 10% of their diameter.
  • the method according to the invention makes it possible to prepare compartmentalized microplates. Indeed, it is possible to deposit particles of different nature, that is to say carriers of different reactive ligands, on certain localized sites, depending on the intended application for the microplate.
  • the method according to the invention makes it possible to manufacture microplates capable of carrying out different analyzes on a sample.
  • the examples below illustrate the invention without, however, limiting it.
  • Anti-human IgG antibodies (specific for the ⁇ chain) labeled with biotin, d (T) 2 oligonucleotides labeled with biotin, glucose oxidase (Gox, quality I, EC 1.1.3.4, from Aspergillus niger), IgG human, luminol (3-aminophthalhydrazide), streptavidin labeled with peroxidase, Sepharose beads carrying human IgG, Sepharose beads bearing d (A) 2 were purchased from Sigma (France). DEAE (diethylaminoethyl) Sepharose Fast Flow and IDA (imidodiacetic acid) Sepharose Fast Flow were obtained from Pharmacia.
  • Example 1 Preparation of bioactive microbeads la) Microbeads carrying glucose oxidase (Gox) were prepared by interaction of IDA-Sepharose loaded with Ni with Gox modified with histidine. The grafting of histidine on Gox was carried out using a method described previously for modifying horseradish peroxidase (T NC Safack, CA Marquette, F. Pizzolato and LJ Blum, Biosens. & Bioelectron., 15 (2000) 125 ).
  • the Gox-His was then separated from the unreacted species by removing the salts on a column of Sephadex G25-M. Then, 500 ⁇ l of IDA-Sepharose microbeads were equilibrated with 30 mM Neronal buffer, 30 mM KC1, pH 8.5 and perfused with a 100 mM ⁇ iCl 2 solution. On the Ni-IDA-Sepharose column thus obtained, 5 mg of Gox-His freed from the salts as described above were deposited. The column was then washed with 10 ml of equilibration buffer and stored at 4 ° C. lb) Luminol was immobilized on DEAE-Sepharose microbeads by electrostatic interactions.
  • Example 2 Preparation of microplates 2a) Microplates were prepared by depositing, on localized sites forming a network, drops of 0.3 ⁇ l of deposition solutions. The deposition solutions were prepared by mixing 45 .mu.l of an aqueous solution composed of 2.5% glycerol, 0.05 M ⁇ aCl with 5 .mu.l of microbeads wet laying d (A) 2, 5 .mu.l of microbeads carrying human IgG or 5 ⁇ l of microbeads carrying glucose oxidase with the addition of 5 ⁇ l of microbeads carrying luminol. These different types of functionalization, as well as their mode of disclosure are illustrated in FIG. 2.
  • a biotinylated tracer is hybridized to the immobilized nucleic acid and is revealed with streptavidin labeled with peroxidase.
  • B) A Sepharose ball modified with a protein is included in the PDMS polymer. An antibody labeled with biotin reacts with the immobilized antigen and is revealed with streptavidin labeled with peroxidase.
  • C A ball of IDA-Sepharose carrying glucose oxidase (Gox) and a ball charged with luminol emerge from the surface of the PDMS.
  • FIG. 1 A), (B) and (C).
  • FIG. 1 A, (B) and (C).
  • an emergence of the microbeads appeared on the surface of the polymer in coincidence with the localized sites.
  • No residue of microbeads was observed on the PNC matrix after the removal of the PDMS layer, which shows the high efficiency of the transfer of microbeads at the PDMS interface.
  • These islands of microbeads are therefore capable of anchoring bioactive molecules at the interface, by means of Sepharose microbeads, as illustrated in FIG. 2.
  • microplates comprising channels, for a fluidic application, hereinafter called active fluid microplate, were prepared by depositing drops of 0.3 ⁇ l of different deposition solutions (see paragraph 2a)) on a PNC matrix composed of 12 channels (width: 2.5 mm, height: 1 mm, length: 15 mm), prepared by fixing different together PNC parts with epoxy adhesive, and following the same protocol as that presented in paragraph 2b). Separating the PDMS substrate and covering it with a flat PVC surface allows 12 active channels to be obtained. These different stages are illustrated in FIG. 3 (A), (B) and (C).
  • d (T) 22 -d (A) 22 was used as a model of the oligonucleotide hybridization method.
  • the low density microplates with active fluidics were tested according to the same general protocol. Briefly, the microplate or a particular channel was saturated for 30 min with a buffer solution A (Neronal (diethyl barbiturate) 30 mM, pH 8.5 containing 30 mM KC1, 0.2 M ⁇ aCl, 0, 1% Tween and 1% BSA), then incubated for 1 h with d (T) 22 biotinylated at a particular concentration in buffer A.
  • a buffer solution A Neonal (diethyl barbiturate) 30 mM, pH 8.5 containing 30 mM KC1, 0.2 M ⁇ aCl, 0, 1% Tween and 1% BSA
  • the microplate or a particular channel was then washed 10 min with buffer B (Neronal 30 mM, pH 8.5 containing 30 mM KC1, 0.2 M ⁇ aCl), then saturated with buffer A for 20 min and then incubated with streptavidin labeled with peroxidase at a concentration of 1 ⁇ g / ml for 30 min.
  • the microplate or a particular channel was then washed for 20 min with buffer B after which it was ready for measurement.
  • Example 4 Test for Microplates Functionalized with Proteins In a similar manner to that used for the microplate functionalized with nucleic acids, the microplates functionalized with proteins were saturated for 30 min with a solution of buffer A, then incubated for 1 h with a biotinylated anti-IgG antibody at a particular concentration in buffer A. The microplates were then washed for 10 min with buffer B, saturated with buffer A for 20 min, then incubated with streptavidin labeled with peroxidase at a concentration of 1 ⁇ g / ml for 30 min. The microplates were then washed for 20 min with buffer B after which they were ready for measurement.
  • Example 5 Measurement on the Microplates
  • the microplates with nucleic acid and proteins ready for the measurement were brought into contact with a buffered solution (Neronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8.5) containing in addition 200 ⁇ M of luminol, 500 ⁇ M of hydrogen peroxide and 20 ⁇ M of j ⁇ ra-iodophenol.
  • the microplates were introduced into the CCD (Intelligent Dark Box II, Fuji Film) light measurement system and the emitted light was integrated for 3 min.
  • CCD Intelligent Dark Box II, Fuji Film
  • the enzyme substrate microplate was used in a similar manner: a buffered solution (Neronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8.5) containing a particular concentration of glucose and 200 ⁇ M of triggering agent (1.3 -dichloro-
  • Example 6 Results 6a) Low density microplates
  • the network of localized low density sites was used to design microplates functionalized with proteins or oligonucleotides based on Sepharose microbeads carrying a human IgG or a homooligonucleotide d (A).
  • Fig. 1 (D) presents a micrograph of a network of 100 d (A) 22 points revealed by chemiluminescence, with a streptavidin-peroxidase conjugate after hybridization of the microplate with a d (T) 22 labeled with biotin. An 8% standard deviation of the chemiluminescent signal was found in the network. Similar results were obtained when the protein network, composed of immobilized human IgG, was incubated with anti-human IgG antibodies labeled with biotin.
  • microplate preparation allows to obtain a homogeneous network of the two most studied types of biomolecules.
  • a modification of the properties of the microbeads used could lead to immobilization of biomolecules on a larger scale.
  • an ohgosaccharide S.
  • the non-specific signal produced by the non-specific adsorption on the PDMS or Sepharose material was evaluated by preparing a microplate with unmodified microbeads (carrying no biological ligand) and by carrying out the test on a protein or a nucleic acid in the presence a maximum amount of labeled antibody or labeled nitric acid (100 ⁇ g and 7 pmol respectively). An extraordinarily weak non-specific signal, close to the instrument sensitivity limit, was observed. With the microplates according to the invention) ' , there is therefore a small standard deviation and a substantially non-existent background noise.
  • the nucleic acid microplate allows the quantitative detection of quantities of biotinylated oligonucleotides in the range of 58 pM-23 nM.
  • fluorescence systems D. Trau, TMH Lee, AIK Lao, R. Lenigk, I. Hsing, NY Ip, MC Caries and NJ Sucher, Anal. Chem., 74 (13) ( 2002) 3168 and JR Epstein, M. Lee and DR Walt, Anal. Chem., 74 (8) (2002) 18366) or based on radiolabelling (H. Salin, T. Vujasinovic, A. Mazurie, S. Maitrejean, C. Menini, J. Mallet and S.
  • the present method has a slightly lower sensitivity but a wider detection domain. .
  • the present detection limit of 58 pM corresponds to an amount of 10 10 molecules in a test volume of 300 ⁇ l.
  • a sample volume of 3 ⁇ l can be used, which reduces the number of nucleic acid molecules detected to 10 8 , which is close to the best results obtained in previous work.
  • the performance of a microplate functionalized with proteins to detect a free antigen in a competition format was evaluated.

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Abstract

La présente invention concerne des microplaques présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, de ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures, caractérisée en ce que la microplaque est essentiellement constituée d'un élastomère, de préférence de PDMS, qui emprisonne partiellement, au niveau de la face active, des particules micrométriques à la surface ou à l'intérieur desquelles les ligands réactifs sont immobilisés, ainsi que leur procédé de fabrication.

Description

MICROPLAQUES EN ELASTOMERE PORTEUSES DE LIGANDS
REACTIFS, AINSI QUE LEUR PROCEDE DE PREPARATION La présente invention concerne le domaine technique des microplaques, et plus particulièrement des supports de cartes d'analyse, nommées communément microplaques. Les cartes d'analyse permettent l'analyse d'un ou plusieurs échantillons liquides différents, dans lequel on cherche à identifier un ou plusieurs analytes, selon tous les processus simples ou complexes d'analyse mettant en jeu un ou plusieurs réactifs différents selon la nature chimique, physique ou biologique du ou des analytes recherchés. Les cartes d'analyse ne sont pas, en général, limitées à un analyte particulier, la seule condition requise est que l'analyte soit distribué dans l'échantillon à analyser en suspension ou en solution. En particulier, le processus d'analyse mis en oeuvre peut être effectué, sous forme homogène, hétérogène ou mixte. Une carte d'analyse peut, par exemple, permettre l'analyse biologique, d'un ou plusieurs ligands, nécessitant pour leur détection et/ou leur quantification, l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Aussi, dans ce cas, les cartes d'analyse présentent en surface des ligands biologiques possédant au moins un site de reconnaissance leur permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. Comme exemples d'application des techniques d'analyse, on peut citer les immuno essais, la détection et/ou la quantification d'acides nucléiques, les tests enzymatiques... En terme de réalisation, ces cartes d'analyse peuvent se présenter sous différentes formes, par exemple carrée, rectangulaire ou circulaire. Ces cartes sont constituées d'un support et éventuellement d'un couvercle. Le support, nommé également microplaque, est souvent muni d'une pluralité de puits et/ou canaux dans lesquels les différents processus d'analyse sont mis en œuvre. Les supports des cartes d'analyse et des microplaques sont en général réalisés par usinage de matériaux choisis parmi le verre, le quartz, le silicium, éventuellement revêtu d'une couche d'oxyde ou de nitrure ou bien dans des polymères du type polystyrène ou matériaux plastiques du type polycarbonate ou polymère hydrocarboné comme les polyoléfines, présentant une surface hydrophobe. Le plus souvent, pour permettre la fonctionnalisation du support avec les ligands biologiques souhaités, il est nécessaire, en préalable, de modifier physiquement ou chimiquement la surface du support. Ces modifications sont bien souvent lourdes à mettre en œuvre et dépendent de la nature du ligand biologique que l'on veut greffer. L'étape de greffage ou d'immobilisation, risquant d'altérer les ligands biologiques, il est souvent nécessaire de contrôler la « qualité » des ligands biologiques sur la microplaque fonctionnalisée finale. Dans ce contexte, un des objectifs de la présente invention est de fournir un procédé de fabrication de microplaques aisé, peu coûteux, facilement industrialisable, s'adaptant à différents types de ligands réactifs. Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé permettant de fonctionnaliser différemment la microplaque sur certains sites localisés. Pour atteindre les objectifs ci-dessus mentionnés, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'une microplaque en élastomère présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, d'au moins un type de ligands réactifs, et qui comprend les étapes successives suivantes : a) déposer sur une empreinte destinée à servir de contremoule pour la grande face active, selon des sites localisés, une solution aqueuse contenant : - un solvant organique dont la température d'ébullition et la viscosité sont supérieures à celles de l'eau, - un sel, apte à cocristalliser avec le solvant organique lors de l'étape b) ultérieure, et - des particules micrométriques en surface ou à l'intérieur desquelles des ligands réactifs sont immobilisés ; b) évaporer la solution aqueuse, à une température T suffisante mais inférieure à la température d'ébullition du solvant organique et à la température de dégradation des ligands réactifs, de façon à obtenir sur les sites localisés une cocristallisation du solvant organique et du sel autour des particules micrométriques ; c) polymériser l' élastomère sur l'empreinte servant de contremoule pour la microplaque, de façon à ce qu'il vienne recouvrir les sites localisés et épouser la forme de l'empreinte ; d) démouler la microplaque en élastomère obtenue, les particules micrométriques étant partiellement emprisonnées sur la face active de la microplaque, au niveau des sites localisés, au moins une partie des ligands réactifs étant accessibles pour une réaction ultérieure. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une microplaque présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, de ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures. Cette microplaque est essentiellement constituée d'un élastomère qui emprisonne partiellement, au niveau de la face active, des particules micrométriques à la surface ou à l'intérieur desquelles les ligands réactifs sont immobilisés. La description ci-après, en référence aux figures annexées, va permettre de mieux comprendre l'invention. La Fig. 1 est un schéma illustrant les étapes (A), (B) et (C) de la fabrication d'une microplaque avec un réseau faible densité de sites localisés. (D) est la micrographie du réseau révélé par chimiluminescence. La Fig. 2 illustre différentes variantes de microplaques selon l'invention, fonctionnalisées avec différents ligands biologiques. La Fig. 3 est un schéma illustrant les étapes (A), (B) et (C) de la fabrication d'une microplaque avec un réseau de sites localisés à fluidique active. (D) est la micrographie du réseau révélé par chimiluminescence. La Fig. 4 illustre les performances de microplaques selon l'invention, fonctionnalisées avec différents ligands biologiques. Les microplaques, fabriquées selon le procédé de l'invention, peuvent être de différentes formes : carrées, rectangulaires, sous la forme d'un disque. Elles présentent deux grandes faces : l'une dite inerte qui est généralement plane et une dite « active » sur laquelle sont fixés des ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures. La première étape du procédé, nommée étape a), consiste à déposer sur une empreinte et sur des sites localisés, une solution aqueuse contenant des microbilles porteuses de ligands réactifs. L'empreinte va servir de contre-moule pour la face
« active » : elle peut donc être plane ou non plane et comporter, notamment, l'empreinte négative de puits ou canaux. De préférence, cette empreinte sera en un matériau présentant une bonne mouillabilité, tel que le PNC. La solution déposée contient un solvant organique et un sel destinés à cocristalliser autour des microbilles et ainsi les protéger lors des étapes ultérieures du procédé. Le solvant organique doit présenter une température d'ébullition et une viscosité supérieures à celles de l'eau. De préférence, le solvant organique présente une température d'ébullition, à pression atmosphérique, supérieure à 150°C. Sa viscosité est élevée et plus particulièrement, sa viscosité Brookfield mesurée à 20°C sera supérieure à 100 cps (centipoises). En tant que solvant organique adapté au procédé de l'invention, on peut citer la série des tween®, en particulier le tween®20 (polyoxyéthylène sorbitan monolaurate), le tween®80 (polyoxyéthylène sorbitan monooléate), la série des triton® (alkylarylpolyether alcool), en particulier le triton®X100, les polyéthylèneglycol diacides, le glycérol ... On utilise, de préférence du glycérol en tant que solvant organique et du chlorure de sodium (ΝaCl) en tant que sel. Avantageusement, un rapport molaire glycérol/ΝaCl compris entre 0,05 et 0,1 est utilisé. Par particules micrométriques, on entend des particules dont le diamètre moyen est inférieur ou égal à 1000 μm. Les particules micrométriques utilisées ont, par exemple, un diamètre moyen inférieur à 500 μm, de préférence compris entre 1 et 150 μm. L'expression « particules micrométriques » englobe les particules de taille nanométrique, notamment de diamètre inférieur à 1 μm. Ces particules micrométriques sont, avantageusement, en un polymère, tel que le latex, les polyosides, ou dans tout autre matériau, comme le verre par exemple. Les particules peuvent être de n'importe quelle forme, les particules de forme sphérique, nommées billes ou microbilles sont, néanmoins, préférées. Des ligands réactifs sont immobilisés en surface ou à l'intérieur de ces particules. Certes, de façon préférentielle, les ligands réactifs sont des ligands biologiques. Néanmoins, on peut envisager d'utiliser d'autres ligands du type pesticides, métaux lourds, polymères, récepteurs synthétiques... Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple, on peut citer les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes et les cellules vivantes actives. Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique, au niveau du squelette. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un AKN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnus par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et les nucléotides. Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires, les enzymes. Au sens de l'invention, le terme « immobilisé » désigne tout type d'interactions, telles que des interactions électrostatiques, des interactions de Van Der Waals, des liaisons hydrogène, des liaisons hydrophobes, des complexations, des liaisons chimiques covalentes, des réactions moléculaires, des adsorptions physiques, permettant l'immobilisation. L'immobilisation peut donc être effectuée par tout moyen. L'immobilisation peut être réalisée de façon à ce que les ligands réactifs restent en surface de la particule ou bien soient à l'intérieur de celles-ci, par exemple emprisonnés dans les pores tout en restant accessibles pour des réactions ultérieures. Les ligands réactifs peuvent en particulier être greffés chimiquement sur les particules, par couplage classique, éventuellement précédé d'une étape d'activation. Dans ce cas, avant couplage, les particules sont porteuses de groupements fonctionnels tels que des groupements carboxylique, aminé, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, époxyde ou anhydride à même de greffer au moins un ligand réactif. Dans le cas des enzymes, l'immobilisation sur les particules est le plus souvent réalisée par liaison électrostatique, mais peut être également de nature covalente. On pourra notamment se référer à Biosens. & Bioelectron. (2000), 15, 125-133 ; Anal. Lett. (2000), 33(9), 1779-1796 et Sensors and actuators B (2003), 90(1-3), 112-117 qui décrivent des exemples de telles particules fonctionnalisées. La fonctionnalisation a donc lieu directement sur les particules et non en étape finale sur la microplaque. De ce fait, il est possible d'effectuer en amont une chimie variée et de mieux maîtriser la nature et la qualité des ligands réactifs présents en surface de la microplaque. Le dépôt de la solution contenant les particules se fait simplement en déposant des gouttes sur les sites localisés désirés. En général, lorsque l'empreinte est non plane, les dépôts sont réalisés, avantageusement, au niveau des contre-empreintes des puits ou microcanaux. Il est possible de déposer une solution contenant différentes particules, par exemple, porteuses de différents ligands réactifs. Une autre variante consiste également, à déposer une solution contenant des particules porteuses de certains ligands réactifs, sur certains sites localisés et une autre solution contenant d'autres particules porteuses d'autres ligands réactifs sur d'autres sites localisés. La seconde étape du procédé, nommée étape b), consiste à chauffer la surface de l'empreinte sur laquelle sont déposées les gouttes, afin d'évaporer la phase aqueuse et obtenir la cocristallisation du solvant et du sel. Ces derniers viennent entourer les particules, assurant ainsi leur protection, notamment lors de l'étape suivante du procédé. La température de chauffage doit être suffisante pour obtenir cette cocristallisation, mais inférieure au point d'ébullition du solvant organique et à la température de dégradation des ligands réactifs, dans les conditions de pression utilisées. En général, cette température sera de l'ordre de 70-80°C, pour un chauffage effectuée à pression atmosphérique. Une lampe à Tungsten pourra, par exemple, être utilisée pour le chauffage. La troisième étape, nommée étape c), consiste à mouler l'élastomère à la surface de l'empreinte fonctionnalisée avec les particules. Un élastomère peut être défini comme un matériel macromoléculaire qui, à température ambiante, est capable de recouvrir sa forme et sa taille initiale après avoir été déformé par une force d'étirement. Son moulage sur une empreinte en trois dimensions permet d'obtenir des facteurs de forme élevés. On peut citer les élastomères du type polyuréthane (notamment commercialisé par A.SMA), polyether (notamment commercialisé par NUTEC), polyester (notamment commercialisé par Harvest), SU-8 photorésine ou polydiméthylsiloxane (PDMS). Le PDMS est particulièrement préféré. La polymérisation est, le plus souvent, réalisée par dépôt sur l'empreinte d'une solution contenant un prépolymère de l'élastomère, en combinaison avec un catalyseur de polymérisation, suivi d'un chauffage. De telles solutions sont notamment disponibles dans le commerce : on peut, par exemple, citer, dans le cas du PDMS, SYLGARD® 184 commercialisée par DOW CORNING. Dans la cas du PDMS, cette polymérisation est réalisée par chauffage à une température comprise entre 70 et 90 °C et pendant une durée comprise entre 20 et 30 mn. Le chauffage est précédé d'un dégazage sous pression réduite. Les conditions sont choisies par l'homme du métier pour obtenir la polymérisation de l'élastomère choisi. En polymérisant, l'élastomère, et notamment le PDMS, vient emprisonner partiellement les particules. Le solvant et le sel viennent se solubiliser dans le PDMS. Une fois la polymérisation achevée, on refroidit pour avoir durcissement de l'élatomère et autoriser le démoulage. Ainsi, après démoulage, on obtient une microplaque présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, de ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures. Cette microplaque est essentiellement constituée d'élastomère qui emprisonne partiellement, au niveau de la face active, des particules micrométriques à la surface desquelles les ligands réactifs sont immobilisés. D'une manière générale, le relief des microplaques non- planes selon l'invention peut comprendre un circuit fluidique à base d'éléments tels que des canaux ou microcanaux, des vannes ou des intersections de canaux (en forme de T, en forme de Y ou en forme de croix), des parties de circuit qui autorisent l'incubation (des puits ou des canaux serpentant) ou la séparation (des longueurs de canaux équivalents à des colonnes par exemple). Ces microplaques constituent un autre aspect de l'invention. Leur épaisseur varie, de préférence, entre 1 et 5 mm. De façon avantageuse, les particules micrométriques émergent, pour majorité, de la face active de la microplaque d'au moins 10 % de leur diamètre. Le procédé selon l'invention permet de préparer des microplaques compartimentées. En effet, il est possible de déposer des particules de nature différente, c'est à dire porteuses de ligands réactifs différents, sur certains sites localisés, en fonction de l'application visée pour la microplaque. Dans le domaine du diagnostic, le procédé selon l'invention permet de fabriquer des microplaques capables d'effecteur différentes analyses sur un échantillon. Les exemples ci-après illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. Les anticorps anti-IgG humaine (spécifiques de chaîne γ) marqués par la biotine, les oligonucléotides d(T) 2 marqués par la biotine, la glucose oxydase (Gox, qualité I, EC 1.1.3.4, de Aspergillus niger), les IgG humaines, le luminol (3- aminophthalhydrazide), la streptavidine marquée par la peroxydase, les billes de Sepharose portant une IgG humaine, les billes de Sepharose portant d(A)2 ont été achetés chez Sigma (France). DEAE (diéthylaminoéthyl) Sepharose Fast Flow et IDA (acide imidodiacétique) Sepharose Fast Flow ont été obtenus auprès de Pharmacia. Le précurseur de PDMS et l'agent de durcissement (Sylgard®184) ont été fournis par Dow Corning. Tous les tampons et solutions aqueuses ont été préparés avec de l'eau déminéralisée distillée. Exemple 1 : Préparation de microbilles bioactives la) Des microbilles portant de la glucose oxydase (Gox) ont été préparées par interaction de IDA-Sepharose chargé avec Ni avec Gox modifiée avec l'histidine. Le greffage d'histidine sur Gox a été réalisé au moyen d'un procédé décrit antérieurement pour modifier la peroxydase de raifort (T N.C. Safack, C.A. Marquette, F. Pizzolato et L.J. Blum, Biosens. & Bioelectron., 15 (2000) 125). En bref, 5 mg de Gox dissous dans 200 μl d'eau distillée et 80 μl d'une solution 0,1 M de ΝaIO4 ont été ajoutés et mélangés sous agitation pendant 20 min. Puis, 40 μl d'une solution 0,2 M d'histidine dans du tampon carbonate 0,1 M, pH 9, et 480 μl de tampon carbonate 0,1 M, pH 9, ont été ajoutés à la glucose oxydase activée et incubés 2 h sous agitation. A ce moment, la réaction était complète et 20 μl de solution 0,1 M de NaBH dans l'eau fraîchement préparée ont été ajoutés et mélangés pendant 15 min pour stabiliser la liaison de l'histidine à la Gox activée. La Gox-His a ensuite été séparée des espèces qui n'avaient pas réagi par élimination des sels sur une colonne de Sephadex G25-M. Ensuite, 500 μl de microbilles de IDA-Sepharose ont été équilibrés avec du tampon Neronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5 et perfusés avec une solution de ΝiCl2 100 mM. Sur la colonne de Ni-IDA-Sepharose ainsi obtenue, 5 mg de Gox-His débarrassée des sels comme décrit ci-dessus ont été déposés. La colonne a ensuite été lavée avec 10 ml de tampon de mise en équilibre et conservée à 4°C. lb) Du luminol a été immobilisé sur des microbilles de DEAE-Sepharose par interactions électrostatiques. 500 μl de DEAE-Sepharose en suspension dans l'éthanol ont été introduits dans une colonne en plastique, équilibrés avec 10 ml de tampon Neronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5 et perfusés avec 1 ml de solution de luminol 10 mM dans du tampon de mise en équilibre. La colonne a ensuite été lavée avec 25 ml de tampon de mise en équilibre et stockée à 4°C.
Exemple 2 : Préparation de microplaques 2a) Des microplaques ont été préparées en déposant, sur des sites localisés formant un réseau, des gouttes de 0,3 μ.1 de solutions de dépôt. Les solutions de dépôt ont été préparées en mélangeant 45 μl d'une solution aqueuse composée de 2,5 % de glycérol, ΝaCl 0,05 M avec 5 μl de microbilles humides portant d(A)2 , 5 μl de microbilles portant une IgG humaine ou 5 μl de microbilles portant de la glucose oxydase avec addition de 5 μl de microbilles portant du luminol. Ces différents types de fonctionnalisation, ainsi que leur mode de révélation sont illustrés Fig. 2. (A) Une bille de Sepharose portant un oligonucléotide émerge de la surface du PDMS. Un traceur biotinylé est hybride à l'acide nucléique immobilisé et est révélé avec de la streptavidine marquée à la peroxydase. (B) Une bille de Sepharose modifiée avec une protéine est incluse dans le polymère PDMS. Un anticorps marqué à la biotine réagit avec l'antigène immobilisé et est révélé avec de la streptavidine marquée à la peroxydase. (C) Une bille de IDA-Sepharose portant de la glucose oxydase (Gox) et une bille chargée de luminol émergent de la surface du PDMS. La Gox oxyde le glucose présent dans le milieu réactionnel, en produisant H2O qui, pour sa part, réagit avec le luminol immobilisé pour produire de la lumière. 2b) Pour former un réseau à basse densité, des gouttes de 0,3 μl ont été déposées sur un substrat en PNC plat tous les 3 mm et séchées sous une lampe à tungstène pendant 30 min. La présence de glycérol dans la solution de dépôt permet d'obtenir, sur les sites localisés, des dépôts de microbilles secs homogènes et uniformes. Les dépôts de microbilles secs ont ensuite été transférés à l'interface de PDMS en versant un mélange de précurseur et d'agent de durcissement sur le substrat en PNC et en durcissant pendant 90 min sous une lampe à tungstène. La préparation des microplaques a ensuite été achevée en séparant le polymère PDMS. Ces différentes étapes sont illustrées Fig. 1 (A), (B) et (C). Après le retrait du PDMS solidifié, une émergence des microbilles est apparue sur la surface du polymère en coïncidence avec les sites localisés. Aucun résidu de microbilles n'a été observé sur la matrice de PNC après le retrait de la couche de PDMS, ce qui montre la grande efficacité du transfert des microbilles à l'interface du PDMS. Ces îlots de microbilles sont donc capables d'ancrer des molécules bioactives à l'interface, par le biais des microbilles de Sepharose, comme illustré Fig. 2. 2c) D'une manière similaire, des microplaques comportant des canaux, pour une application en fluidique, nommées dans la suite, microplaque à fluidique active ont été préparées en déposant des gouttes de 0,3 μl de différentes solutions de dépôt (voir paragraphe 2a)) sur une matrice en PNC composée de 12 canaux (largeur : 2,5 mm, hauteur : 1 mm, longueur : 15 mm), préparée en fixant ensemble différentes pièces en PNC avec un adhésif époxyde, et en suivant le même protocole que celui présenté au paragraphe 2b). La séparation du substrat de PDMS et son recouvrement avec une surface de PVC plane permet d'obtenir 12 canaux actifs. Ces différentes étapes sont illustrées Fig. 3 (A), (B) et (C).
Exemple 3 : Test pour microplaques fonctionnalisées avec des acides nucléiques Un couple d(T)22-d(A)22 a été utilisé comme modèle de procédé d'hybridation d'oligonucléotides. Les microplaques à basse densité et à fluidique active ont été testées selon le même protocole général. En bref, la microplaque ou un canal particulier a été saturée pendant 30 min avec une solution de tampon A (Neronal (barbiturate de diéthyle) 30 mM, pH 8,5 contenant 30 mM de KC1, 0,2 M de ΝaCl, 0,1 % de Tween et 1 % de BSA), puis incubée pendant 1 h avec d(T)22 biotinylé à une concentration particulière dans le tampon A. La microplaque ou un canal particulier a ensuite été lavée 10 min avec du tampon B (Neronal 30 mM, pH 8,5 contenant 30 mM de KC1, 0,2 M de ΝaCl), puis saturée de tampon A pendant 20 min et ensuite incubée avec de la streptavidine marquée à la peroxydase à une concentration de 1 μg/ml pendant 30 min. La microplaque ou un canal particulier a ensuite été lavée pendant 20 min avec du tampon B après quoi elle était prête pour la mesure.
Exemple 4 : Test pour microplaques fonctionnalisées avec des protéines D'une manière similaire à celle utilisée pour la microplaque fonctionnalisée avec des acides nucléiques, les microplaques fonctionnalisées avec des protéines ont été saturées pendant 30 min par une solution de tampon A, puis incubées pendant 1 h avec un anticorps anti-IgG biotinylé à une concentration particulière dans du tampon A. Les microplaques ont ensuite été lavées pendant 10 min avec du tampon B, saturées de tampon A pendant 20 min, puis incubées avec de la streptavidine marquée à la peroxydase à une concentration de 1 μg/ml pendant 30 min. Les microplaques ont ensuite été lavées pendant 20 min avec du tampon B après quoi elles étaient prêtes pour la mesure. Exemple 5 : Mesure sur les microplaques Les microplaques à acide nucléique et à protéines prêtes pour la mesure ont été mises en contact avec une solution tamponnée (Neronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5) contenant en plus 200 μM de luminol, 500 μM de peroxyde d'hydrogène et 20 μM de jσαra-iodophénol. A ce moment, les microplaques ont été introduites dans le système de mesure de la lumière CCD (Intelligent Dark Box II, Fuji Film) et la lumière émise a été intégrée pendant 3 min. La microplaque à substrat d'enzyme a été utilisée d'une manière similaire : une solution tamponnée (Neronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5) contenant une concentration particulière de glucose et 200 μM d'agent déclencheur (1,3-dichloro-
5,5-diméthylhydantoïne) a été injectée dans chaque canal juste avant l'introduction de la microplaque dans le système de mesure, et le signal a été intégré pendant 3 min. Les images de microplaques obtenues ont été quantifiées avec un programme d'analyses d'images FUJIFILM (Image Gauge 3.12).
Exemple 6 : Résultats 6a) Microplaques à basse densité Le réseau de sites localisés à basse densité a été utilisé pour concevoir des microplaques fonctionnalisées avec des protéines ou des oligonucléotides basées sur des microbilles de Sepharose portant une IgG humaine ou un homooligonucléotide d(A) . La Fig. 1(D) présente une micrographie d'un réseau de 100 points de d(A)22 révélés par chimioluminescence, avec un conjugué streptavidine-peroxydase après une hybridation de la microplaque avec un d(T)22 marqué à la biotine. Un écart type de 8 % du signal chimiluminescent a été trouvé dans le réseau. Des résultats similaires ont été obtenus quand le réseau de protéines, composé d'IgG humaine immobilisée, a été incubé avec des anticorps anti-IgG humaine marqués à la biotine.
Il est alors apparu que le présent processus de préparation de microplaques pennet d'obtenir un réseau homogène des deux types de biomolécules les plus étudiées. De plus, une modification des propriétés des microbilles utilisées a pu conduire à une immobilisation de biomolécules à plus grande échelle. Ainsi, un ohgosaccharide (S.
Fukui, T. Feizi, C. Galustian, A.M. Lawson and W. Chai, Nature Biotech., 20 (2002)
1011) ou un substrat de inase (B.T. Houseman, J.H. Huh, S.J. Kron and M. Mrksich, Nature Biotech., 20 (2002) 270) a pu être immobilisé aisément et utilisé comme outils analytique. Le signal non spécifique produit par l'adsorption non spécifique sur le matériau PDMS ou Sepharose a été évalué en préparant une microplaque avec des microbilles non modifiées (ne portant aucun ligand biologique) et en réalisant le test sur une protéine ou un acide nucléique en présence d'une quantité maximale d'anticorps marqué ou d'acide nitrique marqué (100 μg et 7 pmol respectivement). Un signal non spécifique extraordinairement faible, proche de la limite de sensibilité de l'instrumentation, a été observé. Avec les microplaques selon l'invention)', on observe donc un faible écart type et un bruit de fond sensiblement inexistant.
6b) Mesure quantitative avec microplaques à fluidique active Une première étude a été réalisée pour évaluer l'aptitude de la microplaque à détecter quantitativement un acide nucléique. Des échantillons ayant différentes concentrations de d(T) 2 marqué à la biotine ont été injectés dans chaque canal particulier, hybrides et révélés. La Fig. 4(A) présente l'évolution du signal chimiluminescent obtenu en fonction de la quantité d'oligonucléotide introduite dans chaque canal. Les mesures sur la microplaques ont été effectuées pendant 3 min et l'image a été quantifiée avec un programme de quantification FUJIFILM. B0 représente l'intensité lumineuse obtenue en l'absence d'IgG libre et B représente l'intensité lumineuse obtenue en présence d'une concentration particulière d'IgG. En fait, la microplaque à acide nucléique permet la détection quantitative de quantités d'oligonucléotides biotinylés dans le domaine de 58 pM-23 nM. Par rapport aux limites de détection obtenues avec les systèmes à fluorescence (D. Trau, T.M.H. Lee, A.I.K. Lao, R. Lenigk, I. Hsing, N.Y. Ip, M.C. Caries and N.J. Sucher, Anal. Chem., 74(13) (2002) 3168 et J.R. Epstein, M. Lee and D.R. Walt, Anal. Chem., 74(8) (2002) 18366) ou basés sur un radiomarquage (H. Salin, T. Vujasinovic, A. Mazurie, S. Maitrejean, C. Menini, J. Mallet and S. Dumas, Nucl. Acids Res., 30 (2002) el7), impliquant généralement des agencements de microréseaux très complexes, le présent procédé présente une sensibilité légèrement plus basse mais un domaine de détection plus étendu. La présente limite de détection de 58 pM correspond à une quantité de 1O10 molécules dans un volume de test de 300 μl. Néanmoins, quand la microplaque est utilisée dans un format de réseau à basse densité, un volume d'échantillon de 3 μl peut être utilisé, ce qui abaisse à 108 le nombre de molécules d'acide nucléique détectées, ce qui est proche des meilleurs résultats obtenus dans des travaux antérieurs. Dans une étude ultérieure, les performances d'une microplaque fonctionnalisée avec des protéines pour détecter un antigène libre dans un format de compétition ont été évaluées. Des échantillons contenant une IgG humaine à différentes concentrations ont été incubés dans un canal particulier, en même temps que des anticorps anti-IgG marqués à la biotine. La lecture chimilumiscente de la biopuce conduit à l'obtention de la courbe de compétition, qui est une linéarisation par la fonction "logit", représentée sur la Fig. 4(B). lo&t ≈ lnB/βo-B) où B est le signal obtenu à une concentration d'antigène libre fixée et B0 est le signal obtenu en l'absence d'antigène libre. La microplaque fonctionnalisée avec des protéines permet la détection d'un antigène libre avec une limite de détection de 12 ng/ml et un domaine de détection qui s'étend sur quatre décades au moins. Cette quantité correspond à 1,5 x 109 molécules dans le format de fluidique active et a pu être abaissée, comme ci-dessus, à 1,5 x 10 molécules dans le format basse densité. Pour démontrer toutes les potentialités des microplaques à fluidique active, un système à base d'enzyme dans lequel des microbilles chélatantes portant de la glucose oxydase (S. Fukui, T. Feizi, C. Galustian, A.M. Lawson and W. Chai, Nature Biotech., 20 (2002) 1011) étaient co-piégées à l'interface du PDMS avec des microbilles chargées de luminol, a été conçu. Dans la suite des réactions, la glucose oxydase catalyse l'oxydation du glucose et la production de peroxyde d'hydrogène qui réagit en présence d'un agent déclencheur (Z. Rao, X. Zhang and W.R.G. Baeyens, Talanta, 57 (2002) 993) avec le luminol immobilisé pour produire de la lumière. Il a été montré antérieurement que cette configuration, avec un système d'immobilisation différent, permet de réaliser un réseau biocapteur sensible sans problème de contamination entre les différents points. Des échantillons contenant du glucose à différentes concentrations ont été injectés dans la microplaque et l'intensité lumineuse produite a été mesurée simultanément sur toute la microplaque. La courbe d'étalonnage obtenue est présentée sur la Fig. 4(C). Là encore, les performances de la microplaque de l'invention sont apparues compétitives, compte tenu de la sensibilité et du domaine linéaire présentés dans différents articles concernant la détection chimiluminescente d'un substrat d'enzyme (T N.C. safack, C.A. Marquette, F. Pizzolato and L.J. Blum, Biosens. & Bioelectron., 15 (2000) 125 ; L. J. Blum, Bio- Chemi-Luminescent Sensors, World Scientific, Singapore, 1997 ; I. Moser, G. Jobst and G. A. Urban, Biosens. & Bioelectr., 17 (2002) 297 et C.A. Marquette and L.J. Blum, Anal. Chi . Acta, 381 (1999) 1). De plus, dans une étude antérieure, il a été démontré qu'il était possible d'utiliser six enzymes oxydases différentes en même temps dans les mêmes conditions expérimentales, ce qui permet d'obtenir un biocapteur à six paramètres. La présente invention est également applicable pour la conception d'une biopuce à substrat d'enzyme à base de PDMS pour la détection de paramètre multiples.

Claims

REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication d'une microplaque en élastomère présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, d'au moins un type de ligands réactifs, comprenant les étapes successives suivantes : a) déposer sur une empreinte destinée à servir de contremoule pour la grande face active, selon des sites localisés, une solution aqueuse contenant : - un solvant organique dont la température d'ébullition et la viscosité sont supérieures à celles de l'eau, - un sel, apte à cocristalliser avec le solvant organique lors de l'étape b) ultérieure, et - des particules micrométriques en surface ou à l'intérieur desquelles des ligands réactifs sont immobilisés ; b) évaporer la solution aqueuse, à une température T suffisante mais inférieure à la température d'ébullition du solvant organique et à la température de dégradation des ligands réactifs, de façon à obtenir sur les sites localisés une cocristallisation du solvant organique et du sel autour des particules micrométriques ; c) polymériser l'élastomère sur l'empreinte servant de contremoule pour la microplaque, de façon à ce qu'il vienne recouvrir les sites localisés et épouser la forme de l'empreinte ; d) démouler la microplaque d'élastomère obtenue, les particules micrométriques étant partiellement emprisonnées sur la face active de la microplaque, au niveau des sites localisés, au moins une partie des ligands réactifs étant accessibles pour une réaction ultérieure. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'élastomère est du polydiméthylsiloxane (PDMS). 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le solvant utilisé présente une température d'ébullition supérieure à 150°C et une viscosité Brookfield à 20°C supérieure à 100 cps. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le glycérol est utilisé en tant que solvant organique et le chlorure de sodium (NaCl) en tant que sel, de préférence dans un rapport molaire glycérol/NaCl compris entre 0,05 et 0,1. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les particules micrométriques utilisées ont un diamètre moyen compris entre 1 et 150 μm. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les particules micrométriques utilisées sont en un polymère, de préférence en latex. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'empreinte utilisée est plane. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'empreinte utilisée est non plane, de façon à donner à la surface réactive de la microplaque un relief, par exemple formé de puits et/ou canaux. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'au moins un site localisé est porteur de ligands réactifs différents de ceux présents sur les autres sites. 10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les ligands réactifs sont des ligands biologiques. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les ligands biologiques utilisés sont choisis parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptenes et les cellules vivantes actives. 12 - Microplaque présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, de ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures, caractérisée en ce que la microplaque est essentiellement constituée d'un élastomère qui emprisonne partiellement, au niveau de la face active, des particules micrométriques à la surface ou à l'intérieur desquelles les ligands réactifs sont immobilisés. 13 - Microplaque selon la revendication 12, caractérisée en ce que, caractérisé en ce que l'élastomère est du polydiméthylsiloxane (PDMS). 14 - Microplaque selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que, pour majorité, les particules micrométriques émergent, de la face active, d'au moins 10 % de leur diamètre. 15 - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que les particules micrométriques ont un diamètre moyen compris entre 1 et 150 μm. 16 - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisée en ce que la face active présente un relief fonné, notamment, de puits et/ou canaux. 17 - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisée en ce qu'au moins un site localisé est porteur de ligands réactifs différents de ceux présents sur les autres sites. 18 - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisée en ce que les ligands réactifs sont des ligands biologiques. 19 - Microplaque selon la revendication 18, caractérisée en ce que les ligands biologiques sont choisis parmi les polynucleotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptenes ou les cellules vivantes actives.
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