WO2005038025A1 - Methode d'extraction d'acides nucleiques - Google Patents

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WO2005038025A1
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WO
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lysis
nucleic acids
microorganisms
dna
tracks
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PCT/FR2004/002613
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English (en)
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Pierre-Alain Maron
David Lejon
Karine Bizet
Esmeralda Carvalho
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Bertin Technologies
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Priority to US11/399,420 priority patent/US20070015177A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method of extracting nucleic acids from microorganisms, and its use in a method for analyzing a microbial population of a given environment, in particular a population of microorganisms taken from the air.
  • the invention relates to an extraction method comprising the successive implementation of the following three lysis steps in any order: i. chemical lysis of the microorganisms comprising bringing the microorganisms into contact with a lysis solution containing a detergent;
  • thermal shock lysis comprising incubating the extract at a temperature below 0 ° C, immediately followed by incubating the extract at a temperature of at least 95 ° C, preferably about 100 ° C;
  • climate change or ecosystem changes associated with urban planning, agriculture or industry are generally correlated with changes in the composition of microbial flora in the environment. It is therefore possible, in theory, to detect abnormal modifications of the ecosystem by analyzing the evolution of the composition of a microbial population of a given environment over time. Such monitoring would also be useful for detecting the abnormal presence of pathogens in the environment, for example linked to their dissemination in the air by biological weapons.
  • the RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Amplification) technique based on the analysis of the length polymorphism of the 16S / 23S intergenic region of ribosomal RNA, makes it possible to characterize populations of microorganisms and to compare them with one another.
  • RISA Ribosomal Intergenic Spacer Amplification
  • the amplification technique itself must, to be sufficiently sensitive and quantitative, be implemented from a sufficiently large quantity of genetic material extracted from the sample.
  • This quantity of genetic material extracted from the sample obviously depends on the one hand on the quantity of microorganisms taken, and on the other hand on the yield of the method of extraction of nucleic acids used and on the level of purification obtained.
  • the method of extraction of nucleic acids is decisive for obtaining reliable results from a method of analysis of a microbial population based on the analysis of sequences of nucleic acids extracted from microorganisms in a sample.
  • nucleic acids from microorganisms are known from the state of the art. These methods generally include a lysis step, consisting in breaking the wall and the bacterial or fungal membrane, a step of precipitating membrane and protein debris, the nucleic acid remaining in solution, then a step of precipitating the nucleic acids in the alcohol, if necessary preceded by a step of purification of the nucleic acids in the presence of phenol and chloroform.
  • lysis step consisting in breaking the wall and the bacterial or fungal membrane
  • a step of precipitating membrane and protein debris the nucleic acid remaining in solution
  • a step of precipitating the nucleic acids in the alcohol if necessary preceded by a step of purification of the nucleic acids in the presence of phenol and chloroform.
  • the first step in nucleic acid extraction methods is to lyse the membranes of microorganisms.
  • the extraction protocols known in the state of the art use, as an alternative, three lysis modes: chemical lysis using a detergent, mechanical lysis by agitation in the presence of beads or thermal shock lysis by repeat freezing and incubation at very high temperature.
  • a first subject of the invention thus relates to a method of extracting nucleic acids from microorganisms, comprising:
  • nucleic acids e. if necessary, re-solution of the nucleic acids in an appropriate buffer.
  • the microorganisms are suspended in a solution containing the appropriate lysis buffer for the implementation of one of the three lysis steps, chemical, mechanical or thermal.
  • extract will be used to mean the solution containing the nucleic acids to be extracted obtained after any of the steps of the extraction method, from the suspension of the microorganisms before their lysis until the final extract obtained.
  • nucleic acids indifferently, unless otherwise specified, deoxyribonucleic acids (DNA), single strand or double strand, or ribonucleic acids (RNA), including in particular, messenger RNAs, ribosomal RNAs and transfer RNAs .
  • the chemical lysis step comprises bringing the microorganisms into contact in the presence of a solution containing a sufficient amount of detergent determined by a person skilled in the art for get optimal performance.
  • detergents that can be used for chemical lysis are CTAB or sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • SDS will be used as detergent, for example at a concentration of between 1 and 4%, conventionally around 2%.
  • the thermal shock lysis step comprises incubating the extract at a temperature below 0 ° C, immediately followed by incubating the extract at a temperature of at least 95 ° C, preferably about 100 ° C.
  • the incubation temperatures will be chosen so that the temperature of the extract reaches a value below 0 ° C and then a value above 95 ° C. They are, for example, between - 90 ° C and 0 ° C for the low point, preferably between - 80 ° C and - 60 ° C, and between 95 ° C and 110 ° C for the high point, preferably between 95 ° C and 100 ° C.
  • Thermal shock means that the temperature of the extract goes from a temperature below 0 ° C to a temperature above 95 ° C in a time less than 1 minute, preferably less than 30 seconds, and better in a shorter time at 1 second.
  • the extract is incubated at a temperature below 0 ° C until freezing and then incubated at a temperature above 95 ° C, preferably about 100 ° C for at least 2 minutes, preferably 3 minutes.
  • liquid nitrogen or any other inert inert gas can be used at a temperature much below 0 ° C.
  • lysis by thermal shock comprises the incubation of the extract at a temperature of approximately -70 ° C., for example in liquid nitrogen, immediately followed by incubation extract at a temperature of at least 95 ° C, preferably about 100 ° C, for example in boiling water.
  • the thermal shock described above can be repeated as many times as necessary, preferably at least three times, in order to obtain optimum efficiency.
  • the lysis step may be preceded if necessary by an enzymatic lysis in order to degrade the proteins of the microbial walls, for example by incubating the microorganisms in suspension in a solution containing proteases at an appropriate temperature.
  • proteases include proteinase K, conventionally used in nucleic acid extraction protocols.
  • mechanical lysis comprises stirring the extract in the presence of beads.
  • the stirring speed, the size of the beads and the quantity of beads used are determined by a person skilled in the art so as to obtain embrittlement of the optimal membranes.
  • the beads are in particular small diameter glass beads conventionally used in protocols for extracting nucleic acids by mechanical lysis, and in particular protocols for extracting nucleic acids from microorganisms comprising a rigid wall.
  • the extract can be stirred using a grinder, in the presence of beads with a diameter of between 50 ⁇ m and 200 ⁇ m, preferably between 90 and 150 ⁇ m, for example around 100 ⁇ m. Balls of different diameters can be combined. In particular, beads with a diameter of between 50 ⁇ m and 200 ⁇ m, up to 500 mg, for example between 400 mg and 600 mg, will be used for a volume of extract of between 500 and 1500 ⁇ l, in combination with a few larger diameter balls, for example from 1 to 10 balls of diameter between 1 and 3 mm, for example 4 balls of 2 mm in diameter.
  • the three lysis stages defined in (a) are carried out in the following order: (i) chemical lysis, (ii) thermal shock lysis and (iii) mechanical lysis.
  • the supernatant containing the nucleic acids in solution is then recovered and the nucleic acids are precipitated according to the methods conventionally used, for example in the presence of a salt such as sodium acetate and alcohol, in particular ethanol or isopropanol. If necessary, the precipitation step may be followed by a purification step, for example using a mixture of phenol and chloroform.
  • a salt such as sodium acetate and alcohol, in particular ethanol or isopropanol.
  • the precipitation step may be followed by a purification step, for example using a mixture of phenol and chloroform.
  • nucleic acids After precipitation, the nucleic acids are redissolved in an appropriate buffer.
  • the nucleic acid extraction method is suitable for the extraction of nucleic acids from any type of prokaryotic or lower eukaryotic microbial population, including bacteria, protozoa, single-cell algae, archaebacteria or fungi.
  • the method of the invention allows the extraction of nucleic acids from microbial organisms which are mainly bacteria and / or fungi.
  • These microbial organisms can in particular comprise spores of bacteria and / or fungi.
  • the lysis steps are preceded by a step of re-culturing the spores under suitable conditions to allow germination to be initiated, for example by incubating the spores in a rich culture medium at an appropriate temperature, conventionally between 15 minutes and 3 hours at the optimum temperature for culturing the vegetative forms of the microorganisms, for example between 15 and 45 minutes at 37 ° C.
  • Microorganisms can be taken from any type of natural environment, including soil, water or air.
  • the method is suitable for taking samples of microorganisms from the air.
  • the method is also suitable for extracting nucleic acids from a limited number of microorganisms, for example between 10 3 and 10 8 CFU / ml, preferably between 10 6 and 10 7 CFU / ml.
  • said method is particularly suitable for its use in a method for analyzing the microbial population.
  • a second subject of the invention therefore relates to a method for analyzing the microbial population of an environment, comprising:
  • the microbial population to be analyzed is taken from the air.
  • the microbial population sampled is a bacterial and / or fungal population.
  • any method of analysis of the extracted nucleic acids can then be used.
  • the method chosen must make it possible to characterize the structure and the complexity of the bacterial or fungal community contained in the sample.
  • the analysis of the nucleic acids extracted consists in searching for specific genetic markers making it possible to characterize the microbial population, all of the markers constituting the genetic imprint.
  • a genetic fingerprint is for example obtained by the amplification of nucleic acid fragments specific to the genome of microbiological species, in particular by the amplification of ribosomal RNA fragments, preferably from the 16S-23S intergenic space of the microorganisms analyzed. , according to the RISA technique described for example in Ranjard et al., 2001, Applied and Environmental Microbiology, Oct 2001, pp 4479-4487.
  • Figure 1 includes photos of agarose gel in which nucleic acid extracts have been migrated.
  • A DNA agarose gel extracted from the Ralstonia metallidurans CH34 strain. Tracks 1-4 standard range (500 ng, 250 ng, 124 ng, 62.5 ng respectively); tracks 5-7: chemical lysis; tracks 8-10: thermal lysis; tracks 11-13: mechanical lysis 1600 rpm, tracks 14-16: mechanical lysis 3000 rpm, tracks 17-19: BIO 101 kit.
  • FIG. 1 E: DNA agarose gel extracted from the Rhodococcus strain. Deposit 20 ⁇ l. Tracks 1-4: standard range; tracks 5-7: chemical lysis; tracks 8-10: thermal lysis; tracks 11-13: mechanical lysis 1600 rpm, tracks 14-16: mechanical lysis 3000 rpm, Tracks 17-19: BIO 101 kit.
  • Figure 2 Figure 2A is a histogram illustrating the quantities of DNA obtained for each strain with the different protocols: chemical, thermal, mechanical 1600 rpm, mechanical 3000 rpm and Kit BIO101.
  • FIG. 2B is a histogram illustrating the quantities of DNA obtained for each protocol with the different strains. Bars represent standard deviations.
  • Figure 3A is a photo of an agarose gel onto which the DNA extracted has been migrated by a method combining two different lysis modes:
  • FIG. 3B is a photo of an agarose gel onto which the DNA extracted has been migrated by a method combining the three different lysis modes: Tracks 1-4: standard range Tracks 5-7: Agrobacterium Tracks 8-10 -.Pseudomonas Tracks 11-13: Rhodococcus Tracks 14-16: Spores
  • Figure 4 is an agarose gel onto which the DNA extracted from Bacillus globigiil spores has been migrated.
  • Figure 5 is a histogram illustrating the quantities of DNA obtained for each strain with the different protocols combining two or three lysis modes.
  • Figure 6 is an agarose gel onto which was migrated DNA extracted from Bacillus globigii spores at a concentration of 10 9 spores / ml, 30 ⁇ l deposits.
  • Track M size marker; tracks 1-4: standard range; tracks 5-7: 3 deposits of 30 ⁇ l.
  • Figure 7A is an agarose gel onto which was migrated DNA extracted from spores of Bacillus globigii strain speywood. Deposits: 10 ⁇ l.
  • Tracks M Size marker; Tracks 1-3, standard range, tracks 4-6, without re-culture, tracks 7-9, + 0.5h in TS at 37 ° C, tracks 10-12, + 1h in TS at 37 ° C; tracks 13-15, +1, 5h in TS at 37 ° C, tracks 16-19, + 2h in TS at 37 ° C.
  • FIG. 7B is an agarose gel on which a 16S DNA of spores of Bacillus globigii speywood strain has been migrated amplified with Taq polymerase Qbiogene. Deposits: 10 ⁇ l.
  • Tracks M Size marker; Tracks 1-3, + 0.5h in TS at 37 ° C, tracks 4-6, without re-culture; lane 7, negative control; lane 8 positive control.
  • Figure 8A is an agarose gel onto which has been migrated DNA extracted from communities reconstituted at different concentrations, with the extraction method of the invention combining the three lysis modes, deposits of 10 ⁇ l.
  • Track M size marker; tracks 1-4: standard range; tracks 5-8: 6.10 8 CFU / mL; tracks 9-12: 6.10 7 CFU / mL, tracks 13-16: 6.10 6 CFU / mL.
  • FIG. 8B is an agarose gel onto which a DNA extracted from communities reconstituted at different concentrations has been migrated, with the extraction method of the invention combining the three lysis modes, deposits of 20 ⁇ l.
  • Track M size marker; tracks 1-4: standard range; tracks 5-8: 6.10 5 CFU / mL; tracks 9-12: 6.10 4 CFU / mL, tracks 13-16: 6.10 3 CFU / mL, tracks 17-20: 6.10 2 CFU / mL.
  • Figure 9 is an agarose gel on which was migrated DNA extracted from spores and vegetative forms of Bacillus globigii (strain CIP 7718 and strain speywood) with the extraction method of the invention combining the three lysis modes, 20 ⁇ l deposits.
  • Track M size marker; tracks 1-3: standard range; tracks 4-6: vegetative forms of the strain CIP7718; tracks 7-9: sporulated forms of the strain CIP7718, tracks 10-12: vegetative forms of the strain speywood; tracks 13-15: sporulated forms of the speywood strain.
  • the bacterial strains used are representative of the major bacterial types: • Alpha-proteobacterium: Agrobacterium tumefaciens C58 • Beta-proteobacterium: Ralstonia metallidurans CH34 • Gama-proteobacterium: Pseudomonas fluorescens C7R12 • Gram + à Bas GC: Bacillus polymyxa CFBP1954 Phytopathogens) • Gram + at High GC: Rhodococcus rhodochrous ATCC 13898 • Spores of Bacillus globigii strain CIP 7718: 5 ml of suspension in water + TWEEN 20 at 0.01%, at a concentration of 10 9 spores.
  • Agrobacterium tumefaciens C58 1.60.10 9 +/- 0.49.10 8
  • the DNAs of 5 bacterial strains as well as of spores are extracted using the extraction protocols described in example B. For each r
  • the protocols used are based on the main principles of DNA extraction commonly used in molecular ecology. It is (i) a mechanical lysis based on the action of glass beads weakening the bacterial membranes, (ii) a chemical lysis based on the action of a detergent, sodium dodecyl-sulfate (SDS) to weaken the membranes and finally (iii) thermal lysis based on the alternation of hot and cold shocks to burst the cells.
  • SDS sodium dodecyl-sulfate
  • the mechanical lysis protocol includes the following first steps:
  • the thermal lysis protocol includes the following first steps:
  • the commercial FASTDNA ® KIT DNA extraction kit (referenced in the text by KIT BIO101) is a combination of mechanical lysis and chemical lysis.
  • the protocol developed by the Qbiogene supplier is described in the technical note supplied with the KIT.
  • the DNA extracted from each bacterial strain is quantified on a gel by comparison with a standard range of calf thymus DNA. 10 ⁇ L of extracted DNA are deposited on a 1% agarose gel. A standard range of calf thymus DNA corresponding to 500 ng DNA / 1 O ⁇ L, 250 ng DNA / 1 O ⁇ L, 125 ng DNA / 1 O ⁇ L, 62.5 ng DNA / 1 O ⁇ L is also deposited. After migration and staining with ethidium bromide, the gel is treated with an image analyzer making it possible to calculate a standard line and ultimately to determine the quantities of DNA extracted for each strain.
  • FIGS. 1A to 1 E represent the deposits of 10 ⁇ L of DNA for Agrobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Ralstonia and 20 ⁇ L for Rhodococcus respectively.
  • the gel corresponding to the spores was not presented because no DNA was visually detectable.
  • the amounts of DNA, brought back to 10 8 CFU.ml ⁇ 1 are reported in the following table 2 and presented according to the strains in FIG. 2A and according to the protocols in FIG. 2B.
  • the amounts of DNA are included between 0.9 and 425 ng of DNA / 10 8 CFU.
  • Table 2 Quantity of DNA for 10 CFUs extracted from each strain with the different protocols:
  • FIG. 3A corresponds to the deposits of 10 ⁇ L of DNA for Agrobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Ralstonia and 20 ⁇ L for Rhodococcus and the spores. However, no DNA is observed for the spores, as indicated on tracks 35 to 40.
  • the amounts given in FIG. 5 are between 37.4 and 332.4 ng of DNA / 10 8 CFU. We observe a synergistic effect on the Agrobacterium and Rhodococcus strains, without showing significant differences between the 2 different combinations.
  • FIG. 3B represents the 10 ⁇ L deposits of DNA for Pseudomonas, Rhodococcus Agrobacterium and the spores.
  • the results of the quantities of DNA are presented in FIG. 5.
  • the quantities of DNA are respectively doubled and tripled, compared to the synergy of two lysis modes, for Agrobacterium and Rhodococcus.
  • this synergy makes it possible to extract DNA from spores ( ⁇ . Globigii strain CIP 7718) up to 30 ng DNA / 10 8 spores.
  • the deposit of 30 ⁇ L (FIG. 4) of the DNA extracted from the spores makes it possible to visualize DNA of high molecular weight.
  • Table 3 Estimated DNA extraction yield for each strain relative to the size of the genome.
  • the DNA of "reconstituted" communities was extracted at different concentrations according to the extraction method of the invention combining the three lysis modes.
  • the quantity of DNA obtained for 6.10 8 is approximately 3000 ng with a yield of 82% for an average genome size of 5.5 Mb.
  • the quantity of DNA decreases approximately by a factor of 10 to reach 400 ng.
  • the extracted DNA is not visible.
  • a theoretical calculation results in a concentration of 4 ng of DNA per 10 ⁇ L deposited at a cell density of 6.10 6 CFU.ml "1 .
  • Such an amount is not visible on agarose gel and staining with ethidium bromide, which explains these results.
  • the extraction method combining the three lysis modes thus makes it possible to extract very satisfactorily the DNAs of reconstituted communities with relatively high yields.
  • the 2 hour incubation step at 37 ° C should not modify the composition and density of the community bacterial samples. This step could therefore prove to be advantageous with a view to efficient extraction of DNA from the spores contained in the air samples.
  • the nucleic acid extracts obtained according to the extraction method of the invention are analyzed by carrying out a genetic fingerprint of the population by RISA technique (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) as described in Ranjard et ai., 2001, Applied and Environmental Microbiology, pp 4479-4487, or T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism) (Moeseneder et al., 2001, Journal of microbiological methods, Vol 44 (2) pp 159-172; Saka et al., Soil Science and Plant Nutrition, Vol 47 (4) 773-778; Urakawa et al., 2000, MEPS, 220: 47-57; Marsh, 1999, Current opinion in Microbiology, Vol 2 (3) 323-327.
  • RISA technique Ribosomal Intergenic Spacer Analysis
  • T-RFLP Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism

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Abstract

La présente invention porte sur une méthode d'extraction d'acides nucléiques de micro-organismes, et son utilisation dans un procédé d'analyse d'une population microbienne d'un environnement donné, notamment d'une population de micro-organismes prélevés dans l'air. En particulier, l'invention porte sur une méthode d'extraction comprenant la mise en œuvre successive des trois étapes de lyse suivantes dans un ordre quelconque : une lyse chimique des micro-organismes comprenant la mise au contact des micro-organismes avec une solution de lyse contenant un détergent ; une lyse par choc thermique comprenant l'incubation de l'extrait à une température inférieure à 0° C, suivie immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95° C, de préférence environ 100° C ; et ; une lyse mécanique comprenant l'agitation de l'extrait en présence de billes.

Description

METHODE D' EXTRACTION D ' ACIDES NUCLEIQUES
La présente invention porte sur une méthode d'extraction d'acides nucléiques de micro-organismes, et son utilisation dans un procédé d'analyse d'une population microbienne d'un environnement donné, notamment d'une population de micro-organismes prélevés dans l'air. En particulier, l'invention porte sur une méthode d'extraction comprenant la mise en œuvre successive des trois étapes de lyse suivantes dans un ordre quelconque : i. une lyse chimique des micro-organismes comprenant la mise au contact des micro-organismes avec une solution de lyse contenant un détergent ;
ii. une lyse par choc thermique comprenant l'incubation de l'extrait à une température inférieure à 0°C, suivie immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95°C, de préférence environ 100°C ; et,
iii. une lyse mécanique comprenant l'agitation de l'extrait en présence de billes.
Les changements climatiques ou les changements de l'écosystème associés à l'urbanisme, à l'agriculture ou à l'industrie sont généralement corrélés à des modifications de la composition de la flore microbienne dans l'environnement. Il est donc possible, en théorie, de détecter des modifications anormales de l'écosystème par l'analyse de l'évolution de la composition d'une population microbienne d'un environnement donné au cours du temps. Un tel suivi serait également utile pour détecter la présence anormale d'agents pathogènes dans l'environnement, par exemple liés à leur dissémination dans l'air par des armes biologiques.
Cependant, l'impossibilité de cultiver la plupart des micro-organismes prélevées dans l'environnement tels que le sol ou l'air constitue un obstacle majeur pour l'analyse de l'écologie microbienne et de sa diversité.
L'utilisation de techniques de biologie moléculaire permet de surmonter cet obstacle, par l'analyse directe de séquences d'acides nucléiques spécifiques d'espèces de micro-organismes contenus dans l'échantillon analysé, en s'affranchissant des étapes de culture.
En particulier, la technique RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Amplification), fondée sur l'analyse du polymorphisme de longueur de la région intergénique 16S/23S de l'ARN ribosomique, permet de caractériser des populations de micro-organismes et de les comparer entre elles (Ranjard et al., oct 2001 , Applied and Environmental Microbiology, pp 4479-4487, Ranjard et al., 1999, FEMS Microbiology Ecology, 0168-6496, Ranjard et al., 2000, Applied and Environmental Microbiology, vol. 66, pp 5334-5339 ; Ranjard et al., 2000, Microbial Ecology, vol. 39 (4), pp 263- 272, Selenska-Pobell et al., 2001 , Antonie van Leeuwenhoek, vol. 79 (2) pp 149-161).
Ces techniques fondées sur l'analyse de séquences génomiques utilisent en général, l'amplification PCR des acides nucléiques, afin d'obtenir une quantité suffisante de matériel génétique analysable.
Or, la technique d'amplification elle-même doit, pour être suffisamment sensible et quantitative, être mise en oeuvre à partir d'une quantité de matériel génétique extrait de l'échantillon suffisamment importante. Cette quantité de matériel génétique extraite de l'échantillon dépend évidemment d'une part de la quantité de micro-organismes prélevés, et d'autre part du rendement de la méthode d'extraction d'acides nucléiques utilisée et du niveau de purification obtenu. Ainsi, il apparaît que la méthode d'extraction d'acides nucléiques est déterminante pour l'obtention de résultats fiables à partir d'un procédé d'analyse d'une population microbienne fondé sur l'analyse de séquences d'acides nucléiques extraits des micro-organismes d'un échantillon.
De nombreuses méthodes d'extraction d'acides nucléiques de microorganismes sont connues de l'état de la technique. Ces méthodes comprennent généralement une étape de lyse, consistant à rompre la paroi et la membrane bactérienne ou fongique, une étape de précipitation des débris membranaires et protéiques, l'acide nucléique restant en solution, puis une étape de précipitation des acides nucléiques dans l'alcool, le cas échéant précédée d'une étape de purification des acides nucléiques en présence de phénol et de chloroforme. Ces techniques d'extraction sont bien connues de l'homme du métier et sont décrites en particulier dans Sambrook et al, 2001 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd Ed., Coid Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). On citera en particulier les protocoles optimisés pour l'extraction d'ADN de micro-organismes prélevés dans l'environnement, tels que ceux décrits par Yeates et al., 1998 (Biological procédures, 199S, Vol. 1 , No. 1 , pages 40- 47).
Cependant, ces techniques d'extraction s'avèrent encore insuffisantes en terme de rendement ou de qualité pour leurs utilisations dans certains procédés d'analyse microbienne.
En effet, si certains milieux environnementaux tels que l'eau ou le sol sont riches en micro-organismes, il n'en va pas de même pour l'analyse d'autres environnements tels que l'air, qui requiert un échantillonnage à partir de volumes très importants en particulier en raison de rendements d'extraction insuffisants. Des rendements d'extraction élevés sont en outre requis lorsque les micro-organismes prélevés sont sous la forme de spores, naturellement plus résistante aux étapes de lyse.
Il existe par conséquent un réel besoin de développer de nouvelles méthodes d'extraction d'acides nucléiques à rendement élevé, qui puissent être utilisables en routine dans des procédés d'analyse de population microbienne de l'environnement.
La première étape des méthodes d'extractions d'acides nucléiques consiste à lyser les membranes des micro-organismes. Les protocoles d'extractions connus dans l'état de la technique utilisent en alternative, trois modes de lyse : une lyse chimique à l'aide d'un détergent, une lyse mécanique par agitation en présence de billes ou une lyse par choc thermique par répétition de congélation et d'incubation à très haute température.
Alors que les étapes de lyse par choc thermique ou de lyse mécanique sont généralement considérées comme des alternatives à la lyse chimique, il a maintenant été constaté, de manière surprenante, que la mise en œuvre successive des trois étapes de lyse, chimique, mécanique et par choc thermique augmentait considérablement le rendement d'extraction, notamment en comparaison avec une combinaison de seulement deux des trois étapes de lyse.
Un premier objet de l'invention porte ainsi sur une méthode d'extraction d'acides nucléiques de micro-organismes, comprenant :
a. la mise en œuvre successive des trois étapes de lyse suivantes dans un ordre quelconque : i. une lyse chimique des micro-organismes comprenant la mise au contact des micro-organismes avec une solution de lyse contenant un détergent ; ii. une lyse par choc thermique comprenant l'incubation de l'extrait à une température inférieure à 0°C, suivie immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95°C, de préférence environ 100°C ; et, iii. une lyse mécanique comprenant l'agitation de l'extrait en présence de billes.
b. la précipitation des débris membranaires et protéiques,
c. la récupération du surnageant contenant les acides nucléiques,
d. la précipitation des acides nucléiques et l'élimination du surnageant,
e. le cas échéant, la remise en solution des acides nucléiques dans un tampon approprié.
Selon la méthode de l'invention, les micro-organismes sont mis en suspension dans une solution contenant le tampon de lyse approprié pour la mise en œuvre de l'une des trois étapes de lyse, chimique, mécanique ou thermique.
Dans le texte qui suit, on appellera « extrait », la solution contenant les acides nucléiques à extraire obtenue après l'une quelconque des étapes de la méthode d'extraction, de la mise en suspension des micro-organismes avant leur lyse jusqu'à l'extrait final obtenu.
On appellera « acides nucléiques », indifféremment, sauf précision spécifique, les acides désoxyribonucléiques (ADN), simple brin ou double brin, ou les acides ribonucléiques (ARN), incluant en particulier, les ARN messagers, les ARN ribosomaux et les ARN de transferts.
Au sens de l'invention, l'étape de lyse chimique comprend la mise au contact des micro-organismes en présence d'une solution contenant une quantité suffisante de détergent déterminée par l'homme du métier pour obtenir un rendement optimal. Des exemples de détergents utilisables pour la lyse chimique sont le CTAB ou le sodium dodecyl sulfate (SDS). Dans un mode de mise en œuvre spécifique, on utilisera comme détergent, le SDS, par exemple à une concentration comprise entre 1 et 4%, classiquement environ 2%.
L'étape de lyse par choc thermique comprend l'incubation de l'extrait à une température inférieure à 0°C, suivi immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95°C, de préférence environ 100°C.
Les températures d'incubation seront choisies de sorte que la température de l'extrait atteigne une valeur inférieure à 0°C puis une valeur supérieure à 95°C. Elles sont par exemple comprises entre - 90°C et 0°C pour le point bas, de préférence compris entre - 80°C et - 60°C, et compris entre 95°C et 110°C pour le point haut, de préférence entre 95°C et 100°C. Le choc thermique signifie que la température de l'extrait passe d'une température inférieure à 0°C à une température supérieure à 95°C dans un temps inférieur à 1 minute, de préférence inférieur à 30 secondes, et mieux dans un temps inférieur à 1 seconde.
Classiquement, pour un volume d'extrait inférieur à 1 millilitre, l'extrait est incubé à une température inférieure à 0°C jusqu'à congélation puis incubé à une température supérieure à 95°C, de préférence environ 100°C pendant au moins 2 minutes, de préférence 3 minutes.
Pour congeler rapidement l'extrait, on pourra utiliser l'azote liquide ou tout autre gaz inerte liquide à une température très inférieure à 0°C.
Aussi, dans un mode de mise en œuvre particulier, la lyse par choc thermique comprend l'incubation de l'extrait à une température d'environ - 70°C, par exemple dans de l'azote liquide, suivie immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95°C, de préférence environ 100°C, par exemple dans de l'eau bouillante. Le choc thermique décrit ci-dessus peut être répété autant de fois que nécessaire, de préférence au moins trois fois, afin d'obtenir un rendement optimal.
L'étape de lyse pourra être précédée le cas échéant d'une lyse enzymatique afin de dégrader les protéines des parois microbiennes, par exemple en incubant les micro-organismes en suspension dans une solution contenant des proteases à une température appropriée. A titre d'exemples de protéase, on citera les protéinase K, classiquement utilisées dans les protocoles d'extraction d'acides nucléiques.
Selon l'invention, la lyse mécanique comprend l'agitation de l'extrait en présence de billes. La vitesse d'agitation, la taille des billes et la quantité de billes utilisées sont déterminées par l'homme du métier de façon à obtenir un fragilisation des membranes optimales. Les billes sont notamment des billes de verres de faible diamètre classiquement utilisées dans les protocoles d'extractions d'acides nucléiques par lyse mécanique, et notamment les protocoles d'extractions d'acides nucléiques de micro- organismes comportant une paroi rigide.
On peut en particulier procéder à l'agitation de l'extrait au moyen de broyeur, en présence de billes d'un diamètre compris entre 50 μm et 200 μm, de préférence compris entre 90 et 150 μm, par exemple environ 100 μm. Des billes de diamètres différents peuvent être combinées. En particulier, on utilisera des billes d'un diamètre compris entre 50 μm et 200 μm, à hauteur de 500 mg, par exemple entre 400 mg et 600 mg, pour un volume d'extrait compris entre 500 et 1500 μl, en combinaison avec quelques billes de plus gros diamètre, par exemple de 1 à 10 billes de diamètre compris entre 1 et 3 mm, par exemple 4 billes de 2 mm de diamètre. De préférence, les trois étapes de lyse définies en (a) sont réalisées dans l'ordre suivant : (i) la lyse chimique, (ii) la lyse par choc thermique et (iii) la lyse mécanique.
Une fois le lysat obtenu, il est possible de procéder à nouveau à une dégradation enzymatique des protéines contenues dans le lysat, par exemple au moyen de proteases telles que les protéinase K.
Le surnageant contenant les acides nucléiques en solution est ensuite récupéré et les acides nucléiques sont précipités selon les méthodes classiquement utilisées, par exemple en présence d'un sel tel que l'acétate de sodium et d'alcool, notamment l'éthanol ou l'isopropanol. Le cas échéant, l'étape de précipitation pourra être suivie d'une étape de purification, par exemple en utilisant un mélange de phénol et de chloroforme.
Après précipitation, les acides nucléiques sont remis en solution dans un tampon approprié.
La méthode d'extraction des acides nucléiques est appropriée pour l'extraction d'acides nucléiques de tout type de population microbienne procaryote ou eucaryote inférieur, incluant, les bactéries, les protozoaires, les algues unicellulaires, les archaebactéries ou les champignons.
Plus particulièrement, la méthode de l'invention permet l'extraction d'acides nucléiques d'organismes microbiens qui sont principalement des bactéries et/ou des champignons.
Ces organismes microbiens peuvent comprendre notamment des spores de bactéries et/ou de champignons.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, les étapes de lyse sont précédées d'une étape de remise en culture des spores dans des conditions appropriées pour permettre d'initier la germination, par exemple en incubant les spores dans un milieu de culture riche à une température appropriée, classiquement entre 15 minutes et 3 heures à la température optimale de culture des formes végétatives des micro-organismes, par exemple entre 15 et 45 minutes à 37°C.
Les micro-organismes peuvent être prélevés de tout type d'environnement naturel, incluant le sol, l'eau ou l'air. En particulier, la méthode est appropriée pour des prélèvements de micro-organismes contenus dans l'air.
La méthode est également appropriée pour extraire des acides nucléiques à partir d'un nombre limité de micro-organismes, par exemple compris entre 103 et 108 CFU/ml, de préférence compris entre 106 et 107 CFU/ml.
Compte tenu des rendements importants obtenus par la méthode d'extraction d'acides nucléiques selon l'invention, ladite méthode est particulièrement appropriée pour son utilisation dans un procédé d'analyse de la population microbienne.
Un deuxième objet de l'invention porte donc sur un procédé d'analyse de la population microbienne d'un environnement, comprenant :
a. le prélèvement dans l'environnement d'un échantillon de la population microbienne, par exemple sous forme d'aérosol, et la remise en suspension du prélèvement dans une solution,
b. l'extraction des acides nucléiques de lé population microbienne remise en suspension selon la méthode d'extraction de l'invention définie précédemment.
c. l'analyse des acides nucléiques extraits. Dans un mode de mise en œuvre spécifique du procédé, la population microbienne à analyser est prélevée dans l'air. En particulier, la population microbienne prélevée est une population bactérienne et/ou fongique.
Toute méthode d'analyse des acides nucléiques extraits peut être par la suite utilisée. De préférence, la méthode choisie doit permettre de caractériser la structure et la complexité de la communauté bactérienne ou fongique contenue dans le prélèvement.
Dans un exemple de mise en œuvre du procédé, l'analyse des acides nucléiques extraits consiste à rechercher des marqueurs génétiques spécifiques permettant de caractériser la population microbienne, l'ensemble des marqueurs constituant l'empreinte génétique.
Une empreinte génétique est par exemple obtenue par l'amplification de fragments d'acides nucléiques spécifiques du génome d'espèces microbiologiques, notamment par l'amplification de fragments d'ARN ribosomiques, de préférence de l'espace intergénique 16S-23S des microorganismes analysés, selon la technique RISA décrite par exemple dans Ranjard et al., 2001 , Applied and Environmental Microbiology, oct 2001 , pp 4479-4487.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer certains modes de mise en œuvre spécifiques des méthodes de l'invention, sans toutefois en limiter la portée.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : La figure 1 comprend des photos de gel d'agarose dans lesquels ont été migres des extraits d'acides nucléiques.
A : Gel d'agarose de l'ADN extrait de la souche Ralstonia metallidurans CH34. Pistes 1-4 gamme étalon (500 ng, 250 ng, 124 ng, 62.5 ng respectivement); pistes 5-7 : lyse chimique ; pistes 8-10 : lyse thermique ; pistes 11-13 : lyse mécanique 1600 rpm, pistes 14-16 : lyse mécanique 3000 rpm, pistes 17-19 : kit BIO 101.
B : Gel d'agarose de l'ADN extrait de la souche Bacillus polymixa CFBP1954. Pistes 1-4 gamme étalon ; pistes 5-7 : lyse chimique ; pistes 8- 10 : lyse thermique ; pistes 11-13 : lyse mécanique 160O rpm, pistes 14- 16 : lyse mécanique 3000 rpm, Pistes 17-19, kit BIO 101.
C : Gel d'agarose de l'ADN extrait de la souche Pseudomonas fluorescens C7R12. Pistes 1-4 : gamme étalon ; pistes 5-7 : lyse chimique ; piste 8-10 : lyse thermique ; pistes 11-13 : lyse mécanique 1600 rprn, pistes 14-16 : lyse mécanique 3000 rpm, pistes 17-19 : kit BIO 101.
D : Gel d'agarose de l'ADN extrait de la souche Agrobacterium tumefaciens C58. Pistes 1-4 : gamme étalon ; pistes 5-7 : kit BIO 101 ; pistes 8-10 : lyse chimique ; pistes 11-13 : lyse thermique , pistes 14-16 : lyse mécanique 1600 rpm, pistes 17-19 : lyse mécanique 3000 rpm.
E : Gel d'agarose de l'ADN extrait de la souche Rhodococcus. Dépôt 20 μl. Pistes 1-4 : gamme étalon ; pistes 5-7 : lyse chimique ; pistes 8-10 : lyse thermique ; pistes 11-13 : lyse mécanique 1600 rpm, pistes 14-16 : lyse mécanique 3000 rpm, Pistes 17-19 : kit BIO 101. Figure 2 : La figure 2A est un histogramme illustrant les quantités d'ADN obtenues pour chaque souche avec les différents protocoles : chimique, thermique, mécanique 1600 rpm, mécanique 3000 rpm et Kit BIO101.
La figure 2B est un histogramme illustrant les quantités d'ADN obtenues pour chaque protocole avec les différentes souches. Les barres représentent les écarts-types.
Agrobacterium, Ralstonia, Bacillus, Pseudomonas et Rhodococcus
Figure 3 : La figure 3A est une photo d'un gel d'agarose sur lequel a été migré l'ADN extrait par une méthode combinant deux modes de lyse différents :
Pistes M : Marqueur de taille
Pistes 1-4 : Gamme étalon
Pistes 5-7 : Agrobacterium lyses mécanique+chimique
Pistes 8-10 : Agrobacterium lyses chimique+thermique
Pistes 11-13 : Ralstonia lyses mécanique+chimique
Pistes 14-16 : Ralstonia lyses chimique+thermique
Pistes 17-19 : Bacillus lyses mécanique+chimique
Pistes 20-22 : Bacillus lyses chimique+thermique
Pistes 23-25 : Pseudomonas lyses mécanique+chimique
Pistes 26-28 : Pseudomonas lyses chimique+thermique
Pistes 29-31 : Rhodococcus lyses mécanique+chimique
Pistes 32-34 : Rhodococcus chimique+thermique
Pistes 35-37 : spores lyses mécanique+chimique
Pistes 38-40 : spores lyses thermique+mécanique
La figure 3B est une photo d'un gel d'agarose sur lequel a été migré l'ADN extrait par une méthode combinant les trois modes de lyse différents : Pistes 1-4 : gamme étalon Pistes 5-7 : Agrobacterium Pistes 8-10 -.Pseudomonas Pistes 11-13 : Rhodococcus Pistes 14-16 : Spores
Figure 4 : La figure 4 est un gel d'agarose sur lequel a été migré l'ADN extrait des spores de Bacillus globigiil.
Pistes M : Marqueur de tailles,
Pistes 1-3 : gamme étalon
Pistes 4-6 trois répétitions de dépôts de 30 μl
Figure 5 : La figure 5 est un histogramme illustrant les quantités d'ADN obtenues pour chaque souche avec les différents protocoles combinant deux ou trois modes de lyses.
Mécanique+chimique, chimique+thermique., chimique+thermique+mécanique.
Figure 6 : La figure 6 est un gel d'agarose sur lequel a été migré un ADN extrait de spores de Bacillus globigii à la concentration de 109 spores/ml, dépôts de 30 μl.
Piste M : marqueur de taille ; pistes 1-4 : gamme étalon ; pistes 5-7 : 3 dépôts de 30 μl.
Figure 7 : La figure 7A est un gel d'agarose sur lequel a été migré un ADN extrait de spores de Bacillus globigii souche speywood. Dépôts : 10 μl. Pistes M : Marqueur de taille ; Pistes 1-3, gamme étalon, pistes 4-6, sans remise en culture, pistes 7-9, +0,5h dans du TS à 37°C, pistes 10-12, +1h dans du TS à 37°C ; pistes 13-15, +1 ,5h dans du TS à 37°C, pistes 16-19, +2h dans du TS à 37°C.
La figure 7B est un gel d'agarose sur lequel a été migré un ADN 16S de spores de Bacillus globigii souche speywood amplifié avec la Taq polymérase Qbiogene. Dépôts : 10 μl. Pistes M : Marqueur de taille ; Pistes 1 -3, +0,5h dans du TS à 37°C, pistes 4-6, sans remise en culture ; piste 7, témoin négatif ; piste 8 témoin positif.
Figure 8 : La figure 8A est un gel d'agarose sur lequel a été migré un ADN extrait de communautés reconstituées à différentes concentrations, avec la méthode d'extraction de l'invention combinant les trois modes de lyse, dépôts de 10 μl.
Piste M : marqueur de taille ; pistes 1-4 : gamme étalon ; pistes 5-8 : 6.108 CFU/mL ; pistes 9-12 : 6.107 CFU/mL, pistes 13-16 : 6.106CFU/mL.
La figure 8B est un gel d'agarose sur lequel a été migré un ADN extrait de communautés reconstituées à différentes concentrations, avec la méthode d'extraction de l'invention combinant les trois modes de lyse, dépôts de 20 μl.
Piste M : marqueur de taille ; pistes 1-4 : gamme étalon ; pistes 5-8 : 6.105 CFU/mL ; pistes 9-12 : 6.104 CFU/mL, pistes 13-16 : 6.103CFU/mL, pistes 17-20 : 6.102 CFU/mL.
Figure 9 : La figure 9 est un gel d'agarose sur lequel a été migré un ADN extrait de spores et des formes végétatives de Bacillus globigii (souche CIP 7718 et souche speywood) avec la méthode d'extraction de l'invention combinant les trois modes de lyse, dépôts de 20 μl.
Piste M : marqueur de taille ; pistes 1-3 : gamme étalon ; pistes 4-6 : formes végétatives de la souche CIP7718 ; pistes 7-9 : formes sporulées de la souche CIP7718 , pistes 10-12 : formes végétatives de la souche speywood ; pistes 13-15 : formes sporulées de la souche speywood. EXEMPLES
Cinq souches représentatives des grands groupes bactériens ont été utilisées ainsi que des formes sporulées afin de comparer les rendements d'extrait obtenus au moyen d'un kit commercial d'extraction d'acides nucléiques et de différents protocoles basés sur les principes d'une lyse chimique, d'une lyse thermique et d'une lyse mécanique. Après ce premier criblage, un éventuel effet synergique de l'association de plusieurs protocoles a été testé, ainsi qu'une optimisation de l'étape de germination des formes sporulées. La méthode d'extraction de l'invention a ensuite été mise en œuvre à partir de communautés bactériennes dites "reconstituées" à différentes concentrations.
A Solutions, Souches, Conditions de cultures et tîtration
Milieu LB :
Bacto-tryptone 10 g NaCI 5 g
Extrait de levure 10 g H2O qsp 1 L + Agar 15 g/L Milieu B de King : Biogélitone 20 g Glycérol 10 ml KH2PO4 1.5 g MgSO4, 7H2O 1.5 g H2O: qsp 1 litre + Agar 15 g/L
Préparation du Tampon d'extraction de l'ADN TES+SDS à 2%
Préparation avec + tween 20 à 0.01 % : TWEEN 20 1 mL + 999 mL Tris-HCI 1M - pH 8
Pour 500 mL :
60,57 g Tris
+ 25 mL HCI pour ajuster à pH 8
+ H2O qsp 500 mL
Stérilisation : Autoclavage
Stockage : Température ambiante
SDS 20 %
Pour 500 mL :
100 g dans environ 400 mL d'h^O puis chauffer pour dissoudre.
+ H2O qsp 500 mL
Stérilisation : filtration mais pas nécessaire
Stockage : Température ambiante
NaCMM
Pour 500 mL : 29,22 g de NaCI + H2O qsp 500 mL
Stérilisation : Autoclavage
Stockage : Température ambiante
EDTA 0,5M - pH8
Pour 500 mL : 12
93,085 g EDTA
+ 400 mL H2O
+ Ajuster à pH 8 avec NaOH concentré (EDTA soluble à pH 8)
+ H2O qsp 500 mL Stérilisation : Autoclavage Stockage : Température ambiante
Tampon d'extraction (Concentrations finales):
TRIS HCI 100 mM pH8, EDTA 100mM pH 8, NaCI 100mM, 2% SDS.
Donc pour 100 mL de Tampon : 10 mL de TRIS 1 M, 20 mL EDTA 0,5M, 10mL NaCI 1 M, 10 mL SDS 20 %, + 50 mL
Acétate de Potassium 3M - pH 5,5
PouMOOmL :
60 mL Acétate de potassium 5M + 11 ,5 mL Acide Acétique 100 % + H2O qsp 100 mL
Stérilisation : filtration
Stockage : Température ambiante
Les souches bactériennes utilisées sont représentatives des grands types bactériens : • Alpha-protéobactérie : Agrobacterium tumefaciens C58 • Beta-protéobactérie : Ralstonia metallidurans CH34 • Gama-protéobactérie : Pseudomonas fluorescens C7R12 • Gram + à Bas GC : Bacillus polymyxa CFBP1954 (Collection Française des Bactéries Phytopathogènes ) • Gram + à Haut GC : Rhodococcus rhodochrous ATCC 13898 • Spores de Bacillus globigii souche CIP 7718 : 5 mL de suspension dans de l'eau + TWEEN 20 à 0,01 %, à une concentration de 109 spores. ml"1 et utilisées lors de l'extraction à une concentration de 108 spores.ml"1. Les bactéries Ralstonia, Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus sont cultivées en milieux Luria-Bertoni (LB) et Agrobacterium en milieu King B. A la densité optique de 1 (6O0 nm), des suspensions, dilutions et étalements de chaque souche sont réalisés sur les milieux appropriés (LB agar et King B agar). La titration des souches est effectuée par dénombrement des colonies après incubation des boites à 28°C pendant 4 jours. A cette même densité optique, des aliquotes de 1 mL de cultures sont prélevés, centrifugés (8000g, 15 minutes) et congelés (-20°C) pour les étapes futures d'extraction d'ADN. Cette étape permet d'éviter la possible lyse des cellules bactériennes dans le milieu de culture lors de la congélation.
Les dénombrements obtenus sont présentés dans le tableau 1 suivant. A la densité optique de longueur d'ondes à 600 nm égale à 1 , toutes les souches sont comprises entre 3,7.108 et 1 ,6.109 CFU.m."1, densité suffisante pour l'extraction d'ADN.
Tableau 1 : Titration des souches Souches CFU/mL +/- écart-type
Agrobacterium tumefaciens C58 1.60.109 +/- 0,49.108
Bacillus polymyxa CFBP 1954 4.62.108 +/- 7,07.107
Pseudomonas fluorescens C7R12 6,85.108 +/- 1.20.108
Ralstonia metallidurans CH34 3J6.108 +/- 0,94.107
Rhodococcus Rhodochrous 8,30.108 +/- 0,52.108 ATCCI3898.
B/ Extraction d'ADN sur souches
1/ Protocoles séparés
Les ADN de 5 souches bactériennes ainsi que de spores sont extraits au moyen des protocoles d'extraction décrits dans l'exemple B. Pour chaque r
échantillon, 3 répétitions ont été effectuées. Les protocoles utilisés sont basés sur les grands principes d'extraction d'ADN couramment utilisés en écologie moléculaire. Il s'agit (i) d'une lyse mécanique fondée sur l'action de billes de verres fragilisant les membranes bactériennes, (ii) une lyse chimique basée sur l'action d'un détergent, le sodium dodecyl-sulfate (SDS) pour fragiliser les membranes et enfin (iii) une lyse thermique reposant sur l'alternance de chocs chauds et froids pour faire éclater les cellules.
Le protocole de lyse mécanique comprend les premières étapes suivantes :
• A partir du culot Bactérien.
• Reprendre avec 1 ml de tampon d'extraction TES (fait avec H2O + tween 20 à 0.01%) (Tris-HCI 100 mM pH 8, EDTA 100 mM pH 8, NaCI 100 mM).
• Ajouter 500 mg de billes de 106 μm lavées et 4 billes de 2 mm de diamètre (pratiquement peser les billes dans les tubes adaptés puis ajouter le tampon+culot).
• Agiter les tubes dans le broyeur à 1600 rpm pendant 30 secondes ou 3000 rpm 1 minute (support préalablement placé à -20°C).
• Centrifuger 14 000g, 2 minutes (culoter les billes) puis récupérer le surnageant.
Le protocole de lyse thermique comprend les premières étapes suivantes :
• A patir du culot bactérien.
• Reprendre avec 1 ml de tampon d'extraction TES (fait avec H2O + tween20 à 0.01%) (Tris-HCI 100 mM pH 8, EDTA 100 mM pH 8, NaCI 100 mM).
• 3 cycles de « Heat shock » : Azote liquide (jusqu'à congélation) - Eau bouillante (3 minutes à 100 °C). Le protocole de lyse chimique comprend les premières étapes suivantes :
• A partir du culot bactérien.
• Reprendre avec 1 ml de tampon d'extraction TES (fait avec H2O + tween 20 à 0.01%) + SDS 2 % (Tris-HCI 100 mM pH 8, EDTA 100 mM pH 8, NaCI 100 mM, 2% SDS).
• Incubation à 70°C pendant 30 minutes en « vortexant » 10 secondes après 15 et 30 minutes.
Les dernières étapes sont communes à tous les protocoles. Elles consistent tout d'abord à l'ajout de protéinase K pour dénaturer les protéines, puis à l'incubation avec de l'acétate de potassium sur la glace afin de précipiter et d'éliminer les protéines après centrifugation (14000g, 5 min). L'ADN est enfin précipité par de l'isopropanol froid (v/v).
Le protocole des étapes communes est détaillé ci-après : Ajouter Protéinase K : 20μL d'une Solution Mère à 10mg/mL. Incuber 30 minutes entre 37 et 50 °C. Ajouter 1/10 du volume (environ 100 μL) d'acétate de Potassium 3M pH 5,5. Incuber 10 minutes sur la glace. Centrifuger à 14 000 g pendant 5 minutes et récupérer le surnageant dans un tube de 2 mL. Ajouter 1 volume d'isopropanol à -20°C. Placer 30 minutes à -20°C. Centrifuger à 13 000 rpm pendant 30 minutes. Eliminer le surnageant avec précaution avec une pipette. Laver le culot à l'éthanol 70° (200 μl) à -20°C (sans remettre l'ADN en suspension). Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm. Eliminer l'alcool et laisser sécher le culot 30 minutes à température ambiante (ou à l'étuve) jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de traces d'alcool sur les parois du tube • Reprendre le culot dans 10O μl de H2O.
Les protocoles de préparation des différents tampons ont été décrits précédemment.
Le kit commercial d'extraction d'ADN FASTDNA® KIT (référencé dans le texte par KIT BIO101 ) est quant à lui une combinaison de la lyse mécanique et de la lyse chimique. Le protocole élaboré par le fournisseur Qbiogene est décrit dans la note technique fournie avec le KIT.
L'ADN extrait de chaque souche bactérienne est quantifié sur gel par comparaison avec une gamme étalon d'ADN de thymus de veau. 10μL d'ADN extrait sont déposés sur un gel d'agarose à 1 %. Une gamme étalon d'ADN de thymus de veau correspondant à 500 ng ADN/1 OμL, 250 ng ADN/1 OμL, 125 ng ADN/1 OμL, 62,5 ng ADN/1 OμL est également déposée. Après migration et coloration au bromure d'éthidium, le gel est traité par un analyseur d'image permettant de calculer une droite étalon et in fine de déterminer les quantités d'ADN extraites pour chaque souche.
Les figures 1A à 1 E représentent les dépôts de 10 μL d'ADN pour Agrobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Ralstonia et 20 μL pour Rhodococcus respectivement. Le gel correspondant aux spores n'a pas été présenté car aucun ADN n'était détectable visuellement. On remarque dès à présent sur ces photos, (i) l'effet négatif de la lyse mécanique à 3000 rpm pendant 1 minute sur l'intégrité de l;ADN extrait et (ii) l'extrême hétérogénéité des rendements d'ADN entre les protocoles. Cette observation est confirmée par le traitement informatique de l'image. Les quantités d'ADN, ramenées à 108 CFU.ml"1, sont rapportées dans le tableau 2 suivant et présentées en fonction des souches sur la figure 2A et en fonction des protocoles sur la figure 2B. Les quantités d'ADN sont comprises entre 0,9 et 425 ng d'ADN /108 CFU. Tableau 2 : Quantité d'ADN pour 10 CFU extrait de chaque souche avec les différents protocole :
Figure imgf000023_0001
Les principaux enseignements de ces résultats sont que (i) aucun des protocoles ne semble adapté à une extraction équivalente, en terme de rendement, pour toutes les souches testées et (ii) outre le kit, la lyse mécanique à 1600 rpm pendant 30 secondes, la lyse chimique et la lyse thermique semblent donner les meilleurs résultats.
2/ Synergie des protocoles de lyse sur les rendements d'extraction a/ Synergie de deux protocoles
Afin d'augmenter les quantités d'ADN extrait mais également de niveler les différences entre les souches, un possible effet synergique des protocoles d'extraction a été évalué. Pour cela, les protocoles qui donnaient les résultats les plus significatifs ont été combinés de manière indépendante. Les associations lyse chimique / lyse mécanique à 1600 rpm pendant 30 secondes, et lyse chimique / lyse thermique ont été testées.
La figure 3A correspond aux dépôts de 10 μL d'ADN pour Agrobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Ralstonia et 20 μL pour Rhodococcus et les spores. Cependant, aucun ADN n'est observé pour les spores, comme indiqué sur les pistes 35 à 40. Les quantités données en figure 5 sont comprises entre 37,4 et 332,4 ng d'ADN/108 CFU. On observe un effet synergique sur les souches d' Agrobacterium et de Rhodococcus, sans pour autant montrer de différences significatives entre les 2 combinaisons différentes.
Pour les souches de Bacillus, Ralstonia et de Pseudomonas, on note une uniformisation de la quantité d'ADN pour les deux combinaisons. Cette quantité est plus élevée pour la combinaison lyse chimique + thermique avec néanmoins une variabilité importante entre les répétitions d'une même souche (cf. écart-types, figure 5). b/ Synergie de la combinaison des trois modes de lyse
Une combinaison des trois protocoles de lyse a également été testée pour évaluer un éventuel effet synergique, c'est-à-dire la combinaison d'une lyse chimique puis thermique et enfin mécanique, avec une étape préalable à la protéinase K (fragilisation des membranes cellulaires) et une vitesse de 1600 rpm pendant 1 minute. Le protocole détaillé de cette synergie est présenté ci-après :
• A partir du culot Batérien
• Reprendre avec 1ml de tampon d'extraction TES (fait avec H2O + tween 20 à 0,01%) + SDS 2% (Tris-HCI 100 mM pH 8, EDTA 100 mM pH 8,NaCI 100 mM, 2% SDS). • Peser 500 mg de billes de 106 μm lavées et 4 billes de 2 mm de diamètre (pratiquement peser les billes dans les tubes adaptés puis ajouter le tampon + culot).
• Ajouter Protéinase K : 20 μL d'une Solution Mère à 10mg/mL.
• Incuber 30 minutes à 37°C.
• Incubation à 65°C pendant 30 minutes en (vortexant) 10 secondes après 15 et 30 minutes. (Chimique)
• 3 cycles de «Heat shock» : Azote liquide (jusqu'à congélation) - Eau bouillante (3 minutes à 100°C). (thermique)
• Agiter les tubes dans le broyeur à 1600 rpm pendant 1 minutes (support préalablement placé à -20 °C). (Mécanique)
• Centrifuger à 14 000 g pendant 1 minute et récupérer le surnageant dans un tube de 2 ml
• Ajouter 1/10 du volume (environ 100 μL) d'acétate de Potassium 3M pH 5,5.
• Incuber 10 minutes sur la glace.
• Centrifuger à 14 000g pendant 5 minutes et récupérer le surnageant dans un tube de 2 mL.
• Ajouter 1 volume d'isopropanol préalablement placé à -20°C.
• Incuber 30 minutes à -20 °C.
• Centrifuger à 13 000 rpm pendant 30 minutes.
• Eliminer le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette.
• Laver le culot à l'éthanol 70° (200μl) à -20 °C (sans remettre l'ADN en suspension). Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm.
• Eliminer l'alcool et, laisser sécher le culot 30 minutes à température ambiante (ou à l'étuve) jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de traces d'alcool sur les parois du tube.
• Reprendre le culot dans 100 μl de H2O. Cette combinaison de trois protocoles de lyse a été utilisée pour lyser les spores de Bacillus globigii et deux souches (Agrobacterium et Rhodococcus) dont les rendements d'extraction sont les plus faibles ainsi que la souche de Pseudomonas, utilisée comme témoin d'extraction.
La figure 3B représente les dépôts de 10 μL d'ADN pour Pseudomonas, Rhodococcus Agrobacterium et les spores. Les résultats des quantités d'ADN sont présentés sur la figure 5. On remarque d'emblée la faiblesse des écart-types mais également le fort effet synergique de cette technique. Les quantités d'ADN sont respectivement doublées et triplées, par rapport à la synergie de deux modes de lyse, pour Agrobacterium et Rhodococcus. De plus, cette synergie permet d'extraire de l'ADN à partir de spores (β. globigii souche CIP 7718) à hauteur de 30 ng ADN/108 spores. En effet, le dépôt de 30 μL (figure 4) de l'ADN extrait des spores permet de visualiser un ADN de haut poids moléculaire.
Dans le but de confirmer ces résultats sur les spores, le protocole d'extraction combinant les trois modes de lyse a été mis en œuvre sur 109 spores. La figure 6 montre une quantité non négligeable d'ADN extrait des spores. En effet, après quantification l'ADN extrait a été estimé à 1080 ng pour les 109 spores, soit un rendement de 24% d'efficacité pour l'extraction.
La combinaison de la lyse chimique, de la lyse thermique et de la lyse mécanique, est donc adaptée à l'extraction d'acides nucléiques de microorganismes représentatifs des grands phylums et produit un effet synergique sur les rendements d'extraction obtenus. Les principaux avantages de cette synergie sont donc :
(i) une quantité d'ADN extrait sur toutes les souches suffisantes pour l'amplification par PCR (ii) une bonne reproductibilité et enfin
(iii) la possibilité d'extraire de l'ADN sur les spores, éléments hautement résistants et potentiellement présents à forte densité dans l'air. C/ Rendement d'extraction. Les rendements d'extraction ont été calculés avec la taille du génome des souches utilisées, obtenue à partir de bases de données disponibles (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/eub_g.html), et en sachant que 1 Mb correspond à 1.1 O"15 g d'ADN. Connaissant les quantités d'ADN extrait en ng /108 CFU, il est ainsi possible de déterminer des rendements qui sont compris entre 10 % pour les spores et 75 % pour Pseudomonas (avec la combinaison de trois protocoles de lyse). Cependant, la moyenne de ces rendements, si l'on excepte celui obtenu pour les spores, se situe aux alentours de 50 %. Les rendements d'extraction d'ADN obtenues par combinaison des 2 ou 3 modes de lyses et estimées pour chaque souche par rapport à la taille du génome sont indiqués dans le tableau 3 suivant :
Tableau 3 : Rendement d'extraction d'ADN estimée pour chaque souche par rapport à la taille du génome.
Figure imgf000027_0001
** Quantité obtenue avec la synergie de 2 protocoles * Quantité obtenue avec la synergie de 3 protocoles
D/ Extraction sur "communautés reconstituées"
Afin de déterminer la limite de sensibilité de la méthode d'extraction selon l'invention, l'ADN de communautés "reconstituées" a été extrait à différentes concentrations selon la méthode d'extraction de l'invention combinant les trois modes de lyse.
Pour cela, 108 CFU des 5 souches bactériennes ainsi que des formes sporulées (β. globigii souche CIP 7718) ont été remis en suspension dans 1 millilitre de solution. Cette suspension à la concentration de 6.108 CFU. ml"1 a servi de solution mère à des dilutions au dixième jusqu'à 6.102 CFU. ml"1. Quatre répétitions par dilution ont été utilisées pour l'extraction d'ADN. Les résultats sont présentés sur les figures 8A et 8B avec des dépôts de 10 μL pour les concentrations de 6.108 à 6.106 CFU.ml"1 et des dépôts de 20μL de 6.105 à 6.102. La quantité d'ADN obtenue pour 6.108 est d'environ 3000 ng avec un rendement de 82 % pour une taille de génome moyen de 5,5 Mb. A la densité de 6.107 CFU.ml"1 la quantité d'ADN diminue environ d'un facteur 10 pour atteindre 400 ng. Pour les fortes dilutions (de 6.106 à 6.102 CFU.ml"1), l'ADN extrait n'est pas visible. Un calcul théorique aboutit à une concentration de 4 ng d'ADN pour 10μL déposé à une densité cellulaire de 6.106 CFU.ml"1. Une telle quantité n'est pas visible sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium, ce qui explique ces résultats. La méthode d'extraction combinant les trois modes de lyse permet ainsi d'extraire de façon très satisfaisante les ADN de communautés reconstituées avec des rendements relativement élevés.
E/ Test d'extraction d'ADN sur des spores d'une autre souche de Bacillus globigii : la souche speywood.
Les résultats obtenus montrent que les spores sont récalcitrantes à la lyse. En effet même en utilisant la méthode d'extraction de l'invention, les rendements d'extraction d'ADN restent faibles. Pour améliorer ces rendements, un protocole incluant une étape préalable de remise en culture des formes sporulées en milieu liquide TS (trypticase soy) pendant 2 heures à 37°C a été testé. Cette incubation permet le passage des formes sporulées aux formes végétatives. Les ADN des échantillons ont ensuite été extraits à l'aide de la méthode d'extraction de l'invention. Ce protocole a été testé sur deux souches de Bacillus globigii : les souches speywood (aérosolisable) et CIP 7718 (non aérosolisable). L'ADN obtenu à partir des formes végétatives et sporulées des deux souches de Bacillus globigii a été déposé sur gel et les résultats sont présentés en figure 9. Les quantifications correspondant à ces dépôts sont données dans le tableau 4 suivant. Tableau 4
Figure imgf000029_0001
Les résultats obtenus montrent que le passage de la forme sporulée à la forme végétative permet une augmentation de la quantité d'ADN extrait quelle que soit la souche considérée (de 6 à 193 ng d'ADN/108 spores de la souche CIP et de 28 à 173 ng d'ADN/108 spores pour la souche speywood).
Considérant que le temps de génération de la majorité des bactéries de l'environnement est supérieur à 1 heure, l'étape d'incubation de 2 heures à 37°C ne devrait pas modifier la composition et la densité de la communauté bactérienne des échantillons. Cette étape pourrait donc s'avérer intéressante dans l'optique d'une extraction efficace de l'ADN des spores contenues dans les échantillons d'air.
F/ Effet de la remise en culture sur le rendement d'extraction et d'amplification de l'ADN des formes sporulées
Les formes sporulées pouvant potentiellement représenter une partie importante du bruit de fond biologique de l'air, il était apparu important de rechercher un moyen d'améliorer ce rendement. Au cours de la première étape l'effet de la germination sur le rendement d'extraction de l'ADN à partir d'échantillons de formes sporulées avait été testé en incubant les spores de deux souches CIP7718 et speywood de Bacillus globigii à 37°C dans du milieu de culture (TS) pendant 2tι. Cette étape d'incubation était destinée à induire le passage des formes sporulées à des formes végétatives plus facilement lysable. Les cellules avaient été ensuite lysées et l'ADN extrait déposé sur gel. Les résultats obtenus montraient que pour les deux souches testées, l'étape d'incubation améliorait de façon significative le rendement d'extraction de l'ADN des formes sporulées.
Dans l'hypothèse où les formes sporulées pourraient représenter une partie importante du bruit de fond biologique de l'air, cette étape d'incubation semble donc recommandée. Cependant, elle doit être d'une durée suffisamment courte pour éviter la croissance des populations bactériennes sous formes végétatives également présentes dans les échantillons. C'est pourquoi il a été effectué une cinétique de germination des spores afin de déterminer le temps d'incubation minimum suffisant pour améliorer le rendement d'extraction de l'ADN. Pour cela, les formes sporulées de la souche speywood de β. glogigii ont été incubées à 37°C dans du milieu TS pendant 0,5 ; 1 ; 1 ,5 et 2h.
L'ADN a ensuite été extrait en utilisant le protocole de synergie par 3 et déposé sur gel (Figure 7A). Les résultats obtenus montrent que 30 minutes d'incubation suffisent pour améliorer significativement le rendement d'extraction de l'ADN à partir des formes sporulées. Cette incubation est suffisamment courte pour qu'aucune modification de la densité cellulaire des échantillons n'intervienne et que l'équilibre relatif des différentes populations bactériennes ne soit biaisé.
Par la suite, nous avons effectué l'amplification par PCR du gène 16S de l'ADN extrait des formes sporulées après 0 et 0,5 heure d'incubation. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 7B. Les profils montrent que l'amplification est efficace sur les formes sporulées après 0 et 0,5 heures de remise en culture dans du milieu TS à 37°C.
Cependant, il est apparu que cette étape d'incubation améliore de façon significative le rendement et la reproductibilité de l'extraction et de l'amplification de l'ADN des spores.
G/ Analyse des extraits d'ADN de populations microbiennes prélevées dans l'air
Afin d'étudier des communautés microbiennes prélevés dans l'air par des outils de biologie moléculaire, les extraits d'acides nucléique obtenus selon la méthode d'extraction de l'invention sont analysés par réalisation d'une empreinte génétique de la population par la technique RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) telle que décrite dans Ranjard et ai., 2001 , Applied and Environmental Microbiology, pp 4479-4487, ou la T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism) (Moeseneder et al., 2001 , Journal of microbiological methods, Vol 44 (2) pp 159-172 ; Saka et al., Soil Science and Plant Nutrition, Vol 47 (4) 773-778 ; Urakawa et al., 2000, MEPS, 220 : 47-57 ; Marsh, 1999, Current opinion in Microbiology, Vol 2 (3) 323-327.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'extraction d'acides nucléiques de micro-organismes, comprenant a. la mise en œuvre successive des trois étapes de lyse suivantes dans un ordre quelconque : i. une lyse chimique des micro-organismes comprenant la mise au contact des micro-organismes avec une solution de lyse contenant un détergent ; ii. une lyse par choc thermique comprenant l'incubation de l'extrait à une température inférieure à 0°C, suivie immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95°C, de préférence environ 100°C ; et, iii. une lyse mécanique comprenant l'agitation de l'extrait en présence de billes. b. la précipitation des débris membranaires et protéiques, c. la récupération du surnageant contenant les acides nucléiques, d. la précipitation des acides nucléiques et l'élimination du surnageant, e. le cas échéant la remise en solution des acides nucléiques dans un tampon approprié.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les trois étapes de lyse définies en (a) sont réalisées dans l'ordre suivant : (i) la lyse chimique, (ii) la lyse par choc thermique et (iii) la lyse mécanique.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la lyse chimique comprend l'utilisation d'une solution de lyse comprenant un détergent, de préférence du SDS (sodium dodecyl sulfate), de manière encore plus préférée, du SDS à une concentration comprise entre 1 et 4%.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la lyse comprend l'incubation de l'extrait à une température d'environ - 70°C, par exemple dans de l'azote liquide, suivie immédiatement de l'incubation de l'extrait à une température d'au moins 95°C, de préférence environ 100°C, par exemple dans de l'eau bouillante.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la lyse mécanique comprend une agitation dans un broyeur en présence de billes d'un diamètre compris en 50 μm et 200 μm, de préférence d'environ 100 μm.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les microorganismes sont essentiellement des bactéries et/ou des champignons.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les microorganismes peuvent être sous forme de spores de bactéries et/ou de champignons.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que les étapes de lyse sont précédées d'une étape de remise en culture des spores, comprenant la culture des spores dans un milieu riche approprié pour initier la germination.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les organismes microbiologiques sont prélevés dans l'air.
10. Procédé d'analyse de la population microbienne d'un environnement, comprenant a. le prélèvement dans l'environnement d'un échantillon de la population microbienne et la remise en suspension du prélèvement dans une solution, b. l'extraction des acides nucléiques de la population microbienne remise en suspension selon la méthode définie à l'une quelconque des revendications 1 à 9, c. l'analyse des acides nucléiques extraits.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la population microbienne à analyser est prélevée dans l'air.
12. Procédé selon la revendication 10 ou 11 , caractérisé en ce que la population microbienne prélevée est une population bactérienne et/ou fongique.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'analyse des acides nucléiques extraits consiste à rechercher des marqueurs génétiques permettant de caractériser la population microbienne, l'ensemble des marqueurs constituant l'empreinte génétique.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'une empreinte génétique est obtenue par l'amplification de fragments d'acides nucléiques spécifiques du génome d'espèces microbiennes, notamment par l'amplification de fragments d'ARN ribosomiques, de préférence de l'espace intergénique 16S-23S des micro-organismes analysés.
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