WO2005010080A1 - 温度応答性ハイドロゲル - Google Patents

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WO2005010080A1
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Eiichi Kitazono
Hiroaki Kaneko
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Teijin Limited
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    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides

Definitions

  • the present invention relates to a compound comprising hyaluronic acid and a polyalkylene oxide derivative. More specifically, the present invention relates to a temperature-responsive hide mouth gel comprising hyaluronic acid and a polyalkylene oxide derivative.
  • the above-mentioned example requires two incisions for cell harvesting and implanting into the body, which is extremely burdensome for the patient.
  • the development of artificial materials suitable for endoscopic surgery is very important.
  • the required properties of the artificial material are as follows: 1) the shape can be freely controlled (can be directly injected into the affected area), 2) cells and growth factors can be easily embedded, etc. This material is very suitable for regenerative medicine, and is considered to have a great advantage in regenerative medicine.
  • Temperature-responsive hide mouth gel is a type of lower critical solution temperature (LCST) that hydrates at a certain temperature or lower and dehydrates at a certain temperature or higher and causes a volume change in an aqueous environment.
  • LCST lower critical solution temperature
  • the above can be classified as Upper Critical Solution Temperature (UCST) type, which causes volume change by hydration.
  • UCT Upper Critical Solution Temperature
  • the type of hide-mouth gel having the property of LCST which is superior in terms of response speed and the like is preferably used in a drug delivery system.
  • Hide-type gels of the type having the property of LCST for example, are uniformly dissolved in an aqueous solution below a certain temperature because the interaction between polymer and water takes precedence, but become hydrated above a certain temperature.
  • Polymers having the property of LCST in a water-polymer system include N-substituted (meth) acrylamide derivatives such as poly (N-isopropylacrylamide), poly (N-acryloylpyrrolidine), and poly (N-acryloylbiperyl).
  • N-containing cyclic polymers such as gin), vinyl group-containing amino acids such as poly (N-acryloyl L-proline) and esters thereof, poly (vinyl methyl ether), poly (ethylene glycol) Z poly (propylene glycol), Polylactic acid-polyglycolic acid-polyethylene oxide copolymers are known.
  • poly (N-isopropylacrylamide) copolymer is a typical polymer having a sharp transition and a phase transition temperature suitable for application to biological systems.
  • phase transition temperature Various aspects of controlling the phase transition temperature, improving the phase transition temperature, and elucidating the phase transition mechanism Research is being actively pursued from this point.
  • thermoresponsiveness can be imparted to a biomatrix material, it is expected that an ideal temperature-responsive hide-mouth gel excellent in bioabsorbability and biocompatibility will be obtained.
  • examples of attempts to impart temperature responsiveness to a biomatrix material include chitosan (WO 01 36000) and hyaluronic acid (WO 99Z24070).
  • chitosan WO 01 36000
  • hyaluronic acid WO 99Z24070
  • a main object of the present invention is to provide a temperature-responsive hide mouth gel excellent in bioabsorbability and biocompatibility. More specifically, the present invention provides a temperature-responsive hide-mouth gel that can cope with various response temperature ranges.
  • the present invention is as follows.
  • R2 is NH, 0, R3 is H, CH3, R4 is C2H4, CH2CH (CH3), R5 is any of H, CH3, C2H5, C4H9.
  • I is 300-30,000, m is 3 It is an integer up to 140.
  • Hydrate gel wherein the content of the carboxyl group of the hyaluronic acid is 100 equivalents of the polyalkylene oxide derivative residue is 5 to 100 equivalents.
  • FIG. 1 is a phase transition behavior diagram of a compound obtained by introducing 10 equivalents of hyaluronic acid to 100 equivalents of a carboxyl group of hyaluronic acid.
  • FIG. 2 is a phase transition behavior diagram of a compound obtained by introducing 50 equivalents of hyaluronic acid to 100 equivalents of the carboxyl group of hyaluronic acid by using Diephamin (registered trademark) XTJ-507.
  • FIG. 3 is a phase transition behavior diagram of a compound obtained by introducing 100 equivalents of hyaluronic acid to 100 equivalents of the carboxyl group of hyaluronic acid.
  • Figure 4 shows the phase transition behavior of sodium hyaluronate.
  • Figure 5 shows the phase transition behavior of propyl hyaluronate.
  • the hyaluronic acid used in the present invention may be either extracted from animal tissues or produced by fermentation.
  • the strain used in the fermentation method is a microorganism having the ability to produce hyaluronic acid of the genus Streptococcus, and Streptococcus' equi FM-10 0 (JP-A-63-123392) and Streptococcus' equi FM-300 (JP-A-2-234689). Use those cultured and purified using these mutant strains.
  • the molecular weight of hyaluronic acid is preferably about 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 dalton.
  • the hyaluronic acid referred to in the present invention also includes alkali metal salts thereof, for example, sodium, potassium and lithium salts.
  • the polyalkylene oxide used in the present invention is preferably 1) polypropylene glycol or 2) a copolymer composed of poly (propylene glycol) and poly (ethylene glycol).
  • polypropylene glycol or 2) a copolymer composed of poly (propylene glycol) and poly (ethylene glycol).
  • Compounds having an amino group at the terminal such as poly (ethylene glycol) butoxid
  • 1-polypropylene glycol methoxide When introduced into hyaluronic acid through an ester bond, 1-polypropylene glycol methoxide, 1-polypropylene glycol ethoxide, 1-polypropylene glycol propoxide, 1-polypropylene glycol butoxide are used.
  • the molecular weight of the above polyalkylene oxide derivative is preferably 200-6,000. If it is less than 200, the reaction product with hyaluronic acid does not show temperature responsiveness. On the other hand, if it is more than 6,000, a precipitate is formed and a hide mouth gel is not formed.
  • the copolymerization ratio of poly (propylene daricol) nopoly (ethylene glycol) is 1 / 99-99.9 / 0.9. Power of 1 ⁇ I like it. More preferably, the ratio is from 2080 to 99.9 / 0.1. Outside this range, the reaction product with hyaluronic acid does not exhibit temperature responsiveness.
  • the content of the polyalkylene oxide derivative is preferably 5 to 100 equivalents based on 100 equivalents of the carboxyl group of hyaluronic acid. If it is less than 5 equivalents, the reaction product with hyaluronic acid does not show temperature response.
  • a typical reaction method of the hyaluronic acid and the polyalkylene oxide derivative includes the following two methods.
  • the curves in FIGS. 1 to 3 corresponding to Examples 1 to 3 rise and the temperature at which the phase transition starts is compared. It can be seen that the higher the amount of (oxide derivative), the lower the temperature. In other words, by controlling the amount of ligefamine (polyalkylene oxide derivative) to be introduced, it becomes possible to prepare a hyaluronic acid hydrate mouth gel having a desired phase transition temperature.
  • phase transition temperature can be changed depending on the molecular weight of the polyalkylene oxide derivative used and the molecular weight of hyaluronic acid.
  • Injectable gel is expected to be a scaffold that is easy to handle because it can be easily mixed with cells and humoral factors in a liquid state at a temperature lower than body temperature. Therefore, a gel that undergoes a phase transition around body temperature cannot be used as an injectable gel.
  • the hide mouth gel of the present invention can be used as an injectable gel because it undergoes a phase transition at a temperature close to body temperature.
  • the present invention can provide a temperature-responsive hydrid gel comprising hyaluronic acid and a polyalkylene oxide derivative and having excellent bioabsorbability and biocompatibility.
  • This temperature-responsive gel is useful as an artificial material in regenerative medicine targeting endoscopic surgery.
  • a column ( ⁇ 1.2 XL 20 cm) was packed with an ion exchange resin (DOWEX (registered trademark) 50WX8; Total exchange capacity 1.9 eqZI), and an aqueous solution of tetra-n-phthylammonium bromide (48 gZ100 ml) was added. And replaced. After the replacement, flow ion-exchanged water until ⁇ becomes neutral, then pass an aqueous solution of sodium hyaluronate (2gZ1 OOOml) through the column and freeze-dry to obtain tetra-n-butylammonium hyaluronate.
  • DOWEX registered trademark
  • 50WX8 Total exchange capacity 1.9 eqZI
  • thermoresponsive gel is useful as an artificial material in regenerative medicine targeting endoscopic surgery.

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Abstract

　３００～３００００の繰り返し単位を有するヒアルロン酸と特定構造および特定の分子量を有するポリアルキレンオキシド誘導体からなる化合物であって、ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対してポリアルキレンオキシド誘導体の含有量が５～１００当量である化合物及び該化合物からなるハイドロゲル。

Description

明 細 書 温度応答性ハイド口ゲル 技術分野
本発明は、ヒアルロン酸及びポリアルキレンォキシド誘導体からなる化合物に関す る。更に詳しくは、ヒアルロン酸及びポリアルキレンォキシド誘導体からなる温度応 答性ハイド口ゲルに関する。 背景技術
近年、大きく損傷したりまたは失われた生体組織と臓器の治療法の 1つとして、細 胞の分化、増殖能を利用し元の生体組織及び臓器に再構築する技術である再生医 療の研究が活発になってきている。軟骨再生もそのひとつであり、下記の様に積極 的な検討が行われている。
(1)コラーゲンを用いた基材を足場とした軟骨再生（Biomaterials.17, 155-162 (1996))
(2)不溶性べンジルエステル化ヒアルロン酸を用いた細胞培養基材（米国特許第 5 939323号明細書、 J.Biomed.Mater.Res.42:2, 172-81 (1998)、 J.Biomed. Mater.Res.46:3, 337— 346(1999)、 J.Ortho.Res.18:5. 773-380(200 0)))
(3)架橋ヒアルロン酸体を用いた軟骨細胞培養基材（J.Ortho.Res.17, 205-21 3(1999))
(4)ポリ乳酸、ポリダリコール酸を用いた組織再生基材 (特表平 10— 513386号公 報）
しかし前述の例は、細胞採取する際及び体内にインプラントする際に 2度の切開手 術が必要であり患者の負担が非常に大きい。この課題を解決するために、今後内視 鏡手術が増えると考えられ、内視鏡手術に適した人工材料の開発が非常に重要と なってくる。求められる人工材料の特性として、 1 )形状を自在にコントロールできる (患部に直接注入できる）、 2)細胞、成長因子を容易に埋包できるなどが考えられ、 温度応答性ハイド口ゲルはこの条件に非常に適した材料であるので、再生医療にお いてメリットが大きいと考えられる。
温度応答性ハイド口ゲルとは、水環境下において、ある温度以下では水和し、ある 温度以上では脱水和することにより体積変化を引き起こす Lower Critical Soluti on Temperature(LCST)タイプと、逆にある温度以上で水和することにより体積 変化を引き起こす Upper Critical Solution Temperature (UCST)タイプに分 類することが出来る。これら 2つのタイプのうちでは、応答の速さ等の面に優れる LC STの性質を有するタイプのハイド口ゲルの方がドラッグデリバリ一システムにおいて, 好ましく使用されている。 LCSTの性質を有するタイプのハイド口ゲルは、例えば、あ る温度以下では高分子と水との相互作用が優先するために水溶液中に均一に溶解 しているが、ある温度以上になると水和よりも高分子の凝集の方が優勢になるため に脱水和して、水溶液が白濁、ついには沈殿するポリマ一である。即ち水一高分子 系において LCSTの性質を有するポリマーを主成分とし、該ポリマ一を何らかの方法 で 3次元架橋することによって温度応答性ハイド口ゲルを得ることが出来る。
水一高分子系において LCSTの性質を有するポリマーとしては、ポリ（N—イソプロ ピルアクリルアミド）等の N—置換 (メタ）アクリルアミド誘導体、ポリ（N—ァクリロイル ピロリジン）、ポリ（N—ァクリロイルビペリジン）等の含窒素環状ポリマ一、ポリ（N— ァクリロイルー L—プロリン）等のビニル基含有アミノ酸とそのエステル類、ポリ（ビニ ルメチルエーテル）、ポリ（エチレングリコール） Zポリ（プロピレングリコール）、ポリ乳 酸一ポリグリコール酸一ポリエチレンォキシド共重合体が知られている。これらのポ リマーの中で、転移がシャープであり、相転移温度が生体系への応用に適するポリ マ一としてポリ（N—イソプロピルアクリルアミド)共重合体が代表的であり、共重合成 分による相転移温度の制御、相転移温度の改善、相転移メカニズムの解明の各観 点から盛んに研究が展開されている。
しかし、現状においては生体内にインプラント可能な生体吸収性を示す温度応答 性ハイド口ゲルは殆ど無 既存のものとしてポリ（エチレングリコール） Zポリ（プロ ピレングリコール）（TISSUE ENGINEERING Vol 8,No 4, 709 (2002) )、ポ リ乳酸一ポリグリコール酸一ポリエチレンォキシド共重合体（Journal of Controll ed Release. , 72, 203 (2001 ) )しかない。しかしこれらポリマーは合成高分子 であるため、生体マトリックス材料と比較すると生体親和性が低い等の問題が考えら れる。そこで、生体マトリックス材料に温度応答性を付与できれば、生体吸収性及び 生体親和性に優れた理想的な温度応答性ハイド口ゲルが得られると予想される。 生体マトリックス材料に温度応答性を付与する試みとして、キトサン（国際公開 WO 01 36000号明細書）、ヒアルロン酸（国際公開 WO 99Z24070号明細書） の例が挙げられるが、相転移温度が高く生体内での利用が困難であると考えられる ものや、追試において相転移現象を確認できない等問題がある。 発明の開示
本発明の主な目的は、生体吸収性及び生体親和性に優れた温度応答性ハイド口 ゲルを提供することにある。更に詳しくは、多様な応答温度領域に対応できる温度応 答性ハイド口ゲルを提供する。
本発明は以下の通りである。
1 .下記一般式で表されるヒアルロン酸及びポリアルキレンォキシド誘導体からなる 化合物であって、
Figure imgf000006_0001
R,： OH , - R2- CHCH2(OR4)mOR5
R3
(1 )
(R2は NH,0、 R3は H,CH3、 R4は C2H4，CH2CH (CH3)、 R5は H,CH3,C2H5， C4H9、のいずれかである。また Iは 300〜30, 000、 mは 3〜1 40までの整^であ る。）
ヒアルロン酸のカルボキシル基 1 00当量ポリアルキレンォキシド誘導体残基の含有 量が 5〜 1 00当量であるハイド口ゲル。
図面の簡単な説明
図 1は、ジェファーミン（登録商標) XTJ— 507をヒアルロン酸のカルボキシル基 1 0 0当量に対しヒアルロン 1 0当量導入した化合物の相転移挙動図。
図 2は、ジエファ一ミン（登録商標) XTJ— 507をヒアルロン酸のカルボキシル基 1 0 0当量に対しヒアルロン 50当量導入した化合物の相転移挙動図。
図 3は、ジェファーミン（登録商標) XTJ— 507をヒアルロン酸のカルボキシル基 1 0 0当量に対しヒアルロン 1 00当量導入した化合物の相転移挙動図。
図 4は、ヒアルロン酸ナトリウムの相転移挙動図。
図 5は、ヒアルロン酸プロピルエステルの相転移挙動図。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳述する。なお、これらの実施例等および説明は本発明を 例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致 する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
本発明で使用されているヒアルロン酸は、動物組織から抽出したもの、または発酵 法で製造したものどちらでも使用できる。発酵法で使用する菌株はストレプトコッカス 属のヒアルロン酸生産能を有する微生物であり、ストレプトコッカス 'ェクイ FM— 1 0 0 (特開昭 63— 1 23392号公報）、ストレプトコッカス'ェクィ FM— 300 (特開平 2- 234689号公報）が挙げられる。これらの変異株を用いて培養、精製されたものを 用いる。またヒアルロン酸の分子量は、約 1 X 1 0 5〜1 X 1 0 7ダルトンのものが好ま しい。なお本発明でいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、 カリウム、リチウムの塩をも包含する。
本発明で使用されているポリアルキレンォキシドは、 1 )ポリプロピレングリコール、 あるいは 2)ポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）からなる共 重合体が好ましい。ヒアルロン酸にアミド結合により導入する場合には、 1一アミノポ リプロピレングリコ一ルメトキシド、 1ーァミノポリプロピレングリコールエトキシド、 1 - ァミノポリプロピレングリコールプロポキシド、 1—ァミノポリプロピレングリコールブト キシド、 1ーァミノポリ（プロピレングリコール） Zポリ（エチレングリコール）メトキシド、 1—ァミノポリ（プロピレングリコール） Zポリ（エチレングリコール）エトキシド、 1ーァ ミノポリ（プロピレングリコール） Zポリ（エチレングリコール）プロポキシド、 1 -ァミノ ポリ（プロピレングリコール) ポリ（エチレングリコール)ブトキシドなど末端にァミノ 基を有する化合物が挙げられる。また、ヒアルロン酸にエステル結合により導入する 場合には、 1—クロ口ポリプロピレングリコ一ルメトキシド、 1一クロ口ポリプロピレング リコールエトキシド、 1—クロ口ポリプロピレングリコールプロポキシド、 1一クロ口ポリ プロピレングリコールブトキシド、 1一クロ口ポリ（ポピレングリコール）ノポリ（ェチレ ングリコール）メトキシド、 1一クロ口ポリ（ポピレングリコール） zポリ（エチレングリコ —ル）ェトキシド、 1一クロ口ポリ（ポピレングリコール）ノポリ（エチレングリコール）プ ロポキシド、 1一クロ口ポリ（ポピレングリコール）ノポリ（エチレングリコール）ブトキシ ド、 1一ブロモポリプロピレングリコールメトキシド、 1一ブロモポリプロピレングリコー ルェトキシド、 1一ブロモポリプロピレングリコールプロポキシド、 1一ブロモポリプロ ピレングリコールブトキシド、 1一ブロモポリ（プロピレングリコール） Zポリ（エチレン グリコール）メ卜キシド、 1一ブロモポリ（プロピレングリコール） Zポリ（エチレングリコ -ル）ェトキシド、 1一ブロモポリ（プロピレングリコール）ノポリ（エチレングリコール） プロポキシド、 1一ブロモポリ（プロピレングリコール） zポリ（エチレングリコール）ブト キシド、 1—ョ一ドポリプロピレングリコ一ルメトキシド、 1一ョードポリプロピレングリコ ールェトキシド、 1一ョードポリプロピレングリコールプロポキシド、 1一ョードポリプロ ピレングリコールブトキシド、 1 -ョードポリ（プロピレングリコール） ポリ（エチレング リコール）メトキシド、 1 -ョ一ドポリ（プロピレングリコール） Zポリ（エチレングリコー ル）エトキシド、 1—ョ一ドポリ（プロピレングリコール）ノポリ（エチレングリコール）プ ロポキシド、 1—ョードポリ（プロピレングリコール） /"ポリ（エチレングリコール）ブトキ シドなど末端にハロゲン基を有する化合物が挙げられる。
上記のポリアルキレンォキシド誘導体の分子量は、 200-6, 000のものが好まし し、。 200以下であるとヒアルロン酸との反応生成物が温度応答性を示さなし、。また、 6， 000以上であると沈殿物が生じハイド口ゲルを形成しない。
ポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）からなる共重合体を用 し、る場合は、ポリ（プロピレンダリコール）ノポリ（エチレングリコール）の共重合比が 1 /99-99. 9/0. 1のもの力《好まししヽ。さらに好ましくは 20 80〜99. 9/0. 1 のものが好ましい。この範囲外であるとヒアルロン酸との反応生成物は温度応答性 を示さない。
ポリアルキレンォキシド誘導体の含有量は、ヒアルロン酸のカルボキシル基 1 00 当量に対し 5〜 1 00当量が好ましい。 5当量以下であるとヒアルロン酸との反応生成 物は温度応答性を示さない。
ヒアルロン酸とポリアルキレンォキシド誘導体の典型的な反応方法は、以下の 2通 りが挙げられる。
(I)アミド結合
ヒアルロン酸ナトリムをテトラヒドロフランノ水 混合溶媒に溶解し、 1ーァミノポリア ルキレンォキシドを加える。 0. 1 M HCIZO. 1 M NaOHを添加し pH 6. 8に調整 した ί 、 1— Ethyl— 3— [3— (dimethylamino) propyl]— carbodi— imide (ED
C)、 1一 hydroxybenzotriazole (HOBt)を添加する。終夜攪拌後、透析により精製、 凍結乾燥を行い、目的物を得る。
(II)エステル結合
ヒアルロン酸ーテトラー n—プチルアンモニゥム塩を N—メチルピロリドンに溶解し、 1一ブロモポリアルキレンォキシドを加える。 37°Cで 60時間攪拌した後、塩化ナトリ ムを加え 30分間放置する。その後アセトンで再沈殿を行し、、目的物を得る。
【実施例】
以下の実施例により、本発明の詳細をより具体的に説明する。しかし、本発明はこ れら実施例に限定されるものではない。
本実施例に使用したヒアルロン酸ナトリウムはストレプトコッカス属由来の平均分 子量力《1 , 000, 000のヒアノレロン酸ナ卜リウ厶であり、これは 1=3, 500に相当する t その他の試薬についてはテトラヒドロフラン、 0. 1 M HCU O. 1 M NaOH、 1一 Eth yl— 3— [3—、dimethylamino) propyl]— carbodi— imide (EDC)、 1— Hydroxy benzotriazole(HOBt)、テトラー n—ブチルアンモニゥムブロミド、ヨウ化プロピル、 N—メチルピロリドンは和光純薬工業 (株)製、ジェファーミン (登録商標) XTJ— 507 (ポリ（プロピレングリコール） ポリ（エチレングリコール）の共重合比が 39ノ 6、概 略分子量が 2,000)はハンツマン'コーポレーション製を使用した。
[実施例 1 ]
ヒアルロン酸ナトリウム 1 00mgをテトラヒドロフラン Z水 =3/2 (v v) 40mlに溶 解した。この溶液に、ジェファーミン（登録商標） XTJ— 507 1 20mg(0. 00006m ol) (ヒアルロン酸のカルボキシル基 1 00当量に対し 1 0当量）を加え、更に 0. 1 M HCIZ0. 1 M NaOHを添加し、 pH6. 8に調整した。 1一 Ethyl— 3— [3— (dimeth ylamino) propyl]— carbodiimide (EDc 1 2mg(0. 000066mol)、 1— hydro x ybenzotriazole (HOBt) 1 0mg(0. 000066mol)をテ卜ラヒドロフラン Z水 =3Z2 1 0mlに溶解し、反応系に添加し、終夜攪拌を行った。撹拌後、透析精製を行い、凍 結乾燥し目的の化合物を得た。確認は 1 HNMR (日本電子 JNM— alpha400)に より行い、目的物の生成を確認した。 凍結乾燥品 30mgをイオン交換水 970mgに溶解し、濃度 3wt%のハイド口ゲルを 調整した。このハイド口ゲルの相転移挙動を調べるために、 Rheometer RF III (TA Instrument)を使用し、 1 0〜50°Cの温度領域で複素弾性率、粘度の測定を行った c その結果を図 1に示す（G :複素弾性率、 Eta :粘度を表す）。 30°Cより、複素弾性率， 粘度の上昇が確認され 50°Cで飽和に達した (すなわちゾルからゲルへの転移を表 す）。つまり、 30〜50°Cで温度相転移が起こったことが明らかとなった。
[実施例 2]
ジェファーミン（登録商標） XTJ— 507 600 mg (0. 0003mol) (ヒアルロン酸の カルボキシル基 1 00当量に対し 50当量）、 1一 Ethyl— 3— [3—（dimethyl— amin o) propyl]― carbodiimide ( EDC) 60mg (0. 00033mol) N 1— hydroxybenzo tria2ole (HOBt) 50mg (0. 00033mol)、濃度 1 wt%とした以外は、実施例 1と同 様。結果を図 2に示す。
[実施例 3]
ジェファーミン（登録商標） XTJ— 507 1 200mg (0. 0006mol) (ヒアノレロン酸の カルボキシル基 1 00当量に対し 1 00当量）、 1一 Ethyl— 3— [3—（dimethyl— ami no) propyl]— carbodiimide (tDC) 1 20mg (0. 00066mol)、 1— hydroxybenz otriazole (HOBt) 1 00mg (0. 00066mol)、濃度 0. 5wt%とした以外は、実施例 1と同様、結果を図 3に示す。
相転移の温度制御については、実施例 1〜3に対応する図 1〜3の曲線が立ち上 力《る温度、つまり相転移開始温度を比較するとヒアルロン酸に導入されるジェファー ミン (ポリアルキレンォキシド誘導体）の量が多いほど、低温側にシフトしていること が分かる。つまリジェファーミン（ポリアルキレンォキシド誘導体）の導入量をコント口 ールすることで、所望の相転移温度を有するヒアルロン酸ハイド口ゲルを調製するこ とが可能となる。
その他、使用するポリアルキレンォキシド誘導体の分子量、ヒアルロン酸の分子量 によっても相転移温度は変えられるものと考えられる。 再生医療領域においては、このようなハイド口ゲルを Injectable gelとして内視鏡 手術に応用するという期待がある。 Injectable gelは、体温より低温の領域では液 状で細胞や液性因子を簡単に混入でき、体内に注入すると体温によりゲルになるこ とで取扱い性にすぐれた Scaffoldとして期待されている。そのため体温付近で相転 移を起こすゲルでないと Injectable gelとしては使用できない。
然しながら、本発明のハイド口ゲルは、体温に近い温度で相転移を起こすので Inje ctable gelとして使用可能である。
上記のように本発明は、ヒアルロン酸及びポリアルキレンォキシド誘導体からなる、 生体吸収性及び生体親和性に優れた温度応答性ハイド口ゲルを提供できる。この 温度応答性ハイド口ゲルは、内視鏡手術をターゲットとした再生医療における人工 材料として有用である。
[比較例 1 ]
ヒアルロン酸ナトリウム 1 Omgを、水 1 mlに溶解し、実施例 1と同様に相転移挙動 の観察を行った。結果を図 4に示す。
[比較例 2]
国際公開第 99Z24070号明細書を参考に追試実験を行った。詳細は以下の通 りである。
カラム（ Φ 1 . 2 X L 20cm)にイオン交換樹脂（DOWEX (登録商標） 50WX8;Total exchange capacity 1 . 9eqZI)を充填し、テトラー n—フチルアンモニゥムブロミ ド水溶液（48gZ1 OOml)を ί巟し置換した。置換後、 ρΗが中性になるまでイオン交換 水を流し、次にヒアルロン酸ナトリウム水溶液（2gZ1 OOOml)をカラムに通した後 凍結乾燥を行い、ヒアルロン酸テトラ一 n—ブチルアンモニゥム塩を得た。
得られたヒアルロン酸テトラー n—プチルアンモニゥム塩 1 gを N—メチルピロリドン 50mlに溶角？し、室温でヨウ化プロピルを 0. 20g (0. 001 2mol)をゆっくりと i商下し、 37°Cで 60時間攪拌した。攪拌後、塩化ナトリウム 1 gを加え 30分間放置した後、 25 Omlのアセトンを加え沈殿物を得た。得られた沈殿物は、アセトンノ水 =80Z20 (ml ノ ml) 200mlで洗浄を行し、、真空乾燥し目的物を得た。（このとき、硝酸銀を加え、 塩化物イオンが除かれていることを確認する）。確認は 1 HNMR (日本電子 JNM — alpha400)により行い、目的物の生成（エステル化度 50%)を確認した。相転移 挙動については、濃度 1 5wto/oの条件で実施例 1と同様の観察を行った。結果を図 5 に示す。
比較例 1 ,2のハイド口ゲルは共に相転移が確認されなかった。このことからも本発 明で得られた生体吸収性及び生体親和性に優れた温度応答性ハイド口ゲルは、内 視鏡手術をターゲットとした再生医療における人工材料への利用が期待できる。 産業上の利用可能性
この温度応答性ハイド口ゲルは、内視鏡手術をターゲットとした再生医療における 人工材料として有用である。

Claims

求 の
1 .下記一般式 0 )で表されるヒアルロン酸及びポリアルキレンォキシド誘導体から なる化合物であって二α --、主
Figure imgf000013_0001
R,： ΟΗ ,— R2_ CHCH2(OR4)mOR5
R3
( 1 )
(R2は NH,0、 R3は H,CH3、 R4は C2H4，CH2CH (CH3)、 R5は H,CH3，C2H5， C4H9、のいずれかである。また Iは 300〜30， 000、 mは 3〜 1 40までの整数であ る。）
ヒアルロン酸の力ルポキシル基 1 00当量に対し、 R1の内のポリアルキレンォキシド 誘導体残基を 5〜 1 00当量含有する化合物。
2.請求項 1記載の化合物からなるハイドロゲル。
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