WO2004113537A1

WO2004113537A1 - 稔性回復遺伝子を複数の遺伝子座に配置させることを含むハイブリッド植物の稔性を向上させる方法

Info

Publication number: WO2004113537A1
Application number: PCT/JP2004/008025
Authority: WO
Inventors: Toshiyuki Komori
Original assignee: Japan Tobacco Inc.; Syngenta Limited
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2004-12-29
Also published as: AU2004249999A1; EP1645630A4; EP1645630A1; CA2535660A1; US7982109B2; JPWO2004113537A1; US20070277255A1

Abstract

　本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物、及び前記ハイブリッド植物の作成方法を提供することを目的とする。本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。また、本発明の方法は、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む。

Description

明細書

稔性回復遺伝子を複数の遺伝子座に配置させることを含むハイブリッド植物の稔性を向上させる方法

技術分野

[0001] 本出願は、平成 15年 6月 18日に提出された特願 2003— 173927に基づく優先権を主張する。

[0002] 明の Mする術分野

本発明は、稔性回復遺伝子を複数の遺伝子座に導入したハイブリッド植物及びその利用に関する。

背景技術

[0003] 従の術

イネ等の自殖性植物にお、て品種間で交雑を行う場合には、まず自家受精を避けるために穎花が開花する直前に穎花内の雄しベを全て取り除き、次いで交雑をする花粉親品種由来の花粉を用いて受精させる必要がある。し力しながら、このような手作業による交雑方法で商業的規模での大量の雑種種子を生産することは不可能でめる。

[0004] そこで、ハイブリッド品種の生産には、細胞質雄性不稔を利用する三系法が利用されている。三系法とは、雄性不稔細胞質を保有する系統である不稔系統、配偶体型稔性回復遺伝子を保有する系統である回復系統、および核遺伝子は不稔系統と同一であって不稔細胞質を保有しない系統である維持系統とを使用する方法をいう。これらの 3系統を用いて、 (i)不稔系統に回復系統の花粉を受精させることによりハイブリツド種子を獲得することができ、（ii)一方、不稔系統に維持系統の花粉を受精させることにより不稔系統を維持することができる。

[0005] ノ、イブリツド種子を商業的に生産するために、雄性不稔細胞質および核にコードされた稔性回復遺伝子が利用されている。稔性回復遺伝子は、その作用機構により、配偶体型および胞子体型に分類される。配偶体型では、花粉の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネの BT型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子 Rf - 1やトウモロコシの S型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られている。一方、胞子体型では、花粉を生じる植物体の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネの WA型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子やトウモロコシの T型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子などが知られている

[0006] 配偶体型の稔性回復遺伝子を利用してハイブリッド品種を育成すると、ハイブリッド品種の葯では稔性回復遺伝子を持つ花粉と持たない花粉が 1： 1に分離するため、理論的花粉稔性は 50%となる。これは、一般品種の理論的花粉稔性 100%の半分であり、ハイブリッド品種の種子生産の安定性を低下させる要因として危惧されていた。実際に、イネの BT型雄性不稔細胞質とその稔性回復遺伝子 Rf— 1を利用したハイブリツド品種は耐冷性が弱いことが一般に知られているが、その原因は理論的花粉稔性の低さ（50%)であると考えられている。

[0007] 一方、胞子体型でも、以下のような問題が存在する。イネの WA細胞質に対する稔性回復は複数個の稔性回復遺伝子によって付与されると考えられているが、その数や染色体上での位置は詳細に同定されていない。このため、 WA細胞質に対する回復系統としてノ、イブリツド育種で使用するためには、収量性や草型などの特性が優れてヽることに加え、 WA細胞質に対して完全回復能を持つことが不稔系統との交雑次代での種子稔性調査により示されている必要がある。稔性回復能以外の特性がいくら優れて、ても、 WA細胞質雄性不稔系統との交雑次代での種子稔性が完全でなければ、回復系統として利用することはできない。また、前述の通り、回復系統の数や座乗位置が詳細に同定されて、な、ため、その他の特性を維持して回復能だけを改良することは困難である。

[0008] よって、高い稔性を有するハイブリッド品種を作成するための方法が希求される。

特許文献 1：特開 2002-345485号公報

特許文献 2：国際公開第 02Z014506 A1号パンフレット

特許文献 3：国際公開第 03Z027290 A1号パンフレット

特許文献 4:国際公開第 02Z019803 A1号パンフレット

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発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物を提供することを目的とする。本発明のハイブリッド植物は、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。

[0010] 本発明において、完全連鎖関係にない遺伝子座とは、好ましくは異なる染色体上の遺伝子座である。

[0011] 本発明において、稔性回復遺伝子は、好ましくは配偶体型稔性回復遺伝子、より好ましくはイネの BT型雄性不稔性回復遺伝子である。

[0012] 本発明はまた、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む、前記ハイブリッド植物の作成方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0013] 本発明者らは上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、高い稔性を有するハイブリツド植物を得ることに成功し、本願発明を想到した。

[0014] ハイブリッド植物

よって、本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物を提供する。本発明のハイブリツド植物は、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。

[0015] 植物において配偶体である花粉の形成の際に減数分裂が生じ、各組の相同染色体が分離する。よって、配偶体型稔性回復遺伝子と雄性不稔細胞質を利用してハイプリッド品種を育成すると、ハイブリッド品種の葯では稔性回復遺伝子を持つ花粉と持たない花粉が 1 : 1に分離するため、理論的花粉稔性は 50%となる。本発明のハイブリツド植物は、 a) 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を有すること、そして、b)それらを完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に有すること、という特徴のため、減数分裂により花粉が形成される際に、いずれかの染色体に配偶体型回復遺伝子が存在する可能性が高くなる、という利点を有する。

[0016] 具体的には、例えば、イネは 12組の相同染色体を有する力遺伝子導入および交配の繰り返しにより、例えば、第 6、第 7、第 10染色体の 3力所に配偶体型回復遺伝子を配置させる。花粉が形成される場合に配偶体を有する相同染色体と有さない相同染色体は、他組の相同染色体の分離とは独立して分離される。よって、配偶体型稔性回復遺伝子を 3力所に有する花粉 (第 6、第 7、第 10染色体)、 2力所に有する花粉 (第 6及び第 7染色体、第 6及び第 10染色体または第 7及び第 10染色体)、 1力所に有する花粉 (第 6、第 7、第 10染色体のいずれか)、 0力所に有する花粉が、 1 : 3 : 3 : 1の割合で形成される。本研究者は、遺伝子工学的に導入された配偶体型稔性回復遺伝子が内因性の遺伝子と同様に機能すること、花粉が配偶体型稔性回復遺伝子を 1つでも有すれば稔性が得られること、そして、配偶体型稔性回復遺伝子を複数持つ花粉も正常に発育することを明らかにした。よって、理論的には配偶体型稔性回復遺伝子を全く含まない 1Z8の割合の花粉以外、即ち、 87. 5%の花粉は稔性を有すること〖こなる。後述の実施例 4において、 3座 Rf— 1ヘテロ個体の花粉稔性が概ね 8 7. 5%であることが示され、上記理論が正しいことが実証された。

[0017] 以上、本発明の技術的特徴の説明のために、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子が異なる染色体上にある場合を例に挙げた。し力しながら、同一染色体上に複数、例えば 2個の遺伝子座が存在しても、両者にある程度遺伝的距離があれば、異なる染色体上に座乗している場合と同様に独立に遺伝される。あるいは完全に独立して遺伝されなくても、完全に挙動を共にしない限り、「2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を配置することにより花粉稔性を向上させる」という本願発明の目的を達成しうる。よって、本明細書において「完全連鎖関係にない」とは、異なる染色体上に座乗している場合と同様に完全に独立に遺伝されるいわゆる「独立の関係の場合」のみならず、独立ではなヽが完全連鎖でもなヽような「密接なヽし穏やかな連鎖関係にある場合」も含む。限定されるわけではないが、 2個の遺伝子座が約 lc M以上、より好ましくは約 5cM以上の距離にある場合に、両者は完全には挙動を共にせず遺伝する、即ち、「完全連鎖関係にない」と言える。

[0018] さらに胞子体型稔性回復遺伝子については、 BT細胞質に対する稔性回復遺伝子 Rf— 1が WA細胞質に対して部分的稔性回復能を示すことも十分考えられる。しカゝも、複数の Rf— 1を配置することにより回復程度が向上する可能性もある。現在、それらの点を確認するための実験を遂行中である。

[0019] 本発明のハイブリッド植物は、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に有するノ、イブリツド植物は、上述したように稔性回復遺伝子を 1コピーしか有しない稔性回復遺伝子 1座へテロ個体 (従来技術のハイブリッド植物）と比較して、高い花粉稔性を有する。さらに、耐冷性、即ち、低温条件下での種子稔性も向上する（実施例 7)。「低温条件下」とは、例えば、移植後力も登熟期まで、 20°Cないし 28°Cの明条件下、 15°Cないし 23°Cの暗条件下で栽培することを意味する。例えば、後述の実施例 7では、移植後から登熟期まで、明条件 (24°C) 12時間、暗条件（19°C) 12時間で栽培したところ、本願発明のハイブリッド植物（FRコシヒカリ X 16T1— 35の F )は、稔性回復遺伝子を 1コピーしか

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有しない稔性回復遺伝子 1座へテロ個体 (MSコシヒカリ X FRコシヒカリの F ) (従来技術のハイブリッド植物）と比較して、高い種子稔性を維持した。

[0020] 本発明のハイブリッド植物は、花粉、種子、成体のあらゆる状態を含む。

[0021] 本発明にお、て得られるハイブリッド植物の属、種は特に限定されず、例えば、イネ

、トウモロコシが含まれる。最も好ましくはイネである。

[0022] 本発明の「稔性回復遺伝子」は、配偶体型および胞子体型の双方を含む。配偶体型では、花粉の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネの BT 型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子 Rf - 1やトウモロコシの S型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られている。一方、胞子体型では、花粉を生じる植物体の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネの WA型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子 (Ahmed and Siddiq, 1998)やトウモロコシの T型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子 (Dhillon, 1998)などが知られている。

[0023] 「配偶体型稔性回復遺伝子」は、ハイブリッド植物の種類に応じて公知の遺伝子を利用可能である。例えば、ノヽイブリツドイネの場合、イネの BT型雄性不稔性回復遺伝子 Rf— 1が利用可能である。 Rf— 1遺伝子については、本発明者らが単離 '同定し、特許出願を行っている。 Rf-1遺伝子については、本明細書中で詳述する。ノ、イブリツドトウモロコシの場合、 S型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られており、例えば、 Wen, L. &Chase、 C. D. (1999) Curr. Genet. 35, p. 521— 526に記載されている。

[0024] 本発明のハイブリッド植物は稔性回復遺伝子を、 2コピーまたはそれより多く含む。

本発明は、完全連鎖関係にない遺伝子が完全に又は一部独立して遺伝する性質を利用する。よって、複数の稔性回復遺伝子は同一染色体上にある場合でも約 lcM 以上、より好ましくは約 5cM以上の距離に存在することが望ましい。最も好ましくは、各々異なる染色体上に存在することが望ましい。よって、稔性回復遺伝子は特に限定されな!/、が、最大でも染色体の組の数であることが好ま、。

[0025] 本発明のハイブリッド植物は、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に有する。各遺伝子がそれぞれ全て完全連鎖関係にない遺伝子座に存在することが望ましい。但し、 3コピー以上の複数の遺伝子を有する場合、そのうちの一部が連鎖関係にある遺伝子座に存在する場合でも、その他の遺伝子が完全連鎖関係にない遺伝子座に存在している場合は、単一コピー（ヘテロ）の場合よりも高い稔性を得ることができ、本発明のハイプリッド植物に含まれる。例えば、 4コピーの遺伝子を含むノ、イブリツド植物であって、そのうちの 2つが同一の染色体上の連鎖関係にある遺伝子座に存在し、その他の 2つが各々別個の染色体に存在する場合が含まれる。完全連鎖関係にない遺伝子の数が多いほど、稔性を有する花粉の確率は高くなる。理論的には、稔性回復遺伝子が 1コピーしか存在しない場合には 50%であるのに対し、例えば、 2コピー、 3コピー、 4 コピー、 5コピーと増えると、 75%、 87. 5%、 93. 75%、 96. 875%と稳' 14力 ^高くなる。本発明の実施例 4では最大 4遺伝子座に稔性回復遺伝子 Rf-1を有するハイプリッドイネが作成され、理論上の花粉稔性 93. 75%に極めて近い値が観察された。このことから、稔性回復遺伝子を複数個、例えば 4個持つ花粉も正常に発育するものこと力 S示された。よって、限定されるわけではないが、本発明においてハイブリッド植物において、稔性回復遺伝子のコピー数は、好ましくは 2ないし宿主植物の染色体の組の数、好ましくは 2ないし 4である。

[0026] なお、本発明のハイブリッド植物中の 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子のうちの 1コピーは、稔性回復遺伝子を天然に保有する稔性回復系統の植物由来のものであってもよい。例えば、イネの Rf— 1遺伝子座は第 10染色体上に存在することが知られている（Fukuta et al. 1992, Jpn J. Breed. 42 (supl. 1) 16 4 165)。このような内因性の稔性回復遺伝子は、本発明のハイブリッド植物の作成に利用可能である。

[0027] ハイブリッド植物の作成方法

本発明はまた、稔性を高めた本発明のハイブリッド植物の作成方法を提供する。本発明の方法は、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む。

[0028] 限定されるわけではないが、本発明の好ましい方法は、

1) 稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入することによって、 2座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を作成し、

2) 工程 1)で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統と植物と交配することを含む、作成方法である。

[0029] 1)の工程における、植物への稔性回復遺伝子の導入方法は特に限定されず、植物の種類に応じた公知の方法を使用することが可能である。遺伝子工学的手法による形質導入のためには、かなる適切な発現系を使用してもよ、。組換え発現べクタ一は、適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ゥィルス、または昆虫遺伝子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、植物に導入されうる稔性回復遺伝子 (例えば、イネの Rf— 1)を含む核酸を含む。

[0030] 制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはェンハンサー、 mRN Aリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該 DNA配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列が DNA配列の転写を調節するならば、 D NA配列に、機能可能であるように連結されている。植物において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスぺクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。

[0031] さらに、必要に応じて適切なシグナルペプチド (天然または異種性)をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）の DNA配列を、インフレームで核酸配列に融合させ、 DNAがまず転写され、そして mRNAがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもょヽ

プラスミドなどのベクターに遺伝子の DNA断片を組み込む方法としては、例えば、 Sambrook, J. , and Russell, D. W. (2001) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 3rd ed. (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーシヨンキット (例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞である植物に導入される。

[0032] ベクターは、簡便には当業界において入手可能な糸且換え用ベクター（例えば、ブラスミド DNAなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本願発明の核酸断片を用いて植物に稔性を付与する場合には、特に、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、 pBI221、 pBI121 (以上 Clontech社製）、及びこれらから派生したベクタ一が挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、 pIG121Hm、 pTOK 233 (以上 Hieiら， Plant J. , 6, 271— 282 (1994) )、 pSB424 (Komariら， P lant J. , 10, 165— 174 (1996) )など力列示される。

[0033] 形質転換植物は、上述のベクターの β ダルク口-ダーゼ (GUS)遺伝子の部位に本願発明の核酸断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモ一ター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子 (稔性回復遺伝子の核酸配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネータ一を含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードする DNA、ェンハンサー配列、所望の遺伝子の 5'側および 3' 側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている 35Sプロモータ一の他に、ァクチン、ュビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。

[0034] プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、 Sambrook, J.ら（2001)

(上述）に記載のリン酸カルシウム法または塩ィ匕カルシウム Z塩化ルビジウム法、エレタトロポレーシヨン法、エレクト口インジェクション法、 PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法 [Science, 227, 129 (1985) ]、エレクトロポレ—シヨン法 [Nature, 3 19, 791 (1986) ]によって形質転換することができる。

[0035] 特に植物への遺伝子導入法としては、ァグロバタテリゥムを用いる方法 (Horsch e t al. , Science, 227, 129 (1985)、 Hiei et al. , Plant J. , 6, 271—2 82 (1994) )、エレクト口ポレーシヨン法（Fromm et al. , Nature, 319, 791 (1 986) )、 PEG法（Paszkowski et al. , EMBO J. , 3, 2717 (1984) )、マイク口インジェクション法（Crossway et al. , Mol. Gen. Genet. , 202, 179 (19 86) )、微小物衝突法（McCabe et al. , Bio/Technology, 6, 923 (1988 ) )などが挙げられる。所望の植物に核酸を導入する方法であれば特に限定されな、

[0036] 限定されるわけではないが、ァグロバタテリゥムを用いる植物（例えば、イネ）の回復系統の作成方法は、例えば、 Hiei et al. , Plant J. , 6, p. 271— 282 (1994 ) , Komari et al. , Plant J. , 10, p. 165— 174 (1996)、 Ditta et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : p. 7347— 7351 (1980)等【こ記載されて!ヽる。

[0037] 先ず、所期の挿入した!/、核酸断片を含むプラスミドベクターを作成する。プラスミドベクターは、例えば、前記 Komari et al. , Plant J. , 10, p. 165— 174 (199 6)らにプラスミドマップが記載されている、 pSBl l、 pSB22等が使用可能である。あるいは、当業者は例えば前記 pSBl l、pSB22等のプラスミドベクターを基に、自ら適当なベクターを構築する事も可能である。本明細書後述する参考例では、 pSBl lを基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター PSB200を作成して使用した。具体的には、先ず、ュビキチンプロモーターとュビキチンイントロン (Pubi -ubil)に、ノパリン合成酵素のターミネータ一 (Tnos)を接続した。これより得られた P ubi— ubil— Tnos接続体の ubil— Tnos間に、ハイグロマイシン而性遺伝子（HYG (R ；) )を挿入することにより、 Pubi-ubiI-HYG (R) -Tnosからなる接続体を得た。この接続体を、 pSBl l (Komariら、上述）の HindlllZEcoRI断片に接続することにより、 pKY205を得た。この pKY205の Pubi上流に存在する Hindlll部位に NotI、 Nsp V、 EcoRV、 Kpnl、 Sad, EcoRIの制限酵素部位を追加するためのリンカ一配列を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有する PSB200を得た。

[0038] 次、で、挿入核酸を含む組換えベクターを用いて大腸菌（例えば DH5 a、 JM109 、 MV1184等、いずれも例えば TAKARA社より購入可能）を形質転換する。 [0039] さらに、形質転換された大腸菌を用いて、ァグロパクテリゥム菌株を好ましくはヘルパー大腸菌株とともに、例えば、 Ditta et al (1980)の方法に従い、三菌系交雑 (t riparential mating)を行う。限定されるわけではないが、ァグロバタテリゥムは例えば、 Agrobacterium tumefaciens菌株 LBA4404/pSBl、 LBA4404/pNBl 、 LBA4404ZpSB3等を使用することが可能である。いずれも前述の Komari et al. , Plant J. , 10, p. 165— 174 (1996)にプラスミドマップ力記載されており、当業者は例えば自らベクター構築を行うことにより使用可能である。限定されるわけではないが、ヘルパー大腸菌は、例えば HB10lZpRK2013 (クローンテック社より入手可能)等が使用可能である。また、より一般的ではないが _PRK2073を保有する大腸菌もヘルパー大腸菌として使用可能との報告がある（Lemas et al. , Plasmi d 1992, 27, p. 161—163)。

[0040] 次いで、所期の交配が生じたァグロバタテリゥムを用いて、例えば、 Hiei et al ( 1994)の方法に準拠し、雄性不稔植物、例えばイネの形質転換を行う。形質転換に必要なイネ未熟種子は、例えば、雄性不稔イネにジャポニカ品種の花粉をかけることにより作成できる。

[0041] 形質転換植物の稔性回復は、例えば出穂約 1か月後に、種子稔性を立毛調査すること〖こよって調べることが可能である。立毛調査とは、圃場などで栽培されている状態で観察する方法である。あるいは、実験室で穂の稔実率を調べる稔実率調査を行つてもよい。

[0042] 稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入から、 2座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物の作成は、限定されるわけではないが、例えば以下のように行うことができる。

[0043] まず、上述の方法で稔性回復した形質転換体力も定法に従、DNAを抽出して、ゲノミックサザン解析を行う。その際に用いるプローブは、導入した遺伝子断片の一部から調製する。解析結果に基づき、 1コピー導入個体を複数選抜する。次いで、各自殖次代から、当該導入遺伝子についてホモ型の個体を選抜する（以下、 A個体と B 個体と呼称する)。選抜は、上述のゲノミックサザン解析により行うこともできるし、当該遺伝子が導入された座の周辺塩基配列情報に基づいて設計した PCRマーカーによつて行うこともできる。天然の回復系統 X Aの交配により得られた交雑 Fのなかから、

2

2座で稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を選抜する。天然の回復系統に由来する稔性回復遺伝子の遺伝子型は、例えば、 WO 03/027290 A1に記載の方法により推定することが可能である。 A個体に由来する稔性回復遺伝子の遺伝子型は、上述の通り、ゲノミックサザン解析により推定することもできるし、 PCRマーカーによつて推定することもできる。

[0044] 同様の方法により、（天然の回復系統 XA) X (天然の回復系統 X B)の交雑 Fのな

1 かから、天然の回復系統に由来する稔性回復遺伝子をホモで持ち、かつ、 A個体および B個体に由来する稔性回復遺伝子をへテロで持つ個体を選抜する。選抜個体の自殖次代のなかから、 A個体および B個体に由来する稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を選抜することにより、 3座で稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を作成することがでさる。

[0045] なお、各工程の前又は後に、外来の遺伝子が導入された染色体の位置を確認してすることが可能である。導入遺伝子の染色体の位置を確認は、限定されるわけではないが、例えば、以下のように行うことができる。

[0046] 稔性回復遺伝子とともに、宿主植物には天然に存在しない配列が組み込まれる。

例えば、後述の実施例ではイネの Rf— 1遺伝子ともに、ノパリン合成酵素のターミネ一ター（Tnos) (図 9中の Nos)が組み込まれている。なお、 Tnosの配列は公開データベース（Genbank)に登録されているクローユングベクター pBI121 (ァクセッション番号 AF485783)に含まれている。実施例 3では Nosを用いて導入遺伝子の染色体上の導入部位を同定した。具体的には、公知の Nosの塩基配列に基づいてのプライマ一（例：図 9の NosF2)を作成し、 PCRを行った。得られた PCR増幅産物の末端塩基配列を解析し、 Genbankのデータベースに対して相同性検索を行ったところ、イネの特定の染色体のゲノムクローンの相補鎖配列（例：図 9の AP004007)と一致することがゎカゝつた。導入遺伝子が特定の染色体に存在することをさらに確認するために、前記特定の染色体上に 2個のプライマーを設計し（例：図 9の No6F及び No6R)、 PCRを行ってもよい。 PCRにより、導入遺伝子が存在するハイブリッド植物のゲノムを铸型とした場合には増幅産物が得られな、のに対し、導入遺伝子が存在しな、植物ゲノムの場合には所期の長さの断片が増幅される。逆に、導入遺伝子の染色体部位の同定に使用した、 Nosの塩基配列に基づいて単一のプライマー（例：図 9の NosF 2)と、染色体上の配列に基づくプライマー対の一方のプライマー（例：図 9の Nos6R )をプライマー対として使用した場合には、導入遺伝子が存在するハイブリッド植物のゲノムを铸型とした場合には所期の長さの断片が増幅されるの対し、導入遺伝子が存在しな!、植物ゲノムの場合には増幅産物が観察されな、。

[0047] ゲノムの全体又は一部の塩基配列が確認されて、る植物にぉ、て上記確認手法を利用することが可能である。例えば、イネやトウモロコシについては、 Genbank、 E MBL、 DDBJ等のデータバンクにゲノムの塩基配列が開示されている。

[0048] 2) さらに、工程 1)で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統の植物とを交配する、ことにより本発明の植物を得ることができる。

[0049] 交配後、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2 箇所又はそれより多くの遺伝子座に有する植物を選択することができる。ノ、イブリツド植物に、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子が存在することは、例えば、サザン分析におけるバンドの数及び Z又は濃度等によって確認することが可能である。

[0050] さらに、本発明は工程 1)で作成された 2座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を含む。このような稔性回復系統植物は、実際の育種現場において、所期の雄性不稔系統と交配させることによって、本発明のハイブリッド植物を取得するために使用することができる。

[0051] イネの BT型雄件不稳細胞皙に針する稔件回街遺伝子 Rf— 1

本発明者らは、イネの BT型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子 Rf— 1を単離'同定した (参考例)。後述する実施例では配偶体型稔性回復遺伝子として、 Rf - 1遺伝子を用いて、ハイブリッドイネを作成した。 Rf— 1遺伝子については別途、特許出願を行っている。以下、詳述する。

[0052] 本発明者らの先願

(特開 2002— 345485、 WO 02/14506 A1)

(特願 2001— 285247、特願 2001— 309135及び特願 2002— 185709、 WO 03 /027290 A1) (特願 2002— 197560、 PCT/JP03/03154)

本発明者らは、まず、 Rf— 1の存在部位を第 10染色体上の極めて狭い範囲に特定した。その結果に基づいて、 Rf— 1遺伝子座の近傍に存在する PCRマーカーを開発し、これらの PCRマーカー力 Rf-1遺伝子座と連鎖することを利用して、 Rf-1遺伝子を検出する方法が見出された。具体的には、 Rf— 1遺伝子座が、イネ第 10染色体上に存在する PCRマーカー座 S12564 Tsp509I座と C1361 Mwol座との間に座乗することを利用して、近傍に存在する新規の PCRマーカー座の遺伝子型を調査することにより、 Rf— 1遺伝子の有無の調査および Rf— 1遺伝子ホモ型個体の選抜を実施する。当該 Rf— 1遺伝子を検出する方法につき、本発明者らは、特許出願を行い（特願 2000— 247204)、特開 2002— 345485として公開されている。また、前記日本特許出願に基づき国際出願 (PCTZJP01Z07052)を行い、 WO 02/1450 6 A1として国際公開されている。これらの出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。

[0053] 本発明者らはさらに、特願 2000-247204の改良方法として、 Rf-1遺伝子を含む Rf— 1遺伝子座の領域をさらに特定し、特願 2001— 285247 (2001年 9月 19日）、特願 2001— 309135 (2001年 10月 4日;)及び特願 2002— 185709 (2002年 6月 26 日）を出願した。そして、前記 3つの日本特許出願に基づき、国際特許出願 (PCTZJ P02Z09429)を行った。また、本発明者らはさらに研究を進め、 Rf-1遺伝子を同定し、 2002年 7月 5日に特許出願を行った (特願 2002-197560)。また、前記日本特許出願に基づき、国際特許出願 (PCTZJP03Z03154)を行い、 WO 03/02 7290 A1として国際公開されている。これらの出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。

[0054] 特開 2002— 345485において、 Rf— 1遺伝子座が DNAマーカー座 S12564 Tsp 5091と C1361 Mwol座との間に座乗することが本発明者らにより明らかにされ、これを利用した RFLP— PCR用マーカーが記載されている。本発明者らは、さらに DN Aマーカー座 S12564 Tsp509Iと C1361 Mwol座の間の領域について、 Rf— 1 遺伝子座と DNAマーカー座 S 12564 Tsp509Iとが密接連鎖することを手がかりに、染色体歩行および遺伝学的解析を行うことにより、 Rf - 1遺伝子と連鎖する領域を調べた。その結果、 Rf-1遺伝子を含む Rf-1遺伝子座領域を約 76kbまで特定し、そして当該領域の全塩基配列を決定することに成功した。

[0055] 具体的には、特開 2002— 345485では、 MSコシヒカリに MS— FRコシヒカリ（Rf— 1 座へテロ）の花粉をかけて作成した集団 1042個体を用いて連鎖分析を行い、 Rf-1 座と S12564 Tsp509I座との間での組換え個体を 1個体、 Rf— 1座と C1361 Mw ol座との間での組換え個体を 2個体見出した。本発明者らは、上記集団をさらに 410 3個体追加し、合計 5145個体として解析を行った。その結果、新たに、 Rf— 1座と S1 2564 Tsp509I座との間での組換え個体を 1個体、 Rf— 1座と C1361 Mwol座との間での組換え個体を 6個体見出し、それぞれの組換え個体の合計を 2個体および 8個体とした。これら 10個体を Rf— 1座極近傍組換え個体として、高精度分離分析に供試することとした (参考例 1)。

[0056] Rf— 1座と S12564 Tsp509I座との間での組換え個体が 2個体に対し、 C1361 Mwol座との間での組換え個体が 8個体という上記の組換え個体出現頻度は、 S12 564 Tsp509I座と C1361 Mwol座とを it較すると、 S 12564 Tsp509I座のほうが遺伝学的に Rf— 1座に近いことを意味する。遺伝的距離 (組換え価 cMが単位）と物理的距離 (塩基対数 bpが単位)とは必ずしも比例しないが、通常は遺伝的距離が短ければ物理的距離も短!、と期待できる。

[0057] そこで、 S12564 Tsp509I座を起点に染色体歩行を行うことにより、 Rf— 1座を単離することとした (参考例 2)。染色体歩行には、インディ力品種 IR24およびジャポ- 力品種あそみのりのゲノム DNAを用いて λ DASH IIベクターにより作成したゲノミックライブラリーを供試した。 IR24は Rf— 1保有品種、あそみのりは Rf— 1非保有品種である。染色体歩行を進めた結果、 IR24のゲノミッククローンにより約 76kbの染色体領域をカバーするコンテイダ (複数のクローンを重複部分で重ね合わせて染色上での順に整列化したもの）を作成することができ、その全塩基配列（76363bp)を決定した。

[0058] 次いで、得られた塩基配列情報等を利用することにより、新たに 12個のマーカーを開発し、既述の Rf - 1座極近傍組換え個体 10個体を用いて、高精度分離分析を行つた (参考例 3)。その結果、上記の約 76kbの染色体領域に含まれる 65kbの配列が Rf— 1遺伝子の機能の有無を決定する配列を包含することが示された。この領域は、 8個のゲノミッククローン力も構成されるコンテイダによりカバーされて、る。各クローンの長さは、約 12— 22kbであり少なくとも 4. 7kbの重複部を持つ。一方、イネの遺伝子の長さについては、短いもの力も長いものまであることが知られている力大部分の遺伝子は数 kb以内であると考えられる。そのため、これら 8個のゲノミッククローンのうち、少なくともひとつは完全長の Rf— 1遺伝子を包含すると予測される。

[0059] 本発明者らはさらに、上記 76kbの染色体領域のうち、 Rf-1遺伝子領域をさらに絞り込むと共に、稔性回復能の存在を直接的に証明するために、相補性試験を行った

[0060] 具体的には、雄性不稔系統である MSコシヒカリの未熟種子に、上記 76kb領域内の 10個の部分断片（各 10— 21kb)を、別々に遺伝子工学的に導入した（図 5)。使用された 10個の部分断片のうち、 8個は先に染色体歩行で得られた 8個のゲノミッククローン（図 1、参考例 3に記載の XSE1、 XSE7、 XSF4、 XSF20、 XSG22、 XSG1 6、 XSG8及び XSH18)に由来するものである。これらに加えて、さらに 2個のクローン XSF 18および XSX1に由来する断片につ!ヽても相補性試験を行つた。 XSF 18は XSF20と 5'末端及び 3'末端（各々、配列番号 1の塩基 20328及び 41921)が同一だ力途中の塩基 33947— 38591を欠いている。これは、最初にクローン XSF18が単離されたが、単離後の増殖の過程で上記欠失を生じたことが判明したため、再度増殖をやり直すことにより、完全型のクローンを単離し、 XSF20と命名したことに因る。また、 XSX1は、クローン XSG8と XSH18の重複部分がやや小さいため（約 7kb)、制限酵素処理およびライゲーシヨンにより両クローンから、重複部分を十分に含むようなクローンを新たに作成したものである。

[0061] Rf-1は優性遺伝子であるので、導入した断片が Rf— 1遺伝子を完全に包含してヽる場合には、形質転換植物当代において稔性が回復する。相補性試験において、各断片について形質転,物の種子稔性調査を行い、 Xファージクローン XSG16 に由来する 15. 6kb断片（配列番号 1の塩基 38538— 54123を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された (参考例 4)。他の断片については、形質転^ ¾物はすべて不稔であった。これらの結果から、上記 15. 6 kb断片が Rf— 1遺伝子を完全に包含していることが示された。さら〖こ、 Rf— 1遺伝子を遺伝子工学的に導入する方法が提供され、その有効性が実証された。

[0062] 本発明者らは、 λファージクローン XSG16のどの部分が Rf— 1遺伝子を含むかをさらに特定するために、前述の 15. 6kb断片（配列番号 1の塩基 38538— 54123を含む)よりも短い断片について相補性試験による種子稔性調査を行った。その結果、 X SG16に由来する 11. 4kb断片（配列番号 1の塩基 42357— 53743を含む）を導入した形質転換体にお!ヽて、種子稔性が回復して!/ヽることが見出された (参考例 4 (2) ) 。さらに、より短い 6. 8kb断片（配列番号 1の塩基 42132-48883を含む）を導入した形質転換体においても、種子稔性が回復した (参考例 4 (3) )。これらの結果から、上記 6. 8kb断片が Rf— 1遺伝子を包含していることが示された。

[0063] 本発明者らは、さらに研究をすすめ、稔性回復機能を有する核酸を特定し、それによってコードされるアミノ酸配列も明らかにした。具体的には、参考例 5— 6に記載したよう【こ、先ず、酉己歹 U番号 1の 43733— 44038及び 48306— 50226【こネ目当する DNA 断片を PCRを用いて作成した。これらの 2種の断片をプローブ (プローブ P及び Q)として、コシヒカリに Rf— 1を導入した系統より作成した cDNAをライブラリーをスクリー- ングした。その結果、 6個のクローンの末端塩基配列が XSG16の配列と一致し、 Rf— 1遺伝子を含むクローンとして単離され、塩基配列が解析された (配列番号 43 - 48)

[0064] 配列番号 43— 48の!、ずれの配列も、配列番号 49のアミノ酸配列 1 791を持つタンパク質をコードする。具体的には、各々配列番号 43の塩基 215— 2587、配列番号 44の塩基 213— 2585、配列番号 45の塩基 218— 2590、配列番号 46の塩基 208— 2580、酉己歹 IJ番号 47の塩基 149 2521及び酉己歹 IJ番号 48の塩基 225— 2597力、ずれも配列番号 49のアミノ酸配列 1 791をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 1の塩基 43907— 46279に対応する。

[0065] 配列番号 49のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子 (Rf 2)の推定アミノ酸配列（Cui et al. , 1996)と比較したところ、 Ν末端の 7アミノ酸残基（Met—Ala Arg— Arg— Ala— Ala— Ser)がー致した。これら 7アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Liu et al. , 2001)。これらのことから、今回単離した cDNAは Rf - 1遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネ Rf— 1とトウモロコシ Rf 2とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。

[0066] また、今回単離した cDNAの配列を IR24のゲノム配列（配列番号 1)と比較し、 Rf— 1遺伝子のェキソンとイントロンの構造を明らかにした（図 7)。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリ A付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。 Rf— 1遺伝子のコード領域内には、イントロンは介在しない。

[0067] 本発明者らは、参考例 4 (3)の相補性実験で種子稔性を回復した 6. 8kb断片について、さらに相補性実験を行った。具体的には、参考例 7において、前記 6. 8kb断片中の Rf— 1遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2kb断片 ( 配列番号 1の塩基 42132-46318)を用いて、相補性実験を行ったところ、種子稔性が回復した。

[0068] さらに、参考例 8において稔性回復機能を有する核酸を含むクローンを新たに 6個取得した。具体的には、先ず、配列番号 1の塩基 45522— 45545及び 45955— 459 32に相当する 2種類のプライマーを用いて、 IR24のゲノミッククローン XSG16をテンプレートに PCRを行い、 DNA断片を得た。当該 DNA断片をプローブ Rとして、前記プローブ pとともにプラークハイブリダィゼーシヨンを行なった。プローブ Pおよびプローブ Rのどちらでも陽性を示すプラークから、新たに 6個のクローンを得た（# 7-# 1 2)。その結果を配列番号 54— 59に示す。

[0069] 配列番号 54— 59のいずれの配列も、配列番号 49のアミノ酸配列 1 791を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号 54の塩基 229— 260 1、配列番号 55の塩基 175— 2547、配列番号 56の塩基 227— 2599、配列番号 57 の塩基 220— 2592、配列番号 58の塩基 174— 2546及び配列番号 59の塩基 90— 2 462力いずれも配列番号 49のアミノ酸配列 1—791をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 1の塩基 43907— 46279に対応する。

[0070] 今回単離した cDNAの配列を IR24のゲノム配列（特願 2001— 285247の配列番号 1)と比較することにより、ェキソンとイントロンの構造が明らかになった（図 8)。今回単離した cDNAのなかには、予想翻訳領域とは関係のないェキソンを含まず、単一ェキソン力なるものも 3個存在した（ # 10— # 12、配列番号 57— 59)。

[0071] 稔性回復遺伝子 (Rf - 1)座を含む核酸は、配列番号 1の塩基配列を有する核酸、又は配列番号 1の塩基配列と少なくとも 70%同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸を含む。さらに、参考例 4に記載したように、配列番号 1の塩基配列のうち、特に塩基 38538— 54123に Rf-1遺伝子が完全に含まれていると確認された。 Rf-1遺伝子を含む領域はさらに、好ましくは、配列番号 1の塩基 38538— 5412 3、より好ましくは、塩基 42357— 53743、さらに好ましくは、塩基 42132— 48883、さらにより好ましくは塩基 42132-46318と特定された。

[0072] Rf - 1遺伝子を含む核酸として以下の領域が特定された。

[0073] a)酉己列番号 43の塩基 215— 2587、

b)配列番号 44の塩基 213— 2585、

c)配列番号 45の塩基 218— 2590、

d)配列番号 46の塩基 208— 2580、

e)配列番号 47の塩基 149 2521、

f)配列番号 48の塩基 225— 2597、

h)配列番号 54の塩基 229— 2601、

i)配列番号 55の塩基 175— 2547、

j)配列番号 56の塩基 227— 2599、

k)配列番号 57の塩基 220— 2592、

1)配列番号 58の塩基 174— 2546及び

m)配列番号 59の塩基 90— 2462。

[0074] 上記塩基配列は、 g)配列番号 1の塩基 43907— 46279に対応し、そして、いずれも配列番号 49のアミノ酸配列 1 791をコードする。

[0075] 以下、本明細書中、文脈により「配列番号 1の塩基配列」という用語は、配列番号 1 全体、あるいは、その一部であって稔性回復機能に関与する部分、特に、塩基 3853 8— 54123を示す。より好ましくは、塩基 42357— 53743、さらに好ましくは、塩基 42 132— 48883、さらにより好ましくは塩基 42132— 46318を示す。そして、特に好ましくは、 g)配列番号 1の塩基 43907— 46279、あるいは、これに対応する、 a)配列番号 43の塩基 215— 2587、 b)配列番号 44の塩基 213— 2585、 c)配列番号 45の塩基 2 18—2590、 d)配列番号 46の塩基 208— 2580、 e)配列番号 47の塩基 149— 2521、 f)配列番号 48の塩基 225 - 2597、 h)配列番号 54の塩基 229 - 2601、 i)配列番号 55の塩基 175— 2547、 j)配列番号 56の塩基 227— 2599、 k)配列番号 57の塩基 2 20—2592、 1)配列番号 58の塩基 174— 2546又は m)配列番号 59の塩基 90— 246 2のいずれかを示す。

[0076] 後述する参考例では、稔性回復遺伝子 (Rf— 1)を含む核酸として、 Rf— 1遺伝子を含むインディ力米の IR24のゲノムライブラリーより核酸が単離され、配列番号 1の塩基配列が決定された。しカゝしながら、稔性回復遺伝子 (Rf— 1)を含む核酸の由来は、 Rf— 1遺伝子を有するインディ力型品種由来のものであれば特に限定されなヽ。 Rf— 1遺伝子を有するインディ力型品種は、特に限定されず、例えば、 IR24、 IR8、 IR36 、 IR64、 Chinsurah, BoroIIが含まれる。 Rf— 1遺伝子を有しないジャポニカ型品種としては、例えば、限定されるわけではないが、あそみのり、コシヒカリ、きらら 397、ァキヒカリ、あきたこまち、ササ-シキ、キヌヒカリ、日本晴、初星、黄金晴、ヒノヒカリ、ミネアサヒ、あいちのかおり、ハツシモ、ァケボノ、フジヒカリ、峰の雪もち、ココノエモチ、ふくひびき、どんとこい、五百万石、ハナエチゼン、トドロキヮセ、はえぬき、どまんなか、ャマヒカリ等が知られている。「インディ力型品種」も「ジャポニカ型品種」も当業者に周知であり、当業者はどのようなイネ品種が本発明の対象となり得る力容易に判断できる。

[0077] 本発明に利用可能な核酸は、ゲノム DNA (その対応する cDNAも含む）、化学的に合成された DNA、 PCRにより増幅された DNA、およびそれらの組み合わせが含まれる

Rf - 1遺伝子を含む核酸は、好ましくは配列番号 1の塩基配列を有する。 1つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号 1と完全には一致していない DNA配列力配列番号 1と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体 DN A配列は、サイレント（silent)突然変異 (例えば、 PCR増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。

[0078] Rf— 1遺伝子は、好ましくは配列番号 49に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなぐ 1またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換して、るアミノ酸配列を有して、てもよ、。

、稔性回復機能を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。「アミノ酸変異」は 1から複数個、好ましくは、 1ないし 20個、より好ましくは 1ないし 10個、最も好ましくは 1ないし 5個である。 Rf— 1遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、配列番号 49に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約 70%、好ましくは約 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の同一性を有する。

[0079] アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、 2つのタンパク質配列の同一性パーセントは、 Needleman, S. B.及び Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol. , 48 :443—453, 1970)のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ (UWGCG)より入手可能な GAPコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。 GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（l) Henikoff, S及び Hen ikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 10915—10919, 1992)に記載されるような、スコアリング'マトリックス、 blosum62 ; (2) 12のギャップカ卩重；（3) 4のギャップ長加重;及び (4)末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。

[0080] 当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えば Altschulら（Nucl. Acids. Res. 25. , p. 3389—3402, 199 7)に記載されて、る BLASTプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上で National Center for Biotechn ology Information (NCBI)、あるいは DNA Data Bank of Japan (DDBJ)のウェブサイトから利用することが可能である。 BLASTプログラムによる相同性検索の各種条件 (パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能である力検索は通常デフォルト値を用いて行う。

[0081] 同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。 Rf— 1遺伝子は、稔性回復機能を有する限り、配列番号 1の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。「稔性回復機能を有する」とは、当該 DNA断片が導入された場合に、ィネ個体又は種子に稔性を付与することを意味する。稔性回復は、 Rf— 1遺伝子よりタンパク質が発現されることに因ってもよぐあるいは Rf— 1遺伝子の核酸 (DNA又は R NA)自体が稔性の付与に何らかの機能をして、てもよ、。

[0082] 限定されるわけではないが、 Rf— 1遺伝子の相同体、変異体が稔性回復機能を有する力否かは、例えば、以下のように調べることが可能である。 MSコシヒカリ（不稔系統）にコシヒカリの花粉をかけることにより得た未熟種子を供試して、 Hiei et al (Pla nt Journal (1994) , 6 (2) , p. 272— 282)の方法に従い、被検定核酸断片を導入する。得られた形質転換体を通常の条件で栽培すると、被検定核酸断片が稔性回復機能を有する場合にのみ、種子が稔る。

[0083] Rf— 1遺伝子を有しないジャポニカ型のあそみのりの対応する領域に由来する核酸は、配列番号 2に示した塩基配列を有する。配列番号 2と配列番号 1の対応する部分は、全体として約 98%の同一性を有する。よって、稔性回復遺伝子 (Rf— 1)座を含む核酸は、配列番号 1と少なくとも約 70%、好ましくは約 80%以上、より好ましくは 90 %以上、さらに好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の同一性を有する。「配列番号 1」は、特に好ましくは、 g)配列番号 1の塩基 43907— 46279、あるいは、これに対応する、 a)配列番号 43の塩基 215— 2587、 b)配列番号 44の塩基 213— 258 5、 c)配列番号 45の塩基 218— 2590、 d)配列番号 46の塩基 208— 2580、 e)配列番号 47の塩基 149— 2521、 f)配列番号 48の塩基 225— 2597、 h)配列番号 54の塩基 229— 2601、 i)配列番号 55の塩基 175— 2547、 j)配列番号 56の塩基 227— 259 9、 k)配列番号 57の塩基 220— 2592、 1)配列番号 58の塩基 174— 2546又は m)配列番号 59の塩基 90— 2462の!ヽずれかを意図する。

[0084] 核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。

あるいは、 2つの核酸配列の同一性パーセントは、 Devereuxら， Nucl. Acids Res. , 12 : 387 (1984)に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピュータ一グループ（UWGCG)より入手可能な GAPコンピュータープログラム、バージョン 6 . 0を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。 GAPプログラムの好まし V、デフォルトパラメーターには：（ 1)ヌクレオチドに関する単一（unary)比較マトリックス（同一に対し 1および非同一に対し 0の値を含む）、および Schwartzおよび Dayho ff監修, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedi cal Research Foundation, pp. 353— 358 (1979)に記載されるような、 Gribsk ovおよび Burgess, Nucl. Acids Res. 14 : 6745 (1986)のカロ重比較マトリツタス；（2)各ギャップに対する 3. 0のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに 0. 10のペナルティ；および（3)末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。

[0085] 本発明の好ましい核酸はまた、配列番号 1の塩基配列に中程度にストリンジントな条件下でノ、イブリダィズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸、並びに、配列番号 1の塩基配列に高度にストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸を含む。

[0086] 本明細書において使用されるように、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、 D NAの長さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、 Sambrookら， Molecular Cloning : A Laboratory Manual,第 2版， Vol. 1, pp. 1. 101—104, Cold Spring Harbor Lab oratory Press, (1989)に示されている。例えば、ニトロセルロースフィルターに関し、 5XSSC, 0. 5%SDS、 1. OmM EDTA(pH8. 0)の前洗浄溶液、約 40。Cないし 60°Cでの、 1 X SSCないし 6XSSC (または約 42°Cでの約 50%ホルムアミド中の、例えばスターク溶液（Stark' s solution)などの他の同様のハイブリダィゼーシヨン溶液）のハイブリダィゼーシヨン条件、および約 60°C、 0. 5XSSC、 0. 1% SDSの洗浄条件の使用が含まれる。また、例えば、ハイブリダィゼーシヨン溶液が約 50%ホルムアミドを含む場合、上記ハイブリダィゼーシヨン温度は約 15°Cな、し 20°C低めとなる。非常にストリンジェントな条件もまた、例えば DNAの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般に、非常にストリンジェントな条件は、上記中程度にストリンジヱントな条件よりも、より高い温度及び Z又はより低い塩濃度でのハイブリダィゼーシヨン、及び Z又は洗浄条件を含む、例えば、約 60°Cないし 65°C での 0. 1 X SSCないし 0. 2 X SSCのハイブリダィゼーシヨン条件、および/又は約 6 5°Cないし 68°C、 0. 2XSSC、0. 1% SDSの洗浄条件を含む。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよ、ことを認識するであろう。

[0087] 「配列番号 1」は、特に好ましくは、 g)配列番号 1の塩基 43907— 46279、あるいは、これに対応する、 a)配列番号 43の塩基 215— 2587、 b)配列番号 44の塩基 213— 2585、 c)配列番号 45の塩基 218— 2590、 d)配列番号 46の塩基 208— 2580、 e) 配列番号 47の塩基 149— 2521、 f)配列番号 48の塩基 225— 2597、 h)配列番号 5 4の塩基 229— 2601、 i)配列番号 55の塩基 175— 2547、 j)配列番号 56の塩基 227 —2599、 k)配列番号 57の塩基 220— 2592、 1)配列番号 58の塩基 174— 2546又は m)配列番号 59の塩基 90— 2462の!ヽずれかを意図する。

[0088] 同様に、本発明の核酸には、 1つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号 1の塩基配列とは異なるが稔性回復機能を有する核酸を含む。稔性回復機能を有する限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは 1個ないし数千個、より好ましくは 1個ないし千個、さらにこのましくは 1個ないし 500個、さらにより好ましくは 1個ないし 200個、最も好ましくは 1個ないし 100個である。

[0089] 本明細書の記載に基づいて Rf— 1遺伝子がより特定され、当業者が Rf— 1遺伝子以外の部分または Rf— 1遺伝子内のイントロン部分などの核酸を除いて使用することが可能である。また、既定のアミノ酸 (特に配列番号 49に記載のアミノ酸配列）を、例えば同様の物理ィ匕学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、 1つの脂肪族残基を互いに、例えば Ile、 Val、 Leu,または Alaを互いに置換するもの； Lysおよび Arg、 Gluおよび Asp、または Ginおよび Asn間といった、 1つの極性残基力別のものへの置換;あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えば Phe、 Trp、または Tyrを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、 Sambrookら（2001) (上述)等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。

[0090] 本発明者らは、 Rf— 1遺伝子を有するインディ力型の IR24 (塩基配列 27)と、有しな V、ジャポニカ型のあそみのり（塩基配列 28)および GenBankに登録されて!、る日本晴 BACクローン（ァクセッション番号 AC068923)とを比較した。その結果、 Rf— 1遺伝子を含むインディ力型の Rf - 1領域は少なくとも、以下の 1塩基多型（SNP)を有することを見出した。

[0091] 1)配列番号 1の塩基 1239に相当する塩基が Aである；

2)配列番号 1の塩基 6227に相当する塩基が Aである；

3)配列番号 1の塩基 20680に相当する塩基が Gである；

4)配列番号 1の塩基 45461に相当する塩基が Aである；

5)配列番号 1の塩基 49609に相当する塩基が Aである；

6)配列番号 1の塩基 56368に相当する塩基が Tである；

7)配列番号 1の塩基 57629に相当する塩基力である；及び

8)配列番号 1の塩基 66267に相当する塩基が Gである。

[0092] よって、本発明の Rf— 1領域を含む核酸は、好ましくは上記条件 1) 8)の 1つないし全てを満たす。

[0093] なお、後述の参考例 3において、 Rf— 1遺伝子極近傍組換え個体 (RS1— RS2、 RC 1-RC8)についてその Rf— 1領域の染色体構成を調べた。その結果、配列番号 1の塩基 1239ないし 66267の塩基配列、即ち、最大限に見積もっても P4497 Mbol座力 B56691 Xbal座までの領域 (約 65kb) (図 3)に、 Rf— 1遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることが明らかにされた。ただし、 Rf— 1遺伝子の一部の遺伝子型力インディ力型であることが、 Rf— 1遺伝子の遺伝子機能発現に重要であり、残りの部分はジャポニカ型でもインディ力型でも遺伝子機能に大きな差異を生じない可能性がある。極端な場合、ジャポニカ 'インディ力間でコーディング領域は完全に同一で、プロモーター領域だけに差違があり、そして、プロモーター領域及びコーディング領域の一部のみが上記 P4497 Mbol座力ら B56691 Xbal座までの領域（約 65kb)に含まれることもあり得る。よって、上記共有インディ力型領域 (配列番号 1の塩基 1239ないし 66267)が Rf-1遺伝子全体を完全に包含するとは、断定できない。し力しながら、以下の理由、

1)遺伝子の大きさは通常数 kbであり lOkbを超えることは稀である；

2) IR24のゲノム塩基配列 (配列番号 1)は、上記共有インディ力型領域を完全に包含する；

3)配列番号 1の 5 '末端は、上記共有インディ力型領域の 5 '末端から 1238bp上流に位置し、別の遺伝子（S 12564)の一部である；および

4)配列番号 1の 3'末端は、上記共有インディ力型領域の 3'末端から 10096bp 下流に位置する

により、少なくとも配列番号 1は Rf - 1遺伝子全体を完全に包含すると考えられる。

[0094] さらに、本発明者らは相補性試験を行うことにより、配列番号 1の塩基配列のうち、特に塩基 38538— 54123に Rf-1遺伝子が完全に含まれていることを確認した。よつて、本発明の一態様において、配列番号 1の塩基配列又は配列番号 1の塩基 3853 8-54123の塩基配列と、少なくとも 70%同一の塩基配列は、以下の条件 1)及び 2) の少なくとも一つを満たす：

1)配列番号 1の塩基 45461に相当する塩基が Aである；及び

2)配列番号 1の塩基 49609に相当する塩基が Aである。

[0095] 本発明者らはさらに、 Rf— 1遺伝子を含む核酸として以下の領域を特定した。

[0096] a)配列番号 43の塩基 215— 2587、

b)配列番号 44の塩基 213— 2585、

c)配列番号 45の塩基 218— 2590、

d)配列番号 46の塩基 208— 2580、

e)配列番号 47の塩基 149 2521、

f)配列番号 48の塩基 225— 2597、

h)配列番号 54の塩基 229— 2601、

i)配列番号 55の塩基 175— 2547、

j)配列番号 56の塩基 227— 2599、

k)配列番号 57の塩基 220— 2592、

1)配列番号 58の塩基 174— 2546、及び m)配列番号 59の塩基 90— 2462。

[0097] 上記塩基配列は、 g)配列番号 1の塩基 43907— 46279に対応する。本発明の好ましい核酸はさらに、

n)上記 a)— m)のいずれかの核酸と少なくとも 70%同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；

o)上記 a)— m)のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジントな条件下でハイブリダィズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸;及び

P)上記 a)— m)の、ずれかの核酸に 1な、し複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。

を含む。

[0098] 上記の配列番号 1の塩基 45461は、 1)配列番号 43の塩基 1769 ; 2)配列番号 44 の塩基 1767； 3)配列番号 45の塩基 1772 ;4)配列番号 46の塩基 1762； 5)配列番号 47の塩基 1703； 6)配列番号 48の塩基 1779； 7)配列番号 54の塩基 1783； 8)配列番号 55の塩基 1729； 9)配列番号 56の塩基 1781； 10)配列番号 57の塩基 1774 ; 11)配列番号 58の塩基 1728 ;及び 12)配列番号 59の塩基 1644に相当する。よつて、特に好ましくは、本発明の方法に使用する核酸は、好ましくは、以下の条件 1)— 1 2)の少なくとも一つを満たす：

1)配列番号 43の塩基 1769に相当する塩基が Aである；

2)配列番号 44の塩基 1767に相当する塩基が Aである；

3)配列番号 45の塩基 1772に相当する塩基が Aである；

4)配列番号 46の塩基 1762に相当する塩基が Aである；

5)配列番号 47の塩基 1703に相当する塩基が Aである；

6)配列番号 48の塩基 1779に相当する塩基が Aである；

7)配列番号 54の塩基 1783に相当する塩基が Aである；

8)配列番号 55の塩基 1729に相当する塩基が Aである；

9)配列番号 56の塩基 1781に相当する塩基が Aである；

10)配列番号 57の塩基 1774に相当する塩基が Aである；

11)配列番号 58の塩基 1728に相当する塩基が Aである；又は 12)配列番号 59の塩基 1644に相当する塩基が Aである。

[0099] 本明細書中の参考例 4及び 7に記載の相補性試験では実際に、図 5に記載の 10 個のクローン由来の断片を用い、ァグロバタテリゥムを用いる方法により MSコシヒカリ (BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）を形質転換した。その結果、配列番号 1の塩基 38538— 54123、好ましくは、塩基 42357— 53743、より好ましくは、塩基 42132— 48883、さらにより好ましくは塩基 42132— 46318の塩基配列を含む核酸によって、稔性回復系統が育成されることが証明された。

[0100] 本発明の実施例では、 Rf— 1遺伝子として、 XSG16に由来する 15. 6kb断片を使用し、花粉稔性が得られることを確認した。当該断片を含むより長い断片、並びに上述したように Rf— 1遺伝子を含むことが同定されてヽるより短!、断片も同様に利用可能であることは当業者に容易に理解される。好ましくは、より短い断片を利用する。図面の簡単な説明

[0101] [図 1]図 1は、 RFLPマーカー座 S 12564を起点とする染色体歩行の結果を示す。

[図 2]図 2は、 BACクローン AC068923とラムダクローンコンテイダとの位置関係を示す。

[図 3]図 3は、 Rf— 1座極近傍組換え型花粉、ずれも稔性あり）の Rf— 1座極近傍の染色体構成を、その花粉から生じた 10個体 (RS1、 RS2、 RC1— 8)のマーカー座の遺伝子型に基づき、明らかにした結果を示したものである。白抜き部分はジャポニカ型領域を、黒部分はインディ力型領域を示す。

[図 4]図 4は、第 10染色体上のマーカー座と Rf— 1座との連鎖分析の結果に基づき、 Rf— 1座の連鎖地図上での位置を示したものである。地図距離は、 1042F1個体の分離データから算出した。

[図 5]図 5は、相補性試験による Rf— 1領域の同定のために使用した、 10個のゲノムクローン由来の断片を示す。染色体歩行により得られた λクローン (細い線)を用いて、太い直線で示した染色体領域について相補性試験を行った。 XSF18は、欠失を含むクローンであることが分力つたので、その欠失部分は点線で示した。

[図 6]図 6は、 XSG16由来の 15. 7kb (参考例 4)及び XSF18由来の 16. 2kb断片（塩基番号 1の塩基 21065— 33946及び 38592-41921を含む）を用いた相補性試験の結果を示す。 XSG16由来の 15. 7kbでは稔性が回復し、稲穂がたれている。

[図 7]図 7は、 Rf— 1遺伝子構造の模式図を示す。白棒部分および黒線部分は、それぞれェキソンおよびイントロンを示す。ェキソン部分については、塩基対数を示してある。

[図 8]図 8は、相補性試験を行った IR24ゲノム断片、 cDNAライブラリースクリーニングに用いたプローブ及び単離した cDNAから推定した Rf— 1遺伝子の位置関係の模式図を示す。 Rf— 1遺伝子の白棒部分および黒線部分は、それぞれ、ェキソンおよびイントロンを示す。ェキソン部分については、塩基対数を示してある。

[図 9]図 9は、導入 Rf— 1部位を確認するために使用したプライマーの位置を示す模式図である。 Nos :ノパリン合成酵素のターミネータ一（Tnos)、 HPT:ノヽィグロマイシン抵抗性遺伝子、 BR:ライトボーダー、 BL :レフトボーダー。

[図 10]図 10は、本発明及び従来技術のハイブリッド植物の作成方法の例を示す模式図である。

実施例

[0102] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではな、。当業者は本明細書の記載に基づ、て容易に本発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

[0103] 参考例

以下の参考例は、イネの BT型雄性不稔性回復遺伝子 Rf— 1の単離 ·同定、稔性回復活性の確認を記載したものである。

[0104] 参考例 1 Rf - 1座極沂傍組換え個体の獲得

(材料および方法）

MSコシヒカリ（世代： BC10F1)に MS— FRコシヒカリ（世代： BC9F1、 Rf— 1座へテ口）の花粉をかけて作成した BC10F1集団 4103個体を用い、各個体力も DNAを抽出し、特開 2002— 345485 (又は WO02Z14506)に記載の方法で S12564 Tsp 5091座および C1361 Mwol座の遺伝子型を調査した。 S12564 Tsp509I座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、 Rf— 1座と S12564 Tsp509I座との間での組換えにより生じた個体とみなし、 C1361 Mwol座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、 1«—1座とじ1361 Mwol座との間での組換えにより生じた個体とみなした。

[0105] (結果および考察）

4103個体を調査した結果、 Rf— 1座と S12564 Tsp509I座との間での組換え個体を 1個体、 Rf— 1座と C1361 Mwol座との間での組換え個体を 6個体見出した。一方、特開 2002— 345485 (又 ίま WO02/14506)【こおヽて交酉己【こより得られた 10 42個体を調査した結果、 Rf— 1座と S12564 Tsp509I座との間での組換え個体を 1 個体、 Rf— 1座と C1361 Mwol座との間での組換え個体を 2個体見出している。

[0106] 合計すると、 5145個体力ら、 Rf— 1座と S12564 Tsp509I座との間での組換え個体を 2個体、 Rf— 1座と C1361 Mwol座との間での組換え個体を 8個体獲得できたことになる。これら 10個体を以下の参考例における高精度分離分析に供試することにした。

[0107] ί列 2 ^^

(1) 1回目染色体歩行

(材料および方法）

ジャポニカ品種あそみのり（Rf— 1非保有品種）のゲノム DNAを用いて、特開 2002 —345485 (又は WO02/14506)に記載したように Lambda DASH IIベクターによりゲノミックライブラリーを作成し、染色体歩行に供試した。

[0108] RFLPプローブ S 12564の部分塩基酉己列（ァクセッション番号 D47284)に対して次のプライマー対：

5 — atcaggagccttcaaattgggaac— 3 (目 C列 ¾·号5)および

5 — ctcgcaaattgcttaattttgacc— d ' (目 ti列番 4)

を設計し、あそみのり全 DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCRを行った。得られた約 1200bpの増幅産物を、ァガロースゲルでの電気泳動後、 QIAEXIKQIA GEN社）を用いて精製した。精製した DNAは、 rediprime DNA labelling syst em (Amersham Pharmacia社）を用、てラベルし、ライブラリ一スクリ一-ング用プローブ（プローブ A、図 1)とした。

[0109] ライブラリーのスクリーニングは、プラークを Hybond— N+ (Amersham Pharmaci a社）にブロットした後、常法により行った。単一プラークを分離した後、 Lambda Mi di kit (QIAGEN社）を用いてプレートライセート法によりファージ DNAを精製した。

[0110] (結果および考察）

スクリーニングにより 4個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（WSA1および WSA3)は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 WSA1および WSA3に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した（DNAシーケンサー 377、 ABI社)。

[0111] (2) 2回目染色体歩行

(材料および方法）

既述のあそみのりゲノミックライブラリーに加え、インディ力品種 IR24 (Rf— 1保有品種)のゲノム DNAから同様に作成した IR24ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。

[0112] (1)で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：

5— tgaaggagttatgggtgcgtgacg— 3 (酉己歹幡 5)および

5 — ttgccgagcacacttgccatgtgc— d (酉 C列 ¾·号 6)

を設計し、 WSA3の DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCRを行った。得られた 524bpの増幅産物を、既述の方法で精製'ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ E、図 1)とした。

[0113] ライブラリーのスクリーニングおよびファージ DNAの精製は、既述の方法で行った。

[0114] (結果および考察）

あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより 15個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ (WSE8 )は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 WSE8に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。

[0115] IR24ゲノミックライブラリースクリーニングにより 7個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ (XSE1および XSE7)は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 XS E 1および XSE7に対応する IR24ゲノム塩基配列を決定した。

[0116] (3) 3回目染色体歩行 (材料および方法）

既述のあそみのりゲノミックライブラリーおよび IR24ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。

[0117] (2)で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：

5 — gcgacgcaatggacatagtgctcc— 3 (目己列 ¾·号/)および

5 — ttacctgccaagcaatatccatcg—5 (酉 C列备号 8)

を設計し、 WSE8の DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCRを行った。得られた 1159bpの増幅産物を、既述の方法で精製'ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ F、図 1)とした。

[0118] ライブラリーのスクリーニングおよびファージ DNAの精製は、既述の方法で行った。

[0119] (結果および考察）

あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより 8個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ (WSF5 および WSF7)は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 WSF5および WSF7に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。

[0120] IR24ゲノミックライブラリースクリーニングにより 13個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ (XSF4および XSF20)は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 X SF4および XSF20に対応する IR24ゲノム塩基配列を決定した。

[0121] (4) 4回目染色体歩行

(材料および方法）

[0122] (3)で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対してプライマー対：

5 — aaggcatactcagtggagggcaag— J ' (目 C列备号 9)およひ

5 — ttaacctgaccgcaagcacctgtc— 3 (目 C列 ¾·号 10J

を設計し、 WSF7の DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCRを行った。得られた 456bpの増幅産物を、既述の方法で精製'ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ G、図 1)とした。

[0123] ライブラリーのスクリーニングおよびファージ DNAの精製は、既述の方法で行った。

[0124] (結果および考察）

あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより 6個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ (WSG2 および WSG6)は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 WSG2および WSG6に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。

[0125] IR24ゲノミックライブラリースクリーニングにより 14個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちの 3クローン (XSG8、 XSG16および XSG22)は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 XSG8、 XSG16および XSG22に対応する IR24ゲノム塩基配列を決定した。

[0126] (5) 5回目染色体歩行

(材料および方法）

既述の IR24ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。

[0127] 本発明者らは、 TIGR(The Institute for Genomic Research)の公開ホームページを閲覧し、 RFLPマーカー S 12564を包含する BAC (Bacterial Artificia 1 Chromosome)クローン（ァクセッション番号 AC068923)が公開データベース（G enBank)に登録されていることを見出した。この BACクローンは、ジャポニカ品種日本晴のゲノム DNAを含むものであり、塩基配列を比較したところ、（1)ー(4)で作成したあそみのりおよび IR24のコンテイダ領域を完全に包含することが示された（図 2)。

[0128] そこで、この BACクローンの一部を増幅する次のプライマー対：

5，一 tggatggactatgtggggtcagtc— 3，（配列番号 11)および

5 — agtggaagtggagagagtagggag— 3 ' (目 ti歹 U¾>号上 2)

を設計し、 IR24全 DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCRを行った。得られた約 600bpの増幅産物を、既述の方法で精製'ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ H、図 1)とした。

[0129] ライブラリーのスクリーニングおよびファージ DNAの精製は、既述の方法で行った。 [0130] (結果および考察）

IR24ゲノミックライブラリースクリーニングにより 15個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ (XSH18)は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 XSH18に対応する IR24ゲノム塩基配列を決定した。

[0131] »^i3 ^ ^ ^

(1) PCRマーカー P4497 Mbolの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列 (配列番号 2)とを比較した結果、配列番号 1の 1239番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 2 の 12631番目の塩基は Gであることを見出した。

[0132] この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P4497 Mbol F :

5 — ccctccaacacataaatggttgag— 3 (酉己列号 13)

(配列番号 1の塩基 853—876に相当）

(配列番号 2の塩基 12247—12270に相当）

および

P4497 Mbol R:

5 — tttctgccaggaaactgttagatg— 3 ' (目 il列番号 14)

(配列番号 1の塩基 1583— 1560に相当）

(配列番号 2の塩基 12975— 12952に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 730bpの断片を増幅する。増幅産物を Mbol処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は Mbolの認識配列（GATC)をもたず、 Mbo I処理により切断されないのに対し、あそみのり DNAからの増幅産物は Mbolの認識配列をもち、 Mbol処理により切断されるため、 Mbol処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0133] (2) PCRマーカー P9493 Bsllの開発参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列 (配列番号 2)とを比較した結果、配列番号 1の 6227番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 2 の 17627番目の塩基は Cであることを見出した。

[0134] この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P9493 Bsll F:

5 — gcgatcttatacgcatactatgcg— 3 (目 C列 ¾·号 15)

(配列番号 1の塩基 6129— 6152に相当）

(配列番号 2の塩基 17529— 17552に相当）

および

P9493 Bsll R:

5 — aaagtctttgttccttcaccaagg—5 (酉 C歹¹ J¾~号 16ノ

(配列番号 1の塩基 6254— 6231に相当）

(配列番号 2の塩基 17654— 17631に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い 126bpの断片を増幅する。増幅産物を Bs II処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は Bsllの認識配列（CCNNNNNNNGG)をもたず、 Bsll処理により切断されないのに対し、あそみのり DNAからの増幅産物は Bsll の認識配列をもち、 Bsll処理により切断されるため、 Bsll処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0135] なお、本マーカーの開発には、 dCAPS法（Michaels and Amasino 1998, Neff et al 1998)を適用した。具体的には、前記 P9493 Bsll Rプライマーの使用により、配列番号 1の 6236および配列番号 2の 17636の aが gに置換される。これにより、あそみのり DNA由来の断片は、配列番号 2の 17626— 17636の部分の配列が CCtttccttG となり、 Bsll処理により切断される。

[0136] (3) PCRマーカー P23945 Mbolの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列 (配列番号 2)とを比較した結果、配列番号 1の 20680番目の塩基が Gであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 2 の 32079番目の塩基は Aであることを見出した。

[0137] この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P23945 Mbol F :

5 — gaggatttatcaaaacaggatggacg— 3 (酉己列号 17)

(配列番号 1の塩基 20519-20544に相当 )

(配列番号 2の塩基 31918-31943に相当）

および

P23945 Mbol R:

5 — tgggcggcagcagtggaggataga— 3 (目 il歹 U番 18)

(配列番号 1の塩基 20778— 20755に相当）

(配列番号 2の塩基 32177—32154に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い 260bpの断片を増幅する。増幅産物を M bol処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は Mbolの認識配列（GATC)をもち、 Mbol処理により切断されるのに対し、あそみのり DNAからの増幅産物は Mbolの認識配列をもたず、 Mbol処理により切断されないため、 Mbol処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0138] (4) PCRマーカー P41030 Taqlの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列 (配列番号 2)とを比較した結果、配列番号 1の 45461番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 2 の 49164番目の塩基は Gであることを見出した。

[0139] この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P41030 Taql F :

5 — aagaagggagggttatagaatctg— J ' ( 歹 [1¾" 19)

(配列番号 1の塩基 45369— 45392に相当）

(配列番号 2の塩基 49072— 49095に相当）および

P41030 Taql R:

5，— atatcaggactaacaccactgctc— 3， (酉己列番号 20)

(配列番号 1の塩基 45648— 45625に相当）

(配列番号 2の塩基 49351— 49328に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い 280bpの断片を増幅する。増幅産物を T aql処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は Taqlの認識配列（TCGA)をもたず、 Taql処理により切断されないのに対し、あそみのり DNAからの増幅産物は Taqlの認識配列をもち、 Taql処理により切断されるため、 Taql処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0140] (5) PCRマーカー P45177 BstUIの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列 (配列番号 2)とを比較した結果、配列番号 1の 49609番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 2 の 53311番目の塩基は Gであることを見出した。

[0141] この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P45177 BstUI F:

5 — acgagtagtagcgatcttccagcg—5 ' (酉己列番号 21)

(配列番号 1の塩基 49355— 49378に相当）

(配列番号 2の塩基 53057— 53080に相当）

および

P45177 BstUI R:

5 — cagcgtgaaactaaaaacggaggc— 3 (目 ΰ列 ¾·号 22)

(配列番号 1の塩基 50166— 50143に相当）

(配列番号 2の塩基 53868— 53845に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い 812bpの断片を増幅する。増幅産物を Bs tUI処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は BstUIの認識配列（CGCG)を 2個所もち、 Bs tUI処理により 3個の断片に切断されるのに対し、あそみのり DNAからの増幅産物は BstUIの認識配列を 3個所もち、 BstUI処理により 4個の断片に切断されるため、 Bst UI処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することがでさる。

[0142] (6) PCRマーカー B60304 Msplの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)と既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC068923)の塩基配列とを比較した結果、配列番号 1の 56368番目の塩基が Tであるのに対し、当該位置に対応する AC06 8923の塩基は Cであることを見出した。

[0143] この差異の検出は、先ず次のプライマー対：

B60304 Mspl F:

5 — atcccacatcatcataatccgacc— 3 (酉己列号 23)

(配列番号 1の塩基 56149— 56172に相当）

および

B60304 Mspl R:

5 — agcttctcccttggatacggtggcg— 3 (酉己歹 U番 24)

(配列番号 1の塩基 56479— 56455に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 330bpの断片を増幅する。増幅産物を Mspl処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は Msplの認識配列（CCGG)をもたず、 Mspl 処理により切断されないのに対し、日本晴 DNAからの増幅産物は Msplの認識配列をもち、 Mspl処理により切断されるため、 Mspl処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0144] なお、本マーカーの開発には、 dCAPS法を適用した。具体的には、 B60304 Ms pi Rプライマーの使用により、配列番号 1の 56463の gが tに置換される。これにより、配列番号 1の 56460— 56463の Msplの認識配列 CCGGが ccgtとなり、 Msplによつて切断されなくなる。よって、 IR24由来の断片は Msplの認識配列を一つも有さず、一方、日本晴由来の DNAは、配列番号 1の 56367— 56370に対応する領域に 1 箇所 Msplの認識配列を有することとなる。

[0145] (7) PCRマーカー B59066 BsaJIの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)と既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC068923)の塩基配列とを比較した結果、配列番号 1の 57629番目の塩基が Cであるのに対し、当該位置に対応する AC06 8923の塩基は CCであることを見出した。

[0146] この差異の検出は、先ず次のプライマー対：

B59066 BsaJI F :

5 ' atttgttggttagttgcggctgag— 3 ' (配列番号 25)

(配列番号 1の塩基 57563— 57586に相当）

および

B59066 BsaJI R:

5 gcccaaactcaaaaggagagaacc— 3 (目己列 ¾·号 26)

(配列番号 1の塩基 57983— 57960に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 420bpの断片を増幅する。増幅産物を BsaJI処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は BsaJIの認識配列（CCNNGG)をもたず、 B sajl処理により切断されないのに対し、日本晴 DNAからの増幅産物は BsaJIの認識配列をもち、 BsaJI処理により切断されるため、 BsaJI処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0147] (8) PCRマーカー B56691 Xbalの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)と既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC068923)の塩基配列とを比較した結果

、配列番号 1の 66267番目の塩基が Gであるのに対し、当該位置に対応する AC06

8923の塩基は Cであることを見出した。

[0148] この差異の検出は、先ず次のプライマー対：

B56691 Xbal F : 5，— cctcaagtctcccctaaagccact— 3， (酉己列番号 27)

(配列番号 1の塩基 66129— 66152に相当 )

および

B56691 Xbal R:

5— gctctactgctgataaaccgtgag—5 ' (酉己列番 28)

(配列番号 1の塩基 66799— 66776に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 670bpの断片を増幅する。増幅産物を Xbal処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は Xbalの認識配列（TCTAGA)をもたず、 Xbal 処理により切断されないのに対し、日本晴 DNAからの増幅産物は Xbalの認識配列をもち、 Xbal処理により切断されるため、 Xbal処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0149] (9) PCRマーカー B53627 BstZ17Iの開発

参考例 2で明らかにした IR24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 1)と既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC068923)の塩基配列とを比較した結果、配列番号 1の 69331番目の塩基が Tであるのに対し、当該位置に対応する AC06 8923の塩基は Cであることを見出した。

[0150] この差異の検出は、先ず次のプライマー対：

B53627 BstZ17I F:

5—tggatggactatgtggggtcagtc— 3 (目 il歹 U番号 29)

(配列番号 1の塩基 68965— 68988に相当）

および

B53627 BstZ17I R:

5 — agtggaagtggagagagtagggag— 3 (目 il歹 U番 30)

(配列番号 1の塩基 69582— 69559に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 620bpの断片を増幅する。

増幅産物を BstZ17I処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 IR24DNAからの増幅産物は BstZ17Iの認識配列（GTAT AC)をもち、 Xbal処理により切断されるのに対し、日本晴 DNAからの増幅産物は Bs tZl 71の認識配列をもたず、 BstZ17I処理により切断されないため、 BstZ17I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0151] (lO) PCRマーカー B40936 Mselの開発

以下の（10)—（12)の PCRマーカーの開発はいずれも、配列番号 1の 3'末端 763 63よりもさらに下流（3'末端)側に相当する塩基配列についての研究に関する。

[0152] 既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC068923)の塩基配列に対して、次のプライマー対：

5 — tacgacgccatttcactccattgc— 3 (目 C列 ¾·号

および

5， -catttctctatgggcgttgctctg-3，（酉己歹 U番号 32)

を設計した。このプライマー対を用いて、 MS— FRコシヒカリ（Rf— 1座の遺伝子型は R f 1 Rf— 1)およびコシヒカリの全 DNAをテンプレートに、定法に従い PCRを行った。得られた約 1300bpの増幅産物を、ァガロースゲルでの電気泳動後、 QIAEXII (Q IAGEN社)を用いて精製した。精製した DNAの塩基配列を、 DNAシーケンサー 3 77 (ABI社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。

[0153] そのひとつは、次のプライマー対：

B40936 Msel F :

5— acctgtaggtatggcaccttcaacac— 3 (目己列 ¾·号 33)

および

B40936 Msel R:

5— ccaaggaacgaagttcaaatgtatgg— 3 (酉己列号 34)

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い、増幅産物を Msel処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 MS— FRコシヒカリ (Rf— 1 Rf— 1) DNAからの増幅産物は Mselの認識配列（TTAA)をもち、 Msel処理により切断されるのに対し、コシヒカリ DNAからの増幅産物は Mselの認識配列をもたず、 Msel処理により切断されないため、 Msel処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0154] なお、本マーカーの開発には、 dCAPS法を適用した。

[0155] ( l l) PCRマーカー B19839 Mwolの開発

既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC068923)の塩基配列に対して、次のプライマー対：

5， -tgatgtgtttgggcatccctttcg-3，（酉己歹 U番号 35)

および

5 — gagataggggacgacagacacgac— 3 (酉己列号 36)

を設計した。このプライマー対を用いて、 MS— FRコシヒカリ（Rf— 1 Rf-1)およびコシヒカリの全 DNAをテンプレートに、定法に従い PCRを行った。得られた約 1200bp の増幅産物を、ァガロースゲルでの電気泳動後、 QIAEXII (QIAGEN社）を用いて精製した。精製した DNAの塩基配列を、 DNAシーケンサー 377 (ABI社）により解祈した結果、数個所において多型を見出すことができた。

[0156] そのひとつは、次のプライマー対：

B19839 Mwol F :

5 — tcctatggctgtttagaaactgcaca—5 (酉歹¹』¾·号 3 I )

および

B19839 Mwol R :

5 — caagttcaaacataactggcgttg— 3 (目 ΰ列 ¾·号 d8)

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い、増幅産物を Mwol処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 MS— FRコシヒカリ (Rf-1 Rf-1) DNAからの増幅産物は Mwolの認識配列（GCNNNNNNNGC) をもたず、 Mwol処理により切断されないのに対し、コシヒカリ DNAからの増幅産物は Mwolの認識配列をもち、 Mwol処理により切断されるため、 Mwol処理後の DN A鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

[0157] なお、本マーカーの開発には、 dCAPS法を適用した。

[0158] ( 12) PCRマーカー B2387 Bfal の開発

5，— cactgtcctgtaagtgtgctgtgc— 3， (酉己歹 U番号 39)

および

5 — caagcgtgtgataaaatgtgacgc— 3 (酉己列号 40)

を設計した。このプライマー対を用いて、 MS— FRコシヒカリ（Rf— 1 Rf-1)およびコシヒカリの全 DNAをテンプレートに、定法に従い PCRを行った。得られた約 1300bp の増幅産物を、ァガロースゲルでの電気泳動後、 QIAEXII (QIAGEN社）を用いて精製した。精製した DNAの塩基配列を、 DNAシーケンサー 377 (ABI社）により解祈した結果、数個所において多型を見出すことができた。

[0159] そのひとつは、次のプライマー対：

B2387 Bfal F :

5 — tgcctactgccattactatgtgac— 3 ' (酉己列番号 41)

および

B2387 Bfal R:

5 — acatactaccgtaaatggtctctg— 3 (目 G列号 42)

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い、増幅産物を Bfal処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 MS— FRコシヒカリ (Rf-1 Rf - 1) DNAからの増幅産物は Bfalの認識配列（CTAG)をもたず、 Bfal処理により切断されないのに対し、コシヒカリ DNAからの増幅産物は Bfalの認識配列をもち、 Bfal処理により切断されるため、 Bfal処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(13)分離分析

参考例 1で得られた、 Rf— 1座と S12564 Tsp509I座との間での組換え個体 2個体 (RS1および RS2)および Rf— 1座と C1361 Mwol座との間での組換え個体 8個体 (RC1から RC8)について、上記（1)ないし（12)で開発した 12個の DNAマーカ一座の遺伝子型を調査した。結果を、各個体の S12564 Tsp509I座および C136 1 Mwol座の遺伝子型とともに表 1に示した。

[0160] [表 1] 表 1 R 座極近傍組換え個体のマーカ一座遺伝子型

】シヒカリ5!ホモ .

！シヒカリ S!/MS-FRコシヒ力リ ¾ヘテロ表 1は、いずれの個体も P9493 Bsllないし 59066 BsaJIの間については、インディ力型品種由来の Rf— 1染色体領域を有することを示す。この結果から、図 3で示したような染色体構成をもつ組換え型花粉において、花粉の受精能力があること、すなわち、 Rf-1遺伝子が機能してレ、ることが示された。これは、これらの組換え型花粉が共有するインディ力型領域、すなわち、最大限に見積もっても P4497 Mbol座から B56691 Xbal座までの領域（約 65kb)に、 Rf— 1遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることを意味する。

[0161] 参者例 4 XSG16由來の 15. 7kb断片に閣する相補性試験

(1)

(材料および方法）

λファージクローン XSG16 (図 1および 5)を Notlで部分消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 15. 7kbの断片（配列番号 1の塩基 38538— 541 23を含む）を、 QIAEXII (QIAGEN社）を用いて精製した。

[0162] 一方、 pSBl l (Komariら、上述）を基に、ハイグロマイシン而す性遺伝子カセットを持つ中間ベクター PSB200を作成した。具体的には、先ず、ュビキチンプロモーターとュビキチンイントロン（Pubi— ubil)に、ノパリン合成酵素のターミネータ一（Tnos)を接続した。これより得られた Pubi— ubil— Tnos接続体の ubil— Tnos間に、ハイグロマイシン体制遺伝子（HYG (R) )を挿入することにより、 Pubi— ubil— HYG (R) -Tnos からなる接続体を得た。この接続体を、 pSBl lの HindlllZEcoRI断片に接続することにより、 pKY205を得た。この pKY205の Pubi上流に存在する Hindlll部位に N otI、 NspV、 EcoRV、 Kpnl、 Sad, EcoRIの制限酵素部位を追加するためのリンカ一部位を挿入することにより、ノ、イダロマイシン耐性遺伝子カセットを有する PSB200 を得た。

[0163] 上記プラスミドベクター pSB200を Notlで完全消化後、エタノール沈殿により DNA を回収した。回収した DN Aを TE溶液に溶解後、 CIAP (TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 QIAEXII (QIAGE N社)を用いてゲルカゝらベクター断片を精製した。

[0164] 上記により準備した、 XSG16由来の 15. 7kb断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA Ligation Kit Ver. 1 (TAKARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。反応後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを純水（Millipore社製装置により作成）に溶解後、大腸菌 DH5 aと混合し、エレクトロボレーシヨンに供試した。エレクト口ポレーシヨン後の溶液を、 LB培地で振盪培養（37 °C、 1時間）した後、スぺクチノマイシンを含む LBプレートに広げ、加温（37°C、 16時間）した。生じたコロニーからプラスミドを単離した。その制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、組換えプラスミドにより形質転換された所望の大腸菌を選抜した。

[0165] 上記により選抜した大腸菌を、 Agrobacterium tumefaciens菌株 LBA4404Z pSBl (Komari et al, 1996)およびヘルパー大腸菌 HBlOlZ pRK2013 (D itta et al, 1980)とともに供試して、 Ditta et al (1980)の方法に従い、三菌系交雑（triparential mating)を行った。スぺクチノマイシンを含む ABプレートに生じたコロニーのなかの 6個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のァグロバタテリゥムを選抜した。

[0166] 上記により選抜したァグロバタテリゥムを用いて、 Hiei et al (1994)の方法に準拠し、 MSコシヒカリ（BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要な MSコシヒカリの未熟種子は、 MSコシヒカリにコシヒ力リの花粉をかけることにより作成した。

[0167] 形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、 4 8個体の植物を、 1Z5000アールのワグネルポットに移植し（4個体 Zポット）、移植 3 一 4週間後に短日条件の温室に移した。出穂約 1か月後に、種子稔性を立毛調査した。

[0168] (結果および考察）

形質転換植物 47個体のうち、少なくとも 37個体は、明らかに稔性を回復していた（図 6)。このことから、導入した 15. 7kb断片のなかのイネ (IR24)に由来する部分である 15586塩基（配列番号 1の塩基 38538— 54123)力完全長の Rf-1遺伝子を包含していると考えられた。

[0169] (2) XSG16内部の 11. 4kb断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XSG16を AlwNIおよび BsiWIで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DN Aを TE溶液に溶解後、 DNA Blunting Kit (TAKARA社）により平滑ィ匕した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された 11. 4kbの断片を、 QIAEXI QIAGEN社)を用いて精製した。

[0170] プラスミドベクター pSBl l (Komari et al. Plant Journal, 1996)を Smalで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 CIAP (TAKARA社）により脱リン酸ィ匕した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 QIAEXII (QIAGEN社)を用いてゲルカゝらベクター断片を精製した。

[0171] 上記により準備したふたつの断片を供試して、 DNA Ligation Kit Ver. 1 (T AKARA社)を用いてライゲーシヨン反応を行った。反応後、エタノール沈殿により D NAを回収した。回収した DNAを純水（Millipore社製装置により作成）に溶解後、大腸菌 DH5 aと混合し、エレクト口ポレーシヨンに供試した。エレクト口ポレーシヨン後の溶液を、 LB培地で振とう培養（37°C、 1時間）した後、スぺクチノマイシンを含む LB プレートに広げ、加温（37°C、 16時間）した。生じたコロニーのなかの 14個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。

[0172] 上記により選抜した大腸菌を、 Agrobacterium tumefaciens菌株 LBA4404Z pSB4U (高倉ら、特願 2001— 269982 (WO02Z019803 A1) )およびヘルパー大腸菌 HB101Z pRK2013 (Ditta et al, 1980)とともに供試して、 Ditta et al (l 980)の方法に従ヽ、三菌系交雑 (triparential mating)を行った。スぺクチノマイシンを含む ABプレートに生じたコロニーのなかの 12個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のァグロパクテリゥムを選抜した。

[0173] 上記により選抜したァグロバタテリゥムを用いて、 Hiei et al (1994)の方法に準拠し、 MSコシヒカリ（BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要な MSコシヒカリの未熟種子は、 MSコシヒカリにコシヒ力リの花粉をかけることにより作成した。

[0174] 形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、 1 20個体の植物を、 1Z5000アールのワグネルポットに移植し (4個体 Zポット）、移植約 1か月後に短日条件の温室に移した。出穂約 1か月後に、各個体から標準的な穂を 1穂サンプリングし、種子稔性 (総もみ数に対する稔実もみの割合)を調査した。

[0175] (結果および考察）

形質転換植物 120個体のうち、 59個体が 10%以上の種子稔性を示し、そのうち 1 9個体は 70%以上の種子稔性を示した。このことから、導入した 11. 4kb断片（配列番号 1の 42357番目の塩基から 53743番目の塩基まで）力稔性回復の機能を発現するうえで必須の Rf - 1遺伝子領域を包含していると考えられた。

[0176] (3) XSG16内部の 6. 8kb断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XSG16を Hpalおよび AlwNIで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 6. 8kbの断片を、 QIAEXII (QIAGEN社）を用いて精製した。プラスミドベクター pSBl lの調整を含め、以後の過程は上記（2)に記載の方法に準拠した。

[0177] (結果および考察）

形質転換植物 120個体のうち、 67個体が 10%以上の種子稔性を示し、そのうち 2 6個体は 70%以上の種子稔性を示した。このことから、導入した 6. 8kb断片（配列番号 1の 42132番目の塩基力も 48883番目の塩基まで）力稔性回復の機能を発現するうえで必須の Rf— 1遺伝子領域を包含していると考えられた。

[0178] 図 1及び図 5に示したあそみのり由来の他の断片、即ち、 XSE1, XSE7、 XSF4、 XSF4、 XSF18, XSF20, XSG22, XSG8、 XSH18及び XSXUこつ!/ヽても同様【こ相補性実験を行ったが、 V、ずれも稔性回復機能を有しなかった。

[0179] 参考例 5 cDNAライブラリーの作成

先ず、戻し交雑によりコシヒカリに Rf— 1を導入した系統 IL216 (遺伝子型は Rf— 1 ZRf— 1)を作成した。前記 IL216を慣行法で温室栽培し、葉耳間長力— 5— 5cmの生育段階で幼穂をサンプリングした。 SDS—フエノール法 (Watanabe, A. and Price, C. A. (1982) Translation of mRNAs for subunits of chlor oplast coupling factor 1 in spinach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. , 79, 6304— 6308)で全 RNA を抽出した後、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia

Biotech)により poly (A) + RNA を精製した。

[0180] 次いで、精製した poly (A) + RNA を供試して、 ZAP— cDN A Synthesis Kit ( Stratagene)により cDNAライブラリーを作成した。作成したライブラリー（lml)のタイタ一は 16000000pf uZmlと算出され、十分な大きさであると判断された。

[0181] 参者例 6 cDNAライブラリーのスクリーニング

(1)スクリーニング用プライマーの作成

以下の 2種類のプライマー、

センスプライマー

5 — tctcattctctccacgccctgctc— 3 (酉己列番 50 J

アンチセンスプライマー

5 — acggcggagcaattcgtcgaacac— 3 (酉己列号 51)

を用いて、 IR24のゲノミッククローン XSG16をテンプレートに PCRを行った。配列番号 50及び 51は各々、配列番号 1の塩基 43733— 43756及び 44038— 44015に相当する。

[0182] 電気泳動後、約 300bpの増幅産物を QIAEX II Gel Extraction Kit (QIA GEN)によりァガロースゲルから回収した。回収した断片を、 Rediprime II DNA labelling system (Amersham Pharmacia Biotech)を用ヽて³² P—ラベノレした ( 以下、「プローブ P」と呼称する)。

[0183] また、以下の 2種類のプライマー、

センスプライマー

5 -agtgtgtggcatggtgcatttccg-3 (目 il歹 U番号 52)

アンチセンスプライマー

5 — ctctacaggatacacggtgtaagg—5 ' (¾C歹¹』¾·号 53)

を用いて、 IR24のゲノミッククローン XSG16をテンプレートに PCRを行った。配列番号 52及び 53は各々、配列番号 1の塩基 48306— 48329及び 50226— 50203に相当する。電気泳動後、約 1900bpの増幅産物を上述の方法によりァガロースゲルから回収した。回収した断片を、上述の方法で³² P—ラベルした (以下、「プローブ Q」と呼称する)。

[0184] (2) cDNAライブラリーのスクリーニング

参考例 5で作成した cDNAライブラリーを供試して、約 15000プラークが出現した寒天培地を 70枚作成した。各寒天培地について 2回ずつプラークリフトを行い、 Hyb ond-N⁺ (Amersham Pharmacia Biotech)に転写した。一方のメンブレンをプローブ Pとのハイブリダィゼーシヨンに、もう一方のメンブレンをプローブ Qとのハイブリダィゼーシヨンに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。

[0185] ハイブリダィゼーシヨンは、 250mM Na HPO、 ImM EDTAおよび 7% SDS

2 4

を含むハイブリダィゼーシヨン溶液にプローブを添カ卩し、 65°Cで 16時間行った。洗浄は、 1 X SSCおよび 0. 1 % SDSを含む溶液により 65°C、 15分で 2回行った後、 0. 1 X SSCおよび 0. 1% SDSを含む溶液により 65°C、 15分で 2回行った。洗浄後のメンブレンを FUJIX BAS 1000 (Fuji Photo Films)で解析した。

[0186] その結果、プローブ Pおよびプローブ Qのどちらでも陽性を示すプラークが 8個見出された。そこで、それらプラークを単離し、製造者 (Stmtagene)の手引書に従い pBl uescriptにサブクローユングした後、末端塩基配列を調査した。 8個のクローンのうち、 6個のクローンの末端塩基配列が XSG16の配列と一致した。それら 6クローンの全塩基配列を決定し、結果を、配列表の配列番号 43-74に示した。 [0187] 配列番号 43— 74のいずれの配列も、配列番号 49のアミノ酸配列 1 791を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号 43の塩基 215— 258 7、配列番号 44の塩基 213— 2585、配列番号 45の塩基 218— 2590、配列番号 46 の塩基 208 - 2580、配列番号 47の塩基 149— 2521及び配列番号 48の塩基 225 - 2597力いずれも配列番号 49のアミノ酸配列 1—791をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 1の塩基 43907— 46279に対応する。

[0188] 配列番号 49のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子 (Rf 2)の推定アミノ酸配列（Cui et al. , 1996)と比較したところ、 Ν末端の 7アミノ酸残基（Met-Al a— Arg— Arg— Ala— Ala— Ser)がー致した。これら 7アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Liu et al. , 2001)。これらのこと力ら、今回単離した cDNAは Rf - 1遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネ Rf— 1とトウモロコシ Rf 2とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。遺伝子産物がミトコンドリアに移行してからの稔性回復機構は、両者で異なるものと推測される。

[0189] また、今回単離した cDNAの配列を IR24のゲノム配列（配列番号 1)と比較することにより、ェキソンとイントロンの構造が明らかになった（図 7)。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリ A付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。

[0190] 17 ネ目補件験

参考例 4 (3)において、稔性回復能を持つことが証明された IR24由来の 6. 8kbゲノム断片を含むプラスミド中の、 Rf— 1遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2kb断片を用いて、相補性実験を行った。

[0191] 先ず、上記参考例 4 (3)のプラスミドを EcoRIで処理し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。 Rf— 1のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2kb断片（配列番号 1の塩基 42132-46318に相当する）を分離し、 QIAEXII (QIAGEN)を用いてゲルから回収した。この 4. 2kb断片を、 EcoRI処理後 CIAP (TAKARA)処理した pBluescriptll SK (—）とともに供試して、 DNA Ligation Kit Ver. 1 (T AKARA社)を用いてライゲーシヨン反応を行った。反応後、エタノール沈殿により D NAを回収した。

[0192] 回収した DNAを純水（Millipore社製装置により作成）に溶解後、大腸菌 DH5 aと混合し、エレクト口ポレーシヨンに供試した。エレクト口ポレーシヨン後の溶液を、 LB培地で振とう培養（37°C、 1時間）した後、アンピシリンを含む LBプレートに広げ、加温（ 37°C、 16時間）した。生じたコロニーのなかの 12個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。つぎに、選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、 BamHIおよび Sail で処理後、ァガロースゲルによる電気泳動を行い、 Rf— 1のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2kb断片を分離し、 QIAEXII (QIAGEN)を用いてゲルから回収した。

[0193] 一方、 TnosJH0072 (nosターミネータ一およびアンピシリン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）を BamHIおよび Sailで処理後、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。 nosターミネータ一およびアンピシリン耐性遺伝子カセットとを包含する 3. Okb断片を分離し、 QIAEXII (QIAGEN)を用いてゲルから回収した。

[0194] Rf— 1のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2kb断片及び TnosJHO 072由来の断片を、前述の方法でライゲーシヨン反応およびポレーシヨンを行った。アンピシリンを含む LBプレートに広げ、加温（37°C、 16時間）後、生じたコロニーのなかの 12個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。

[0195] さらに、上述のとおり選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、 Sgflで処理後、ァガロースゲルによる電気泳動を行、、 Rf— 1のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2kb断片を分離し、 QIAEXII (QIAGEN)を用いてゲルから回収した。この 4. 2kb断片を、 Pacl処理後 CIAP (TAKARA)処理した pSB200Pac (ノヽィグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）とともに供試して、前述の方法でラィゲーシヨン反応およびポレーシヨンを行った。スぺクチノマイシンを含む LBプレートに広げ、加温（37°C、 16時間）後、生じたコロニーのなかの 16個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。 [0196] 以上の工程により、 Rf— 1のプロモーター領域と Rf— 1の予想翻訳領域を含む断片に nosターミネ-ターが接続されたキメラ遺伝子力中間ベクター内に挿入された大腸菌が得られた。この大腸菌を、 Agrobacterium tumefaciens菌株 LB4404Zp SBl (Komari et al, 1996)およびヘルパー大腸菌 HBlOlZ pRK2013 (Dit ta et al, 1980)とともに供試して、 Ditta et al (1980)の方法に従い triparen tial matingを行った。スぺクチノマイシンを含む ABプレートに生じたコロニーのなかの 6個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のァグロバタテリゥムを選抜した。

[0197] 上記により選抜したァグロバタテリゥムを用いて、 Hiei et al (1994)の方法に準拠し、 MSコシヒカリ（BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要な MSコシヒカリの未熟種子は、 MSコシヒカリにコシヒ力リの花粉をかけることにより作成した。

[0198] 形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、 3 2個体の植物を、 1Z5000アールのワグネルポットに移植し（4個体 Zポット）、移植 3 一 4週間後に短日条件の温室に移した。出穂約 1か月後に、種子稔性を立毛調査した。その結果、 32個体のうち 28個体は、稔性を回復していることがわ力つた。

[0199] 以上の結果から、予想翻訳領域を発現させることにより Rf - 1遺伝子の機能を付与できることが、実験的に証明された。

[0200] 参者例 8 cDNA単離

参考例 6では、プローブ Pおよびプローブ Qにより IR24幼穂由来 cDNAライブラリ一をスクリーニングし、どちらのプローブでも陽性を示すプラークを単離 '解析することにより、 6個の cDNAを単離した。本参考例では、プローブ Pおよび下記のプローブ R により同様のスクリーニングを行うことにより、さらに 6個の cDNAを単離した。詳細は、以下のとおりである。

まず、 2種類のプライマー、

センスプライマー

5 — cagttgggttgaaacctaatactg— 3 (目 C列 ¾·号 60)

アンチセンスプライマー 5， cactaaaccgttagacgagaaagc— 3， (酉己列番号 61)

を用いて、 IR24のゲノミッククローン XSG16をテンプレートに PCRを行った。配列番号 60および 61は各々、配列番号 1の塩基 45522— 45545及び 45955— 45932に相当する。

[0201] 電気泳動後、約 430bpの増幅産物を QIAEX II (QIAGEN)によりァガロースゲルから回収した。回収した断片を、 Rediprime II DNA labelling system (Ame rsham Pharmacia Biotech)を用いて"² P—ラベルした（プローブ R、図 8)。

[0202] IR24幼穂由来 cDNAライブラリーを供試して、約 15000プラークが出現した寒天培地を 20枚作成した。各寒天培地について 2回ずつプラークリフトを行い、 Hybond -N⁺ (Amersham Pharmacia Biotech)に転写した。一方のメンブレンを参考例 6 のプローブ pとのハイブリダィゼーシヨンに、もう一方のメンブレンをプローブ Rとのハイブリダィゼーシヨンに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。その結果、プローブ Pおよびプローブ Rのどちらでも陽性を示すプラークが 12個見出された。

[0203] そこで、それらプラークを単離し、製造者（Stratagene)の手引書に従い pBluescri ptにサブクローユングした後、末端塩基配列を調査した。 12個のクローンのうち、 6個のクローンの末端塩基配列が XSG16の配列と一致したため、それら 6クローンの全塩基配列を決定した（ # 7— # 12)。その結果を配列番号 54— 85に示す。

[0204] 配列番号 54— 85のいずれの配列も、配列番号 49のアミノ酸配列 1 791を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号 54の塩基 229— 260 1、配列番号 55の塩基 175— 2547、配列番号 56の塩基 227— 2599、配列番号 57 の塩基 220— 2592、配列番号 58の塩基 174— 2546及び配列番号 59の塩基 90— 2 462力いずれも配列番号 49のアミノ酸配列 1—791をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 1の塩基 43907— 46279に対応する。

[0205] 今回単離した cDNAの配列を IR24のゲノム配列（配列番号 1)と比較することにより、ェキソンとイントロンの構造が明らかになった（図 8)。今回単離した cDNAのなかには、予想翻訳領域とは関係のないェキソンを含まず、単一ェキソン力もなるものも 3個存在した（# 10-# 12、配列番号 57— 59)。 [0206] 実施例 1 単一コピー導人形皙転椽体の撰抜

(材料および方法）

本発明者らは、参考例 4 (1)において、 IR24のゲノミッククローン XSG16に由来する 15. 6kb断片を MSコシヒカリ（BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一 )に導入することにより、形質転換当代 (T世代)で種子稔性が回復することを見出し

0

た。

[0207] 稔性が回復した形質転換植物 (T世代)のなカゝから 12個体を選び、緑葉から SDS

0

—フエノール法（Komari et al. , 1989)により全 DNAを抽出した。全 DNAを Sacl で消化し、ァガロース電気泳動にかけた後、製造者の手引書に従い Hybond— N+(A mersham Pharmacia Biotech)に転写し、サザン解析に供試した。

[0208] サザン解析のためのプローブは、以下のようにして作成した。まず、 2種類のプライマー、

5 — attgagggttgaacaatgatgggc— J ' (酉己歹幡 62)

(配列番号 1の塩基 49244— 49267に相当）

および

5— ctctacaggatacacggtgtaagg—5 ' (酉己列^ 号 o3)

(配列番号 1の塩基 50226— 50203に相当）

を用いて、上述のゲノミッククローン XSG16をテンプレートに PCRを行った。電気泳動後、約 980bpの増幅産物を QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN)によりァガロースゲルから回収した。回収した断片を、 Rediprime II DNA labellin g system、Amersham Pharmacia Biotech)を用ヽて P—フべノレした。

[0209] ハイブリダィゼーシヨンは、 250mM Na HPO、 ImM EDTAおよび 7%SDSを

2 4

含むハイブリダィゼーシヨン溶液にプローブを添カ卩し、 65°Cで 16時間行った。洗浄は、 1 X SSCおよび 0. 1% SDSを含む溶液により 65°C ' 15分で 2回行った後、 0. 1 X SSCおよび 0. 1%SDSを含む溶液により 65°C ' 15分で 2回行った。洗浄後のメンブレンを FUJIX BAS 1000 (Fuji Photo Films)で解析した。その他の実験手法は、実験手引書（Sambrookら， 2001、上述）を参考にして行った。

[0210] Sacl消化の結果から、単一コピーであることが示された個体の一部については、 E coRV消化後、上述と同様にサザン解析を行った。

[0211] (結果および考察）

12個体についての Sacl消化サザン解析の結果、内生の rf 1遺伝子に対応する約 12kbのバンドに加え、種々のサイズのバンドが観察された。各個体のバンドの数は、その個体の導入コピー数を反映していると考えられるので、約 12kbのバンド以外のバンドが 1本だけ観察された 7個体を、単一コピー導入個体候補とした。

[0212] それら単一コピー導入個体候補のな力から 6個体を選抜し、 EcoRV消化サザン解析を行った。その結果、いずれの個体についても、内生の Rf— 1遺伝子に対応する約 15kbのバンドにカ卩え、 1本のバンドが観察された。以上の結果から、これら 6個体は単一コピー導入個体であることが示された。

[0213] m2 人遣伝早ホモ型個体の撰

(材料および方法）

実施例 1で単一コピー導入個体であることが示された 6個体のなかの 4個体（ 16T0 6、 16T0 - 26、 16T0 - 34、 16T0— 35)の自殖次代を 6個体ずつ栽培し、実施例 1 に記載した方法で全 DNAを抽出し、 EcoRV消化サザン解析を行った。

[0214] (結果および考察）

内生の rf 1遺伝子に対応する約 15kbのバンドと導入遺伝子に対応するバンドの強度を、各系統内で比較することにより、各系統から導入遺伝子ホモ型個体を 1個体ずつ選抜した（16Tl—6、 16T1— 26、 16Τ1—34、 16Τ1—35)。これら 4個体の花粉稔性をヨウ素ヨウ化カリウム染色で調査したところ、いずれも 100%に近いことがわかり、サザン解析の結果から推定した導入遺伝子座の遺伝子型が正しいことが示された。

[0215] 実施例 3 導人遺伝子の染色体部位の同定

(1) 16T0— 6における導入部位の同定

(材料および方法）

実施例 1で用いた 16T0—6の DNAを Pstlで完全消化した後、 LA PCR in vitr o Cloning Kit (TAKARA)を用いて製造者の手引書に従って導入部位の増幅を行った。 1回目の PCRには、特異的プライマーとして Nos Fl :

5，— agattgaatcctgttgccggtcttgcgatg— 3， (酉己列番号 64)

を用いた。 PCR条件は、 94°Cで 2分間処理した後、 94°Cで 1分間の熱変性、 58°Cで 1分間のアニーリング、 72°Cで 2分間の伸長反応力もなるサイクルを 30回繰り返し、最後に 72°Cで 2分間処理した。

[0216] 2回目の PCRは、 1回目の PCR反応溶液の 200倍希釈液 1 μ 1をテンプレートにし、特異的プライマーとして

Nos F2 :

5 — tcatctatgttactagatccgatgataagc— 3 (酉己列番号 65ノ

を用いた。 PCR条件は、 1回目と同様とした。 2回目の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけ、増幅された断片を、 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGE N)によりァガロースゲルから回収し、塩基配列を解析した。

[0217] (結果および考察）

2回目の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけ、約 500bpの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、 Genbank公開データベースに対して BLAST検索 (Altschul et al. , 1990)を行った。その結果、日本晴の第 6染色体のゲノムクローン（ァクセッション番号 ΑΡ004007)の相補鎖配列と一致することがわかった。

[0218] そこで、 ΑΡ004007の相補鎖配列に対して図 9に示す位置に、

No6 F :

5 — acttcaactagcaccctctctcacct— 3 (酉己列^ 号。6)

および

No6 R :

5 -tctgctggttgaacatggtgtgatag-3 (酉己歹 U番 67)

の 2個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例 2 に記載した 16T1— 6 (導入遺伝子ホモ型個体）の全 DNAをテンプレートとして、 PCR を行った。 PCR条件は、 94°Cで 2分間処理した後、 94°Cで 30秒間の熱変性、 58°C で 30秒間のアニーリング、 72°Cで 30秒間の伸長反応からなるサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°Cで 2分間処理した。 PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリ DNAからは期待された大きさ（210bp)の断片が増幅されたことが示された。一方、 16T1— 6からは、期待通り当該産物は増幅されな力つた。

[0219] さらに、 NosF2と No6Rとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび 16T1— 6の全 DNAをテンプレートとして、上記条件で PCRを行った。その結果、 16T1— 6からは期待された大きさ（234bp)の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されな力つた。

[0220] 以上の結果から、 16T0— 6における導入遺伝子挿入部位は、第 6染色体の APOO 4007に対応する部位であることが示された。

[0221] (2) 16T0— 26における導入部位の同定

(材料および方法）

実施例 1で用いた 16T0— 26の DNAを Pstlで完全消化した後、上記（1)に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。ただし、 PCRのバッファーには、 TaKaRa LA Taq (TAKARA)添付の GC Buffer (I)を用いた。

[0222] (結果および考察）

2回目の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけ、約 1700bpの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、 Genbank公開データベースに対して BLAST検索（Altschul et al. , 1990)を行った。その結果、日本晴の第 10 染色体のゲノムクローン（ァクセッション番号 AC026758)の配列と一致することがわかった。

[0223] そこで、 AC026758の配列に対して図 9に示す位置に、

No26 F :

5— ccccccccctctcctct— 3 (目 il列番号 68)

および

No26 R:

5— tcccaccaaagggcattcctctcatc— 3 (酉己列番号 69)

の 2個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例 2 に記載した 16T1— 26 (導入遺伝子ホモ型個体）の全 DNAをテンプレートとして、 PC Rを行った。 PCR条件は、 94°C2分間処理した後、 94°Cで 30秒間の熱変性、 58°C で 30秒間のアニーリング、 72°Cで 30秒間の伸長反応からなるサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°Cで 2分間処理した。 PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリ DNAからは期待された大きさ（246bp)の断片が増幅されたことが示された。一方、 16T1— 26からは、期待通り当該産物は増幅されな力つた。

[0224] さらに、 Nos F2と No26 Rとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび 16T1— 26の全 DNAをテンプレートとして、上記条件で PCRを行った。その結果、 16T1— 2 6からは期待された大きさ（352bp)の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されな力つた。

[0225] 以上の結果から、 16T0-26における導入遺伝子挿入部位は、第 10染色体の AC 026758に対応する部位であることが示された。

[0226] (3) 16T0— 34における導入部位の同定

(材料および方法）

実施例 1で用いた 16T0—34の DNAを BamHIで完全消化した後、上記（1)に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。

(結果および考察）

2回目の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけ、約 1700bpの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、 Genbank公開データベースに対して BLAST検索（Altschul et al. , 1990)を行った。その結果、 2002年 9月 9 日時点では、当該配列を持つクローンは見出されな力つた。

[0227] (4) 16T0— 35における導入部位の同定

(材料および方法）

実施例 1で用いた 16T0— 35の DNAを Pstlで完全消化した後、上記（1)に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。

[0228] (結果および考察）

2回目の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけ、約 500bpの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、 Genbank公開データベースに対して BLAST検索 (Altschul et al. , 1990)を行った。その結果、日本晴の第 7染色体のゲノムクローン（ァクセッション番号 AP004009)の配列と一致することがわかつ 7こ。

[0229] そこで、 AP004009の配列に対して図 9に示す位置に、

No35 F :

5 — ggctagggtttggggaaatgggcg— 3 ' (目 ti歹 U¾>号 70)

および

No35 R:

5 — cgtcatcatcttctcccaaaacagcc— 3 (酉己列番号 71ノ

の 2個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例 2 に記載した 16T1— 35 (導入遺伝子ホモ型個体）の全 DNAをテンプレートとして、 PC Rを行った。 PCR条件は、 94°Cで 2分間処理した後、 94°Cで 30秒間の熱変性、 58 °Cで 30秒間のアニーリング、 72°Cで 30秒間の伸長反応からなるサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°Cで 2分間処理した。 PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリ DNAからは期待された大きさ（235bp)の断片が増幅されたことが示された。一方、 16T1-35からは、期待通り当該産物は増幅されなかった。

[0230] さらに、 Nos F2と No35 Rとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび 16T1— 35の全 DNAをテンプレートとして、上記条件で PCRを行った。その結果、 16T1— 3 5からは期待された大きさ（177bp)の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されな力つた。

[0231] 以上の結果から、 16T0— 35における導入遺伝子挿入部位は、第 7染色体の AP0 04009に対応する部位であることが示された。

[0232] 実施例 4 Rf-1奪穑系統のヨウ素ヨウ化カリウム染色による花粉稔件調杳

(材料および方法）

下記の植物材料を供試した。

[0233] 1) MSコシヒカリ

2)コシヒカリ

3) FRコシヒカリ（連続戻し交雑によりコシヒカリに Rf— 1遺伝子を導入した系統）

4) MSコシヒカリ X FRコシヒカリ 5) 16T1— 6、 16T1— 26、 16T1— 34、 16T1— 35の自殖次代（16T2— 6、 16T2— 26、 16T2— 34、 16T2-35)

6) MSコシヒカリ X 16T1— 6、 MSコシヒカリ X 16T1— 26、 MSコシヒカリ X 16T1— 3 4、 MSコシヒカリ X 16T1-35

7) FRコシヒカリ X 16T1— 6、 FRコシヒカリ X 16T1— 26、 FRコシヒカリ X 16T1— 34 、 FRコシヒカリ X 16T1-35

8) 3座 Rf— 1ヘテロ個体

9) 4座 Rf— 1ヘテロ個体

8)及び 9)の 3座 Rf— 1ヘテロ個体および 4座 Rf— 1ヘテロ個体は、以下のように作出した。 3座 Rf 1ヘテロ個体を作出するために、（FRコシヒカリ X 16T1— 6) X (FR コシヒカリ X 16T1-35)の交配で得られた植物 39個体から DNAを調整し、各個体の Rf - 1座遺伝子型、 16T1 - 6の導入遺伝子座遺伝子型 (第 6染色体）、および、 16 T1-35の導入遺伝子座遺伝子型 (第 7染色体)を、下記のとおり DNAマーカーにより推定した。 Rf— 1座【こつヽて ίま、 Komori et al. , 2002【こ従!ヽ、 S12564 Tsp5 091座および CI 361 Mwol座の遺伝子型から推定した。 16T1—6の導入遺伝子座については、実施例 3に記載した Nos F2および No6 Rを用いた PCRを行い、 234 bpの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。同様に、実施例 3に記載した Nos F2および No35 Rを用いた PCRを行い、 177bpの断片が増幅された場合に、 16T1— 35の導入遺伝子座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの 3個体力 Rf— 1座、 16 T1— 6の導入遺伝子座、および、 16T1— 35の導入遺伝子座すべてについてヘテロであると推定された。

また、 4座 Rf 1ヘテロ個体を作出するために、（16T1— 34 X 16T1— 6) X (FRコシヒカリ X 16T1— 35)の交配で得られた植物 62個体について、 Rf 1座遺伝子型、 16 T1 6の導入遺伝子座遺伝子型、 16T1— 35の導入遺伝子座遺伝子型、および、 1 6T1— 34の導入遺伝子座遺伝子型を推定した。 16T1— 34の導入遺伝子座にっヽては、実施例 3に記載した Nos F2および

No34 R: 5 '— cctttatacctccccacttcttatcc— 3 ' (酉己列番号 72)

を用いて PCRを行った。 PCR条件は、 94°Cで 2分間処理した後、 94°Cで 30秒間の熱変性、 58°Cで 30秒間のアニーリング、 72°Cで 30秒間の伸長反応力もなるサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°Cで 2分間処理した。 PCR反応液をァガロースゲル電気泳動にかけ、 245bpの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの 5個体力 Rf— 1座、 16T1 - 6の導入遺伝子座、 16T1 - 35の導入遺伝子座、および、 16T1 - 34の導入遺伝子座すべてについてヘテロであると推定された。

[0235] 1)ないし 9)の各品種，系統の 2個体から、出穂後の未開花穎花を 1個体あたり 4穎花サンプリングした。各穎花から葯を取り出し、ヨウ素ヨウ化カリウム液中で軽く粉砕した後に顕微鏡観察した。ヨウ素デンプン反応により濃青色を呈する花粉を稔実花粉、それ以外の花粉を不稔花粉とみなした。各穎花について、 200花粉以上を調査した

[0236] (結果および考察）

穎花ごとの花粉稔性を算出し、各品種'系統について 8穎花の花粉稔性の平均値および標準偏差を求めた結果を表 2に示す。

[0237] [表 2] 表 2 ヨウ素ヨウ化カリウム染色による花粉稔性讕査の結果品種 *系統平均花粉稔性（％) 標準偏差

MSコシヒカリ 0,00 0.00

Uシヒカリ 97—24 1.12

コシヒカリ 95.71 1.71

MSコシヒカリ XFRコシヒカリ 50.17 2.38

16T1-6 95.12 2.79

16T1-26 93.66 1.61

16T1-34 94.08 2.06

16T1-35 95,20 1.20

MSコシヒカリ X 16T1-6 51.92 4.03

MSコシヒカリ X 16T1-26 53.27 4.37

MSコシヒカリ X 16T1-34 49.65 2.81

MSコシヒカリ X 16T1-35 51.20 4.19

2座 Rf-1ヘテロ（FRコシヒカリ X 16T1-6) 74.34 3.78

2座 Rf-1ヘテロ（FRコシヒカリ X 16T1-26) 91.71 3.04

2座 Kf-1ヘテロ（1¾コシヒカリ X 16T1-34) 70.41 5. IS

2座 Rf.lへテロ（FRコシヒカリ X 16T1-35) 75.69 472

3座 Rf-1へテ α 86.28 2.01

4座; f-1ヘテロ 92.23 1.73 1) MSコシヒカリ、 2)コシヒカリ、 3) FRコシヒカリ、および、 4) MSコシヒカリ X FRコシヒカリの理論的花粉稔性は、それぞれ、 0%、 100%、 100%、および、 50%であるが、それらの理論値に近い花粉稔性が実際に観察された。

[0238] 5)の 16T2— 6、 16T2— 26、 16T2— 34、および、 16T2— 35は、 FRコシヒカリと同程度の花粉稔性を示し、また、 6)の MSコシヒカリ X 16T1— 6、 MSコシヒカリ X 16T1 —26、 MSコシヒカリ X 16Τ1—34、および、 MSコシヒカリ X 16T1—35は MSコシヒ力リ X FRコシヒカリと同程度の花粉稔性を示した。これらのことから、遺伝子工学的に導入した各 Rf— 1遺伝子が、内生 Rf— 1遺伝子と同様に機能していることが示唆された。

[0239] 7)の FRコシヒカリ X 16T1— 6および FRコシヒカリ X 16T1— 35の花粉稔性は、それぞれ、 74%および 76%であった。 FRコシヒカリが持つ内生 Rf-1遺伝子は第 10染色体に座乗するのに対し、 16T1— 6および 16T1— 35が持つ導入 Rf— 1遺伝子は、実施例 3に記載したとおり、それぞれ、第 6および第 7染色体に座乗する。このため、上記 Fでは、内生 Rf— 1および導入 Rf— 1をともに持つ花粉、内生 Rf— 1のみを持つ花

1

粉、導入 Rf— 1のみを持つ花粉、ならびに、いずれの Rf— 1も持たない花粉力 1 : 1 : 1 : 1の比で分離すると考えられる。これら Fの花粉稔性が概ね 75%であったことから

1

、 Rf-1を 1個以上持つ花粉は、稔性を持つと推察された。

[0240] FRコシヒカリ X 16T1— 34の花粉稔性は 70%であり、内生 Rf— 1および導入 Rf— 1 が独立である場合の期待値 75%に近力つた。 16T1— 34が持つ導入 Rf— 1遺伝子の位置は同定されていないが、本結果から、少なくとも第 10染色体の内生 Rf— 1座と強 V、連鎖関係にな、座位であることが示された。

[0241] FRコシヒカリ X 16T1— 26の花粉稔性は 92%であった。 16T1— 26が持つ導入 Rf — 1遺伝子は、実施例 3に記載したとおり、第 10染色体の AC026758の内部に位置し、 AC026758は RFLPマーカー座 C797に対応する。一方、 FRコシヒカリが持つ内生 Rf— 1遺伝子は、第 10染色体の RFLPマーカー座 S12564と密接連鎖している (Komari et al. , 2002)。 RFLP連鎖地図（Harushima et al. , 1998)によると、 C797と S12564との間の地図距離は約 20cMである。両マーカー間の糸且換え価が約 20%である場合、 FRコシヒカリ X 16T1— 26の理論的花粉稔性は約 90%と計算される。観察された花粉稔性は、この理論値に近いものであった。 [0242] 8)の 3座 Rf— 1ヘテロ個体は、 Rf— 1を第 6、第 7および第 10染色体に持っため、各 Rf— 1は独立に遺伝する。したがって、これらの個体では、 Rf— 1を 3個、 2個、 1個および 0個持つ花粉が、 1 : 3 : 3 : 1の比で分離すると期待される。これらの個体の花粉稔性が概ね 87. 5%であったことから、 Rf— 1を 1個以上持つ花粉は稔性を持つことが示され、 Rf— 1を 3個持つ花粉も正常に発育するものと推察された。

[0243] また、 9)の 4座 Rf— 1ヘテロ個体については、 16T1— 34の導入遺伝子座が同定されていないため、各 Rf— 1が独立に遺伝するカゝ否かは不明である。しかし、各 Rf— 1が独立に遺伝し、かつ、 Rf— 1を 1個以上持つ花粉は稔性を持つ、と仮定したときの理論上の花粉稔性 93. 75%に極めて近い値が観察された。このことから、 Rf— 1を 4個持つ花粉も正常に発育するものと推察された。

[0244] mB Rf - ί暴統の粉芽試,験

(材料および方法）

下記の植物材料を供試した。

[0245] 1)コシヒカリ

2) MSコシヒカリ X FRコシヒカリ

3) FRコシヒカリ X 16T1— 6、 FRコシヒカリ X 16T1— 35

各品種，系統の 2個体から、開花中の穎花を 1個体あたり 4穎花選び、葯をピンセットでつまみ取り、花粉発芽培地上に直接置床した。花粉発芽培地には、既報 (Kariy a, 1989)に従!ヽ、 l⁰/o Agar, 20% Sucrose, 20ppm H BO力らなる寒天培地

3 3

を用いた。 20分以上経過した後、顕微鏡観察し、花粉管の伸長が認められた花粉を稔性花粉とみなした。各穎花について、 200花粉以上を調査した。

[0246] (結果および考察）

穎花ごとの発芽率を算出し、各品種 ·系統について 8穎花の発芽率の平均値および標準偏差を求めた結果を表 3に示す。

[0247] [表 3] 表 3 . 花粉発芽率調査の結果

コシヒカリおよび MSコシヒカリ X FRコシヒカリの発芽率は、それぞれ、 93%および 3 9%であった。 FRコシヒカリ X 16T1— 6および FRコシヒカリ X 16T1— 35の発芽率は、それぞれ、 58%および 66%であり、コシヒカリの発芽率ほど高くはないものの、 MS コシヒカリ X FRコシヒカリの発芽率よりは有意に高力つた。

[0248] ヨウ素ヨウ化カリウム染色による花粉稔性調査の結果と考えあわせると、複数座で Rf —1ヘテロの系統は、通常のハイブリッド（単一座で Rf— 1ヘテロ）と比較して、デンプンを蓄積する花粉の割合、即ち、正常に発育する花粉の割合が増加し、その結果、実際に発芽する花粉の割合も増加するものと考えられる。

[0249] 実施例 6 2座 Rf— 1ホモ稔性回復系統及び 3座 Rf— 1ホモ稔性回復系統の作成

2座 Rf— 1ホモ稔性回復系統は、以下のようにして作成した。 FRコシヒカリ X 16T1 — 6の交雑 Fの 24個体から DNAを調整し、各個体の Rf— 1座および 16T1— 6の導入

2

遺伝子座 (第 6染色体）における遺伝子型を推定した。 Rf— 1座については、 Komori et al. , 2002【こ従!ヽ、 S12564 Tsp509I座および C1361 Mwol座の遺伝子型力も推定した。 16T1— 6の導入遺伝子座については、実施例 3に記載した No6 F および No6 Rを用いた PCRを行い、 210bpの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。マーカー検定の結果、調査したなかなかの 1個体が、 Rf— 1座および 16T1—6の導入遺伝子座の両座において、稔性回復遺伝子ホモであると推定された。

3座 Rf— 1ホモ稔性回復系統は、以下のようにして作成した。実施例 4に記載した通り、（FRコシヒカリ X 16T1-6) X (FRコシヒカリ X 16T1— 35)の交配で得られた植物 3 9個体カゝら DNAを調整し、各個体の Rf - 1座、 16T1 - 6の導入遺伝子座 (第 6染色体）、および、 16T1— 35の導入遺伝子座 (第 7染色体)を、下記のとおり DNAマーカ一【こより推定した。 Rf— 1座【こつヽて ίま、 Komori et al. , 2002【こ従!ヽ、 S12564 Tsp509I座および C1361 Mwol座の遺伝子型から推定した。 16T1—6の導入遺伝子座については、実施例 3に記載した Nos F2および No6 Rを用いた PCRを行い、 234bpの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。同様に、実施例 3に記載した Nos F2および No35 Rを用いた PCRを行い、 177bp の断片が増幅された場合に、 16T1— 35の導入遺伝子座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの 1個体力 Rf-1 座で Rf - 1ホモ、かつ、 16T1—6の導入遺伝子座および 16T1—35の導入遺伝子座の両座においてへテロであると推定された。

[0250] そこで、その個体の自殖次代 24個体から DNAを調整し、各個体の 16T1— 6の導入遺伝子座および 16T1— 35の導入遺伝子座における遺伝子型を推定した。 16T1 6の導入遺伝子座については、上述の通り、 No6 Fおよび No6 Rを用いた PCR を行い、 210bpの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。 16T1— 35の導入遺伝子座については、実施例 3に記載した No3 5 Fおよび No35 Rを用いた PCRを行い、 235bpの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。マーカー検定の結果、調査したなかなかの 2個体力 16T1—6の導入遺伝子座および 16T1—35の導入遺伝子座の両座において、稔性回復遺伝子ホモであると推定された。これらの個体は、 Rf— 1 座で Rf— 1ホモであるので、合計 3座で Rf— 1ホモである。

[0251] 実施例 7 耐冷性検定

(材料および方法）

コシヒカリ、 MSコシヒカリ X FRコシヒカリの F、及び、 !^コシヒカリ 16丁1—35 (実施例 4に記載)の Fを供試した。慣行法により移植期まで育成させた後、各品種'系

1

統にっき 4個体を、 1Z5000アールのワグネルポットに移植した（1個体、 1ポット）。移植後は、明条件 (24°C) 12時間、暗条件（19°C) 12時間に設定した人工気象器内で栽培した。登熟後に各個体から 10穂をサンプリングし、各穂について種子稔性 (全穎果中の稔実穎果の割合)を求め、 10穂の種子稔性の平均をその個体の種子稔性とした。

[0252] (結果および考察） 4個体の平均種子稔性は、コシヒカリで約 95%であったのに対し、 MSコシヒカリ X FRコシヒカリの Fでは約 57%であった。コシヒカリと比較して MSコシヒカリ X FRコシヒカリの Fの種子稳性が低力たことから、今回用いた低温条件により、耐冷性の品種，系統間比較が可能であると考えられたまた、 FRコシヒカリ X 16T1— 35の Fの 4 個体の平均種子稔性は約 76%であり、コシヒカリほど高くはないものの、 MSコシヒ力リ X FRコシヒカリの Fよりは高かった。母比率の差の検定を行ったところ、 MSコシヒ

1

カリ X FRコシヒカリの F l^OS穎果のなかの 3276穎果が稔実）と FRコシヒカリ X 16 T1— 35の F (5900穎果のなかの 4587穎果が稔実）との間の種子稔性の差は、 1%

1

水準で有意であることが示された。本結果は、複数座で Rf— 1遺伝子をへテロで保有するハイブリッドは、従来のハイブリッドと比較して、低温条件においても高い種子稔性を維持することを意味する。以上のことから、複数座で Rf— 1遺伝子をホモで保有する稔性回復系統を用いることにより、ハイブリッド品種の耐冷性を向上させることができると考えられる。

Claims

請求の範囲

[1] 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2力所又はそれより多くの遺伝子座に有するハイブリッド植物。

[2] 2コピーな、し 4コピー稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にな！ヽ 2力所なヽし 4力所の遺伝子座に有する、請求項 1に記載のハイブリッド植物。

[3] 複数の稔性回復遺伝子が異なる染色体上に座乗する、請求項 1又は 2に記載のハイブリツド植物。

[4] 稔性回復遺伝子が配偶体型稔性回復遺伝子である、請求項 1な！ヽし 3のヽずれか

1項に記載のハイブリッド植物。

[5] ハイブリッド植物がイネであり、稔性回復遺伝子力イネの BT型雄性不稔性回復遺伝子である、請求項 1な、し 4の、ずれ力 1項に記載のハイブリッド植物。

[6] イネの BT型雄性不稔性回復遺伝子が、配列番号 49のアミノ酸配列、又は配列番号 49のアミノ酸配列と少なくとも 70%同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸である、請求項 5に記載のハイブリッド植物。

[7] 稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、 2コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない 2箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む、請求項 1な、し 6に記載のハイブリッド植物の作成方法。

[8] 1) 稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入することによって、 2座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を作成し、

2) 工程 1)で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統と植物と交配することを含む、請求項 7に記載の作成方法。

[9] 2座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物。

[10] 稔性回復遺伝子を 1コピーのみ有する稔性回復遺伝子 1座へテロ個体よりも、低温条件下で高、種子稔性を有する、請求項 1な!、し 6に記載のハイブリッド植物。