WO2004108929A1

WO2004108929A1 - 高親和性IgE受容体β鎖発現調節

Info

Publication number: WO2004108929A1
Application number: PCT/JP2003/007086
Authority: WO
Inventors: Chisei Ra; Kyoko Takahashi
Original assignee: NIHON UNIVERSITY SCHOOL JURIDICAL PERSON
Current assignee: NIHON UNIVERSITY SCHOOL JURIDICAL PERSON
Priority date: 2003-06-04
Filing date: 2003-06-04
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2005-12-04
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Abstract

　本発明は、ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）β鎖遺伝子の転写を調節する、配列番号１で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１で記載される塩基配列を含むFcεRIβ鎖遺伝子の転写調節領域と、MZF-1との結合を促進する工程を含む、FcεRIＩβ鎖遺伝子の転写調節方法を提供する。また、本発明は、配列番号１で記載される塩基配列を含むFcεRIβ鎖遺伝子の転写調節領域と、MZF-1との結合を促進する工程を含む、FcεRIβ鎖遺伝子の転写調節方法を利用するスクリーニング方法及びそのキットを提供され、新しいアレルギー疾患の予防・治療剤の開発が可能となる。

Description

明細書高親和性 IgE受容体 β鎮発現調節技術分野

本発明は、高親和性 IgE受容体; 8鎖発現調節に係り、より詳細には、高親和性 IgE受容体鎖遺伝子転写抑制及びその利用関する。背景技術

近年、花粉症、ァトピー性皮膚炎及びァトピー性喘息等のアレルギー症状を持つ人が増加しており、社会的に問題となっている。これらのァレルギ一は、 IgEによって媒介される I型アレルギーに分類される。肥満細胞や好塩基球の細胞膜上に発現する高親和性 IgE受容体（以下「Fc _E RI」という。）は I型アレルギー反応において、鍵を握る糖蛋白質であることが知られている。 Fc ε RIに結合した抗原特異的 IgEが、対応する多価抗原（たとえば、杉花粉症の患者では杉花粉抗原、ダニァレルギー患者ではダニ抗原）によって架橋されると、 FC E RIは凝集し、シグナル伝達機構が作動し、肥満細胞が初めて活性化される。その結果、ァレルギ一性炎症を惹起する種々の化学伝達物質、すなわち予め細胞内顆粒に蓄えられているヒスタミンの放出をはじめとして、細胞内代謝産物であるロイコトリェン、プロスタグランジンなどの新たな合成と放出が爆発的に誘導され、 I型アレルギー反応が惹起される。

さらに、肥満細胞上の Fc 8 RIの凝集により、肥満細胞からのサイトカィンの分泌が促進され、近接する血管内皮細胞に種々の接着分子の発現を誘導する。血液中の好酸球並びにリンパ球がこれらの接着分子を介して炎症局所の血管内皮細胞に結合し、集積する。結果として、遅発性喘息反応が惹起される。さらにまた、皮膚のランゲルハンス細胞に発現する Fc _ε RIは、抗原提示、サイトカイン産出などにより、アトピー性皮膚炎の病態形成に寄与していると推定されている。

これらのことから、 I型ァレルギ一を特異的に支配する Fc E RIを標的にして、この受容体からのシグナル伝達をその根幹で遮断することは、ァレルギ一予防■治療剤の開発に有望な戦略である。

一方、ヒトにおいては、ヒト Fc ε RI力ひ鎖、 j3鎖、および 2つの γ 鎖からなる四量体、あるいは α鎖と 2つの γ鎖からなる三量体として、細胞表面上に発現して機能している。 α鎖は、その細胞外領域で直接 IgE と結合し、一方、鎖 · γ鎖は細胞内へのシグナル伝達に関与する。これらのサブュニットのうち、鎮は γ鎖を介したシグナルを増幅する重要な役目を果たしているのみならず（たとえば、非特許文献 1及び 2参照）、最近では α鎖の成熟化を促進することにより細胞上の Fc ε RIの発現を促進することも報告されている（たとえば、非特許文献 3参照）。これは、鎖の発現を抑制することにより、細胞表面上の受容体の発現も減少し、さらに受容体 1個あたりが伝達する細胞内シグナルの強さも低減されることを意味する。そして、この /3鎖発現抑制は、非常に効果的にアレルギー反応を抑制することができると推測される。

Fc a RI鎖の発現を抑制するにあたって、 ]3鎖遺伝子の転写を特異的に抑制することは有用な方法である。

ところで、ヒト Fc ε RI /3鎖遺伝子に関しては、すでに、そのゲノム構造及び塩基配列が明らかになつている（たとえば、非特許文献 4参照）。このうち、プロモーター領域を含む、開始コドンの上流域についてのみ既に解析が行われており、 Oct- 1 の結合モチーフを含む領域がプロモーター活性に必須であることが報告されている（非特許文献 5参照）。

しかしながら、その他の遺伝子領域については具体的に転写調節領域を特定した例は皆無であり、イントロンや 3 ' 側の非翻訳領域に転写調節領域が存在する例も多いことから、未解析の遺伝子領域中に Fc _ε RI/3 鎖遺伝子の転写を調節する領域が存在する可能性もある。

[非特許文献 1]

S. Lin et al. , Cell 85, 985-995 (1996)

[非特許文献 2]

D. Domobro icz et al. , Immunity 8， 517-529 (1998)

[非特許文献 3]

E. Donnadieu et al. , Immunity 2, 515-523 (2000)

[非特許文献 4]

H. Kuster et al.， J. Biol. Chem. 267， 12782-12787 (1992)

[非特許文献 5]

Y. Akizawa et al.， Int. Immunol. 15， 549-556 (2003) 発明の開示

そこで、本発明は、ヒト F_{C £} RI 3鎖遺伝子の転写調節に関与する領域を未解析の領域中から特定し、さらにその領域に結合する転写因子を特定することを目的とする。そして、ヒト Fee RIjS鎖遺伝子の転写調節に関与する領域と当該領域に結合する転写因子に基づく知見から本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、（ 1) ヒト高親和性 IgE受容体（FC E RI) ]3鎖遺伝子の転写を調節する、配列番号 1で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド；（2 ) 前記ポリヌクレオチドが DNAである、前記（1 ) 記載のポリヌクレオチド；（3) 配列番号 1で記載される塩基配列を含む Fc ε Ιίΐ 鎖遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1 との結合を促進する工程を含む、 F_{C £} RIj3鎖遺伝子の転写調節方法；（4) 配列番号 1で記載される塩基配列を含む Fc _E RI 鎖遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1 を含む転写抑制複合体との結合を促進する工程を含む、 Fc _£ RI 鎖遺伝子の転写調節方法；（5) 配列番号 1で記載される塩基配列を含む Fc ε RIj3鎖遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1 との結合を促進する化合物又はその塩のスクリーニング方法；（6) 配列番号 1で記載される塩基配列を含む FC E RI j3鎖遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1 を含む転写抑制複合体との結合を促進する化合物又はその塩のスクリ一ユング方法；（7) 配列番号 1で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチドを用いる、 Fc_£ RI ]3鎮遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；（8) 前記（5) 又は（6) 記載のスクリーニング方法、又は前記（7) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、 FC E RIj3鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩；（9) 前記（8) 記載の化合物又はその塩を含有してなる医薬； ( 1 0) 前記医薬がアレルギー疾患の予防 ·治療剤である、前記（9) 記載の医薬；（1 1) 哺乳動物に対して、前記（8) 記載の化合物又はその塩を有効量投与する工程を含む、ァレルギ一疾患の予防 ·治療方法；

( 1 2) アレルギー疾患の予防 ·治療剤を製造するための、前記（8) 記載の化合物又はその塩の使用；を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明におけるレポーターァッセィによるヒト Fc _f RI /3鎖遺伝子 nt4180 - nt4260領域の転写調節活性の測定結果を示す図である。図 2は、本発明における部位特異的変異の導入による nt4180 - nt4260 領域中の転写調節エレメントの詳細なマッビングを示す。

図 3は、本発明におけるゲルシフトアツセィによる結合因子の同定を示す。（A) 非標識二本鎖オリゴ DNAを用いた競合試験（添加した非標識二本鎖 DNAは、レーン 3— 5 ；プローブと同じ配列、レーン 6 _ 8 ；プローブの配列中の 3塩基置換、レーン 9一 1 1 ；非特異的配列） ( B )組換え MZF- 1を用いた試験（レーン 1 ；無添加、レーン 2； GST、レーン 3 ； GST-MZF- 1) 。

図 4は、本発明における MZF- 1アンチセンス導入による、ヒト Fc _ε RI j3鎮遺伝子プロモーター活性の増大を示す。

図 5は、本発明における MZF- 1アンチセンス導入による、ヒト Fc ε RI 鎮発現量の増加を示す。発明を実施するための最良の形態

次に、本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。

本発明に係るヒト高親和性 IgE受容体（Fc ε RI) j3鎖遺伝子の転写を調節する領域を含む DNAは、次に示す方法で取得した。

まず、レポーター遺伝子を用いたアツセィにより、ヒト Fc _£ RI j3鎖遺伝子のうち、第 4ェクソンと第 5ェクソンとの間に存在する第 4イント口ンの一部に相当する領域が、 Fc ε RI ]3鎮遺伝子の転写を抑制することを見出した。また、部位特異的変異法を用いて、第 4イントロン中の MZF-1 結合モチーフと相同性を持つ、配列番号 1で記載される配列が実際に転写抑制に関与することを明らかにした。次いで、転写調節領域である配列番号 1で記載される配列に結合する転写調節因子の同定を行つた。 Fc £ RI発現細胞より調製した核抽出物蛋白質を用いたゲルシフトァッセィにより、この配列に実際に MZF - 1が結合することが判明した。さらにまた、 MZF- 1 のアンチセンス発現ベクターを、 Fc _£ RI |3鎖発現細胞に導入することにより、 Fc _ε RI /3鎖遺伝子のプロモーター活性が増大し、 Fc _£ RI 0鎖の raRNA 量が増大したことから、転写調節因子である MZF- 1 力 S、実際に Fc ε RI 13鎖遺伝子の転写を抑制することが確認された。

このようにして、 Fc _f RI j3鎖遺伝子の転写調節に関与する DNA領域並びにその領域に結合する転写調節因子が決定されたことにより、 FC E RI i3鎖発現を阻害する化合物又はその塩のスクリ一ユング方法及びスクリ一ユング用キットを構築することが可能となり、ひいてはアレルギー疾患の治療 ·予防剤の開発に資するものとなる。たとえば、同定した転写調節因子 MZF-1 と特定した遺伝子領域の結合を促進する物質を探索するといった方策により、鎖発現を阻害する化合物又はその塩を開発することが可能となる。

転写調節因子 MZF- 1は、細胞の種類や遺伝子のプロモーター構造によつて転写活性又は転写抑制にも機能することが報告されており、転写活性化及ぴ抑制性補因子の存在が示唆されている（R. Hromas, et al. , Cuur. Top. Microbiolo. Immunol. , 211 , 159-164 ( 1996) ) 。した力 Sつて、 MZF-1 がさらに他の補因子と結合することにより転写抑制に寄与している可能性もあり、その相互作用を促進するような物質を探索する方策により、 |3鎖発現を阻害する化合物又はその塩を開発することも可能となる。たとえば、後述する本発明の実施例 1中の；3鎖遺伝子の nt4180 - nt4260 領域を挿入したレポータープラスミドを適当な Fc ε RI i3鎖発現細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性の低下を指標として、天然物や合成化合物から、 Fc ε RI ]3鎖転写抑制のスクリーニング方法を提供できる。また、 MZF-1 の転写活性化補因子との結合領域に相当するぺプチドあるいは MZF-1の転写活性化捕因子のアンチセンス DNAを利用して、 MZF- 1を含む転写抑制複合体と配列番号 1で記載される配列を含む領域の結合を促進する化合物又はその塩を探索することも可能となる。ここで、化合物の塩とは生理学的に許容される酸（たとえば、無機酸、有機酸など）や、生理学的に許容される塩基（たとえば、アルカリ金属など）などとの塩である。とりわけ好ましいのは、生理学的に許容される酸付加塩である。かかる塩の具体例としては、無機酸として、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸との塩が挙げられ、あるいは有機酸として、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などとの塩が挙げられる。

本発明に係るスクリ一二ング方法及びスクリ一ユング用キットを用いて得られる、 Fc ε RI ]3鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩は、アレルギー疾患の予防 '治療剤として有用である。とりわけ、前記化合物又はその塩を含有する医薬は、その利用価値が高い。

本発明により得られる化合物又はその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤な.どの注射剤の形で非経口的に使用できる。たとえば、本発明により得られる化合物又はその塩を、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これらの製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、たとえば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチエリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液体担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油などのような天然産出植物油などを溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することできる。注射用水の水性液としては、たとえば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（たとえば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえば、エタノールなど）、ポリアルコール（たとえば、プロピレンダリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（たとえば、ポリソルベート 8 0 (登録商標）、 H C O— 5 0など）などと併用してもよい。溶解補助剤として、たとえば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解捕助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（たとえば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（たとえば、塩酸ベンザルコ- ゥム、塩酸プロ力インなど）、安定化剤（たとえば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（たとえば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

このようにして得られえた製剤は、安全で低毒性であるので、たとえば、哺乳動物や温血動物（たとえばヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ）に対して投与することができる。本発明により得られる化合物又はその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、たとえば、花粉症治療の目的で本発明により得られる化合物又はその塩を経口投与する場合、一般的に成人（6 0 K g )において、 1 曰につき、該化合物又はその塩を 0 . l m g〜 l . O g、好ましくは約 1. 0 m g〜 5 0 m g投与する。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明をこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1 ヒト Fc ε RI ]3鎖遺伝子 nt4l80 - nt4260領域の転写調節活性の測定

ヒトゲノミックライブラリー（Stratagene社）よりプラークハイプリダイゼーシヨン法を用いて、 Fc _£ RI /3鎖遺伝子断片を取得した。制限酵素切断及び PCRを利用して得た、第 4イントロンの一部を含む遺伝子断片 nt4180 - nt4260をヒト Fc ε RI ]3鎖プロモーター下流にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼをコ一ドする発現プラスミドに揷入した。

500 Ai l の培地（20%FCS添加 RPMI (Invitrogen社））に懸濁したヒトの Fc ε RIj3鎖発現肥満細胞株 KU812 (1X10⁷個）に、上記レポーターブラスミド 5/i g、及び対照として CMVプロモーター支配下にシーパンジールシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド pRL-CMV (東洋インク社） 0.1/z gを添加し、 Gene Pulser II (Bio- Rad社）を用いて、エレクトロポレーシヨン（300V、 950AiF)を行った。 lwell あたり 2ml の培地を添加した 12well プレートに半量ずつを移し、 37°C、 5% C0₂条件下で、 24時間培養した。細胞を回収し、細胞溶解液を添加後、 Luminomete Berthold 社）を使用してホタルルシフェラーゼ活性及ぴシーパンジールシフェラーゼ活性の測定を行った。細胞溶解液及ぴ基質は、 Dual luciferase assay kit (Promega社）に含まれるものを用いた。各サンプルについて、ホタルルシフェラーゼ活性/シーパンジールシフェラーゼ活性の値を算出した。

図 1 は、 ]3鎖プロモーターのみのときのホタルルシフェラーゼ活性/ シーパンジールシフェラーゼ活性の値を 1.0 とした、相対活性を示す。その結果、遺伝子断片 nt4180 - nt4260にその揷入向きに関わらず強い転写抑制活性が認められた。実施例 2 部位特異的変異の導入による転写調節エレメントの詳細なマッピング

次に、 β鎖遺伝子領域 nt4180 - nt4260中の転写活性化配列の特定を行った。この領域中の 3 - 5塩基に Quick Change Site -Directed Mutagenesi s Kit (Stratagene 社）を利用し、それぞれ部位特異的変異を導入したレポータープラスミドを用いて、実施例 1に示したのと同様の方法でルシフェラーゼアツセィを行った。

図 2に示したように、 nt 4190 近傍に変異を導入した場合に、転写抑制活性が阻害されることから、 nt 4190 近傍の配列が転写抑制活性に必須であることが明らかとなった。実施例 3 ゲルシフトアツセィによる結合因子の同定

KU812 細胞より、以下のようにして、核タンパク質画分を調製した。 KU812 細胞を回収後、氷冷したリン酸緩衝塩溶液（8g NaCl、 0. 2g KC1、 0. 2g KH₂P0₄、 2. 9g Na₂HP0₄ - 12H₂0/ 1L H₂0) にて洗浄し、同じく氷冷したバッファー A (10mM HEPES pH7. 9, lOmMKCl, 0. ImM EDTA, IraM DTT, IraM PMSF, 1 μ g/ml leupeptin, 1 μ g /ml aprotinin)に懸濁後、氷上で 10 分間静置した。 NP - 40を最終濃度 0. 5 %となるように添加し、さらに、氷上で 15分間静置後、 6000 X gで 1分間遠心した。沈殿画分をバッファー E (20mM HEPES pH7. 9, 400mM KCL, 15mM MgCl₂, 0. 2raM EDTA, ImM DTT, ImM PMSF, ImM DTT, ImM PMSF, 1 μ g /ml leupeptin, 1 μ g /ml aprotinin) に懸濁して、氷上で 1時間放置後、 10000 X gで 10分間遠心した。遠心分離した上清を核タンパク質画分とした。 FITC標識した合成 DNA オリゴ 5， -GTGAGTTGCCCGCTTCTGTCTTTG - 3，及び 5 ' -CAAAGACAGAAGCGGGCAACTCAC-3 ' ( Invitrogen社）を等モル混合し、 95°C 5 分間静置後ゆっくり放冷し、プローブとして使用した。また、プローブと同一の塩基配列を持つもの（self) 、 nt 4190 近傍の 3塩基を置換したもの（ mutant ) 、プローブと無関係の配列を持つもの (non-specific) の 3種類の非標識二本鎖合成ォリゴ DNAをコンぺティターとして用いた。

調製した核抽出物 30 i gと、プローブ 5 pmol、コンペティター各 5 - 125pmol を poly (dl-dC) 400ng、 ImM MgCl₂、 30mM KC1、 ImM DTT、 5%グリセロールを含む lOmM HEPES緩衝液（pH7. 9)中で混合して、室温で 20 分間静置した。その後、 0. 5 X TBE緩衝液（45mM トリス、 45mMホウ酸、 ImM EDTA) を用いた、 4%ポリァクリルァミドゲル電気泳動に供した。 120V にて 2- 3時間泳動後、 Fluorlmager 595 (Amersham Biosc ience社）を使用して、 FITC の蛍光を検出した。その結果を図 3 (A)に示す。プローブ単独のバンドょり移動度の小さい位置にいくつかのシフトしたバンドが観察され（レーン 2) 、このうち白抜きの矢印で示したバンドは、 self コンペティターを添加した場合（レーン 3-5) にコンペティターの濃度依存的に消失し、 non-spec:Lfic コンペティターを添加した場合（レーン 6-8) には影響を受けなかったことから、このバンドがプローブに特異的にタンパク質が結合したことによるものであることが示された。さらに、 mutantコンぺティターを添加した場合（レーン 9- 11) には、競合のかかり方が非常に弱くなつたことから、このタンパク質が nt 4190近傍の配列を認識して結合することが明らかとなつた。

nt 4190近傍の遺伝子領域は転写因子 MZF-1の結合モチーフと相同性を有する塩基配列を含んでいた。そこで、次にこの配列に結合する転写因子の同定を行った。通常、ゲルシフトアツセィにおいて MZF-1に対する抗体を添加してシフトパンドのスーパーシフトあるいは消失が起こるかどうかにより解析するが、 MZF-1 に対する抗体が市販されていないため、大腸菌を用いて glutathione S-transf erase (GST)との融合タンパクとして発現させた組換え MZF-1 を用いて解析を行った（図 3 ( B ) ) 。 GST-MZF-1 融合タンパクをプローブに添加した場合にはシフトしたパンドが観察され、 GST のみを発現させた場合には観察されなかったことから、 MZF- 1が特定した nt 4190近傍の遺伝子領域に結合することが示された。実施例 4 KU812細胞への MZF- 1アンチセンス導入による鎖プロモーター活性の増大

次に、同定された転写因子の細胞内における転写調節能を確認するため、 MZF-1 のアンチセンスを細胞に導入しその因子の発現を抑制した状態で、 Fc ε RI /3鎖プロモーター活性を測定した。まず、以下のようにして、 MZF- 1 アンチセンスを作製した。 Κ562細胞より、 TRIZOL (Invitrogen 社）を用いて total RNAを調製した。調製した total RNA l /i gを錡型とし、ランダムへキサマーをプライマーとして用いて RT反応を行った。その後、ヒト MZF-1 の塩基配列に特異的なプライマー

5 ' -ATGAATGGTCCCCTTGTGTATGCAG-3'

5， -CTACTCGGCGCTGTGGACGCGCTGGT-3 '

を用いて、 94°C 30秒、 65°C30秒、 72°C2分を 30 サイクルのプロトコ一ルで PCRを行った。得られた增幅断片を、 pCR3. 1ベクター（Invitrogen 社）に揷入し、制限酵素の切断パターンから CMVプロモーターに対して逆向きに断片が揷入されたクローンを選択し、シークェンスにより塩基配列を確認した（pCR3. 1-hMZF- 1 anti sense) 。また、コントロールとして使用するために、 pCR3. 1を coRIで切断後、 T4 Ligaseを用いて閉環したプラスミド PCR3. 1- self を作製した。

pCR3. 1-hMZF-l anti sense あるレヽま pCR3. 1— self 5_20 /i g を鎖プロモーターおよび nt4180 - nt4260領域を含むレポータープラスミドとともに実施例 1に記載の条件と同条件のエレクトロポレーシヨンにより KU812細胞に導入し、同様にルシフェラーゼアツセィを行った。レポ一タープラスミドのみの場合のホタルルシフェラーゼ活性/シーパンジールシフェラーゼ活性の値を 1. 0 とした、相対活性を図 4に示した。その結果、 pCR3. 1- hMZF- 1 anti sense の濃度依存的に、ルシフェラーゼ活性、すなわち、ヒト Fc _ε 鎖遺伝子のプロモーター活性が増大した。このことより、実施例 3で同定した MZF-1が、特定した DNA配列に結合することにより、プロモーター活性を抑制することが確認された。実施例 5 KU812細胞への MZF-1アンチセンス導入による /3鎖 mRNA量の増大

pCR3. 1-hMZF-l antisenseあるいは pCR3. 1-self 20 gを実施例 1 と同様にしてエレクトロポレーシヨンにより KU812細胞へ導入した。 5% C0₂ 存在下 37°Cで 12時間培養した後、 DNAが導入された細胞を選択するために G418を最終濃度 0. 4mg/ml となるように添加した。さらに 48時間培養した後細胞を回収し、 TRIZOL (Invitrogen社）を用いて total RNAを調製した。 total RNA各 1 μ gを錄型とした RT-PCRにより、 Fc E RI /3鎖および ]3 - actinの mRNA量の測定を行った。 PCRは RT産物各 Ι μ ΐを鍀型として 94°C30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分のサイクルを ]3鎖は 28- 32回、 j3 -actin は 18- 22回行った。 PCR反応に用いたプライマーは以下のとおりである。 i3鎖 5 ' -ATGGACACAGAAAGTAATAGGAGAG-3 '

5 ' - CTTATAAATCAATGGGAGGAGACATT- 3 :

β -actin 5， -CATCGAGCACGGCATCGTCACCAAC-3 '

5 ' -GTGTTGGCGTACAGGTCTTTGCGGA-3 '

MZF-1のアンチセンスの導入により ]3鎖の mRNA量が増加することが明らかとなつた。また、 j3 -actinのバンドの濃さはほとんど変化しないことから、この転写活性化効果が] 3鎖に特異的であると考えられた。（図 5 (A) )

さらに、 pCR3. 1- hMZF - 1 anti senseあるいは pCR3. 1- se lf lO gを同様にして KU812細胞へ導入し、 G418により DNAが導入された細胞を選択した。回収した細胞より total RNAを調製し、ノーザンブロッテイングにより Fc £ RI ]3鎮および -actinの mRNA量の測定を行った。 total RNA 10 μ gを 2. 2Mホルムアルデヒドを含む 1. 5%ァガロースゲルを用いた電気泳動に供し、 HybondN (+)ナイロンメンブラン (Amersham Bioscience 社）に ¾R写した。 50%ホノレムアミド、 1% bl ocking reagent (Roche Diagnost ics 社）、 0. 1% N-lauroi l salcos ine, 0. 02% SDSを含む 5 X SSC緩衝液中で、 DIG標識した Fc ε RI /3鎖および ]3 - act inに対するプローブとハイプリダィズさせた。ハイブリダィズしたプローブを抗 DIG 抗体と CDP- Star substrate (いずれも Roche Diagnost ics社）を用いて検出した。結果を図 5 (B)に示した。（B)の右側のグラフは j3鎖のバンドの濃さを数値化して β -act inのバンドの濃さで捕正した値である。 MZF- 1 のアンチセンスを導入することにより ]3鎖の mRNA量が約 2. 5倍増加した。

以上の結果より、 MZF- 1 アンチセンスを導入して細胞内の MZF- 1 の発現を抑制することにより、 Fc _£ RI ]3鎖の発現が増大することが示された。産業上の利用'可能性

本発明によれば、ヒト Fc £ RI j3鎖遺伝子の転写抑制に関与する塩基配列が提供され、 /3鎖発現を阻害する化合物又はその塩のスクリ一二ング方法及びそのキットが確立される。そのため、本発明は、新しいアレルギー疾患の予防 ·治療剤の開発を進めることが可能となる。

SEQUENCE LISTING

く 110〉NIH0N UNIVERSITY SCHOLL JURIDICAL PERSON

<120>Expression Modulation of IgE receptor β -Chain

<130>N0468SW01WO

く 160〉1

<210> 1

<211>24

く 212〉DNA

く 213〉Hotno sapi ens

<400> 1

gtgagttgcc cgyttctgtc tttg 24

Claims

請求の範園

1. ヒト高親和性 IgE受容体（Fc _E RI) 鎖遺伝子の転写を調節する、配列番号 1で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、。

2. 前記ポリヌクレオチドが DNAである、請求項 1記載のポリヌクレオチド。

3. 配列番号 1で記載される塩基配列を含む Fc ε RI 3鎖遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1 との結合を促進する工程を含む、 Fc a RIj3鎖遺伝子の転写調節方法。

4. 配列番号 1で記載される塩基配列を含む Fc E 鎖遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1を含む転写抑制複合体との結合を促進する工程を含む、 Fc _ε RI]3鎖遺伝子の転写調節方法。

5. 配列番号 1で記載される塩基配列を含む Fc _E RI |3鎮遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1 との結合を促進する化合物又はその塩のスクリ一二ング方法。

6. 配列番号 1で記載される塩基配列を含む Fc _£ RI /3鎖遺伝子の転写調節領域と、 MZF-1を含む転写抑制複合体との結合を促進する化合物又はその塩のスクリ一二ング方法。

7. 配列番号 1で記載される塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチドを用いる、 Fc ε RIj3鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩のスクリ一ユング用キット。

8. 請求項 5又は 6記載のスクリーニング方法、又は請求項 7記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、 Fc ε RI ]3鎖遺伝子の転写を調節する化合物又はその塩。

9 · 請求項 8記載の化合物又はその塩を含有してなる医薬。 1 0. 前記医薬がアレルギー疾患の予防 ·治療剤である、請求項 9記載の医薬。

1 1. 哺乳動物に対して、請求項 8記載の化合物又はその塩を有効量投与する工程を含む、アレルギー疾患の予防 ·治療方法。

1 2. アレルギー疾患の予防 '治療剤を製造するための、請求項 8記載の化合物又はその塩の使用。