WO2005019245A1

WO2005019245A1 - ヘプタデプシン

Info

Publication number: WO2005019245A1
Application number: PCT/JP2004/012076
Authority: WO
Inventors: Kazuo Umezawa; Osamu Ono; Yoko Ikeda
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2004-08-23
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2006-02-25
Also published as: JPWO2005019245A1

Description

明細書

ヘプタデプシン

技術分野

[0001] 本発明は、血管内皮細胞の活性化に起因する疾患や、細菌の感染または増殖に起因する疾患の予防'治療に有用な化合物、並びに、その化合物を含有する医薬組成物、抗菌剤、細胞接着阻害剤、増殖抑制剤、吸着剤、除去材、及び担持体、並びに、上記化合物を用いた除去方法に関する。

^景技術

[0002] 炎症性刺激や物理的刺激などが血管内皮細胞に加わると、血管内皮細胞膜上の細胞接着分子の発現が増強し、血中の細胞 (腫瘍細胞や白血球など）が血管内皮細胞表面上に接着し、血管外へ移動する。これは、血管内皮細胞内の転写因子である NF- κ Bが活性化することにより、 ICAM- VCAM-1, E-セレクチンなどの接着分子の発現を増強するからである。白血球の接着は脂質の蓄積などを介して動脈硬化を誘導し、腫瘍細胞の接着は血管からの浸出、転移を引き起こすことが知られている。そのため、血中の細胞と血管内皮細胞との接着を阻害することができれば、腫瘍転移や動脈硬化などの予防や治療につながると考えられている。

[0003] 近年、細菌の構成成分である LPSが血管内皮細胞を活性化し、腫瘍転移や動脈硬化を引き起こす作用を有すると考えられている。従って、 LPSによる血管内皮細胞の活性化を抑制することができれば、腫瘍転移や動脈硬化などの予防や治療につながると考えられている。

[0004] 一方、細菌の感染症を予防'治療すベぐ様々な抗菌剤や抗生物質が開発されてレ、るが（例えば、特開 2003—104893号公報及び特開 2002—326952号公報参照 )、新たな耐性菌が出現するという問題があり、その対応が迫られている。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] そこで、本発明は、血管内皮細胞の活性化に起因する疾患や、細菌の感染または増殖に起因する疾患の予防'治療に有用な化合物を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0006] 本発明者らは、 LPS (リポポリサッカライド： lipopolysaccharaide)刺激により活性化した血管内皮細胞への腫瘍細胞の接着を測定する実験系を用いて、細胞接着阻害物質を探索するスクリーニング系を構築し、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、下式 (Π)で表される化合物（以下、「ヘプタデプシン (H印 tad印 sin)」と称する場合もある。）が、 LPS刺激により活性化した血管内皮細胞と、白血病細胞との接着を阻害することを見出した。

[0007]

[0008] また、本発明者らは、 LPSが示す内毒素（エンドトキシン)活性の活性中心である Lipid A (リピド A)を用いて活性化した血管内皮細胞と白血球との接着に式 (Π)で表される化合物が与える影響を調べた。その結果、式 (II)で表される化合物は、 Lipid Aの刺激により活性化した血管内皮細胞と白血病細胞との接着も阻害することを見出した

[0009] そこで、本発明者らは、 LPSや Lipid A以外の血管内皮細胞の活性化を誘導する炎症性サイト力インで血管内皮細胞の活性を阻害するか否力を調べた。ここでは TNF- aや IL-1 βを用いて、式 (II)で表される化合物力 TNF- aや IL_1 βによる血管内皮細胞の活性化を阻害するか否力を調べた力式 (Π)で表される化合物は TNF- aや IL-1 βによる血管内皮細胞の活性化を阻害しなかった。

[0010] また、本発明者らは、式 (Π)で表される化合物が Lipid Aと結合することを見出し、このこと力、式 (Π)で表される化合物は、 Lipid Aと結合して Lipid Aによる血管内皮細胞の活性化を阻害し、結果として血管内皮細胞と白血病細胞との接着阻害を引き起こすことが示唆された。

[0011] さらに、本発明者らは、式 (II)で表される化合物の機能を調べる過程で、この化合物力グラム陰性菌に対して細胞増殖抑制活性を示さず、グラム陽性菌に対して細胞増殖抑制活性を示すことを見出した。このようにして、本発明者らは本発明を完成するに至った。

[0012] すなわち、本発明に係る化合物は、一般式 (I)で表される化合物であることを特徴とする。

[0013]

[0014] 式中、 R かがヒドロキシル基で

1一 Rは全てが水素原子、または、 R

4 1一 Rのいずれ

4

あって残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 1

5 一 30 の整数であればどのようなものでもよぐ 10— 20の整数が好ましぐ 14の整数であることが特に好ましい。なお、前記化合物は下式 (II)で表される化合物であることが好ましい。

[0015]

[0016] また、本発明に係る医薬組成物は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。なお、式 (I)中、 R 一 Rは全てが水素原子、または、 R一 Rのいずれかがヒドロキシル基であって残り

1 4 1 4

が水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 1

5 一 30の整数であればどのようなものでもよく、 10— 20の整数が好ましぐ 14の整数であることが特に好ましレ、。なお、前記化合物は上記式 (II)で表される化合物であることが好ましい。

[0017] 本発明に係る医薬組成物は、リポ多糖またはリピド Aによる血管内皮細胞の活性化に起因する疾患を改善することを特徴とする。特に前記血管内皮細胞の細胞接着を阻害することにより前記疾患を改善することを特徴とする。すなわち、リポ多糖またはリピド Aによって活性化された血管内皮細胞の細胞接着を阻害することにより、前記血管内皮細胞の活性化に起因する疾患を改善することを特徴とする。前記疾患は、例えば、動脈硬化や腫瘍転移などである。

[0018] また、本発明に係る医薬組成物は、グラム陽性菌の感染または増殖に起因する疾患を改善することを特徴とする。前記疾患は、例えば、感染症、中毒症、歯周病、炎症性腸疾患、血管炎、 IV型アレルギー性疾患、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、 MRSA感染症、リツター病、新生児における水疱性インペチゴ、腫瘍、肺炎、関節炎、髄膜炎、各種化膿性疾患、腸炎、髄膜炎、菌血症、眼感染、食中毒、呼吸器感染症、中耳炎、副鼻腔炎、咽頭炎、猩紅熱、急性糸状体腎炎、リウマチ熱、膿痂疹、激症型感染、齲歯、尿路感染症、創感染、胆道感染症、細菌感染によるアトピー性疾患（アトピー性皮膚炎など）の重症化などの疾患である。本明細書において「グラム陽性菌」とは、グラム染色に陽性反応を示し、ポリンを有しない細菌をいう。

[0019] 本発明に係るグラム陽性菌に対する抗菌剤は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。式 (I )中、 R Rは全てが水素原子、または、 R一 Rのいずれかがヒドロキシル基であつ

1 4 1 4

て残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 1一 30の整

5

数であればどのようなものでもよぐ 10— 20の整数が好ましぐ 14の整数であることが特に好ましい。なお、前記化合物は上記式 (Π)で表される化合物であることが好ましい [0020] 本明細書において、抗菌剤とは、細菌の増殖を抑制したり、細菌を死滅させたり、細菌を不活性化させたりする物質をいい、化学合成された狭義の抗菌剤、布や生地などにコーティングするための抗菌コート剤、及び力ビゃ菌から単離され、医薬品として用いられる抗生物質を含む広義の抗菌作用を有する物質を意味する。なお、本発明に係るグラム陽性菌に対する抗菌剤は抗生物質として用レ、られることが好ましいが、用途はそれに限らない。

[0021] 本発明に係る、リポ多糖またはリピド Aによる活性化血管内皮細胞の細胞接着を阻害するための細胞接着阻害剤は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。式 (I)中、 R Rは

1 4 全てが水素原子、または、 R

1一 Rのいずれかがヒドロキシル基であって残りが水素原 4

子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 1

5 一 30の整数であればどのようなものでもよく、 10— 20の整数が好ましぐ 14の整数であることが特に好ましい。なお、前記化合物は上記式 (II)で表される化合物であることが好ましレ、。

[0022] 本発明に係る、グラム陽性菌に対する増殖抑制剤は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。式 (I)中、 R— Rは全てが水素原子、または、 R

1 4 1一 Rのいずれかがヒドロキシル基

4

であって残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 1

5 一 3

0の整数であればどのようなものでもよぐ 10— 20の整数が好ましぐ 14の整数であることが特に好ましい。なお、前記化合物は上記式 (Π)で表される化合物であることが好ましい。

[0023] 本発明に係るリピド A吸着剤、 LPS吸着剤、及び LPSを構成成分とする菌の吸着剤は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその塩を有効成分として含有することを特徴とする。式 (I)中、 R -Rは全てが水素原子、または、 R ずれかがヒドロ

1 4 1一 Rのい

4

キシル基であって残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。

5

nは 1一 30の整数であればどのようなものでもよぐ 10 20の整数が好ましぐ 14の整数であることが特に好ましい。なお、前記化合物は上記式 (Π)で表される化合物であることが好ましい。

[0024] 本発明に係るリピド A除去材、 LPS除去材、及び LPSを構成成分とする菌の除去材は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその塩を有効成分として含有することを特徴とする。式 (I)中、 R は全てが水素原子、または、 R のいずれかがヒドロ

1 4 1 4

5

[0025] 本発明の担持体は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその塩を担持させてなることを特徴とする。式 (I)中、 R— Rは全てが水素原子、または、 R

1 4 1一 Rのいずれか

4 力 Sヒドロキシノレ基であって残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチド

5

である。 nは 1一 30の整数であればどのようなものでもよぐ 10 20の整数が好ましく、 14の整数であることが特に好ましい。なお、前記化合物は上記式 (Π)で表されるィ匕合物であることが好ましい。

[0026] 本発明に係るリピド A、 LPS,又は LPSを構成成分とする菌の除去方法は、上記一般式 (I)で表される化合物またはその塩に結合させて除去することを含んでなる。式 (I)中、 R一 Rは全てが水素原子、または、 R一 Rのいずれかがヒドロキシル基であって

1 4 1 4

残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 1

5 一 30の整数であればどのようなものでもよぐ 10— 20の整数が好ましぐ 14の整数であることが特に好ましい。なお、前記化合物は上記式 (Π)で表される化合物であることが好ましい。

[0027] 関連文献とのクロスリファレンス

なお、本願は、 2003年 8月 25日付けで出願した日本国特願 2003— 300419号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。

図面の簡単な説明

[0028] 図 1は、本実施の一形態において、紫外線吸収スペクトルにより'

測定した結果を示す図である。

図 2は、本実施の一形態において、赤外線吸収スペクトルにより

測定した結果を示す図である。

図 3は、本実施の一形態において、プロトン核磁気共鳴スペクトルによりヘプタデプシンを測定した結果を示す図である。図 4は、本実施の一形態において、炭素 13核磁気共鳴スペクトルによりヘプタデプシンを測定した結果を示す図である。

図 5は、本発明の一実施例において、ヘプタデプシンが HUVECと HL-60の接着に及ぼす阻害効果を示す図である。

図 6は、本発明の一実施例において、 BIAcoreXを用いた表面プラズモン共鳴センサ一によりヘプタデプシンと Lipid Aとの分子間相互作用を解析した結果を示す図でめる。

発明を実施するための最良の形態

[0029] 以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laooratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

[0030] なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではなレ、。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

[0031] = = =上記一般式 (I)で表される化合物の製造方法 = = =

まず、本発明に係る化合物の製造方法について説明する。上記一般式 (I)で表される化合物は、例えば、 1-グァニジル-アクリル酸アルキルと、直鎖状または環状ぺプチドとをアミド結合させ、その後、触媒 (例えば、硫酸水銀及び硫酸）を用いることにより、二重結合を開裂させて水を付加することにより製造することができる。なお、前記環状ペプチドは、保護基を用いた公知のペプチド合成法により合成することが可能である。

[0032] このようにして得られた化合物は、スぺーサとしての疎水性アルキル基の両末端にペプチドとグアノジル基を有しており、これらが血管内皮細胞の活性化に起因する疾患や、細菌の感染または増殖に起因する疾患に対する機能部位であり、リポ多糖やリピド Aと結合してリポ多糖またはリピド Aによる活性化血管内皮細胞の細胞接着を阻害する機能や、グラム陽性菌に対する抗菌作用や増殖抑制作用などを有するものと考えられる。従って、上記一般式 (I)で表される化合物の R Rは全てが水素原子で

1 4

あってもよく、 R— Rのいずれ力 1つがヒドロキシル基であって残りが水素原子であつ

1 4

てもよく、また、 Rは直鎖状または環状のペプチドであり、 nは 1

5 一 30の整数であればどのようなものでもよいと考えられる。

[0033] なお、本発明の化合物は、薬理学的に許容される塩、例えば、第 4級アンモニゥム塩などの有機塩、あるいはアルカリ金属などの金属塩、のような形態としてもよレ、。このような化合物の塩は、上記一般式 (I)で表される化合物と同様の薬理学的作用を有し、本発明の技術的範囲に属する。

[0034] 以下、上記一般式 (I)で表される化合物の薬理作用を、上記式 (II)で表される化合物を例に挙げて説明する。

[0035] = = =上記式 (Π)で表される化合物の薬理作用 = = =

<細胞接着阻害作用 >

血管内皮は腫瘍転移や動脈硬化症、糖尿病など様々な疾病の発症 ·悪化において重要な役割を担っている組織である。これらの疾病に共通して見られる現象に血中の細胞と血管内皮細胞の相互作用がある（Science, 272, 689-693, 1996)。特に血中を流れる腫瘍細胞の血管内皮細胞への接着は腫瘍の転移につながり、単球の接着は動脈硬化症の一つである粥状硬化症（ァテローム硬化症）の発症につながることが知られている（Invasion Metastasis, 14, 109-122, 1994-1995、 Nature, 362, 801-809, 1993)。これらの細胞同士の接着はいずれも炎症性サイト力イン等の刺激因子が仲介する血管内皮細胞の炎症反応が原因となっていることが報告されている (Cell Adhesion and Communication, 2, 261-268， 1994)。したがって、血管内皮細胞の炎症を抑え、血管内皮細胞と他の細胞（白血球や腫瘍細胞など）との接着を阻害することで、腫瘍転移や動脈硬化症の改善 (予防や治療を含む）が期待できる。

[0036] そこで、本発明者らは、腫瘍転移や動脈硬化症の予防'治療薬として、その発症- 悪化の一つの段階である血中の細胞と血管内皮細胞間の細胞接着に着目し、その接着阻害物質を探索するため、 LPS刺激により活性化させた血管内皮細胞への白血球の接着を測定する実験系を用いて接着阻害物質を探索するスクリーニング系を構築し、新規接着阻害物質を天然資源より探索した。その結果、本発明者らは、バエ二バチルス属（Paenibacillus sp.)に属すると思われる BML771-113F9株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 FERM P-19367として平成 15年 5月 21日に寄託されている。）の培養液中に、 LPSで刺激した血管内皮細胞と白血球の接着を阻害する物質が産生されることを見出した。この接着阻害物質の分子構造を解析し、上記式 (Π)で表される新規化合物、ヘプタデプシンを同定した。

[0037] このようにして得られたヘプタデプシンは、実施例 2に記載のように LPSや Lipid Aの刺激により活性化した血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着を特異的に阻害することから、 LPSや Lipid Aの刺激により活性化した血管内皮細胞の細胞接着阻害剤として有用であることがわかる。

[0038] また、ヘプタデプシンは、実施例 3及び 4に記載のように LPSや Lipid Aの刺激により活性化した血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着を阻害する濃度では、血管内皮細胞に対して毒性や増殖抑制作用を示さないことから、ヘプタデプシンは毒性が弱ぐ LPSや Lipid Aによる血管内皮細胞の活性化に起因する疾患（腫瘍転移や動脈硬化など）に対する薬剤としての有用性が期待できる。

[0039] さらに、ヘプタデプシンは、実施例 5に記載のようにグラム陽性菌に対して抗菌活性を有するため、グラム陽性菌に対する増殖抑制剤や抗菌剤として有用であり、グラム陽性菌の感染または増殖に起因する疾患を改善できる。グラム陽性菌の感染または増殖に起因する疾患としては、例えば、感染症、中毒症、歯周病、炎症性腸疾患、血管炎、 IV型アレルギー性疾患、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、 MRSA感染症、リッター病、新生児における水疱性インペチゴ、腫瘍、肺炎、関節炎、髄膜炎、各種化膿性疾患、腸炎、髄膜炎、菌血症、眼感染、食中毒、呼吸器感染症、中耳炎、副鼻腔炎、咽頭炎、猩紅熱、急性糸状体腎炎、リウマチ熱、膿痂疹、激症型感染、齲歯、尿路感染症、創感染、胆道感染症、細菌感染によるアトピー性疾患 (アトピー性皮膚炎など）の重症化などを挙げることができる。

[0040] また、ヘプタデプシンは、実施例 5に記載のように Lipid Aと直接結合することから、 Lipid A、 Lipid Aを活性部分として有する LPS、又は LPSを構成成分とする菌に対する吸着剤として利用することができる。従って、ヘプタデプシンを例えば、フィルター、膜、ビーズ、プラスチック、磁性物質、繊維、中空糸、金属、セラミック、ガラス等の担体に担持させてなる担持体又はそれを充填したカラムもしくは装置は、液体 (例えば、水、血液、血漿、血清、医薬品など）に含まれる Lipid A、 LPS,又は LPSを構成成分とする菌の除去材として有用であり、例えば、液体に含まれる Lipid A、 LPS,又は LPS を構成成分とする菌を結合させて除去し、液体の浄化を行うことができるようになる。

[0041] また、上記除去材を用いることにより、血液における Lipid A、 LPS,又は LPSを構成成分とする菌を体外に除去することも可能になり、感染症 (例えば、敗血症や合併症など）の予防や治療を行うこともできる。

[0042] = = =上記式 (Π)で表される化合物の製造 = = =

ヘプタデプシンは、上述の方法により製造することもできる力 BML771-113F9株を培養し、その培養液中から以下の物理化学的性質を有する物質を単離することにより得ることちでさる。

[0043] <ヘプタデプシンの物理化学的性質 >

(1)性状：白色粉末

(2)分子式： C H N 0

45 81 11 12

(3)高分解能 FAB-MSスペクトル（m/z) : 968.6133 (M+H)⁺

(4)融点： 223— 225°C (分解）

(5)比旋光度： [ α ] ²⁴ +35.7。 (c 0.27, DMSO(ジメチルスルフォキシド))

D

(6)溶解度：メタノール、エタノール、 n—ブタノール、ジメチルスルフォキシド、水に可溶、クロ口ホルム、酢酸ェチル、アセトン、 n—へキサン、ァセトニトリル、トルエンに不溶である。 (7) TLC Rf¾ :

(i) 0.39〔シリカゲル薄層上で展開溶媒としてブタノール一メタノール一水（4:1:2)を用いて測定した場合〕

(ii) 0.36〔シリカゲル薄層上で展開溶媒としてブタノール一酢酸一水 (4:1:1)を用いて測定した場合〕

(8)紫外線吸収スペクトルにより測定した結果を図 1に示す。

(9)赤外線吸収スペクトル (臭化カリウム錠）により測定した結果を図 2に示す。

(10)プロトン核磁気共鳴スペクトル（重ジメチルスルフォキシド中、 500 MHz)により測定した結果を図 3及び表 1に示す。

(11)炭素 13核磁気共鳴スペクトル（重ジメチルスルフォキシド中、 125 MHz)により測定した結果を図 4及び表 1に示す。

[表 1]

Ή

AlaCO 171.5

2 47,3 4.11

3 16.8 0.91

丽 7.26

AsnCO 170.3

2 48.8 4.57

3 34.6 2.29 2.65

CO 171.5*

CONH₂ 6.82 7.32

NH 8.21

SerCO 171.6

2 56.2 4.07

3 60.7 3,51 3.57

OH 5.49

NH 8.69

AlaCO 172.3

2 48.0 4.55

3 19.9 1,18

NH 8.21

IleCO 169.7

2 55.4 4.38

3 38.0 1.65

3-CH₃ 15.5 0.79

4 24.1 1.04 1.36

5 11 1 0.76

NH 7.24

ValCO 169.9

2 56.4 4.49

3 31.6 1,83

4 17+5 0.71

4， 19.1 0.79

NH 7.13

SerCO 168.1

2 53.1 4.42

3 64.3 3.79 4.67

NH 8.48

GHHDCO 171.4

2 43.3 2.31 2,38

3 67.4 3.81

3 -OH 4.72

4 36.7 1.39 1.39

5 25+3 1.36 1.36

6-14 (CH₂)₉ 28.6, 29.0, 29.1 1,22

15 26.0 1.26

16 28.4 1.43

17 40.7 3.05

17NH 7.58

C=NH(NH)(NH₂) 157.1

* ：テトラメチルシラン (0 ppm)を內部標準として測定した。

GHHD： 17-グァュジノ -3.ヒドロキシへブタデカン酸実施例

[0044] 以下、本発明の実施例について詳細に述べる。

[0045] <実施例 1 >ヘプタデプシンの製造

2.5%のラタトース（関東化学株式会社， Tokyo, Japan)、 7.5%のポリペプトン（和光純薬株式会社， Tokyo, Japan)、 0.5%の肉エキス (極東製薬工業株式会社， Tokyo, Japan)、 0.5%の酵母エキス (和光純薬株式会社)、 0.2%の塩ィ匕ナトリウム（関東化学株式会社）、 0.05%の硫酸マグネシウム 7水和物（関東化学株式会社）、 0.05%のリン酸水素二カリウム（関東化学株式会社)、及び 0.2%の炭酸カルシウム（関東化学株式会社）を含む斜面培地（pH 7.4に調整）にパェニバチルス属の BML771-113F9株を植菌し、好気的に 27°Cで 96時間振盪培養した（毎分 180回転)。その後、菌体を除かずに培養液を等量のクロ口ホルム（関東化学株式会社)で洗浄し、水層を等量の n —ブタノール（関東化学株式会社)で 3回抽出し、各回で得られた有機層（n-ブタノール抽出液）を混合し減圧濃縮して、 4.67gのオイル状物質を得た。

[0046] この物質を小量の n—ブタノールに溶解し、あらかじめ n—ブタノールで平衡化させた

200gのシリカゲル 60 (Merck, Darmstadt, Germany)のカラムにかけて吸着させ、 1Lの溶出液（n—ブタノール:メタノール：水 = 7 : 1 : 1 )で溶出し、 6mlずつの画分を回収した。各画分に対し、接着阻害活性の有無を調べ、細胞接着阻害活性の見られた画分を回収し、減圧乾固して 212 mgの固体を得た。この固体を小量のメタノールに溶解し、ゲル濾過カラム（Sh印 hadex LH-20)にかけて吸着させ、 200mlのメタノールで溶出し、再び活性画分を回収し、減圧乾固するという操作を 2回行い、最終的に 13.1mgの白色粉末 (ヘプタデプシン)を得た。

[0047] <実施例 2 >

本実施例においては、 LPS、 Lipid A、 TNF- α、又は IL-1 βにより刺激した血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着に対するヘプタデプシンの効果を調べた。

[0048] ( 1 )細胞培養

正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC ; Cell systems, Lake Kirland, WA)は、 I型コラ一ゲン（株式会社高研， Tokyo, Japan)でコートしたプラスチックフラスコ（Costar, New York, USA)を使用し、非働化した 10%子牛胎児血清（FBS ; JRH BIOSCIENCES, Lenexa, KS)、 10 μ g/ml bFGF (Pepro Tech EC LTD, London, UK)を含む

MCDB- 131培地（Sigma, St. Louis, M〇）を用いて、 37。C、 5% COのインキュベーター中で培養した。ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株 HL-60細胞（Japanese Collection of Research Bioresources)は、非働化した 10% FBSを含む RPMI1640培地（日水製薬株式会社， Tokyo, Japan)を用いて、 37°C、 5% COのインキュベータ一中で培養した [0049] (2)細胞接着実験

HUVECを 48ゥエルプレート（Costar)に 4.0 X 10⁴細胞/ゥエル（500 μ 1/ゥエル）でまき、 37°C、 5% COの条件で一晩培養した。翌日、培地中に最終濃度 0.3、 1、 3、 10 μ g/mlのヘプタデプシンで処理し、 37°C、 5% COで 2時間インキュベートした。その後、最終濃度 l z g/ml又は 10ng/mlになるように、 LPS (Sigma) , Lipid A (Sigma) , TNF- a (Genzyme-Techne, Cambridge, MA)、又は IL- 1 β (Pepro Tech EC LTD)を添加し、 37。C、 5% COの条件でさらに 4時間インキュベートした（コントロールとして、これらの刺激因子を添加しないゥヱルも用意した）。その後、各ゥヱルを 37°Cに温めた PBS (リン酸緩衝生理食塩水）で 2回洗レ、、新しい培地（200 μ ΐ/ゥヱル）を加えた。続いて、各ゥエルに HL-60細胞を 6.0 X 10⁴ cells/ゥヱル（20 μ ΐ/ゥエル）の濃度で加え、 37°C、 5% COで 1時間インキュベートした。次に、 37°Cに温めた PBSで各ゥヱルを 3回洗レ、、未接着の HL-60細胞を除去し、新しい培地（200 /i l/well)を加えた。その後、 HUVECに接着した HL-60細胞を顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内の接着細胞数を測定することで細胞接着能を評価した。

[0050] 図 5に示すように、ヘプタデプシンを LPSに先だって培地に加えると、 LPSで刺激した HUVECと HL-60細胞との接着を 3 μ g/ml以上の濃度で顕著に阻害した。従って、ヘプタデプシンは LPSで刺激した HUVECの活性化による細胞接着を生じさせないように働くことが明らかになった。また、ヘプタデプシンは Lipid Aで刺激した HUVECと HL-60細胞との接着も LPSの場合と同様に阻害した。従って、ヘプタデプシンは Lipid Aに対しても同様の効果を有することが明らかになった。し力ながら、炎症性サイト力インである TNF- aや IL-1 βで刺激した HUVECと HL-60細胞との接着に対して阻害作用は示さなかった。これらのこと力、ら、ヘプタデプシンは LPS刺激による血管内皮細胞の活性化を選択的に阻害し、 LPS及び Lipid Aによって活性化された血管内皮細胞の細胞接着を特異的に阻害することが示唆された。

[0051] ぐ実施例 3 >

次に、実施例 2の結果がヘプタデプシンの細胞毒性によらないことを確認するために、ヘプタデプシン自体が HUVECに対して致死的作用を示すかどうかを調べた。 [0052] HUVECを 24ゥエルプレート（Costar)に 1·6 X 10⁵細胞/ゥエル（500 μ 1/ゥエル）でまき、 37°C、 5% COでー晚培養した。翌日、最終濃度 0.3、 1、 3、 10 μ g/mlのヘプタデプシンで処理し、 37° (、 5% COでインキュベートし、 24時間目と 48時間目にトリパンブル一細胞外排出試験を行った。細胞培養液をエツペンドルフチューブに移し、その後、各ゥヱルを 200 μ 1の PBS (リン酸緩衝生理食塩水）で 2回洗い、洗った PBSをエツペンドルフチューブに移した。続いて各ゥエルにトリプシン一 EDTA溶液 200 μ 1を加えて 37

-トし、細胞をはがし、はがれた細胞ごとトリプシン一 EDTA溶液をエツ -ブに移した。次に、遠心分離 (4200rpm X 5分間）して上清を取り除き、新しい培養液を加えた。その後、 5倍濃縮のトリパンブルー染色液 (4mg/mlトリパンブルー（Sigma)、 9mg/ml塩ィ匕ナトリウム）をカ卩えて攪拌し、これを血球計算板（エルマ販売株式会社， Tokyo, Japan)に乗せ、顕微鏡視野内の全細胞数及び細胞内が青く染色した死細胞の数を測定し、細胞生存率を求め、細胞毒性の有無を調べた。結果は示さなレ、が、ヘプタデプシンの濃度が少なくとも 30 μ g/mほで細胞生存率には変化がなぐ図 5におけるヘプタデプシンの細胞接着阻害効果が HUVECに対する細胞毒性によるものではないことが明らかとなった。

[0053] <実施例 4 >

さらに、実施例 2の結果がヘプタデプシンの HUVECに対する細胞増殖抑制作用によるものかどうかを調べた。

[0054] HUVECを 96ゥエルプレート（Costar)に 2.0 X 10³細胞/ゥエル（200 μ 1/ゥエル）でまき、 37°C、 5% COの条件でー晚培養した。翌日、最終濃度 0.3、 1、 3、 10 /i g/mlのヘプタデプシンを添加して 37°C、 5% COでインキュベートし、 48時間目と 72時間目に以下のように MTTアツセィを行った。まず各ゥヱルに 5mg/ml MTT (Sigma)水溶液を 20 μ 1 加え、 37°Cのインキュベータ一中で 4時間静置した。その後、各ゥエルから培地を除去し、ジメチルスルフォキシド（関東化学株式会社）を 100 μ 1ずつ加えてホルマザン沈殿を溶解させた。その後、マイクロプレートリーダー（MPR_A4i ;東ソー株式会社， Tokyo, Japan)で波長 570nmにおける OD値を測定し、細胞数の割合を求めた。結果は示さないが、ヘプタデプシンの濃度が少なくとも 30 μ g/mlまで HUVECの細胞数は減少せず、図 5におけるヘプタデプシンの細胞接着阻害効果が HUVECによる増殖抑制作用によるものではないことが明らかとなった。

[0055] <実施例 5 >

実施例 2の結果から、ヘプタデプシンは LPS刺激による HUVECの活性化を選択的に阻害し、 LPS及び Lipid Aによって活性化された HUVECの細胞接着を特異的に阻害することが示唆された。そこで、 LPSの活性部分である Lipid Aとヘプタデプシンが直接結合するかどうかを調べた。

[0056] ヘプタデプシンと Lipid Aの分子間相互作用は、 BIAcoreX (BIAcore AB， Uppsala, Sweden)を用いた表面プラズモン共鳴センサーによる経時的解析により確認した。なお、 Lipid Aの HPAセンサーチップ（BIAcore AB)への固定は、文献（Biochimica et Biophysica Acta, 1611卷， 234-242頁， 2003年）の記載に基づいて以下のように行つた。

[0057] HPAセンサーチップを BIAcore Xに揷入し、センサーチップ表面に TBS (Tris緩衝液）を流した。続いて、 40 mMの濃度の n-octy卜 β -D-glucoside (Sigma)をセンサーチップ表面の測定用セルに 5 μ 1/minの流速で 5分間流して洗浄した。次に、 0.5 mg/ml の濃度の Lipid Aをセンサーチップ表面の測定用セルに 1 μ 1/minの流速で 30分以上流して固定した。固定後、 2 mMの濃度の NaOHを 20 μ 1/πήηの流速で 1分間ずつ数回流して、センサーチップ表面に過剰に結合した Lipid Aを除去した。

[0058] また、センサーチップ表面の対照用セルには、 Lipid Aの代わりに DMPC (

dimyristoylphosphatidylcholine； Sigma) 用レヽて、上己と |P]様に固したものを用い

[0059] TBSに溶解したヘプタデプシン（最終濃度で 1 , 3, 4, 5 μ g/ml)を 20 _β 1/minの流速で 2分間添加し、その前後のレゾナンスシグナルの変化を測定し、ヘプタデプシンとセンサーチップ表面に固定した Lipid Aとの結合の解析を行った。なお、測定は 25 °C の条件下で行った。

[0060] 図 6に示すように、ヘプタデプシンの添加直後よりレゾナンスシグナルの上昇が観察された。このレゾナンスシグナルの上昇はヘプタデプシンの濃度の上昇に伴レ、増大しており、 5 μ g/mlのヘプタデプシンを流した時に最大で約 200 RUの上昇が観察された。この結果から、ヘプタデプシンはその濃度依存的にセンサーチップ表面に固定した Lipid Aと結合することが明らかになった。また、ヘプタデプシンの添加を止めることにより、時間依存的なレゾナンスシグナルの減少が見られた。この結果から、へプタデブシンと Lipid Aの結合が可逆的であることが明らかになった。得られた結果を定量的に解析したところ、ヘプタデプシンと Lipid Aとの結合の速度定数 (k )、解離速 a 度定数（k )、及び解離定数（K )は、それぞれ k = 10.4 M— ¹ s— k = 2.04 X 10— ³ s— K

d D a d

= 1.97 X 10— ⁴ Mであることがわかった。以上のことから、ヘプタデプシンが LPSと結合

D

して、 LPSによる HUVECの活性化を阻害することが示唆された。

[0061] ぐ実施例 6 >

本実施例では、ヘプタデプシンのグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する抗菌効果を調べた。すなわち、表 2及び表 3に示す各細菌の増殖に対するヘプタデプシンの影響を寒天希釈画線法（agar dilution streak method ; 2-fold dilution)により調べた。各種濃度（最終濃度 0.39, 0.78, 1.56, 3.13， 5.25, 12.5, 25, 50， 100 x g/ml)でヘプタデプシンを添加した Mueller-Hinton agar (Difco)又は 5%羊血液添カロ

Mueller-Hinton agarに、表 2又は表 3に示される試験菌を画線後、 37°Cで 18時間培養した。培養後、試験菌が生育しないヘプタデプシンの最低濃度を最低発育阻止濃度（MIC値）とした。

[0062] その結果を表 2及び表 3に示す。なお、マイコバクテリゥム.スメグマチス ATCC607 ( Mycobacterium smegmatis ATCC607)の培養は 37°Cで 42時間行った。

[表 2]

最低発育阻止濃度種別試験菌

g/ml、

β

Q

oy グラム陽 '14菌

St- 107TC 6.25

S - 108TC 6.25

6.25

St-56-188SM

Enterococcus faecium NCTC 12204 VCM R Q 25

Staphylococcus aureus FDA209P 6.25

S. aureus Smith 6.25 培地ーラ一ヒントンァガ一（5%羊血液添加）

[表 3]

表 2及び 3に示すように、ヘプタデプシンはスタフイロコッカス 'ァウレウス等のグラム陽性菌に対してそれぞれ 0.78— 6.25 μ g/mlの最低発育阻止濃度で抗菌活性を示した。しかしながら、大腸菌などのグラム陰性菌に対しては抗菌活性を示さな力た。このようなヘプタデプシンのグラム陽性菌に対する抗菌作用は、グラム陽性菌特異的な糖脂質（例えば、リポティコ酸 (lipoteichoic acid： LTA)など）のような表面抗原に因るものと考えられる。

産業上の利用の可能性本発明によれば、血管内皮細胞の活性化に起因する疾患や、細菌の感染または増殖に起因する疾患の予防 ·治療に有用な化合物を提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 下記の一般式 (I)で表される化合物。

(式中、 R— Rは全てが水素原子、または、 R ずれ力、 1つがヒドロキシル基

1 4 1一 Rのい

4

であって残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 10—

5

20の整数である。）

[2] 下式 (II)で表される化合物。

[3] 一般式 (I)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。

0 ₃

/

R₅— C— C— C― (CHzj -N G, ( I )

R₄ R₂ NH (式中、 R— Rは全てが水素原子、または、 R ヒドロキシル基

1 4 1一 Rのいずれ力 1つが

4

5

20の整数である。）

[4] 前記化合物が下式 (II)で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲 3に記載の医薬組成物。

[5] リポ多糖またはリピド Aによる血管内皮細胞の活性化に起因する疾患を改善することを特徴とする請求の範囲 3または 4に記載の医薬組成物。

[6] 前記血管内皮細胞の細胞接着を阻害することにより前記疾患を改善することを特徴とする請求の範囲 5に記載の医薬組成物。

[7] 前記疾患が、動脈硬化または腫瘍転移であることを特徴とする請求の範囲 5または 6に記載の医薬組成物。

[8] グラム陽性菌の感染または増殖に起因する疾患を改善することを特徴とする請求の範囲 3または 4に記載の医薬組成物。

[9] 前記疾患が、感染症、中毒症、歯周病、炎症性腸疾患、血管炎、 IV型アレルギー性疾患、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、 MRSA感染症、リツター病、新生児における水疱性インペチゴ、腫瘍、肺炎、関節炎、髄膜炎、各種化膿性疾患、腸炎、髄膜炎、菌血症、眼感染、食中毒、呼吸器感染症、中耳炎、副鼻腔炎、咽頭炎、猩紅熱、急性糸状体腎炎、リウマチ熱、膿痂疹、激症型感染、齲歯、尿路感染症、創感染、胆道感染症、及び細菌感染によるアトピー性疾患の重症化から選ばれる疾患であることを特徴とする請求の範囲 8に記載の医薬組成物。

[10] 一般式 (I)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、グラム陽性菌に対する抗菌剤。

0 R₃

,NH₂

R₅— C— C— C― (CH_Z) -N— G ( I )

R₄ R₂ NH

(式中、 R Rは全てが水素原子、または、 R一 Rのいずれかがヒドロキシル基であつて残りが水素原子であり、 Rは直鎖状または環状のペプチドである。 nは 10 20 の整数である。 )

[11] 前記化合物が下式 (II)で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲 10に記載の、グラム陽性菌に対する抗菌剤。