TW200523358A - Composition for inhibiting function of human flt3 - Google Patents

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200523358 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種人類Flt3功能抑制用組合物、使用有該 組合物之細胞凋亡誘導方法以及用以實施該方法之套組。 【先前技術】 長年來一直在研究有關白血病的基因治療（例如，參照非 專利文獻1或2)。並且，亦開始實施致力於現實之臨床研究 (例如，參照非專利文獻3或4)。進而，亦正在開發使用有反 義技術或核酶技術的RNA基礎之治療技術（例如，參照非專 利文獻5)。 另一方面，1998年所報告之線蟲中RNA干擾（RNA interference，RNAi)係作為藉由雙股RNA而產生序列特異性 mRN A分解的基因表現之抑制現象而被世人所矚目（例如， 參照非專利文獻6)。可認為上述RNA干擾係起因於所謂下 述機理：長鏈雙股RNA係藉由稱為Dicer之RNaselll類型之 活性分解為稱為siRNA(short interfering RNA，短鏈干擾 RNA)的21〜25核苷酸之短鏈RNA，接著該siRNA併入稱為 RISC(RNA-induced silencing complex，RNA誘導沉默複合 物）之核糖核酸蛋白質複合體中，ATP依存性結合於標的 RNA中，分解標的RNA(例如，參照非專利文獻7〜12)。其 後，報告有即使哺乳動物細胞中亦可應用RNA干擾，從而 可抑制基因表現之情形（例如，參照非專利文獻13或14)， 又，報告有一種RNA干擾劑，其可抑制所謂白血病特有之 BCR-ABL或AML1-MTG8之嵌合體mRNA表現（例如，參照 96236.doc 200523358 非專利文獻15或16)。 另一方面，報告有於白血病細胞中，以AML(急性骨髓性 白血病、acute myeloid leukemia)、ALL(急性淋巴性白血 病、acute lymphocytic leukemia)、CML(慢性骨髓:性白血 病、chronic myeloid luekemia)等之 70%〜100% 中，可觀察到 所謂1000〜10000倍於正常骨髓細胞的Flt3高表現（例如’參 照非專利文獻17)。進而，於將Flt3之膜貫通部正下方實施 編碼之膜附近區域中，可發現有串聯重複變異（FU3/ITD變 異、ITD ·· internal tandem duplication，内部序列重複性）’ 且可於AML之20〜30%、APL(急性前骨髓球性白血病，acute promyelocytic leukemia，於現今的 FAB 分類中，稱為 AML · M3)之20%、MDS(骨髓成形不良症候群，myelodysplastic syndrome)之5%中得以檢測出，暗示存有係病態或預後不良 之獨立因子的可能性（例如，參照專利文獻1或非專利文獻 18〜21)。存有Flt3/ITD變異之情形時，將會引起配位基非依 存性之激酶活性化。至於阻礙相關Flt3之激酶活性之低分子 化合物，相繼研究有例如CEP-701 (例如，參照非專利文獻 22)、SU11248(例如，參照非專利文獻23)、SU5416(例如’ 參照非專利文獻24)以及AG 1295(例如，參照非專利文獻25) 等，但目前還未獲得有效作為醫藥品之化合物。 [專利文獻1]國際公開第〇〇/11470號小冊子 [非專利文獻 l]Holt J· T.、其他2名、Molecular Cellular Biology、第 8卷、第 2號、963 〜973 頁（1988 年） [非專利文獻 2]Bettinger T·、Read M. 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於本發明之組合物中之載體中，作為啟動子亦可含有 RNA聚合酶III啟動子、RNA聚合酶II啟動子等之啟動子。 又，於該載體中，雖然未加以特別限定，但例如上述啟動 子較好是U6啟動子、H1啟動子、tRNA啟動子以及CMV啟 動子等。進而，於該載體中，較好是使用選自腺病毒載體、 慢病毒載體以及逆轉錄病毒載體的載體作為基本骨架。

本發明之第五方面係關於一種細胞凋亡誘導方法，其特 徵在於：藉由本發明之組合物，選擇性地抑制Flt3高表現細 胞及/或含FU3/ITD變異之細胞之增殖，藉此誘導該FU3高表 現細胞及/或含FU3/ITD變異之細胞之細胞凋亡。於本發明 之細胞凋亡誘導方法中，亦可進而使用阻礙激酶之藥劑， 同時或者使用任一者後再使用另一者，從而選擇性地抑制 Flt3高表現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞之增殖，藉此誘 導該FU3高表現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞之細胞凋 亡。 於本發明之第一至第五方面中，本發明之組合物亦可係 用以實施下述處理者··有效率地實施上述細胞凋亡誘導， 抑制F113高表現細胞及/或含F113 /1T D變異之細胞、例如F113 高表現白血病細胞及/或含FU3/ITD變異之白血病細胞的增 殖，優先抑制上述細胞之增殖，誘導上述細胞之細胞〉周亡， 96236.doc -13- 200523358 抑制上述細胞之源自Flt3之增殖信號，抑制上述細胞之Flt3 蛋白質表現量，以及抑制上述細胞之Flt3基因之表現量等。 本發明之第六方面係關於一種含有本發明之組合物的套 組。相關套組亦可作為用以實施下述處理之套組所使用： 有效率地實施上述細胞凋亡誘導，抑制Flt3高表現細胞及/ 或含Flt3/ITD變異之細胞、例如Flt3高表現白血病細胞及/ 或含Flt3/ITD變異之白血病細胞的增殖，優先抑制上述細胞 之增殖’誘導上述細胞之細胞凋亡，抑制上述細胞之源自 Fit3之增殖信號，抑制上述細胞之Fit3蛋白質表現量，以及 抑制上述細胞之Flt3基因之表現量等。 即’本發明之主旨係關於 [1] 一種組合物，其含有將選自由人類Flt3之膜附近區 域、激區域以及ATP結合部位區域所組成之群的至少一種 區域設為標的且可抑制FU3功能的核酸； [2] —種組合物，其含有將選自由下述區域所組成 之群的至少一種區域設為標的且可抑制Flt3功能的核酸： (a) 對應於序列號：27揭示之人類正常型nt3之膜附近區 域之cDNA驗基序列的區域， (b) 對應於序列號：28揭示之人類正常型Fit3之激酶區域 之cDN A驗基序列的區域’以及 (c) 對應於序列號：29揭示之人類正常型Flt3之ATP結合部 位區域之cDNA鹼基序列的區域； [3] 如上述[1]或[2]之組合物，其中含有具有15〜25個鹼基 鍵長的核酸， 96236.doc -14- 200523358 [4] 如上述[1]或[2]之組合物，其中含有對應於選自由序列 號·· 1、4、7、32、35及3 8所組成之群之至少一種驗基序列 的RNA序列； [5] 如上述[1]至[4]中任一項之組合物，其中含有選自由下 述核酸所組成之群的核酸： 組合具有序列號：2之鹼基序列之核酸與具有序列號：3 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：5之驗基序列之核酸與具有序列號：6 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：8之驗基序列之核酸與具有序列號：9 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：3 3之驗基序列之核酸與具有序列號： 34之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號·· 3 6之驗基序列之核酸與具有序列號： 37之鹼基序列之核酸的核酸，以及 組合具有序列號：3 9之鹼基序列之核酸與具有序列號： 40之鹼基序列之核酸的核酸； [6] —種組合物，其含有保持有核酸之載體，該核酸係將 選自由人類Flt3之膜附近區域、激酶區域以及Ατρ結合部位 區域所組成之群的至少一種區域設為標的且可抑制功 能者； [7] —種組合物，其含有保持有核酸之載體，該核酸係將 選自由下述（a)〜(c)區域所組成之群的區域設為標的，並且 於哺乳動物細胞内可抑制Flt3功能者·· 96236.doc -15- 200523358 (a) 對應於序列號：27揭示之人類正常型nt3之膜附近區 域之cDNA驗基序列的區域， (b) 對應於序列號：28揭示之人類正常型pit3之激酶區域 之cDNA鹼基序列的區域，以及 (c) 對應於序列號：29揭示之人類正常型Fit3之ATP結合部 位區域之cDNA驗基序列的區域； [8] 如上述[6]或[7]之組合物，其中該核酸具有標的區域之 15〜25個鹼基之鹼基序列； [9] 如上述[6]或[7]之組合物，其中含有保持有核酸之載 體’該核酸係對應於選自由序列號：1、4、7、3 2、3 5及3 8 所組成之群的至少一種鹼基序列，並且可表現對應於該鹼 基序列之RNA者； [10] 如上述[6]至[9]中任一項之組合物，其中含有保持有 核酸之載體，該核酸係選自由下述核酸所組成之群者： 組合具有序列號：2之鹼基序列之核酸與具有序列號：3 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：5之驗基序列之核酸與具有序列號：6 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號·· 8之驗基序列之核酸與具有序列號：9 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號·· 3 3之驗基序列之核酸與具有序列夢· 34之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：3 6之驗基序列之核酸與具有序列f · 37之鹼基序列之核酸的核酸，以及 96236.doc -16 - 200523358 組合具有序列號：3 9之驗基序列之核酸與具有序列號： 40之鹼基序列之核酸的核酸； [11] 如上述[6]至[10]中任一項之組合物，其中含有載體， 該載體係具有RNA聚合酶III啟動子或RNA聚合酶II啟動子 作為啟動子； [12] 如上述[11]之組合物，其中該啟動子係選自由U6啟動 子、Η1啟動子、tRNA啟動子以及CMV啟動子所組成之群者； [13] 如上述[6]至[12]中任一項之組合物，其中含有選自腺 病毒載體、慢病毒載體以及逆轉錄病毒載體的載體作為基 本骨架； [14] 一種細胞凋亡誘導方法，其特徵在於··藉由上述π] 至[13]中任一項之組合物，選擇性地抑制FLT3高表現細胞 及/或含FLT3/ITD變異之細胞之增殖，藉此誘導該flT3高表 現細胞及/或含FLT3/ITD變異之細胞之細胞凋亡； [1 5]如上述[14]之方法，其中進而使用阻礙激酶之藥劑， 同時或者使用任一者後再使用另一者，從而選擇性地抑制 FLT3高表現細胞及/或含FLT3/ITD變異之細胞之增殖，藉此 誘導該FLT3高表現細胞及/或含FLT3/ITD變異之細胞之細 胞凋亡；以及 [16]一種套組，其含有如上述[1]至[13]中任一項之組合物 且係用以實施如上述[14]或[15]之方法者。 [發明之效果] 、根據本發明’可提供一種組合物，其與先前之反義技術 或核酶技術有所不同，可使用於抑制Flt3功能。根據本發 96236.doc 200523358 明，可提供一種組合物，其含有作為上述組合物所化學合 成之核酸（例如siRNA)以及其衍生物，或可提供一種組合 物，其含有以於細胞内可表現該核酸之方式所構築之載 體。又，可提供一種方法，例如細胞凋亡誘導方法以及用 以實施該方法之套組，上述方法係於利用有本發明之組合 物且具有Flt3高表現細胞及/或Flt3/ITD變異之細胞中，可選 擇或優先抑制Flt3功能者。藉由本發明之組合物，可達到下 述優良效果：下調Flt3功能；優先抑制Flt3高表現細胞及/ 或含FU3/ITD變異之細胞、例如Flt3高表現癌細胞及/或含 FU3/ITD變異之癌化細胞、進而例如Fh3高表現白血病細胞 及/或含FU3/ITD變異之白血病細胞的增殖；誘導上述細胞 之細胞凋亡；抑制上述細胞之源自Flt3之增殖信號；抑制上 述、、、田I之Fit3蛋白貪表現量；抑制上述細胞之^1〖3基因之表 現量；或抑制依據將Flt3實施編碼之核酸變異的情勢。又， 藉由本發明之組合物，可達成下述優良效果：發揮抑制上 述Flt3功能之效果；於上述細胞中，表現可抑制mu功能之 核酸；於上述細胞中’例如產生腿人干擾，從而抑制上述 細胞之Flt3基因之表現量；#制依據將彻實施編碼之核酸 變異的情勢；或抑細3蛋白質表現量。進而，藉由本發明 之、、、田I凋亡誘導方法，可達成下述優良效果·· 1憂先抑制上 述細胞之增殖、誘導上述細胞之細胞計。又，藉由本發 月之套、&可達成下述優良效果：可有效率地實施上述細 胞〉周亡誘導方法、可優先抑制上述細胞之增殖從而誘導上 述細胞之細胞凋亡。 96236.doc -18 - 200523358 【實施方式】 本發明係基於本發明者們意外地發現：藉由下調 Flt3(FMS-like tyrosine kinase 3，FMS樣酿胺酸激酶3)功 能，可優先抑制Flt3高表現細胞及/或含FU3/ITD變異之細胞 之增殖，且可誘導細胞凋亡。治療具有作為白血病之預後 不良要因之Flt3高表現或ITD變異的患者，目前係依賴於骨 髓移植法，但現狀為無法挽救白血病之大約25%患者即全 世界每年數萬具有Flt3異常的患者，故而藉由本發明，可期 待藉由阻礙Flt3基因之高表現及/或Flt3/ITD變異基因之表 現，或控制Flt3蛋白質之表現，可阻礙傳達白血病細胞之增 殖信號的根本，從而阻礙白血病細胞之增殖。 上述FU3係作為造血細胞之增殖因子的FL(Flt3配位基） 之受體，且係屬於包含KIT(幹細胞因子受體）、M-CSF(巨噬 細胞菌落刺激因子）以及PDGF(血小板源性生長因子）之III 型受體酿胺酸激酶（Type III receptor tyrosine kinase)(TRK) 家族的膜結合型酪胺酸激酶受體之一。上述Flt3係由五個細 胞外免疫球蛋白樣區，一個膜貫通區，連接於其之膜附近 區，以及含有所謂TK1及TK2兩個子區的細胞内激酶區所構 成。藉由於上述FU3中結合有FL，引起受體之二聚化與受 體激酶之活性化，開始將信號傳達至細胞内。 又，可認為上述Flt3係特別有助於造血細胞之腫瘤化或增 殖的重要分子。已經踢除Flt3基因之小老鼠雖然可成長為健 康小老鼠，但顯現出初期造血細胞之缺乏狀態，且於正常 骨髓細胞中限定於可強烈表現CD117之CD34 +細胞而表 96236.doc -19· 200523358 現。 (1)本發明之組合物 本發明之一方面係關於一種組合物，其含有將選自由人 類FU3之膜附近區域、激酶區域以及ATP結合部位區域所組 成之群的至少一種區域設為標的且可抑制Flt3功能的核酸。 本發明另一方面係關於一種組合物，其含有將選自由下 述（a)〜（c)區域所組成之群的至少一種區域設為標的且可抑 制Flt3功能的核酸： (a) 對應於序列號：27揭示之人類正常型Flt3之膜附近區 域之cDNA驗基序列的區域， (b) 對應於序列號：28揭示之人類正常型Fit3之激酶區域 之cDNA驗基序列的區域，以及 (c) 對應於序列號：29揭示之人類正常型pit3之ATP結合部 位區域之cDNA鹼基序列的區域。 於本說明書中，所謂「人類Flt3之膜附近區域」係指例如 健常人之該Flt3基因之外顯子13〜14之區域。上述區域較好 是作為包含於本發明之組合物中的核酸（即，可抑制FU3功 能之核酸）之標的區域。又，該「人類Flt3之膜附近區域」 包含「對應於人類正常型FU3之膜附近區域之cDNA鹼基序 列的區域」。所謂上述「對應於人類正常型Flt3之膜附近區 域之cDNA鹼基序列的區域」係指對應於藉由序列號·· 27之 鹼基序列所示的人類正常型FU3之膜附近區域鹼基 序列區域的區域，雖然未加以特別限定，但亦可包含有例 如於上述序列號·· 27中，具有鹼基之附加、取代、缺失以 96236.doc -20- 200523358 及插入等之序列的區域。又，於包含上述膜附近區域之外 顯子14 15中’具有Flt3/ITE^^異之序列之區域亦包含於本 毛月之、、且α物所包含之「可抑制Flt3功能的核酸之標的區 域」’即對應於人類正常型FU3之膜附近區域之CDNA鹼基 序列的區域」令。再者，關於人類正常型FU3之胺基酸序列 及cDNA序列’例如可例示有揭示於基因庫許可號碼： NM—004119之序列等。 於本說明書中，所謂「人類Flt3之激酶區域」係指例如健 常人之該FU3基因之外顯子15〜外顯子19之區域。上述區域 較好是作為包含於本發明之組合物中的核酸（即，可抑制 Flt3功此之核酸）之標的區域。又，該「人類pm之激酶區域」 包含「對應於人類正常型Flt3之激酶區域之cDNA鹼基序列 的區域」。所明上述「對應於人類正常型F1G之激酶區域之 cDNA驗基序列的區域」係指對應於藉由序列號：28之驗基 序列所不的人類正常型Flt3之激酶區域之cDNA鹼基序列區 域的區域，雖然未加以特別限定，但亦可包含例如於序列 號· 28中，具有鹼基之附加、取代、缺失以及插入等之序 列的區域。 於本說明書中，所謂「人類Flt3之ATP結合部位區域」係 指例如健常人之該Flt3基因之外顯子14〜外顯子19之區域。 上述區域較好是作為包含於本發明之組合物中的核酸 (即可抑制Flt3功能之核酸）之標的區域。又，該「人類mu 之ATP結合部位區域」亦可包含「對應於人類正常型 ATP結合部位區域icDNA鹼基序列的區域」。所謂上述「對 96236.doc -21 - 200523358 應於人類正常型Flt3之ATP結合部位區域之CDNA鹼基序列 的區域」係指對應於藉由序列號：29之鹼基序列所示的人 類正常型Flt3之ATP結合部位區域icDNA.基序列區域的 區域，雖然未加以特別限定，但亦可包含例如於序列號： 29中，具有鹼基之附加、取代、缺失以及插入等之序列的 區域。 本發明之組合物係含有用以抑制人類Flt3功能之核酸 者，且具有下述一個較大特徵··將選自由上述人類Flt3之膜 附近區域、激酶區域以及Ατρ結合部位區域所組成之群的至 少一種區域，或選自由上述（a)〜(c)所組成之群的至少一種 區域設為標的區域。再者，上述標的區域亦可係一種區域， 亦可係複數種區域。故而，本發明之組合物可根據下述實 施例，自上述區域之鹼基序列任意構築。又，藉由本發明 之組合物，由於該RNA干擾劑係可將上述區域設為標的 者，因此可發揮所謂有效下調Flt3功能的優良效果。 於本說明書中，所謂「可抑制Flt3功能」，雖然未加以特 別限定，但係指可抑制FU3基因之表現、源自Flt3之增殖信 號功能及/或表現、或Flt3蛋白質之表現。換言之，例如相 關概念中，亦可包含有下述情形：可抑制FU3基因之轉錄， 使轉錄後之mRNA不穩定化，可抑制自jqt3 mRNA之轉譯， 或可抑制轉譯後之胺基酸序列功能。又，於其他方面中， 所謂「可抑制Flt3功能」亦可係指下述情形：抑制Fh3高表 現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞、例如Flt3高表現白血病 細胞及/或含Flt3/ITD變異之白血病細胞的增殖，優先抑制 96236.doc *22- 200523358 上述細胞之增殖，誘導上述細胞之細胞凋亡，抑制上述細 胞之源自Flt3之增殖信號，抑制上述細胞之Flt3蛋白質表現 量，以及抑制上述細胞之Flt3基因之表現量。至於上述「可 抑制Flt3功能」之核酸，雖然未加以特別限定，但可例示有 siRNA。 故而，藉由本發明之組合物，可發揮下述優良效果··優 先抑制Flt3高表現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞、例如 Flt3高表現癌化細胞及/或含Flt3/ITD變異之癌化細胞、進而 抑制例如Flt3高表現白血病細胞及/或含Flt3/ITD變異之白 血病細胞增殖。進而，於其他方面，根據本發明之組合物， 由於該組合物係將選自由人類Flt3之膜附近區域、激酶區域 及ATP結合部位區域所組成之群的至少一種區域，或選自由 上述（a)〜（c)所組成之群的至少一種區域設為標的，因此可 抑制依據將Flt3實施編碼之核酸變異的情勢。 於本說明書中，所謂「Flt3高表現細胞」可包含高表現有 Flt3 mRNA之細胞、擴增有源自Flt3之增殖信號之細胞、以 及高表現有Flt3蛋白質之細胞等中任何一個。又，所謂上述 「Flt3高表現癌化細胞」可包含高表現有Flt3 mRNA之癌化 細胞、擴增有源自FU3之增殖信號之癌化細胞、以及高表現 有Flt3蛋白質之癌化細胞等中任何一個。進而，所謂Flt3高 表現白血病細胞，可包含高表現有Fit3 mRNA之白血病細 胞、擴增有源自Flt3之增殖信號之白血病細胞、以及高表現 有Flt3蛋白質之白血病細胞等中任何一個。 進而，所謂「含Flt3/ITD變異之細胞」可包含於Flt3之膜 96236.doc -23- 200523358 附近區域之外顯子14〜15區域中，具有健常人所沒有之串聯 重複、交異的細胞，即，高表現有源自該變異之mRN A的細 胞；起因於該變異從而擴增有源自Flt3之增殖信號之細胞； 以及高表現有該變異FU3蛋白質之細胞等中任何一個。又， 所明「含FU3/ITD變異之癌化細胞」可包含於^^3之膜附近 區域之外顯子14〜15區域中，具有健常人所沒有之串聯重複 變異的癌化細胞，即，高表現有源自該變異之mRNA之癌化 細胞；起因於該變異從而擴增有源自Flt3之增殖信號之癌化 細胞；以及高表現有該變異Flt3蛋白質之癌化細胞等中任何 一個。進而，所謂「含FU3/ITD變異之白血病細胞」可包含 於Flt3之膜附近區域之外顯子μ〜15區域中，具有健常人所 沒有之串聯重複變異的白血病細胞，即，高表現有源自該 麦異之mRNA之白血病細胞；起因於該變異從而擴增有源自 Flt3之增殖信號之白血病細胞；以及高表現有該變異？1〖3蛋 白質之白血病細胞等中任何一個。 至於上述「依據將Flt3實施編碼之核酸變異的情勢」，可 列舉例如造血器官腫瘤，具體的是白血病，進而具體的是 急性骨髓性白血病（AML)、急性前骨髓性白血病（ApL)、急 性淋巴性白血病（ALL)以及骨髓成形不良症候群（MDg)等。 至於包含於本發明之組合物中之「可抑制Flt3功能之核 酸」，雖然未加以特別限定，但可例示有用於RNA干擾之 siRNA ’该siRNA之情形時’考慮到於哺乳動物細胞中干擾 素應答抑制的觀點，例如可例示有具有1 5〜29個鹼基之鏈長 者，較好是具有15〜25個鹼基對之鏈長者，尤其好的是具有 96236.doc -24- 200523358 20〜25個驗基對之鏈長者。又，上述鏈長之㈣序列全部亦 可係標的區域之驗基序列，其_部分亦可係標的區域之驗 基序列進而，於本發明之組合物中，考慮到於哺乳動物 細胞中RNA干擾之有效性觀點，亦可係例如於3，末端側突出 有2 4個鹼基的雙股111^八形狀者，尤其好的是於〕，末端側突 出有2们驗基的雙股RNA形狀者。至於該2〜*個驗基，可例 示有TT序列〜TTTT序列。 又，至於本發明之一態樣，亦可係含有核酸之組合物， 忒核fee係將健常人所沒有的串聯重複變異之區域設為標的 者。所謂該「串聯重複變異」，係指於Flt3基因之膜附近區 域中，數十個核苷酸之鹼基序列引起串聯重複的變異之情 形。再者，於上述串聯重複變異中，亦可包含有關於串聯 重複之程度、串聯重複之序列等，產生因各個體（症例）而異 的多樣性之情形。 gP，將該串聯重複變異設為標的之情形時，可使用對應 於包含上述各個症例之串聯重複變異區域之鹼基序列的核 酸。雖然未加以特別限定，但亦可係例如用以實施RNA干 擾之siRNA。藉由使用該串聯重複變異區域，可僅將具有 Flt3基因之串聯重複變異之細胞實施rnA干擾，從而其結果 可抑制FU3功能。 藉由本發明之組合物，可選擇性地抑制Flt3高表現白血病 細胞及/或含Flt3/ITD變異之白血病細胞之增殖，且可於該 細胞中誘導細胞凋亡。 以下，就包含於本發明之組合物中之「可抑制Flt3功能之 96236.doc -25- 200523358 核酸」的設計方法，以用於RNA干擾之siRNA為例加以說 明。該siRNA之情形時，可藉由（I)兩次構造預測之步驟以 及（II)siRNA序列選定之步驟來設計。 上述（I)兩次構造預測可藉由程式等，預測應抑制之基因 之兩次構造而加以實施。考慮到有效率地產生RNA干擾的 觀點，較好是避開獲得較強兩次構造之部位。至於上述兩 次構造預測之程式，雖然未加以特別限定，但可使用MFOLD 程式（http : //bioweb.pasteur.fr/seqanal/ interfaces/mfold_simple.html) 〇 於上述（II)siRNA序列選定中，若係設為標的之區域之序 列，對應於可抑制Flt3功能之核酸之鹼基序列的區域之序列 即可，雖然未加以特別限定，但較好是使用例如啟動子區 域、構造基因區域、5’非轉譯區域、3’非轉譯區域以及開始 密碼子周邊區域之鹼基序列中任何一個。例如，選定設為 標的之區域之序列之情形時，較好是自將Flt3實施編碼之核 酸中的序列之開始密碼子之75核苷酸殘基以上下游，更好 是於1687〜2347核苷酸殘基下游之區域中，將兩個連續之腺 嘌呤核苷酸殘基，或兩個腺嘌呤核苷酸殘基與一個鳥嘌呤 核苷酸殘基設為正義鏈。又，製作siRNA序列之情形時，較 好是包含兩個連續之腺嘌呤核苷酸殘基以後之任意13〜29 個核苷酸殘基的序列，尤其好的是包含一個鳥嘌呤核苷酸 殘基與任意20個核苷酸殘基的序列，或包含一個胞嘧啶核 苷酸殘基與任意20個核苷酸殘基的序列。對於正義鏈之GC 含量雖然位加以特別限定，但可設為30〜70%，更好是設為 40〜60%。為防止非特異性作用，較好是於設計階段中檢索 96236.doc -26- 200523358 鹼基序列之相同性，從而確認標的序列 即，確認對於已知序列之資料庫中之序列的序二=較 低’對於標的序列為特異性之序列。 對於包含於本發明之組合物中之核酸，雖然未加以特別 限定’但考慮到可抑制哺乳動物細胞中所表現之㈣功能之 序列，較好是例如含有對應於選自由序列號^、4、7、32、 35及38所組成之群之至少一種鹼基序列的rna序列者。進 而，至於本發明之組合物，可例示有一種組合物，其含有 包含序列號：2及3、5及6、8及9、33及34、36及37、或39 及40揭示之鹼基序列之組合的核酸，即，其含有選自由下 述核酸所組成之群的至少一種核酸： 組合具有序列號：2之驗基序列之核酸與具有序列號：3 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號·· 5之鹼基序列之核酸與具有序列號：6 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：8之鹼基序列之核酸與具有序列號：9 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：3 3之驗基序列之核酸與具有序列號： 34之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：3 6之驗基序列之核酸與具有序列號： 3 7之鹼基序列之核酸的核酸，以及 組合具有序列號：3 9之驗基序列之核酸與具有序列號： 40之鹼基序列之核酸的核酸。 包含於本發明之組合物中之核酸，較好是包含脫氧核糖 96236.doc -27- 200523358 核《及/或核糖核芽酸者。x ’對於該核酸，雖然未加以 特別限定，但若係具有抑制Flt3功能之作用者即可，亦可係 單股核酸’亦可係雙股核酸。又’對於包含於本發明之組 合物中之核酸，雖然未加以特別限定，但可藉由使用有 2，-ACE(2，·雙（乙醢氧基甲氧基）_甲基⑹或2，_TBDMs(2，·第 三丁基二甲基矽烷基）等之保護基的化學合成法進行合成。 對於藉由化學合成法所合成之核酸，雖然未加以特別限 定，但為達成穩定化或標識化，亦可藉由化學修飾基實施 修飾。對於可使用於本發明之修飾，雖然未加以特別限定， 但可列舉例如6-螢光素附加、生物素附加、2,_〇_甲基化、 PNA(PeptideNucleiC Acid，縮胺酸核酸）化、胺基化等。該 修飾基只要不阻礙RN A干擾作用，即可附加至5,末端、3， 末端或内部鹼基中任何一個。 至於本發明之組合物之其他方面，係關於一種組合物， 其含有保持有核酸之載體’上述核酸係將選自由人類 之膜附近區域、激酶區域以及ATP結合部位區域所組成之群 的至少一種區域設為標的且可抑制FU3功能者。 進而，至於本發明之其他方面，係關於一種組合物，其 含有保持有核酸之載體，上述核酸係將選自例如由下述 (a)〜（c)區域所組成之群的區域設為標的，並且可於哺乳動 物細胞内抑制Flt3功能者： (a) 對應於序列號·· 27揭示之人類正常型Flt3之膜附近區 域之cDNA鹼基序列的區域， (b) 對應於序列號：28揭示之人類正常型Flt3之激酶區域 96236.doc •28- 200523358 之cDNA鹼基序列的區域，以及 (c)對應於序列5虎· 29揭不之人類正常型pit3之ATP结合部 位區域之cDNA鹼基序列的區域； 具體的是，關於一種組合物，其含有保持有核酸之載體， 該核酸係對應於選自例如由序列號：1、4、7、32、35及38 所組成之群的至少一種驗基序列’並且可表現對應於該鹼 基序列之RNA者；進而具體的是，關於一種組合物，其含 有保持有核酸之載體，該核酸係選自例如由不述核酸所組 成之群者； 組合具有序列號：2之驗基序列之核酸與具有序列號：3 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：5之驗基序列之核酸與具有序列號·· $ 之鹼基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號·· 8之驗基序列之核酸與具有序列號：9 之驗基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：3 3之驗基序列之核酸與具有序列號： 3 4之驗基序列之核酸的核酸， 組合具有序列號：3 6之驗基序列之核酸與具有序列號： 3 7之驗基序列之核酸的核酸，以及 組合具有序列號·· 3 9之鹼基序列之核酸與具有序列號： 4 0之驗基序列之核酸的核酸。 藉由本發明之組合物，由於含有保持且表現核酸之載 體，因此可發揮藉由上述核酸所達成之效果，且於上述細 胞中，可表現抑制上述Flt3功能之核酸，且於上述細胞中， 96236.doc -29- 200523358 可抑制依據將Flt3實施編碼之核酸變異的情勢；上述核酸係 將選自由人類Flt3之膜附近區域、激酶區域以及ATP結合部 位區域所組成之群的至少一種區域，或選自由上述（a)〜(c) 所組成之群的至少一種區域設為標的，並且可抑制Flt3功能 者。再者，標的區域亦可係一種區域，亦可係複數種區域。 包含於本發明之組合物中之載體，其係用以於哺乳動物 細胞内保持·表現可抑制Flt3功能的核酸者，若係可於該細 胞内有效率地表現者，則對於成為骨架之載體未加以特別 限定。至於成為上述骨架之載體，雖然未加以特別限定， 但可列舉例如質粒載體，或例如腺病毒載體、腺病毒伴隨 病毒載體、逆轉錄病毒載體以及慢病毒載體等病毒載體。 至於上述質粒載體，雖然未加以特別限定，但可列舉例如 表現用於RNA干擾之核酸的piGENE tRNA質粒（商品名、 iGENE公司製造）、siLentGene(商品名、Promega公司製造）、 pSEC Hygro Vector(商品名、Ambion公司製造）等。至於上 述腺病毒載體，可列舉BD Knockout Adenoviral RNAi System(商品名、Bee ton Dickinson公司製造）。至於逆轉錄 病毒載體，可列舉pSIREN-RetroQ Vector(商品名、Becton Dickinson公司製造）等。 至於包含於本發明之組合物中之載體所使用之啟動子， 若係可於哺乳動物細胞内發揮功能者，則未加以特別限 定，可列舉例如RNA聚合酶II啟動子、RNA聚合酶III啟動 # 子以及藉由四環素可調節之啟動子等。又，藉由使用組織 特異性啟動子，於所期望之部位、器官等中能夠表現可抑 96236.doc -30- 200523358 制Flt3功能之核酸方面較為有利。雖然未加以特別限定，但 至於上述RNA聚合酶II啟動子，可例如列舉CMV啟動子 等。又，至於上述RNA聚合酶III系啟動子，可列舉tRNA啟 動子、U6 snRNA啟動子以及組織蛋白H1啟動子等。至於上 述可藉由四環素調節之啟動子，可列舉四環素調節型U6啟 動子、TR啟動子等。又，亦可藉由將上述啟動子與Cre-loxP 系統組合，更嚴密地控制表現。

該載體例如可藉由（I)兩次構造預測之步驟以及 (II)siRNA序列選定之步驟，構築可抑制上述Flt3功能的核 酸從而獲得該核酸，可保持·表現地併入恰當的載體中，藉 此實施構築。 對於上述載體之構築，雖然未加以特別限定，但例如RNA 干擾之情形時，可藉由設為下述類型所構築而得以實施：

(A) 於不同的兩個啟動子控制下，將編碼上述核酸相關之 正義RNA之核酸與編碼反義RNA之核酸分別配置於正方 向，從而單獨轉錄正義RNA與反義RNA的串聯類型， (B) 於一個啟動子控制下，將編碼本發明之RNA干擾劑所 相關之正義RNA之核酸與編碼反義RNA之核酸分別配置於 逆方向，從而正義RNA與反義RNA分別轉錄以環連結之莖 環類型（或髮夾類型）之RNA的類型，或

(C) 於載體之正義鏈中發揮功能之啟動子控制下，配置編 碼一方RN A的核酸，於反義鏈中發揮功能之啟動子控制 下，配置編碼與該RNA互補性RNA的核酸，從而於單獨啟 動子控制下，分別轉錄各RNA之對向類型。於本發明之RN A 96236.doc -31 - 200523358 干擾載體中，雖然未加以特別限定，但較好是根據反應條 件、例如哺乳動物細胞之種類、正義序列與反義序列之種 颏等刀開使用串聯類型、莖環類型以及對向類型。 再者，於上述載體中，可抑制Flt3#能的核酸之鹼基序列 右係表不序列特異性抑制作用、例如RNAi干擾作用的序 列，則未加以特別限定，但使用RNA聚合酶m啟動子之情 ^ ^ 較好疋滿足下述兩個條件·· 轉錄開始點設為嘌呤殘基〔鳥嘌呤核苷酸殘基⑼或腺 嘌呤核苷酸（A)〕，以及 由於附加有於反義鏈之3，末端所連續的四個尿嘧啶核苷 酉文殘基，因此轉錄開始點之前2個鹼基設為AA。又，使用 RNA聚合酶Π啟動子之情形時，較好的是 -設為莖環類型，以及 -附加較短之聚序列。 以下，就保持有可抑制Flt3功能之核酸的載體製作方法， 說明用於RNA干擾之載體之情形。 P FU3之f月形日$，例如關於膜附近區域、ATp結合區域 以及激酶活性區域，如上所述選擇siRN^m可轉錄 ，亥siRNA之方式構築載體。另一方面，使用於轉錄之 表現載體， 即本叙明之組合物可藉由下述處理獲得··藉由 PCR法製作由於轉錄而產 生siRNA之序列，且插入至U6 RNA聚合酶啟動子（即U6啟動子）之下游，從而製作表現卡 E，將所獲得之表現卡E連結於料的載时架，或化學 合成由於轉錄而產生S1RN^DNA，附加限制酶之識別序 96236.doc -32- 200523358 列標簽，且將獲得之產物插入至載體中。其次，將包含所 獲得之載體之組合物，藉由電穿孔法或脂轉染法，於目的 mRNA表現細胞中實施轉移感染，或將標的基因實施共轉移 感染，藉此篩選目的mRNA之表現抑制。另一方面，考慮到 改善對細胞之轉移感染效率的觀點，將表現卡匣插入至腺 病毒、逆轉錄病毒以及慢病毒載體的載體係可作為本發明 之組合物加以利用。 如此，本發明之組合物係含有可抑制FIt3功能之核酸或保 持有該核酸之載體者，進而可與藥學上所許可之眾所周知 之載體組合從而調製，χ，亦可根據其使用目的實施製劑 化。例如，亦可作為如注射劑、點滴用劑之醫藥組合物。 進而，含有用以實施上述有效成分之穩定化或導入至細胞 之成分的組合物，亦可包含於本發明之組合物中。再者， 作為w藥組合物之投藥量可根據其製劑形態、投藥方法、 使用目的及欲投藥之患者的年齡、體重、症狀而適宜設定。 ()使用有本發明之組合物的高表現細胞之細胞凋亡 誘導方法 本發明之其他方面係關於一種細胞凋亡誘導方法，其使 用有本發明之組合物且選擇性地抑制高表現白血病細 胞及/或含FU3/ITD變異之白血病細胞的增殖，且誘導細胞 >周亡。 -具體的疋，本發明之一個實施態樣係關於一種細胞凋亡 誘$方法，其特徵在於：藉由本發明之組合物，選擇性地 抑制Flt3高表現細胞及/或含FU3/ITD變異之細胞之增殖，藉 96236.doc -33- 200523358 此誘導該Flt3高表現細胞及/或含FU3/ITD變異之細胞的細 胞凋亡。 本發明之細胞凋亡誘導方法由於使用有本發明之組合 物，因此可優先抑制Flt3高表現細胞及/或含FU3/ITD變異之 細胞、例如Flt3高表現癌化細胞及/或含Flt3/ITD變異之癌化 細胞、進而例如Flt3高表現白血病細胞及/或含Flt3/ITD變異 之白血病細胞的增殖，且誘導上述細胞之細胞〉周亡。 又，本發明之細胞凋亡誘導方法亦可進而組合有使用阻 礙激酶之藥劑之方法。至於阻礙上述激酶之藥劑，可列舉 較好是阻礙酪胺酸激酶之藥劑，更好是阻礙Flt3激酶之藥 劑。對於阻礙上述激酶之藥劑，雖然未加以特別限定，但 可列舉例如σ引1"朵叶峻（Indocarbazole)系衍生物 CEP-701(Cephalon公司製造）、喹唑啉系化合物 CT535 18(Millennium Pharmaceuticals 公司製造）、細菌生 物鹼衍生物PKC412(CGP41251、Novartis公司製造）、吲哚 酸1系化合物SU11248(Sudgen公司製造）、甲_衍生物 D-64406 、 D-65476(ASTA medica 公司製造）以及 AG1295(CALBIOCHEM公司製造）等。 即，阻礙上述激酶之藥劑若係藉由與本發明之組合物之 相乘效果，可選擇性地抑制FU3激酶之表現且可誘導細胞凋 亡者，則均可較好地使用。 藉由本發明之細胞凋亡誘導方法，具體的是將本發明之 組合物導入至Flt3高表現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細 胞、例如Flt3高表現癌化細胞及/或含FU3/ITD變異之癌化細 96236.doc -34- 200523358 胞、進而例如Flt3高表現白血病細胞及/或含Flt3/ITD變異之 白血病細胞中，藉此實施選擇性地抑制該細胞增殖的步 驟，藉此可誘導該細胞之細胞〉周亡。 為將本發明之組合物導入至Flt3高表現細胞及/或含 Flt3/ITD變異之細胞、具體的是Flt3高表現癌化細胞及/或含 Flt3/ITD變異之癌化細胞、更具體的是Flt3高表現白血病細 胞及/或含FU3/ITD變異之白血病細胞中，可使用眾所周知 之基因導入方法。雖然未加以特別限定，但可藉由下述方 法加以實施：例如電穿孔法，組織内注射，流體動力學法， 顯微注射，轉移感染，脂轉染法，使用有金粒子之基因槍 法，磷酸鈣法，DEAE葡聚糖法，使用膠束粒子之方法，使 用逆膠束粒子之方法，使用低密度脂蛋白質之方法，使用 轉鐵蛋白之方法，使用動脈膠原之方法，使用腺病毒載體、 慢病毒載體及逆轉錄病毒載體等之病毒載體的方法，使用 膜透過性肽之方法，以及使用膜融合性肽之方法等。 又，使用阻礙上述激酶之藥劑之情形時，同時或者使用 任一者後再使用另一者，從而選擇性地抑制Flt3高表現細胞 及/或含Flt3/ITD變異之細胞之增殖，藉此可誘導該Flt3高表 現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞之細胞凋亡。 抑制Flt3高表現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞之增 殖，可使用眾所周知之基因擴增方法、核酸雜交法、使用 抗體之方法等評估。雖然未加以特別限定，但例如可藉由 RT-PCR法、同步RT-PCR法、北方墨點法、西方點墨法、酶 免疫分析（EIA)、ELISA以及免疫染色法等加以實施。 96236.doc -35- 200523358

Flt3高表現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞之細胞凋 亡，可使用眾所周知之方法評估。雖然未加以特別限定， 但例如可藉由該細胞之形態變化觀察、該細胞中2DNA片 斷化檢測、乳酸脫氫酶等漏出細胞外之檢測、tuNEL法、 MTT法、ELISA以及免疫染色等加以實施。 進而，本發明之細胞凋亡誘導方法可選擇性地抑制具有 Flt3高表現白血病細胞及/或含Flt3/ITD變異之白血病細胞 的白血病患者之該細胞增殖且可誘導細胞凋亡，從而可作 為上述Flt3基因相關的白血病治療方法而加以利用。 白血病之治療效果可使用眾所周知之方法。雖然未加以 特別限定，但可使用例如骨髓·末梢血中之白血球像之確 認、藉由白血球RT-PCR法所實施之確認、藉由免疫染色所 貫施之確認、藉由ELIS A所實施之確認等加以評估。 (3 )用以貫施上述細胞凋亡誘導方法的套組 本發明之其他方面係關於一種套組，其用以實施上述細 胞凋亡誘導方法。 、

根據本發明之套組，由於含有本發明之組合物，因此可 有效率地實施上述細胞計誘導方法，可優先抑制上述彻 高表現細胞及/或含FU3/ITD變異之細胞、例如扪〇高表現癌 化細胞及/或含FH3ATD變異之癌化細胞、進而例如高I 現白血病細胞及/或含Flt3/ITD變異之白血病細胞的增：： 且可誘導上述細胞之細胞凋亡。 於本發明之套組中 物的緩衝溶液。又， ’亦可進而含有穩定化本發明之組合 於本發明之套組中’亦可進而含有將 96236.doc -36- 200523358 本發明之組合物制於下述方法的試劑：眾所周知之基因 導入方法’未加以特別限定’但為例如電穿孔法、組織内 注射、流體動力學法、轉染試劑法、顯微注射、磷酸鈣法 以及DEAE葡聚糖法等。 又，於本發明之套組中，亦可進而含有舰依存型腿 聚合酶’其係用以自保持有可抑制Flt3功能之核酸的載體轉 錄該核酸者。 猎由使用本發明之組合物或套组，可選擇性地抑制刚 高表現白血病細胞及/或含Flt3/ITD變異之白血病細胞之增 殖，且可誘導細胞凋亡。 為將本發明之組合物導入至Flt3高表現細胞及/或含 F謂TD變異之細胞、具體的是剛高表現癌化細胞及/或含 Flt3/ITD變|之癌化細胞、更具體的是咖高表現白血病細 胞及/或含Flt3/ITD變異之白血病細胞中，可使用眾所周知 之基因導入方法。雖然未加以特別限定，但可藉由下述方 法加以實施：例如電穿孔法，組織内注射，流體動力學法， 顯微注射，轉移感染，脂轉染法，使用有金粒子之基因搶 法，磷酸鈣法，DEAE葡聚糖法，使用膠束粒子之方法，使 用逆膠束粒子之方法，使用低密度脂蛋白質之方法，使用 轉鐵蛋白之方法，使用動脈膠原之方法，使用腺病毒載體、 k病毒載體及逆轉錄病毒載體等之病毒載體的方法，使用 膜透過性肽之方法，以及使用膜融合性肽之方法等。 藉由下述實施例，進而詳細地說明本發明，但本發明並 非僅限定於實施例之範圍者。 96236.doc -37- 200523358 [實施例π (1) 可抑制Flt3功能之核酸的合成與選擇 使用HL-60細胞〔FU3WT(野生型）低表現細胞〕、EoL_l 細胞〔Flt3WT(野生型）高表現細胞〕以及MV4-11細胞 〔Flt3/ITD高表現細胞〕，討論含有核酸之組合物的有效 性，該核酸係將Flt3序列之ATP結合部位區域、激酶區域（TK 區域）或膜附近區域設為標的且可抑制FU3功能者。 作為可抑制FU3功能之核酸所使用之siRNA，其係設計如 下表示之序列，且委託TAKARA生物公司製造。 將ATP結合部位區域之標的序列示於序列號：1。將對於 該標的序列之siRNAl之正義序列示於序列號：2，而將反義 序列示於序列號：3。將TK區域之標的序列示於序列號：4。 將對於該標的序列之siRNA2之正義序列示於序列號：5，而 將反義序列示於序列號：6。將膜附近區域（Flt3/JMD區域） 之標的序列示於序列號：7。將對於該標的序列之siRNA3 之正義序列示於序列號：8，而將反義序列示於序列號：9。 (2) 基因導入至各細胞 於添加有1〇體積％小牛胚胎血清（FBS)之RPMI1640培養 基（TAKARA生物公司製造）中，於5體積％ C02、37°C條件下 培養HL-60細胞〔Flt3 WT(野生型）低表現細胞；ATCC CCL-240〕、EoL-1細胞〔Flt3WT(野生型）高表現細胞； ECACC 94042252〕以及MV4-11細胞〔FU3/ITD高表現細 胞；ATCC CRL-9591〕之各細胞。 其次，於六孔培養盤中預先將細胞（2xlO5細胞/ml)培養24 96236.doc -38- 200523358 小時後回收細胞，且以成為1.5χΙΟ5細胞/ml之方式將該細胞 懸浮至Opti-MEM(商品名、Invitrogen公司製造），於所獲得 之懸浮液中，以終濃度成為200 pmol之方式添加合成 siRNA。使用 Oligofectamin(商品名、Invitrogen公司製造）4 #1/反應，且根據商品名：Oligofectamin中所附之Invitrogen 公司協議從而實施轉移感染。再者，作為對照組，以無添 加siRNA之方式同樣實施操作。又，使用對於BCR/ABL嵌 合體mRNA之siRNA，評估由於siRNA所產生之非特異性影 響。 將BCR/ABL嵌合體mRNA之標的序列示於序列號：1〇。 將對於該標的序列之siRNA4之正義序列示於序列號：11， 而將反義序列示於序列號：12。 (3)RNA干擾之確認 確認標的基因之RNA干擾係如下所示，藉由同步rT-pcr 法測定mRNA量之變化。 使用〇ligofectamin(商品名、Invitrogen公司製造），將合 成siRNA轉移感染至各細胞。24小時後，使用triz〇itm試劑 (Invitrogen公司製造），自所獲得之細胞萃取全RnA ,且藉 由DNaseI(TAKARA生物公司製造）處理所獲得之產物。再 者，關於藉由轉移感染、全RNA之萃取以及Dnasei所實施 之處理，係根據所使用之試劑之製造者協議得以實施。

將所獲得之RN A 10 0 n g设為模板’將具有序列號：13之 鹼基序列之募核苷酸與具有序列號：14之鹼基序列之募核 苷酸設為一對引子（各20 pmol)，使用即時單步驟rnA PCR 96236.doc -39- 200523358 套組（Real Time One Step RNA PCR Kit)(商品名、TAKARA 生物公司製造）從而實施同步RT-PCR法。再者，於同步 RT-PCR法中，藉由LightCycler(商品名、Roche公司製造） 從而測定依據SYBER Green I(TAKARA生物公司製造）之螢 光變動。藉由使用序列號：15及16揭示之引子同樣測定 GAPDH mRNA，從而使RNA量標準化。 PCR條件係於95°C下培養30秒後，設為可實施以95°C下1 秒、60°C下10秒、72°C下30秒為一次循環之40次循環反應 的條件。 將藉由各siRNA所獲得之Flt3 mRNA干擾結果示於以下 表1中。再者，於表1中，將未添加合成siRNA且僅實施轉移 感染之各操作的細胞之相對mRNA表現量（Flt3 mRNA /GAPDH mRNA)設為100%，從而算出且表示藉由使用合成 siRNA而變化之相對mRNA表現量（Flt3 mRNA/GAPDH mRNA)所抑制之比率（％)。 [表1] 細胞名 siRNAl siRNA2 siRNA3 siRNA4 MV4-11 65% 54% 65% 5% (ITD變異高表現） (1.6) (1) (1) EoLl 41% 54% 63% 8% (WT高表現） (1)* ⑴ ⑴ HL60 (WT低表現） 31% 46% 38% 7% * : EoL 1中RNA干擾效果設為1時之抑制相對比 如表1所示，可瞭解使用有siRNA1之情形時’於具有ITD 變異之細胞中Flt3 mRNA表現抑制係未使用siRNA時之 65%，且與未具有1TD變異（即WT)之細胞時的Flt3 mRNA表 96236.doc -40- 200523358 現抑制率相比，可選擇性地抑制根據抑制相對值為1.6倍以 上的Flt3 mRNA表現。 另一方面，顯示有使用有siRNA3之情形時，不論ITD變 異之有無，於Flt3高表現細胞中，Flt3 mRNA表現抑制係未 使用siRNA時之65%，與Flt3低表現細胞相比，可選擇性地 抑制根據抑制相對值為1.6倍以上的Flt3 mRNA表現。 再者，使用有siRNA2之情形時，於全部細胞中抑制Flt3 mRNA表現，其效果係未使用siRNA時之50%左右。根據上 述情形，已經確認本發明之組合物係可抑制Flt3功能。 另一方面，與Flt3 mRNA無關之siRNA4中，未引起Flt3 mRNA表現之抑制。故而，得以確認於Flt3 mRNA表現之抑 制中，存有序列特異性之情形。 [實施例2] 就對於本發明組合物之細胞增殖以及細胞凋亡的影響加 以討論。 本發明之組合物（合成siRNAl〜3)係使用與上述實施例 1-(1)相同者。 於RPMI培養基（含有10體積％ FBS)中培養以2χ104細胞/ 孔之濃度加入至96孔培養盤的細胞。藉由各種合成 siRNA(各10 ηΜ)實施轉移感，染，20小時後，使用商品名·· Pfemix WST1試劑（商品名、TAKARA生物公司製造）從而測 定細胞增殖活性。求得與對照組（以無添加siRNA實施轉移 感染處理者）之增殖能相比較的相對增殖能（％)。再者，實 驗係以n= 3分別實施，求得其平均值。 96236.doc -41 - 200523358 又，使用細胞凋亡檢測ELISA試劑（Roche公司製造），根 據所附之協議測定全細胞中之細胞凋亡細胞的比率。再 者，實驗係以η = 3分別實施，求得其平均值。細胞凋亡檢 測係以PBS(磷酸緩衝化生理鹽水）洗淨導入有siRNA後之細 胞，自5 X 103細胞獲得細胞溶胞物，實施使該細胞溶胞物之 細胞胞漿區份與生物素化抗組織蛋白抗體反應且與過氧化 物酶標識抗DNA抗體反應之三明治ELISA。洗淨非結合抗 體後，添加ABTS發色試劑，測定405 nm之吸光度，從而以 %表示細胞凋亡對於對照組（以無添加siRNA實施轉移感染 處理者）之相對頻率。 將對於藉由各種合成siRNA所產生之Flt3 mRNA表現白 血病細胞之增殖活性的影響結果示於表2。 [表2] 細胞名 siRNAl siRNA2 siRNA3 MV4-11 56.4% 41.4% 37.5% (ITD變異高表現） (0.49) (0.36) (0.41). EoLl 68.5% 79.7% 45.1% (WT高表現） (0.60) (0.70) (0.50) HL60 116% 115% 90.3% (WT低表現） ⑴* (1) Ο) :HL60中RNA干擾效果設為1時之細胞增殖活性比 如表2所示，可確認使用有siRNAl〜3之情形時，可選擇 性地抑制各Fit3 mRNA高表現細胞之增殖。又，可石萑認使用 有siRNA3之情形時，不論ITD變異之有無，可以IC50(50% 抑制濃度）10 nM之濃度抑制Flt3 mRNA高表現細胞之增殖。 進而，可確認於藉由導入siRNA而將增殖抑制為60%以下 之細胞中，於40%以上之細胞中會引起細胞凋亡。 96236.doc -42- 200523358 [實施例3] 用以表現可抑制Flt3功能之核酸的卡匣，係以具有BamHI 部位、loop部位、RNAPolIII(RNA聚合酶III)終止基因部位 以及Hindlll部位之方式加以設計，且藉由TAKARA生物公 司製造。 將對於ATP結合部位區域之正義序列示於序列號：17， 而將反義序列示於序列號：1 8。又，作為對照，亦製作GC 含量與上述siRNA相同的卡匣。將正義序列示於序列號： 19，而將反義序列示於序列號·· 20。 將對於Flt3/ITD區域之正義序列示於序列號：21，而將反 義序列示於序列號·· 22。又，作為對照，亦製作GC含量與 上述siRNA相同的卡匣。將正義序列示於序列號：23，而將 反義序列示於序列號：24。 將所獲得之合成DNA於90°C下加熱3分鐘。其後，立刻冷 卻至37°C，且具有正義序列之核酸與具有所對應之反義序 列之核酸培育1小時，實施退火，藉此製作用以表現可抑制 Flt3功能之核酸的卡匣。 其次，使用商品名：pSilencer 2· 1 siRNA表現載體套組（人 類U6啟動子、Hygromysin選擇用；Ambion公司製造），根 據製造者協議，構築保持有可抑制Flt3功能之核酸的載體。 即，使用T4DNA連接酶，使經過上述退火之該卡匣連結至 上述pSilencer載體，從而獲得保持有可抑制Flt3功能之核 酸的載體。使用所獲得之載體，轉化大腸菌勝任細胞（DH5ce 或JM109)，3 7°C下於含有安比西林（Ampicillin)之LB培養基 96236.doc -43- 200523358 上培養一個晚上，選擇經過轉化之群體從而純化pSilencer 質粒。再者，使用BamHI與Hindlll消化經過純化之質粒， 且將插入片斷之存在作為指標從而確認陽性純系。又，關 於陽性純系之DNA，使用序列號：25揭示之鹼基序列以及 序列號：26揭示之鹼基序列的各種定序引子實施解析，從 而確認pSilencer質粒之插入片斷的驗基序列。 [實施例4] (1) 與激酶抑制劑之組合討論 就藉由本發明之組合物（合成siRNA3)與激酶抑制劑組合 處理所獲得的MV4-11 (ITD變異）細胞之增殖阻礙活性加以 討論。合成siRNA3係使用與上述實施例1-(1)相同者。使用 對於ITD變異細胞特異性較高之AG1295(CALBIOCHEM公 司製造）作為激酶抑制劑。 (2) 對細胞之轉移感染 與上述實施例1-(2)相同，於添加10體積％小牛胚胎血清 (FBS)至RPMI1640培養基（TAKARA生物公司製造）所獲得 之培養基（以下稱為培養物培養基）上，且在5體積％ C02存 在下，37°C中培養MV4-11細胞24小時。接著，將於 Opti-MEM(商品名、Invitrogen公司製造）中懸浮之MV4 -11 細胞（1 x 106細胞/ml)移液至測量管（Cuvvet)(BIO RAD公司 製造；間隙為4 mm)，且於該測量管中，以終濃度成為1 ·2 μΜ 之方式添加有siRNA3。其次，將該測量管置於基因脈衝器 (Gene Pulser) Xcell(商品名、BIO RAD公司製造）後，以電 場強度650 V/cm、25 msec實施脈衝。其次，添加懸浮於測 96236.doc -44- 200523358 量管中所懸浮之細胞液量4倍量的培養物培養基中，且以成 為100 /xl/孔之方式分注於96孔培養盤中。 再者，使用具有C3GFP(綠色螢光蛋白質之變異體）之序列 (正義序列··序列號：30，反義序列··序列號：3 1)的siRNA 作為對照組siRNA，以同樣之方式操作實施。 (3)AG1295 處理 於上述培養物培養基中將調製為10 、6 以及〇 一乂（0.25體積％〇1^〇)之各濃度八〇1295，以成為100#1/孔之 方式添加至上述（2)中所準備的96孔培養盤中，在5體積％ C02存在下，37°C中培養4 mM之AG1295(以DMSO溶解）。培 養開始後第72小時時，使用Premix WST-1試劑（商品名、 TAKARA生物公司製造），根據製造者協議，測定細胞之增 殖活性。再者，實驗係以n = 6分別實施’求得其平均值。 求得與藉由對照組siRNA/0 AG1295實施轉移感染之 情形之增殖能相比較的相對增殖率（％)。將結果示於圖1。 於圖1中，橫軸係表示AG1295濃度（μΜ)、縱軸係表示相 對增殖率（％)。黑棒係表示對照組siRNA，白棒係表示使用 有siRNA3之情形之結果。 如圖1所示，可確認藉由激酶抑制劑單獨處理， MV4-11(ITD變異）細胞之增殖與藉由對照組siRNA/Ο 之 AG 1295實施轉移感染之情形相比，於濃度依存性方面3·〇 μΜ 之 AG1295 中抑制 59.8%，5·0 μΜ 之 AG1295 中抑制 84.3%。又，可確認單獨使用siRNA3之情形時，與以對照 組siRNA/Ο μΜ之AG1295實施轉移感染之情形相比可抑制 96236.doc -45- 200523358 83.7%。 但是，較為驚奇的是，可確認若併用siRNA3與AG1295 ’ 則細胞之增殖與藉由對照組8111]^八/〇/^%之八01295實施轉 移感染之情形相比，3·〇 μΜ之AG1295中抑制高達94.5% ’ 5.0 μΜ之AG1295中抑制高達99.7%。 根據上述情形，可確認即使於單獨使用siRNA3之情形， 或併用有該組合物與AG1295等之受體型激酶抑制劑之情 形中任何一個情形時，亦可獲得非常高之增殖抑制效果。 [實施例5] (1)藉由保持有可抑制Flt3功能之核酸之載體所產生的細 胞增殖效果 將預先於5體積％ C02、37°C中培養之MV4-11細胞（2χ106 細胞）移液至測量管（BIO RAD公司製造；間隙為4 mm)，且 於該測量管中，添加3 /xg實施例3中所構築之具有FU3/ITD 區域的載體，以及3 Mg之GC含量與FU3/ITD區域相同的載 體作為對照組。其次，將該測量管置於基因脈衝器Xcell(商 品名、BIO RAD公司製造）後，以電場強度650 V/cm、25 msec 實施脈衝。其次，添加懸浮於測量管中所懸浮之細胞液量 之4倍量的培養物培養基中，以成為100 μΐ/孔之方式分注於 96孔培養盤中，且於5體積％ C02存在下，37°C中培養細胞。 培養開始24小時後，使用PremixWST-1試劑（TAKARA生物 公司製造），根據所附之製造者協議，測定細胞之增殖活 性。再者，實驗係以n= 6分別實施，求得其平均值。求得 將MV4-11細胞（ITD變異高表現）細胞之增殖阻礙活性與對 96236.doc -46- 200523358 照組之增殖能相比較的相對增殖率（％)。將結果示於圖2。 如圖2所示，可確認MV4-11 (ITD變異高表現）細胞之增殖 與對照組相比，可抑制71.4%。故而，可確認有與上述實施 例1〜4中之合成siRNA相同，即使於將FU3/ITD區域設為標 的之siRNA中，亦可獲得有效率地增殖抑制作為ITD變異高 表現之MV4-11的效果。 [實施例6] (1) 抗Flt3 siRNA之合成與選擇 使用HL-60細胞（Flt3WT低表現）、EoL_l細胞（FU3WT高表 現）以及MV4-11細胞（FU3/ITD高表現），討論作為核酸之 siRNA之有效性，該核酸係將Flt3序列之ATP結合部位區 域、激酶區域（TK區域）或膜附近區域設為標的者。再者， 作為本發明之組合物所使用之siRNA，亦係由TAKARA生物 公司製造。 本實施例中，就未具有3 ’突出構造之dsRNA加以討論。 將ATP結合部位區域之標的序列示於序列號：32。將對 於該標的序列之siRNA之正義序列示於序列號：33，而將反 義序列示於序列號：34。將TK區域之標的序列示於序列 號：35。將對於該標的序列之siRNA之正義序列示於序列 號：36，而將反義序列示於序列號：37。將膜附近區域 (FU3/JMD區域）之標的序列示於序列號：38。將對於該標的 序列之siRNA之正義序列示於序列號：39，而將反義序列示 於序列號：40。 (2) 於各細胞導入基因 96236.doc -47- 200523358 HL-60細胞、e〇L-1細胞以及MV4-11細胞的各細胞係於添 加有10重量％小牛胚胎血清（FBS)之RPMI1640培養基 (TAKARA生物公司製造）中，在5體積％ C02存在下，37t： 培養24小時。 將該細胞以成為1.5xlO6細胞/ml之方式懸浮於 〇0〖^]\^]\4(商品名、111¥：11：1*〇8611公司製造），將所獲得之懸浮 液移液至測量管（BIO RAD公司製造；間隙為4 mm)，且以 終濃度分別成為1 ·2 μΜ之方式添加於該測量管中所合成之 siRNA。 其次，將該測量管置於基因脈衝器Xcell(商品名、BIO RAD公司製造）後，以電場強度650 V/cm、25 msec實施脈 衝。其次，添加懸浮於測量管中所懸浮之細胞液量4倍量的 培養物培養基中，且以成為100 μΐ/孔之方式分注於96孔培 養盤中。 再者，使用具有C3GFP(綠色螢光蛋白質之變異體）之序列 (正義序列：序列號·· 30，反義序列··序列號·· 31)的siRNA 作為對照組siRNA，以同樣之方式操作實施。 (3)RNA干擾之確認 標的基因之RNA干擾之確認係如下所述，藉由同步 RT-PCR法之mRNA量加以實施。即，將合成siRNA於各細胞 中實施轉移感染。17小時後，使用TRIzolTM試劑（Invitrogen 公司製造），自上述細胞萃取全RNA。其後，藉由 DNaseI(TAKARA生物公司製造）處理所獲得之全RNA。關於 藉由轉移感染、全RNA之萃取以及DNasel的處理，係分別 96236.doc -48- 200523358 根據製造者協議加以實施。 將所獲得之RNA 1〇〇 ng設為模板，且將具有序列號：13 之鹼基序列之寡核苷酸與具有序列號：14之鹼基序列之寡 核苷酸設為一對引子（各20 pmol)，使用即時單步驟RNA PCR套組（商品名、TAKARA生物公司製造），實施同步 RT-PCR法。再者，於同步RT-PCR法中，藉由LightCycler(商 品名、Roche公司製造）而測定依據SYBER Green I(TAKARA 生物公司製造）之螢光變動。使用序列號：15及16揭示之引 子，同樣測定GAPDH mRNA，藉此將RNA量標準化。 PCR條件係95°C下培養30秒後，實施將95°C 1秒、60°C 10 秒以及72°C 30秒設為一次循環之40次循環反應的條件。 其結果為，可確認於可抑制Flt3功能之核酸中，即使作為 未含有突出至3’末端之TT序列之序列的核酸’亦可抑制於 具有ITD變異之細胞中所表現之Flt3 mRNA，且與未含有 ITD變異（即WT)之細胞相比可選擇性地抑制。 [實施例7] (1) 對於合成siRNA之細胞增殖之影響 就由於作為本發明之組合物含有合成siRNAl、2、3的混 合液（cocktail)及siRNA3單獨所引起的MV4-11(ITD變異）細 胞之增殖阻礙活性加以討論。合成siRNA1、2以及3係使用 與上述實施例1 -(1)相同者。 (2) 對細胞之轉移感染 MV4-11細胞之培養基係使用與上述實施例1-(2)相同 者，於添加10體積％小牛胚胎血清（FBS)至RPMI1640培養基 96236.doc -49- 200523358 (TAKARA生物公司製造）的培養基（以下稱為培養物培養基） 上，在5體積％ C02存在下，37°C中培養24小時。其次，如 下所述實施合成siRNA3之轉移感染。將於 Opti-MEM(Invitrogen公司製造）中懸浮之MV4-11細胞 (2χ106細胞/ml)移液至測量管（BIO RAD公司製造；間隙為4 mm)，且以終濃度分別成為1 ·2 μΜ之方式，添加siRNA混合 液以及單獨siRNA3，該siRNA混合液係以等量莫耳添加有 siRNAl、2以及3者。其次，將該測量管置於基因脈衝器 Xcell(BIO RAD公司製造）後，以電場強度650 V/cm、25 msec 實施脈衝。其次，添加懸浮於測量管中懸浮之細胞液量4 倍量的培養物培養基中，且以成為100 μΐ/孔之方式分注於 9 6孔培養盤中。 再者，使用具有C3GFP(綠色螢光蛋白質之變異體）之序列 (正義序列：序列表之序列號·· 30，反義序列：序列表之序 列號：31)的siRNA作為對照組siRNA，以同樣之方式操作 實施。 (3)細胞增殖測定 於上述（2)中所準備之96孔培養盤中，添加100 /xl/孔，在5 體積％〇02存在下，37t中培養。培養開始後第72小時時， 使用Premix WST-1試劑（TAKARA生物公司製造），且根據製 造商協議，測定細胞之增殖活性。再者，實驗係以n= 6分 別實施，求得其平均值。求得與藉由對照組siRNA實施轉移 感染之增殖能相比較的相對增殖率（％)。將結果示於圖3。 如圖3所示，顯示藉由單獨使用siRNA3增殖可被抑制 96236.doc -50- 200523358 _ ^藉由使用灿财混合液可抑制增殖高達23.0%。 藉匕可確邮有下述情形：即使單獨使用仙皿3，亦可充 分獲得增殖抑制效果’進而藉由使用含有siRNA之混合液， 亦可獲得非常高之增殖抑制效果。 [產業上之可利用性] 根據本I明’可提供—種組合物，其含有核酸或保持有 名核1之載體’上述核酸係將選自包含人類叩3之膜附近區 域、激酶區域或ATP結合部位區域之區域設為標的且可抑制 Flt3功此者。该組合物係可使用於一種方法，該方法係選擇 性地抑制Flt3兩表現細胞及/或含Flt3/ITD變異之細胞之増 殖且誘導細胞祠亡者。進而，可提供一種用以實施該方法 之套組。本發明之組合物係可作為白血病患者之治療劑使 用。 [序列表 free text] 序列號：1係ATP結合部位區域之部分cDNA序列。 序列號：2稱為SEQ1-S。核苷酸20及21係脫氧核糖核苷 酸，其他核苦酸係核糖核苷酸。 序列號· 3稱為SEQ1 - AS。核苦酸20及21係脫氧核糖核皆 酸，其他核苦酸係核糖核苷酸。 序列號：4係TK區之部分cdNA序列。 序列號·· 5稱為SEQ2-S。核苦酸20及21係脫氧核糖核苷 酸，其他核苷酸係核糖核苷酸。 序列號：6稱為SEQ2-AS。核苷酸20及21係脫氧核糖核苷 酸，其他核芽酸係核糖核苷酸。 96236.doc -51 - 200523358 序列號：7係Flt3/ITD區之部分cDNA序列。 序列號：8稱為SEQ3-S。核苷酸20及21係脫氧核糖核苷 酸，其他核苦酸係核糖核苦酸。 序列號：9稱為SEQ3-AS。核苷酸20及21係脫氧核糖核苷 酸，其他核苦酸係核糖核苦酸。 序列號：10係bcr/abl嵌合體區之部分cDNA序列。

序列號：11中，核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸，其他 核苦酸係核糖核苦酸。 序列號：12中，核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸，其他 核皆酸係核糖核皆酸。 序列號：13係用以使編碼FU3之基因擴增的PCR引子 FltllF。 序列號：14係用以使編碼Flt3之基因擴增的PCR引子 Fltl2R 〇

序列號：15係用以使編碼GAPDH之基因擴增的PCR引子 Gl〇 序列號·· 16係用以使編碼GAPDH之基因擴增的PCR引子 G2。 序列號·· 17係用以表現對於ATP結合區之siRNA的表現卡 匣Flt3SIlF。核苷酸1-5區域係BamHI限制酶部位，核苷酸 26-34區域係環部位，核苷酸54-59區域係RNA聚合酶III終 止基因部位。 序列號·· 18係用以表現對於ATP結合區之siRNA的表現卡 匣FU3SI1R。核苷酸1-5區域係Hindlll限制酶部位，核苷酸 96236.doc -52- 200523358 10-15區域係RNA聚合酶III終止基因部位，核苷酸35-43區 域係環部位。 序列號：19係用以表現對照組序列的表現卡匣 Flt3CONlF。核苷酸1-5區域係BamHI限制酶部位，核苷酸 26-34區域係環部位，核苷酸54-59區域係RNA聚合酶III終 止基因部位。 序列號：20係用以表現對照組序列的表現卡匣 FU3CON1R。核苷酸1-5區域係Hindlll限制酶部位，核苷酸 10-15區域係RNA聚合酶III終止基因部位，核苷酸35-43區 域係環部位。 序列號：21係用以表現對於Flt3/ITD區之siRNA的表現卡 匣Flt3SI3F。核苷酸1-5區域係BamHI限制酶部位，核苷酸 26-34區域係環部位，核苷酸54-59區域係RNA聚合酶III終 止基因部位。 序列號：22係用以表現對於Flt3/ITD區之siRNA的表現卡 匣FU3SI3R。核苷酸1-5區域係Hindlll限制酶部位，核苷酸 10-15區域係RNA聚合酶III終止基因部位，核苷酸35_43區 域係環部位。 序列號：23係用以表現對照組序列的表現卡匣 FU3CON3F。核苷酸1-5區域係BamHI限制酶部位，核苷酸 26-34區域係環部位，核苷酸54-59區域係RNA聚合酶III終 止基因部位。 序列號·· 24係用以表現對照組序列的表現卡匣 Flt3CON3R。核苷酸1-5區域係Hindlll限制酶部位，核苷酸 96236.doc -53- 200523358 10-15區域係RNA聚合酶III終止基因部位，核苷酸35-43區 域係環部位。 序列號：25係5f定序引子。 序列號：26係3’定序引子。 序列號：27係膜附近部位區。 序列號：28係酪胺酸激酶區。 序列號：29係ATP結合區。 序列號：30中，核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸，其他 核普酸係核糖核苦酸。 序列號：31中，核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸，其他 核普酸係核糖核苦酸。 序列號：32係ATP結合部位之部分cDNA序歹J。 序列號：33係siRNA。 序列號：34係siRNA。 序列號：35係TK區之部分cDNA序歹J。 序列號：36係siRNA。 序列號：37係siRNA。 序列號：38係FU3/ITD區之部分cDNA序列。 序列號：39係siRNA。 序列號：40係siRNA。 ， 【圖式簡單說明】 圖1係關於藉由併用siRNA及激酶抑制劑之細胞增殖活 性變化圖。 圖2係關於使用有siRNA表現載體之細胞增殖抑制圖。 96236.doc -54- 200523358 圖3係關於藉由單獨使用siRNA或使用siRNA混合液之細 胞增殖活性變化圖。 96236.doc 55- 200523358 序列表 <110> TAKARA BIO INC. 〈120>人類FLT-3功能抑制用組合物

<130> 04-062-PCTJP 〈140〉 093130634 <141〉2004-10-08 <150> JP2003-350253 <151〉 2003-10-09 <160> 40 〈170>專利版本3. 3 <210> I <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉ATP結合部位區域之部分cDNA序列。 <400> 1 aaggtactag gatcaggtgc t <210〉 2 96236.doc 200523358 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉稱為SEQ1—S。“核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸， 其他核苷酸係核糖核苷酸。” <400> 2 gguacuagga ucaggugcut t <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉稱為SEQ1 —AS。“核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸, 其他核苷酸係核糖核苷酸。” <400〉 3 agcaccugau ccuaguacct t <210> 4 <2il> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> TK區之部分cDNA序列。 -2- 96236.doc 200523358 <400> 4 aacaggagtc tcaatccagg t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉稱為SEQ2—S。“核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸， 其他核苷酸係核糖核苷酸。” <400> 5 caggagucuc aauccaggut t 21 <2I0> 6 <211〉 21 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉稱為SEQ2—AS。“核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸， 其他核苷酸係核糖核苷酸。” <400> 6 accuggauug agacuccugt t 21

<210> 7 <21l> 21 <212> DNA 96236.doc 200523358 <213〉人工序列 <220〉 〈223> FLT3/ITD區之部分cDNA序列。 <400〉 7 aatatgaata tgatctcaaa t 21 <210> 8 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉稱為SEQ3—S。“核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸, 其他核苷酸係核糖核苷酸。” <400> 8 uaugaauaug aucucaaaut t 21

<210〉 9 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉稱為SEQ3—AS。“核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸, 其他核苷酸係核糖核苷酸。” <400> 9 21 auuugagauc auauucauat t 96236.doc 4- 200523358 <210> 10 <21i> 21 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> <223〉bcr/ab丨嵌合體區之部分cDNA序列。 <400> 10 21

aagcagagt t caaaagcccu u <210〉 11 <21l> 21 <2i2> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> “核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸，其他核苷酸係核糖核苷酸。”

<400> 11 gcagaguuca aaagcccaut t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> 96236.doc 200523358 <223> “核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸，其他核苷酸係核糖核苷酸。 <400> 12 aagggcuuuu gaacucugct t 21 <210〉 13 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以使編碼FLT3之基因擴增的PCR引子FLT11F。 <400> 13 23 23 gcaatttagg tatgaaagcc age <210> 14 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <2 23〉用以使編碼FLT3之基因擴增的PCR引子FLT12R。 <400〉 14 ct t teageat tttgaeggea acc <210〉 15 <211〉 22 96236.doc 200523358 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>用以使編碼GAPDH之基因擴增的PCR引子G1。 <400〉 15 caacagcctc aagatcatca gc 22 <210> 16 <211〉 21 〈212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以使編碼GAPDH之基因擴增的PCR引子G2。 <400> 16 t tc tagacgg caggtcaggt c 21

<210〉 17 <211〉 64 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉用以表現對於ATP結合區之s iRMA的表現卡匣FLT3S11F。 “核苷酸1 一5區域係BamHI限制酶部位，核苷酸26—34 區域係環部位，核苷酸54—59區域係RNA聚合酶Μ丨終 止基因部位” 96236.doc 200523358 <400> 17 gatcccggta ctaggatcag gtgctttcaa gagaagcacc tgatcctagt accttttttg gaaa <210> 18 <211〉 64 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以表現對於ATP結合區之s i RNA的表現卡匣FLT3S丨1R。 “核苷酸1—5區域係Hindll I限制酶部位，核苷酸10 —15 區域係RNA聚合酶丨丨丨終止基因部位，核苷酸35—43區 域係環部位” <400> 18 agcttttcca aaaaaggtac taggatcagg tgcttctctt gaaagcacct gatcctagta ccgg <210〉 19 <211〉 64 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉用以表現對照組序列的表現卡匣FLT3C0N1F。“核苷酸1 一5 區域係BamHI限制酶部位，核苷酸26—34區域係環部位， 核苷酸54—59區域係RNA聚合酶I丨丨終止基因部位” 96236.doc 200523358 <400〉 19 gatcccggag tcgtagctgc agtatttcaa gagaatactg cagctacgac tccttttttg gaaa 〈210〉 20 <211> 64 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以表現對照組序列的表現卡匣FLT3C0N1R。“核苷酸1 一5 區域係Hindlll限制酶部位，核苷酸10—15區域係RNA聚 合酶I丨丨終止基因部位，核苷酸35—43區域係環部位” <400> 20 agct 11 tcca aaaaaggagt cgtagctgca gtattcictt gaaatactgc agctacgact ccgg <210> 21 <211> 64 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 96236.doc 200523358 <223>用以表現對於FLT3/1TD區之s i RNA的表現卡匣FLT3S13F。 “核苷酸1 一5區域係BamHI限制酶部位，核苷酸26—34 區域係璟部位，核苷酸54—59區域係RNA聚合酶11丨終 止基因部位” <400> 21 gatccctatg aatatgatct caaatttcaa gagaatttga gatcatattc atattttttg gaaa <210〉 22 <21l> 64 <212> DNA <213〉 人工序列 <220> <223〉用以表現對於FLT3/1 TD區之s i RNA的表現卡匣FLT3S13R。 “核苷酸1—5區域係Hindlll限制酶部位，核苷酸10 —15 區域係RNA聚合酶丨丨丨終止基因部位，核苷酸35—43區 域係環部位” <400〉 22 agcttttcca aaaaaiatga atatgatc tc aaattctctt gaaat t tgag atcatat tea tagg <210> 23 <21I> 64

<212> DNA 96236.doc - 10- 200523358 <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以表現對照組序列的表現卡匣FLT3C0N3F。“核苷酸1 一5 區域係BamHI限制酶部位，核苷酸26—34區域係環部位， 核苷酸54—59區域係RNA聚合酶I丨丨終止基因部位” <400> 23 gatcccaata atttgcttca aagatttcaa gagaatcttt gaagcaaatt attttttttg gaaa 〈210〉 24 <2I1> 64 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉用以表現對照組序列的表現卡匣FLT3C0N3R。“核苷酸1 一5 區域係Hindi 11限制酶部位，核苷酸10—15區域係RNA聚 合酶丨丨丨終止基因部位，核苷酸35—43區域係環部位” <400> 24 agcttttcca aaaaaaataa tttgcttcaa agaltctctt gaaatctttg aagcaaatta ttgg <210> 25 96236.doc -11 - 200523358 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉5’定序引子 <400> 25 taatacgact cactataggg 20 <210〉 26 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉3’定序引子 <400> 26 aggcgat taa gt tgggta 18 <210> 27 〈211〉 144 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉膜附近部位區 <400〉 27 tgtcacaagt acaaaaagca atttaggtat gaaagccagc tacagatggt acaggtgacc 60 96236.doc -12- 200523358 ggctcctcag ataatgagta cttctacgtt gatttcagag aatatgaata tgatctcaaa 120 tgggagt t tc caagagaaaa ttta 144 <210〉 28 <211> 471 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉酪胺酸激酶區 % <400> 28 acgcaacagc ttatggaatt agcaaaacag gaglctcaat ccaggttgcc gtcaaaatgc 60 tgaaagaaaa agcagacagc tctgaaagag aggcactcat gtcagaactc aagatgatga 120 cccagctggg aagccacgag aatattgtga acctgctggg ggcgtgcaca ctgtcaggac 180 caatttactt gatttttgaa tactgttgct atggtgatct tctcaactat ctaagaagta 240 aaagagaaaa atttcacagg acttggacag agattttcaa ggaacacaat ttcagttttt 300 accccacttt ccaatcacat ccaaattcca gcatgcctgg ttcaagagaa gttcagatac 360 acccggactc ggatcaaatc tcagggcttc atgggaattc atttcactct gaagatgaaa 420 ttgaatatga aaaccaaaaa aggctggaag aagaggagga cttgaatgtg c 471 <210〉 29 96236.doc -13- 200523358 <211〉 517 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉ATP結合區 <400> 29 gagtttggga aggtactagg atcaggtgct tttggaaaag tgatgaacgc aacagcttat 60 ggaattagca aaacaggagt ctcaatccag gttgccgtca aaatgctgaa agaaaaagca 120 gacagctctg aaagagaggc actcatgtca gaactcaaga tgatgaccca gctgggaagc 180 cacgagaata ttgtgaacct gctgggggcg tgcacactgt caggaccaat ttacttgatt 240 tttgaataci gttgctatgg tgatcttctc aactatctaa gaagtaaaag agaaaaattt 300 cacaggactt ggacagagat tttcaaggaa cacaatttca gtttttaccc cactttccaa 360 tcacatccaa attccagcat gcctggttca agagaagttc agatacaccc ggactcggat 420 caaatctcag ggcttcatgg gaattcattt cactctgaag atgaaattga atatgaaaac 480 caaaaaaggc tggaagaaga ggaggacttg aatgtgc 517 <2i0> 30 <211> 21 <2!2> DNA <213〉人工 <220〉 96236.doc -14- 200523358 <223〉“核苷酸20及21係脫氧核糖核苷酸，其他核苷酸係核糖核苷酸。 <400> 30 gguuauguac aggaacgcat t 21 <210> 31 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> “核苷酸2〇及21係脫氧核糖核苷酸，其他核苷酸係核糖核苷酸。” <400> 31 ugcguuccug uacauaacct t 21 <210> 32 <211〉 19 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉ATP結合區之部分cDNA序列。 <400> 32 19 ggtactagga tcaggtgct <210> 33 96236.doc -15- 200523358 <211> 19 <212〉 RNA <213〉人工 <220〉 <223〉 siRNA <400> 33 gguacuagga ucaggugcu <210〉 34 <211> 19 <212> RNA <213〉人工 <220〉 <223〉 siRNA <400> 34 agcaccugau ccuaguacc <210> 35 <2ll> 19 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉TK區之部分cDNA序列。 <400〉 35 caggagtctc aaiccaggt 19 19 19 96236.doc -16- 200523358 <210〉 36 <21i> 19 <212〉 RNA <213〉人工 <220〉 <223> siRNA <400> 36 caggagucuc aauccaggu <210> 37 <211> 19 〈212〉 RNA 〈213> 人工 <220〉 <223〉 siRNA <400> 37 accuggauug agacuccug <210〉 38 <211> 19 <2t2> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉FLT3/ITD區之部分cDNA序列。 19

19 96236.doc -17- 200523358 <400> 38 tatgaatatg atctcaaat <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213〉人工 <220〉 <223> siRNA <400> 39 uaugaauaug aucucaaau <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213〉人工 〈220〉 <223〉 siRNA <400〉 40 auuugagauc auauucaua 96236.doc

Claims (1)

1. 200523358 十、申請專利範圍： 1. 一種組合物，其含有將選自由人類Flt3之膜附近區域、激 酶區域以及ATP結合部位區域所組成之群的至少一種區 域设為標的且可抑制jqt3功能的核酸。 2. 一種組合物，其含有選自由下述（a)〜(c)區域所組成之群的 至少一種區域設為標的且可抑制Flt3功能的核酸： 0)對應於序列號：27揭示之人類正常型Flt3之膜附近區 域之cDNA鹼基序列的區域， (b) 對應於序列號：28揭示之人類正常型pit3之激酶區 域之cDNA鹼基序列的區域，以及 (c) 對應於序列號：29揭示之人類正常型nt3之ATP結合 部位區域之cDNA驗基序列的區域。 3·如請求項1或2之組合物，其中含有具有15〜25個鹼基鏈長 的核酸。 4.如請求項1或2之組合物，其中含有對應於選自由序列 號：1、4、7、3 2、3 5及3 8所組成之群之至少一種驗基序 列的RNA序列。 5 ·如請求項1至4中任一項之組合物，其中含有選自由下述 核酸所組成之群的核酸： 組合具有序列號：2之鹼基序列之核酸與具有序列號· 3之驗基序列之核酸而成的核酸， 組合具有序列號：5之驗基序列之核酸與具有序列號· 6之驗基序列之核酸而成的核酸’ 組合具有序列號·· 8之鹼基序列之核酸與具有序列發· 96236.doc 200523358 9之鹼基序列之核酸而成的核酸， 組合具有序列號：33之鹼基序列之核酸與具有序列 號：3 4之鹼基序列之核酸而成的核酸， 組合具有序列號：36之鹼基序列之核酸與具有序列 號：37之鹼基序列之核酸而成的核酸，以及 組合具有序列號·· 39之鹼基序列之核酸與具有序列 號：40之鹼基序列之核酸而成的核酸。 6 · —種組合物，其含有保持有核酸之載體，該核酸係將選 自由人類Flt3之膜附近區域、激酶區域以及ATP結合部位 區域所組成之群的至少一種區域設為標的且可抑制Flt3 功能者。 7 · —種組合物，其含有保持有核酸之載體，該核酸係將選 自由下述（a)〜(c)區域所組成之群的至少一種區域設為標 的’並且於哺乳動物細胞内可抑制jqt3功能者： (a) 對應於序列號：27揭示之人類正常型Flt3之膜附近區 域之cDNA鹼基序列的區域， (b) 對應於序列號·· 28揭示之人類正常型Flt3之激酶區 域之cDNA鹼基序列的區域，以及 (c) 對應於序列號：29揭示之人類正常型FU3之ATP結合 部位區域之cDNA鹼基序列的區域。 8·如請求項6或7之組合物，其中該核酸具有標的區域之 15〜25個驗基之驗基序列。 9.如請求項6或7之組合物，其中含有保持有核酸之載體， 4核S文係對應於選自由序列號·· 1、4、7、3 2、3 5及3 8所 96236.doc 200523358 組成之群的至少一種驗基序列，並且可表現對應於該驗 基序列之RNA。 10·如請求項6至9中任一項之組合物’其中含有保持有核酸 之載體，該核酸係選自由下述核酸所組成之群者： 組合具有序列號：2之驗基序列之核酸與具有序列號· 3之驗基序列之核酸而成的核酸， 組合具有序列號：5之鹼基序列之核酸與具有序列號： 6之鹼基序列之核酸而成的核酸， 組合具有序列號：8之鹼基序列之核酸與具有序列號： 9之鹼基序列之核酸而成的核酸， 組合具有序列號：33之鹼基序列之核酸與具有序列 號：34之鹼基序列之核酸而成的核酸， 組合具有序列號：36之鹼基序列之核酸與具有序列 號：37之鹼基序列之核酸而成的核酸，以及 組合具有序列號：3 9之鹼基序列之核酸與具有序列 號：40之驗基序列之核酸而成的核酸。 11·如請求項6至10中任一項之組合物，其中含有載體，該載 體係具有RNA聚合酶III啟動子或RNA聚合酶Π啟動子作 為啟動子者。 12·如請求項11之組合物，其中該啟動子係選自由U6啟動 子、H1啟動子、tRNA啟動子以及CMV啟動子所組成之群 者。 13·如請求項6至12中任一項之組合物，其中含有選自腺病毒 載體、慢病毒載體以及逆轉錄病毒載體的載體作為基本 96236.doc 200523358 骨架。 14. 一種細胞凋亡誘導方法，其特徵在於：藉由如請求項1至 1 3中任一項之組合物，選擇性地抑制FLT3高表現細胞及/ 或含FLT3/ITD變異之細胞之增殖，藉此誘導該FLT3高表 現細胞及/或含FLT3/ITD變異之細胞之細胞凋亡。 1 5.如請求項14之方法，其中進而使用阻礙激酶之藥劑，同 時或者使用任一者後再使用另一者，而選擇性地抑制 FLT3高表現細胞及/或含FLT3/ITD變異之細胞之增殖，藉 此誘導該FLT3高表現細胞及/或含FLT3/ITD變異之細胞 之細胞〉周亡。 16. —種套組，其含有請求項1至1 3中任一項之組合物且係用 以實施如請求項14或15之方法者。 96236.doc