WO2005033711A2 - Clot-lyse-assay - Google Patents

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WO2005033711A2
WO2005033711A2 PCT/DE2004/002224 DE2004002224W WO2005033711A2 WO 2005033711 A2 WO2005033711 A2 WO 2005033711A2 DE 2004002224 W DE2004002224 W DE 2004002224W WO 2005033711 A2 WO2005033711 A2 WO 2005033711A2
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plasma
clots
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Thomas Stief
Harald Renz
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Philipps-Universität Marburg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a new method for performing a clot-lysis assay which is suitable for thrombolysis, in particular by urokinase (u-PA), t-PA, streptokinase (SK), plasminogen-streptokinase activator complex ( PSAC), reteplase (RP), tenecteplase (TP), or plasmin.
  • u-PA urokinase
  • t-PA streptokinase
  • PSAC plasminogen-streptokinase activator complex
  • PSAC reteplase
  • TP tenecteplase
  • plasmin plasminogen-streptokinase activator complex
  • Plasma thrombolysis is a current form of therapy for atherothrombotic diseases such as myocardial or cerebral infarct [1, 2].
  • the clinically available plasminogen activators (PA) include urokinase (u-PA), t-PA, streptokinase (SK), plasminogen-streptokinase activator complex (PSAC), or mutants of t-PA, such as reteplase ( RP) or tenecteplase (TP).
  • RP reteplase
  • TP tenecteplase
  • Lysis suitability of these 6 plasminogen activators in the presence or absence of human plasma in the clot supernatant [3-7].
  • the plasmatic thrombolysis is then simulated by using plasminogen activators in different concentrations and determining their clot-lysis activity.
  • the fibrinolysis system is routinely determined chromogenically via the enzyme activity of the plasmin.
  • This measuring system is only partially physiological, since the last reaction of the fibrinosis, the dissolution of the fibrin strands, cannot be recorded. It is the object of the present invention to provide a new method for measuring fibrinosis in all partial reactions, in particular the dissolution of the fibrin strands.
  • This object is achieved according to the invention by a novel clot-lysis assay which is used to measure the fibrin-lytic activity of plasmin in plasma or blood instead of the chromogenic activity of plasmin.
  • An advantage of the new invention is the use of microtiter plates which contain microthrombi. Lysis is determined based on the declining turbidity of the thrombus. 1st example
  • a new micro-clot lysis assay - the CLA - was used to study thrombolysis by urokinase, t-PA, streptokinase, PSAC, reteplase or tenecteplase.
  • the effective 50% doses (ED 50 ) in the clot supernatant were: urokinase 128 or 183 lU / ml; t-PA 0.3 or 0.2 ⁇ g / ml; Streptokinase 215 or 1371 IU / ml; PSAC about 60 or 91 U / ml; Reteplase 664 or 996 U / ml; Tenecteplase 0.2 or 0.2 ⁇ g / ml.
  • thrombus increases the activity of t-PA 20-30-fold and that of tenecteplase 300-400-fold after 4 hours (37 ° C.) compared to urokinase; in contrast, the activity of reteplase decreases approximately twice, i.e. the plasmin formed by reteplase is prevented in its lytic action against a thrombus.
  • Physiological activators of thrombolysis e.g. Granulocyte activators can improve clinical thrombolysis.
  • the 4h ED 50 clot lysis activities (CLA) with albumin or plasma in the clot supernatant were: u-PA 128 or 183 lU / ml, t-PA 0.3 or 0.2 ⁇ g / ml, SK 215 or 1371 lU / ml, PSAC 60 or 91 U / ml, RP 664 or 996 U / ml, TP 0.2 or 0.2 ⁇ g / ml.
  • the respective ED 25 values in plasma in the absence of a clot (25% of the maximum inducible plasmin activity in 10 minutes incubation of the PA in plasma without the presence of a clot (Pli-10m)):
  • the Pli-10m / CLA-4h for the plasma system are: u-PA 1.7, t-PA 40, SK 4.4, PSAC 1.5, RP 0.7 and TP 750.
  • thrombus increases the activity of t-PA 20-30-fold and that of tenecteplase 300-400-fold after 4 h (37 ° C) compared to urokinase, whereas the activity of reteplase decreases approximately twice, i.e. the plasmin formed by reteplase is prevented in its lytic action against a thrombus.
  • CLA clot lysis assay
  • CLA-4h clot lysis activity after 4h (37 ° C);
  • ED 50 effective 50% dose
  • Pli-10m ED 25 the formation of plasmatic plasmin within 10 min
  • PA plasminogen activator
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • SK streptokinase
  • PSAC plasminogen streptokinase activator complex
  • RP reteplase
  • TP tenecteplase
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS phosphate-buffered saline
  • PAC 50% Pathromtin SL®, 6% BSA, 25 mM CaCI
  • AMCHA aminomethylcyclohexanoic acid
  • FIPA fibrinysis parameter assay
  • MW molecular weight
  • D Dalton
  • mA mill
  • the turbidity ( absorbance at 405 nm) was determined after 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 hours (37 ° C.) using a microtiter plate reader (Milenia, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA).
  • the 0% -clot ( 100% lysis) absorbance control consisted of an extension of the incubation period to 20 h (37 ° C).
  • the turbidity of the clot was calculated by subtracting the absorbance control of the 0% clot from the measured absorbance in the PA reaction and was shown in% of the 100% clot control:
  • the coefficient of variation was ⁇ 5%.
  • the effective 50% dose [ED 50 ] for each activator was determined with 6% albumin or normal human plasma in the supernatant of the clots:
  • the [ED 50 ] is defined as the activator concentration that leads to lysis after 4 h (37 ° C) leads from 50% of the clots.
  • n 29 healthy blood donors were incubated with 50 ⁇ l 50% Pathromtin SL® (DadeBehring), 6% BSA, 25 mM CaCI 2 in microtiter plates (Maxi Sorp; NUNC, Wiesbaden, Germany) for 30 min (37 ° C ). After the coagulation, either 50 ⁇ l of the same plasma or 50 ⁇ l BSA-PBS were added; the generated micro-clots did not adhere to the wall of the wells.
  • Lysis produced by contact phase micro-Clots The plasminogen activators in BSA-PBS were added at concentrations 5 corresponded to the above ED o-4H-concentrations was being used in the clot supernatant from the mean value between albumin and Plasma: 50 ul 468 IU / ml u-PA ( 0.75 ⁇ g / ml t-PA, 2379 lU / ml SK, 225 U / ml PSAC, 2490 U / ml RP, 0.6 ⁇ g / ml TK or for the control BSA-PBS.
  • the turbidity of the wells was reduced after 0 - 16 h (37 ° C.)
  • the clot lysis was determined according to Table 1, the value measured for PA after 0 h incubation time being used as 100% clot turbidity.
  • FIGS. 1-3 show the clot lysis by u-PA in the presence of buffered albumin or normal plasma in the supernatant of the micro-clots and the determination of the PA concentration required to induce the effective 50% dose.
  • FIGS. 4-6 show the clotysis by t-PA, FIGS. 7-9 that by streptokis nose, FIGS. 10-12 those by PSAC, FIGS. 13-15 those by reteplase and FIGS. 16-18 clotlyses by tenecteplase.
  • Plasma piasmin activity appears to be a clinically relevant PA dosage.
  • the ED 25 (Pli-10min) values obtained were divided by the values obtained in the presence of a micro-clot with a plasma supernatant.
  • the Pli-10m / CLA-4h ratios were: for u-PA 1.7, for t-PA 40, for SK 4.4, for PSAC 1.5, for RP 0.7, for TP 750.
  • This tranexam concentration increases the piasmin activity in the plasma / u-PA-based global fibrinolysis assay system FIPA [3] by about ten times. 0.02 mM decreases the inhibition constant
  • omega-amino acids AMCHA, ⁇ -aminocaproic acid or lysine are antifibrinolytics. Although it is a fold of the
  • AMCHA is 10 times more effective than ⁇ -aminocaproic acid and 20 times more effective than lysine , ie the antifibrinolytic activity of 16 mg AMCHA can also be achieved with 320 mg lysine [11, 12].
  • the present study shows a combined in vitro simulation of the clotting capacity of 6 different PAs, which was examined with the help of a new microtiter plate thrombolysis test.
  • the clot lysis activity of this PA with 6% bovine albumin or with normal human plasma in the supernatant of microclots.
  • the thrombolytic activity of reteplase is half that of plasmin formation compared to u-PA.
  • Fibrin is not only found in the pathological thrombus, but also circulates in the blood in the form of soluble fibrin polymers and has physiological functions in preventing blood loss or preventing bleeding into vital areas of the organ [14, 15].
  • Dose studies with fibrin-selective t-PA showed that fibrinolytic activity in vivo required significant systemic plasminogen activation, whereas in purified systems it showed high selective fibrinolytic activity in vitro; So-called "t-PA paradox" [16].
  • Clinical thrombolysis should mimic physiologically selective thrombolysis, the origin of which is mainly non-plasmatic in nature [17-20].
  • thrombolytic agents may show different clinical results, which may depend mainly on endogenous thrombi.
  • thrombolytic e.g. plasminogen activator or plasmin
  • Fig. 1a Clotlyse by u-PA with 6% bovine albumin in the supernatant of the clot 25 ul u-PA in 6% BSA-PBS and 100 ul 6% BSA-PBS were added to 100 ul micro-clots. After 0-5 h (37 ° C) the turbidity was determined at 405 nm. The initial cloud turbidity was 782 + 10 mA (Tab. 1).
  • the concentrations in the supernatants set were: 0 IU / ml u-PA (0); 0.78 IU / ml u-PA (O); 1.56 IU / ml u-PA (D); 3.13 IU / ml u-PA (+); 6.25 lU / ml u-PA (•); 12.5 lU / ml u-PA (*); 25 IU / ml u-PA (X); 50 IU / ml u-PA (A); 100 lU / ml u-PA ( ⁇ ); 200 lU / ml u-PA ( ⁇ ).
  • Fig. 1b Clotlyse by u-PA with normal human plasma in the supernatant of the clot
  • Fig. 2a Clotlyse by t-PA with 6% bovine albumin in the supernatant of the clot. 25 ul t-PA in 6% BSA-PBS and 100 ul 6% BSA-PBS were added to 100 ul micro-clots. After 0-5 h (37 ° C) the clot turbidity was determined as described in Fig. 1a.
  • concentrations in the supernatants added were: 0.078 ⁇ g / ml t-PA (O); 0.156 ⁇ g / ml t-PA (D); 0.313 ⁇ g / ml t-PA (+); 0.625 ⁇ g / ml t-PA (•); 1.25 ⁇ g / ml u-PA (*); 2.5 ⁇ g / ml t-PA (X); 5 ⁇ g / ml t-PA (A); 10 ⁇ g / ml t-PA ( ⁇ ); 20 ⁇ g / ml t-PA ( ⁇ ).
  • Fig. 2b Clotlyse by t-PA with normal human plasma in the supernatant of the clot. 25 ul t-PA in 6% BSA-PBS and 100 ul normal human plasma were added to 100 ul micro-clots.
  • the concentrations in the supernatants added were: 0.078 ⁇ g / ml t-PA (O); 0.156 ⁇ g / ml t-PA (D); 0.313 ⁇ g / ml t-PA (+); 0.625 ⁇ g / ml t-PA (•); 1.25 ⁇ g / ml u-PA (*); 2.5 ⁇ g / ml t-PA (X); 5 ⁇ g / ml t-PA (A); 10 ⁇ g / ml t-PA ( ⁇ ); 20 ⁇ g / ml t-PA ( ⁇ ).
  • Fig. 2c Clotlyse by t-PA; Determination of ED 5 o
  • Clotlyse activity was determined for 2- and 4-hour incubation periods of the micro-clots with t-PA. 2h BSA-PBS in the supernatant of the clot ( ⁇ ); 2h normal plasma in the clot supernatant (O); 4h BSA-PBS in the supernatant of the clot (A); 4h normal plasma in the supernatant of the clot (•).
  • Fig. 3a Clotlyse by streptokinase with 6% bovine albumin in the supernatant of
  • concentrations in the supernatants added were: 31.3 lU / ml SK (O); 62.5 IU / ml SK (D); 125 IU / ml SK (+); 250 lU / ml SK (•);
  • SK streptokinase
  • concentrations in the supernatants added were: 31.3 lU / ml SK (O); 62.5 IU / ml SK (D); 125 IU / ml SK (+); 250 lU / ml SK (•); 500 lU / ml SK (*); 1000 lU / ml SK (X); 2000 IU / ml SK (A); 4000. lU / ml SK ( ⁇ ); 8000 lU / ml SK ( ⁇ ).
  • 3c clotlyse by streptokinase; Determination of the ED 50 The clot lysis activity was determined for 2 and 4 hour incubation periods of the micro clots with streptokinase. 2h BSA-PBS in the supernatant of the clot ( ⁇ ); 2h normal plasma in the clot supernatant (O); 4h BSA-PBS in the supernatant of the clot (A); 4h plasma in the supernatant of the clot (•).
  • Fig. 4a Clotlyse by PSAC with 6% bovine albumin in the supernatant of the clot To 100 ul micro-clots 25 ul PSAC in 6% BSA-PBS and 100 ul 6% BSA-PBS were added. After 0-5 h (37 ° C) the clot turbidity was determined as described in Fig. 1a.
  • the concentrations in the supernatants added were: 3.13 U / ml PSAC (O); 6.25 U / ml PSAC (D); 12.5 U / ml PSAC (+); 25 U / ml PSAC (•); 50 U / ml PSAC (*); 100 U / ml PSAC (X); 200 U / ml PSAC (A); 400 U / ml PSAC ( ⁇ ); 800 U / ml PSAC ( ⁇ ).
  • Fig. 4b Clotlyse by PSAC with normal human plasma in the supernatant of the clot
  • Fig. 4c Clotlyse by PSAC; Determination of ED50
  • Clotlyse activity was determined for 2- and 4-hour incubation periods of the micro-clots with PSAC. 2h BSA-PBS in the supernatant of the clot ( ⁇ ); 2h normal plasma in the clot supernatant (O); 4h BSA-PBS in the supernatant of the clot (A); 4h normal plasma in the supernatant of the clot (•).
  • reteplase (RP) in 6% BSA-PBS and 100 ul of 6% BSA-PBS were added to 100 ul of MiKro clots. After 0-5 h (37 ° C) the clot turbidity was determined as described in Fig. 1 a.
  • the concentrations in the supernatants added were: 31.3 U / ml RP (O); 62.5 U / ml RP (D); 125 U / ml RP (+); 250 U / ml RP (•); 500 U / ml RP (*); 1000 U / ml RP (X); 2000 U / ml RP (A); 4000 U / ml RP ( ⁇ ); 8000 U / ml RP ().
  • FIG. 5b Clotlyse by reteplase with normal human plasma in the supernatant of the clot. 25 .mu.l reteplase (RP) in 6% BSA-PBS and 100 .mu.l normal human plasma were added to 100 ul micro-clots.
  • RP reteplase
  • the concentrations in the supernatants added were: 31.3 U / ml RP (O); 62.5 U / ml RP (D); 125 U / ml RP (+); 250 U / ml RP (•); 500 U / ml RP (*); 1000 U / ml RP (X); 2000 U / ml RP (A); 4000 U / ml RP (M); 8000 U / ml RP ( ⁇ ).
  • the concentrations in the supernatants 5 added were: 0.049 ⁇ g / ml ( ⁇ ); 0.098 ⁇ g / ml TP ( ⁇ ); 0.195 ⁇ g / ml TP ( ⁇ ); 0.39 ⁇ g / ml TP (0); 0.78 ⁇ g / ml TP (O); 1.56 ⁇ g / ml TP (D); 3.13 ⁇ g / ml TP (+); 6.25 ⁇ g / ml TP (•); 12.5 ⁇ g / ml TP (*); 25 ⁇ g / ml TP (X); 50 ⁇ g / ml TP (-A-); 100 ⁇ g / ml TP (- ⁇ -); 200 ⁇ g / ml TP (- ⁇ -).
  • Fig. 6b Clotlyse by tenecteplase with normal human plasma in the supernatant of the clot. 25 ul TP in 6% BSA-PBS and 100 ul normal human plasma were added to 100 ul micro-clots.
  • the concentrations in the supernatants added were: 0.049 ⁇ g / ml TP ( ⁇ ); 0.098 ⁇ g / ml TP ( ⁇ ); 0.195 ⁇ g / ml TP ( ⁇ ); 0.39 ⁇ g / ml TP5 (0); 0.78 ⁇ g / ml TP (O); 1.56 ⁇ g / ml TP (D); 3.13 ⁇ g / ml TP (+); 6.25 ⁇ g / ml TP (•); 12.5 ⁇ g / ml TP (*); 25 ⁇ g / ml TP (X); 50 ⁇ g / ml TP ( ⁇ A ⁇ ); 100 ⁇ g / ml TP (- ⁇ -); 200 ⁇ g / ml TP (- ⁇ -).
  • the main effector cells of cellular thrombolysis are activated polymorphonuclear neutrophils. These cells form urokinase (u-PA) and hypochlorite / chloramines, which are donors for non-radical excited oxygen of the singlet oxygen type ( 1 O 2 ).
  • u-PA urokinase
  • hypochlorite / chloramines which are donors for non-radical excited oxygen of the singlet oxygen type ( 1 O 2 ).
  • the intrinsic plasmatic thrombolysis mediated by u-PA / 1 O 2 is imitated in a microtiter plate clot lysis assay.
  • 0.5 ⁇ mol chloramine leads to a normal lysis of about 60%.
  • the normal range for INOXCLA is 100% + 25% (0 ⁇ SD; in% of the normal standard; CVs ⁇ 10%).
  • 50% lysis of the adherent 125 ⁇ l micro-clots occurs after 0.75 h, 2 h, 14 h, 13 d or 17 d (37 ° C.) when using 1000, 100, 10, 1 or 0 lU / ml u-PA- Reagent on. If u-PA activity is inhibited by PAI-2, no clotysis occurs.
  • PMN polymorphonuclear neutrophils
  • INOXCLA microtiter plate clot-lysis assay
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBS 10 mM Na 2 HPO 4 , 138 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH 7.4; Dulbecco 's PBS, endotoxin free; PAA Laboratories GmbH, Vienna, Austria
  • PBS phosphate buffered saline
  • a Multipette Eppendorf, Hamburg, Germany
  • PolySorp NUNC
  • 25 ⁇ l were withdrawn from each well, combined and examined for their pseudocholinesterase content PCHE in a Hitachi 917 analyzer (Röche, Basel, Switzerland).
  • the lysable clotting turbidity [% of the initial clotting turbidity] was calculated as 100 times the ratio from (corrugation after incubation - 0% clotting turbidity) / (initial corrugation - 0% clotting turbidity) (Table 2).
  • the 100% clot control was the initial turbidity of the wells, since the increase in the lysable turbidity units was ⁇ 15% within 24 h. 2.2. Optimization of the pathromtin concentration
  • lysis of non-adherent clots is also of clinical importance, e.g. clots in pulmonary embolism are often not adherent.
  • 50 ul 0, 1, 10, 100, 1000 lU / ml u-PA in BSA-PBS 50 ul 100 (u-PA inhibiting) units / ml plasminogen activator inhibitor (PAD-2 (DadeBehring) or 50 ⁇ l 1 lU / ml u-PA, 100 U / ml PAI-2 in BSA-PBS and the turbidity of the wells (absorbance at 405 nm) determined after 0 - 17 h; after 24 h 10 ⁇ l 2.3% NaN3 (Sigma) in physiological NaCI was added and the turbidity of the wells was determined after 0-19 d (37 ° C.)
  • SD standard deviation
  • FIPA fibrinolysis parameter assay
  • the 100% turbidity of the soluble clots was 310 ⁇ 18 mA for 50 ⁇ l normal plasma, the 0% turbidity of the clots was 321 + 10 mA for 50 ml normal plasma.
  • 3.2. Optimization of the pathromtin concentration 50% pathromtin was regarded as the optimal pathromtin concentration: the clot-lysis curve approaches its maximum asymptotically at pathromtin concentrations> 40%. Without pathromtin, clot lysis is about 5 times lower 5 than with 50-100% pathromtin reagent (Fig. 1 b).
  • FIGS. 2a, b show the soluble clogging turbidity of normal plasma as a function of the incubation time and the concentration of oxidizing agent. There is a 10% increase in clotting turbidity / ⁇ mol chloramine-T. In INOXCLA00), the optimal amount of chloramine added to the microclots is 0.5-1 ⁇ mol, which leads to clot lysis> 100-fold greater than that of non-oxidized clots (Fig. 3a, b).
  • the results of the I-NOXCLA (1) and the INOXCLA (o) are shown in Figures 6a and 6b.
  • the amount of chloramine, which induces 50% of the maximum inducible thrombolysis, 5 is approximately 0.25 ⁇ mol (FIGS. 3b, 4b, 5b, 6b).
  • Non-oxidized clots are only lysed if the u-PA concentration in the reagent is> 16 lU / ml. If the u-PA concentration in the reagent is ⁇ 16 lU / ml, oxidation of the clots with 0.5 - 1 ⁇ mol chloramine increases the thrombolysis> 100-fold (Fig. 8a).
  • 9a shows the lysis of normal oxidized non-adherent micro-clots by u-PA in INOXCLA.
  • a 50% clotysis occurs after 0.5 h, 1.5 h, 7 h, 5 d or 9 d (37 ° C) with the appropriate use of 1000, 100, 10, 1 or 0 lU / ml u-PA reagent. Addition of 50 ⁇ l 1 lU / ml u-PA leads to 5 - 10% lysis after 17 h
  • FIG. 9b shows the lysis of normal oxidized non-adherent micro-clots with 50 ⁇ l 1 lU / ml u-PA, 0 lU / ml u-PA, 1 lU / ml u-PA + 100 U / ml PAI-2 or 100 U / ml PAI-2:
  • 50 ⁇ l 1 lU / ml u-PA after 3 d (37 ° C.) approximately 20% of the oxidized normal clot is lysed.
  • u-PA Without the addition of u-PA, about 20% of the oxidized normal clot is lysed after 7 d (37 ° C.). Clotysis is completely inhibited by adding 50 ⁇ l 100 U / ml PAI-2.
  • the CV values in the intra-assay for adherent thrombus pooled normal plasma in INOXCLA (10) and INOXCLA (100) are 5.7% and 3.8%, respectively.
  • the CV values in the inter-assay are 8.6% and 6.1%.
  • FIPA results were 103 ⁇ 28% of the standard (calculated linear piasmin activity: 6 mA / min (RT)).
  • the functional plasminogen in the blood donations was 94 ⁇ 20% of the standard (0 ⁇ 1 SD).
  • Plasminogen correlated with FIPA with r 0.735.
  • the soluble clot turbidity correlated with r 0.682 with the plasmatic fibrinogen concentration.
  • the results of the 10 lU / ml u-PA reagent INOXCLA correlated with r 0.513 to those of the 100 lU / ml u-PA reagent.
  • Activated granulocytes are the effectors of cellular fibrinoysis [1 -5]; cellular fibrinoysis is of greater importance than plasmatic [7].
  • the main products of these cells are urokinase and NADPH-Oxidas + myeloperoxides, which form O 2 -, H 2 O 2, HOCI and 1 O 2 .
  • the fibrinolytic and oxidative pathways are linked [8] -
  • 1 O 2 is generated by spontaneous dismutation of the superoxide anion (O 2 ), by the redox cycle [11, 12] or by the interaction of HOCI or chloramines with H 2 O 2 (Mallet reaction) formed [13-16].
  • the present method represents another comprehensive fibrinolysis assay.
  • the INOXCLA allows the extensive analysis of the lysis of individual patient clots with the help of fibrinolytics.
  • PAI-1 and ⁇ 2-antiplasmin The most important regulatory proteins in plasmatic fibrinoysis are PAI-1 and ⁇ 2-antiplasmin [21]. These serine protease inhibitors are 70% oxidatively inactivated by a chloramine concentration of 5 mM [22, 23]. 1 O 2 scavengers in the blood are proteins that contain methionine or cysteine residues and unsaturated fatty acids or cholesterol [11, 24, 25]. Activated PMN produce about 5-10 mM HOCI / Chlormaine in their microenvironment [26].
  • the ED50 for inhibiting platelet aggregation in platelet-rich plasma is 1.0 mM chloramine, that for fibrinogen inactivation is 2.0 mM chloramine [29, 30].
  • ischemic tissue damage In contrast to non-radical singlet oxygen ( 1 O 2 ), the oxygen radicals - especially hydroxyl radicals (-OH) - are involved in ischemic tissue damage [31-34].
  • Vascular NADPH oxidase produces reactive oxygen species that modulate hemostasis; NADPH oxidase + myeloperoxidase appear to have an antiatherosclerotic effect [35-38].
  • Fibrin activates PMN [4, 39-43]. Activated PMN release 1 O 2 / photons, which call for further PMN activation and increase thrombolysis [4, 6, 12, 44, 45]. The inhibition of coagulation and the intensification of fibriniosis shift the hemostasis to an antithrombotic state [46].
  • Mimicking physiological cellular thrombolysis enables new assay techniques to measure fibrinosis, and therapeutic activation of cellular thrombolysis could result in a new class of physiological fibrinolytics.
  • Step TW The physiology and pharmacology of singlet oxygen. Med Hypothes 60: 567-72, 2003.
  • Step TW The blood fibrinolysis / deep-sea analogy: a hypothesis on the cell signals singlet oxygen / photons as natural antithrombotics. Thromb Res 99: 1-20, 2000.
  • 50 ⁇ l normal citrate buffered plasma were mixed with 20 ⁇ l 64 mM CaCI 2 with or without 100 ⁇ g / ml Polybren® or with 20 ⁇ l Pathromtin SL®, 64 mM CaCI 2 with or without 100 ⁇ g / ml Polybren® for 30 min (37 ° C) incubated. 50 ⁇ l 0 mM () or 10 mM () chloramine-T® in PBS was added. After 30 min (37 ° C) 50 ul 0 lU / ml or 10 lU / ml u-PA in 6% bovine serum albumin-PBS were added.
  • the turbidity of the wells at 405 nm was determined after 0-170 h (37 ° C): no pathromtin, no polybrene (O); no pathromtin, with polybrene ( ⁇ ); with pathromtin, no polybrene (•); with pathromtin, with polybrene (A).
  • 10b Clotlyse as a function of the amounts of chloramine T at incubation times: 2 min (O), 0.75 h ( ⁇ ), 1.5 h ( ⁇ ), 2.25 h (A), 3 h (•), 4 h ( D), 8 h (*), 16 h ( ⁇ ).
  • the incubation time was for 50 ⁇ l 1 lU / ml u-PA ( ⁇ ), 0 lU / ml u-PA (O), 1 lU / ml u-PA + 100 U / ml PAI-2 ( ⁇ ), 100 U / ml PAI-2 (0) extended to 19 d (37 ° C) (Fig. 9b).
  • the lysis of the micro-clots [%] was calculated as described in Methods and Tab. 1.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Methode eines Clot-Lyse-Assays, der zur Untersuchung der Thrombolyse, insbesondere durch Urokinase (u-PA), t-PA, Streptokinase (SK), Plasminogen-Streptokinase-Aktivator-Komplex (PSAC), Reteplase (RP) oder Tenecteplase (TP), verwendet werden kann.

Description

Patentanmeldung
Clot-Lyse-Assay
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Methode zur Durchführung eines Clot- Lyse-Assay, der dazu geeignet ist, die Thrombolyse, insbesondere durch Urokinase (u-PA), t-PA, Streptokinase (SK), Plasminogen-Streptokinase-Activator- Complex (PSAC), Reteplase (RP), Tenecteplase (TP), oder Plasmin zu untersuchen.
Hintergrund der Erfindung
Die plasmatische Thrombolyse ist eine derzeitige Therapieform für atherothrom- botische Erkrankungen wie Myocard- oder Cerebral-Infarct [1 ,2]. Die klinisch verfügbaren Plasminogen Aktivatoren (PA) beinhalten Urokinase (u-PA), t-PA, Strep- tokinase (SK), Plasminogen-Streptokinase-Activator-Complex (PSAC), oder Mutanten von t-PA, wie zum Beispiel Reteplase (RP) oder Tenecteplase (TP). Alle Plasminogen Aktivatoren bergen aber gewisse Gefahren, da sie ernste Blutungskomplikationen verursachen können; iatrogene Tode durch Komplikationen bei der plasmatischen Thrombolyse ereignen sich bei bis zu 1 % der Patienten mit akutem Myokard-Infarkt [2]. Zur Zeit gibt es nur wenige Vergleichsdaten zur Clot
Lyse Eignung dieser 6 Plasminogen Aktivatoren in Gegenwart oder Abwesenheit von humanem Plasma im Clot-Überstand [3-7]. Daraufhin wird die plasmatische Thrombolyse simuliert, indem Plasminogen Aktivatoren in verschiedenen Konzentrationen verwendet werden und ihre Clot-Lyse-Aktivität bestimmt wird.
Im Stand der Technik wird routinemäßig das Fibrinolysesystem chromogen über die Enzymaktivität des Plasmins bestimmt. Dieses Messsystem ist nur zum Teil physiologisch, da die letzte Reaktion der Fibrinoiyse, die Auflösung der Fibrinstränge, nicht erfasst werden kann. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Methode zur Messung der Fibrinoiyse in allen Teilreaktionen, insbesondere der Auflösung der Fibrinstränge bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch einen neuartigen Clot-Lyse- Assay, der zur Messung der Fibrin-lytischen Aktivität von Plasmin in Plasma oder Blut statt der chromogenen Aktivität von Plasmin verwendet wird.
Ein Vorteil der neuen Erfindung ist die Verwendung von Mikrotiterplatten, die Mikrothromben enthalten. Die Lyse wird auf Basis der zurückgehenden Trübung des Thrombus bestimmt. 1. Beispiel
Exogene Stimulation der therapeutischen Thrombolyse - Klinische Implikationen
Ein neuer Mikro-Clot-Lyse-Assay - der CLA - wurde zur Untersuchung der Thrombolyse durch Urokinase, t-PA, Streptokinase, PSAC, Reteplase oder Tenecteplase verwendet. Nach 4 h (37 °C) mit 6 % Rinderalbumin oder normalem Humanplasma betrugen die effektiven 50 %-Dosen (ED50) im Clot-Überstand: Urokinase 128 oder 183 lU/ml; t-PA 0.3 oder 0.2 μg/ml; Streptokinase 215 oder 1371 lU/ml; PSAC etwa 60 oder 91 U/ml; Reteplase 664 oder 996 U/ml; Tenecteplase 0.2 oder 0.2 μg/ml.
Die Gegenwart eines Thrombus vergrößert die Aktivität von t-PA 20-30-fach und diejenige von Tenecteplase 300-400-fach nach 4h (37 °C) im Vergleich zu Uroki- nase; im Gegensatz dazu sinkt die Aktivität von Reteplase ungefähr um das Zweifache, d.h. das durch Reteplase gebildete Plasmin wird in seiner lytischen Wirkung gegen einen Thrombus gehindert. . Auf Grund unselektiver Piasminbildung im Plasma können alle PA bei Patienten ernste Hämorrhagien hervorrufen. Physiologische Aktivatoren der Thrombolyse, wie z.B. Granulozyten-Aktivatoren, können die klinische Thrombolyse verbessern.
Methoden:
25 μl PA in 6 % Albumin-PBS und 100 μl 6 % Albumin-PBS oder 100 μl übliches Zitrat-Plasma wurden zu 100 μl-Mikro-Clots gegeben. Nach 0-5 h wurde die Ex- tinktion des Wells bei 405 nm bestimmt. Die Trübung des Clots wurde berechnet, indem die Kontroll-Extinktion der 100%igen Lyse von der in der jeweiligen PA- Reaktion gemessenen Extinktion subtrahiert wurde.
Die effektive 50%-Dosis, d.h. die PA-Konzentration, die nach 4 h zu 50 % der maximalen Lyse führt, wurde für jeden PA bestimmt. Ergebnisse:
Die 4h-ED50-Clot-Lyse-Aktivitäten (CLA) mit Albumin oder Plasma im Clot- Überstand waren: u-PA 128 oder 183 lU/ml, t-PA 0.3 oder 0.2 μg/ml, SK 215 oder 1371 lU/ml, PSAC 60 oder 91 U/ml, RP 664 oder 996 U/ml, TP 0.2 oder 0.2 μg/ml. Die jeweiligen ED25-Werte in Plasma in Abwesenheit eines Clots (25 % der maximal induzierbaren Plasmin-Aktivität in 10minütiger Inkubation der PA in Plasma ohne Gegenwart eines Clots (Pli-10m)):
320 lU/ml u-PA, 8.0 μg/ml t-PA, 6000 lU/ml SK, 140 U/ml PSAC, 720 U/ml RP, und 150 μg/ml TP. Die Pli-10m/CLA-4h für das Plasma-System sind: u-PA 1.7, t- PA 40, SK 4.4, PSAC 1.5, RP 0.7 und TP 750.
Die Gegenwart eines Thrombus steigert die Aktivität des t-PA 20-30-fach und die von Tenecteplase 300-400-fach nach 4 h (37 °C) im Vergleich zu Urokinase, dagegen sinkt die Aktivität von Reteplase ungefähr um das Zweifache, d.h. das durch Reteplase gebildete Plasmin wird in seiner lytischen Wirkung gegen einen Thrombus gehindert.
Diskussion:
Hier wird ein neuer Mikro-Clot-Lyse-Assay vorgestellt, der 6 verschiedene PA miteinander vergleicht. Die Untersuchungen weisen darauf hin, dass verschiedene thrombolytische Agenzien zu unterschiedlichen klinischen Ergebnissen führen, die in erster Linie von endogenen Thromben abhängen dürften.
Abkürzungen:
CLA, Clot Lysis Assay; CLA-4h, Clot Lysis Aktivität nach 4h (37°C); ED50, effektive 50 %-Dosis; Pli-10m, ED25 der Bildung von plasmatischem Plasmin innerhalb von 10 min; PA, Plasminogenaktivator; u-PA, Urin-Plasminogen Aktivator = Urokinase; t-PA, Gewebs- Plasminogen Aktivator; SK, Streptokinase; PSAC, Plasminogen- Streptokinase-Activator-Komplex; RP, Reteplase; TP, Tenecteplase; BSA, Rinder- Serumalbumin; PBS, Phosphat-buffered saline; PAC, 50 % Pathromtin SL®, 6 % BSA, 25 mM CaCI ; AMCHA, Aminomethylcyclohexansäure; FIPA, Fibri- noIyseparameter-Assay; U, Unit; IU, internationale Unit ; MW, Molekulargewicht; D, Dalton; mA, Milliextinktionseinheiten; 0, Mittelwert; PMN, Polymorphonukleäre Neutrophile. Material und Methoden
Herstellung von Mikro-Clots durch Plasma-Recalcifizierung
In Doppelbestimmung wurden 200 μl 1563 mM CaCI2 zu 20 ml normalem humanem Zitrat-Plasma gegeben (1 Teil 106 mM (3.2%) gepuffertes Natriumeitrat pH 7.4 zu 9 Teilen Blut; bei -70 °C eingefroren, Haemochrom, Essen, Deutschland). Davon wurden 100 μl-Portionen sofort in 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Greiner, Nürtigen, Deutschland). Die Platten wurden für 30 min inkubiert (37 °C).
Lyse der vorgebildeten Mikro-Clots
Zu den 100 μl Mikro-Clots (adhärent an der Wand der Wells) wurden in Doppelbestimmung 25 μl 0 - 1000 lU/ml (0 - 200 lU/ml Endkonzentration) u-PA (medac, Hamburg, Deutschland; 1 mg = 100 000 IU; MW = 54 000 D), 0 - 100 μg/ml (0 - 20 μg/ml Endkonzentration) t-PA (Actilyse®, Boehringer Ingelheim, Deutsch- land; 1 mg = 500 000 IU; MW = 70 000 D [7], 1 IU u-PA = 6.5 IU t-PA,
0 - 40 000 lU/ml (0-8000 lU/ml Endkonzentration) SK (Aventis, Frankfurt a.M., Deutschland; MW = 47 000 D [7]), 0-4000 U/ml (0-800 U/ml final conc.) PSAC (DadeBehring, Marburg, Deutschland; MW = 132 000, 1 mg = 41 000 U [4], 0-40000 U/ml (0-8000 U/ml final conc.) Reteplase Rapilysin®, Röche, Basel, Schweiz; 1 mg = 550 000 U; MW=39 000 D [8]), 0-1000 μg/ml (0-200 μg/ml) Tenecteplase (Metalyse®, Boehringer Ingelheim; MW = 70 000 D [9]) - alle Aktivatoren in 6 % bovinem Serumalbumin (BSA; Sigma, Deisenhofen, Deutschland), Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS; Sigma) - und 100 μl BSA-PBS oder normales Humanplasma gegeben.
Die Trübung (= Extinktion bei 405 nm) wurde nach 0, 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5 Stunden (37°C) unter Verwendung eines Mikrotiterplattenreaders bestimmt (Milenia, Di- agnostic Products Corporation, Los Angeles, USA). Die 0 %-Clot (= 100 % Lyse) Extinktions-Kontrolle bestand in einer Verlängerung der Inkubationsperiode auf 20 h (37 °C). Die Trübung des Clots wurde berechnet, indem die Extinktionskontrolle des 0 %-Clots von der gemessenen Extinktion in der PA-Reaktion subtrahiert wurde, und wurde in % der 100%-igen Clotkontrolle dargestellt: Die Clot-Trübung von 0 μg/ml PA wurde als 100 % Clotkontrolle gesetzt (initial 0= 783 ± 10 mA; mit einer Trübungszunahme < 10 % innerhalb von 20 h (37 °C) mit BSA im Überstand; beziehungsweise mit Plasma im Überstand: 0= 783, 882, 948, 984, 1015, 1055, 1079, 226 mA für Inkubationszeiten (37°C) von 0, 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 20 h). Die Variationskoeffizienten waren < 5 %. Die effektive 50 %-Dosis [ED50] für jeden Aktivator wurde mit 6 % Albumin oder normalem Humanplasma im Überstand der Clots bestimmt: Die [ED50] ist definiert als die Aktivatorkonzentration, die nach 4 h (37 °C) zu einer Lyse von 50 % der Clots führt.
Herstellung von Mikro-Clots durch Kontaktphasen-Aktivierung von Plasma
50 μl Normalplasma oder n=29 gesunde Blutspender wurden mit 50 μl 50 % Pathromtin SL® (DadeBehring), 6 % BSA, 25 mM CaCI2 in Mikrotiterplatten (Maxi Sorp; NUNC, Wiesbaden, Deutschland) für 30 min inkubiert (37 °C). Nach der Ge- rinnung wurden entweder 50 μl desselben Plasmas oder 50 μl BSA-PBS zugegeben; die erzeugten Mikro-Clots hafteten nicht an der Wand der Wells.
Lyse der mittels Kontaktphase hergestellten Mikro-Clots Die Plasminogenaktivatoren in BSA-PBS wurden in Konzentrationen zugesetzt, die den obigen ED5o-4h-Konzentrationen entsprachen, wobei im Clot-Überstand der Mittelwert zwischen Albumin und Plasma verwendet wurde: 50 μl 468 lU/ml u- PA( 0.75 μg/ml t-PA, 2379 lU/ml SK, 225 U/ml PSAC, 2490 U/ml RP, 0.6 μg/ml TK oder für die Kontrolle BSA-PBS. Die Trübung der Wells wurde nach 0 - 16 h (37 °C) bestimmt. Die Clotlyse wurde gemäß Tab. 1 bestimmt, wobei der für PA nach 0 h Inkubationszeit gemessene Wert als 100 % Clottrübung verwendet wurde.
Ergebnisse
Die Fig. 1 -3 zeigen die Clotlyse durch u-PA in Gegenwart von gepuffertem Albu- min oder normalem Plasma im Überstand der Mikro-Clots und die Bestimmung der für das Induzieren der effektiven 50%-Dosis erforderlichen PA-Konzentration. Die Fig. 4-6 zeigen die Clotlyse durch t-PA, die Fig. 7-9 diejenige durch Streptoki- nase, die Fig. 10-12 diejenigen durch PSAC, die Fig. 13-15 diejenigen durch Reteplase und die Fig. 16-18 die Clotlyse durch Tenecteplase. Daher ergaben sich die (folgenden) 4h-ED50 Clotlyse-Aktivitäten (CLA) mit 6 % Albumin oder Plasma im Überstand: für u-PA 128 lU/ml oder 183 lU/ml, für t-PA 0.3 μg/ml oder 0.2 μg/ml, für SK 215 lU/ml oder 1371 lU/ml, für PSAC etwa 60 U/ml oder 91 U/ml; für RP 664 U/ml oder 996 U/ml, für TP 0.2 μg/ml oder 0.2 μg/ml. Daher wird das Clotlysevermögen von SK in einem Plasmamilieu inhibiert. Eine verminderte Lyse bei hohen in vitro-Konzentrationen könnte durch unphysiologisch hohe Piasminkonzentrationen hervor gerufen werden, die antifibri- nolytisch wirken könnten.
Die jeweiligen ED25-Werte in Plasma in Abwesenheit eines Clots (25 % der maximal induzierbaren Piasminaktivität nach 10 min Inkubation des PA in Plasma ohne Gegenwart eines Clots (Pli-10m)): 320 lU/ml u-PA, 8.0 μg/ml t-PA, 6000 lU/ml SK, 140 U/ml PSAC, 720 U/ml RP, and 150 μg/ml TP [10]). Diese ED25 wurden bestimmt, weil 25 % der innerhalb von 10 min (37 °C) maximal induzierbaren
Piasminaktivität in Plasma eine klinisch relevante PA-Dosierung zu sein scheinen. Die erhaltenen ED25(Pli-10min)-Werte wurden durch die in Gegenwart eines Mik- ro-clots mit Plasma-Überstand erhaltenen Werte dividiert. Die Pli-10m/CLA-4h- Verhältnisse waren: für u-PA 1.7, für t-PA 40, für SK 4.4, für PSAC 1.5, für RP 0.7, für TP 750.
Dies deutet darauf hin, dass die Gegenwart eines Thrombus die Aktivität von t-PA 20-30-fach und diejenige von Tenecteplase 300-400-fach im Vergleich zu Urokinase erhöht. Im Gegensatz dazu sinkt die Aktivität von Reteplase etwa um das Zweifache, d.h. das durch Reteplase gebildete Plasmin wird in seiner lytischen Wirkung gegen einen Thrombus gehindert.
2 Dosen Reteplase enthalten 8+8 mg Tranexamsäure (trans-Aminomethylcyclo- hexansäure = AMCHA; MW 157.2), was zu einer Plasmakonzentration von etwa 0.05-0.1 mM im Patienten führt. Diese Tranexamkonzentration erhöht die Piasminaktivität im auf Plasma/u-PA basierenden globalen Fibrinolyseassaysystem FIPA [3], etwa um das Zehnfache. 0.02 mM vermindert die Inhibierungskonstante
(klapp) der Plasmin-AP-Reaktion um 50 % [6]. Die omega-Aminosäuren AMCHA, ε-Aminocapronsäure oder Lysin sind Antifibrinolytika. Obwohl sie eine Faltung des
Glu-Plasminogens in die leichter aktivierbare Lys-Plasminogenform induzieren und die Reaktion zwischen Plasmin und Plasmin-Inhibitor verringern, wechselwir- ken sie mit den Lysin-Bindungsstellen von Plasminogen oder t-PA, was zu einer verminderten Fibrin/Plasminogen- oder Fibrin/t-PA-Wechselwirkung führt. Dies könnte die widersprüchlichen Ergebnisse bezüglich Reteplase im Hinblick auf die plasmatische Plasminbildung auf der einen Seite und der Clotlyse auf der anderen Seite erklären, d.h. RP erzeugt große Mengen Plasmin, welches nicht auf Fibrin einwirken kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass die galenische Zusammensetzung eines Arzneimittels ebenfalls von großer Bedeutung sein könnte: Lysin oder Argi- nin könnten beispielsweise eine erwünschte fibrinolytische Wirksamkeit inhibieren: auf molarer Basis ist AMCHA 10-fach wirksamer als ε-Aminocapronsäure und 20- fach wirksamer als Lysin, d.h. die antifibrinolytische Aktivität von 16 mg AMCHA kann auch durch 320 mg Lysin erzielt werden [11 , 12].
Die 1 h-Clot-Lysen mit Albumin [oder Plasma] im Clot-Überstand für Pathromtin- erzeugte nicht adhärente Clots für normales Plasma und die im Methodenteil aufgeführten PA-Konzentrationen waren: u-PA 46 % [35 %], t-PA 41 % [30 %], SK 26 % [17 %], PSAC 30 % [27 %], RP 51 % [37 %], TK 47 % [33 %] (normales Plasma: 100 % Clotgröße = 467 ± 24 lysierbare Milli-Extinktionseinheiten für BSA im Clot-Überstand und 753 ± 39 lysierbare Milli-Extinktionseinheiten für Plasma im Überstand).
Die Blutspender wiesen mit BSA [oder mit ihrem eigenen Plasma] eine Clotlysbar- keit im Clotüberstand auf von: u-PA 46 ± 16 % [38 ± 16 %], t-PA 43 ± 16 % [31 ± 17 %], SK 52 + 18 % [34 ± 18 %], PSAC 47 ± 20 % [39 ± 15 %], RP 42 ± 13 % [31 ± 16 %], TK 43 + 14 % [30 ± 18 %]. Die einzige Korrelation >0.6 war diejenige zwischen der Clotlysbarkeit durch u-PA und durch t-PA, r = 0.614 [r= 0.617], was mit dem für die Plasminbildung im Patientenplasma bestimmten Korrelationsfaktor (r=0.7 [4]) vergleichbar ist; (100 % Clotgröße = 611 ± 158, Bereich: 254 - 815 lysierbare Milli-Extinktionseinheiten für BSA im Clot-Überstand und 835 ± 187, Bereich: 431 - 1114 lysierbare Milli-Extinktionseinheiten für Plasma im Überstand). | g, 12.0<t Diskussion
Die vorliegende Untersuchung zeigt eine kombinierte in vitro-Simulation des Clot- lysevermögens von 6 verschiedenen PA, das mit Hilfe eines neuen Mikrotiterplat- ten-Thrombolysetests untersucht wurde. Kürzlich haben wir die Plasminbildung dieser PA in einem Plasmamilieu in Abwesenheit eines Clots kinetisch untersucht. Hier haben wir die Clotlyseaktivität dieser PA mit 6 % bovinem Albumin oder mit normalem Humanplasma im Überstand von Mikroclots untersucht. Die hier erhaltenen Aktivitätsdaten von Tenecteplase sind identisch mit denjenigen von t-PA (ED50 = 0.2 μg/ml). Die thrombolytische Aktivität von Reteplase ist im Vergleich zu u-PA halb so groß wie ihr Plasminbildungsvermögen.
Bei allen PA besteht die Gefahr des Hervorrufens schwerer Hämorrhagien [2, 13]. Fibrin wird nicht nur im pathologischen Thrombus gefunden .sondern zirkuliert auch in Form löslicher Fibrinpolymere im Blut und besitzt physiologische Funktionen bei der Verhinderung von Blutverlusten oder der Vermeidung von Einblutun- gen in vitale Organbereiche [14, 15]. Untersuchungen zur Dosisfindung mit dem Fibrin selektiven t-PA zeigten, dass die fibrinolytische Wirksamkeit in vivo eine signifikante systemische Plasminogenaktivierung erforderte, wogegen es in gereinigten Systemen in vitro eine hohe selektive fibrinolytische Wirksamkeit zeigte; sog. „t-PA-Paradoxon" [16]. Eine klinische Thrombolyse sollte die physiologisch selektive Thrombolyse imitieren, deren Ursprung hauptsächlich nicht plasmati- scher Natur ist [17-20].
Die vorliegende Arbeit deutet darauf hin, dass verschiedene thrombolytische Agenzien unterschiedliche klinische Ergebnisse zeigen könnten, was vor allem von endogenen Thromben abhängen dürfte.
Tabelle 1 :
Clot Lyse Assay (CLA)
50 μl Plasma 50 μl 50 % Pathromtin SL®, 6 % BSA, 25 mM CaCI2 (PAC)
30 min (37°C)
50 μl Thrombolytikum (z.B. Plasminogen-Aktivator oder Plasmin) in 6 % BSA-PBS oder 6 % BSA-PBS ohne Thrombolytikum
Extinktion bei 405 nm nach 0 - 16 h (37°C) A: Haupt-Trübung
Extinktion des Thrombolytikum-wells nach Inkubationszeit
B: 0 % Clottrübung
Ersetzen von PAC durch 6 % BSA-PBS und Zugabe von 35 mA (Eigentrübung) von 50 μl 50 % Pathromtin) zur gemessenen Extinktion
(Alternativ: Extinktion von 1000 lU/ml u-PA nach 16 h Inkubationszeit)
C: 100 % Clottrübung
Extinktion von 6 % BSA-PBS well nach 16 h Inkubationszeit (Alternativ: Falls die lysbaren Clottrübungseinheiten um weniger als 10 % / 16 h: Extinktion von PA in 6% BSA-PBS bei 0 h Inkubationszeit) Clotgröße [%] = (A-B)/(C-B) * 100
Clotlyse [%] = 100 - (A-B)/(C-B) * 100 = (C-A)/(C-B) * 100
Figurenbeschreibungen
Fig. 1a: Clotlyse durch u-PA mit 6 % bovinem Albumin im Überstand des Clots Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl u-PA in 6 % BSA-PBS und 100 μl 6 % BSA- PBS gegeben. Nach 0 - 5 h (37°C) wurde die Trübung bei 405 nm bestimmt. Die initiale Clottrübung betrug 782 + 10 mA (Tab. 1). Die Konzentrationen in den zu- gesetzten Überständen waren: 0 lU/ml u-PA (0); 0.78 lU/ml u-PA (O); 1.56 lU/ml u-PA (D); 3.13 lU/ml u-PA (+); 6.25 lU/ml u-PA (•); 12.5 lU/ml u-PA (*); 25 lU/ml u-PA (X); 50 lU/ml u-PA (A); 100 lU/ml u-PA (■); 200 lU/ml u-PA (♦). Fig. 1b: Clotlyse durch u-PA mit normalem Humanplasma im Überstand des Clots
Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl u-PA in 6 % BSA-PBS und 100 μl normales Humanplasma gegeben. Nach 0 - 5 h (37°C) wurde die Clottrübung bestimmt. Die Konzentrationen im zugesetzten Überstand waren: 0 lU/ml u-PA (0); 0.78 lU/ml u-PA (O); 1.56 lU/ml u-PA (D); 3.13 lU/ml u-PA (+); 6.25 lU/ml u-PA (•); 12.5 lU/ml u-PA (*); 25 lU/ml u-PA (X); 50 lU/ml u-PA ( A); 100 lU/ml u-PA (■); 200 lU/ml u-PA (♦).
Fig. 1c: Clotlyse durch u-PA; Bestimmung der ED5o Die Clotlyse-Aktivität wurde für 2- und 4-stündige Inkubationsperioden der Mikro- Clots mit u-PA bestimmt. 2h BSA-PBS im Überstand des Clots (Δ); 2h normales Plasma im Clotüberstand (O); 4h BSA-PBS im Überstand des Clots (A); 4h normales Plasma im Überstand des Clots (•).
Fig. 2a: Clotlyse durch t-PA mit 6 % bovinem Albumin im Überstand des Clots Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl t-PA in 6 % BSA-PBS und 100 μl 6 % BSA- PBS gegeben. Nach 0 - 5 h (37°C) wurde die Clottrübung wie in Fig. 1a beschrieben bestimmt. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 0.078 μg/ml t-PA (O); 0.156 μg/ml t-PA (D); 0.313 μg/ml t-PA (+); 0.625 μg/ml t-PA (•); 1.25 μg/ml u-PA (*); 2.5 μg/ml t-PA (X); 5 μg/ml t-PA (A); 10 μg/ml t-PA (■); 20 μg/ml t-PA (♦).
Fig. 2b: Clotlyse durch t-PA mit normalem Humanplasma im Überstand des Clots Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl t-PA in 6 % BSA-PBS und 100 μl normales Humanplasma gegeben. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 0.078 μg/ml t-PA (O); 0.156 μg/ml t-PA (D); 0.313 μg/ml t-PA (+); 0.625 μg/ml t-PA (•); 1.25 μg/ml u-PA (*);2.5 μg/ml t-PA (X); 5 μg/ml t-PA (A); 10 μg/ml t-PA (■); 20 μg/ml t-PA (♦). Fig. 2c: Clotlyse durch t-PA; Bestimmung der ED5o
Die Clotlyse-Aktivität wurde für 2- und 4-stündige Inkubationsperioden der Mikro- Clots mit t-PA bestimmt. 2h BSA-PBS im Überstand des Clots (Δ); 2h normales Plasma Im Clotüberstand (O); 4h BSA-PBS im Überstand des Clots (A); 4h nor- males Plasma im Überstand des Clots (•).
Fig. 3a: Clotlyse durch Streptokinase mit 6 % bovinem Albumin im Überstand des
Clots
Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl Streptokinase (SK) in 6 % BSA-PBS und 100 μl 6 % BSA-PBS gegeben. Nach 0 - 5 h (37°C) wurde die Clottrübung wie in Fig.
1a beschrieben bestimmt. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 31.3 lU/ml SK (O); 62.5 lU/ml SK (D); 125 lU/ml SK (+); 250 lU/ml SK (•);
500 lU/ml SK (*); 1000 lU/ml SK (X); 2000 lU/ml SK (A); 4000 lU/ml SK (■);
8000 lU/ml SK (♦).
Fig. 3b: Clotlyse durch Streptokinase mit normalem Humanplasma im Überstand des Clots
Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl Streptokinase (SK) in 6 % BSA-PBS und 100 μl normales Humanplasma gegeben. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 31.3 lU/ml SK (O); 62.5 lU/ml SK (D); 125 lU/ml SK (+); 250 lU/ml SK (•); 500 lU/ml SK (*);1000 lU/ml SK (X); 2000 lU/ml SK (A); 4000 . lU/ml SK (■); 8000 lU/ml SK (♦).
Fig. 3c: Clotlyse durch Streptokinase; Bestimmung der ED50 Die Clotlyse-Aktivität wurde für 2- und 4-stündige Inkubationsperioden der Mikro- Clots mit Streptokinase bestimmt. 2h BSA-PBS im Überstand des Clots (Δ); 2h normales Plasma im Clotüberstand (O); 4h BSA-PBS im Überstand des Clots (A); 4h Plasma im Überstand des Clots (•).
Fig. 4a: Clotlyse durch PSAC mit 6 % bovinem Albumin im Überstand des Clots Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl PSAC in 6 % BSA-PBS und 100 μl 6 % BSA- PBS gegeben. Nach 0 - 5 h (37°C) wurde die Clottrübung wie in Fig. 1a beschrieben bestimmt. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 3.13 U/ml PSAC (O); 6.25 U/ml PSAC (D); 12.5 U/ml PSAC (+); 25 U/ml PSAC (•); 50 U/ml PSAC (*); 100 U/ml PSAC (X); 200 U/ml PSAC (A); 400 U/ml PSAC (■); 800 U/ml PSAC (♦).
Fig. 4b: Clotlyse durch PSAC mit normalem Humanplasma im Überstand des Clots
Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl PSAC in 6 % BSA-PBS und 100 μl normales Humanplasma gegeben. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 3.13 U/ml PSAC (O); 6.25 U/ml PSAC (D); 12.5 U/ml PSAC (+); 25 U/ml PSAC (•); 50 U/ml PSAC (*); 100 U/ml PSAC (X); 200 U/ml PSAC (A); 400 U/ml PSAC (■); 800 U/ml PSAC (♦).
Fig. 4c: Clotlyse durch PSAC; Bestimmung von ED50
Die Clotlyse-Aktivität wurde für 2- und 4-stündige Inkubationsperioden der Mikro- Clots mit PSAC bestimmt. 2h BSA-PBS im Überstand des Clots (Δ); 2h normales Plasma im Clotüberstand (O); 4h BSA-PBS im Überstand des Clots (A); 4h normales Plasma im Überstand des Clots (•).
Fig. 5a: Clotlyse durch Reteplase mit 6 % bovinem Albumin im Überstand des ClotS
Zu 100 μl MiKro-Clots wurden 25 μl Reteplase (RP) in 6 % BSA-PBS und 100 μl 6 % BSA-PBS gegeben. Nach 0 - 5 h (37°C) wurde die Clottrübung wie in Fig. 1 a beschrieben bestimmt. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 31.3 U/ml RP (O); 62.5 U/ml RP (D); 125 U/ml RP (+); 250 U/ml RP (•); 500 U/ml RP (*); 1000 U/ml RP (X); 2000 U/ml RP (A); 4000 U/ml RP (■); 8000 U/ml RP ( ).
Fig. 5b: Clotlyse durch Reteplase mit normalem Humanplasma im Überstand des Clots Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl Reteplase (RP) in 6 % BSA-PBS und 100 μl normales Humanplasma gegeben. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 31.3 U/ml RP (O); 62.5 U/ml RP (D); 125 U/ml RP (+); 250 U/ml RP (•); 500 U/ml RP (*); 1000 U/ml RP (X); 2000 U/ml RP (A); 4000 U/ml RP (M); 8000 U/ml RP (♦).
Fig. 5c: Clotlyse durch Reteplase; Bestimmung der ED5o 5 Die Clotlyse-aktivität wurde für 2- und 4-stündige Inkubationsperioden der Mikro- Clots mit Reteplase bestimmt. 2h BSA-PBS im Überstand des Clots (Δ); 2h normales Plasma im Clotüberstand (O); 4h Plasma im Überstand des Clots (A); 4h Plasma im Überstand des Clots (•).
o Fig. 6a: Clotlyse durch Tenecteplase mit 6 % bovinem Albumin im Überstand des Clots Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl Tenecteplase (TP) in 6 % BSA-PBS und 100 μl 6 % BSA-PBS gegeben. Nach 0 - 5 h (37°C) wurde die Clottrübung wie in Fig. 1 a beschrieben bestimmt. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen 5 waren: 0.049 μg/ml (Δ); 0.098 μg/ml TP (■); 0.195 μg/ml TP (♦); 0.39 μg/ml TP (0); 0.78 μg/ml TP (O); 1.56 μg/ml TP (D); 3.13 μg/ml TP (+); 6.25 μg/ml TP (•); 12.5 μg/ml TP (*); 25 μg/ml TP (X); 50 μg/ml TP (-A-); 100 μg/ml TP (-■-); 200 μg/ml TP (-♦-). 0 Fig. 6b: Clotlyse durch Tenecteplase mit normalem Humanplasma im Überstand des Clots Zu 100 μl Mikro-Clots wurden 25 μl TP in 6 % BSA-PBS und 100 μl normales Humanplasma gegeben. Die Konzentrationen in den zugesetzten Überständen waren: 0.049 μg/ml TP (Δ);0.098 μg/ml TP (■); 0.195 μg/ml TP (♦); 0.39 μg/ml TP5 (0); 0.78 μg/ml TP (O); 1.56 μg/ml TP (D); 3.13 μg/ml TP (+); 6.25 μg/ml TP (•); 12.5 μg/ml TP (*); 25 μg/ml TP (X); 50 μg/ml TP (~A~); 100 μg/ml TP (-■--); 200 μg/ml TP (-♦-).
Fig. 6c: Clotlyse durch Tenecteplase; Bestimmung der ED500 Die Clotlyse-Aktivität wurde für 2- und 4-stündige Inkubationsperioden der Mikro- Clots mit Tenecteplase bestimmt. 2h BSA-PBS im Überstand des Clots (Δ); 2h normales Plasma im Clotüberstand (O); 4h BSA-PBS im Überstand des Clots (A); 4h normales Plasma im Überstand des Clots (•). Literatur 1. Bizjak ED, Mauro VF. Thrombolytic therapy: a review of its use in acute myocardial infarction. Ann Pharmacother 1998; 32: 769-84. 2. Cundiff DK. Thrombolysis for acute myocardial infarction: drug review. 5 MedGenMed 2002; 4: 1 3. Stief TW, Hinz F, Kurz J, Doss MO, Kretschmer V. A simple screening as- say for certain fibrinolysis parameters (FIPA). Thromb Res 2000; 97: 231 -7. 4. Stief TW. The susceptibility of plasma to activation of fibrinolysis. Blood Coagul Fibrinolysis 1993; 4: 123-5. o 5. Stief TW. Oxidized fibrin stimulates the activation of pro-urokinase and is the preferential Substrate of human plasmin. Blood Coagul Fibrinolysis 1993; 4: 117-21. 6. Collen D, Lijnen HR. The fibrinolytic System in man. CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1986; 4: 249-301. 5 7. Lijnen HR. Elements of the fibrinolytic System. Ann NY Acad Sciences 2001 ; 936: 226-36. 8. Seifried E, Müller M, Martin U, König R, Hombach V. Bolus application of a novel recombinant plasminogen activator in acute myocardial infarction pa- tients: pharmacokinetics and effects on the hemostatic system. Ann NY 0 Acad Sei 1992; 667: 417-20. 9. Van de Werf FJ. The ideal fibrinolytic: can drug design improve clinical re- sults ? Europ Heart J 1999; 20: 1452-8. 10. Stief TW, Bünder R, Richter A, Maisch B, Renz H, Fareed J. In vitro - Simulation of therapeutic plasmatic fibrinolysis. Clin Appl Thromb Hemost 2003;5 (in press) 11. Stief TW, Lenz P, Becker U, Heimburger N. Determination of plasminogen activator (PAI) capacity of human plasma in presence of oxidants: a novel principle. Thromb Res 1988; 50: 559-73. 12. Stief TW, Weippert M, Kretschmer V, Renz H. Arginine inhibits hemostasis o activation. Thromb Res 2001 ; 104: 265-74. 13. Fox KA. Have we reached the limit with thrombolytic therapy ? Cardiovasc Drugs Ther 1999; 13: 211-6. 14. Schafer AI. Warfarin for venous thromboembolism - walking the dosing tightrope. N Engl J Med 2003; 348: 1478-80. 15. Nagy Z, Kolev K, Csonka E, Vastag M, Machovich R. Perturbation of the integrity of the blood-brain barrier by fibrinolytic enzymes. Blood Coagul Fibrinolysis 1998; 9:471 -8.
16. Gurewich V. Fibrinolysis: an unfinished agenda. Blood Coagul Fibrinolysis 2000; 11 : 401 -8.
17. Langleben D, Moroz LA. Participation of blood cells in exercise-induced fibrinolysis. Thromb Res 1985; 39: 733-40.
18. Stief TW, Fareed J. The antithrombotic factor singlet oxygen/light (1O2/hv). Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 2000; 6: 22-30. 19. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med 1989; 320: 365- 76. 20. Stief TW. The blood fibrinolysis/deep-sea analogy: a hypothesis on the cell Signals singlet oxygen/photons as natural antithrombotics. Thromb Res 2000; 99: 1-20.
2. Beispiel
Singulett-Sauerstoff verstärkt die intrinsische Thrombolyse - der intrinsi- sche oxidative Clot-Lyse-Assay (INOXCLA)
Die Haupteffektorzellen der zellulären Thrombolyse sind aktivierte polymorpho- nukleäre Neutrophile. Diese Zellen bilden Urokinase (u-PA) und Hypochlo- rit/Chloramine, die Donoren für nicht radikalischen angregten Sauerstoff vom Typ des Singulett-Sauerstoffs sind (1O2). Hier wird die von u-PA/1O2 vermittelte intrin- sische plasmatische Thrombolyse in einem Mikrotiterplatten-Clot-Lyse-Assay imitiert.
Methoden: 75 μl Plasma werden mit 50 μl 50 % Pathromtin SL®, 6 % BSA, 38 mM CaCI2 für 30 min (37°C) inkubiert. Dann werden 50 μl 10 mM Chloramine-T® in PBS zugegeben. Nach 30 min (37°C) werden 50 μl 0, 100, oder 10 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugegeben, und die Trübung wird als Extinktion bei 405 nm nach 0 h, 3 h beziehungsweise 16 h bestimmt. Ergebnisse: 0.5 - 1 μmol Chloramin steigern die Clotlyse > 10-fach (ED5o= 0.25 μmol). 0.5 μmol Chloramin führen zu einer normalen Lyse von etwa 60 %. Der Normalbereich für INOXCLA ist 100 % + 25 % (0 ± SD; in % des Normal- Standards; CVs < 10 %). 50 % Lyse der adhärenten 125 μl Mikro-Clots tritt nach 0.75 h, 2 h, 14 h, 13 d oder 17 d (37°C) bei Verwendung von 1000, 100, 10, 1 oder 0 lU/ml u-PA-Reagenz ein. Wenn die u-PA-Aktivität durch PAI-2 inhibiert wird, tritt keine Clotlyse auf.
o Diskussion: 1O2 verstärkt die u-PA-vermittelte Lyse von Plasmaclots nachhaltig. Basierend auf dem natürlichen u-PA/1O2-Synergismus wurde ein neuer allgemeiner Hämostaseassay abgeleitet: der intrinsische oxidative Clot-Lyse-Assay.
Abkürzungen: 5 ΔA, Zunahme der Extinktion; BSA, bovines Serumalbumin; CS, chromogenes Substrat, CT, Chloramine T® (N-Chlor-Toluolsulfonamid); ED5o, effektive 50%-Dosis; 0 FIPA, Fibrinolyseparameter-Assay; G, Schwerkraft (relative Zentrifugalkraft); INOXCLA, intrinsischer oxidativer Clot-Lyse-Assay; INOXCLA(x), INOXCLA mit x lU/ml u-PA-Reagenz; mA, Milli-Extinktionseinheiten;5 1O2, Singulettsauerstoff; PAC, 50 % Pathromtin (verdünnt mit physiol. NaCI), 6 % BSA, 38 mM CaCI2; PMN, polymorphonukleäre Neutrophile; rpm, Umdrehungen pro Minute; rr, Rotationsradius (in cm);0 RT, Raumtemperatur; SD, Standardabweichung; 0, Mittelwert. Die Haupteffektorzellen der zellulären Thrombolyse sind aktivierte polymorpho- nukleäre Neutrophile (PMN) [1 -6]. PMN produzieren Urokinase (u-PA), und mittels Aktivierung der NADPH-Oxidase und Myeloperoxidase erzeugen sie Oxidatien des Hypochlorit/Chloramin-Typs, die Donoren für nicht radikalischen angeregten Sauerstoff vom Typ des Singulettsauerstoffs (1O2) sind.
Wir interessierten uns für die Wechselwirkung von 1O2 mit der Kontaktphase der Hämostase und imitierten die u-PA/1O2-vermittelte intrinsische plasmatische Thrombolyse in einem Mikrotiterplatten-Clot-Lyse-Assay (INOXCLA).
2. Material und Methoden
Herstellung der Mikro-Clots
50 μl gepooltes normales Plasma aus 5 ml Citrat-Blut (1 Teil 106 mM Natriumeitrat
+ 9 Teile Blut; Zentrifugation bei 2500 g (4000 rpm) für 10 min (G = 0.00001118 - rr • rpm2); 1.5 ml Plasmaproben von n=48 gesunden Blutspendern wurden vereinigt: 1 ml-Aliquote wurden bei -80 °C eingefroren und vor der Analyse unter Schütten innerhalb von 180 sec. bei 37 °C in einem Wasserbad aufgetaut; Proben davon wurden 12-fach mit 50 μl 50 % Pathromtin SL®, enthaltend 6 % BSA, 25 mM CaCI2, für 30 min (37°C) inkubiert. 50 μl Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS=10 mM Na2HPO4, 138 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH 7.4; Dulbecco's PBS, Endotoxin frei; PAA Laboratories GmbH, Wien, Österreich) wurden mit Hilfe einer Multipette (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) unter einem Winkel kleiner 45° in die Mikrotiterplatten (PolySorp, NUNC) gegeben, und die Wells wurden für weitere 30 min in einem Inkubator (37 °C) inkubiert. Dann wurden 25 μl aus jedem Well abgezogen, vereinigt und in einem Hitachi 917 Analyzer (Röche, Basel, Schweiz) auf ihren Pseudocholinesterasegehalt PCHE) untersucht. Die Experimente wurden ebenfalls mit Wells durchgeführt, die mit 75 μl Plasma und 50 μl Pathromtin-BSA-Reagenz, enthaltend 38 mM CaCI2, gefüllt waren. Vereinigtes Normalplasma enthielt 5496 U/ml PCHE, 6% Albumin enthiel- ten 544 U/ml PCHE. Aus der PCHE-Aktivität, die im Clot-Überstand gefunden wurde (1156 + 29 U/ml), wurde der Anteil der flüssigen Phase in den Wells zu 80 μl für die 100 μl-Clots + 50 μl PBS und ebenfalls zu 80 μl für die 125 μl-Clots + 50 μl PBS berechnet (x-fache Verdünnung der Probe), d.h. 30 μl der adhärenten Mikro-Clots befinden sich in der flüssigen Phase.
INOXCLA Optimierung
2.1. Steigerung der Clot-Lyse durch Kontaktphasenaktivierung
In Doppelbestimmung wurden 50 μl-Proben (normales humanes Citrat-Plasma; bei -70 °C eingefroren, Haemochrom, Essen, Deutschland) mit 20 ml physiol. NaCI., 64 mM CaCI2 mit oder ohne 100 μg/ml Polybren ® (Hexadimethrinbromid, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) oder mit 20 ml Pathromtin SL® (Siliciumdio- xidpartikel, pflanzliche Phospholipide, 2.4 g/l NaCI (MW=58.4), 14.3 g/l Hepes, pH 7.6; DadeBehring, Marburg, Deutschland) 64 mM CaCI2 (MW=110.9) mit oder ohne 100 μg/ml Polybren® für 30 min (37 °C) in 300 μl 96-Well-Mikrotiter-Wells mit flachem Boden (PolySorp, NUNC, Wiesbaden) inkubiert, was zur Bildung von Mikro-Clots führte. Es wurden 50 μl 0 mM oder 10 mM Chloramin-T® (MW=281.6 als Tihydrat, Sigma) in PBS zugegeben. Nach 30 min (37 °C) wurden 50 μl 0 lU/ml oder 10 lU/ml u-PA (1 mg = 100 000 IU; MW = 54 000 D; medac, Hamburg, Deutschland) in 6 % bovinem Serumalbumin (BSA)-PBS (Sigma) zugege- ben. Nach 0 - 170 h (37 °C) wurde die Trübung der Wells bei 405 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Readers bestimmt (Milenia, DPC Biermann, Los Angeles, USA). Nach 24-stündiger Inkubation wurde 10 μl 2.3 % NaN3 (MW=65.0, Sigma) in physiol. NaCI zugegeben.
Die 0 % Clottrübungskontrollen bestanden aus dem Ersatz von CaCI2 ± Pathromtin durch physiol. NaCI und Zugabe von 28 mA, falls Pathromtin verwendet worden war (= Eigentrübung von 20 μl Pathromtin).
Die lysbare Clottrübung [% der initialen Clottrübung] wurde als das Hundertfache des Verhältnisses aus (Welltrübung nach Inkubation - 0 % Clottrübung)/(initiale Welltrübung - 0 % Clottrübung) berechnet (Tabelle 2). Bei der 100 %-Clot- Kontrolle handelte es sich um die initiale Trübung der Wells, da die Zunahme der lysbaren Trübungseinheiten innerhalb 24 h < 15 % betrug. 2.2. Optimierung der Pathromtin-Konzentration
50 μl 0 - 100 % Pathromtin SL® (verdünnt in physiol. NaCI), versetzt mit 6 % BSA, 38 mM CaCI2, wurden mit 75 μl vereinigtem normalem Plasma für 30 min (37 °C) inkubiert. 50 μl 10 mM Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben und für 30 min (37 °C) inkubiert. 50 μl 0 lU/ml, 10 lU/ml oder 100 lU/ml u-PA in 6 % BSA- PBS wurden zugegeben und die Clotlyse nach 0 - 16 h bestimmt.
2.3. Optimierung der Chloraminmenge
75 μl gepooltes normales Plasma wurden mit 50 μl PAC (50% Pathromtin SL®, enthaltend 6% BSA, 38 mM CaCI2) für 30 min (37°C) in Mikrotiterplatten mit flachem Boden inkubiert. 50 μl 0-50 mM (= 0 - 2.5 μmol) CT wurden zugegeben. Nach 30 min (37°C) wurden 50 μl 0, 10, 100 oder 1000 lU/ml u-PA in BSA-PBS zugegeben, und die Trübung der Wells wurde nach 0 - 28 d (37°C) bestimmt.
Die Clotlyse wurde wie in Tab. 1 beschrieben berechnet. INOXCLA00) und INOXCLA000) wurden mit n=24 Plasmen von gesunden Blutspendern durchgeführt (5 ml Citrat-Blut), wobei die Chloraminmenge von 0 - 1.5 μmol variiert wurde.
2.4. Optimierung der u-PA-Konzentration 50 μl vereinigtes normales Humanplasma wurden mit 50 μl PAC für 30 min (37°C) inkubiert, um adhärente Mikro-Clots herzustellen. 50 μl 0, 5, 10, 20 mM (0, 0.25, 0.5, 1 μmol) Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben und für 30 min (37 °C) inkubiert. Dann wurden 50 μl 0 - 31.4 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugegeben und die Extinktion bei 405 nm nach 0 und 16 h (37 °C) bestimmt. Die Clotlyse wurde wie in Tabelle 1 beschrieben berechnet.
50 μl gepooltes normales Plasma wurde mit 50 μl Pathromtin SL®, das 25 mM CaCI2 und 6 % BSA enthielt, für 30 min (37°C) inkubiert, um adhärente Mikro- Clots zu erzeugen. 50 μl 0, 5, 10, 20 mM (0, 0.25, 0.5, 1 μmol) Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben und für 30 min (37°C) inkubiert. Dann wurden 50 μl 0 - 1000 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugegeben und die Extinktion bei 405 nm nach 0, 40, 100, 160 min (37°C) bestimmt. Die Clotlyse wurde wie in Tabelle 2 beschrieben berechnet. 2.5. Lyse von nicht adhärenten Mikro-Clots
50 μl vereinigtes normales Citrat gepuffertes Plasma wurden 6-fach mit 50 μl 50 %igem Pathromtin SL® (DadeBehring, Marburg, Deutschland), 6 % BSA, 25 mM CaCI2 für 30 min (37°C) inkubiert, um nicht adhärente Mikro-Clots in Mikroti- terplatten mit flachem Boden zu bilden (MaxiSorp NUNC, Wiesbaden, Deutschland; im Gegensatz zu adhärenten Mikro-Clots können nicht adhärente Mikro- Clots durch einmaliges festes Aufklopfen der Platte auf absorbierendes Papier aus der Platte gelöst werden). 50 μl 10 mM Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben. Die INOXCLA wird bevorzugt mit Mikrotiterplatten durchgeführt, die "die Bildung adhärenter Clots gestatten.
Die Lyse nicht adhärenter Clots ist jedoch ebenfalls von klinischer Bedeutung, z.B. sind Clots bei Lungenembolie häufig nicht adhärent. Nach 30 min (37°C) wurden 50 μl 0, 1 , 10, 100, 1000 lU/ml u-PA in BSA-PBS, 50 μl 100 (u-PA hemmende) Einheiten/ml Plasminogenaktivator-Inhibitor (PAD-2 (DadeBehring) oder 50 μl 1 lU/ml u-PA, 100 U/ml PAI-2 in BSA-PBS zugegeben und die Trübung der Wells (Extinktion bei 405 nm) nach 0 - 17 h bestimmt; nach 24 h wurden 10 μl 2.3 %ige NaN3 (Sigma) in physiol. NaCI zugegeben, und die Trübung der Wells wurde nach 0 - 19 d (37 °C) bestimmt. Die 100%-Lyse-(= 0 % Clot)-Kontrolle bestand im Ersetzen der PAC durch BSA-PBS und Zugabe von 35 mA (Eigentrübung von Pathromtin) zur gemessenen Extinktion; diese korrigierte 100%-ige Lysekontrolle war identisch mit der Trübung der Wells, die für 17 h (37 °C) mit 50 μl 100 lU/ml u-PA behandelt wurden. Die 100%-ige Clotkontrolle stellte die initiale Trübung der Wells dar, da die Zunahme der lysbaren Trübungseinheiten innerhalb 17 h < 15 % betrug.
2.6. INOXCLA-Präzision und - Normalbereich
Die Variationskoeffizienten (CV) der INOXCLA wurden bestimmt: gepooltes nor- males Plasma, überführt in adhärente Mikro-Clots, wurde 10-fach im intra- und inter-Assay INOXCLA00), INOXCLA(100) analysiert. Die Mittelwerte und die CV- Werte wurden berechnet (CV= 100 * SD/0). Die INOXCLA wurde mit n=36 Citratplasma-Proben gesunder Blutspender durchgeführt (5 ml Blutproben; die Plasmaproben waren < 3 h alt, normale basale Hä- mostaseparameter PT, APTT, Fibrinogen, ATIII). Der Normalbereich der INOXCLA wurde als Mittelwert (0) ± Standardabweichung (SD) berechnet, wobei die mitt- lere Clotlyse als 100 % der normalen Aktivität gesetzt wurde.
2.7. INOXCLA-Korrelation mit Fibirinogen, Plasminogen und FIPA
Die INOXCLA-Ergebnisse für n=36 Normalproben wurden zum funktionalen Fibri- nogen in Beziehung gesetzt (modifizierte Clauss-Methode, Behring-Coagulation Timer). Diese Proben wurden ebenfalls im Fibrinolyseparameter-Assay untersucht (FIPA): 50 μl Probe oder 100 % normales gepooltes Plasma wurde mit 50 μl 10 lU/ml u-PA, 1.1 mM Tranexamsäure (MW=157; Sigma), 6 % BSA-PBS wurden für 20 min (37°C) inkubiert. Dann wurden 50 μl 3 mM HD-Val-Leu-Lys-pNA (Hae- mochrom), 1.2 M KCI (MW=74.6; Sigma), 0.45 M Arginin, pH 8.7 (FW=174.2; Sigma) zugegeben und die Zunahme der Extinktion bei 405 nm überwacht (RT=25°C). Die Ergebnisse der Piasminaktivität wurden mit derjenigen Aktivität verglichen, die in 100 % normalem Plasma erzeugt worden war. Plasmatisches Plasminogen wurde chromogen bestimmt (DadeBehring).
3. Ergebnisse
3.1. Clotlyse-Zunahme durch Kontaktphasenaktivierung Das u-PA-Reagenz mit 10 lU/ml u-PA induziert nur dann eine Thrombolyse, wenn der Clot oxidiert wird (Fig. 1 a). Ohne Pathromtin sowie ohne Oxidationsmittel nimmt die Trübung der löslichen Clots in Abwesenheit oder Gegenwart von Polybren innerhalb von 170 h bis zu einem Wert von 120 % des initialen Wertes zu. Die Zugabe von Pathromtin führt innerhalb von 12 h zu einer 5 - 10%igen Zu- nähme der Trübung der löslichen Clots (Fig. 1 a). Die 100%-ige Trübung der löslichen Clots betrug für 50 μl normales Plasma 310 ± 18 mA, die 0%-ige Trübung der Clots betrug für 50 ml normales Plasma 321 + 10 mA. 3.2. Optimierung der Pathromtin-Konzentration 50 % Pathromtin wurden als die optimale Pathromtin-Konzentration betrachtet: Die Clot-Lyse-Kurve nähert sich ihrem Maximum asymptotisch bei Pathromtin- Konzentrationen > 40 %. Ohne Pathromtin ist die Clot-Lyse etwa 5-fach niedriger 5 als mit 50 - 100 % Pathromtin-Reagenz (Fig. 1 b).
3.3. Optimierung der Chloramin-Menge Die Fig. 2a,b zeigen die lösliche Clottrübung normalen Plasmas in Abhängigkeit o von der Inkubationszeit und der Oxidationsmittelkonzentration. Es tritt eine 10%- ige Zunahme der Clottrübung/μmol Chloramin-T auf. Im INOXCLA00) beträgt die optimale Chloraminmenge, die zu den Mikroclots gegeben wird, 0.5-1 μmol, dies führt zu einer im Vergleich zu nicht oxidierten Clots > 100-fach verstärkten Clotlyse (Fig. 3a,b). Diese Menge an Oxidationsmittel führt zu einer Lyse von rund5 60 %; die Oxidation durch > 1.5 μmol führt zu einer verminderten Clotlyse, die Zugabe von 2.5 mmol Chloramin führt zu einem vollständigen Verlust der Lyse (Fig. 3b). Auch im INOXCLA(100) trat die maximale Lyse (etwa 60 %) mit 0.5 - 1 mmol Chloramin auf (Fig. 4a, b). In einer INOXCLA(1000)-Version des Assays stellen 0.5 - 1 μmol die optimale Chloraminmenge dar, welche zu einer Clotlyse0 von rund 60 % nach 45 min führt (37 °C) (Fig. 5a, 5b). Die Ergebnisse des I- NOXCLA(1) und des INOXCLA(o) sind in Fig. 6a und 6b gezeigt. Nach 0.75 h, 2 h, 14 h, 13 d oder 17 d (37°C) traten nach Verwendung von 1000, 100, 10, 1 oder 0 lU/ml u-PA reagent 50 % Clotlyse der adhärenten 125 μl Mikro-Clots auf. Die Chloraminmenge, die 50 % der maximal induzierbaren Thrombolyse induziert,5 liegt bei etwa 0.25 μmol (Fig. 3b, 4b, 5b, 6b).
Die Fig. 7a,b zeigen INOXCLA(10) und INOXCLA000) mit steigenden Chlora- minmengen für n=24 verschiedene Blutspender. Auch hier betrag das Clotlyse- Optimum 0.5 - 1.0 μmol Chloramin für jedes einzelne Plasma.0 3.4. Optimierung der u-PA-Konzentration
Nicht oxidierte Clots werden nur lysiert, wenn die u-PA-Konzentration im Reagenz > 16 lU/ml beträgt. Falls die u-PA-Konzentration im Reagenz < 16 lU/ml ist, verstärkt eine Oxidation der Clots mit 0.5 - 1 μmol Chloramin die Thrombolyse > 100- fach (Fig. 8a). Fig. 8b-e zeigt die Lyse nicht oxidierter und oxidierter Mikro-Clots durch 0-1000 lU/ml u-PA im Reagenz nach 10 min (Fig. 8b), 40 min (Fig. 8c), 100 min (Fig. 8d) oder 160 min (Fig. 8e); 100 % lösliche Clottrübungseinheiten = 345 ± 9 mA.
3.5. Lyse von nicht adhärenten Mikro-Clots
Fig. 9a zeigt die Lyse normaler oxidierter nicht adhärenter Mikro-Clots durch u-PA im INOXCLA. Eine 50%-ige Clotlyse tritt nach 0.5 h, 1.5 h, 7 h, 5 d oder 9 d (37°C) bei entsprechender Verwendung von 1000, 100, 10, 1 oder 0 lU/ml u-PA- Reagenz auf. Zugabe von 50 μl 1 lU/ml u-PA führt zu 5 - 10 % Lyse nach 17 h
(37 °C). Wenn das 1 lU/ml u-PA-Reagenz mit 100 u/ml PAI-2 aufgestockt wird, tritt innerhalb von 19 d (37 °C) fast keine Clotlyse auf.
Fig. 9b zeigt die Lyse normaler oxidierter nicht adhärenter Mikro-Clots mit 50 μl 1 lU/ml u-PA, 0 lU/ml u-PA, 1 lU/ml u-PA + 100 U/ml PAI-2 oder 100 U/ml PAI-2: Bei Verwendung von 50 μl 1 lU/ml u-PA sind nach 3 d (37 °C) ungefähr 20 % des oxidierten normalen Clots lysiert. Ohne Zugabe von u-PA sind nach 7 d (37 °C) etwas 20 % des oxidierten normalen Clots lysiert. Die Clotlyse wird durch Zugabe von 50 μl 100 U/ml PAI-2 vollständig inhibiert.
3.6. INOXCLA-Präzision und Normalbereich
Die CV-Werte im Intra-Assay für adhärente Thromben gepoolten Normalplasmas im INOXCLA(10) und im INOXCLA(100) betragen 5.7 % bzw, 3.8 %. Die CV- Werte im Inter-Assay betragen 8.6 % bzw. 6.1 %. Der Normalbereich (0 ± SD) für INOXCLA00) beträgt 100 ± 26 % (relativ zum 0 = 58 % Lyse), der Normalbereich für INOXCLA(100) beträgt 100 ± 23 % (relativ zum 0 = 63 % Lyse). 3.7. INOXCLA-Korrelation mit Fibrinogen, Plasminogen und FIPA
Bei n=36 gesunden Blutspendern ergaben sich FIPA-Ergebnisse von 103 ± 28% des Standards (errechnete lineare Piasminaktivität: 6 mA/min (RT)). Das funktionale Plasminogen in den Blutspenden betrug 94 ± 20% des Standards (0 ± 1 SD). Plasminogen korrelierte mit FIPA mit einem r=0.735. Die FIPA-Kinetik war bis zu einem Anstieg der Extinktion auf etwa 100 mA linear, was etwa 40% des maximalen Anstiegs der Extinktion bei den Bedingungen dieses Assays entsprach (max. ΔA=2500 mA für 50 μl 3 mM Val-Leu-Lys-pNA). Der INOXCLA(10) entsprach dem Plasminogen und dem FIPA mit r=0.290 bzw. r=0.077. Der INOXCLA000) ent- sprach dem Plasminogen und dem FIPA mit r=0.405 bzw. r=0.367. Die löslichen
Clottrübung korrelierte mit r = -0.375 mit dem INOXCLA00) und mit r = -0.433 mit dem INOXCLA000). Die lösliche Clottrübung korrelierte mit r=0.682 mit der plasmatischen Fibrinogenkonzentration. Die Ergebnisse des 10 lU/ml u-PA_Reagenz- INOXCLA korrelierten mit r=0.513 mit denjenigen des 100 lU/ml u-PA-Reagenz.
4. Diskussion
Aktivierte Granulozyten sind die Effektoren der zellulären Fibrinoiyse [1 -5], die zelluläre Fibrinoiyse besitzt eine größere Bedeutung als die plasmatische [7]. Die Hauptprodukte dieser Zellen sind Urokinase und NADPH-Oxidas + Myeloperoxi- dase, die O2 -, H2O2, HOCI und 1O2 bilden. Der fibrinolytische und der oxidative Weg sind miteinander gekoppelt [8]- Im menschlichen Organismus wird 1O2 durch spontane Dismutation des Superoxid-Anions (O2 ), durch den Redoxcyclus [11 , 12] oder durch Wechselwirkung von HOCI oder chloraminen mit H2O2 (Mallet- Reaktion) gebildet [13-16].
Der 1O2-Donor Chloramin verstärkt die u-PA vermittelte Lyse von Plasma-Clots erheblich, welche durch Aktivierung der Kontaktphase der Koagulation, die intrin- sische Hämostase, gebildet wurden; aus diesen Erkenntnissen wurde ein neuer Hämostase-Assay entwickelt: der intrinsische oxidative Clot-Lyse-Assay (INOXC- LA), bei dem die Clottrübung als Mittel zur Bestimmung der Clotgröße oder der Clotlyse verwendet wird. Die vorliegende Methode stellt einen weiteren umfassenden Fibrinolyse-Assay dar, zusätzlich zum chromogenen FIPA [17] und anderen auf Arginin basierenden Hämostase-Assays gestattet der INOXCLA die umfassende Untersuchung der Lyse einzelner Patientenclots mit Hilfe von Fibrinolytika. Die wichtigsten Regulatorproteine der plasmatischen Fibrinoiyse sind PAI-1 und α2-Antiplasmin [21]. Diese Serinprotease-Inhibitoren werden durch eine Chlora- min-Blutkonzentration von 5 mM zu 70 % oxidativ inaktiviert [22, 23]. 1O2-Fänger im Blut sind Proteine, die Methionin- oder Cystein-Reste und ungesättigte Fettsäuren oder Cholesterin enthalten [11 , 24, 25]. Aktivierte PMN erzeugen etwa 5-10 mM HOCI/Chlormaine in ihrer Mikroumgebung [26]. 1O2 wirkt - ebenso wie das Prooxidans Stickstoffmonoxid [27, 28] - antithrom botisch: Die ED50 für die Hemmung der Pättchenaggregation in Plättchen-reichem Plasma beträgt 1.0 mM Chloramin, diejenige für die Fibrinogeninaktivierung beträgt 2.0 mM Chloramin [29, 30].
Ausblicke
Im Gegensatz zu nicht radikalischem Singulett-Sauerstoff (1O2) sind die Sauerstoff-Radikale - insbesondere Hydroxyl-Radikale (-OH) - an der ischämischen Gewebsschädigung beteiligt [31-34]. Die vaskuläre NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoffspezies, welche die Hämostase modulieren; NADPH-Oxidase + Myeloperoxidase scheinen antiatherosklerotisch zu wirken [35-38]. Fibrin aktiviert PMN [4, 39-43]. Aktivierte PMN setzen 1O2/Photonen frei, die zu weiterer PMN- Aktivierung aufrufen und die Thrombolyse verstärken [4, 6, 12, 44, 45]. Die Hem- mung der Koagulation und die Verstärkung der Fibrinoiyse verschieben die Hämostase hin zu einem antithrombotischen Zustand [46].
Die Nachahmung der physiologischen zellulären Thrombolyse ermöglicht neue Assaytechniken zur Messung der Fibrinoiyse, und die therapeutische Aktivierung der zellulären Thrombolyse könnte eine neue Klasse physiologischer Fibrinolytika zur Folge haben. Literatur
1. Moroz LA, Sniderman AD, and Marpole DGF. Leucocyte-plasma interac- tions in fibrinolysis. N Engl J Med 301 : 1100-4, 1979.
2. Moroz LA and MacLean LD. Fibrinolysis during surgery: the role of poly- morphonuclear leukocytes in fibrinolytic activity. Progress in Chemical Fibrinolysis and Haemostasis 4: 380-8, 1979.
3. van Giezen JJ, Chung A Hing JE, Vegter CB, Bouma NN, and Jansen JW. Fibrinolytic activity in blood is distributed over a cellular and the plasma fraction which can be modulated separately. Thromb Haemost 72: 887-92, 1994.
4. Stief TW and Fareed J. The antithrombotic factor singlet oxygen/light (1O2/hv). Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 6: 22-30, 2000.
5. Moir E, Booth NA, Bennett B, and Robbie LA. Polymorphonuclear leuco- cytes mediate endogenous thrombus lysis via a u-PA-dependent mecha- nism. Br J Haematol 113: 72-80, 2001.
6. Stief TW. The physiology and pharmacology of singlet oxygen. Med Hy- pothes 60: 567-72, 2003.
7. Schott D, Dempfle CE, Beck P, Liermann A, Mohr-Pennert A, Goldner M, Mehlem P, Azuma H, Schuster V, Mingers AM, Schwarz HP, and Kramer MD. Therapy with a purified plasminogen concentrate in an infant with lig- neous conjunctivitis and homozygous plasminogen deficiency. N Engl J Med 339: 1679-86, 1998.
8. Cao D, Mizukami IF, Garni-Wagner BA, Kindzelskii AL, Todd RF 3rd, Boxer LA, and Petty HR. Human urokinase-type plasminogen activator primes neutrophils for Superoxide anion release. Possible roles of complement re- ceptor type 3 and calcium. J Immunol 154: 1817-29, 1995.
9. Mao Y, Zang L, and Shi X. Singlet oxygen generation in the Superoxide reaction. Biochem Mol Biol Int 36: 227-32, 1995.
10. Tarr M and Valenzeno DP. Singlet oxygen: the relevance of extracellular production mechanisms to oxidative stress in vivo. Photochem Photobiol Sei 2: 355-61 , 2003.
11. Foote CS, Shook FC, and Abakerli RB. Characterization of singlet oxygen. Methods Enzymol 105: 36-47, 1984. 12. Stief TW. The blood fibrinolysis/deep-sea analogy: a hypothesis on the cell Signals singlet oxygen/photons as natural antithrombotics. Thromb Res 99: 1-20, 2000.
13. Rosen H and Klebanoff SJ. Formation of singlet oxygen by the myeloper- oxidase- mediated antimicrobial System. J Biol Chem 252: 4803-10, 1977.
14. Tatsuzawa H, Maruyama T, Hori K, Sano Y, and Nakano M. Singlet oxygen (0)Delta(g)O(2)) as the principal oxidant in myeloperoxidase-mediated bac- terial killing in neutrophil phagosome. Biochem Biophys Res Commun 262: 647-50, 1999. 15. Kiryu C, Makiuchi M, Miyazaki J, Fujinaga T, and Kakinuma K. Physiologi- cal production of singlet oxygen in the myeloperoxidase-H2O2-chloride System. FEBS Lett 443: 154-8, 1999. 16. Babior BM. Oxidants from phagocytes: agents of defense and destruction. Blood 64: 959-66, 1984. 17. Stief TW, Hinz F, Kurz J, Doss MO and Kretschmer V. A simple screening assay for certain fibrinolysis parameters (FIPA). Thromb Res 97: 231 -7, 2000.
18. Stief TW, Stief MH, Ehrenthal W, Darius M, and Martin E. Nonradical oxidants of the phagocyte type induce the activation of plasmatic single-chain urokinase. Thromb Res 64: 597-610, 1991.
19. Dano K and Reich E. Plasminogen activator from cells transformed by an oncogenic virus: inhibitors of the activation reaction. Biochim Biophys Acta 566: 138-51 , 1979.
20. Stief TW, Weippert M, Kretschmer V, and Renz H. Arginine inhibits hemostasis activation. Thromb Res 104: 265-74, 2001.
21. Collen D and Lijnen HR. The fibrinolytic System in man. CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 4: 249-301 , 1986.
22. Lawrence DA and Loskutoff DJ. Inactivation of plasminogen activator Inhibitor by oxidants. Biochem 25: 6351 -5, 1986. 23. Stief TW, Lenz P, Becker U, and Heimburger N. Determination of plasminogen activator (PAI) capacity of human plasma in presence of oxidants: a novel principle. Thromb Res 50: 559-73, 1988. 24. Kanofsky JR. Quenching of singlet oxygen by human plasma. Photochem Photobiol 51 : 299-303, 1990. 25. Wagner JR, Motchnik PA, Stocker R, Sies H, and Arnes BN. The oxidation of blood plasma and low density lipoprotein components by chemically generated singlet oxygen. J Biol Chem 268: 18502-6, 1993.
26. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med 320: 365-76, 1989.
27. Di Mascio P, Bechara EJ, Medeiros MH, Briviba K, and Sies H. Singlet mo- lecular oxygen production in the reaction of peroxynitrite with hydrogen per- oxide. FEBS Lett 355: 287-9, 1994.
28. Salvemini D, DeNucci RJ, Gryglewski RJ, and Vane JR. Human neutrophils and mononuclear cells inhibit platelet aggregation by releasing a nitric oxide like factor. Proc Natl Acad Sei USA 86: 6328-32, 1989.
29. Stief TW, Kurz J, Doss MO, and Fareed J. Singlet oxygen (1O2) inactivates fibrinogen, Factor V, Factor VIII, Factor X and platelet aggregation of human blood. Thromb Res 97: 231 -7, 2000. 30. Stief TW, Feek U, Ramaswamy A, Kretschmer V, Renz H, and Fareed J. Singlet oxygen (1O2) disrupts platelet aggregates. Thromb Res 104: 361-70, 2001.
31. Downey JM, Omar B, Ooiwa H, and McCord J. Superoxide dismutase therapy for myocardial infarction. Free Radic Res Commun 12-13: 703-20, 1991.
32. McCord JM. Superoxide radical: controversies, contradictions, and paradoxes. Proc Soc Exp Biol Med 209: 112-7, 1995.
33. Toufektsian MC, Morel S, Tanguy S, Jeunet A, De Leiris J, and Boucher F. Involvement of reactive oxygen species in cardiac preconditioning rats. An- tioxid Redox Signal 5: 115-22, 2003.
34. Swiatkowska M, Szemraj J, Al-Nedawi KN, and Pawlowska Z. Reactive oxygen species upregulate expression of PAI-1 in endothelial cells. Cell Mol Biol Lett 7: 1065-71 , 2002.
35. Babior BM. NADPH-oxidase: an update. Blood 93:1464-76, 1999. 36. Babior BM, Lambeth JD, and Nauseef W. The neutrophil NADPH oxidase. Arch Biochem Biophys 397: 342-4, 2002. 37. Görlach A, Kietzmann T, and Hess J. Redox signaling through NADPH oxi- dases: involvement in vascular proliferation and coagulation. Ann N Y Acad Sei 973: 505-7, 2002.
38. Brennan ML, Anderson MM, Shih DM, Qu XD, Wang X, Mehta AC, Lim LL, Shi W, Hazen SL, Jacob JS, Crowley JR, Heinecke JW, and Lusis AJ. In- creased atherosclerosis in myeloperoxidase-deficient mice. J Clin Invest 107: 419-30, 2001.
39. Ruf A, Schlenk RF, Maras A, Morgenstern E, and Patscheke H. Contact- induced neutrophil activation by platelets in human cells suspensions and whole blood. Blood 80:1238-46, 1992.
40. Kirchhofer D, Riederer MA, and Baumgartner HR. Specific accumulation of circulating monocytes and polymorphonuclear leueocytes on platelet thrombi in a vascular injury model. Blood 89: 1270-8, 1997.
41. Shappell SB, Toman C, Anderson DC, Taylor AA, and Smith CW. Adher- ence-dependent neutrophil hydrogen peroxide secretion is mediated by Mac-1 (CD11 b/18). J Immunol 144: 2702-11 , 1989.
42. Simon DI, Ezratty AM, Francis SA, Rennke H, and Loscalzo J. Fibrinogen is internalized and degraded by activated human monocytoid cells via Mac-1 (CD11 b/CD18): a non-plasmin fibrinolytic pathway. Blood 82: 2414-22, 1993.
43. Rubel C, Gόmez S, Fernändez GC, Isturiz MA, Caamano J, and Palermo MS. Fibrinogen-CD11 b/CD18 interaction activates the NF-KB pathway and delays apoptosis in human neutrophils. Eur J Immunol 33: 1429-38, 2003.
44. Klotz LO, Kroncke KD, and Sies H. Singlet oxygen-induced signaling effects in mammalian cells. Photochem Photobiol Sei 2: 88-94, 2003.
45. Petrone WF, English DK, Wong K, and McCord JM. Free radicals and in- flammation: superoxide-dependent activation of a neutrophil chemotactic factor in plasma. Proc Natl Acad Sei USA 77: 1159-63, 1980.
46. Stief TW. Nonradical excited oxygen species induce selective thrombolysis in vivo. Thromb Res 62: 147-63, 1991. Tabelle 2: Intrinsischer Oxidativer Clot-Lyse-Assay (INOXCLA)
75 μl Plasma
50 μl 50 % Pathromtin SL®, 6 % BSA, 38 mM CaCI2 (PAC)
30 min (37°C)
50 μl 10 mM Chloramin-T® in PBS
30 min (37°C)
50 μl 0, 10, or 100 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS
Extinktion bei 405 nm nach 0, 3 und 16 h (37°C) A: Haupttrübung - Extinktion von 10 lU/ml u-PA nach 16 h Inkubationszeit = INOXCLA(10) - Extinktion von 100 lU/ml u-PA nach 3 h Inkubationszeit = INOXCLA(100)
B: 0 % Clottrübung
PAC durch 6 % BSA-PBS ersetzen und 35 mA (= Eigentrübung von 50 μl 50%- igem Pathromtin) zur gemessenen Extinktion zugeben. C: 100 % Clottrübung
Extinktion von 0 lU/ml u-PA nach 16 h Inkubationszeit
(Alternativ: falls Anstieg von C-B (=lösliche Clottrübung)/ 16 h (37°C) < 15 %: Extinktion von 10 lU/ml u-PA bei 0 h Inkubationszeit)
Clotgröße [%] = (A-B)/(C-B) * 100
Clotlyse [%] = 100 - 100 * (A-B)/(C-B) = (C-A)/(C-B) * 100
Fig. 7a: Clotlyse-Verstärkung der Kontaktphasenaktivierung
50 μl normales Citrat gepuffertes Plasma wurden mit 20 μl 64 mM CaCI2 mit oder ohne 100 μg/ml Polybren® oder mit 20 μl Pathromtin SL®, 64 mM CaCI2 mit oder ohne 100 μg/ml Polybren® für 30 min (37 °C) inkubiert. 50 μl 0 mM ( ) oder 10 mM ( )Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben. Nach 30 min (37°C) wurden 50 μl 0 lU/ml oder 10 lU/ml u-PA in 6 % bovinem Serumalbumin-PBS zugegeben. Die Trübung der Wells bei 405 nm wurde nach 0 - 170 h (37°C) bestimmt: kein Pathromtin, kein Polybren (O); kein Pathromtin, mit Polybren (■); mit Pathromtin, kein Polybren (•); mit Pathromtin, mit Polybren (A).
Fig. 7b: Optimierung der Pathromtin-Konzentration
50 μl 0 - 100 % Pathromtin SL®, 6 % BSA, 38 mM CaCI2 wurden mit 75 μl ge- pooltem normalem Plasma für 30 min (37°C) inkubiert. 50 μl 10 mM Chloramin-T® wurden zugegeben und für 30 min (37 °C) inkubiert. 50 μl 10 lU/ml ( ) oder
100 lU/ml ( ) u-PA in 6 % BSA-PBS wurden zugegeben, und die Clotlyse wurde nach 1.5 h (D), 3 h (♦), 4 h (A), 8 h (■), 16 h (•) bestimmt.
Fig. 8a,b: Trübung der oxidierten Clots ohne Zugabe von u-PA
75 μl gepooltes normales Plasma wurden mit 50 μl PAC für 30 min (37°C) inkubiert. 50 μl 0 - 50 mM (= 0 - 2.5 μmoles) CT wurden zugegeben. Nach 30 min (37°C) wurden 50 μl 6 % BSA-PBS zugegeben, und die Trübung der Wells (= 100 % Clottrübung) wurde nach 0-24 h (37°C) bestimmt. Chloramin-T-Menqe: 0 μmol (O), 0.04 μmol (D), 0.07 μmol (Δ), 0.1 μmol (0), 0.15 μmol (*), 0.22 μmol (A) , 0.33 μmol (♦), 0.49 μmol (•), 0.74 μmol (■), 1.11 μmol (- D -), 1.67 μmol (- Δ - ), 2.5 μmol ( - 0 -) (Fig. 2a)
Inkubationszeit: 0 h (0), 0.75 h (D), 1.5 h (Δ), 2.25 h (*), 3 h (•), 4 h (A), 8 h (♦), 16 h (■), 24 h (+). Für die 100 %-Lyse = 0 % Clotkontrolle (O) wurden die Wells mit 1000 lU/ml u-PA für 16 h inkubiert. (Fig. 2b).
Fig. 9a, b: Optimierung der Chloraminmenge im INOXCLA(10)
75 μl gepooltes normales Plasma wurden mit 50 μl PAC für 30 min (37°C) inkubiert. 50 μl 0 - 50 mM (= 0 - 2.5 μmol) CT wurden zugegeben. Nach 30 min (37°C) wurden 50 μl 10 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugegeben, und die Lyse der Clots wurde nach 0-24 h (37 °C) bestimmt.
Fig. 9a: Clotlyse in Abhängigkeit der Inkubationszeit bei Chloramin-T-Mengen: 0 μmol (O), 0.04 μmol (D), 0.07 μmol (Δ), 0.1 μmol (0), 0.15 μmol (X), 0.22 μmol (*),0.33 μmol (♦), 0.49 μmol (•), 0.74 μmol (■) 1.11 μmol (A),1.67 μmol ( ),2.5 μmol (-Δ-) (Fig. 3a). Fig. 9b: Clotlyse In Abhängigkeit der Chloramin-T-Mengen bei Inkubationszeiten: 0.75 h (O), 1.5 h (D), 2.25 h (0), 3 h (*), 4 h (■), 8 h (A), 16 h (•), 24 h (♦).
5 Fig. 10a, b: Optimierung der Chloraminmenge im INOXCLA (100) 75 μl gepooltes normales Plasma wurden mit 50 μl PAC für 30 min (37°C) in Mikrotiterplatten inkubiert. 50 μl 0 - 50 mM (= 0 - 2.5 μmol) CT wurden zugegeben. Nach 30 min wurden (37°C) 50 μl 100 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugege- o ben, und die Lyse der Clots wurde nach 0-16 h (37 °C) bestimmt. Fig. 10a: Clotlyse in Abhängigkeit der Inkubationszeit bei Chloramin-T-Mengen: 0 μmol (O), 0.04 μmol (D), 0.07 μmol (Δ), 0.1 μmol (0), 0.15 μmol (X), 0.22 μmol (*), 0.33 μmol (♦), 0.49 μmol (•), 0.74 μmol (■), 1.11 μmol (A), 1.67 μmol ( - ), 2.5 μmol ( + ). 5 Fig. 10b: Clotlyse in Abhängigkeit der Chloramin-T-Mengen bei Inkubationszeiten: 2 min (O), 0.75 h (♦), 1.5 h (■), 2.25 h (A), 3 h (•), 4 h (D), 8 h (*), 16 h (Δ).
Fig. 11a,b: Optimierung der Chloraminmenge im INOXCLA(1000) 75 μl gepooltes normales Plasma wurden mit 50 μl PAC für 30 min (37°C) in 0 Mikrotiterplatten inkubiert. 50 μl 0 - 50 mM (= 0 - 2.5 μmol) CT wurden zugegeben. Nach 30 min (37°C) wurden 50 μl 1000 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugegeben, und die Lyse der Clots wurde nach 0-16 h (37°C) bestimmt. Fig. 11a: Clotlyse in Abhängigkeit von der Inkubationszeit bei Chloramin-T- Mengen: 0 μmol (O)( 0.04 μmol (D), 0.07 μmol (Δ), 0.1 μmol (0), 0.15 μmol (X),5 0.22 μmol (*), 0.33 μmol (♦), 0.49 μmol (•), 0.74 μmol (■) 1.11 μmol (A), 1.67 μmol ( - ), 2.5 μmol ( + ). Fig. 11 b: Clotlyse in Abhängigkeit von den Chloramin-T-Mengen bei Inkubationszeiten: 2 min (O), 0.75 h (•), 1.5 h (■), 2.25 h (A), 3 h (♦), 4 h (D), 8 h (*), 16 h (Δ).0 Figs. 12a,b: Verstärkung der Clotlyse durch Chloramin 75 μl gepooltes normales Plasma wurden mit 50 μl PAC für 30 min (37°C) in Mikrotiterplatten inkubiert. 50 μl 0 - 50 mM (= 0 - 2.5 μmol) CT wurden zugege- ben. Nach 30 min (37°C) wurden 50 μl 0 lU/ml u-PA (O) or 1 lU/ml u-PA (•) in 6 % BSA-PBS zugegeben, und die Lyse der Clots wurde nach 0 -28d (37°C) bestimmt: 0.49 μmol CT und 0 lU/ml u-PA (O), 0.49 μmol CT und 1 lU/ml u-PA (•); 0.74 μmol CT und 0 lU/ml u-PA (D), 0.74 μmol CT und 1 lU/ml u-PA (■) (Fig. 6a). 5 Clotlyse nach 15 d: 1 lU/ml u-PA-Reagenz (•), 0 lU/ml u-PA (O) (Fig. 6b).
Fig. 13a,b: Oxidative Verstärkung der Clotlyse in einzelnen Clots 75 μl Plasma von n=24 Blutspendern wurden im INOXCLA(10) (Fig. 6a) und INOXCLA000) (Fig. 6b) analysiert. Die Chloraminkonzentration im INOXCLA o wurde von 0 - 30 mM (0 - 1.5 μmol) variiert. 100 % lysbare Clottrübung = 894 ± 115 mA; 0 % Clottrübung = 295 + 55 mA.
Fig. 14a: Optimierung der u-PA-Konzentration 50 μl normales Plasma wurden mit 50 μl PAC für 30 min (37°C) inkubiert. 0 μmol 5 (O), 0.25 μmol (■), 0.5 μmol (•), 1 μmol (A) Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben und für 30 min (37°C) inkubiert. Dann wurden 50 μl 0 - 31.4 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugegeben, und die Extinktion bei 405 nm wurde nach 0 und 16 h (37°C) bestimmt. Die Clotlyse wurde wie in Tab. 1 beschrieben berechnet. Fig. 14b-e: Optimierung der u-PA-Konzentration0 50 μl normales Plasma wurden mit 50 μl Pathromtin SL®, enthaltend 25 mM CaCI2 und 6 % BSA, für 30 min (37°C) inkubiert. 0 (O), 0.25 (■), 0.5 (•), 1 μmol (A) Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben und für 30 min (37°C) inkubiert. Dann wurden 50 μl 0 - 1000 lU/ml u-PA in 6 % BSA-PBS zugegeben, und die Extinktion bei 405 nm wurde nach 0, 10 min (Fig. 8b), 40 min (Fig. 8c), 100 min (Fig.5 8d), 160 min (Fig. 8e) (37°C) bestimmt. Die Clotlyse wurde wie in Tab. 1 beschrieben berechnet.
Fig. 15a,b: Lyse der nicht adhärenten Mikro-Clots 50 μl normales Plasma wurden mit 50 μl 50 % Pathromtin SL®, 6 % BSA, 25 mM0 CaCI2 für 30 min (37°C) inkubiert, um nicht adhärente Mikro-Clots wie unter Methoden beschrieben herzustellen. 50 μl 10 mM Chloramin-T® in PBS wurden zugegeben. Nach 30 min wurden (37°C) 50 μl 0 lU/ml (O), 1 lU/ml (♦), 10 lU/ml (•), 100 lU/ml (■), 1000 lU/ml (A) u-PA in BSA-PBS oder 1 lU/ml u-PA + 100 U/ml PAI-2 (Δ) zugegeben und die Trübung der Wells (Extinktion bei 405 nm) nach 0 - 17 h bestimmt (Fig. 9a). Die Inkubationszeit wurde für 50 μl 1 lU/ml u-PA (♦), 0 lU/ml u-PA (O), 1 lU/ml u-PA+100 U/ml PAI-2 (Δ), 100 U/ml PAI-2 (0) bis auf 19 d (37°C) verlängert (Fig. 9b). Die Lyse der Mikro-Clots [%] wurde wie in Methoden und Tab. 1 beschrieben berechnet.

Claims

Ansprüche
1. Clot-Lyse-Assay enthaltend die folgenden Schritte: a) Herstellung von Mikro-Clots durch Proben-Recalcifizierung 5 b) Lyse der hergestellten Mikro-Clots c) Herstellung von Mikro-Clots durch Kontaktaktivierung von Plasma d) Lyse des durch Kontaktaktivierung von Plasma hergestellten Mikro-Clots
2. Clot-Lyse-Assay gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Her- o Stellung der Mikro-Clots durch Proben-Recalcifizierung durch Inkubation mit Pathromtin erfolgt.
3. Clot-Lyse-Assay gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse der vorgebildeten Mikro-Clots durch Zugabe von Plasminogen-Aktivatoren er- 5 folgt.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5110727A (en) * 1987-04-03 1992-05-05 Cardiovascular Diagnostics, Inc. Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3838529A1 (de) * 1988-11-14 1990-05-17 Behringwerke Ag Globaltest zur erfassung der hauptkomponenten des fibrinolysesystems
DE3917949A1 (de) * 1989-05-30 1991-01-24 Schering Ag Neues thrombolytikum
DE19903693A1 (de) * 1998-04-24 1999-10-28 Centeon Pharma Gmbh Protease zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors VII
EP0937146A2 (de) * 1996-09-20 1999-08-25 The General Hospital Corporation Zusammensetzung und verfahren zur verstärkung von fibrinolyse unter verwendung von antikörpern gegen alpha2-antiplasmin
DE19756773A1 (de) * 1997-12-19 1999-06-24 Dade Behring Marburg Gmbh Neues Verfahren und Diagnosemittel zur Hämostase-Diagnostik

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5110727A (en) * 1987-04-03 1992-05-05 Cardiovascular Diagnostics, Inc. Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1989, BERRETTINI M ET AL: "INTERACTION OF TYPE 1 PLASMINOGEN ACTIVATOR INHIBITOR WITH THE ENZYMES OF THE CONTACT ACTIVATION SYSTEM" XP002318600 Database accession no. PREV198988071035 & JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Bd. 264, Nr. 20, 1989, Seiten 11738-11743, ISSN: 0021-9258 *
JONES A J ET AL: "A precise and rapid microtitre plate clot lysis assay: methodology, kinetic modeling and measurement of catalytic constants for plasminogen activation during fibrinolysis." THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS. 30 NOV 1990, Bd. 64, Nr. 3, 30. November 1990 (1990-11-30), Seiten 455-463, XP009044274 ISSN: 0340-6245 *
MISCHKE R: "Sensitivity of the reaction time of the resonance thrombogram for factor VIII:C and factor IX deficiencies in the blood of dogs with haemophilia A or B." HAEMOPHILIA : THE OFFICIAL JOURNAL OF THE WORLD FEDERATION OF HEMOPHILIA. SEP 2000, Bd. 6, Nr. 5, September 2000 (2000-09), Seiten 575-580, XP002318599 ISSN: 1351-8216 *
SWANK P R ET AL: "A computer program for microplate reader interface and analysis of kinetic, microclot lysis assays." THROMBOSIS RESEARCH. 15 OCT 1991, Bd. 64, Nr. 2, 15. Oktober 1991 (1991-10-15), Seiten 235-242, XP002318597 ISSN: 0049-3848 *
TORBET J: "The thrombin activation pathway modulates the assembly, structure and lysis of human plasma clots in vitro." THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS. MAY 1995, Bd. 73, Nr. 5, Mai 1995 (1995-05), Seiten 785-792, XP001076643 ISSN: 0340-6245 *
VON DEM BORNE P A ET AL: "Feedback activation of factor XI by thrombin in plasma results in additional formation of thrombin that protects fibrin clots from fibrinolysis." BLOOD. 15 OCT 1995, Bd. 86, Nr. 8, 15. Oktober 1995 (1995-10-15), Seiten 3035-3042, XP002318596 ISSN: 0006-4971 *

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