WO2005035004A1 - ヒトＦlｔ３の機能を抑制するための組成物 - Google Patents

ヒトＦlｔ３の機能を抑制するための組成物 Download PDF

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region
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Masazumi Yasumoto
Masamitsu Shimada
Fumitsugu Hino
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a composition for suppressing the function of human Flt3, a method for inducing apoptosis using the composition, and a kit for the method.
  • Non-Patent Document 1 Gene therapy for leukemia has been studied for many years (see, for example, Non-Patent Document 1 or 2). In fact, clinical research has been started (see, for example, Non-Patent Document 3 or 4). Furthermore, RNA-based therapeutic technologies using antisense technology or ribozyme technology are also being developed (see, for example, Non-Patent Document 5).
  • RNA interference reported in 1998 is attracting attention as a phenomenon that suppresses gene expression due to sequence-specific mRNA degradation caused by double-stranded RNA.
  • RNA interference long double-stranded RNA is decomposed into 21-25 nucleotide short RNA called siRNA (short interfering RNA) by RNaselll type activity called Dicer, and then the siRNA is converted into RISC.
  • RNA interference agents that suppress the expression of chimeric mRNA such as MTG8 have been reported (see, for example, Non-Patent Documents 15 and 16).
  • leukemia cells such as AML (acute myeloid leukemia), ALL (acute lymphocytic leukemia), CML (chronic myeloid luekemia) 70—100 It has been reported that high Flt3 expression of 1000-10000 times that of normal bone marrow cells is observed in% (for example, see Non-Patent Document 17).
  • Flt3ZlTD mutation ITD: internal tandem duplication
  • AML APL
  • APL acute promyelocytic leukemia
  • AML acute promyelocytic 1 eukemia
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • CEP-701 see, for example, Non-Patent Document 22
  • SU11248 see, for example, Non-Patent Document 23
  • SU5416 for example, Non-Patent Document 24
  • AG1295 see, for example, non-patent document 25
  • Patent Document 1 International Publication No. 00Z11470 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Holt J. T. and 2 others, Molecular Cellular Biology, Vol. 8, No. 2, pages 963-973 (1988)
  • Non-Patent Document 2 Bettinger T., Read M. L., Current Opinion in Molecular Therapeutics, III, No. 8, pp. 116-124 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Verzeletti S., 6 others, Human Gene Therapy, No. 9, No. 15, 2243-2251 (1998)
  • Non-Patent Document 4 Wierda W. G., Kipps T. J., Seminars in Oncology, No. 27, No. 5, 502-511 (2000)
  • Non-Patent Document 5 Gewirtz A. M., 2 others, Blood, No. 92, No. 3, pages 712-736 (1998)
  • Non-Patent Document 6 Fire A., 5 others, Nature, 391, 806, 806-811 (1998)
  • Non-patent document 7 Bernstein E., 3 others, Nature, 409, 6818 363-36 6 pages (2001)
  • Non-Patent Document 8 Tuschlt., 4 others, Genes and Development, Vol. 13, No. 24, 3191-3197 (1999)
  • Non-Patent Document 9 Zamore PD, 3 others, Cell, No. 101, No. 1, pages 25-33 (200 0 years)
  • Non-Patent Document 10 Nykanen A., 2 others, Cell, No. 107, No. 3, 309-321 (20 01)
  • Non-patent literature ll Elbashir S. M., 2 others, Genes and Development, 15th, 2nd, 188-200 (2001)
  • Non-Patent Document 12 Lipardi C., 2 others, Cell, No. 107, No. 3, 297-307 (2001)
  • Non-Patent Document 13 Elbashir S. M. and 5 others, Nature, No. 411, No. 6836, No. 49 4 pp. 498 (2001)
  • Non-Patent Document 14 Caplen N. J., 4 others, Proc Natl Acad Sci USA, No. 98, No. 17, 9742-9747 (2001)
  • Non-Patent Document 15 Wilda M. and 3 others, Oncogene, 21st, 37, 5716-5724 (2002)
  • Non-Patent Document 16 Heidenreich O. and 7 others, Blood, No. 101, No. 8, 3157-31 63 (2003)
  • Non-Patent Document 17 Drexler H. G., Leukemia, Vol. 10, No. 4, 588-599 (1 996)
  • Non-Patent Document 18 Nakao M. and 8 others, Leukemia, No. 10, Vol. 21, No. 1911, p. 1918 (1996)
  • Non-Patent Document 19 Yokota S., 10 others, Leukemia, No. 11, No. 10, 1605-16 09 (1997)
  • Non-Patent Document 20 Kiyoi H. and 19 others, Leukemia, No.11, No.9, 1447-1452 (1997)
  • Non-Patent Document 21 Gilliland D. G., Griffin J. D., Blood, No. 100, No. 5, 1 532- 1542 (2002)
  • Non-Patent Document 22 Levis M. and 9 others, Blood, No. 99, No. 11, 3885-3891 (2002)
  • Non-Patent Document 23 0, Farrell AM, 14 others, Blood, No. 101, No. 9, 3597— 3605 (2003)
  • Non-Patent Document 24 Giles F. J., 16 others, Blood, No. 102, No. 3, 795-801 (2003)
  • Non-Patent Document 25 Levis M. and 4 others, Blood, No. 98, No. 3, pages 885-887 (2001)
  • One aspect of the present invention is to suppress the function of Flt3, Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells, such as Flt3 high-expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancerous cells, For example, suppressing the growth of Flt3 high-expressing leukemia cells and leukemia cells containing Z or Flt3ZlTD mutation, preferentially suppressing the growth of the cells, suppressing the expression level of Flt3 gene, and the nucleic acid encoding Flt3 It is an object of the present invention to provide a composition that can achieve at least one of suppression of a phenomenon based on mutation, suppression of a growth signal derived from Flt3, suppression of the expression level of Flt3 protein, and the like.
  • another aspect of the present invention is that the effect of the composition is exerted, Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells, for example, Flt3 high-expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancers Expression of a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 in the composition in, for example, a Flt3 high-expressing leukemia cell and a leukemia cell containing Z or Flt3ZlTD mutation, and the Flt3 gene expression level in the cell Providing a composition that can achieve at least one of suppression, suppression of events based on mutation of nucleic acid encoding Flt3, suppression of Flt3-derived growth signal, suppression of Flt3 protein expression level, etc. There is to do.
  • Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells such as Flt3 high-expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancerous cells, Suppresses the growth of expressed leukemia cells and leukemia cells containing Z or Flt3ZlTD mutation, preferentially suppresses the proliferation of the cells, induces apoptosis of the cells, suppresses the Flt3-derived proliferation signal of the cells Suppress the expression level of Flt3 protein in the cell and suppress the expression level of Flt3 gene in the cell. It is to provide a method for inducing apoptosis that can achieve at least one of
  • another aspect of the present invention is to efficiently perform the apoptosis induction method, Fit 3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells, for example, Flt3 high-expressing leukemia cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing Inhibiting the proliferation of leukemia cells, preferentially inhibiting the proliferation of the cells, inducing apoptosis of the cells, inhibiting the Flt3-derived proliferation signal of the cells, and reducing the expression level of Flt3 protein in the cells
  • the present invention provides a human Flt3 near-membrane region, a kinase region, and
  • the present invention relates to a composition containing a nucleic acid that targets at least one region selected from the group consisting of an ATP binding site region and can suppress the function of Flt3.
  • the present invention provides the following (a)-(c):
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a nucleic acid that targets at least one region selected from the group that is also capable of suppressing the function of Flt3.
  • a nucleic acid having a chain length of 15 to 25 bases is preferable.
  • the composition of the present invention includes, for example, a combination of a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 2 and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 3, and having a base sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Nucleic acid and SEQ ID NO: 6 A combination with a nucleic acid having a base sequence, a combination with a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 8 and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 9, and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: A combination of a nucleic acid having a base sequence of 34, a combination of a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 36 and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 37, and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 39 No .: a combination containing a nucleic acid having a base sequence of 40, and the like.
  • the present invention targets at least one region selected from the group consisting of a human Flt3 near-membrane region, a kinase region, and an ATP binding site region, and suppresses the function of Flt3.
  • the present invention relates to a composition containing a vector carrying a controllable nucleic acid.
  • the present invention provides the following (a)-(c):
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a vector that retains a nucleic acid that targets a region selected from a powerful group and that can suppress the function of Flt3 in a mammalian cell.
  • the vector in the composition of the present invention may contain a promoter such as an RNA polymerase III promoter or an RNA polymerase II promoter as a promoter.
  • the vector is not particularly limited.
  • the promoter is a U6 promoter, an HI promoter, a tRNA promoter, a CMV promoter, or the like.
  • adenoviral vectors, lentiviral vectors, and retroviral vector strengths can be suitably used as the basic skeleton as the vector.
  • the present invention selectively suppresses the growth of Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells by the composition of the present invention, whereby the Flt3 high-expressing cells and
  • the present invention relates to a method for inducing apoptosis, which comprises inducing apoptosis of a cell containing Z or Flt3ZlTD mutation.
  • apoptosis induction method of the present invention Further use of an agent that inhibits nuclease, and at the same time or after one of the other, the other is used to selectively suppress the growth of Flt3 high-expressing cells and cells containing Z or Flt3ZlTD mutations, whereby the Flt3 Induce apoptosis of high-expressing cells and cells containing Z or Flt3ZlTD mutations! /.
  • the composition of the present invention efficiently induces apoptosis, Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells, for example, Flt3 high-expressing leukemia cells And inhibiting the growth of Z or Flt3ZlTD mutation-containing leukemia cells, preferentially inhibiting the proliferation of the cells, inducing apoptosis of the cells, inhibiting the Flt3-derived proliferation signal of the cells, It is also a string product for suppressing the expression level of Flt3 protein in the cell, suppressing the expression level of Flt3 gene in the cell, and the like.
  • the present invention relates to a kit containing the composition of the present invention.
  • a powerful kit efficiently induces apoptosis, and suppresses the growth of Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3 ZITD mutation-containing cells, such as Flt3 high-expressing leukemia cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing leukemia cells.
  • Preferentially suppressing the proliferation of the cell, inducing apoptosis of the cell, suppressing the Flt3-derived proliferation signal of the cell, suppressing the expression level of Flt3 protein in the cell It can also be used as a kit for suppressing the expression level of the Flt3 gene.
  • the gist of the present invention is as follows:
  • a composition comprising a nucleic acid that targets at least one region selected from the group consisting of a human Flt3 near-membrane region, a kinase region, and an ATP binding site region, and that can suppress the function of Flt3.
  • a composition comprising a nucleic acid that targets at least one region selected from the group consisting of and that can inhibit the function of Flt3;
  • composition according to [1] or [2], comprising a nucleic acid having a chain length of 15 to 25 bases,
  • SEQ ID NO: 1, [2] or [2] above comprising an RNA sequence corresponding to at least one base sequence selected from the group consisting of 1, 4, 7, 32, 35 and 38 [5] a nucleic acid obtained by combining a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 2 and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 3;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 6;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 9;
  • a nucleic acid combining a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 33 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 34;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 36 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 37;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 39 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 40;
  • composition according to any one of the above [1]-[4], comprising a nucleic acid selected from the group consisting of:
  • [6] Contains a vector carrying a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3, targeting at least one region selected from the group consisting of human Flt3 membrane region, kinase region and ATP binding site region ,Composition,
  • a composition comprising a vector carrying a nucleic acid that targets a region selected from the group consisting of and that can suppress the function of Flt3 in a mammalian cell;
  • nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 3;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 6;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 9;
  • a nucleic acid combining a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 33 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 34;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 36 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 37;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 39 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 40;
  • composition according to item [6]-[9] above comprising a vector holding a nucleic acid selected from the group consisting of:
  • composition according to [6]-[10] above which contains a vector having an RNA polymerase III promoter or an RNA polymerase II promoter as a promoter,
  • the promoter is U6 promoter, HI promoter, tRNA promoter And the composition according to [11] above, which is a promoter selected from the group that also has CMV promoter power,
  • composition according to any one of [6]-[12] above comprising a vector selected from an adenovirus vector, a lentivirus vector and a retrovirus vector as a basic skeleton,
  • the present invention provides a composition that can be used to suppress the function of Flt3, which is different from conventional antisense technology and ribozyme technology.
  • the present invention provides a composition containing a chemically synthesized nucleic acid (for example, siRNA) and a derivative thereof as the composition, or a composition containing a vector constructed to express the nucleic acid in a cell. Is done.
  • a method for selectively or preferentially suppressing the function of Flt3 in a cell that highly expresses Flt3 and a cell having a Z or Flt3ZlTD mutation using the composition of the present invention for example, an apoptosis induction method, for the method Kits are provided.
  • Flt3 function is down-regulated, and Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells, such as Flt3 high-expressing cancer cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancerous cells, Flt3 high expression leukemia cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing leukemia cells
  • Flt3 high expression leukemia cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing leukemia cells Preferentially suppress the proliferation of the cell, induce apoptosis of the cell, suppress the F1 t3-derived proliferation signal of the cell, suppress the Flt3 protein expression level of the cell, expression of the Flt3 gene of the cell It has an excellent effect that it can suppress the amount or an event based on mutation of a nuclear acid encoding Flt3.
  • the effect of suppressing the function of Flt3 is exerted, and in the cell, a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 is expressed. It is possible to suppress the expression level of the Flt3 gene in the cell, to suppress the event based on the mutation of the nucleic acid encoding Flt3, or to suppress the expression level of the Flt3 protein. . Furthermore, according to the apoptosis inducing method of the present invention, there is an excellent effect that the proliferation of the cells can be preferentially suppressed and apoptosis of the cells can be induced. In addition, according to the kit of the present invention, the apoptosis induction method can be efficiently performed, and the excellent effects of preferentially suppressing the proliferation of the cells and inducing apoptosis of the cells can be achieved. Play.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in cell proliferation activity by the combined use of siRNA and a kinase inhibitor.
  • FIG. 2 is a diagram regarding cell growth suppression using siRNA expression vectors.
  • FIG. 3 A graph showing changes in cell proliferation activity due to the use of siRNA alone or siRNA cocktail.
  • the present invention down-regulates the function of Flt3 (FMS-like tyrosine kinase 3) to preferentially suppress the proliferation of Flt3 high-expressing cells and cells containing Z or Flt3ZlTD mutation, and induce apoptosis. Based on the inventors' surprising finding that it can. Treatment of patients with high expression of Flt3 and ITD mutations, which are the cause of poor prognosis of leukemia, relies on bone marrow transplantation, and about 25% of leukemia, or tens of thousands of patients with Flt3 abnormalities annually worldwide. Therefore, the present invention is in a state where life cannot be saved.
  • Flt3 FMS-like tyrosine kinase 3
  • Flt3 gene and the expression of Z or Flt3ZlTD mutant gene are inhibited, and in some cases, leukemia is controlled by controlling the expression of Flt3 protein.
  • Cell proliferation signaling It is expected to inhibit the growth of leukemia cells.
  • Flt3 is a receptor for FL (Flt3 ligand), which is a hematopoietic cell growth factor.
  • KIT stem cell factor receptor
  • ⁇ -CSF macrophage colony stimulating factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • Flt3 is composed of five extracellular immunoglobulin-like domains, one transmembrane domain, followed by a transmembrane domain, and an intracellular kinase domain consisting of two subdomains, TK1 and TK2.
  • the Flt3 is considered to be an important molecule particularly involved in tumorigenesis and proliferation of hematopoietic cells. Mice knocked out of the Flt3 gene showed the ability to grow into healthy mice. Early hematopoietic cells were deficient, and normal bone marrow cells expressed CD117 strongly, but were restricted to CD34 + cells.
  • One aspect of the present invention is a composition containing a nucleic acid that targets at least one region selected from the group consisting of a region near human membrane, a kinase region, and an ATP binding site region of human Flt3 and can suppress the function of Flt3.
  • a nucleic acid that targets at least one region selected from the group consisting of a region near human membrane, a kinase region, and an ATP binding site region of human Flt3 and can suppress the function of Flt3.
  • Another aspect of the present invention is the following (a) — (c):
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a nucleic acid that targets at least one region selected from the group that is also capable of suppressing the function of Flt3.
  • the "region close to the membrane of human Flt3” refers to, for example, the region of exon 13-14 of the Flt3 gene of a healthy person.
  • the region is a nucleus contained in the composition of the present invention. It is suitable as a target region of an acid (that is, a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3).
  • the “human Flt3 membrane region” includes “a region corresponding to the cDNA base sequence of the human normal Flt3 membrane region”.
  • the “region corresponding to the cDNA base sequence of the human normal Flt3 membrane region” refers to the region corresponding to the cDNA base sequence region of the human normal Flt3 membrane region shown by the base sequence of SEQ ID NO: 27
  • force that is not particularly limited includes the region of the sequence having base addition, substitution, deletion, insertion, etc. in SEQ ID NO: 27.
  • the region of the sequence having the Flt3 / ITD mutation is also included in the composition of the present invention as the “target region of a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3”, that is, Included in “region corresponding to cDNA base sequence of human normal Flt3 near membrane”.
  • the amino acid sequence and cDNA sequence of human normal Flt3 include, for example, the sequence disclosed in Gene Bank Accession Number: NM-004119.
  • the “kinase region of human Flt3” refers to, for example, the exon 15-exon 19 region of the Flt3 gene of a healthy person.
  • the region is suitable as a target region for a nucleic acid (ie, a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3) contained in the composition of the present invention.
  • the “human Flt3 kinase region” includes “a region corresponding to the cDNA base sequence of the normal human Flt3 kinase region”.
  • region corresponding to the cDNA base sequence of the human normal Flt3 kinase region refers to the region corresponding to the cDNA base sequence region of the human normal Flt3 kinase region shown by the base sequence of SEQ ID NO: 28.
  • region of the sequence having base addition, substitution, deletion, insertion and the like in SEQ ID NO: 28 is also included.
  • the “ATP binding site region of human Flt3” refers to, for example, the region of exon 14 to exon 19 of the Flt3 gene of a healthy person.
  • the region is suitable as a target region for a nucleic acid (that is, a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3) contained in the composition of the present invention.
  • the “human Flt3 ATP binding site region” also includes “a region corresponding to the cDNA base sequence of the human normal Flt3 ATP binding site region”.
  • the “region corresponding to the cDNA base sequence of the ATP binding site region of human normal Flt3” refers to the region of the cDNA base sequence of the ATP binding region of human normal Flt3 represented by the base sequence of SEQ ID NO: 29.
  • the region of the sequence having base addition, substitution, deletion, insertion, etc. in SEQ ID NO: 29 is also included.
  • the composition of the present invention contains a nucleic acid for suppressing the function of human Flt3, and is selected from the group consisting of the human Flt3 membrane region, the kinase region, and the ATP binding site region.
  • a nucleic acid for suppressing the function of human Flt3 is selected from the group consisting of the human Flt3 membrane region, the kinase region, and the ATP binding site region.
  • the target region may be one type of region or a plurality of types of regions. Therefore, the composition of the present invention can be arbitrarily constructed from the base sequence of the above region according to the examples described later.
  • the RNA interference agent targets the region, it is excellent if the function of Flt3 can be effectively down-regulated. Demonstrate the effect.
  • the phrase "can suppress the function of Flt3” is not particularly limited !, but the expression of the Flt3 gene, the function of the Flt3-derived proliferation signal and the Z or expression or Flt3 It means that protein expression can be suppressed.
  • a powerful concept is that it can suppress transcription of the Flt3 gene, can destabilize the post-transcriptional mRNA, can suppress translation from the Flt3 mRNA, or can be a post-translational amino acid. It also includes the ability to suppress sequence function.
  • “can suppress the function of Flt3” means that proliferation of Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells such as Flt3 high-expressing leukemia cells and Z or Fit 3ZITD mutation-containing leukemia cells. Inhibiting, preferentially inhibiting the proliferation of the cell, inducing apoptosis of the cell, inhibiting the Flt3-derived proliferation signal of the cell, inhibiting the Flt3 protein expression level of the cell, It may be to suppress the expression level of the Flt3 gene in the cell.
  • the nucleic acid “which can suppress the function of Flt3” is not particularly limited, and siRNA is exemplified.
  • Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells such as Flt3 high-expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancerous cells, and further, for example, Flt3-high It exhibits an excellent effect that it can preferentially suppress the proliferation of expressed leukemia cells and leukemia cells containing Z or Flt3ZlTD mutation.
  • the composition is a human Flt3 near-membrane region, kinase.
  • Flt3 is selected because it targets at least one region selected from the group consisting of a lyase region and an ATP binding site region, or at least one region of (a)-(c) above. Events based on mutations in the coding nucleic acid can be suppressed.
  • Flt3 highly expressing cells refers to cells that highly express Flt3 mRNA, cells that have an increased Flt3-derived proliferation signal, cells that highly express Flt3 protein, and the like. Both are included.
  • Flt3 high-expressing cancerous cell means a cancerous cell in which Flt3 mRNA is highly expressed, a cancerous cell in which Flt3-derived proliferation signal is increased, or a cancerous cell in which Flt3 protein is highly expressed Etc. are included.
  • leukemia cells with high expression of Flt3 include leukemia cells with high expression of Flt3 mRNA, leukemia cells with increased Flt3-derived proliferation signal, leukemia cells with high expression of Flt3 protein, etc. It is.
  • the "Flt3 / lTD mutation-containing cell” refers to a cell having tandem duplication mutation that is not found in a normal person in the exon 14-15 region in the vicinity of the Flt3 membrane, ie, the mRNA derived from the mutation. These include miscellaneous deviations such as cells that are highly expressed, cells that have increased Flt3-derived proliferation signals due to the mutation, and cells that are highly expressed by the mutant Flt3 protein.
  • “Flt3 / lTD mutation-containing cancerous cell” refers to a cancerous cell having tandem duplication mutation that is not found in healthy individuals in the exon 14-15 region of the Flt3 membrane region, that is, the mutation Cancerous cells with high expression of mRNA derived from them, cancerous cells with increased proliferation signals derived from Fit 3 due to the mutation, cancerous cells with high expression of the mutant Flt3 protein, etc. Is included.
  • ⁇ Flt3ZlTD mutation-containing leukemia cells '' refer to leukemia cells that have tandem duplication mutations that are not found in healthy individuals in the exon 14-15 region in the vicinity of the Flt3 membrane, that is, the mRNA derived from the mutation is highly expressed.
  • V leukemia cells, leukemia cells whose Flt3-derived proliferation signal is increased due to the mutation, leukemia cells in which the mutant Flt3 protein is highly expressed, and the like are included.
  • Examples of the "event based on mutation of nucleic acid encoding Flt3" include hematopoietic tumors, specifically leukemia, more specifically acute myeloid leukemia (AML), acute promyelocytic leukemia ( APL), acute lymphocytic leukemia (ALL), myelodysplastic syndrome (MDS), etc. It is done.
  • AML acute myeloid leukemia
  • APL acute promyelocytic leukemia
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • the "nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3" contained in the composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include siRNA for RNA interference.
  • the nucleic acid can be used in mammalian cells. From the viewpoint of suppressing interferon response, for example, those having a chain length of 15-29 bases, preferably those having a chain length of 15-25 base pairs, more preferably those having a chain length of 20-25 base pairs are exemplified. Is done. Further, all of the base sequence of the chain length may be the base sequence of the target region, or a part thereof may be the base sequence of the target region.
  • composition of the present invention has, for example, 3 in the form of double-stranded RNA protruding 2-4 bases on the terminal side, more preferably 3, from the viewpoint of the effectiveness of RNA interference in mammalian cells. It may be in the form of a double-stranded RNA with two bases protruding at the terminal end. Examples of 2-4 bases include TT sequence and TTTT sequence.
  • tandem duplication mutation refers to a mutation in which a base sequence of several tens of nucleotides causes tandem duplication in the region near the membrane of the Flt3 gene.
  • the tandem duplication mutation includes a case where diversity is caused by individual individuals (cases) with respect to the degree of tandem duplication, the tandem duplication sequence, and the like.
  • a nucleic acid corresponding to the base sequence including the tandem duplication mutation region of each individual case can be used.
  • it may be siRNA for RNA interference.
  • the tandem duplication mutation region only cells having the tandem duplication mutation of the Flt3 gene can be allowed to cause RNA interference, and as a result, the function of Flt3 can be suppressed.
  • siRNA for RNA interference
  • siRNA it can be designed by (I) a secondary structure prediction step and (i) a siRNA sequence selection step.
  • the secondary structure of a gene to be suppressed is predicted by a program or the like. It can be done by measuring. From the viewpoint of efficiently generating RNA interference, it is preferable to avoid a place having a strong secondary structure.
  • the secondary structure prediction program is not particularly limited, but can be an MFOLD program (http: ZZbioweb. Pasteur. Fr / seqanal / int erfacesz miola—simple, html).
  • siRNA sequence is not particularly limited as long as it is a sequence of a target region and a sequence of a region corresponding to a nucleotide sequence of a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3.
  • any of the promoter region, the structural gene region, the 5 ′ untranslated region, the 3 ′ untranslated region, and the base sequence around the start codon can be preferably used.
  • the sequence of the target region when selecting the sequence of the target region, two consecutive sequences in the region more than 75 nucleotide residues downstream from the start codon of the sequence in the nucleic acid encoding Flt3, more preferably 1687-2347 nucleotide residues downstream Desirably, the adenylic acid residue, or two adenylic acid residues and one gualic acid residue are used as the sense strand.
  • a sequence consisting of any 13-29 nucleotide residues after two consecutive adenylate residues, more preferably one gualate residue and any 20 A sequence consisting of nucleotide residues or a sequence consisting of one cytidylic acid residue and any 20 nucleotide residues is desirable.
  • the GC content of the sense strand is not particularly limited, but can be 30-70%, more preferably 40-60%.
  • a base sequence homology search is performed at the design stage, and it is specific to the target sequence, that is, the sequence identity to the sequence in the database of known sequences is low, and the target sequence It is desirable to identify sequences that are specific for.
  • the nucleic acid contained in the composition of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of a sequence capable of suppressing the function of Flt3 expressed in mammalian cells, for example, SEQ ID NOs: 1, 4, 7, Three
  • composition of the present invention includes SEQ ID NO: 2 and
  • nucleic acid comprising a combination of the base sequences described in 39 and 40, that is, having a base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a nucleic acid combining a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 3 and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 5 and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 6 Combined nucleic acids,
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 9;
  • a nucleic acid combining a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 33 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 34;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 36 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 37;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 39 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 40;
  • Examples include a composition containing at least one nucleic acid selected from the group of force.
  • the nucleic acid contained in the composition of the present invention is preferably composed of deoxyribonucleotide and Z or ribonucleotide.
  • the nucleic acid is not particularly limited, and may be a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid as long as it has an action of suppressing the function of Flt3.
  • the nucleic acid contained in the composition of the present invention is not particularly limited, but protection of 2, -ACE (2, 1 bis (acetoxymethoxy) 1 methylether) or 2, TBDMS (2'-tbutyldimethylsillyl), etc. It can be synthesized by a chemical synthesis method using a group.
  • the nucleic acid synthesized by a chemical synthesis method is not particularly limited, but may be modified with a chemical modifying group for stabilization or labeling. Modifications that can be used in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include 6-fluorescein addition, piotin addition, 2, -0-methylation, PNA (Peptide Nucleic Acid), and amination.
  • the modifying group may be added to any of the 5 ′ end, 3 ′ end or internal base as long as RNA interference is not inhibited.
  • the function of Flt3 is targeted by targeting at least one region selected from the group consisting of a human Flt3 region near the membrane, a kinase region, and an ATP binding site region.
  • the present invention relates to a composition containing a vector retaining a nucleic acid capable of inhibiting the above.
  • nucleic acid for example, the following (a)-(c):
  • a composition containing a vector that targets a region selected from a powerful group and retains a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 in mammalian cells specifically, for example, SEQ ID NOs: 1, 4
  • a composition containing a vector corresponding to at least one base sequence selected from the group consisting of 7, 32, 35 and 38, and holding a nucleic acid capable of expressing RNA corresponding to the base sequence Specifically, for example, a nucleic acid in which a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 2 and a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 3 are combined,
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 6;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 9;
  • a nucleic acid combining a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 33 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 34;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 36 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 37;
  • a nucleic acid comprising a combination of a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 39 and a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 40;
  • the present invention relates to a composition containing a vector holding a nucleic acid selected from the group consisting of mosquitoes.
  • composition of the present invention at least one region selected from the group consisting of the human Flt3 membrane region, the kinase region, and the ATP binding region region, or the group consisting of the above (a)-(c) Since it contains a vector that targets at least one selected region and can hold and express a nucleic acid that suppresses the function of Flt3, the effect of the nucleic acid is exerted, and the function of Flt3 in the cell A nucleic acid that suppresses Flt3 can be expressed, and an event based on mutation of a nucleic acid encoding Flt3 can be suppressed in the cell.
  • the target region may be one type of region or multiple types of regions.
  • the vector contained in the composition of the present invention is a vector for retaining and expressing a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 in a mammalian cell, and can be expressed efficiently in the cell.
  • the backbone vector is not particularly limited.
  • the vector serving as the backbone is not particularly limited, and examples thereof include plasmid vectors and virus vectors such as adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, and lentivirus vectors.
  • the plasmid vector is not particularly limited.
  • piGENE tRNA plasmid (trade name, manufactured by iGENE), siLentGene (trade name, manufactured by Promega), pSEC Hygro Vector (trade name, Ambion) and the like.
  • adenovirus vector examples include BD Knockout Adenoviral RNAi System (trade name, manufactured by Becton Dickins on).
  • retrovirus vector examples include pSIREN—RetroQ Vector (trade name, manufactured by Becton Dickinson).
  • the promoter used in the vector contained in the yarn composition of the present invention is not particularly limited as long as it can function in mammalian cells.
  • RNA polymerase II promoter, RNA polymerase III Examples include promoters and promoters that can be regulated by tetracycline.
  • the use of a yarn-and-woven specific promoter is advantageous in that it enables the expression of a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 at a desired site, organ, or the like.
  • examples of the RNA polymerase II promoter include CMV promoter.
  • Examples of the RNA polymerase III promoter include tRNA promoter, U6 snRNA promoter, histone HI promoter and the like.
  • Examples of the promoter that can be regulated by tetracycline include tetracycline-regulated U6 promoter and TR promoter.
  • expression can be controlled more precisely.
  • the vector comprises, for example, a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 in (1) step of secondary structure prediction and (II) siRNA sequence selection step to obtain the nucleic acid, It can be constructed by incorporating in a single holdable / expressible manner.
  • RNA interference A tandem type in which a nucleic acid encoding a sense RNA and a nucleic acid encoding an antisense RNA are placed in the forward direction under the control of two promoters, and the sense RNA and the antisense RNA are transcribed separately.
  • the nucleic acid encoding the sense RNA and the nucleic acid encoding the antisense RNA related to the RNA interference agent of the present invention are placed in the opposite directions under the control of one promoter, and the sense RNA and the antisense RNA
  • One RNA is encoded as a stem loop type (or hairpin type) RNA ligated to each NA in a loop, or (C) under the control of a promoter that functions in the sense strand of the vector.
  • a nucleic acid encoding an RNA complementary to the RNA is arranged for controlling the promoter functioning in the antisense strand.
  • Rukoto ⁇ Koyori can be built.
  • RNA interference vector of the present invention is not particularly limited.
  • a tandem type, a stem loop type, and an opposite type are used depending on the reaction conditions, for example, the type of mammalian cell, the type of sense and antisense sequences, etc. It is desirable.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid that can suppress the function of Flt3 in the vector is not particularly limited as long as it is a sequence that exhibits a sequence-specific inhibitory action, for example, an RNAi interference action.
  • RNAi interference action preferably, the following two conditions are used:-The transcription start site should be a purine residue [gualic acid residue (G) or aduric acid residue (A)], and
  • RNA polymerase II promoter when RNA polymerase II promoter is used,
  • a method for producing a vector retaining a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 will be described below in the case of a vector for RNA interference.
  • siRNA sequences are selected for the region near the membrane, the ATP binding region, and the kinase active region as described above, and a vector is constructed so that the siRNA is transcribed.
  • the expression vector used for siRNA transcription that is, the composition of the present invention, a sequence that generates siRNA by transcription is prepared by PCR and inserted downstream of the U6 RNA polymerase promoter (ie, U6 promoter).
  • the composition containing the obtained vector can be transferred to the target mRNA expression cell or co-transfected with the target gene by the Elect Mouth Positioning Method or the Lipofection Method.
  • the composition of the present invention is a composition containing a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 or a vector retaining the nucleic acid, and further combined with a known pharmaceutically acceptable carrier.
  • it may be a pharmaceutical composition such as an injection or an infusion.
  • a composition containing an ingredient for stabilizing the active ingredient or introducing it into cells is also included in the composition of the present invention.
  • the dosage as a pharmaceutical composition is appropriately set according to the preparation form, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptoms of the patient to be administered.
  • the present invention relates to a method for inducing apoptosis, which selectively inhibits the proliferation of leukemia cells with high Flt3 expression and leukemia cells containing Z or Flt3ZlTD mutation and induces apoptosis using the composition of the present invention.
  • the method for inducing apoptosis of the present invention selectively suppresses the proliferation of Flt3 high-expressing cells and Z- or Flt3ZlTD mutation-containing cells with the composition of the present invention, To induce apoptosis of the Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells.
  • the composition of the present invention is used in the apoptosis-inducing method of the present invention
  • Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells such as Flt3 high-expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancers
  • the proliferation of leukemia cells with high Flt3 expression and leukemia cells containing Z or Flt3ZlTD mutation can be preferentially suppressed, and apoptosis of the cells can be induced.
  • the method for inducing apoptosis of the present invention may be further combined with a method using an agent that inhibits kinase.
  • the agent that inhibits the kinase preferably includes an agent that inhibits tyrosin kinase, more preferably an agent that inhibits Flt3 kinase.
  • the agent that inhibits the kinase is not particularly limited.
  • an indocarbazole derivative CEP-701 (manufactured by Cephalon), a quinazoline compound CT53518 (manufactured by Millennium Pharmaceutical), a staurosporine derivative PKC412 (CGP41 251 Indolinone compound SU11248 (manufactured by Sugen), methanone derivatives D-64406, D-65476 (manufactured by ASTA Medica), AG1295 (manufactured by CALBIOCHE M), and the like.
  • any drug that inhibits the kinase is suitable as long as it can selectively suppress the expression of Flt3 kinase and induce apoptosis by a synergistic effect with the composition of the present invention. Can be used.
  • the Flt3 high-expressing cell and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cell for example, Flt3 high-expressing cancerous cell and Z or Flt3ZlTD mutation are used.
  • Introducing into cells containing cancerous cells for example, leukemia cells with high Flt3 expression and leukemia cells with Z or Flt3ZlTD mutation, thereby selectively suppressing the proliferation of the cells, thereby inducing apoptosis of the cells It can be made.
  • High Flt3 expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells specifically Flt3 high expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation containing cancerous cells, more specifically Flt3 high expressing leukemia cells and Z or Flt3ZlTD mutation
  • a known gene transfer method can be used for introducing the composition of the present invention into the leukemia cells.
  • elect mouth position method intra-tissue injection, no, id mouth dynamics method, microin Jection, transfection, lipolysis method, bombardment method using gold particles, calcium phosphate method, DEAE dextran method, method using micelle particles, method using reverse micelle particles, method using low-density lipoprotein, transferrin It can be carried out by a method, a method using atelocollagen, a method using a virus vector such as an adenovirus vector, a lentivirus vector or a retrovirus vector, a method using a membrane-permeable peptide, a method using a membrane-fusible peptide, or the like.
  • the growth of Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells is selectively suppressed by using the other at the same time or after one of them is used. , Apoptosis of the Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells can be induced.
  • Suppression of the growth of Flt3 high-expressing cells and Z- or Flt3ZlTD mutation-containing cells can be evaluated using known gene amplification methods, nucleic acid hybridization methods, methods using antibodies, and the like.
  • RT-PCR method real-time RT-PCR method
  • Northern blot method Western blot method
  • EIA Enzyme immunoassay
  • ELISA immunostaining method
  • Apoptosis of Flt3 highly expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells can be evaluated using known methods. Although not particularly limited, for example, observation of morphological changes of the cells, detection of DNA fragmentation in the cells, detection of leakage of lactate dehydrogenase, etc., TUNEL method, MTT method, ELISA Or by immunostaining.
  • the method for inducing apoptosis of the present invention can induce apoptosis by selectively suppressing proliferation of leukemia patients having leukemia cells with high Flt3 expression and leukemia cells containing Z or Fit 3ZITD mutation. It can also be used as a treatment method for leukemia involving the Flt3 gene.
  • a known method can be used for the therapeutic effect of leukemia. Although not particularly limited, for example, it can be evaluated by confirmation of leukocyte images in bone marrow 'peripheral blood, confirmation of leukocytes by RT-PCR, confirmation by immunostaining, confirmation by ELISA, and the like.
  • Kit for performing the apoptosis induction method In another aspect, the present invention relates to a kit for performing the method for inducing apoptosis.
  • the apoptosis-inducing method can be efficiently performed, and the Flt3 high-expressing cell and the Z- or Flt3ZlTD mutation-containing cell, for example, Preferentially suppresses the proliferation of Flt3-highly expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancerous cells, for example, Flt3-highly expressing leukemia cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing leukemia cells, and induces apoptosis of the cells be able to.
  • the kit of the present invention may further contain a buffer solution for stabilizing the composition of the present invention.
  • the kit of the present invention contains the composition of the present invention as a known gene transfer method, and is not particularly limited.
  • the elect mouth position method, the yarn-and-woven injection method, the no-idrodynamic method, the lipophectamine It may further contain reagents used in the method, microinjection, calcium phosphate method, DEA dextran method and the like.
  • the kit of the present invention may further contain a DNA-dependent RNA polymerase for transferring the nucleic acid from a vector holding a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3.
  • composition or kit of the present invention it is possible to selectively suppress the proliferation of leukemia cells that highly express Flt3 and leukemia cells containing Z or Flt3ZlTD mutation and induce apoptosis.
  • Flt3 high-expressing cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cells specifically Flt3 high-expressing cancerous cells and Z or Flt3ZlTD mutation-containing cancerous cells, more specifically Flt3 high-expressing leukemia cells and Z or
  • a known gene transfer method can be used for introducing the composition of the present invention into the Flt3ZlTD mutation-containing leukemia cells.
  • Examples include, but are not limited to, the erect mouth position method, intra-tissue injection, no, id mouth dynamics method, microinstruction, transfusion, lipofuxion method, bombardment method using gold particles, calcium phosphate method DEAE dextran method, micelle particle method, reverse micelle particle method, low density lipoprotein method, transferrin method, atelocollagen method, adenovirus vector, lentivirus vector , A method using a virus vector such as a retrovirus vector, a method using a membrane-permeable peptide, a method using a membrane-fusible peptide, and the like.
  • compositions containing a nucleic acid capable of inhibiting the function of Flt3 targeting the ATP-binding site region, kinase region (TK region), or near-membrane region of the Flt3 sequence were compared with that of HL-60 cells [Flt 3WT (wild type ) Low expression cells], EoL-1 cells [Flt3WT (wild type) high expression cells] and MV4-11 cells [Flt3ZlTD high expression cells].
  • siRNA used as a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 was designed as shown below, and outsourced to Takara Bio.
  • the target sequence of the ATP binding site region is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sense sequence of siRNA for this target sequence is shown in SEQ ID NO: 2, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the target sequence in the TK region is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the sense sequence of siRNA2 for this target sequence is shown in SEQ ID NO: 5, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the target sequence in the region near the membrane (Flt3ZjMD region) is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the sense sequence of siRNA3 for this target sequence is shown in SEQ ID NO: 8, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 9.
  • HL-60 cells [Flt3WT (wild type) low expression cells; ATCC CCL-240], EoL-1 cells [Flt3WT (wild type) high expression cells; ECACC 94042252] and MV4-11 cells [Flt3 ZITD high expression cells; ATCC CRL - each cell 9591], in 10 vol% ⁇ Shi bovine serum (FBS) and ⁇ Ka ⁇ the RPMI 1640 medium (manufactured by Takara Bio Inc.), 5 volume 0/0 CO presence, 3
  • FBS Shi bovine serum
  • Ka ⁇ the RPMI 1640 medium manufactured by Takara Bio Inc.
  • the cells (2 ⁇ 10 5 cells Zml) were pre-cultured in 6-well plates for 24 hours, the cells were collected, and the cells were optimized to 1.5 ⁇ 10 5 cells Zml.
  • MEM trade name, manufactured by Invitrogen
  • synthesized siRNA was added to the resulting suspension to a final concentration of 200 pmol.
  • Oligofectamin (trade name, manufactured by Invitrogen) Products using 4 ⁇ lZ reaction Name: Transfection was performed according to the Invitrogen protocol attached to Oligofectamin. As a control, the same operation was carried out using siRNA-free additives. In addition, non-specific effects of siRNA were evaluated using siRNA against BCRZABL chimeric mRNA.
  • the target sequence of BCRZABL chimeric mRNA is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the sense sequence of siRNA4 for this target sequence is shown in SEQ ID NO: 11, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • RNA interference of the target gene was performed by measuring changes in the amount of mRNA by real-time RT-PCR as follows.
  • RNA lOOng was used as a saddle type, and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 were used as a primer pair (each 20 pmol), and Real Time One Real-time RT-PCR was performed using Step RNA PCR Kit (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.). In the real-time RT-PCR method, the fluctuation of fluorescence based on SYBER Green 1 (manufactured by Takarabio) was measured by LightCy cler (trade name, manufactured by Roche). The amount of RNA was normalized by measuring GAPDH mRNA in the same manner using the primers described in SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • PCR conditions are as follows: incubation at 95 ° C for 30 seconds followed by 40 cycles of 1 cycle at 95 ° C, 10 seconds at 60 ° C, and 30 seconds at 72 ° C Condition.
  • Flt3 mRNA expression was suppressed by 65% in the Flt3 high-expressing cells regardless of the presence or absence of ITD mutation, and compared to the Flt3 low-expressing cells.
  • Flt3 mRNA expression was selectively suppressed by a relative suppression value of 1.6 times or more.
  • siRNA4 which is not related to Flt3 mRNA, did not suppress Flt3 mRNA expression. Therefore, it was confirmed that there was sequence specificity in suppressing Flt3 mRNA expression.
  • composition of the present invention The effects of the composition of the present invention on cell proliferation and apoptosis were examined.
  • composition of the present invention was the same as in Example 1- (1) above.
  • the proportion of apoptotic cells in the total cells was determined using an apoptosis detection ELISA reagent.
  • Apoptosis was detected by washing the cells after the introduction of siRNA with PBS (phosphate buffered saline) to obtain a cell lysate such as 5 ⁇ 10 3 cells, and the cytoplasmic fraction of the cell lysate.
  • the reaction was performed by performing a sandwich ELISA in which the fraction was reacted with a Piotinich anti-histone antibody and reacted with a peroxidase-labeled anti-DNA antibody. After washing the unbound antibody, ABTS coloring reagent was added, the absorbance at 405 nm was measured, and the relative frequency of apoptosis relative to the control (when transfection was performed without addition of siRNA) was expressed in%.
  • Table 2 shows the effect of various synthetic siRNAs on the proliferation activity of Flt3 mRNA-expressing leukemia cells.
  • a cassette for expressing a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3 is designed to have a BamHI site, a loop site, an RNA PolIII (RNA polymerase III) terminator site and a Hindlll site, and is manufactured by Takarabio It was done.
  • the sense sequence for the ATP binding site region is shown in SEQ ID NO: 17, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • a cassette having the same GC content as the above siRNA was also prepared.
  • the sense sequence is shown in SEQ ID NO: 19, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the sense sequence for the Flt3ZlTD region is shown in SEQ ID NO: 21, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 22.
  • a cassette having the same GC content as the above siRNA was also prepared.
  • the sense sequence is shown in SEQ ID NO: 23, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
  • the obtained synthetic DNA was heated at 90 ° C for 3 minutes. Immediately after that, it is cooled to 37 ° C and incubated for 1 hour with a nucleic acid having a sense sequence and a corresponding nucleic acid having an antisense sequence, followed by annealing to express a nucleic acid capable of suppressing the function of Flt3.
  • a cassette was made.
  • pSilencer 2.1 siRNA Expression Vector Kit Human U 6 Promotor, Hygromysin selection; manufactured by Ambion
  • pSilencer 2.1 siRNA Expression Vector Kit Human U 6 Promotor, Hygromysin selection; manufactured by Ambion
  • the resulting vector using Escherichia coli Combi competent cells (DH5 a, also ⁇ Contact M109) were transformed, 1 ⁇ at 37 ° C, and cultured on Ampicillin-containing LB medium, select the colonies transformed
  • the pSilencer plasmid was purified.
  • the purified plasmid was digested with BamHI and Hindlll, and positive clones were confirmed using the presence of the inserted fragment as an index.
  • the DNA of the positive clone was analyzed using the respective sequencing primers of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 26, and the base sequence of the inserted fragment of the pSilencer plasmid was determined. confirmed.
  • the growth inhibitory activity of MV4-11 (ITD mutation) cells by treatment with a combination of the composition of the present invention (synthetic siRNA3) and Kinase inhibitor was examined.
  • Synthetic siRNA 3 was the same as in Example 1 (1) above.
  • As a Kinase inhibitor AG1295 (CALBIOCHEM) having high specificity for ITD mutant cells was used.
  • RPMI1640 medium manufactured by Takara Bio Inc.
  • FBS fetal bovine serum
  • MV4-11 cells were cultured for 24 hours at 37 ° C in the presence of 5 volume% CO.
  • MV4-11 cells (1 x 10 6 cells Zml) suspended in M (trade name, manufactured by Invitrogen) were transferred to Cuv vet (BIO RAD; gap 4 mm), and siRNA3 was added to the Cuwet at a final concentration of 1. I added it to 2 M.
  • this Cuwet was set in Gene Pulser Xcell (trade name, manufactured by BIO RAD) and then pulsed at an electric field strength of 650 VZcm and 25 msec.
  • the suspension was added to a culture medium 4 times the volume of the cell suspension suspended in Cuwet, and the suspension was dispensed to a 96-well plate at 100 ⁇ l well.
  • siRNA having a C3GFP (Green Fluorescent Protein mutant) sequence (sense sequence: SEQ ID NO: 30, antisense sequence: SEQ ID NO: 31) was used and operated in the same manner. Carried out.
  • siRNA as a nucleic acid targeting the ATP-binding site region, kinase region (TK region) or membrane region of the Flt3 sequence was measured using HL-60 cells (Flt3WT low expression), EoL-1 cells (Flt3WT high expression). ) And MV4-11 cells (high expression of Flt3ZlTD).
  • the siRNA used as the composition of the present invention was also manufactured by Takarabio.
  • the target sequence of the ATP binding site region is shown in SEQ ID NO: 32.
  • the sense sequence of siRNA for this target sequence is shown in SEQ ID NO: 33, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 34.
  • the target sequence of the TK region is shown in SEQ ID NO: 35.
  • the siRNA sense sequence for this target sequence is shown in SEQ ID NO: 36, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 37.
  • the target sequence in the region near the membrane (Flt3 ZJMD region) is shown in SEQ ID NO: 38.
  • the sense sequence of siRNA for this target sequence is shown in SEQ ID NO: 39, and the antisense sequence is shown in SEQ ID NO: 40.
  • the cells were cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • the cells were suspended in Opti-MEM (trade name, manufactured by Invitrogen) so as to be 1.5 x 10 6 cells Zml, and the resulting suspension was Cuwet (manufactured by BIO RAD; gap 4 mm).
  • the siRNA synthesized in the cuwet was added to a final concentration of 1.2 M.
  • this Cuwet was set in Gene Pulser Xcell (trade name, manufactured by BIO RAD), and then pulsed at an electric field strength of 650 VZcm and 25 msec. Next, add to the culture medium 4 times the volume of the cell suspension suspended in Cuwet, suspend and add 100 lZ to the 96-well plate. Dispensed to become a well.
  • Gene Pulser Xcell trade name, manufactured by BIO RAD
  • siRNA having a C3GFP (Green Fluorescent Protein variant) sequence (sense sequence: SEQ ID NO: 30, antisense sequence: SEQ ID NO: 31) was used, and the same operation was performed. Carried out.
  • C3GFP Green Fluorescent Protein variant
  • RNA interference of the target gene was performed based on the amount of mRNA by real-time RT-PCR as follows. That is, synthetic siRNA was transfected into each cell. After 17 hours, total RNA was extracted from the cells using TRIzol TM reagent (Invitrogen). Subsequently, the obtained total RNA was treated with DNasel (Takarano). Transfection, total RNA extraction and DNasel treatment were performed according to the manufacturer's protocol.
  • RNA lOOng obtained was used as a base, and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 were used as a primer pair (each 20 pmol), and Real Time One Real-time RT-PCR was performed using Step RNA PCR Kit (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.). In the real-time RT-PCR method, the fluctuation of fluorescence based on SYBER Green 1 (manufactured by Takarabio) was measured by LightCy cler (trade name, manufactured by Roche). The amount of RNA was normalized by measuring GAPDH mRNA in the same manner using the primers described in SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • PCR conditions are as follows: incubation at 95 ° C for 30 seconds followed by 40 cycles of 1 cycle at 95 ° C, 10 seconds at 60 ° C, and 30 seconds at 72 ° C Condition.
  • the nucleic acid that can suppress the function of Flt3 does not include the TT sequence protruding at the 3 'end, and even the nucleic acid that is a sequence suppresses Flt3 mRNA expressed in cells having ITD mutation, and the ITD mutation However, it was confirmed that it was selectively suppressed as compared with (ie, WT) cells.
  • composition of the present invention growth inhibition activity of MV4-11 (ITD mutation) cells by a cocktail containing synthetic siRNA 1, 2, 3 and siRNA 3 alone was examined.
  • Synthetic siRNAl , 2 and 3 were the same as in Example 1- (1) above.
  • the medium of MV4-11 cells was the same as that in Example 1 1 (2) above, and RPMI1640 medium (Takara Bio Inc.) plus 10% by volume fetal bovine serum (FBS) (hereinafter referred to as culture medium) referred), 5 volume 0/0 CO presence for 24 hours at 37 ° C.
  • RPMI1640 medium Takara Bio Inc.
  • FBS fetal bovine serum
  • culture medium 5 volume 0/0 CO presence for 24 hours at 37 ° C.
  • the NA3 transformation was performed as follows. MV4-11 cells (2 x 10 6 cells Zml) suspended in Opti-MEM (Invitrogen) were transferred to Cuwet (BIO RAD; gap 4 mm), and synthesized siRNAs 1, 2 and 3 etc. A siRNA cocktail containing siRNA 3 and siRNA 3 alone were added to a final concentration of 1.2 M, respectively. Next, this Cuwet was set in Gene Pulser Xcell (manufactured by BIO RAD), and pulsed at an electric field strength of 650 VZcm and 25 msec. Next, the suspension was added to a culture medium of 4 times the amount of cell suspension suspended in Cuwet, and the suspension was dispensed to a 96-well plate at 100 ⁇ l well.
  • siRNA having a C3GFP (Green Fluorescent Protein variant) sequence was similarly manipulated. Carried out.
  • siRNA3 alone was shown to inhibit 46.5% growth.
  • the siRNA cocktail showed very high growth inhibition of 23.0%.
  • a sufficient growth inhibitory effect could be obtained even with siRNA 3 alone, and that a very high growth inhibitory effect could be obtained by using it with a force vector containing siRNA.
  • human Flt3 near-membrane region, kinase region, or ATP binding site region there is provided a composition comprising a nucleic acid capable of targeting a region selected from the above and capable of suppressing the function of Flt3, containing a vector carrying the nucleic acid.
  • the composition can be used in a method for selectively suppressing the proliferation of Flt3 high-expressing cells and Z- or Flt3ZlTD mutation-containing cells and inducing apoptosis.
  • a kit for the method is provided.
  • the composition of the present invention can be used as a therapeutic agent for leukemia patients.
  • SEQ ID NO: 1 is a partial cDNA sequence of the ATP binding site region.
  • SEQ ID NO: 2 is referred to as SEQ1-S.
  • Nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 3 is referred to as SEQ1-AS.
  • Nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 4 is a partial cDNA sequence of TK domain.
  • SEQ ID NO: 5 is referred to as SEQ2—S.
  • Nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 6 is referred to as SEQ2—AS.
  • Nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 7 is a partial cDNA sequence of Flt3ZlTD domain.
  • SEQ ID NO: 8 is referred to as SEQ3—S.
  • Nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 9 is referred to as SEQ3—AS.
  • Nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 10 is a partial cDNA sequence of bcrZabl chimeric domain.
  • nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides, and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides, and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 13 is a PCR primer for amplifying the gene encoding Flt3 Fltl l
  • SEQ ID NO: 14 is a PCR primer Fltl2 R for amplifying a gene encoding Flt3.
  • SEQ ID NO: 15 is a PCR primer G1 for amplifying a gene encoding GAPDH.
  • SEQ ID NO: 16 is PCR primer G2 for amplifying the gene encoding GAPDH.
  • SEQ ID NO: 17 is an expression cassette Flt3SIlF for expressing siRNA against the ATP-binding domain.
  • the region of nucleotides 1-5 is the BamHI restriction enzyme site, the region of nucleotides 26-34 is the loop site, and the region of nucleotides 54-59 is the RNA polymerase III terminator partial position.
  • SEQ ID NO: 18 is an expression cassette Flt3SIlR for expressing siRNA against the ATP-binding domain.
  • the region of nucleotides 1-5 is a Hindlll restriction enzyme site, the region of nucleotides 10-15 is the partial position of the RNA polymerase III terminator, and the region of nucleotides 35-43 is norepe.
  • SEQ ID NO: 19 is an expression cassette Flt3CONlF for the control sequence.
  • the nucleotide 1-5 region is the BamHI restriction enzyme site
  • the nucleotides 26-34 region is the loop site
  • the nucleotides 54-59 region is the RNA polymerase III terminator partial position.
  • SEQ ID NO: 20 is an expression cassette Flt3CONlR for expression of a control sequence.
  • the nucleotide 1-5 region is the Hindlll restriction enzyme site, the nucleotide 10-15 region is the RNA polymerase ⁇ terminator partial position, and the nucleotide 35-43 region is the loop site.
  • SEQ ID NO: 21 is an expression cassette Flt3SI3F for expression of siRNA against the Flt3ZlTD domain.
  • the region of nucleotides 1-5 is the BamHI restriction enzyme site
  • the region of nucleotides 26-34 is the loop site
  • the region of nucleotides 54-59 is the RNA polymerase III terminator site.
  • SEQ ID NO: 22 is an expression cassette Flt3SI3R for expression of siRNA against the Flt3ZlTD domain.
  • the region of nucleotides 1-5 is the Hindlll restriction enzyme site, nucleotide 1
  • the region from 0 to 15 is a part of RNA polymerase ⁇ ⁇ terminator, and the region from nucleotides 35 to 43 is a loop site.
  • SEQ ID NO: 23 is an expression cassette Flt3CON3F for expression of a control sequence.
  • the nucleotide 1-5 region is the BamHI restriction enzyme site
  • the nucleotides 26-34 region is the loop site
  • the nucleotides 54-59 region is the RNA polymerase RNA terminator site.
  • SEQ ID NO: 24 is an expression cassette Flt3CON3R for expression of a control sequence.
  • the region of nucleotides 1-5 is a Hindlll restriction enzyme site, the region of nucleotides 10-15 is the partial position of the RNA polymerase terminator, and the region of nucleotides 35-43 is the loop site.
  • SEQ ID NO: 25 is a 5 'sequencing primer.
  • SEQ ID NO: 26 is a 3 'sequencing primer.
  • SEQ ID NO: 27 is a membrane region domain.
  • SEQ ID NO: 28 is a tyrosine kinase domain.
  • SEQ ID NO: 29 is an ATP-binding domain.
  • nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides, and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides, and the other nucleotides are ribonucleotides.
  • SEQ ID NO: 32 is a partial cDNA sequence of the ATP binding site.
  • SEQ ID NO: 33 is siRNA.
  • SEQ ID NO: 34 is an siRNA.
  • SEQ ID NO: 35 is a partial cDNA sequence of TK domain.
  • SEQ ID NO: 36 is an siRNA.
  • SEQ ID NO: 37 is siRNA.
  • SEQ ID NO: 38 is the partial cDNA sequence of the Flt3ZlTD domain.
  • SEQ ID NO: 39 is siRNA.
  • SEQ ID NO: 40 is an siRNA.

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Abstract

　Ｆｌｔ３の機能を調節する手段を提供すること。ヒトＦｌｔ３の機能を抑制するための組成物、該組成物を用いたアポトーシス誘発方法、該方法のためのキット。                                                                                   

Description

明 細 書
ヒト Fit 3の機能を抑制するための組成物
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト Flt3の機能を抑制するための組成物、該組成物を用いたアポトーシ ス誘発方法、該方法のためのキットに関する。
背景技術
[0002] 白血病の遺伝子治療は、長年にわたって研究されている（例えば、非特許文献 1又 は 2参照)。そして、現実に臨床研究も開始されている（例えば、非特許文献 3又は 4 参照)。さらに、アンチセンス技術ゃリボザィム技術を用いた RNAベースの治療技術 も開発されつつある (例えば、非特許文献 5参照)。
[0003] 一方、 1998年に報告された線虫における RNA干渉 (RNA interference、 RN A i)は、二本鎖 RNAによって配列特異的な mRNA分解が生じることによる遺伝子発現 の抑制現象として注目されて ヽる（例えば、非特許文献 6参照)。前記 RNA干渉は、 長鎖 2本鎖 RNAが、 Dicerと呼ばれる RNaselllタイプの活性により siRNA (short i nterfering RNA)と呼ばれる 21— 25ヌクレオチドの短鎖 RNAに分解され、続いて 、該 siRNAが、 RISC (RNA— induced silencing complex)と呼ばれるリボ核酸 タンパク質複合体に組み込まれ、標的 RNAに ATP依存的に結合し、標的 RNAを分 解するというメカニズムにより起こると考えられている（例えば、非特許文献 7— 12参 照)。その後、哺乳動物細胞でも RNA干渉を応用して遺伝子発現を抑制することが 可能であることが報告されており（例えば、非特許文献 13又は 14参照）、白血病に特 有な BCR— ABLや AML1— MTG8といったキメラ mRNAの発現を抑制する RNA干 渉剤が報告されている (例えば、非特許文献 15又は 16参照)。
[0004] 一方、白血病細胞では、 AML (急性骨髄性白血病、 acute myeloid leukemia )、 ALL (急性リンパ性白血病、 acute lymphocytic leukemia)、 CML (慢性骨 髄性白血病、 chronic myeloid luekemia)等の 70— 100%で正常骨髄細胞に 比べ 1000— 10000倍という Flt3の高発現が観察されることが報告されている（例え ば、非特許文献 17参照)。さらに、 Flt3の膜貫通部直下をコードする膜近傍領域に 縦列重複変異（Flt3ZlTD変異、 ITD : internal tandem duplication)が発見さ れ、 AMLの 20— 30%、 APL (急性前骨髄球性白血病、 acute promyelocytic 1 eukemia、現在の FAB分類においては AML : M3と称する）の 20%、 MDS (骨髄 異形成症候群、 myelodysplastic syndrome)の 5%に検出され、病態や予後不良 の独立した因子である可能性が示唆されている（例えば、特許文献 1又は非特許文 献 18— 21参照)。 Flt3ZlTD変異が存在する場合はリガンド非依存性のキナーゼ 活性ィ匕がおこって 、る。力かる Flt3のキナーゼ活性を阻害する低分子化合物として 、例えば、 CEP—701 (例ぇば、非特許文献 22参照）、 SU11248 (例えば、非特許 文献 23参照）、 SU5416 (例えば、非特許文献 24参照）、 AG1295 (例えば、非特 許文献 25参照)等が研究されているが、医薬品として有効な化合物は未だ得られて いないのが現状である。
特許文献 1：国際公開第 00Z11470号パンフレット
非特許文献 1 : Holt J. T.、他 2名、 Molecular Cellular Biology、第 8卷、第 2 号、 963— 973頁（1988年）
非特許文献 2： Bettinger T. , Read M. L.、 Current Opinion in Molecul ar Therapeutics,第 3卷、第 8号、 116— 124頁（2001年）
非特許文献 3 :Verzeletti S.、他 6名、 Human Gene Therapy、第 9卷、第 15 号、 2243— 2251頁（1998年）
非特許文献 4:Wierda W. G.、 Kipps T. J.、 Seminars in Oncology、第 27卷、第 5号、 502— 511頁（2000年）
非特許文献 5 : Gewirtz A. M.、他 2名、 Blood、第 92卷、第 3号、 712— 736頁 (1998年）
非特許文献 6 :Fire A.、他 5名、 Nature、第 391卷、第 806— 811頁（1998年） 非特許文献 7 : Bernstein E.、他 3名、 Nature、第 409卷、第 6818号、 363— 36 6頁（2001年）
非特許文献 8 :Tuschlt.、他 4名、 Genes and Development、第 13卷、第 24号 、 3191— 3197頁（1999年）
非特許文献 9 :Zamore P. D.、他 3名、 Cell、第 101卷、第 1号、 25— 33頁（200 0年）
非特許文献 10:Nykanen A.、他 2名、 Cell、第 107卷、第 3号、 309— 321頁（20 01年）
非特許文献 ll:Elbashir S. M.、他 2名、 Genes and Development、第 15卷 、第 2号、 188— 200頁（2001年）
非特許文献 12:Lipardi C.、他 2名、 Cell、第 107卷、第 3号、 297— 307頁（200 1年）
非特許文献 13:Elbashir S. M.、他 5名、 Nature,第 411卷、第 6836号、第 49 4一 498頁（2001年）
非特許文献 14:Caplen N. J.、他 4名、 Proc Natl Acad Sci USA、第 98卷 、第 17号、 9742— 9747頁（2001年）
非特許文献 15:Wilda M.、他 3名、 Oncogene,第 21卷、 37号、 5716— 5724頁 (2002年）
非特許文献 16:Heidenreich O.、他 7名、 Blood、第 101卷、第 8号、 3157— 31 63頁（2003年）
非特許文献 17:Drexler H. G.、 Leukemia,第 10卷、第 4号、 588— 599頁（1 996年）
非特許文献 18:Nakao M.、他 8名、 Leukemia、第 10卷、第 21号、 1911一 1918 頁（1996年）
非特許文献 19:Yokota S.、他 10名、 Leukemia、第 11卷、第 10号、 1605— 16 09頁（1997年）
非特許文献 20:Kiyoi H.、他 19名、 Leukemia,第 11卷、 9号、 1447— 1452頁（ 1997年）
非特許文献 21:Gilliland D. G.、 Griffin J. D.、 Blood,第 100卷、第 5号、 1 532— 1542頁（2002年）
非特許文献 22:Levis M.、他 9名、 Blood、第 99卷、第 11号、 3885— 3891頁（2 002年）
非特許文献 23:0，Farrell A. M.、他 14名、 Blood,第 101卷、第 9号、 3597— 3605頁（2003年）
非特許文献 24: Giles F. J.、他 16名、 Blood,第 102卷、第 3号、 795— 801頁（ 2003年）
非特許文献 25 : Levis M.、他 4名、 Blood,第 98卷、第 3号、 885— 887頁（2001 年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の 1つの側面は、 Flt3の機能を抑制すること、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現癌化細胞及び Z又は Flt3ZlTD 変異含有癌化細胞、さらに例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD 変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制する こと、 Flt3遺伝子の発現量を抑制すること、 Flt3をコードする核酸の変異に基づく事 象を抑制すること、 Flt3由来増殖シグナルを抑制すること、 Flt3タンパク質発現量を 抑制すること等の少なくとも 1つを達成しうる、組成物を提供することにある。
[0006] また、本発明の他の側面は、前記組成物による効果を発揮させること、 Flt3高発現 細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現癌化細胞及び Z 又は Flt3ZlTD変異含有癌化細胞、さらに、例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞において、前記組成物中の Flt3の機能を 抑制しうる核酸を発現させること、前記細胞において、 Flt3遺伝子の発現量を抑制 すること、 Flt3をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制すること、 Flt3由来増殖 シグナルを抑制すること、 Flt3タンパク質発現量を抑制すること等の少なくとも 1つを 達成しうる、組成物を提供することにある。
[0007] また、本発明のさらに他の側面は、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含 有細胞、例えば、 Flt3高発現癌化細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌化細胞、 さらに例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞 の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポト 一シスを誘発させること、前記細胞の Flt3由来増殖シグナルを抑制すること、前記細 胞の Flt3タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞の Flt3遺伝子の発現量を抑制 すること等の少なくとも 1つを達成しうる、アポトーシス誘発方法を提供することにある
[0008] さらに、本発明の別の側面は、前記アポトーシス誘発方法を効率よく行なうこと、 Fit 3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現白血病細 胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の 増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞 の Flt3由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞の Flt3タンパク質発現量を抑制 すること、前記細胞の Flt3遺伝子の発現量を抑制すること等の少なくとも 1つを達成 しうる、前記方法のための組成物及びキットを提供することにある。なお、本発明の他 の概念、目的等は、本明細書の記載力もも明らかである。
課題を解決するための手段
[0009] すなわち、本発明は、第 1の側面では、ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び
ATP結合部位領域カゝらなる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3 の機能を抑制しうる核酸を含有した組成物に関する。
[0010] 本発明は、第 2の側面では、下記 (a)—（c)：
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、
(b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
力もなる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる 核酸を含有してなる、組成物に関する。本発明の組成物においては、好ましくは、 15 一 25塩基の鎖長を有する核酸であることが望ましい。特に限定されないが、例えば、 配列番号： 1、 4、 7、 32、 35及び 38からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩基配 列に対応する RNA配列を含有するもの等が挙げられる。さら〖こ、本発明の組成物と しては、例えば、配列番号： 2の塩基配列を有する核酸と配列番号： 3の塩基配列を 有する核酸との組み合わせ、配列番号： 5の塩基配列を有する核酸と配列番号： 6の 塩基配列を有する核酸との組み合わせ、配列番号： 8の塩基配列を有する核酸と配 列番号： 9の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、配列番号： 33の塩基配列を有 する核酸と配列番号： 34の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、配列番号： 36の 塩基配列を有する核酸と配列番号: 37の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、及 び配列番号： 39の塩基配列を有する核酸と配列番号： 40の塩基配列を有する核酸 との組み合わせ、を含有するもの等が挙げられる。
[0011] 本発明は、第 3の側面では、ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合 部位領域カゝらなる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑 制しうる核酸を保持したベクターを含有した組成物に関する。
[0012] 本発明は、第 4の側面では、下記 (a)—（c)：
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、
(b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
力 なる群より選択された領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内で Flt3の機能を抑 制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物に関する。本発明の組成物 中のベクターにおいて、プロモーターとして、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター、 RN Aポリメラーゼ IIプロモーター等のプロモーターを含有していてもよい。また、該ベクタ 一においては、特に限定されないが、例えば、前記プロモーターが、 U6プロモータ 一、 HIプロモーター、 tRNAプロモーター、 CMVプロモーター等であることが望まし い。さらに、該ベクターには、アデノウイルスベクター、レンチウィルスベクター及びレ トロウィルスベクター力も選択されたベクターを基本骨格として好適に使用できる。
[0013] 本発明は、第 5の側面では、本発明の組成物により、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該 Flt3高発現細 胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とす る、アポトーシス誘発方法に関する。本発明のアポトーシス誘発方法においては、キ ナーゼを阻害する薬剤をさらに用いて、同時にあるいは 、ずれか一方の使用後に他 方を使用し、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞の増殖を選択 的に抑制し、それにより、該 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞 のアポトーシスを誘発してもよ！/、。
[0014] 本発明の第 1一第 5の側面において、本発明の組成物は、前記アポトーシス誘発を 効率よく行なうこと、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、例えば 、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞の増殖を抑 制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘 発させること、前記細胞の Flt3由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞の Flt3タ ンパク質発現量を抑制すること、前記細胞の Flt3遺伝子の発現量を抑制すること等 のための糸且成物でもある。
[0015] 本発明は、第 6の側面では、本発明の組成物を含有したキットに関する。力かるキッ トは、前記アポトーシス誘発を効率よく行なうこと、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3 ZITD変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変 異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること 、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞の Flt3由来増殖シグナルを抑 制すること、前記細胞の Flt3タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞の Flt3遺 伝子の発現量を抑制すること等のためのキットとしても用いうる。
[0016] すなわち、本発明の要旨は、
[1] ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部位領域からなる群より 選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を含有して なる、組成物、
[2] 下記 (a)— (c) :
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、
(b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
からなる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる 核酸を含有してなる、組成物、
[3] 15— 25塩基の鎖長を有する核酸を含有してなる、前記 [1]又は [2]記載の組 成物、
[4] 配列番号： 1、 4、 7、 32、 35及び 38からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩 基配列に対応する RNA配列を含有してなる、前記 [ 1]又は [2]記載の組成物、 [5] 配列番号： 2の塩基配列を有する核酸と配列番号： 3の塩基配列を有する核酸 とを組み合わせた核酸、
配列番号： 5の塩基配列を有する核酸と配列番号： 6の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 8の塩基配列を有する核酸と配列番号： 9の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 33の塩基配列を有する核酸と配列番号： 34の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
配列番号： 36の塩基配列を有する核酸と配列番号： 37の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、及び
配列番号： 39の塩基配列を有する核酸と配列番号： 40の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
からなる群より選択された核酸を含有してなる、前記 [1]一 [4]の 、ずれか 1項に記 載の組成物、
[6] ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部位領域からなる群より 選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を保持した ベクターを含有してなる、組成物、
[7] 下記 (a)— (c) :
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、
(b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
からなる群より選択された領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内で Flt3の機能を抑 制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物、
[8] 該核酸が、標的領域の 15— 25塩基の塩基配列を有する、前記 [6]又は [7]記 載の組成物、
[9] 配列番号： 1、 4、 7、 32、 35及び 38からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩 基配列に対応し、かつ該塩基配列に対応する RNAを発現しうる核酸を保持したベタ ターを含有してなる、前記 [6]又は [7]記載の組成物、
[10] 該核酸が、配列番号: 2の塩基配列を有する核酸と配列番号 : 3の塩基配列を 有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号： 5の塩基配列を有する核酸と配列番号： 6の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 8の塩基配列を有する核酸と配列番号： 9の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 33の塩基配列を有する核酸と配列番号： 34の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
配列番号： 36の塩基配列を有する核酸と配列番号： 37の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、及び
配列番号： 39の塩基配列を有する核酸と配列番号： 40の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
からなる群より選ばれた核酸を保持したベクターを含有してなる、前記 [6]— [9]の ヽ ずれ力 1項に記載の組成物、
[11] プロモーターとして、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター又は RNAポリメラーゼ I Iプロモーターを有するベクターを含有してなる、前記 [6]— [10]の!、ずれか 1項に 記載の組成物、
[12] 該プロモーターが、 U6プロモーター、 HIプロモーター、 tRNAプロモーター 及び CMVプロモーター力もなる群より選択されたプロモーターである、前記 [11]記 載の組成物、
[13] アデノウイルスベクター、レンチウィルスベクター及びレトロウイルスベクターか ら選択されたベクターを基本骨格として含有してなる、前記 [6]— [ 12]の 、ずれか 1 項に記載の組成物、
[14] 前記 [1]一 [13]のいずれか 1項に記載の組成物により、 FLT3高発現細胞及 び Z又は FLT3ZITD変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該 FLT 3高発現細胞及び Z又は FLT3ZITD変異含有細胞のアポトーシスを誘発させるこ とを特徴とする、アポトーシス誘発方法、
[15] キナーゼを阻害する薬剤をさらに用いて、同時にあるいはいずれか一方の使 用後に他方を使用し、 FLT3高発現細胞及び Z又は FLT3ZITD変異含有細胞の 増殖を選択的に抑制し、それにより、該 FLT3高発現細胞及び Z又は FLT3ZITD 変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、前記 [ 14]記載の方法、 並びに
[16] 前記 [1]一 [13]のいずれか 1項に記載の組成物を含有してなる、前記 [14] 又は [15]記載の方法を行なうためのキット、
に関する。
発明の効果
本発明により、従来のアンチセンス技術ゃリボザィム技術とは異なる、 Flt3の機能 の抑制に使用できる組成物が提供される。本発明により、前記組成物として化学合 成された核酸 (例えば、 siRNA)ならびにその誘導体を含有する組成物、又は当該 核酸を細胞内で発現するように構築されたベクターを含有する組成物が提供される。 また、本発明の組成物を利用した Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異を有 する細胞で選択的に又は優先的に Flt3の機能を抑制する方法、例えば、アポトーシ ス誘発方法、該方法のためのキットが提供される。本発明の組成物によれば、 Flt3の 機能をダウンレギュレーションし、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有 細胞、例えば、 Flt3高発現癌細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌化細胞、さら に、例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞 の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞の F1 t3由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞の Flt3タンパク質発現量を抑制する こと、前記細胞の Flt3遺伝子の発現量を抑制すること、あるいは Flt3をコードする核 酸の変異に基づく事象を抑制することができるという優れた効果を奏する。また、本 発明の組成物によれば、前記 Flt3の機能を抑制する効果を発揮させ、前記細胞に おいて、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を発現させ、前記細胞において、例えば、 RN A干渉を生じさせ、前記細胞の Flt3遺伝子の発現量を抑制すること、 Flt3をコードす る核酸の変異に基づく事象を抑制することあるいは Flt3タンパク質発現量を抑制す ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のアポトーシス誘発方法に よれば、前記細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させるこ とができるという優れた効果を奏する。また、本発明のキットによれば、前記アポトーシ ス誘発方法を効率よく行なうことができ、前記細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細 胞のアポトーシスを誘発させることができるという優れた効果を奏する。
図面の簡単な説明
[0018] [図 l]siRNA及びキナーゼ阻害剤の併用による、細胞増殖活性の変化に関する図で ある。
[図 2]siRNA発現ベクターを用いた細胞増殖抑制に関する図である。
[図 3]siRNA単独もしくは siRNAカクテルの使用による、細胞増殖活性の変化に関 する図である。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 本発明は、 Flt3 (FMS— like tyrosine kinase 3)の機能をダウンレギュレートす ることで Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞の増殖を優先的に抑 制し、アポトーシスを誘発することができるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。 白血病の予後不良の要因である Flt3の高発現や ITD変異を有する患者の治療は、 骨髄移植法に頼っており、白血病の約 25%つまり全世界で年間数万人の Flt3異常 を有する患者を救命できない状態にあるのが現状であり、したがって、本発明により、 Flt3遺伝子の高発現及び Z又は Flt3ZlTD変異遺伝子の発現を阻害すること、あ る ヽは Flt3タンパク質の発現を制御することにより、白血病細胞の増殖シグナル伝達 の大元を阻害することになり、白血病細胞の増殖を阻害することが期待される。
[0020] 前記 Flt3は、造血細胞の増殖因子である FL (Flt3リガンド）の受容体であり、 KIT( 幹細胞因子受容体）、 Μ— CSF (マクロファージコロニー刺激因子)及び PDGF (血小 板由来増殖因子）を含む Type III receptor tyrosine kinase (TRK)ファミリー に属する膜結合型チロシンキナーゼ受容体のひとつである。前記 Flt3は、 5つの細 胞外ィムノグロブリン様ドメインと 1つの膜貫通ドメインとそれに続く膜近傍ドメインと T K1及び TK2という 2つのサブドメインからなる細胞内キナーゼドメインとから構成され る。前記 Flt3に FLが結合することにより、受容体の 2量体化と受容体キナーゼの活 性ィ匕がおこり、細胞内へのシグナル伝達が開始される。
[0021] また、前記 Flt3は、特に造血細胞の腫瘍化や増殖に関与する重要な分子と考えら れる。 Flt3遺伝子をノックアウトしたマウスは健康なマウスに成長する力 初期造血細 胞の欠乏状態を示し、正常骨髄細胞では CD 117を強発現して 、る CD34 +細胞に 限定されて発現している。
[0022] (1)本発明の組成物
本発明の 1つの側面は、ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部位 領域力 なる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制し うる核酸を含有した組成物に関する。
[0023] 本発明の別の側面は、下記 (a)— (c)：
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、
(b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
力もなる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる 核酸を含有してなる、組成物に関する。
[0024] 本明細書において、「ヒト Flt3の膜近傍領域」とは、例えば、健常人の当該 Flt3遺 伝子のェキソン 13— 14の領域をいう。前記領域は、本発明の組成物に含まれる核 酸 (すなわち、 Flt3の機能を抑制しうる核酸)の標的領域として好適である。また、当 該「ヒト Flt3の膜近傍領域」は、「ヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に 対応する領域」を包含する。前記「ヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列 に対応する領域」とは、配列番号: 27の塩基配列で示されるヒト正常型 Flt3の膜近傍 領域の cDNA塩基配列の領域に対応する領域をいい、例えば、特に限定されない 力 前記配列番号: 27において、塩基の付加、置換、欠失、挿入等を有する配列の 領域も包含する。また、上記膜近傍領域を含むェキソン 14一 15において、 Flt3/IT D変異を有する配列の領域も、本発明の組成物に含まれる「Flt3の機能を抑制しうる 核酸の標的領域」、すなわち、「ヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に 対応する領域」に含まれる。なお、ヒト正常型 Flt3のアミノ酸配列及び cDNA配列に ついては、例えば、ジーンバンクァクセッション番号： NM— 004119に開示された配 列等が例示される。
[0025] 本明細書において、「ヒト Flt3のキナーゼ領域」とは、例えば、健常人の当該 Flt3 遺伝子のェキソン 15—ェキソン 19の領域をいう。前記領域は、本発明の組成物に含 まれる核酸 (すなわち、 Flt3の機能を抑制しうる核酸)の標的領域として好適である。 また、当該「ヒト Flt3のキナーゼ領域」は、「ヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA 塩基配列に対応する領域」を包含する。前記「ヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cD NA塩基配列に対応する領域」とは、配列番号： 28の塩基配列で示されるヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列の領域に対応する領域をいい、例えば、特 に限定されないが、配列番号: 28において、塩基の付加、置換、欠失、挿入等を有 する配列の領域も包含する。
[0026] 本明細書において、「ヒト Flt3の ATP結合部位領域」とは、例えば、健常人の当該 Flt3遺伝子のェキソン 14ーェキソン 19の領域をいう。前記領域は、本発明の組成物 に含まれる核酸 (すなわち、 Flt3の機能を抑制しうる核酸)の標的領域として好適で ある。また、当該「ヒト Flt3の ATP結合部位領域」は、「ヒト正常型 Flt3の ATP結合部 位領域の cDNA塩基配列に対応する領域」をも包含する。前記「ヒト正常型 Flt3の A TP結合部位領域の cDNA塩基配列に対応する領域」とは、配列番号： 29の塩基配 列で示されるヒト正常型 Flt3の ATP結合領域の cDNA塩基配列の領域に対応する 領域をいい、例えば、特に限定されないが、配列番号： 29において、塩基の付加、 置換、欠失、挿入等を有する配列の領域も包含する。
[0027] 本発明の組成物は、ヒト Flt3の機能を抑制するための核酸を含有するものであって 、前記ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部位領域カゝらなる群より 選択された少なくとも 1種の領域、又は前記 (a)— (c)力もなる群より選択された少なく とも 1種の領域を標的領域とすることに 1つの大きな特徴がある。なお、前記標的領域 は、 1種の領域であっても、複数種の領域であってもよい。従って、本発明の組成物 は、上記領域の塩基配列から任意に後述の実施例にそって構築することができる。 また、本発明の組成物によれば、該 RNA干渉剤が前記領域を標的としているもので あるするものであるため、 Flt3の機能を効果的にダウンレギュレーションすることがで きると!ヽぅ優れた効果を発揮する。
[0028] 本明細書にぉ 、て、「Flt3の機能を抑制しうる」とは、特に限定されな!、が、 Flt3遺 伝子の発現、 Flt3由来増殖シグナルの機能及び Z又は発現あるいは Flt3タンパク 質の発現を抑制しうることをいう。いいかえれば、例えば、力かる概念には、 Flt3遺伝 子の転写を抑制しうること、転写後の mRNAを不安定化しうること、 Flt3 mRNAか らの翻訳を抑制しうること、あるいは翻訳後のアミノ酸配列の機能を抑制しうることも含 まれる。また、別の側面では、「Flt3の機能を抑制しうる」とは、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Fit 3ZITD変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に 抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞の Flt3由来増殖 シグナルを抑制すること、前記細胞の Flt3タンパク質発現量を抑制すること、前記細 胞の Flt3遺伝子の発現量を抑制することであってもよ ヽ。上記「Flt3の機能を抑制し うる」核酸としては、特に限定されないが、 siRNAが例示される。
[0029] 従って、本発明の組成物によれば、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異 含有細胞、例えば、 Flt3高発現癌化細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌化細 胞、さらに例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病 細胞の増殖を優先的に抑制することができるという優れた効果を発揮する。さらに、 別の側面では、本発明の組成物によれば、該組成物がヒト Flt3の膜近傍領域、キナ ーゼ領域及び ATP結合部位領域カゝらなる群より選択された少なくとも 1種の領域、又 は前記（a)—（c)の少なくとも 1種の領域を標的としているものであるため、 Flt3をコ ードする核酸の変異に基づく事象を抑制することができる。
[0030] 本明細書において、「Flt3高発現細胞」とは、 Flt3 mRNAが高発現している細胞 、 Flt3由来増殖シグナルが増大している細胞、 Flt3タンパク質が高発現している細 胞等のいずれもが含まれる。また、前記「Flt3高発現癌化細胞」とは、 Flt3 mRNA が高発現している癌化細胞、 Flt3由来増殖シグナルが増大している癌化細胞、 Flt3 タンパク質が高発現している癌化細胞等のいずれもが含まれる。さらに、 Flt3高発現 白血病細胞とは、 Flt3 mRNAが高発現している白血病細胞、 Flt3由来増殖シグ ナルが増大している白血病細胞、 Flt3タンパク質が高発現している白血病細胞等の いずれもが含まれる。
[0031] さらに、「Flt3/lTD変異含有細胞」とは、 Flt3の膜近傍領域のェキソン 14一 15の 領域において健常人にはない縦列重複変異を有する細胞、すなわち、当該変異由 来の mRNAが高発現している細胞、当該変異に起因して Flt3由来増殖シグナルが 増大して!/、る細胞、当該変異 Flt3タンパク質が高発現して 、る細胞等の 、ずれもが 含まれる。また、「Flt3/lTD変異含有癌化細胞」とは、 Flt3の膜近傍領域のェキソ ン 14一 15の領域において健常人にはない縦列重複変異を有する癌化細胞、すな わち、当該変異由来の mRNAが高発現している癌化細胞、当該変異に起因して Fit 3由来増殖シグナルが増大している癌化細胞、当該変異 Flt3タンパク質が高発現し ている癌化細胞等のいずれもが含まれる。さらに、「Flt3ZlTD変異含有白血病細 胞」とは、 Flt3の膜近傍領域のェキソン 14一 15の領域において健常人にはない縦 列重複変異を有する白血病細胞、すなわち、当該変異由来の mRNAが高発現して V、る白血病細胞、当該変異に起因して Flt3由来増殖シグナルが増大して 、る白血 病細胞、当該変異 Flt3タンパク質が高発現している白血病細胞等のいずれもが含ま れる。
[0032] 前記「Flt3をコードする核酸の変異に基づく事象」としては、例えば、造血器腫瘍、 具体的には白血病、さらに具体的には急性骨髄性白血病 (AML)、急性前骨髄性 白血病 (APL)、急性リンパ性白血病 (ALL)、骨髄異形成症候群 (MDS)等が挙げ られる。
[0033] 本発明の組成物に含まれる「Flt3の機能を抑制しうる核酸」としては、特に限定され ないが、 RNA干渉用の siRNAが例示され、当該 siRNAの場合、哺乳動物細胞にお けるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば 15— 29塩基の鎖長を有するもの 、好ましくは 15— 25塩基対の鎖長を有するもの、さらに好ましくは、 20— 25塩基対 の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列の全てが標的領域の 塩基配列であってもよぐその一部が標的領域の塩基配列であってもよい。さらに、 本発明の組成物には、哺乳動物細胞における RNA干渉の有効性の観点から、例え ば、 3，末端側に 2— 4塩基突出した二本鎖 RNAの形状のものさらに好ましくは 3，末 端側に 2塩基突出した二本鎖 RNAの形状のものであっても良い。該に 2— 4塩基とし ては TT配列一 TTTT配列が例示される。
[0034] また、本発明の一態様として、健常人には見られな 、Flt3遺伝子の縦列重複変異 の領域を標的とした核酸を含有する組成物であってもよ ヽ。当該「縦列重複変異」と は、 Flt3遺伝子の膜近傍領域において、数十ヌクレオチドの塩基配列が縦列重複を おこす変異のことをいう。なお、前記縦列重複変異には、縦列重複の度合い、縦列重 複する配列等について、各個体 (症例）による多様性が生じている場合も含まれる。
[0035] すなわち、当該縦列重複変異を標的とする場合、上記個々の症例の縦列重複変 異領域を含む塩基配列に対応する核酸を用いることができる。特に限定されないが、 例えば RNA干渉のための siRNAであってもよ ヽ。当該縦列重複変異領域を用いる ことにより、 Flt3遺伝子の縦列重複変異を有する細胞のみを RNA干渉させることが でき、その結果として Flt3の機能を抑制することができる。
[0036] 本発明の糸且成物によれば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含 有白血病細胞の増殖を選択的に抑制し、該細胞にアポトーシスを誘発させることが できる。
[0037] 以下、本発明の組成物に含まれる「Flt3の機能を抑制しうる核酸」の設計方法につ いて、 RNA干渉用の siRNAを例として説明する。当該 siRNAの場合、（I) 2次構造 予測のステップ、及び (Π) siRNA配列選定のステップにより設計されうる。
[0038] 前記 (I) 2次構造予測は、抑制すべき遺伝子の 2次構造をプログラム等によって予 測することにより行なわれうる。 RNA干渉を効率よく生じさせる観点から、強い 2次構 造をとる箇所は避けることが好ましい。前記 2次構造予測プログラムとしては、特に限 定は無いが、 MFOLDプログラム（http : ZZbioweb. pasteur. fr/seqanal/int erfacesz miola— simple, html) 使用でさる。
[0039] 前記 (Π) siRNA配列選定にぉ 、ては、標的とする領域の配列、 Flt3の機能を抑制 しうる核酸の塩基配列に対応する領域の配列であればよぐ特に限定されないが、例 えば、プロモーター領域、構造遺伝子領域、 5'非翻訳領域、 3'非翻訳領域及び開 始コドン周辺領域の塩基配列のいずれもが好適に使用できる。例えば、標的とする 領域の配列を選定する場合、 Flt3をコードする核酸における配列の開始コドンから 7 5ヌクレオチド残基以上下流、より好ましくは、 1687— 2347ヌクレオチド残基下流の 領域において、 2つの連続したアデニル酸残基、又は 2つのアデニル酸残基と 1つの グァ -ル酸残基とを、センス鎖とすることが望ましい。また、 siRNA配列を作製する場 合、 2つの連続したアデニル酸残基以降の任意の 13— 29ヌクレオチド残基とからな る配列、さらに好ましくは、 1つのグァ -ル酸残基と任意の 20ヌクレオチド残基とから なる配列又は 1つのシチジル酸残基と任意の 20ヌクレオチド残基と力もなる配列であ ることが望ましい。センス鎖の GC含量は、特に限定されないが、 30— 70%、より好ま しくは 40— 60%とすることができる。非特異的作用を防ぐため、好ましくは、設計段 階で塩基配列相同性検索を行ない、標的配列に特異的であること、すなわち、既知 配列のデータベース中の配列に対する配列同一性が低く、標的配列に対して特異 的である配列を確認することが望まし 、。
[0040] 本発明の組成物に含有される核酸は、特に限定されないが、哺乳動物細胞におい て発現した Flt3の機能を抑制しうる配列の観点から、例えば、配列番号： 1、 4、 7、 3
2、 35及び 38からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩基配列に対応する RNA配 列を含有するものが好適である。さらに、本発明の組成物としては、配列番号： 2及び
3、 5及び 6、 8及び 9、 33及び 34、 36及び 37、又は 39及び 40記載の塩基配列の組 み合わせからなる核酸を含有する組成物、すなわち、配列番号： 2の塩基配列を有 する核酸と配列番号： 3の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、 配列番号： 5の塩基配列を有する核酸と配列番号： 6の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 8の塩基配列を有する核酸と配列番号： 9の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 33の塩基配列を有する核酸と配列番号： 34の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
配列番号： 36の塩基配列を有する核酸と配列番号： 37の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、及び
配列番号： 39の塩基配列を有する核酸と配列番号： 40の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
力 なる群より選択された少なくとも 1種の核酸を含有した組成物が例示される。
[0041] 本発明の組成物に含まれる核酸は、好ましくは、デォキシリボヌクレオチド及び Z又 はリボヌクレオチドによって構成されるものが望ましい。また、当該核酸は、特に限定 されないが、 Flt3の機能を抑制する作用を有するものであればよぐ一本鎖核酸であ つてもよく、二本鎖核酸であってもよい。また、本発明の組成物に含まれる核酸は、特 に限定されな 、が、 2， -ACE (2，一 bis (acetoxymethoxy)一 methylether)又は 2， TBDMS (2'— t butyldimethylsillyl)等の保護基を用いた化学合成法により合 成することができる。
[0042] 化学合成法により合成された核酸は、特に限定は無いが、安定化や標識化のため に、化学修飾基により修飾してもよい。本発明に使用できる修飾には特に限定は無 いが、例えば、 6-フルォレセイン付加、ピオチン付加、 2，-0-メチル化、 PNA (Pep tide Nucleic Acid)ィ匕、アミノ化等が挙げられる。当該修飾基は、 RNA干渉作用 を阻害しない限り、 5 '末端、 3 '末端あるいは内部塩基のいずれに付加してもよい。
[0043] 本発明の組成物の別の側面としては、ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部位領域カゝらなる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3 の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有した組成物に関する。
[0044] さらに本発明の別の側面としては、前記核酸、例えば、下記 (a)— (c)：
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、 (b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
力 なる群より選択された領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内で Flt3の機能を抑 制しうる核酸を保持したベクターを含有した組成物、具体的には、例えば、配列番号 : 1、 4、 7、 32、 35及び 38からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩基配列に対応し 、かつ該塩基配列に対応する RNAを発現しうる核酸を保持したベクターを含有した 組成物、さらに具体的には、例えば、配列番号： 2の塩基配列を有する核酸と配列番 号： 3の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号： 5の塩基配列を有する核酸と配列番号： 6の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 8の塩基配列を有する核酸と配列番号： 9の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 33の塩基配列を有する核酸と配列番号： 34の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
配列番号： 36の塩基配列を有する核酸と配列番号： 37の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、及び
配列番号： 39の塩基配列を有する核酸と配列番号： 40の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
カゝらなる群より選ばれた核酸を保持したベクターを含有した組成物に関する。
本発明の組成物によれば、ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部 位領域力 なる群より選択された少なくとも 1種の領域、又は前記 (a)—（c)からなる 群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、かつ Flt3の機能を抑制する核酸を 保持し発現させうるベクターを含有しているため、前記核酸による効果を発揮させ、 前記細胞において、前記 Flt3の機能を抑制する核酸を発現させ、前記細胞におい て、 Flt3をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制することができる。なお、標的 領域は、 1種の領域であってもよぐ複数種の領域であってもよい。 [0046] 本発明の組成物に含まれるベクターは、哺乳動物細胞内で Flt3の機能を抑制しう る核酸を保持'発現させるためのベクターであり、当該細胞内で効率良く発現できる ものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となる ベクターとしては、特に限定はないが、例えば、プラスミドベクターや、例えば、アデノ ウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウィル スベクター等のウィルスベクターが挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、特に 限定されないが、例えば RNA干渉用の核酸を発現させる piGENE tRNAプラスミ ド（商品名、 iGENE社製）、 siLentGene (商品名、 Promega社製）、 pSEC Hygro Vector (商品名、 Ambion社製)等が挙げられる。前記アデノウイルスベクターとし ては、 BD Knockout Adenoviral RNAi System (商品名、 Becton Dickins on社製）が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、 pSIREN— RetroQ Vector (商品名、 Becton Dickinson社製)等が挙げられる。
[0047] 本発明の糸且成物に含有されるベクターに用いるプロモーターとしては、哺乳動物細 胞内で機能しうるものであれば特に限定はなぐ例えば、 RNAポリメラーゼ IIプロモ 一ター、 RNAポリメラーゼ IIIプロモーター、テトラサイクリンで調節可能なプロモータ 一等が挙げられる。また、糸且織特異的プロモーターを用いることにより、所望の部位、 臓器等において Flt3の機能を抑制しうる核酸の発現が可能となる点で有利である。 特に限定は無いが、例えば、前記 RNAポリメラーゼ IIプロモーターとしては、 CMV プロモーター等が挙げられる。また、前記 RNAポリメラーゼ III系プロモーターとして は、 tRNAプロモーター、 U6snRNAプロモーター、ヒストン HIプロモーター等が挙 げられる。前記テトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン調 節型 U6プロモーター、 TRプロモーター等が挙げられる。また、上記プロモーターを Cre— ΙοχΡシステムと組み合わせることにより、より厳密に発現を制御することもできる
[0048] 当該ベクターは、例えば前記 Flt3の機能を抑制しうる核酸を (1) 2次構造予測のス テツプ、及び (II) siRNA配列選定のステップで構築し、当該核酸を得、適切なベクタ 一に保持 ·発現可能に組み込むことにより構築されうる。
[0049] 前記ベクターの構築は、特に限定されな 、が、例えば、 RNA干渉の場合 (A)異な る 2つのプロモーター制御下に、前記核酸に関するセンス RNAをコードする核酸とァ ンチセンス RNAをコードする核酸とをそれぞれ順方向に配置して、別個にセンス RN Aとアンチセンス RNAとを転写するタンデムタイプとして、（B) 1つのプロモーター制 御下に本発明の RNA干渉剤に関するセンス RNAをコードする核酸とアンチセンス R NAをコードする核酸とをそれぞれ逆方向に配置して、センス RNAとアンチセンス R NAとがそれぞれループで連結されたステムループタイプ（又はヘアピンタイプ）の R NAを転写するタイプとして、あるいは、（C)ベクターのセンス鎖にて機能するプロモ 一ター制御下に一方の RNAをコードする核酸を、アンチセンス鎖にて機能するプロ モーター制御化に該 RNAに相補的な RNAをコードする核酸を配置して、それぞれ 別個のプロモーター制御下でそれぞれの RNAを転写する対向タイプとして、構築す ること〖こより行われうる。本発明の RNA干渉ベクターにおいては、特に限定されない 力 好ましくは、反応条件、例えば、哺乳動物細胞の種類、センス配列とアンチセン ス配列の種類等に応じ、タンデムタイプ、ステムループタイプ、対向タイプを使い分け ることが望ましい。
[0050] なお、前記ベクターにお!/、て、 Flt3の機能を抑制しうる核酸の塩基配列は、配列特 異的抑制作用、例えば RNAi干渉作用を示す配列であれば特に限定されないが、 R NAポリメラーゼ IIIプロモーターを用いる場合、好ましくは、以下の 2つの条件： - 転写開始点は、プリン残基〔グァ -ル酸残基 (G)又はァデュル酸残基 (A)〕とする こと、及び
- アンチセンス鎖の 3'末端に連続した 4個のゥラシル残基が付加されるため、転写 開始点の前 2塩基は AAとすること、
を満たすことが望ましい。また、 RNAポリメラーゼ IIプロモーターを用いる場合、好ま しくは、
ステムループタイプにすること、及び
短 、ポリ (A)配列を付加すること
が望ましい。
[0051] 以下に Flt3の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターの作製方法について、 RN A干渉用のベクターの場合について説明する。 [0052] すなわち、 Flt3の場合、例えば膜近傍領域、 ATP結合領域及びキナーゼ活性領 域について、前記のように siRNA配列を選択し、該 siRNAが転写されるようにべクタ 一を構築する。一方、 siRNA転写に用いる発現ベクター、すなわち、本発明の組成 物は、転写により siRNAを生じる配列を PCR法で作製し、 U6 RNAポリメラーゼプ 口モーター（すなわち、 U6プロモーター）の下流に挿入して、発現カセットを作製し、 得られた発現カセットを適切なベクターの骨格に連結すること、あるいは、転写により siRNAを生じる DNAをィ匕学合成し、制限酵素の認識配列のタグを付加し、得られた 産物を、ベクターに挿入することにより得られうる。次に、得られたベクターを含む組 成物を、エレクト口ポレーシヨン法ゃリポフエクシヨン法によって、目的 mRNA発現細 胞にトランスフエクシヨンすること、又は標的遺伝子を共トランスフエクシヨンすることで
、目的 mRNAの発現抑制をスクリーニングする。一方、細胞へのトランスフエクシヨン 効率を改善する観点からは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウィルスベクター に発現カセットを挿入したベクターが本発明の組成物として利用できる。
[0053] このように本発明の組成物は、 Flt3の機能を抑制しうる核酸又は当該核酸を保持し たベクターを含有する組成物であり、さらに薬学的に許容される公知の担体と組み合 わせて調製することができ、また、その使用目的に応じて製剤化することもできる。例 えば、注射剤、点滴用剤のような医薬組成物としてもよい。さらに、前記有効成分の 安定化や細胞への導入のための成分を含有する組成物も本発明の組成物に包含さ れる。なお、医薬組成物としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及 び投与される患者の年齢、体重、症状に応じて適宜設定される。
[0054] (2)本発明の組成物を用いた Flt3高発現細胞のアポトーシス誘発方法
本発明は、別の側面では、本発明の組成物を用いた Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞の増殖を選択的に抑制し、アポトーシスを 誘発させる、アポトーシス誘発方法に関する。
[0055] 具体的には、本発明のアポトーシス誘発方法は、 1つの実施態様では、本発明の 組成物により、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞の増殖を選択 的に抑制し、それにより、該 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞 のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、アポトーシス誘発方法に関する。 [0056] 本発明のアポトーシス誘発方法は、本発明の組成物が用いられているため、 Flt3 高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現癌化細胞 及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌化細胞、さらに例えば、 Flt3高発現白血病細胞 及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞 のアポトーシスを誘発させることができる。
[0057] また、本発明のアポトーシス誘発方法は、キナーゼを阻害する薬剤を用いる方法を さらに組み合わせてもよい。前記キナーゼを阻害する薬剤としては、好ましくは、チロ シンキナーゼを阻害する薬剤、より好ましくは、 Flt3キナーゼを阻害する薬剤が挙げ られる。前記キナーゼを阻害する薬剤は、特に限定されないが、例えば、インドカル バゾール系誘導体 CEP— 701 (セファロン社製）、キナゾリン系化合物 CT53518 (ミ レニアム ファーマシューティカル社製）、スタウロスポリン誘導体 PKC412 (CGP41 251、ノバルテイス社製）、インドリノン系化合物 SU11248 (スージェン社製）、メタノ ン誘導体 D— 64406、 D— 65476 (ASTAメデイカ社製）、 AG1295 (CALBIOCHE M社製)等が挙げられる。
[0058] すなわち、前記キナーゼを阻害する薬剤は、本発明の組成物との相乗効果により、 Flt3キナーゼの発現を選択的に抑制し、アポトーシスを誘発できるものであれば、い ずれもが好適に使用できる。
[0059] 本発明のアポトーシス誘発方法によれば、具体的には、本発明の組成物を、 Flt3 高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現癌化細胞 及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌化細胞、さらに例えば、 Flt3高発現白血病細胞 及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞に導入し、それにより該細胞の増殖を 選択的に抑制するステップを行ない、それにより、該細胞のアポトーシスを誘発させる ことができる。
[0060] Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、具体的には Flt3高発現 癌化細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌化細胞、より具体的には Flt3高発現 白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞への本発明の組成物の導 入は、公知の遺伝子導入方法を用いることができる。特に限定するものではないが、 例えば、エレクト口ポレーシヨン法、組織内注射、ノ、イド口ダイナミクス法、マイクロイン ジェクシヨン、トランスフエクシヨン、リポフエクシヨン法、金粒子を用いたボンバードメン ト法、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、ミセル粒子を用いる方法、逆ミセル 粒子を用いる方法、低密度リポタンパク質を用いる方法、トランスフェリンを用いる方 法、ァテロコラーゲンを用いる方法、アデノウイルスベクター、レンチウィルスベクター 、レトロウイルスベクターなどのウィルスベクターを用いる方法、膜透過性ペプチドを 用いる方法、膜融合性ペプチドを用いる方法等により行われうる。
[0061] また、前記キナーゼを阻害する薬剤を用いる場合、同時にあるいはいずれか一方 の使用後に他方を使用し、 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞 の増殖を選択的に抑制し、それにより、該 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD 変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることができる。
[0062] Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞の増殖の抑制は、公知の 遺伝子増幅方法、核酸ハイブリダィゼーシヨン法、抗体を用いる方法等を用いて評価 することができる。特に限定するものではないが、例えば、 RT— PCR法、リアルタイム RT— PCR法、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、ェンザィムィムノアッセィ（EI A)、 ELISA、免疫染色法等により行われうる。
[0063] Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞のアポトーシスは、公知の 方法を用いて評価することができる。特に限定するものではないが、例えば、当該細 胞の形態変化の観察、該細胞中における DNA断片化の検出、乳酸脱水素酵素等 の細胞外への漏出の検出、 TUNEL法、 MTT法、 ELISA、免疫染色等により行わ れうる。
[0064] さらに、本発明のアポトーシス誘発方法は、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Fit 3ZITD変異含有白血病細胞を有する白血病患者の当該細胞の増殖を選択的に抑 制し、アポトーシスを誘発させることができ、上記 Flt3遺伝子が関与する白血病の治 療方法としても利用できる。
[0065] 白血病の治療効果は、公知の方法を用いることができる。特に限定するものではな いが、例えば、骨髄'末梢血中の白血球像の確認、白血球の RT— PCR法による確認 、免疫染色による確認、 ELISAによる確認等により評価されうる。
[0066] (3)前記アポトーシス誘発方法を行なうためのキット 本発明は、別の側面では、前記アポトーシス誘発方法を行なうためのキットに関す る。
[0067] 本発明のキットによれば、本発明の組成物を含有しているため、前記アポトーシス 誘発方法を効率よく行なうことができ、前記 Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD 変異含有細胞、例えば、 Flt3高発現癌化細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌 化細胞、さらに例えば、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白 血病細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させることができ る。
[0068] 本発明のキットには、本発明の組成物を安定ィ匕させる緩衝溶液をさらに含有しても よい。また、本発明のキットには、本発明の組成物を、公知の遺伝子導入方法、特に 限定するものではないが、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、糸且織内注射、ノ、イドロダ イナミクス法、リポフエクタミン法、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、 DEA Eデキストラン法等に使用される試薬をさらに含有して 、てもよ 、。
[0069] また、本発明のキットには、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターから当 該核酸を転写させるための DNA依存型 RNAポリメラーゼをさらに含有していてもよ い。
[0070] 本発明の組成物又はキットを用いることにより、 Flt3高発現白血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞の増殖を選択的に抑制し、アポトーシスを誘発させ ることがでさる。
[0071] Flt3高発現細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞、具体的には Flt3高発現 癌化細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有癌化細胞、より具体的には Flt3高発現白 血病細胞及び Z又は Flt3ZlTD変異含有白血病細胞への本発明の組成物の導入 は、公知の遺伝子導入方法を用いることができる。特に限定するものではないが、例 えば、エレクト口ポレーシヨン法、組織内注射、ノ、イド口ダイナミクス法、マイクロインジ 工クシヨン、トランスフエクシヨン、リポフエクシヨン法、金粒子を用いたボンバードメント 法、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、ミセル粒子を用いる方法、逆ミセル 粒子を用いる方法、低密度リポタンパク質を用いる方法、トランスフェリンを用いる方 法、ァテロコラーゲンを用いる方法、アデノウイルスベクター、レンチウィルスベクター 、レトロウイルスベクターなどのウィルスベクターを用いる方法、膜透過性ペプチドを 用いる方法、膜融合性ペプチドを用いる方法等により行われうる。
[0072] 以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲 に何ら限定されるものではな 、。
実施例 1
[0073] (l) Flt3の機能を抑制しうる核酸の合成と選択
Flt3配列の ATP結合部位領域、キナーゼ領域 (TK領域)又は膜近傍領域を標的 とした Flt3の機能を抑制しうる核酸を含有する組成物の有効性を、 HL— 60細胞〔Flt 3WT (野生型)低発現細胞〕、 EoL - 1細胞〔Flt3WT (野生型）高発現細胞〕及び M V4-11細胞〔Flt3ZlTD高発現細胞〕を用いて検討した。
[0074] Flt3の機能を抑制しうる核酸として用いる siRNAは、以下に示す配列を設計し、タ カラバイオ社に製造を委託した。
[0075] ATP結合部位領域の標的配列を配列番号： 1に示す。この標的配列に対する siR NA1のセンス配列を配列番号： 2に、アンチセンス配列を配列番号： 3に示す。 TK領 域の標的配列を配列番号: 4に示す。この標的配列に対する siRNA2のセンス配列 を配列番号： 5に、アンチセンス配列を配列番号: 6に示す。膜近傍領域 (Flt3ZjM D領域）の標的配列を配列番号： 7に示す。この標的配列に対する siRNA3のセンス 配列を配列番号： 8に、アンチセンス配列を配列番号： 9に示す。
[0076] (2)各細胞への遺伝子導入
HL - 60細胞〔Flt3WT (野生型）低発現細胞； ATCC CCL - 240〕、 EoL - 1細胞 [Flt3WT (野生型）高発現細胞； ECACC 94042252]及び MV4 - 11細胞〔Flt3 ZITD高発現細胞; ATCC CRL - 9591〕の各細胞を、 10体積％ ゥシ胎仔血清（ FBS)を添カ卩した RPMI 1640培地（タカラバイオ社製)で、 5体積0 /0 CO存在下、 3
2
7°Cで培養した。
[0077] 次に、細胞（2 X 105細胞 Zml)を、 6ゥエルプレート中で 24時間予め培養し、細胞 を回収し、該細胞を 1. 5 X 105細胞 Zmlとなるように Opti— MEM (商品名、 Invitrog en社製）に懸濁し、得られた懸濁液に、終濃度 200pmolとなるように合成 siRNAを 添加した。 Oligofectamin (商品名、 Invitrogen社製） 4 μ lZ反応を用いて、商品 名： Oligofectaminに添付の Invitrogen社のプロトコールに従ってトランスフエクショ ンを行なった。なお、コントロールとして、 siRN A無添カ卩で同様に操作した。また、 siR NAによる非特異的影響を、 BCRZABLキメラ mRNAに対する siRNAを用いて評 価し 7こ。
[0078] BCRZABLキメラ mRNAの標的配列を配列番号： 10に示す。この標的配列に 対する siRNA4のセンス配列を配列番号： 11に、アンチセンス配列を配列番号： 12 に示す。
[0079] (3)RNA干渉の確認
標的遺伝子の RNA干渉の確認は、以下のように、リアルタイム RT— PCR法による mRNA量の変化を測定することによって行なった。
[0080] Oligofectamin (商品名、 Invitrogen社製）を用いて、合成 siRNAを各細胞にトラ ンスフヱクシヨンした。 24時間後、得られた細胞から、 TRIzol™試薬（Invitrogen社 製)を用いて、全 RNAを抽出し、得られた産物を、 DNasel (タカラバイオ社製）により 処理した。なお、トランスフエクシヨン、全 RNAの抽出及び DNaselによる処理につい て、用いた試薬の製造者のプロトコールに従って行なった。
[0081] 得られた RNA lOOngを铸型とし、配列番号： 13の塩基配列を有するオリゴヌタレ ォチドと配列番号： 14の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマー対 (各 20 pmol)とし、 Real Time One Step RNA PCR Kit (商品名、タカラバイオ社 製）を用いて、リアルタイム RT— PCR法を行なった。なお、リアルタイム RT— PCR法に おいては、 SYBER Green 1 (タカラバィォ社製）に基づく蛍光の変動を、 LightCy cler (商品名、 Roche社製）により測定した。配列番号： 15及び 16記載のプライマー を用いて同様に GAPDH mRNAを測定することにより、 RNA量を標準化した。
[0082] PCR条件は、 95°Cで 30秒のインキュベーションの後、 95°Cで 1秒と 60°Cで 10秒と 72°Cで 30秒とを 1サイクルとする 40サイクルの反応を行なう条件とした。
[0083] 各 siRNAによる Flt3 mRNA干渉の結果を以下の表 1に示す。なお、表 1におい て、合成 siRNAを添加せず、トランスフエクシヨンの各操作のみを行なった細胞の相 対 mRNA発現量（Flt3 mRNA/GAPDH mRNA)を 100%とし、合成 siRNAを 用いることにより変化した相対 mRNA発現量（Flt3 mRNA/GAPDH mRNA) の抑制された割合 (％)を算出し、表示した。
[0084] [表 1]
細胞名 s i RNA 1 s i RNA2 s i RNA 3 s i RNA4
MV4-U 65¾ 54% 65% 5%
(ITD変異高発現） (1. 6) (1) (1)
EoLl 41% 5 % 63% 8%
(WT髙発現） (1) * (1) (1)
HL60 31 % 46% 38% 1%
(WT低発現)
* ： EoL 1での RN A干渉効果を 1としたと きの抑制相対比
[0085] 表 1に示されるように、 siRNAlを用いた場合、 ITD変異を有する細胞における Fit 3 mRNA発現を、 siRNAを用いな 、場合の 65%抑制し、 ITD変異がな 、（つまり WT)の細胞の場合の Flt3 mRNA発現の抑制率と比べ、抑制相対値で 1.6倍以 上 Flt3 mRNA発現を選択的に抑制することがわかる。
[0086] 一方、 siRNA3を用いた場合、 ITD変異の有無にかかわらず、 Flt3高発現細胞に おいて、 Flt3 mRNA発現を、 siRNAを用いない場合の 65%抑制し、 Flt3低発現 細胞に比較し、抑制相対値で 1.6倍以上 Flt3 mRNA発現を選択的に抑制するこ とが示された。
[0087] なお、 siRNA2を用いた場合、全ての細胞で Flt3 mRNA発現を抑制し、その効 果は、 siRNAを用いない場合の 50%前後であった。以上のことから、本発明の組成 物は、 Flt3の機能を抑制することができることを確認した。
[0088] 一方、 Flt3 mRNAとは関係ない siRNA4では、 Flt3 mRNA発現の抑制は起こ らな力つた。したがって、 Flt3 mRNA発現の抑制において、配列特異性があること が確認された。
実施例 2
[0089] 本発明の組成物の細胞増殖及びアポトーシスへの影響にっ 、て検討した。
[0090] 本発明の組成物（合成 siRNA 1— 3)は、上記実施例 1—(1)と同様のものを用いた [0091] 2 X 104細胞 Zゥエルの濃度で 96ゥエルプレートに入れた細胞を RPMI培地（10体 積0 /0 FBS含有）で培養した。各種合成 siRNA (各 ΙΟηΜ)でトランスフエクシヨンし、 20時間後、細胞増殖活性を、商品名： Premix WST1試薬（商品名、タカラバイオ 社製）を用いて測定した。コントロール（siRNA無添加でトランスフエクシヨン処理した 場合）の増殖能に比較しての相対増殖能（％)を求めた。なお、実験は、各々 n=3で 実施し、その平均値を求めた。
[0092] また、全細胞中におけるアポトーシス細胞の比率を、アポトーシス検出 ELISA試薬
(Roche社製）を用レ、、添付のプロトコールにしたがって測定した。なお、実験は、各 々n=3で実施し、その平均値を求めた。アポトーシスの検出は、 siRNAを導入した 後の細胞を PBS (リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄し、 5 X 103細胞カゝら細胞ライゼ ートを得、該細胞ライゼートのサイトプラズミック画分をピオチンィヒ抗ヒストン抗体と反 応させ、ペルォキシダーゼ標識抗 DNA抗体と反応させるサンドイッチ ELISAを行な うことにより実施した。非結合抗体を洗浄後、 ABTS発色試薬を添加し、 405nmの吸 光度を測定し、コントロール (siRNA無添加でトランスフエクシヨン処理した場合）に対 するアポトーシスの相対頻度を％で表した。
[0093] 各種合成 siRNAによる Flt3 mRNA発現白血病細胞への増殖活性への影響の 結果を表 2に示す。
[0094] [表 2]
細胞名 s i RNA 1 s i RNA2 Ξ ί RNA3
MV4-11 56. 4% 41. 4% 37. h%
(IT 変異高発現） (0. 49) (0. 36) (0. 41)
EoLl 68. 5% 7：9. 7% 45. 1 %
(WT髙発現） (0. 60) (0. 70) (0. 50)
HL60 1 16 % 1 15% 90. 3%
(WT低発現） (1) * (1) (1)
* ： HL60での RN A千涉効果を 1としたと きの細胞増殖活性比 表 2に示されるように、 siRNAl— 3を用いた場合、各々 Flt3 mRNA高発現細胞 の増殖を選択的に抑制することが確認できた。また、 siRNA3を用いた場合、 ITD変 異の有無に関係なぐ IC50 (50%阻止濃度） ΙΟηΜの濃度で Flt3 mRNA高発 現細胞の増殖を抑制することが確認できた。 [0096] さらに、 siRNAを導入することによって増殖が 60%以下に抑制された細胞では、 4 0%以上の細胞でアポトーシスが起こっていることが確認された。
実施例 3
[0097] Flt3の機能を抑制しうる核酸を発現させるためのカセットは、 BamHIサイト、 loopサ イト、 RNA PolIII (RNAポリメラーゼ III)ターミネータ一サイト及び Hindlllサイトを 有するように設計され、タカラバィォ社により製造された。
[0098] ATP結合部位領域に対するセンス配列を配列番号： 17に、アンチセンス配列を配 列番号： 18に示す。また、対照として、上記 siRNAと GC含量が同じであるカセットも 作製した。センス配列を配列番号： 19に、アンチセンス配列を配列番号： 20に示す。
[0099] Flt3ZlTD領域に対するセンス配列を配列番号： 21に、アンチセンス配列を配列 番号： 22に示す。また、対照として、上記 siRNAと GC含量が同じであるカセットも作 製した。センス配列を配列番号： 23に、アンチセンス配列を配列番号： 24に示す。
[0100] 得られた合成 DNAを、 90°Cで 3分間加熱した。その後、直ちに 37°Cに冷却し、セ ンス配列を有する核酸と対応するアンチセンス配列を有する核酸とを 1時間インキュ ベーシヨンし、アニーリングすることで Flt3の機能を抑制しうる核酸を発現させるため のカセットを作製した。
[0101] 次に商品名： pSilencer 2. 1 siRNA Expression Vector Kit (Human U 6 Promotor、 Hygromysin選択用； Ambion社製）を用いて、製造者のプロトコ一 ルにしたがって、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを構築した。すな わち、前記アニーリングさせた該カセットを、 T4DNAリガーゼを用いて、上記 pSilen cer Vectorに連結させ、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを得た。 得られたベクターを用いて、大腸菌コンビテントセル (DH5 a、又 ίお M109)を形質 転換し、 37°Cで 1晚、 Ampicillin含有 LB培地上で培養し、形質転換されたコロニー を選択し、 pSilencerプラスミドを精製した。なお、精製されたプラスミドを、 BamHIと Hindlllとを用いて消化し、挿入断片の存在を指標として陽性クローンを確認した。ま た、陽性クローンの DNAについて、配列番号： 25に示される塩基配列及び配列番 号： 26に示される塩基配列のそれぞれのシーケンシングプライマーを用いて解析し、 pSilencerプラスミドの挿入断片の塩基配列を確認した。 実施例 4
[0102] (1) Kinase inhibitorとの組み合わせの検討
本発明の組成物（合成 siRNA3)と Kinase inhibitorとの組み合わせによる処理 による MV4— 11 (ITD変異)細胞の増殖阻害活性について検討した。合成 siRNA3 は、上記実施例 1一（1)と同様のものを用いた。 Kinase inhibitorとして、 ITD変異 細胞に対して特異性の高 、AG1295 (CALBIOCHEM社製）を用いた。
[0103] (2)細胞へのトランスフエクシヨン
上記実施例 1— (2)と同様に、 RPMI1640培地 (タカラバイオ社製）に 10体積％ ゥ シ胎仔血清（FBS)を添カ卩して得られた培地（以下、 culture mediumと称す）、 5体 積％ CO存在下、 37°Cで 24時間、 MV4— 11細胞を培養した。ついで、 Opti— ME
2
M (商品名、 Invitrogen社製）で懸濁した MV4— 11細胞（1 X 106細胞 Zml)を Cuv vet (BIO RAD社製；間隙 4mm)に移し、該 Cuwetに、 siRNA3を終濃度 1. 2 Mとなるように添カ卩した。次に、この Cuwetを、 Gene Pulser Xcell (商品名、 BIO RAD社製）にセットした後、電場強度 650VZcm、 25msecで Pulseした。次に、 Cuwetに懸濁した細胞液量の 4倍量の culture medium中に加えて懸濁し、 96ゥ エルプレートに 100 μ 1Ζゥエルとなるように分注した。
[0104] なお、コントロール siRNAとして、 C3GFP (Green Fluorescent Proteinの変異 体）の配列（センス配列：配列番号： 30、アンチセンス配列：配列番号：31)を有する si RNAを用い、同様に操作して実施した。
[0105] (3)AG1295処理
4mM AG1295 (DMSOにて溶解）を、前記 culture mediumにて 10 M、 6 Μ及び 0 μ Μ (0. 25体積％ DMSO)に調製した各濃度の AG1295を、上記（2)で 用意した 96ゥエルプレートに 100 1Zゥエルとなるように添カ卩し、 5体積0 /0 CO
2存在 下、 37°Cで培養した。培養開始後 72時間目、 Premix WST— 1試薬 (商品名、タカ ラバイオ社製)を用い、製造者のプロトコールに従って、細胞の増殖活性を測定した 。なお、実験は各々 n=6で実施し、その平均値を求めた。コントロール siRNAZO M AG1295でトランスフエクシヨンした場合の増殖能に比較した相対増殖率（％)を 求めた。結果を図 1に示す。 [0106] 図 1において、横軸は AG1295濃度 M)、縦軸は相対増殖率（％)を示す。黒棒 はコントロール siRNAを、白棒は siRNA3を用いた場合の結果を示す。
[0107] 図 1に示されるように、 Kinase inhibitor単独での処理により、 MV4— 11 (ITD変 異）細胞の増殖は、コントロール siRNA/0 μ M AG1295でトランスフエクシヨンし た場合と itベ、濃度依存的に、 3. AG1295で 59. 8%、 5. AG 129
5で 84. 3%抑制されることが確認できた。また、 siRNA3単独で用いた場合、細胞の 増殖は、コントロール siRNA/0 μ M AG1295でトランスフエクシヨンした場合と比 ベ、 83. 7%抑制されることが確認できた。
[0108] しカゝしながら、驚くべきことに、 siRNA3と AG1295とを併用すると、細胞の増殖は、 コントロール siRNA/O /z M AG1295でトランスフエクシヨンした場合と比べ、 3. 0 μ Μ AG1295で 94. 5%、 5. AG1295で 99. 7%と 常に高く抑帘 IJするこ とが確認できた。
[0109] このことにより、 siRNA3単独の場合、あるいは当該組成物と AG1295等のレセプ ター型 Kinase阻害剤と併用した場合のいずれにおいても、非常に高い増殖抑制効 果を得ることができることが確認できた。
実施例 5
[0110] ( l) Flt3の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターによる細胞増殖効果
予め 5体積％ CO、 37°Cで培養してお!、た MV4— 11細胞（2 X 106細胞）を Cuw
2
et (BIO RAD社製；間隙 4mm)に移し、該 Cuvvetに、実施例 3で構築した Flt3 ZITD領域を有するベクター 3 g、又はコントロールとして、 Flt3ZlTD領域と GC 含量が同じであるベクター 3 iu gを添カ卩した。次にこのCuvvetを、Gene Pulser Xcell (商品名、 BIO RAD社製）にセットした後、電場強度 650VZcm、 25msec で Pulseした。次に Cuwetに懸濁した細胞液量の 4倍量の culture medium中に 加えて懸濁し、 96ゥエルプレートに 100 μ 1Ζゥヱル分注し、 5体積0 /0 CO存在下、
2
37°Cで細胞を培養した。培養開始 24時間後、細胞の増殖活性を、 Premix WST— 1試薬 (タカラバイオ社製)を用いて、添付の製造者のプロトコールに従 、測定した。 なお、実験は各々 n= 6で実施し、その平均値を求めた。 MV4— 1 1 (ITD変異高発 現)細胞の増殖阻害活性をコントロールの増殖能に比較しての相対増殖率 (％)を求 めた。結果を図 2に示す。
[0111] 図 2に示されるように、 MV4— 11 (ITD変異高発現）細胞の増殖は、コントロールに 比べ、 71. 4%抑制されることが確認できた。従って、前記実施例 1一 4における合成 siRNAと同様に Flt3ZlTD領域を標的とする siRNAにお 、ても、 ITD変異高発現 である MV4— 11を効率よく増殖抑制する効果を得られることが確認できた。
実施例 6
[0112] (1)抗 Flt3 siRNAの合成と選択
Flt3配列の ATP結合部位領域、キナーゼ領域 (TK領域)又は膜近傍領域を標的 とした核酸としての siRNAの有効性を、 HL— 60細胞（Flt3WT低発現）、 EoL— 1細 胞 (Flt3WT高発現)及び MV4— 11細胞 (Flt3ZlTD高発現）を用いて検討した。な お、本発明の組成物として用いる siRNAも、タカラバィォ社で製造した。
本実施例にお 、ては、 3，突出構造を有さな 、dsRNAにつ 、て検討した。
[0113] ATP結合部位領域の標的配列を配列番号： 32に示す。この標的配列に対する siR NAのセンス配列を配列番号： 33に、アンチセンス配列を配列番号： 34に示す。 TK 領域の標的配列を配列番号： 35に示す。この標的配列に対する siRNAのセンス配 列を配列番号: 36に、アンチセンス配列を配列番号 : 37に示す。膜近傍領域 (Flt3 ZJMD領域）の標的配列を配列番号： 38に示す。この標的配列に対する siRNAの センス配列を配列番号： 39に、アンチセンス配列を配列番号： 40に示す。
[0114] (2)各細胞への遺伝子導入
HL - 60細胞、 EoL - 1細胞及び MV4 - 11細胞の各細胞は、 10重量％ ゥシ胎仔 血清 (FBS)を添カ卩した RPMI 1640培地（タカラバイオ社製)で、 5体積0 /0 CO存在
2 下、 37°Cで 24時間培養した。
[0115] 該細胞を 1. 5 X 106細胞 Zmlとなるように Opti— MEM (商品名、 Invitrogen社製 )に懸濁し、得られた懸濁液を Cuwet (BIO RAD社製；間隙 4mm)に移し、該 C uwetに合成した siRNAをそれぞれ終濃度 1. 2 Mとなるように添加した。
[0116] 次に、この Cuwetを Gene Pulser Xcell (商品名、 BIO RAD社製）にセットした 後、電場強度 650VZcm、 25msecで Pulseした。次に、 Cuwetに懸濁した細胞 液量の 4倍量の culture medium中に加えて懸濁し、 96ゥエルプレートに 100 lZ ゥエルとなるように分注した。
[0117] なお、コントロール siRNAとしては C3GFP (Green Fluorescent Proteinの変 異体）の配列（センス配列：配列番号： 30、アンチセンス配列：配列番号：31)を有す る siRNAを用い、同様に操作して実施した。
[0118] (3)RNA干渉の確認
標的遺伝子の RNA干渉の確認は、以下のように、リアルタイム RT— PCR法による mRNA量によって行なった。すなわち、合成 siRNAを各細胞にトランスフエクシヨン した。 17時間後、前記細胞から、 TRIzol™試薬 (Invitrogen社製)を用いて、全 RN Aを抽出した。その後、得られた全 RNAを DNasel (タカラノィォ社製）により処理し た。トランスフエクシヨン、全 RNAの抽出及び DNaselによる処理について、各々、製 造者のプロトコールに従って行なった。
[0119] 得られた RNA lOOngを铸型とし、配列番号： 13の塩基配列を有するオリゴヌタレ ォチドと配列番号： 14の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマー対 (各 20 pmol)とし、 Real Time One Step RNA PCR Kit (商品名、タカラバイオ社 製）を用いて、リアルタイム RT— PCR法を行なった。なお、リアルタイム RT— PCR法に おいては、 SYBER Green 1 (タカラバィォ社製）に基づく蛍光の変動を、 LightCy cler (商品名、 Roche社製）により測定した。配列番号： 15及び 16記載のプライマー を用いて同様に GAPDH mRNAを測定することにより、 RNA量を標準化した。
[0120] PCR条件は、 95°Cで 30秒のインキュベーションの後、 95°Cで 1秒と 60°Cで 10秒と 72°Cで 30秒とを 1サイクルとする 40サイクルの反応を行なう条件とした。
[0121] その結果、 Flt3の機能を抑制しうる核酸において 3'末端に突出している TT配列を 含まな 、配列である核酸でも ITD変異を有する細胞で発現した Flt3 mRNAを抑制 し、 ITD変異がな 、（つまり WT)の細胞と比較して選択的に抑制することが確認でき た。
実施例 7
[0122] (1)合成 siRNAの細胞増殖への影響
本発明の組成物として合成 siRNA 1、 2、 3を含有するカクテル及び siRNA3単独 による MV4— 11 (ITD変異)細胞の増殖阻害活性について検討した。合成 siRNAl 、 2及び 3は上記実施例 1-(1)と同様のものを用いた。
[0123] (2)細胞への Transfection
MV4— 11細胞の培地は上記実施例 1一（2)と同様のものを用い、 RPMI1640培地 (タカラバイオ社製）に 10体積％ 牛胎児血清 (FBS)を加えた培地（以下、 culture mediumと称す）、 5体積0 /0 CO存在下、 37°Cで 24時間培養した。次に合成 siR
2
NA3のトランスフエクシヨンは、以下のように行った。 Opti— MEM (invitrogen社製） で懸濁した MV4— 11細胞（2 X 106細胞 Zml)を Cuwet (BIO RAD社製；間隙 4 mm)に移し、これに合成した siRNAl、 2及び 3を等量モルカ卩えた siRNAカクテル及 び siRNA3単独をそれぞれ終濃度 1. 2 Mとなるよう〖こ添加した。次にこの Cuwet を Gene Pulser Xcell (BIO RAD社製）にセットした後、電場強度 650VZcm、 25msecで Pulseした。次に、 Cuwetに懸濁した細胞液量の 4倍量の culture med ium中に加えて懸濁し、 96ゥエルプレートに 100 μ 1Ζゥエルとなるように分注した。
[0124] なお、コントロール siRNAとしては C3GFP (Green Fluorescent Proteinの変 異体）の配列（センス配列：配列表の配列番号 30、アンチセンス配列：配列表の配列 番号 31)を有する siRNAを同様に操作して実施した。
[0125] (3)細胞増殖測定
上記（2)で用意した 96ゥエルプレートに 100 μ 1Ζゥエルカ卩ぇ 5体積0 /0 CO存在下
2
、 37°Cで培養した。培養開始後 72時間目に細胞の増殖活性を Premix WST— 1試 薬 (タカラバイオ社製)でメーカーのプロトコールに従い測定した。なお、実験は各々 n=6で実施し、その平均値を求めた。コントロール siRNAで Transfectionの増殖 能に比較しての相対増殖率 (％)を求めた。結果を図 3に示す。
[0126] 図 3に示したように、 siRNA3単独では 46. 5%増殖抑制することが示された力 si RNAカクテルでは 23. 0%と非常に高い増殖抑制することが示された。このことにより 、 siRNA3単独でも十分な増殖抑制効果を得ることでき、さらに siRNAを含有する力 クテルで用いることにより非常に高い増殖抑制効果を得ることができることが確認でき た。
産業上の利用可能性
[0127] 本発明により、ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域、あるいは ATP結合部位領域 から選択された領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる核酸ある ヽは該核酸を保持 したベクターを含有してなる、組成物が提供される。当該組成物は、 Flt3高発現細胞 及び Z又は Flt3ZlTD変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、アポトーシスを誘 発させる方法に使用することができる。さらに、当該方法のためのキットが提供される 。本発明の組成物は、白血病患者の治療剤として用いることができる。
配列表フリーテキスト
[0128] 配列番号： 1は、 ATP結合部位領域の部分 cDNA配列である。
[0129] 配列番号： 2は、 SEQ1— Sと称す。ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレオ チド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0130] 配列番号： 3は、 SEQ1— ASと称す。ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレ ォチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0131] 配列番号： 4は、 TKドメインの部分 cDNA配列である。
[0132] 配列番号： 5は、 SEQ2— Sと称す。ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレオ チド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0133] 配列番号： 6は、 SEQ2— ASと称す。ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレ ォチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0134] 配列番号： 7は、 Flt3ZlTDドメインの部分 cDNA配列である。
[0135] 配列番号： 8は、 SEQ3— Sと称す。ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレオ チド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0136] 配列番号： 9は、 SEQ3— ASと称す。ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレ ォチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0137] 配列番号： 10は、 bcrZablキメラドメインの部分 cDNA配列である。
[0138] 配列番号： 11において、ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレオチド、他の ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0139] 配列番号： 12において、ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレオチド、他の ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0140] 配列番号： 13は、 Flt3をコードする遺伝子を増幅するための PCRプライマー Fltl l
Fである。 [0141] 配列番号： 14は、 Flt3をコードする遺伝子を増幅するための PCRプライマー Fltl2 Rである。
[0142] 配列番号： 15は、 GAPDHをコードする遺伝子を増幅するための PCRプライマー G1である。
[0143] 配列番号： 16は、 GAPDHをコードする遺伝子を増幅するための PCRプライマー G2である。
[0144] 配列番号： 17は、 ATP結合ドメインに対する siRNAを発現させるための発現カセッ ト Flt3SIlFである。ヌクレオチド 1—5の領域は、 BamHI制限酵素部位、ヌクレオチド 26— 34の領域は、ループ部位、ヌクレオチド 54— 59の領域は、 RNAポリメラーゼ III ターミネータ一部位である。
[0145] 配列番号： 18は、 ATP結合ドメインに対する siRNAを発現させるための発現カセッ ト Flt3SIlRである。ヌクレオチド 1—5の領域は、 Hindlll制限酵素部位、ヌクレオチド 10— 15の領域は、 RNAポリメラーゼ IIIターミネータ一部位、ヌクレオチド 35— 43の領 域は、ノレープである。
[0146] 配列番号： 19は、コントロール配列のための発現カセット Flt3CONlFである。ヌク レオチド 1—5の領域は、 BamHI制限酵素部位、ヌクレオチド 26— 34の領域は、ルー プ部位、ヌクレオチド 54— 59の領域は、 RNAポリメラーゼ IIIターミネータ一部位であ る。
[0147] 配列番号： 20は、コントロール配列の発現のための発現カセット Flt3CONlRであ る。ヌクレオチド 1—5の領域は、 Hindlll制限酵素部位、ヌクレオチド 10— 15の領域 は、 RNAポリメラーゼ ΠΙターミネータ一部位、ヌクレオチド 35— 43の領域は、ループ 部位である
[0148] 配列番号： 21は、 Flt3ZlTDドメインに対する siRNAの発現のための発現カセット Flt3SI3Fである。ヌクレオチド 1—5の領域は、 BamHI制限酵素部位、ヌクレオチド 2 6— 34の領域は、ループ部位、ヌクレオチド 54— 59の領域は、 RNAポリメラーゼ IIIタ ーミネーター部位である。
[0149] 配列番号： 22は、 Flt3ZlTDドメインに対する siRNAの発現のための発現カセット Flt3SI3Rである。ヌクレオチド 1—5の領域は、 Hindlll制限酵素部位、ヌクレオチド 1 0— 15の領域は、 RNAポリメラーゼ ΠΙターミネータ一部位、ヌクレオチド 35— 43の領 域は、ループ部位である。
[0150] 配列番号： 23は、コントロール配列の発現のための発現カセット Flt3CON3Fであ る。ヌクレオチド 1—5の領域は、 BamHI制限酵素部位、ヌクレオチド 26— 34の領域 は、ループ部位、ヌクレオチド 54— 59の領域は、 RNAポリメラーゼ ΠΙターミネータ一 部位である。
[0151] 配列番号： 24は、コントロール配列の発現のための発現カセット Flt3CON3R で ある。ヌクレオチド 1—5の領域は、 Hindlll制限酵素部位、ヌクレオチド 10— 15の領 域は、 RNAポリメラーゼ ΠΙターミネータ一部位、ヌクレオチド 35— 43の領域は、ルー プ部位である。
[0152] 配列番号： 25は、 5'シーケンシングプライマーである。
[0153] 配列番号： 26は、 3'シーケンシングプライマーである。
[0154] 配列番号： 27は、膜近傍部位ドメインである。
[0155] 配列番号： 28は、チロシンキナーゼドメインである。
[0156] 配列番号： 29は、 ATP結合ドメインである。
[0157] 配列番号： 30において、ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレオチド、他の ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0158] 配列番号： 31において、ヌクレオチド 20及び 21は、デォキシリボヌクレオチド、他の ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
[0159] 配列番号: : 32は、 ATP結合部位の部分 cDNA配列である。
[0160] 配列番号: : 33は、 siRNAである。
[0161] 配列番号: : 34は、 siRNAである。
[0162] 配列番号: : 35は、 TKドメインの部分 cDNA配列である。
[0163] 配列番号: : 36は、 siRNAである。
[0164] 配列番号: : 37は、 siRNAである。
[0165] 配列番号: : 38は、 Flt3ZlTDドメインの部分 cDNA配列である。
[0166] 配列番号: : 39は、 siRNAである。
[0167] 配列番号: :40は、 siRNAである。

Claims

請求の範囲
[1] ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部位領域カゝらなる群より選択 された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を含有してなる 、組成物。
[2] 下記 (a)— (c) :
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、
(b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
力もなる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる 核酸を含有してなる、組成物。
[3] 15— 25塩基の鎖長を有する核酸を含有してなる、請求項 1又は 2記載の組成物。
[4] 配列番号： 1、 4、 7、 32、 35及び 38からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩基配 列に対応する RNA配列を含有してなる、請求項 1又は 2記載の組成物。
[5] 配列番号： 2の塩基配列を有する核酸と配列番号： 3の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
配列番号： 5の塩基配列を有する核酸と配列番号： 6の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 8の塩基配列を有する核酸と配列番号： 9の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 33の塩基配列を有する核酸と配列番号： 34の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
配列番号： 36の塩基配列を有する核酸と配列番号： 37の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、及び
配列番号： 39の塩基配列を有する核酸と配列番号： 40の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、 からなる群より選択された核酸を含有してなる、請求項 1一 4のいずれか 1項に記載の 組成物。
[6] ヒト Flt3の膜近傍領域、キナーゼ領域及び ATP結合部位領域カゝらなる群より選択 された少なくとも 1種の領域を標的とし、 Flt3の機能を抑制しうる核酸を保持したベタ ターを含有してなる、組成物。
[7] 下記 (a)— (c) :
(a)配列番号 : 27記載のヒト正常型 Flt3の膜近傍領域の cDNA塩基配列に対応す る領域、
(b)配列番号： 28記載のヒト正常型 Flt3のキナーゼ領域の cDNA塩基配列に対応 する領域、及び
(c)配列番号： 29記載のヒト正常型 Flt3の ATP結合部位領域の cDNA塩基配列に 対応する領域、
力 なる群より選択された少なくとも 1種の領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内で F1 t3の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物。
[8] 該核酸が、標的領域の 15— 25塩基の塩基配列を有する、請求項 6又は 7記載の 組成物。
[9] 配列番号： 1、 4、 7、 32、 35及び 38からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩基配 列に対応し、かつ該塩基配列に対応する RNAを発現しうる核酸を保持したベクター を含有してなる、請求項 6又は 7記載の組成物。
[10] 該核酸が、配列番号： 2の塩基配列を有する核酸と配列番号： 3の塩基配列を有す る核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号： 5の塩基配列を有する核酸と配列番号： 6の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 8の塩基配列を有する核酸と配列番号： 9の塩基配列を有する核酸とを組 み合わせた核酸、
配列番号： 33の塩基配列を有する核酸と配列番号： 34の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
配列番号： 36の塩基配列を有する核酸と配列番号： 37の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、及び
配列番号： 39の塩基配列を有する核酸と配列番号： 40の塩基配列を有する核酸とを 組み合わせた核酸、
力もなる群より選ばれた核酸を保持したベクターを含有してなる、請求項 6— 9のいず れカ 1項に記載の組成物。
[11] プロモーターとして、 RNAポリメラーゼ ΠΙプロモーター又は RNAポリメラーゼ IIプロ モーターを有するベクターを含有してなる、請求項 6— 10のいずれか 1項に記載の 組成物。
[12] 該プロモーターが、 U6プロモーター、 HIプロモーター、 tRNAプロモーター及び C MVプロモーターからなる群より選択されたプロモーターである、請求項 11記載の組 成物。
[13] アデノウイルスベクター、レンチウィルスベクター及びレトロウイルスベクターから選 択されたベクターを基本骨格として含有してなる、請求項 6— 12のいずれ力 1項に記 載の組成物。
[14] 請求項 1一 13のいずれか 1項に記載の組成物により、 FLT3高発現細胞及び Ζ又 は FLT3ZITD変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該 FLT3高発 現細胞及び Ζ又は FLT3ZITD変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特 徴とする、アポトーシス誘発方法。
[15] キナーゼを阻害する薬剤をさらに用いて、同時に或いはいずれか一方の使用後に 他方を使用し、 FLT3高発現細胞及び Ζ又は FLT3ZITD変異含有細胞の増殖を 選択的に抑制し、それにより、該 FLT3高発現細胞及び Ζ又は FLT3ZITD変異含 有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、請求項 14記載の方法。
[16] 請求項 1一 13のいずれか 1項に記載の組成物を含有してなる、請求項 14又は 15 記載の方法を行なうためのキット。
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