WO2004108920A1

WO2004108920A1 - 抗肥満薬のスクリーニング方法及び肥満モデル動物

Info

Publication number: WO2004108920A1
Application number: PCT/JP2004/007692
Authority: WO
Inventors: Noboru Yamaji; Toshio Suda; Yuichi Oike
Original assignee: Astellas Pharma Inc.; Keio University; Yasunaga, Kunio
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-06-03
Publication date: 2004-12-16
Also published as: EP1593740A1; US20060156423A1; EP1593740A4; CA2518627A1; JPWO2004108920A1

Abstract

　アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）プロモーター、該プロモーターを含むベクター、及び前記プロモーターを含む形質転換体、並びに該形質転換体を使用する、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬のスクリーニング方法を開示する。また、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症のモデル動物として有用な、ＡＧＦノックアウト動物を開示する。更に、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療薬、並びに／又は創薬標的分子の同定に有用な、ＡＧＦトランスジェニック動物を開示する。

Description

明細書

抗肥満薬のスクリーニング方法及び肥満モデル動物

技術分野

[0001] 本発明は、抗肥満薬のスクリーニング方法、及び肥満モデル動物、並びにアンジォポェチン関連増殖因子（Angiopoietin- Related Growth Factor;以下、 AGFと称する）のプロモーターに関する。

^景技術

[0002] 肥満の有害性は広く知られているにもかかわらず、近年肥満が顕著に増加している。肥満つまり脂肪組織の過剰蓄積が多彩な疾患の原因となっていることは周知の事実であり、疾患としての肥満症を治療対象にすることが提唱されている。肥満によつて発症する疾患として、例えば、腰痛、膝関節痛、及び変形性関節症があり、これらの整形外科学的疾患は肥満による体重増加が直接の原因となる。肥満に伴う脂肪の過剰蓄積は、糖尿病、高脂血症、高血圧、又は動脈硬化性疾患の原因となっている。特に内臓脂肪の蓄積がこれらの疾患の発症に関与していることが明らかにされている (非特許文献 1)。

[0003] 基本的な肥満改善方法としては、運動療法と食事療法があるが、どちらも継続的な実施が困難である。また、運動又は食事療法以外の改善方法としては医薬品の使用があり、現時点では、世界的に見ると、シブトラミンとオルリスタツトが主に使用されている。しかし、それらの効果は弱ぐどちらも副作用の問題がある。日本ではマジンドールのみが認可されているが、適用が高度肥満者に限定されており、投与期間も限定されてレ、る (非特許文献 2)。

[0004] 社会の近代化に伴い、日本のみならず世界的に糖尿病患者は急増している。特に、患者数の多い Π型糖尿病は、肥満や脂肪の過剰蓄積が発症に関与していることが知られている。 II型糖尿病の治療としては、肥満症と同様に運動療法と食事療法があるが、継続的な実施が困難であり、医薬品が使用されている。重度の糖尿病患者ではインスリン療法が行なわれている。しかし、インスリン療法には低血糖の副作用が常にある。経口血糖降下薬として、チアゾリジン系薬剤又はスルホニルゥレア（SU)薬等が多く使用されている。しかしながら、チアゾリジン系薬剤には、肝障害 '浮腫'心不全という副作用があり、 SU薬には肥満を助長する副作用が危惧され、安全で、体重増加を伴わないインスリン抵抗性改善薬が強く求められている（非特許文献 3)。

[0005] 肥満の糖尿病患者の内臓脂肪に多く含まれる肥大化した脂肪細胞からは、インスリン抵抗性を惹起するようなアディポサイト力イン類が産生及び分泌され、近傍の脂肪細胞及び/又は筋細胞に作用して、インスリン抵抗性を引き起こしていると考えられる。このように、脂肪組織は、糖尿病病態では脂肪細胞が肥大化し、インスリン抵抗性を増強する方向に関わる組織へと変化する (非特許文献 4及び 5)。

[0006] 肥満や糖尿病の原因となる脂肪組織の蓄積に関与する因子としてはレブチンがよく知られている。レプチンは、体重増加抑制ホルモンであり、レプチンを欠失することで食欲が亢進し、エネルギー消費が減少して肥満となることが知られている。このような脂肪組織の蓄積、及び脂肪細胞の肥大化に関与する因子の発見は、肥満症、糖尿病、又は高脂血症等の疾患の治療薬開発に非常に有用である (非特許文献 6)。

[0007] 肥満症又は糖尿病の創薬標的分子を同定したり、治療薬を開発するためには、病態に関与する遺伝子の、遺伝子改変マウスの作製とその表現型解析が重要である。レプチン欠損マウスである ob/obマウスは、肥満とインスリン抵抗性が生じ、高インスリン血症と軽度の血糖値上昇を示す。レプチン受容体欠損マウスである db/dbマウスは、肥満、高インスリン血症、高レプチン血症、及びインスリン血症を生じ重篤な糖尿病状態となる。これらのマウスは何れもレプチン作用不全によって摂食亢進、及び末梢でのエネルギー消費低下が起こり、肥満となり糖尿病を発症した (非特許文献 7 )。肥満 II型糖尿病モデルマウスとして、 KKA^yマウスが汎用されている。 KKA^yマウスはインスリン感受性の低下と肥満を伴い、高血糖を発症するため、糖尿病治療薬の開発研究に利用されている。しかし、 KKA^yマウスのこれらの表現型の原因となっている遺伝子は同定されていない（非特許文献 8)。肥満や糖尿病には多くの未知の遺伝子が関与していると考えられている（非特許文献 9)。従って、疾患関連遺伝子を見つけ、遺伝子改変マウスを作製して表現型解析することが、肥満症又は糖尿病の医薬品開発、更に、病態解明のために切望されていた。

[0008] アンジォポェチン関連増殖因子（AGF)は、 N末端側にコイルドコイル（Coiled-coil )ドメインを、 C末端側にフイブリノ一ゲン様（Fibrinogen-like)ドメインを持つ分泌タンパク質である。 AGFは特許文献 1で報告された NL8と同一であり、 NL8を CHO細胞に安定発現させて、ヌードマウスに皮下移植すると、 CHOが腫瘍形成能を持つようになることが報告されている。また、 AGFと同一又は類似の配列が、特許文献 2 16 に記載されている。これらの文献には、発現分布（特許文献 4及び特許文献 5)、血管内皮増殖因子 (VEGF)刺激による増殖阻害活性 (特許文献 5)、又は増殖因子処理したヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)における過剰発現の検出（特許文献 6及び特許文献 7)が示されており、血管組織等での発現、腫瘍形成能、及び Z又はファミリ一分子との相同性から、 AGFと同一又は類似のアミノ酸配列からなるポリペプチドが血管新生に関与すると記載されている。

非特許文献 10には、 K14プロモーターを用いて表皮細胞に AGFを強制発現させたトランスジエニックマウスでは過剰な血管新生が起こっており、皮膚の微細血管が増カロ、ケラチノサイトの増殖が活性化されたことが示されている。非特許文献 11には、 AGFは表皮細胞の増殖活性があることが記載されている。

[0009] AGFレセプターは同定されていないことから、内在性の AGFが作用する組織が不明であり、前記以外の AGFの生理機能に関しては何ら知見がなかった。 AGFの抗肥満、抗糖尿病、又は抗高脂血症の作用に関しても、全く知られてなかった。一方、 AGFプロモーター領域に関する報告はこれまでにな力た。

[0010] 非特許文献 1 :「メタボリズム（Metabolism)」，（米国)， 1987年， 36卷， p.54-59

非特許文献 2 :「日本臨床」， 2003年， 61卷，増刊号 6,肥満症， p.649-654 非特許文献 3 :「日本臨床」， 2002年， 60卷，増刊号 9,新時代の糖尿病学 3, p.310 -331

非特許文献 4 :「医学のあゆみ」， 2000年， 192卷， p.513-518

非特許文献 5 :「医学のあゆみ」， 2000年， 192卷， p.541-545

非特許文献 6 :「トレンズ'イン'モレキュラ^ ~ ·メディスン（Trends inMolecular Medicine

)」，（オランダ）， 2002年， 8卷， 9号， p. 442-447

非特許文献 7 :ケージーェムェム'アルベルティ、ポール'ズィミット、及びアールエー' デフロンゾ（K. G. M. M. Alberti, Paul Zimmet, and R. A. DeFronzo)編，シージエー 'ベイリー（C.J. Bailey)著，「インターナショナル'テキストブック 'ォブ 'ダイアビーティーズ'メリタス（INTERNATIONAL TEXTBOOK OFDIABETES MELLITUS) J ,第 2版 , (米国），ジョン'ワイリ^ ~ ·アンド'ソンズ 'インク（John Wiley & Sons, Inc.) , 1997年， p. 23. 1-23. 25

非特許文献 8 :「日本臨床」， 2002年， 60卷，増刊号 18, p38 - 44

非特許文献 9 :「最新医学」， 2002年， 57卷， 3月増刊号， p536-544

非特許文献 10 :「サーキュレーション（Circulation)」，（米国）， 2002年 11月 5日， 10

6卷， 19号， p. 11-276-277

非特許文献 11 :血管新生 *抑制因子 2種 -癌増殖 ·転移防止，「日刊工業新聞」， 20 02月 10月 2曰， p. 5

特許文献 1 :国際公開第 99/15653号パンフレット

特許文献 2：特開 2000 - 300263号公報

特許文献 3 :特表 2001 - 517437号公報

特許文献 4 :国際公開第 00/32221号パンフレット

特許文献 5：国際公開第 00/53753号パンフレット

特許文献 6 :国際公開第 02/00690号パンフレット

特許文献 7：国際公開第 02/08284号パンフレット

特許文献 8：米国特許出願公開第 2003/0105011号明細書

特許文献 9 :米国特許出願公開第 2003/0105012号明細書

特許文献 10 :米国特許出願公開第 2003/0105013号明細書

特許文献 11 :米国特許第 5972338号明細書

特許文献 12：米国特許第 6057435号明細書

特許文献 13：米国特許第 6350450号明細書

特許文献 14 :米国特許第 6413770号明細書

特許文献 15：米国特許第 6368853号明細書

特許文献 16 :米国特許第 6420542号明細書

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0011] 本発明の課題は、抗肥満薬のスクリーニング方法及び肥満モデル動物を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明者らは鋭意検討した結果、 AGFノックアウト (K〇）マウス及び AGFトランスジヱニック (Tg)マウスの解析から、 AGFを亢進する物質は抗肥満、抗糖尿、及び Z又は抗高脂血症の作用を有することを明らかにした。すなわち、 AGFノックアウトマウスが顕著な肥満を示すことを見出し、前記マウスが肥満モデル動物になることを見出した（実施例 4)。 AGFノックアウトマウスは脂肪組織の重量が増加しており（実施例 5)、脂肪細胞が肥大化（実施例 6)、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量が増加することを見出した（実施例 7)。一方、 AGFトランスジエニックマウス (AGFを強制発現したマウス）は体重増加が抑制されており（実施例 4)、脂肪組織の重量増加が抑制され（実施例 5)、脂肪細胞の肥大化は抑制（実施例 6)、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量は減少（実施例 7)することを見出した。更に、 AGFノックアウトマウスは糖負荷試験により糖尿病症状を示した（実施例 8)。これらの知見から、 AGFを亢進する物質は抗肥満、抗糖尿、及び/又は抗高脂血症の作用を有することを明らかにした。

[0013] 更に、本発明者らは、様々な長さのヒト AGF遺伝子上流配列を取得し試行錯誤した結果、約 400bp—約 3kbpの配列ではプロモーター活性を示さなかったにも力力、わらず、予想外に約 300bpという短い配列のみがプロモーター活性を有することを見出した。また、前記プロモーター活性を有する DNAを利用した AGFの発現を亢進する物質をスクリーニングする方法を構築した。前記知見から AGFの発現を亢進する物質をスクリーニングする方法が抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び Z又は抗高脂血症薬をスクリーニングする方法として利用することができることを見出した。

これらの知見により、 AGFノックアウトマウス、 AGFトランスジエニックマウス、 AGF プロモーター、及び AGF亢進物質をスクリーニングする方法を提供し、本発明を完成させた。

[0014] すなわち、本発明は、

[1] (a)配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列において、 1一 10個の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列からなり、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA 、又は

(b)配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列との相同性が 90%以上である塩基配列からなり、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、

[2]配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列力なる DNA、

[3] [1]又は [2]に記載の DNAを含み、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、組換えベクター、

[4] [1]又は [2]に記載の DNAを含み、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、形質転換体、

[5]i) [4]に記載の形質転換体に試験物質を接触させる工程、及び

ii)アンジォポェチン関連増殖因子プロモーター活性を測定し、試験物質依存的な前記活性の変化を分析する工程

を含むことを特徴とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングする方法、

[6] [4]に記載の形質転換体が、 [1]又は [2]に記載の DNAの下流にレポーター遺伝子を保持し、アンジォポェチン関連増殖因子プロモーター活性を測定する工程がレポーター遺伝子の発現を分析する工程である、 [5]に記載のスクリーニングする方法、

[7]アンジォポェチン関連増殖因子をコードするポリヌクレオチドの遺伝子機能が染色体上で欠損していることを特徴とする、非ヒトノックアウト動物、並びに

[8] (a)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、

(b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列

、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列において、 1一 10個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び Z又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、

(c)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列をコードする DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに

(d)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配歹 IJとの相同性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド

力、らなる群力、ら選んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、 CAGプロモータ一と共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物又はその子孫であつて、染色体上に前記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、非ヒトトランスジエニック動物

に関する。

また、 AGFの cDNAの上流に CAGプロモーターを連結させた DNAコンストラクトを ES (Embryonic Stem)細胞に導入する工程、 AGFが導入されたクローンを選択する工程、選択したクローンを胚盤胞へ導入する工程、該操作卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）の子宮へ移植する工程、及び該非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）を飼育し、生まれた仔から AGFをコードする、導入した DNAをゲノム中に有する個体を選択する工程を含む、非ヒトトランスジヱニック動物（好ましくはマウス）の作製方法も本発明に含まれる。

更に、 AGF遺伝子の〇RF (Open Reading Frame)を含むゲノム配列において、その一部を薬剤耐性遺伝子 (例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）と置換した DNAコンストラクトを ES細胞に導入する工程、該細胞を薬剤（例えば、 G418)の存在下で培養し薬剤耐性株を選択する工程、該薬剤耐性株を胚盤胞へ導入する工程、該操作卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）の子宮へ移植する工程、生まれたキメラ動物（好ましくはマウス）を正常動物（好ましくはマウス）と交配させることによりヘテロ接合体動物（好ましくはマウス）を得る工程、及び得られたヘテロ接合体マウス同士を交配させてホモ接合体動物（好ましくはマウス）を得る工程を含む、非ヒトノックアウト動物 (好ましくはマウス）の作製方法も本発明に含まれる。

[0016] 本明細書において、用語「トランスジヱニック動物」は、プロモーター及び遺伝子を染色体に導入して、遺伝子を所望の個所で強制発現させた動物を意味し、用語「ノックアウト動物」は、染色体に遺伝子操作することで特定の遺伝子の発現を欠失させた動物を意味するものとして使用する。

[0017] 本発明のトランスジヱニック動物作製に用いることのできる配列番号 3又は配列番号

5に記載のアミノ酸配列であるヒト又はマウス AGFと同一又は相同性のあるポリぺプチドが、特許文献 1一 16に記載されている。これらの文献中には、血管組織等での発現、腫瘍形成能、及び Z又はファミリー分子との相同性から、配列番号 3又は配列番号 5に記載のアミノ酸配列であるヒト又はマウス AGFと同一又は相同性のあるポリペプチドが血管新生に関与すると記載されている。特許文献 4一 9には、多数列挙された疾患に糖尿病が含まれるが、何ら具体的裏付けはなぐ根拠のない記載である。また、非特許文献 10には、 K14プロモーターを用いて表皮細胞に AGFを強制発現させたトランスジヱニックマウスの機能解析が示され、非特許文献 11には、 AGFは表皮細胞の増殖活性があることが記載されている。 AGFを K14プロモーターを用いて表皮細胞に強制発現させたトランスジヱニックマウス等を用いて、 AGFに、血管新生活性、表皮細胞増殖活性、軟骨細胞増殖活性、創傷治癒促進活性、及び組織再生活性があることが、本願優先日後に公開された国際公開第 03/083114号パンフレット（特許文献 17)及び「プロシデイング ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス'ォブ 'ザ'ュナイテイツド'ステート'ォブ 'アメリカ（Proceedings of the national acaaemy or sciences of the United States

of America)」， (米国）, 2003年， 100卷， p. 9494— 9499 (非特許文献 12)に示されている。しかしながら、 AGFレセプターは同定されていないことから、内在性の AG Fが作用する組織が不明であり、前記以外の AGFの生理機能に関しては何ら知見がなかった。 AGFの抗肥満又は抗高脂血症の作用に関しても、全く知られていなかつた。

[0018] 一方、配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列を含む 129048塩基長の配列が配列データベース Genbankのァクセッション番号 AC020931に収載されている。しかしながら、該配列が AGFプロモーター活性を有するという記載はおろ力 \該配列の活性又は用途は全く記載されていない。

[0019] K14プロモーターを用いて表皮細胞に強制発現させたトランスジヱニックマウスに関する報告はあるが (非特許文献 10、非特許文献 12、及び特許文献 17)、 AGFノックアウト動物及び AGFを全身性に発現するトランスジヱニック動物を作製し、機能解析した報告はこれまでになかった。

[0020] 本発明者らは、 AGFノックアウトマウス及び全身性に AGFを過剰発現する AGFトランスジエニックマウスを初めて作製し、意外にも AGFノックアウトマウスが肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症のモデル動物として有用であること、全身性に AGFを過剰発現する AGFトランスジヱニックマウスが肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療薬並びに創薬標的分子の同定に有用であることを見出した。

[0021] 更に、本発明者らは、 AGFノックアウトマウス及び AGFを全身性に発現するトランスジエニックマウスの解析から、 AGF又は AGFを亢進する物質が抗肥満、抗糖尿、及び/又は抗高脂血症の作用を有することを初めて明らかにした。 AGFプロモーター活性を有する AGF遺伝子上流配列を初めて取得し、該配列を利用した AGFの発現を亢進する物質をスクリーニングする方法を構築した。すなわち、 AGF非ヒトノックァゥト動物、 AGF非ヒトトランスジエニック動物及び AGFプロモーター並びに AGF亢進物質 (すなわち抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は抗高脂血症治療薬)をスクリ一二ングする方法は本発明者らによって初めて提供されたものである。発明の効果

[0022] 本発明の AGFプロモーターによれば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び Z又は抗高脂血症薬のスクリーニング系を提供することができる。

本発明のスクリーニング方法により得られる _AGFの発現を亢進する物質は、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び/又は抗高脂血症薬の有効成分として有用である。

本発明の非ヒト AGFノックアウト動物は、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症のモデル動物として有用である。

本発明の非ヒトトランスジエニック動物は、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療薬、並びに/又は創薬標的分子を同定することに使用することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0023] [1]本発明の DNA、組換えベクター、及び形質転換体

本発明者らは、ヒトゲノムライブラリーを用いて hAGF遺伝子上流の部分配列約 20 Obp、約 300bp、約 400bp、約 600bp、約 800bp、約 lkbp、約 1. 3kbp、及び約 3k bpを得て、それらの塩基配列を決定した（配列番号 1で表される塩基配列における 2 790番ー 3001番、 2705番ー 3001番、 2604番ー 3001番、 2406番ー 3001番、 2 206番ー 3001番、 2021番ー 3001番、 1640番ー 3001番、及び 1番ー 3001番の塩基からなる各配列）。これらの DNA断片を適当なプラスミド、具体的には、レポータ一遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド pGV— B2内にサブクローニングした。これらの融合プラスミドのレポーター遺伝子の発現、すなわち、活性によりノレシフェラーゼの発現を検出することによって、得られた上流 DNA領域がプロモータ一活性を有しているかを確認した。この結果、約 400bp—約 3kbpの長さの DNAはプロモーター活性を有していなかった力予想外にもそれより短い約 300bpの DNA がプロモーター活性を有していることを見出した。更に、約 300bpよりも短い約 200b pの DNAはプロモーター活性を有していないことを見出した。前記約 300bpの DNA を使用することにより AGFプロモーター活性を調節する物質のスクリーニングが可能であり、 AGFプロモーター活性を調節する物質、すなわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は抗高脂血症治療薬の探索を行うことができる。

[0024] 本発明の DNAには、例えば、

1)配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列力なる DNA、

2)配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列において、 1一 10個（好ましくは 1一 7個、より好ましくは 1一 5個、更に好ましくは 1一 3 個）の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列からなり、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、

3)配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列との相同性が 90%以上（好ましくは 95%以上、より好ましくは 97%以上）である塩基配列からなり、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA が含まれる。

[0025] 本明細書にぉレ、て「アンジォポェチン関連増殖因子（AGF)プロモーター活性」とは、 AGF遺伝子のプロモーター活性を意味し、より具体的には、配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基力もなる配列力もなる DNAの有するプロモーター活性を意味する。或る DNAが「AGFプロモーター活性」を有するか否かの判定方法は、特に限定されるものではなレ、が、既知の通常の方法、例えば、前記 DNAの 3'下流に適当なレポーター遺伝子 DNAを連結させ、これを有核細胞（好ましくは動物細胞株）に導入して培養し、前記細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例 12に記載の方法で確認することができる。

[0026] 本発明の DNAは下記の方法で製造することができる力これらの方法に限定されない。

(l) PCR法を用いた製造

配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列の 5 '側に該当する塩基配列からなるプライマーと 3 '側の配列の相補鎖に該当する塩基配列からなるプライマー、好ましくは配列番号 47及び配列番号 46で表される塩基酉己列からなるプライマーセットを合成し、これらのプライマーとヒトゲノム DNAを用いて PCRを行レ、、配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列からなる DNAを製造することができる。ヒトゲノム DNAは、通常用いられる方法によりヒトの適当な組織から調製することができる。あるいは、市販品を用いることができる。本発明の DNAは、より具体的には実施例 11に記載の方法で製造することができるが、この方法に限定されず、例えば、用いるプライマーは配列番号 47及び配列番号 46とは異なる制限酵素認識部位を付加することもでき、異なる長さの物を用レ、ることもできる。

[0027] (2) DNA合成を用いた製造

配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列の一部分に該当する配列及びその相補鎖を、何本かに分割して化学合成法によって製造し、これらの DNA断片を結合することによつても製造できる。各 DNA断片は、 D NA合成機 [例えば、 Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman社)、あるいは、 394 DNA/RNA Synthesizer

(Applied Biosystems社)など]を用いて合成することができる。

[0028] 当業者であれば、天然型に存在するプロモーター配列の塩基配列の一部を他の塩基への置換や塩基の欠失、及び/又は付加などの改変により、天然型のプロモーター DNAと同等のプロモーター活性を有する DNAを調製することが可能である。このように天然型の塩基配列において塩基が置換、欠失、付加、及び Z又は挿入した塩基配列を有し、天然型のプロモーター DNAと同等のプロモーター活性を有する D NAもまた本発明の DNAに含まれる。塩基の改変は、例えば、制限酵素又は DNA ェキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入 [

Nucleic Acid Res. 10， 6487 (1982)]、変異プライマーを用いた PCR法によるプロモーター配列の改変、あるいは、合成変異 DNAの直接導入などの方法により行うことができる [Maniatis,

T. et al. (1989)： Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2 Edt.

Cold Spring Harbor Laboratory, NY]。

[0029] 上述のように製造した DNAがプロモーター活性を有するか否かは、既知の通常の方法、例えば前記 DNAの 3'下流に適当なレポーター遺伝子 DNAを連結させ、これを有核細胞（好ましくは動物細胞株）に導入して培養し、前記細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例 1 2に記載の方法で確認することができる。

[0030] 本発明の組換えベクターは、目的に応じ適宜選択したベクターに、本発明の DNA を組み込むことにより製造することができる。ベクターにおいては、発現させる目的の構造遺伝子を含む DNAは本発明の DNAの 3'下流に揷入することができる。ここで、構造遺伝子とは、タンパク質をコードしている DNAであれば特に限定されるものではなく、 ORF (〇pen Reading Frame)の全部であっても一部であっても良レ、。例えば、実施例 11に記載したように、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を組み込んだべクタ一に本発明の DNA (すなわち AGFプロモーター活性を有する DNA)を組み込んで製造することが好ましい。「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子（CAT)、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Luc)、又はクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子（GFP)等が挙げられる。好ましくは実施例 11に記載の方法により製造することができる。製造した組換えベクターが AGFプロモーター活性を有するか否かは、既知の通常の方法に従って確認することができ、具体的には、組換えべクタ一を有核細胞（好ましくは動物細胞株）に導入して培養し、前記細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例 12に記載の方法で確認することができる。

[0031] 本発明の形質転換体は、目的に応じ適宜選択した宿主細胞に、本発明の DNAを含む組換えベクターを導入することにより製造することができる。例えば、 hAGFプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング系構築を目的とする場合には、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、又はラットなど）由来の細胞、より好ましくはヒト由来の細胞を用いることができる。細胞株としては、通常の細胞内に存在する転写制御因子等を有する細胞であればよぐより具体的には、例えば、市販されている 293EBNA、 HT -1080、又は HepG2などを用いることができる。

[0032] 宿主細胞への導入方法としては、以下に限定されないが、例えば、 DEAE-デキス卜ラン法 [Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res., 11,

1295-1308]、リン酸カルシウム— DNA共沈殿法 [Graham, F.し and van der Ed, A. J. (1973)

Virology, 52, 456-457]、 FuGENE6 (日本ロシュ社製）を用いた方法、又は電気パノレス穿孔法 [Neumann, E. et

al.(1982) EMBO J., 1, 841-845]等が挙げられる。

[0033] 製造した形質転換体が AGFプロモーター活性を有するか否かは、細胞内のレポ一ター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例 12に記載の方法で確認することができる。本発明の DNAを含まない組換えべクタ一を導入した場合と比較することによって、 AGFプロモーター活性を有する形質転換体を選択することができる。

[0034] [2]本発明のスクリーニング方法

後述の実施例 4一実施例 10に示すように、 AGFは抗肥満、抗糖尿、及び/又は抗高脂血症の作用を有する。従って、 AGFプロモーター活性を促進する物質をスクリーニングすることにより、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び Z又は抗高脂血症に有効な物質を取得することができる。

具体的には、 i)本発明の形質転換体に試験物質を接触させる工程、及び、 ii) hAG Fプロモーター活性を測定し、試験物質依存的な前記活性の変化を分析 (検出又は測定)する工程を含むことを特徴とする、本発明のスクリーニング方法により、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングすることができるより好ましくは、 i)本発明の DNA (好ましくは、配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基力なる配列力なる hAGFプロモーター領域）と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、及び、 ii)レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的なレポーター活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、本発明のスクリーニング方法により、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。

[0035] レポーター遺伝子アツセィ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、 1993年）は、レポ一ター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を分析 (検出又は測定)する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその 5 '上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモータ一の活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。従って、 AGFプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アツセィにより、 AGFの発現調節に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。本発明の DNA (好ましくは配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列力なる hAGFのプロモーター領域）と融合される「レポーター遺伝子」は、一般に用レ、られるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフエニコールァセチルトランスフエラーゼ遺伝子（CAT)、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Luc)、又はクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子（GFP)等が挙げられる。レポーター遺伝子は、本発明の DNA (好ましくは配列番号 1の第 2705番目一 3001番目で表される塩基配列からなる hAGFのプロモーター領域）と機能的に融合されていればよい。本発明の DNA (好ましくは hAGFのプロモーター領域）と融合されたレポーター遺伝子を細胞（例えば、動物細胞又は酵母）に安定あるいは一過性に発現させる。ついで形質転換された細胞に試験物質を培養液中で接触した場合と接触しなかった場合のレポ一ター遺伝子の発現量を比較することにより、試験物質依存的なプロモーター活性の変化を分析することができる。

[0036] 形質転換細胞の作製方法は前記 [1]に記載のものを用いることができる。また、レポーター遺伝子の発現量の解析方法としては、前記レポーター遺伝子がコードするタンパク質により適宜選択される。例えば、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質 (例えば、ルシフェラーゼ）をコードする場合、導入細胞を適当な方法により溶解し、この細胞溶解液の上清中に基質となるルシフェリンを添加した後、適当な蛍光検出器 (例えば、 ML3000 ;ダイナテックラボラトリーズ社等）を用いて蛍光を測定し、レポーター遺伝子の発現量とすることができる。また、この反応は適当な市販の検出キット、具体的には、例えば、ルシフェラーゼアツセィシステム（プロメガ社)等を用いて行うこともできる。

[0037] 前記工程を実施することにより、 AGFの発現を亢進する物質、すなわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は抗高脂血症治療薬のスクリーニングを実施することができる。具体的なスクリーニング法としては、実施例 12に記載の方法が好ましぐプロモーター活性を促進する物質としては、化合物無添加時の 1. 5倍以上のプロモータ一活性化能を有する物質を選択することが好ましい。

[0038] 本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル.ケミストリー技術 (Terrettら， J.Steele.Tetrahedron,第 51卷，第 8135— 8173頁， 1995年）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるレ、は、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。

[0039] [3]本発明の非ヒトノックアウト動物及び非ヒトトランスジエニック動物

本発明の非ヒトノックアウト動物は、 AGFをコードするポリヌクレオチドの遺伝子機能が染色体上で欠損している限り、特に限定されるものではなぐノックアウト動物の製造において一般に使用される方法 [例えば、『最新動物細胞実験マニュアル』 LIC発行，第 7章第 361 408頁 (1990)等参照]に従って、 AGF遺伝子の ORFを含むゲノム配列又は AGF遺伝子の周辺の配列を含むゲノム配列を利用し、作製することができる。前記ゲノム配列としては、作製する動物（種）に応じた配列を利用することができ、例えば、マウスの場合、ジーンバンク（GenBank)ァクセッション番号 AC073775.2の配列を利用することができる。又は、ランダムミュータジエネシスの方法（例えば、 Nature, 392, 608-611, 1998参照）によって作製されたマウスから、 AGF遺伝子機能が欠損したマウスを選択することで、 AGFノックアウト動物を得ることもできる。

[0040] 本発明の非ヒトノックアウト動物は、具体的には、例えば、実施例 1に記載の方法に従って作製することができる。すなわち、 AGF遺伝子の ORFを含むゲノム配列において、その一部を薬剤耐性遺伝子 (例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）と置換した D NAコンストラクトを作製し、得られた DNAコンストラクトを ES細胞へ導入し、適当な薬剤（例えば、 G418)の存在下で培養することにより、耐性株を取得する。続いて、例えば、サザンプロット解析により、所望の相同組換えが起きているクローンを選択し、それを胚盤胞へマイクロインジヱクシヨンし、その操作卵を子宮へ移植することにより、キメラマウスを出産させることができる。前記キメラマウスを正常マウスと交配させることによりへテロ接合体マウスを得る。更に、得られたヘテロ接合体マウス同士を交配することにより、メンデルの法則に従いホモ接合体マウスが得られる。

[0041] ES細胞を用いず、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法 (マイクロインジヱクシヨン法；米国特許第 4,873, 191号公報）、レトロウイルスベクターに遺伝子を挿入し卵に感染させる方法、あるいは、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法 [ M . Lavitrano

et al.， Cell 57(5): 717-723 (1989)]等も公知であり、本発明の非ヒトノックアウト動物（又は後述の本発明の非ヒトトランスジヱニック動物）の作製に当たって利用することができる。

[0042] 本発明の非ヒトノックアウト動物（又は後述の本発明の非ヒトトランスジエニック動物）は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作製することができる。具体的には、例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ミニブタ、ャギ、ヒッジ、又はゥシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたノックアウト動物が作り出されており、本発明の非ヒトノックアウト動物もこれらの種を含む。本発明の非ヒトノックアウト動物（又は後述の本発明の非ヒトトランスジエニック動物）としては、げっ歯類が好ましぐ特にマウスが好ましい。

[0043] 本発明の非ヒトノックアウト動物は、実施例に示すように、顕著な肥満を示し (実施例

4)、脂肪組織の重量が増加しており（実施例 5)、脂肪細胞が肥大化し (実施例 6)、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量が増加し (実施例 7)、糖負荷試験により糖尿病症状を示す（実施例 8)。このような表現型は、肥満者、糖尿病患者、又は高脂血症患者の症状と類似していることから、本発明の非ヒトノックアウト動物は肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症のモデル動物として有用である。すなわち、本発明の非ヒトノックアウト動物は、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症等の治療又は予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、これらの疾患のメカニズムの解明、及びスクリーユングされた医薬品の安全性試験にも使用することができる。 AGF非ヒトノックアウト動物の肥満、糖尿病、及び Z又は高脂血症モデル動物としての使用も本発明に含まれる。

[0044] 本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、導入遺伝子として、下記（a)— (d)：

(a)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、

(b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列において、 1一 10個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び Z又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、

からなる群から選んだポリペプチド（以下、トランスジヱニック動物作製用ポリペプチドと称する）をコードするポリヌクレオチドを、 CAG (modified chicken beta-actin promoter with CMV— IE enhancer)プロモータ¹ ~~ [uENE,

108(1991) 193-200]が連結された状態で用いること以外は、本発明の非ヒトノックァゥト動物と同様にして作製することができる。

[0045] 前記トランスジヱニック動物作製用ポリペプチドとしては、配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列からなるヒト AGF、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列からなるマウス AGFが好ましい。

[0046] 配列番号 3で表されるアミノ酸配列は、ヒト AGF前駆体のアミノ酸配列である。ヒト A GFは、 N末端にシグナル配列 (一 20—— 1)を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列からなるヒト成熟 AGF力生理活性を有する。

同様に、配列番号 5で表されるアミノ酸配列は、マウス AGF前駆体のアミノ酸配列である。マウス AGFは、 N末端にシグナル配列 (一 24—- 1)を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列からなるマウス成熟 AGF力 S、生理活性を有する。

[0047] トランスジヱニック動物作製用ポリペプチドとして用いることのできる前記ポリべプチド (b)、すなわち、配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸力なる配歹 IJ、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のァミノ酸からなる配列において、 1一 10個（例えば、 1一数個）のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は揷入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドとしては、前記各配列において、好ましくは 1一 7個、より好ましくは 1一 5個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は揷入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドを挙げることができる。

[0048] ポリペプチドの機能を維持するために、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グノレ一プに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。非極性アミノ酸： Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Phe、及び T卬

非荷電性アミノ酸： Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、及び Gin

酸性アミノ酸: Asp及び Glu

塩基性アミノ酸： Lys、 Arg、及び His

[0049] 或るポリペプチドが体重増加抑制活性を有するか否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、実施例 4に記載の方法によって確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて作製したトランスジヱニック動物を、標準食又は高脂肪食で飼育し、その体重変動を野生型動物と比較することによって確認することができる。

[0050] トランスジヱニック動物作製用ポリペプチドとして用いることのできる前記ポリべプチド（c)における「ストリンジェントな条件」としては、ハイブリダィゼーシヨンのための条件として、「5xSSPE、 5xデンハート（Denhard's)液、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリウム（S DS)、 40%ホノレムアミド、 200 /i g/mLサケ精子 DNA、 37°Cオーバーナイト」程度の条件であり、より厳しい条件としては「5xSSPE、 5xデンハート液、 0. 5%SDS、 5 0%ホノレムアミド、 200 μ gZmLサケ精子 DNA、 42。Cオーバーナイト」程度の条件である。また、洗浄のための条件として、緩い条件としては「5xSSC、 1%SDS、 42 °C」であり、通常の条件として「0. 5xSSC、 0. 1。/。SDS、 42°C」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0. 2xSSC、 0. 1%SDS、 65°C」程度の条件である。なお、 5XSSPEの組成は、 50mmol/Lリン酸ナトリウム（pH7. 4)、 0. 75mol/L NaCl 、及び 5mmol/L EDTAであり、 5XSSCの組成は、 0. 75molZL NaCl及び 75 mmol/Lクェン酸ナトリウム（pH7. 0)である。

[0051] トランスジヱニック動物作製用ポリペプチドとして用いることのできる前記ポリべプチド（d)における前記相同性は、少なくとも 95%以上であるが、 97%以上の相同性を示すことが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、 BLAST検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、 BLASTパッケージ（sgi32bit版、バージョン 2.0.12 じ8はり入手）の)1236(1プログラム[下& &1^ A. Tatusova,

Thomas L. Madden, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250 (1999)]を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズアラインメントノラメーターとして、プログラム名 blastp、 Gap挿入 Cost値を 0、 Gap伸長 Cost値を 0、 Query配列のフィルタ一として SEG、 Matrixとして BLOSUM62を使用することができる。

[0052] トランスジエニック動物作製用ポリペプチドとしては、前記ポリペプチド（a)— (d)の N末端側にシグナル配列を含むものが好ましレ、。シグナル配列としては、ポリぺプチドの膜通過を先導する配列であれば限定されず、例えば、 Biochemistry, 28(3)， 923-930, 1989に記載のシグナル配列を用いることができる。より好ましくは、前記ポリペプチド（a)— (d)の N末端側に、配列番号 3で表されるアミノ酸配列におけるシグナル配列 (一 20 — 1)又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列におけるシグナル配列（ -24一— 1)を含むものが好ましぐ配列番号 3で表されるアミノ酸配列又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列が最も好ましレ、。 [0053] 前記トランスジヱニック動物作製用ポリペプチドの起源は、ヒト又はマウスに限定されない。前記ポリペプチド（a)—（d)のいずれかに該当する限り、例えば、ヒト又はマウス以外の生物由来のポリペプチドも、また、配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配歹 IJ、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列を基にして、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも、トランスジエニック動物作製用ポリペプチドとして用いることができる。

[0054] 前記ポリペプチド（a)—（d)をコードするポリヌクレオチド、すなわち、本発明の非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いることのできるポリヌクレオチドには、 DNA及び RNAが含まれ、 DNAであることが好ましレ、。前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号 2で表される塩基配列における 61番ー 1410番の塩基からなる配歹 IJ、又は配列番号 4で表される塩基配列における 73番ー 1371番の塩基からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げること力 Sできる。好ましくは、配列番号 2で表される塩基配列又は配列番号 4で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号 2で表される塩基配列における 61番ー 1410番の塩基からなる配歹 lj、又は配列番号 4で表される塩基配列における 73番ー 1371番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドである。

[0055] 本発明の非ヒトトランスジエニック動物は、具体的には、例えば、実施例 2に記載の方法に従って作製することができる。すなわち、 AGFの cDNAの上流に CAGプロモ一ターを連結させた DNAコンストラクトを作製し、得られた DNAコンストラクトを ES細胞へ導入し、例えば、ウェスタンブロット解析により AGFが発現しているクローンを選択し、それを胚盤胞へマイクロインジヱクシヨンし、その操作卵を子宮へ移植することにより、キメラマウスを出産させることができる。前記キメラマウスを正常マウスと交配させることによりトランスジヱニックマウスを得ることができる。

[0056] 本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、肥満、糖尿病、及び Z又は高脂血症の治療薬、並びに Z又は創薬標的分子を同定することに使用することができる。より具体的には、任意の遺伝子 Xを改変した動物（例えば、マウス）と、本発明の非ヒトトランスジェニック動物（例えば、 AGFトランスジエニックマウス）とを交配させることにより、両遺伝子が改変した産仔を作出することができ、その産仔の表現型解析を行うことができる。両遺伝子改変動物に抗肥満、抗糖尿病、及び/又は抗高脂血症作用がなくなつていた場合、前記遺伝子 Xに抗肥満、抗糖尿病、及び/又は抗高脂血症作用があることが判り、遺伝子 X及び Z又は遺伝子 Xに対する機能促進剤が肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の治療薬となることが判る。

[0057] また、本発明の非ヒトトランスジエニック動物で発現変動している遺伝子は、肥満、糖尿病、及び/又は高脂血症の創薬標的分子となり、前記遺伝子又はそのァゴニスト若しくはアンタゴニストは、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び Z又は抗高脂血症薬となる。本発明の非ヒトトランスジヱニック動物は、新たな創薬標的分子を同定するための材料 (例えば、組織や血液）の供給源として有用である。

実施例

[0058] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法ひ Molecular CionmgJ , sambrook, J.ら， Cold Spring Harbor Laboratory

Press, 1989年など）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には、市販品の指示書に従って実施可能である。

[0059] ノックアウト動物及びトランスジヱニック動物の作製については、特に断りがない場合は、 Manipulating

the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd Edition, B. Hogan, R. Bedaington, F. Costantim, £. Lacy, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 1994に従って、 ES細胞を用いたキメラマウス作製については、 AL Joyner: Gene Targeting, A

Practical Approach, OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1993又はバイオマニュアルシリーズ 8,ジーンターゲッティング

ES細胞を用いた変異マウスの作製，相沢慎一/著，羊土社， 1994に従って実施可能である。

[0060] 《実施例 1 :AGF KOマウスの作製》

(1)ターゲッティングベクターの作製マウス AGF遺伝子の 5 '側のゲノム配列（5 ' long arm)、 pgkプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、マウス AGF遺伝子のェクソン（exon) 2の一部とェクソン 3を含むゲノム配列（3 ' short

arm)、及び HSV— tk遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作製した。

[0061] すなわち、 WO03/083114号公報の実施例 1と同様に作製したマウス AGFのタンパク質コード領域全長に対応する cDNAをプローブとして、添付マニュアルに従ってマウスゲノミックライブラリー（Mouse

Genomic, 129 SVJ Library ;ストラタジーン社）のスクリーニングを行レ、、約 17. 9kbp の配列（AGF遺伝子を含む、 mouse- pub-genome配列 AC073775.2の 90644— 108544)を持つファージクローンを単離し、プラスミド pBluescript (ストラタジーン社）にサブクーニングした。このプラスミドクローン（_PBN2)を制限酵素 Sail及び Mf elで切断することで、約 6· 2kbpの 5，ロングアーム（mouse-pub-genome配列

AC073775.2の 90664— 96900を含む）を切り出した。また、前記プラスミド pBN2を铸

で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いて PCRを行い、約 2. Okbpの 3 ' ショートアーム（mouse-pub-genome配列 AC073775.2の 105903— 107914を含む）を得た。 5 'ロングアーム及び 3 'ショートアームを、それぞれ、プラスミド pPNT (Cell, 1991， 65(7), 1153-1163)の Xholサイト及び Xbalサイトへ挿入してターゲッティングべクタ一を完成した。

[0062] (2)相同組み換え ES細胞の取得

得られたターゲッティングベクターを制限酵素 Notlで切断し、 ES細胞株 R1 ( Proceedings

of the National Academy of Sciences, Vol 90, 8424-8428, 1993)へ電気穿孔法で導入した。 G418を含んだ培地で ES細胞を培養し、耐性株を得た。 ES細胞から DNA を抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。具体的には、 AGFのェクソン 4とェクソン 5を含む、配列番号 8 (

GTGGATAGGGACAGAGACTCATATTCTGマウス）で表される塩基配列からなる D NAをプローブとして、制限酵素 Hindlllで切断した DNAを用いてサザンブロット解析を行った。その結果、野生型の 4. 6Kbに対して相同組換えでは 6. 5Kbの DNA 断片を検出することができた。

(3)AGF KOマウスの作製

得られた ES細胞株を、 C57BL/6マウスと DBA/2マウス交雑第 2代である BDF 2マウスより得た胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作卵を子宮へ移植した。操作卵を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスを C57BL/6 マウスと交配することによって、 AGFの開始コドンを欠失した変異アレルを持つへテ口接合体マウス（以下、 AGFヘテロ KOマウスと称する）を得た。 AGFヘテロ KOマウス同士の交配によってホモ接合体マウス（以下、 AGFホモ KOマウスと称する）を得た。仔マウスの尻尾より単離したゲノム DNAを錡型として PCRを行レ、、マウスの遺伝子型を、 PCRによって生じる DNA断片のサイズによって確かめた。尻尾をプロティナーゼ Κで処理し、 DNAをフエノール 'クロ口ホルム抽出した。抽出した DNAは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、トリス一 EDTA緩衝液（以下、 Τ Ε溶液と称する）に溶解した。ネオマイシン耐性遺伝子配列及びターゲッティングによつて欠失するゲノム配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした (ネオマイシン耐性遺伝子）

フォワードプライマー：配列番号 9 (5'_agaggctattcggctatgac-3，人工配列）リバースプライマー：配列番号 10 (5'_caccatgatattcggcaagc-3，人工配列）

(ゲノム DNA)

フォワードプライマー：配列番号 11 (5'-tggcctctgttatcatgctc_3，マウス）

リバースプライマー：酉 S歹 IJ番号 12 (5'-ctacctacatccactcctac-3，マウス）

[0064] 得られた仔マウス由来ゲノム DNAについて、前記プライマーを用いて PCRを行つた。 PCRは DNAポリメラーゼ（ExTaq ;Takara社）を用いて、 95°C (5分間）の熱変性を行った後、 95°C (1分間）、 60°C (1分間）、及び 72°C (1分間）からなるサイクルを 3 0サイクル実施し、更に 72°C (7分間）の伸長反応を行レ、、増幅される断片のサイズを調べた。変異アレルがある場合は、ネオマイシン耐性遺伝子を検出する PCRにおいて 545bpのバンドが検出され、野生型アレルがある場合は、マウス AGFェクソン 1を含むゲノム DNAを検出する PCRにおいて 322bpのバンドが検出される。これらの結果より、マウスの遺伝子型を判定した。その結果、 AGFホモ KOマウスでは、変異ァレルのバンドが検出され、野生型アレルのバンドが検出されず、 AGFヘテロ KOマウスでは、変異アレルのバントと野生型アレルのバンドが共に検出され、野生型マウス [以下、リタ一メイト（Littermate)WTマウスと称する]では変異アレルのバンドが検出されず、野生型アレルのバンドが検出された。

[0065] また、前記実施例 1 (2)のサザンブロット解析を行なうことでも、マウスの遺伝子型を調べた。その結果、 AGFホモ KOマウスでは、変異アレルの 6. 5kbpのバンドが検出され、 AGFヘテロ KOマウスでは、変異アレルの 6· 5kbpのバントと野生型アレルの 4 . 6kbpのバンドが共に検出され、リタ一メイト WTマウスでは野生型アレルの 4. 6kbp のバンドが検出された。

[0066] 更に、 AGF K〇マウスから採血した血液を 37°Cに 30分間静置後、遠心し、その上清から血清を得た。血清をリシス（lysis)ノッファー [0.5mol/L HEPES (pH7.2), 1% TritonX-100, 10%グリセロール，

10mmol/L Na P 0 , 0.1mol/L NaF, O. lmmol/L Na VO ,

4mmol/L EDTA (pH8) , 0.05mg/mLァプロチュン， lmmol/L PMSF, O. lmmol/Lロイぺプチン，

0.025mmol/Lぺプスタイン A]で 20倍希釈したものを 2 X SDSサンプルバッファーで倍量希釈した。 1レーン当たり 20 μ Lを 10%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、ウェスタンブロッテイングを行なった。ウェスタンブロッテイングは、ブロッキング剤として 5%ゥシ血清アルブミン（BSA)含有 TBS_T[20mmol/L

Tris-HCl (pH 7.5), 150mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20]を、 1次抗体として抗マウス AGF抗体（WO03/083114号公報）を、 2次抗体として抗ラビット抗体 (ALI3404； BIO

SourCE社）を 3%BSA含有 TBS— Tで 5000倍に希釈したものを各々使用した。 AG Fホモ K〇マウスでは、 AGFのバンドが欠失していることより AGFの欠損を確認した。

[0067] 《実施例² : CAG— AGF Tgマウスの作製》

本実施例では、 CAG (modified chicken beta- actin

promoter with CMV-IE enhancer)プロモーター [GENE, 108(1991) 193-200]制御下に全身にマウス AGFを強制発現させた AGFトランスジエニックマウス（以下、 CAG— AGF Tgマウスと称する）を作製した。プラスミド pBluescriptll KS ( + ) (ストラタジーン社）のマルチクローニングサイトに、 CAGプロモーター（1. 7kb)、 1οχ71配歹 lj、ブラストサイジン遺伝子（bsr)、ポリ Aシグナル配列（0· 5kb)、 lox P配歹 I」、マウス A GF cDNA配歹 lj、及び IRES (internal

ribosomal entry site)— _geo_ポリ A配列（4· 5kb)を順に挿入したプラスミドを以下の方法で作製した。

[0068] WO03/083114号公報と同様に作製したマウス AGF全長 cDNAを铸型に、配列番

される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして PCR (95°Cで 10分間の反応後、 94°Cで 15秒間、 60°Cで 30秒間、及び 72°Cで 2分間からなる反応を 45サイクノレ実施）を行い、得られた PCR産物を pZEr〇_2クローニングベクター（インビトロジェン社）にサブクローユングした。得られたプラスミドを制限酵素 Hindlllと Sailで切断し、プラスミド pBluescriptll SK (ストラタジーン社）の Hindlllと Sailサイトへ揷入してマウス AGF全長遺伝子をもつプラスミド pBS_mAGFを作製した。次に、プラスミド pBS _mAGFに IRES— β一 geo—ポリ Α遺伝子を導入するために、この遺伝子を持つプラスミド pU— San (Hum

Mol Genet 8:387-396 1999)を制限酵素 Sailと Bglllで切断して IRES— /3 _geo_ポリ A遺伝子を切り出し、 pBS_mAGFの Bglllと Sailサイトへ揷入し、マウス AGF cDN A配列及び IRES— β _geo_ポリ Α配列を持つプラスミド pBS_mAGF_ β geoを作製した。

CAGプロモーター、 1οχ71配歹 1J、 bsr、及びポリ Aシグナル配列を持つプラスミド pC AGlox71bsr (Nucleic Acids Res. 1997;25(4):868- 872)の、ポリ Aシグナルの 3，側に、 loxP配列を揷入して、 bsrと polyAシグナルを 1οχ71配列と loxP配列で挟んだ構造を持つプラスミドを作製した。すなわち、 10 ？を含むリン酸化（1^1& 1011)処理した8：^ Pの断片（配列番号 15 :

AGGTCCCTCGACCTGCAGCCCGGGGGATC：人工配列）を、制限酵素 Smalでの切断後 BAP (bacterial

alkaline phosphatase)処理したプラスミド pCAGlox71bsrへ挿入し、プラスミド 1οχΡ_1 ox71を作製した。プラスミド loxP— 1ρχ71に挿入された loxP配列を確認するために、 T3プライマー（配列番号 16： AATTAACCCTCACTAAAGGG)を用レヽてシークェンシングを行い、挿入した loxP配列を含む領域の塩基配列を調べた。その結果、 T3 プライマーで読んだ塩基配列が、前記配列番号 15で表される塩基配列と一致し、 lo xPと 1οχ71が同じ方向であることを確認した。プラスミド loxP— 1οχ71を制限酵素 Spe Iで切断し、得られた CAGプロモーター、 1οχ71酉己歹 IJ、 bsr,ポリ Aシグナル配歹 lj、及ひ loxP配列を含む断片を、プラスミド pBS_mAGF_ j3 geoの Spelサイトへ揷入し、目的のプラスミド pBS_loxP_lox71— mAGF— /3 geoを作製した。得られたプラスミド pBS-loxP-lox71-mAGF- β geoの構造を図 1に示す。このプラスミドを制限酵素 Notlで切断し、直鎖 DNA断片 [CAGプロモーター（promoter)、 1οχ71配歹 IJ、 bsr, ポリ Aシグナル配列（pA)、 lox P配歹、マウス AGF cDNA配歹 lj、及び IRES— /3 _ geo—ポリ A配列 (_PA)を含む]を得た。 [0070] TT2 ES細胞 [Anal. Biochem., 1993, 214(1):

70-76]に電気穿孔法で前記直鎖 DNA断片を導入した（0. 8V, 3 /i F) ₀ 4 M g/mL ブラストサイジン存在下で ES細胞を培養して、遺伝子が導入された細胞を選択し、 2 0クローンを樹立した。これらの細胞に CAG_Creベクター（Blood,

1326-1333, VollOO, 2002)をサークルのまま電気穿孔法で導入した（0. 8V, 3 μ F)

[0071] CAGプロモーターによって発現した Creリコンビナーゼ力 1οχ71_1οχΡ間の遺伝子を除去すれば、 AGF及び j3 _geoが CAGプロモーター活性によって発現する。そこで、 /3—geo発現クローンを選択するために、 G418 (200 x gZmL)存在下で ES 細胞を培養し、 1οχ71-1_ΟΧΡ間が除去された遺伝子構造を持つ細胞を選択した。この段階で選ばれた 15クローンの細胞は、 CAGプロモーター（1. 7kb)、 1οχ71配歹、マウス AGF cDNA配歹 IJ、及び IRES_ i3 _geo_ポリ A配列（4. 5kb)をもち、 CAG プロモーターの制御下に AGFが恒常的に発現している ES細胞となる。 CAG-Cre ベクターを導入する前の 1οχ71— ΙοχΡ間が除去されていない各クローンの ES細胞をネガティブコントロールとして、選ばれた 15クローンの ES細胞で AGFが発現していることを、実施例 1 (3)と同様の抗 AGF抗体を用いたウェスタンブロッテイングで確認した。すなわち、 ES細胞をリシスバッファー及び 2 X SDSサンプルバッファーで 2倍希釈したものをサンプノレとしてウェスタンブロッテイングを行い、 AGFが発現していることを確認した。 AGFの発現を確認した ES細胞の中から、 8_1、 8_2、及び 9一 1の 3ラインを選び、これを胚盤胞へマイクロインジヱクシヨンし、操作卵を子宮へ移植した。操作卵を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスを C57BL /6マウスと交配することによって CAGプロモーターの制御下に AGFが恒常的に発現しているトランスジェニックマウスを得た。トランスジエニックマウスを同定するため、仔マウスの尻尾より単離したゲノム DNAを铸型として PCRを行った。尻尾をプロティナーゼ Kで処理し、 DNAをフエノール'クロ口ホルム抽出した。抽出した DNAは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、 TE溶液に溶解した。

[0072] マウス AGF cDNA配列及び LacZ配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした。 (AGF)

フォワードプライマー：配列番号 17 (5'-cccactacgacagcttctcc-3，マウス）

リバースプライマー：酉 5歹 IJ番号 18 (5'_agccgggtcaacataacagc-3，マウス)

(LacZ)

フォワードプライマー：配列番号 19 (5'_gcgttacccaacttaatcg-3，人工配列）リバースプライマー：配列番号 20 (5'-tgtgagcgagtaacaacc- 3'人工配列）

このプライマーを用いて PCRを行うと、導入遺伝子からは、 AGF cDNAを検出する PCRにおいて 325bp断片が増幅され、 LacZを検出する PCRにおいては 320bp 断片が増幅され、マウスゲノム DNAからはこれらのサイズの断片は増幅されないはずである。前記プライマーを用いて、得られた仔マウス由来ゲノム DNAについて PC Rを行った。 PCRは DNAポリメラーゼ（ExTaq ;Takara社）を用いて、 94°C (5分間）熱変性を行った後、 94°C (1分間）、 62°C (1分 30秒間）、及び 72°C (1分 30秒間）からなるサイクルを 28サイクル実施し、更に 72°C (7分間）の伸長反応を行レ、、増幅される断片のサイズを調べた。その結果、 3ラインとも、 AGF cDNAを検出する PCR及び LacZを検出する PCR共にバンドが確認された。すなわち、 3ラインともジャームライントランスミッションを確認し、それぞれ CAGプロモーターの制御下に AGFが恒常的に発現しているトランスジエニックマウスであることが確認された。

[0073] 《実施例 3 : CAG_AGF Tgマウスの AGF遺伝子発現》

実施例 2で作製した CAG— AGF Tgマウスで、 AGF遺伝子がどの程度発現してレ、るかを調べた。 CAG— AGF Tgマウス及び同腹の野生型マウス（リタ一メイト WT マウス）の白色脂肪 (WAT)、褐色脂肪 (BAT)、大脳、小脳、視床下部、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋、及び瞎臓の各組織よりトリゾール試薬 (Invitrogen社)を用いて総 RNAを調製した。市販の RNA精製試薬（RNeasy；キアゲン社）及び DNァーゼ（キァゲン社）を用いて総 RNAを DNァーゼ処理及びクリーンアップした。 DNァーゼ処理した総 RNA0. 5 μ gを、スーパースクリプト 'ファーストストランドシステム（RT—PC R用）（LIFE

TECHNOLOGIES社）を用いて cDNAに変換した。

[0074] AGF及び内部標準の 18Sリボゾ一マル RNA (18SrRNA)の発現量は定量 PCR法で行なった。定量 PCRは、シークェンスディテクシヨンシステム（ABI

PRISM 7900HT Sequence Detection System ; Applied Biosystems社）を用いて、リアルタイムの蛍光量を計測することで測定した。铸型として cDNAを、プライマーとして各遺伝子毎にデザインしたプライマー及びタックマンプローブ（Taq

Man probe)を使用した。 AGF遺伝子の発現量測定には、プライマーとして配列番号

21 (TCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGTマウス）と酉己歹番号 22 (

CACCTGATGCACAGGTTCCAマウス）を用レヽ、 PCR試薬として市販の試薬（SYBR

Green PCR Master Mix ;アプライドバイオシステムズ社）を用いて PCRを行った。 18S rRNAの発現量測定には、プライマーとして配列番号 23 (

TGGTTGATCCTGCCAGTAGマウス）と酉己歹番号 24 (

CGACCAAAGGAACCATAACTマウス）を、タックマンプローブとして配列番号 25 ( CCGGTACAGTGAAACTGCGAATGマウス）を用レヽ、 PCR試薬として市販の試薬（ TaqMan

Universal PCR Master Mix ;アプライドバイオシステムズ社）を使用して PCRを行った

[0075] PCRの反応は、 95°C (10分間）の初期変性反応を実施した後、 94°C (15秒間）と 6 0°C (60秒間）からなるサイクル反応を 45回繰り返すことにより実施した。遺伝子発現量算出の標準曲線は、上記 cDNA又はマウスゲノム DNAを铸型として用いて同様の反応を行ない、遺伝子の発現量はサンプノレ間の相対値で算出した。

その結果、 CAG-AGF Tgマウスの組織では、 WTマウスの組織に比べて AGF遺伝子の発現量が上昇していることが判った。特に、骨格筋、 BAT、心臓での発現上昇が顕著であった。

[0076] 《実施例 4：遺伝子改変マウスの体重変化》

(l) CAG-AGF Tgマウスの体重変化

CAG-AGF Tgマウスを C57BL/6に 2世代戻し交配し、 F2の CAG—AGF Tg マウスを得た。 CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスを標準食（CE- 2 ;日本クレア社)で通常に飼育した。 6週齢の雌マウスの体重を比較したところ、 CAG-A GF Tgマウス fま 15. 7g± 0. 8g (SD)、 WTマウス fま 17. 8g± 0. 5g (SD)であり、 1 2週齢の雌マウスの体重を比較したところ、 CAG— AGF Tgマウスは 19· 5g ± 0. 7g (SD)、 WTマウスは 23· 5g ± 2. 5g (SD)であり、 CAG—AGF Tgマウスの方が体重が少ないことが判った。

[0077] 次に、同じマウスを引き続き高脂肪食負荷して体重の変動を調べた。高脂肪食（ HFD-32 ;日本クレア社)で通常に 12週間飼育し、体重の変動を調べた。その結果、 12週間での体重増加量力 CAG—AGF Tgマウスは、 7. lg ± lg (SD)であったのに対して、 WTマウスは 21. 8g ±4g (SD)であった。これらのことより、 CAG-AGF Tgマウスでは、標準食での体重増加抑制、高脂肪食での顕著な体重増加抑制があることが判り、 AGFに体重増加抑制作用があることが判った。

[0078] (2) AGF KOマウスの体重変化

AGFホモ KOマウス、 AGFヘテロ K〇マウス、及びリタ一メイト WTマウスを標準食で通常に飼育した。 1週間毎に 24週齢まで各マウスの体重を測定した。結果を図 2に示す。図 2に示すように、 AGFホモ ΚΟマウスでは、約 12週齢より、 WTマウスに比べて体重が重くなり始め、その後も体重増加が続き、顕著な肥満となることが判った。 A GFヘテロ KOマウスでは、 AGFホモ KOマウスとリタ一メイト WTマウスの中間的な表現型となった。

[0079] 《実施例 5：遺伝子改変マウスの臓器重量変化》

(l) CAG-AGF Tgマウスの臓器重量変化

CAG-AGF Tgマウスでは体重増加が抑制されていることが判った力 S、その原因を明らかにするために、 S蔵器の重量を測定した。 CAG-AGF Tgマウス及びリターメイト WTマウスの、生殖器脂肪 (WAT)、褐色脂肪 (BAT)、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。標準食で飼育した 12週齢のマウスと、高脂肪食で 12週齢一 24週齢の 12週間飼育したマウスで調べた。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓では、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、 CAG-AGF Tgマウスと WTマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪（白色脂肪組織)は、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、 CAG-AGF

Tgマウスの方が、 WTマウスよりも体重当たりの組織重量が減少していた。すなわち , CAG-AGF Tgマウスで体重増加が抑制されていたのは、白色脂肪組織の重量増加が抑制されていたためであることが示された。すなわち、 AGFは、他の臓器重量には何ら影響を与えず、肥満などに伴う脂肪組織重量の増加を抑制する作用があることが判った。白色脂肪組織に関する結果を図 3 (標準食)及び図 4 (高脂肪食負荷）に示す。

[0080] (2)AGF KOマウスの臓器重量変化

AGF KOマウスでは体重が増加していることが判った力その原因を明らかにするために、臓器の重量を測定した。標準食で飼育した 20週齢雌の AGFホモ KOマウス、 AGFヘテロ KOマウス、及びリタ一メイト WTマウスの、生殖器脂肪（WAT)、褐色脂肪 (BAT)、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓は、 AGFホモ KO マウス、 AGFヘテロ K〇マウス、及び WTマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪は、 AGFホモ Κ〇マウスの方力 WTマウスよりも、マウス個体当たり及び体重当たりの組織重量が増加していた。 AGFヘテロ ΚΟマウスは、 AGFホモ ΚΟ マウスと WTマウスの中間的な組織重量となった。すなわち、 AGF KOマウスで体重が増加してレ、たのは、生殖器脂肪組織等の白色脂肪組織の重量が増加してレ、たためであることが示された。このことより、 AGF KOマウスは、 CAG— AGF Tgマウスと逆の表現型となることが明らかとなり、 AGFの生理活性として他の臓器重量には影響を与えずに脂肪組織の重量増加抑制作用があることが明らかとなった。生殖器脂肪組織（白色脂肪組織）に関する結果を図 5 (白色脂肪組織重量)及び図 6 (白色脂肪組織重量/体重）に示す。

[0081] 《実施例 6：遺伝子改変マウスの脂肪細胞形態変化》

(l) CAG-AGF Tgマウスの脂肪細胞形態変化

高脂肪食負荷することで白色脂肪組織の重量が増大し、更に脂肪細胞が肥大化することが知られている。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られてレヽる（医学のあゆみ， 192, 513-518, 2000 ;医学のあゆみ， 192, 541—54 5, 2000)ため、 CAG-AGF Tgマウスの脂肪細胞の形態を調べた。高脂肪食で 1 2週齢一 24週齢の 12週間飼育した CAG—AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの生殖器脂肪組織を採取し、 10。/₀中性緩衝ホルマリン液 (Wako)で固定し、バラフイン包埋後、薄切切片の作製及びへマトキシレンーェォジン（H&E)染色を行なった。結果を図 7に示す。リタ一メイト WTマウス（NTG)では、脂肪細胞が肥大化していた 1S CAG-AGF Tgマウス (TG)では、脂肪細胞の肥大化が抑制されて、ほぼ正常の大きさに維持されていた。

[0082] (2)AGF KOマウスの脂肪細胞形態変化

糖尿病モデルマウスや肥満モデルマウスでは、脂肪組織の重量増大に伴って脂肪細胞が肥大化していることが知られている [Diabetologia, 14(3)， 141-148, 1978]。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られているため、 AGF K Oマウスの脂肪細胞の形態を調べた。 AGFホモ KOマウス及びリタ一メイト WTマウスの生殖器脂肪組織 (WAT)及び褐色脂肪組織 (BAT)を採取し、 10%中性緩衝ホルマリン液で固定し、パラフィン包埋後、薄切切片の作製及びへマトキシレンーェォジン（H&E)染色を行なった。結果を図 8 (AGFホモ K〇マウス）及び図 9 (リタ一メイト WTマウス）に示す。リタ一メイト WTマウスの WATは、脂肪細胞が正常の大きさであつたが、 AGFホモ KOマウスの WATは、脂肪細胞が肥大化していることが判った。更に、 AGFホモ KOマウスではリタ一メイト WTマウスに比べて BATでの脂肪の蓄積が観察された。

[0083] 《実施例 7：遺伝子改変マウスの組織中トリグリセリド含量変化》

(l) CAG-AGF Tgマウスの組織中トリグリセリド含量変化

肥満では、脂肪組織の増大に加えて、骨格筋や肝臓中でのトリグリセリド (TG)含量の増加が起きることが知られている（日本臨床、 1995年、 53卷、 1995年特別号、肥満症、 p354_p358)。そこで CAG— AGF Tgマウスの骨格筋 (腓腹筋)及び肝臓組織中の TG含量を調べた。 CAG—AGF Tgマウス（Tg)及びリタ一メイト WTマウス（WT) を高脂肪食 (HFD-32 ;日本クレア社)で 1箇月間及び 3箇月間飼育し、各マウスの骨格筋及び肝臓組織から、クロ口ホルム一メタノール溶液を用いて、組織中の TGを抽出した (生化学実験講座 3、脂質の化学、東京化学同人)。抽出した TGの濃度をキット（トリグリセライド Eテストヮコ一；和光純薬工業社)を用いて測定し、組織中の TG含量を求めた。結果を図 10 (肝臓)及び図 11 (骨格筋）に示す。骨格筋と肝臓共に CAG -AGF Tgマウスは WTマウスに比べて、組織中の TG含量が減少していることが判つた。このことより、肥満によって増加することが知られている骨格筋や肝臓中の TG 含量を、 AGFが減少させる活性があることが明らかとなった。

[0084] (2)AGF KOマウスの組織中 TG含量

AGF KOマウスの骨格筋 (腓腹筋)及び肝臓組織中の TG含量を調べた。 AGF KOマウス及びリタ一メイト WTマウスの骨格筋及び肝臓組織から前記（1)の方法で、組織中の TGを抽出した。抽出した TGの濃度をキット（トリグリセライド Eテストヮコー；和光純薬工業社)を用いて測定し、組織中の TG含量を求めた。結果を図 12に示す。 AGF KOマウスは WTマウスに比べて、骨格筋及び肝臓組織中の TG含量が顕著に増加していることが判った。 AGF KOマウスは CAG—AGF Tgマウスと逆の表現型となることが判り、 AGFの生理活性として、骨格筋や肝臓中の TG含量を減少させる活性があることが明らかとなった。

[0085] 《実施例 8 :AGF KOマウスの血糖値及び血中インスリン濃度変化》

AGFホモ KOマウス及びリタ一メイト WTマウスの糖負荷試験を行レ、、血糖値及び血中インスリン濃度を調べた。マウスを 16時間絶食後、 lg/kgの D-グノレコースを腹腔内注射 (ip)による投与し、投与前、並びに投与後 15、 30、 60、及び 120分後に眼静脈より採血した。ダルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を、 RIA2 抗体法（SRL社)を用レ、て血中インスリン濃度を測定した。結果を図 13 (血糖値)及び図 14 (血清インスリン）に示す。

[0086] WTマウスは、糖負荷により上昇した血糖値が投与後 30分後力減少し始めるのに対して、 AGFホモ KOマウスは、糖負荷によって血糖値がより大きく上昇し、投与後 6 0分後でも血糖値は減少し始めなかった。これらのことより、 AGFホモ KOマウスでは耐糖能異常が起きていることが判った。血中インスリン濃度は、 WTマウスでは、糖負荷によりインスリン濃度が上昇した力 AGFホモ K〇マウスでは、糖負荷前から血中ィンスリン濃度が顕著に高値であり、高インスリン血漿の状態にあることが判った。これらのことより、 AGF遺伝子を欠失した AGFホモ ΚΟマウスでは、糖尿病が惹起されることが判り、 AGFに抗糖尿病作用があることが明らかとなった。

[0087] 《実施例 9 : CAG_AGF Tgマウスの酸素消費量》

CAG-AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの酸素消費量を測定した。酸素消費量測定装置（OXYMAX ; Columbus Instruments社）を用いて、絶食下で、マウスの酸素消費量を 24時間に渡り計測した。計測方法は酸素消費量測定装置に添付の取扱説明書に従った。 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウス各 14匹の、酸素消費量を計測し、明期の 12時間（7 : 00 19 : 00)、喑期の 12時間（19 : 00 7 : 00)、及び 24時間の酸素消費量を求め、 CAG-AGF Tgマウスと WTマウス間で比較した。結果を図 15に示す。何れの時間帯においても、 CAG-AGF Tgマウスの酸素消費量 (VO )が WTマウスに比較して多いことが判った。この結果、 AGFに

2

は酸素消費量を亢進する活性があることがわかった。酸素消費量とエネルギー消費量は相関するので、酸素消費量が亢進することで、抗肥満の作用がある [FEBS Letters, 491(1-2): 154-158, 2001]。 AGFには酸素消費量を亢進する活性があることが判ったので、 AGFには抗肥満作用があることが裏付けられた。

[0088] 《実施例 10 : CAG— AGF Tgマウスの組織中の遺伝子発現変動》

CAG-AGF Tgマウスの褐色脂肪組織（BAT)及び骨格筋での、 UCP ( Uncoupling

Protein)遺子及び PPAR (Peroxisome Proliferator- Activated Receptor;遺 1s十の発現変動を調べた。 CAG-AGF Tgマウス及びリタ一メイト WTマウスの BAT及び骨格筋組織から、実施例 3と同様の方法で、総 RNAを調製し、 DNァーゼ処理後、 c DNA合成した。 UCP1、 UCP3、 PPAR- a , PPAR- δ、及び j3—ァクチンの発現量は定量 PCR法で行なった。定量 PCRは、実施例 3に記載の方法と同様の方法で実施した。各遺伝子の定量 PCRで用いたプライマーとしては表 1に記載のプライマ一を用いた。また、市販の PCR試薬として、 —ァクチンについては SYBR

Green PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ）を、 UCP1、 UCP3、 PPAR— ひ、及び PPAR— δについては、 TaqMan

Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ）を使用した。

[0089] [表 1] 遗伝子 _ フォワードプライマ一リバースプライマータックマンプライマ一

U C P 1 配列番号 2 6 配列番号 2 7 配列番号 2 8 U C P 3 配列番号 2 9 配列番号 3 0 配列番号 3 1 P P A R— Qf 配列番号 3 2 配列番号 3 3 配列番号 3 4 P P A - <5 配列番号 3 5 配列番号 3 6 配列番号 3 7 ーァクチン配列番号^ 配列号 3 9 用せず

[0090] その結果、 CAG— AGF Tgマウスの BATでは UCP1が発現誘導していること、 C AG-AGF Tgマウスの骨格筋では UCP3、 PPAR_ a、及び PPAR— 5が発現誘導していることが判った。すなわち、 AGFは、 BATでは UCP1を発現誘導させ、骨格筋では UCP3、 PPAR—ひ、及び PPAR— 5を発現誘導させることが判った。このことより、 AGFによる熱消費を亢進させる UCPの発現亢進、熱消費や脂質代謝を亢進させる PPARの発現亢進力 AGFによる酸素消費量の亢進、体重増加抑制、及び脂肪組織重量増加抑制等の作用のメカニズムの一つであることが明らかとなった。

[0091] 《参考例 1：マウス AGFとヒト AGFの発現及び精製》

ヒト AGF及びマウス AGFを WO03/083114号公報（実施例 19)に記載の方法に従つて発現し、精製した。すなわち、 PCRにより得られた約 1. 4kbp (ヒト）又は約 1. 3k bp (マウス）の DNA断片をプラスミド pcDNA_Signal_FLAGに揷入して得られた発現プラスミドを HEK293細胞に導入した。ヒト AGF及びマウス AGFの発現細胞株の培養上清を、抗 FLAG—M2モノクローナル抗体ァガロースァフィ二ティーゲル（ ANTI-FLAG

M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel ; Sigma社）を用いてァフィ二ティー精製してヒト及びマウスのリコンビナント AGFタンパク質を得た。

[0092] 《参考例 2 :骨格筋分化 C2C12細胞への AGF刺激による遺伝子発現変動》

C2C12細胞（ATCCより入手）をコンフルェントまで培養後、培養培地を 10%ゥシ胎児血清（FCS)含有の DMEMから、 2. 5%ゥマ血清含有の DMEMに置換して、 8日間培養を継続し、細胞を骨格筋細胞へ分化させた。骨格筋分化した C2C12細胞へ、 12時間のスターべーシヨン後、 3 /i g/mLのヒト又はマウス AGFリコンビナントタンパク質を添加又は未添カ卩し、添加後、 4、 8、 12、及び 24時間反応した。 AGF無刺激及び AGF刺激した細胞から総 RNAを調製し、 DNァーゼ処理後、 cDNA合成し 7こ。 PPAR— α、 PGし一 1 (Peroxisome Pr oliferat or- Act ivat e d

Receptor-coactivator 1 alpha)、及び CYP (cyclophilin)の遺伝子発現量は、前記実施例 10に記載した方法で定量 PCRを行うことで測定した。定量 PCRには、表 1及び表 2に記載のプライマーを用いた。また、市販の PCR試薬として、 CYPについては SYBR

Green PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ）を、 PPAR—ひ及び PGC— 1 については、 TaqMan Universal PCR

Master Mix (アプライドバイオシステムズ）を使用した。 LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase)の遺伝子発現量は、市販のアツセィシステム（Assay

on demand ;アプライドバイオシステムズ社）及び TaqMan Universal PCR Master Mix ( アプライドバイオシステムズ）を利用して測定した (Assay

ID: Mm00599660_ml)。測定は前記実施例 10に記載した方法に準じて行なったが、プライマー及び PCR反応液は、前記アツセィシステムで購入した反応液を使用し、添付のプロトコールに従って実施した。

[0093] [表 2] 遗伝子フォワードプライマーリバースプライマ一タックマンプライマー P G C - 1 α 配列番号 4 0 配列番号 4 1 配列番号 4 2 C Y Ρ 配列番号 4 3 配列番号 4 4 使用せず

[0094] その結果、ヒト又はマウス AGF刺激により、 PPAR—ひ、 PGC—l a、及び LCADの各遺伝子が発現誘導されることが判った。このことより、 AGFにより、骨格筋細胞で、熱消費の亢進及び脂肪酸酸化の亢進が引き起こされることが判った。 PPAR—ひ及び PGC—l αが脂質代謝や熱消費を亢進させることが知られている [Acta

Physiologica Scandinavica. 178(4):425-434, 2003 ; Endocrine

Reviews 24(1):78_90, 2003]。 AGFが、 PPAR—ひ、 LCAD,及び PGC—l を発現誘導したことから、 AGFには抗肥満作用があることが裏付けられた。

[0095] 《実施例 l l : hAGF mRNA転写領域上流配列のクローニング》

( l ) hAGF mRNA転写領域上流の約 200、約 300、約 400、約 600、及び約 800 ( bp)のクローニング

ヒトゲノム（Genomic DNA ;クロンテック社）を铸型にし、 DNAポリメラーゼ（TaKaRa LA taq™;宝酒造社）を用レヽ、 95°C2分間の後、 94°C30秒間、 60°C30秒間、及び 7 2°C1分間のサイクルを 40回、続いて 72°C5分間の条件で PCRを行った。プライマーセットとしては、（配列番号 45、配列番号 46)、（配列番号 47、配列番号 46)、（配列番号 48、配列番号 46)、（配列番号 49、配列番号 46)、及び (配列番号 50、配列番号 46)で表される塩基配列からなる 5種類のプライマーセットを用いた。それぞれのプライマーセットを用レ、て得られた約 200、約 300、約 400、約 600、及び約 800bp の断片をクローニングベクター（PCR2.1-TOPO ;インビトロジェン社）に各々サブクロ一ユングした。ここで得られた各サブクローンを制限酵素 Kpnl及び Nhelで処理し、酉己歹 IJ番号 1で表される塩基酉己歹' Jの 2790番ー 3001番、 2705番ー 3001番、 2604番一 3001番、 2406番ー 3001番、及び 2206番ー 3001番で表される各塩基配歹' Jを含む断片を、制限酵素 Kpnl及び Nehlで処理したルシフェラーゼアツセィシステム用ベクター pGV_B2 (PicaGene

Vector 2ベーシックベクター；東洋インキ社）に挿入し、 pGV_hAGFpro200 (N6) 、 pGV-hAGFpro300 (N6)、 pGV-hAGFpro400 (N6)、 pGV-hAGFpro600 ( N6)、及び pGV— hAGFpro800 (N6)を得た。

[0096] このようにして、配列番号 1で表される塩基配列の 2790番ー 3001番、 2705番ー 3 001番、 2604番ー 3001番、 2406番ー 3001番、及び 2206番ー 3001番で表される各塩基配列、すなわち、ヒト AGF mRNA転写領域の上流の約 200bp、約 300bp 、約 400bp、約 600bp、及び約 800bpの領域をクローニングし、そのプロモーター活性の測定が可能なプラスミドを作製した。

[0097] (2) hAGF mRNA転写領域上流の約 lk、約 1. 3k、及び約 3k (bp)のクローニング

hAGF mRNA転写領域上流の約 lk及び約 1. 3kのクローニングは PCRを用いて行なった。約 lkbの領域のクローニングには、フォワードプライマーとして、配列番号 51で表される塩基配列からなる DNAを、リバースプライマーとして、配列番号 52 で表される塩基配列からなる DNAを使用し、約 1. 3kbの領域のクローユングには、フォワードプライマーとして、配列番号 53で表される塩基配列からなる DNAを、 '一として配列番号 52で表される塩基配列からなる DNAを使用した。ヒトゲノム（Genomic DNA;クロンテック社）を铸型にし、これらのプライマーセット並びに D NAポリメラーゼ（TaKaRa LA taq™;宝酒造社）を用い、 95°C2分間の後、 94°C30秒間、 60°C30秒間、及び 72°C3分間のサイクルを 45回、続いて 72°C5分間の条件で PCRを行った。得られた約 lkbp及び 1. 3kbpの断片をクローニングベクター（ pCR-XL-T〇PO ;インビトロジェン社）にサブクローニングした。各サブクローンを Kpn I及び Nhel処理し、得られた断片（すなわち、配列番号 1で表される塩基配列の 202 1番ー 3028番、及び 1640番ー 3028番で表される各塩基配列を含む断片）を、 Kp nl及び Nhel処理した pGV_B2に揷入し、 pGV_hAGFprolk (N4)及び pGV_hA GFprol . 3k (N4)を得た。

[0098] 更に、フォワードプライマーとして配列番号 54で表される塩基配列からなる DNA、リバースプライマーとして配列番号 55で表される塩基配列からなる DNAを使用し、ヒトゲノム（Genomic DNA ;クロンテック社）を铸型にして DNAポリメラーゼ（TaKaRa LA taq™;宝酒造社）を用い、 95°C2分間の後、 94°C30秒間、 63°C30秒間、及び 72°C 2分 30秒間のサイクルを 45回、続レ、て 72°C5分間の条件で PCRを行った。

[0099] 得られた約 2kbの断片を、クローニングベクター（pCR- XL- TOPO；インビトロジェン社）へサブクローニングした。ここで得られたサブクローンを Kpnl及び Xmal処理し、配列番号 1で表される塩基配列の 1番ー 1768番で表される塩基配列を含む断片を得た。 pGV— hAGFprol . 3k (N4)には、 hAGF mRNA転写領域上流配列中と p GV— B2ベクターのクローニングサイト中との 2箇所に Xmal制限酵素サイトが存在する。 8· 7 μ g( pGV-hAGFprol . 3k (N4)を 5ユニットの Xmal制限酵素で 1一 10 分間処理することで、 Xmalが、 0、 1、又は 2箇所切断されたプラスミドを作製した。 1 箇所のみ切断したプラスミドを電気泳動で分離抽出した。更に Kpnl処理を行レ、、電気泳動により 6. lkbpのサイズに分離される断片を得ることで、 pGV— B2ベクターのクローニングサイト中の Xmalサイトが切断されず、 hAGFプロモーター領域の配列中の Xmalサイトのみが切断されたプラスミドを得た。このプラスミドに、先に述べた方法 (Kpnlと Xmal処理）で得た、配列番号 1で表される塩基配列の 1番ー 1768番で表される各塩基配列を含む断片を揷入して、 pGV— hAGFpro3k (N4)を得た。 [0100] pGV-hAGFpro800 (N6)を SnaBI及び Xbal処理し、約 2kbpの断片（N6断片）を得た。 pGV— hAGFpro lk (N2)、 pGV— hAGFpro 1 · 3k (N4)、及び pGV— hAG Fpro3k (N4)を SnaBI及び Xbal処理して、切り出される約 2kbpの断片を除去した。これらに、 N6断片を揷入することで、 pGV_hAGFhAGFprolk (N6)、 pGV_hAG Fprol . 3k (N6)、及び pGV_hAGFpro3k (N6)を得た。これらのプラスミドは、レポ一タープラスミド中に、配列番号 1で表される塩基配列の 2021番ー 3001番、 1640 番ー 3001番、及び 1番ー 3001番で表される hAGFのプロモーター領域の塩基配列をそれぞれ持つ。

[0101] このようにして、配列番号 1で表される塩基配列の 2021番ー 3001番、 1640番ー 3 001番、 1番ー 3001番で表される塩基配列である hAGF mRNA転写領域の上流の約 lkbp、 1. 3kbp、及び約 3kbpの領域をクローユングし、そのプロモーター活性の測定が可能なプラスミドを作製した。

[0102] 《実施例 12：ヒト AGFプロモーター領域 DNA配列の解析》

i) pGV-B2 (空ベクター）、実施例 11で得られたプラスミド pGV— hAGFpro200 (N 6)、 pGV— hAGFpro 300 (N6)、 pGV-hAGFpro400 (N6)、 pGV-hAGFpro60 0 (N6)、 pGV-hAGFpro800 (N6)、 pGV— hAGFprolk (N6)、 pGV— hAGFpro 1. 3k (N6)、及び pGV_hAGFpro3k (N6)、並びに ii) j3—gal発現プラスミド（ pCHHO ;アマシャムフアルマシアバイオテック社）を、トランスフエクシヨン試薬（

FuGene-6 ;日本ロッシュ社）を用レヽ、 10%ゥシ胎児血清、 100 /i g/mLペニシリン、及び 100 μ g/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM) で培養していた 293EBNA細胞 (インビトロジェン社）に導入した。通常の培養条件で 48時間培養後のルシフェラーゼ活性を、市販の測定キット（PicaGene発色キット；東洋インキ社)を用いて測定した。この際、測定値は同時導入した /3— gal発現プラスミドより発現した /3—galの活性値で補正した。 β -gal活性の測定は市販の測定キット (Galacto-Light

Plusキット；ロシュ社）を用いた。その結果、約 400bp 約 3kbpの DNAを含むプラスミド [pGV— hAGFpro400 (N6)、 pGV-hAGFpro600 (N6)、 pGV-hAGFpro80 0 (N6)、 pGV-hAGFprolk (N6)、 pGV-hAGFprol . 3k (N6)、及び pGV_hA GFpro3k (N6) ]を導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性の上昇は観察されなかつた。意外にも、それらより短い領域である約 300bpの DNAを含むプラスミド [pGV-h AGFpro300 (N6) ]を導入した細胞では、空ベクターを導入した細胞では認められないルシフェラーゼ活性の明らかな上昇が観察された（図 16)。また、更に短い約 20 Obpの DNAを含むプラスミド [pGV_hAGFpro200 (N6) ]を導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性の上昇は観察されなかった（図 17)。このことは、配列番号 1で表される塩基配列の 2705番ー 3001番で表される約 300bpの領域内にプロモーター活性が存在することを示している。更に、この約 300bpのプロモーター活性を持つ領域の上流の配列中に、プロモーター活性を減弱させるサイレンサーが存在することを示している。

[0103] 配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列で表される約 300bpの DNA配列を利用したレポーターアツセィを構築することができ、前記領域に AGFプロモーター活性が含まれることを見出した。本アツセィ系において、好ましくは pGV— hAGFpro300 (N6)導入後の細胞に試験化合物を添加し、ルシフェラーゼ活性の変化を分析することにより、 AGF遺伝子のプロモーター活性を促進し AGFの発現を亢進する物質である抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び/又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。

[0104] 《参考例 3：マウス AGFのクローニング》

マウス AGFの増幅には、フォワードプライマーとして配列番号 56で表される塩基配歹 IJからなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号 57で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。 PCRは、パイ口べスト DNAポリメラーゼ（ Pyrobest DNA polymerase ;宝酒造社）を用レ、、 5%ホルムアミド存在下で 98°C (20秒 ) /64°C (30秒） /74°C (3分）のサイクルを 35回繰り返した。その結果、約 1. 5kbp の DNA断片が増幅された。この断片を pCR2. 1プラスミド（インビトロジヱン社）を用いてクローニングし、プラスミド pCR2. l_mNewを得た。得られたクローンの塩基配列はダイデォキシターミネーシヨン法により DNAシークェンサ一（ABI377

DNA Sequencer;アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号 58に示す。同配列は 1374塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号 58の 1番ー 1374番）を持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（457アミノ酸）を配列番号 59に示す。マウス AGFは、 N末端にシグナル配列 (一 24—- 1)を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号 59で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなるマウス成熟 AGF力 S、生理活性を有する。

[0105] 配列番号 59で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列（マウス）は、ヒト NL8ZNEW、アンジォポェチン様 6 (angiopoietin- like 6)、又はアンジォポェチン関連タンパク質 5 (angiopoietin- related protein

5)として公知のヒト AGFアミノ酸配列（Genbank accession番号 NP_114123における 21 番ー 470番）と 76%の相同性を有していた。特に、アンジォポェチンファミリーに属するタンパク質の活性において重要であることが知られる C末端側のフイブリノ一ゲン

/illiam

N. Procopio et al., J.Biol.Chem. 274: 30196-30201 (1999)]においては 89%という高レ、相同性を有する。このように活性を維持する上で重要と予想される領域の相同性が高レ、こと力ら、配列番号 58で表されるマウス AGFはヒト AGFのカウンターパートであり、マウス AGFとヒト AGFとは同等の活性を有するものと予測された。なお、ァミノ酸配列の相同性は、 BLAST検索アルゴリズムを用いて決定した。具体的には、 BL ASTパッケージ（sg 2bit版、バージョン 2.0.12 ^じ8はり入手）の31236(1プログラム[ Tatiana

A. Tatusova, Thomasし Madden, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250 (1999)]を用レ、、デフォルトパラメーターに従って算出した。ペアワイズアラインメントノラメータ一として、プログラム名 blastp、 Gap揷入 Cost値を 0、 Gap伸長 Cost値を 0、 Query 配列のフィルタ一として SEG、 Matrixとして BLOSUM62を使用した。

[0106] 《参考例 4 :AGF発現〇P9細胞株の作製》

参考例 3で作製したプラスミド pCR2. l_mNewを制限酵素 Xbal及び Spelで切断し、 1. 4kbのマウス AGF遺伝子を含む断片を得た。この断片を、 Xbalで切断して B AP処理した pEF— BOS— neo [Mizushima， S.， & Nagata, S. Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990)]に揷入して、マウス AGFの発現ベクター pEF_BOS_mAGFを作製した。フユ¹ ~~ジ¹ ~~ン 6 (Fugene6) (Roche

Diagnostics社）を用いて、添付プロトコールに従い、 OP9細胞 [Nakano Τ·，

Semin. Immunol. 7(3), 197-203，

1995]に pEF— BOS— mAGFをトランスフエクシヨンした。 300 μ g/mLジエネテイシン（Geneticin ; Roche Diagnostics社）存在下で、トランスフエクシヨンした細胞を培養することで、マウス AGFの安定発現株（OP9ZAGF)を得た。更に、ネガティブコント口ール用として、マウス AGF遺伝子を含まなレ、pEF— BOS_neoベクターのみをトランスフヱクシヨンした OP9細胞株（〇P9/vector)を得た。

[0107] 《参考例 5 :AGFの軟骨細胞増殖活性》

AGFの軟骨細胞増殖活性をインビトロ（in vitro)で調べた。レトロウイルス発現系で利用することができる緑色蛍光タンパク質遺伝子（green

fluorescent protein ; GFP)の発現ベクターである pEGFPMY[〇nai N.et al., Blood, 96(6),

2074-2080， 2000]をマウス前駆軟骨細胞株 ATDC5 [Atsumi T. et al., Cell Differ. Dev. 30(2),

109-116, 1990]に導入した。レトロウイルスの作製及び ATDC5へのインフエクシヨンは、 Miyamotoらの方法 [Miyamoto T.et

al., Blood, 98(8)、 2544-2554、 2001]に従って実施した。

[0108] インフエクシヨンした細胞を ATDC5培養培地 [DMEM/F_12 (Lifetechnologies 社）、 5%FCS、 5 μ g/mLインスリン、 5 μ g/mLトランスフェリン、 3 X 10— ⁸mol/L 亜セレン酸ナトリウム]で培養し、コンフルェントになる前にトリプシン処理により培養プレートより剥がして細胞を分散した。分散した細胞を、細胞分離装置（FACS vantage ; Becton Dickinson社）に力、けて、 GFPの蛍光を持つ ATDC5を分離回収して、 GFPを発現する ATDC5を得た。得られた GFPを発現する ATDC5を培養及び増殖させ、もう一度同様に上記の細胞分離装置による GFPを発現する細胞の分離回収を実施し、安定的に GFPを発現する ATDC5 (ATDC5ZGFP)を得た。参考例 4で作製した AGF安定発現〇P9細胞株（OP9/AGF)及びコントロール用 OP9 細胞株（OP9Zvector)を 12ゥエルプレートでコンフルェントになるまで培養した。このプレートに、 ATDC5/GFPを 50細胞/ゥエルとなるように撒き、 ATDC5培養培地で 14日間培養した。蛍光顕微鏡で ATDC5/GFPの増殖を調べた。

[0109] その結果、コントロール用 OP9細胞株（OP9/vector)をフィーダ一（feeder)細胞とした場合は、 ATDC5ZGFPのコロニーは全く形成されておらず、 ATDC5ZGFP は増殖していなかった。一方、 AGF安定発現 OP9細胞株（OP9ZAGF)をフィーダ一細胞とした場合は、 ATDC5ZGFPのコロニーが、 1ゥエル当たり約 16コロニーと多数形成されており、 ATDC5/GFPが顕著に増殖していた。 OP9ZAGFは、リコンビナント AGFタンパク質を発現するので、リコンビナント AGFに ATDC5/GFPの細胞増殖活性があること、すなわち、リコンビナント AGFに軟骨細胞増殖活性があることが半 IJつた。

産業上の利用可能性

[0110] 本発明の AGFプロモーター又はスクリーニング方法並びに本発明の非ヒトノックァゥト動物は、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び/又は抗高脂血症薬のスクリーニングの用途に適用することができる。また、本発明の非ヒトトランスジエニック動物は、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び/又は抗高脂血症薬の開発の用途に適用することができる。以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

図面の簡単な説明

[0111] [図 1]プラスミド pBS-loxP— 1οχ71— mAGF—iS geoの構造を模式的に示す図面である。記号「pro.」及び「pri.」は、それぞれ、プロモーター及びプライマーを意味する。

[図 2]AGF KOマウスの体重変化を示すグラフである。横軸は週齢 (週）を、縦軸は体重（g)を示す。また、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、ヘテロ KOマウス、及びホモ ΚΟマウスを意味する。

[図 3]CAG - AGF Tgマウス (標準食)の生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) /体重 (g)を示す。また、記号「WT 」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。

[図 4]CAG-AGF Tgマウス (高脂肪食負荷)の生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) Z体重 (g)を示す。また、記号「WT」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。

[図 5]AGF KOマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化（白色脂肪組織重量 )を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g)を示す。また、記号「WT」、「H TR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 AGFヘテロ KOマウス、及び AGFホモ KOマウスを意味する。

[図 6]AGF KOマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織)重量変化（白色脂肪組織重量 /体重）を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量 (g) Z体重 (g)を示す。また、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、 AGFヘテロ KOマウス、及び AGFホモ KOマウスを意味する。

園 7]CAG— AGF Tgマウスの脂肪細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図面である。

園 8]AGFホモ KOマウスの脂肪細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図面でめる。

園 9]リタ一メイト WTマウスの脂肪細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図面である。

[図 10]CAG— AGF Tgマウスの組織 (肝臓）中 TG含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷 (箇月間）を、縦軸は TG含量 (mg/g組織)を示す。また、記号「WT」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。

園 11]CAG-AGF Tgマウスの組織 (骨格筋）中 TG含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷 (箇月間）を、縦軸は TG含量 (mg/g組織)を示す。また、記号「W

T」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。

[図 12]AGF KOマウスの組織中 TG含量を示すグラフである。縦軸は TG含量 (mg

/g組織)を示す。また、横軸の記号「L」及び「SM」は、それぞれ、肝臓及び骨格筋を意味し、記号「WT」、「HTR」、及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス、ヘテロ KOマウス、及びホモ K〇マウスを意味する。

[図 13]AGF KOマウスの糖負荷試験の結果（血糖値）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血糖値 (mg/dL)を示す。また、記号「WT」及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス及びホモ KOマウスを意味する。 [図 14]AGF KOマウスの糖負荷試験の結果（血清インスリン）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血清インスリン (ng/mL)を示す。また、記号「WT」及び「HM」は、それぞれ、 WTマウス及びホモ KOマウスを意味する。

[図 15]CAG_AGF Tgマウスの酸素消費量を示すグラフである。横軸において、レーン 1は「明期」、レーン 2は「喑期」、レーン 3は「24時間」であり、縦軸は V〇 (mL/

2 kgZmin)を示す。また、記号「WT」及び「Tg」は、それぞれ、 WTマウス及び Tgマウスを意味する。

[図 16]ルシフヱラーゼ活性を示すグラフである。縦軸はルシフヱラーゼ/ β一 galを示す。

園 17]ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ/ β -galを示す。

配列表フリーテキスト

以下の配列表の数字見出し < 223 >には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。酉己歹 1J番号 6、 7、 9、 10、 13、 14、 16、 19、 20、 45— 53、及び 56の酉己歹 IJで表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号 15の配列で表される各塩基配列は、 ΙοχΡを含む配列である。

Claims

請求の範囲

[1] (a)配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列において、 1一 10個の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は揷入された塩基配列力、らなり、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA、又は

(b)配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列との相同性が 90%以上である塩基配列からなり、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有する DNA。

[2] 配列番号 1で表される塩基配列における 2705番ー 3001番の塩基からなる配列からなる DNA。

[3] 請求項 1又は 2に記載の DNAを含み、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、組換えベクター。

[4] 請求項 1又は 2に記載の DNAを含み、かつアンジォポェチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、形質転換体。

[5] i)請求項 4に記載の形質転換体に試験物質を接触させる工程、及び

を含むことを特徴とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び Z又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングする方法。

[6] 請求項 4に記載の形質転換体が、請求項 1又は 2に記載の DNAの下流にレポータ一遺伝子を保持し、アンジォポェチン関連増殖因子プロモーター活性を測定するェ程がレポーター遺伝子の発現を分析する工程である、請求項 5に記載のスクリーニングする方法。

[7] アンジォポェチン関連増殖因子をコードするポリヌクレオチドの遺伝子機能が染色体上で欠損していることを特徴とする、非ヒトノックアウト動物。

[8] (a)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配歹 IJ、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、 (b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列において、 1一 10個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、

(d)配列番号 3で表されるアミノ酸配列における 1番ー 450番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番ー 433番のアミノ酸からなる配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド

力なる群から選んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、 CAGプロモータ一と共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物又はその子孫であつて、染色体上に前記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、非ヒトトランスジエニック動物。