WO2004103406A1

WO2004103406A1 - 血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物

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Publication number: WO2004103406A1
Application number: PCT/JP2004/007566
Authority: WO
Inventors: Yuka Nagata; Kazuo Todokoro
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Mochida Pharmaceutical Co Ltd; RIKEN
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Mochida Pharmaceutical Co Ltd; RIKEN
Priority date: 2003-05-26
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2005-11-26

Abstract

　本発明は、血小板を選択的に減少あるいは増加させ、他の血球成分に影響が少なく、体外循環や全血輸血あるいは成分輸血を伴わず、かつ副作用の少ない血小板の減少あるいは増加を伴う疾患の治療用組成物を提供することを目的とする。　本発明は、３β−ヒドロキシ脱水素酵素活性化作用または阻害作用を有する物質を含有し、血小板の減少を伴う疾患または血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物を提供する。

Description

明細書血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物技術分野

本発明は、 3 ]3—ヒドロキシ脱水素酵素（以下、「 3 j3 H S D」と略記することがある）の活性化作用または阻害作用を有する物質を含有する、新規な巨核球からの血小板産生の調節剤に関する。

また、本発明は、エストロゲン受容体ァゴニストまたはエストロゲン受容体ァンタゴ二ストを含有する、新規な巨核球からの血小 ¾生の調節剤に関する。また、本発明は、上記の調節剤を有効成分として含有することを特徴とする新規な血小板の減少を伴う疾患の治療用組成物に関する。

また、本発明は、上記の調節剤を有効成分として含有することを特徴とする新規な血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物に関する。

また、本発明は、上記の調節剤を用いた、新規な巨核球からの血小板産生の調節方法に関する。

また、本発明は、上記の治療用組成物の新規なスクリーニング方法に関する。背景技術

血小板は他の血球細胞と同様に骨髄中の多能性造血幹細胞に由来する。造血幹細胞から巨核球系前駆細胞、巨核芽球、前巨核球、巨核球へと成熟分化し、分離膜形成等の細胞質の成熟を終えると神経突起に似た細長い胞体突起を形成（P r o p 1 a t e 1 e t f o r ma t i o n。以下、「PPF」と略記することがある。）し、その断裂により多数の血小板が血中に放出される。この血小板産生メカニズムは哺乳動物で共通していると考えられている。しかし、その分子メカニズムは依然として不明である。

巨核球特異的な転写因子 NF— E 2のノックアウト（以下、「NF— E 2 一」と略記することがある。）マウスは血小板の大幅な減少により胎生あるいは新生児致死となる（シダサ二，アール. エー. （S h i V d a s a n i， R. A. ) 等、セル（C e 1 1 ) 、（米国）、 1 995年、 81巻、 p. 695 - 70) 。同様に、 NF— E 2— z—マウス由来の胚性幹細胞（emb r y on i c s t em c e 1 1。以下、「ES細胞」と略記することがある。）を i n v i t r oで巨核球 ·血小板系に分化誘導させると、巨核球まである程度正常に分化するが P P Fが全く見られず血小板は産生されない。

NF— E 2で産生増強される因子としては、 β 1—チュープリン (レシン，ピー. （L e c i n e， P. ) 等、ブラッド（B l o o d) 、（米国）、 2 000年、 96巻、 p. 1366- 1373) およびトロンポキサン合成酵素（デブォゥクス， S. (De v e aux、 S. ) 等、ェンボジャーナル (EMBO J ou r n a l ) 、（英国）、 1 997年、 16巻、 p. 56 54- 5661) が報告されているが、いずれも NF— E 2_z—マウス E S 細胞由来の P P Fおよび血小板産生を復帰させることはできない。

血小板の減少を伴う疾患としては、例えば血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血等が知られている。これらの疾患では、皮膚および可視粘膜に紫斑が多発したり、出血症状や貧血を呈する。治療の基本は、副腎皮質ステロイド剤が用いられる。ステロイド剤の効果が低い症例や副作用が強い症例では摘脾、免疫グロブリン大量投与や血小板輸血が併用されている。しかしながら、効果のない症例があることおよび副作用あるいは感染の危険性などがあり、血小板の減少を伴う疾患の治療剤として必ずしも満足できるものはないのが現状である。

一方、血小板の増加を伴う疾患として、例えば血小板増多症、血小板血症等が知られている。これらの疾患では血栓症あるいは血小板機能異常による出血傾向の危険性がある。治療の基本は血小板数を減じる目的で、緊急的には血小板交換除去（血小板フヱレーシス）と骨髄抑制剤（6—メルカプトプリン、ブスルファン、メルファラン、ニトロソゥレア、ヒドロキシゥレア等）、抗癌剤（ラニムスチン等）が投与されているが、体外循環系への血液移動があり循環系疾患への対策が必要であり、かつ、他の血球成分減少の副作用に注意が必要である。また、対処療法として抗血小板剤（アスピリン、チクロピジン、ジピリダモール等）が投与されているが、必ずしも根本的な治療ではない。血小板の増加を伴う疾患の治療剤として必ずしも満足できるものはないのが現状である。発明の開示

したがって、本発明の目的は、上記現状に鑑み、有効性が高く、血小板を選択的に減少あるいは増加させ、他の血球成分に影響が少なく、体外循環や全血輸血あるいは成分輸血を伴なわず、かつ副作用の少ない血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物を提供することにある。

また、巨核球から血小板産生のメカニズムを研究する上で、巨核球から血小板産生を促進あるいは阻害する作用を有する調節剤が必要である。したがつて、本発明は、このような調節剤および該調節剤を用いて巨核球からの血小板産生を調節する方法を提供することも目的とする。

また、本発明は、血小板の増加または減少を伴う疾患の治療用組成物のスクリーニング方法を提供することも目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は、以下を提供する。

3 ]3—ヒドロキシ脱水素酵素の活性化作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する調節剤。

巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する剤を製造するための 3 β ーヒドロキシ脱水素酵素の活性化作用を有する物質の使用（用途）。

また、エストロゲン受容体ァゴニストを含有し、巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する調節剤。

巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する剤を製造するためのエストロゲン受容体ァゴニストの使用（用途）。

また、上記の調節剤を有効成分として含有する血小板の減少を伴う疾患の治療用組成物。

上記の治療用組成物において、前記有効成分はリオチロニン、エストラジオールおよびゲニスティンからなる群から選択される少なくとも 1種であることが好ましい。

また、上記の治療用組成物において、前記血小板の減少を伴う疾患は、血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、白血病、溶血性尿毒症症候群、播種性血管内凝固症候群および放射線 ·制癌剤 ·骨髄抑制剤による副作用からなる群から選択されるいずれか 1つであることが好ましい。

3 ^—ヒドロキシ脱水素酵素の活性化作用を有する物質と、巨核球とをィンビトロで接触させて、巨核球の血小板産生を増加させる方法。

エストロゲン受容体ァゴニストと、巨核球とをインビトロで接触させて、巨核球の血小板産生を増加させる方法。

また、 3 3—ヒドロキシ脱水素酵素阻害作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する調節剤。

巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する剤を製造するための 3 3 ーヒドロキシ脱水素酵素阻害作用を有する物質の使用（用途）。

また、エストロゲン受容体アンタゴニストを含有し、巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する調節剤。

巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する剤を製造するためのエストロゲン受容体アンタゴニストの使用（用途）。

また、上記の調節剤を有効成分として含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物。

上記の治療用組成物において、前記有効成分は、トリロスタン、ミトタン、メドロキシプロゲステロン、タモキシフェン、メチピオスタン、トレミフェン、クロミフェンおよび I C I 1 8 2 7 8 0からなる群から選択される少なくとも 1種であることが好ましい。

前記有効成分は、トリロスタンであることがより好ましい。また、上記の治療用組成物において、前記血小板の増加を伴う疾患は、血小板増多症、血小板血症、慢性骨髄性白血病および慢性骨髄増殖症候群からなる群から選択されるいずれか 1つであることが好ましい。

3 i3—ヒドロキシ脱水素酵素阻害作用を有する物質と、巨核球とをインビトロで接触させて、巨核球の血小板産生を減少させる方法。

エストロゲン受容体アン夕ゴニストと、巨核球とをインビトロで接触させて、巨核球の血小板産生を減少させる方法。

本発明は、また、下記工程（A) 、または（A) および（B) を含むことを特徴とする 3 ーヒドロキシ脱水素酵素活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物のスクリーニング方法を提供する。

(A) 3 ]3 _ヒドロキシ脱水素酵素にその基質となる物質および被検物質を添加して 3 —ヒドロキシ脱水素酵素の活性を測定する工程、

(B) 培養巨核球に被検物質を添加して胞体突起形成を測定する工程。図面の簡単な説明

図 1A〜Cは、実験例 1における、マウスの ES細胞由来の巨核球の顕微鏡写真であり、図 1Aは、分化誘導 10日目の NF— E2^+/+の ES細胞の顕微鏡写真（倍率 600倍）であり、図 1 Bは、分化誘導 12日目の NF— E2_/—の ES細胞の顕微鏡写真（倍率 600倍）であり、図 1 Cは、分化誘導 10日目の 3 /3HS D遺伝子を導入した N F-E 2 の E S細胞の顕微鏡写真（倍率 600倍) である。図 2は、実施例 1における PPFの測定結果を示したグラフであり、対照での PPFを 100%として示している。

図 3は、実施例 2における PPFの測定結果を示したグラフであり、対照での PPFを 100%として示している。

図 4は、実施例 3でエストロゲン受容体ァゴニストであるエス卜ラジオ一ルを添加して培養した場合における P F Fの測定結果を示したグラフであり、対照での P PFを 100 %として示している。

図 5は、実施例 4におけるマウスの末梢血中の血小板数の測定結果を示したグラフであり、対照での血小板数を 100%として示している。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。

本発明者は、巨核球からの血小板産生のメカニズムについて鋭意研究を行ない、下記実験例 1および 2に示すように、巨核球における胞体突起形成 (PPF) および血小板産生に 3 ;8—ヒドロキシ脱水素酵素（3 /3HSD) が重要な役割を果たしていること、および 33HSD遺伝子を NF— E 2のノックアウト（NF— E2_/_) マウスの胚性幹（ES) 細胞に導入し巨核球 ·血小板系に分化誘導させると、 P P Fが起こり血小板産生能が復帰することを見いだした。

(実験例 1) 巨核球からの血小板産生に関与する因子の単離および同定シダサ二，アール. エー. （S h i V d a s a n i， R. A. ) 等（セル (Ce l l) , 1995年、 81巻、 p. 695— 704が作製した NF— E 2の異型接合体（以下、「NF— E2^+/-J と略記することがある。）マウス（ジャクソンラボラトリ一より入手）を交配し、発生 4日目の胚盤胞由来の正常（以下、「NF— E2^+/+」と略記することがある。）の ES細胞および NF— E2-/_の ES細胞を樹立した。各 ES細胞を 20%ゥシ胎児血清含有 α— MEM (ギブコ（G i b c o) — BRL、グランドアイランド (Gr and I s l and) , ニューヨーク、米国）培養液中で、 OP 9 細胞（仲野等、サイエンス（S c i e nc e) 、 1994年、 265巻、 p. 1098- 1101) と 37 °Cで 3日間共培養し、次いで組換えマウストロンボポェチン（以下、「TP〇」と略記することがある。）（50単位 Zm 1) 添加で 8日間培養し、巨核球へ分化誘導した。マウス組換え TPOは、ナガ夕，ワイ. （N a g a t a， Y. ) 等、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリ一（ J o u r n a 1 o f B i o l o i c a l C emi s t ry) 、 1995年、 270巻、 p. 19673— 19675に記載の方法で、マウス TPOをコードする cDNAを挿入した p ME 18で形質転換した COS— 7細胞の培養上澄から調製した。その全 RNAを RN e a s y Mi n i K i t (キアゲン（Q i a g e n) 、バレンシア（V a 1 e nc i a) 、カリフォルニア、米国）を用いそのマニュアルに従って単離した。次いで、 PCR— s e l e c t c DNA s ub t r a c t i on k i t (クローンテック（c 1 o n e t e c h) 、パロアルト（P a 1 o A 1 t o) 、カリフォルニア、米国）を用いてサブトラクティブ (Sub t r a c t i ve) — P C R法をそのマニュアルに従って行い、 N F-E 2の下流に存在して P P Fを制御する可能性のある因子を単離した。その結果、 3 /3HSDをコードする cDNAフラグメントが最も頻度が高く (約 16%) 検出された。 3 )3HSDの c DNAを p c DNA3. 1発現べクタ一（インビトロゲン）に挿入した。また、ノーザンプロットおよびィムノブロットを用いて、 NF— E 2^+/+の ES細胞由来巨核球および骨髄由来巨核球では 3 i8HSDが発現しているのに対し、 NF— E 2—ハの E S細胞由来巨核球では 3 /3 H S Dの発現がないことを確認した。

(実験例 2) 3 J3HSD導入による血小板産生への影響

NF— E 2— Z-の ES細胞に 3 J3HSDの遺伝子をエレクトロボレ一ション法で導入し、 3 iSHSD発現クローンを得た。 NF— E 2^+/+の ES細胞、 NF— E 2 _の ES細胞および 3 /3 H S D遺伝子を導入した N F— E 2— , 一の ES細胞をそれぞれ 20 %ゥシ胎児血清含有ひ— MEM培地中で OP 9 腫瘍細胞と 37°C、 3日間共培養し、次いでマウス組換え TP O (50単位 /ml) 添加で 8日間培養し、分化誘導 8日目に顕微鏡写真を撮影して PP Fを起こしている細胞数を計測し、その割合を求めた。また、 NF— E2^+/ ⁺の ES細胞および 3 i8HSD遺伝子を導入したNF— E2—^/—のES細胞について、培養 10日目（分化誘導 10日目）に顕微鏡写真を撮影し、 NF — E2—Z-の ES細胞については、培養 12日目（分化誘導 12日目）に顕微鏡写真を撮影して、同様に PPFを起こしている細胞数を計測し、その割合を求めた。

図 1Aは、分化誘導 10日目の NF— E 2^+/+の ES細胞の顕微鏡写真 (倍率 600倍）であり、図 1 Bは、分化誘導 12日目の NF— E2— の ES細胞の顕微鏡写真（倍率 600倍）であり、図 1 Cは、分化誘導 10日目の 3 ;8 HSD遺伝子を導入した NF— E 2—/—の ES細胞の顕微鏡写真 (倍率 600倍）である。図 1 Aから明らかなように、 NF— E2^+/+の E S細胞より分化誘導させた巨核球では、分化誘導 10日目に PPFが観察されたが、図 1 Bから明らかなように、 NF— E 2— /一の ES細胞より分化誘導させた巨核球では、分化誘導 12日目においても P P Fが観察されな^^つた。一方、図 1 Cから明らかなように、 3 J3HSD遺伝子を導入した NF— E2— の ES細胞では、分化誘導 10日目に PPFが観察された。

また、分化誘導 8日目に測定した PPFについて、 NF— E2— の ES 細胞から分化誘導させた巨核球では PPFが全く起こらなかったが、 3 S D遺伝子を導入した N F— E 2— /一の E S細胞より分化誘導させた巨核球では、ほとんどが PPFを起こし、 3 /3HSD遺伝子の導入により、巨核球の血小板産生能が復帰したことが確認された。

3 i3HSDは、哺乳動物において、ェストラジオ一ルを含めて全てのステロイドホルモン生合成の鍵となる酵素であり、 Δ 5—プレダネノロンからプ口ゲステロン、 17—ヒドロキシプレダネノロンから 170；—ヒドロキシプ口ゲステロンおよびデヒドロェピアンドロステロンから Δ4—アンドロステンジオンへの変換酵素として知られている。

本発明者は、上記の知見に基づいて、 3 j8 HSD活性化作用を有する物質あるいは 3 ]3 HSD阻害作用を有する物質をマウス骨髄細胞由来の巨核球に添加したところ、 3 ]3 HSD活性化作用を有する物質を添加した場合には、巨核球からの PFFが促進され、一方 3 )3HSD阻害作用を有する物質を添加した場合には巨核球からの PPFが阻害されることを見出した。また、本発明者らは、エストロゲン受容体ァゴニストであるェストラジオールをマウス骨髄細胞由来の巨核球に添加したところ、巨核球の P F Fが促進されることを見出した。

また、本発明者らは、エストロゲン受容体アン夕ゴニストである夕モキシフェンまたは I C I 182780をマウスに i n v i voで投与したところ、マウスの末梢血中の血小板数が減少することを見出した。

本発明の第一の態様は、 3 jSHSD活性化作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する調節剤である。

ここで、「3 jSHSD活性化作用を有する物質」とは、 3 j3HSDの酵素活性を促進する物質である。このような物質としては、具体的には例えば、リオチロニンが挙げられる。

本発明の第二の態様は、 3 HSD阻害作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する調節剤である。

ここで、「3 jSHSD阻害作用を有する物質」とは、 3 ^HSDの酵素活性を阻害する物質である。このような物質として、例えば、トリロスタン、ミトタン、メドロキシプロゲステロンが挙げられる。

上記第一の態様および第二の態様の調節剤に含有される物質として例示した物質が、 3 /3 H S D活性化作用または阻害作用を有すること自体は公知である。たとえば上記リオチロニン（I nM) あるいはトリロスタン（100 ιιΜ) がブ夕黄体細胞のプロゲステロン分泌を促進あるいは抑制すること (グレコラシュッック，ィー. エリレ. (Gr e go r a s z c z uk, E. L. ) 等、エンドクラインレギュレーションズ（En d c r i n e Re gu l a t i on s) 、 1999年、 33巻、 p. 155— 160) 、トリロスタンがラットあるいはゥシ副腎皮質ミトコンドリアの 3 /3HSDを特異的に阻害する（Km=2 M) こと（ポッツ，ジー. ォー. （Po t t s, G. O. ) 等、ステロィズ（S t e r o i d s) , 1978年、 32巻、 p. 257 - 267, および、ヒヮ夕シアツォ、ジャーナルォブバイオケミス卜リ一 (J ou r n a l o f B i o c hemi s t ry、 1985 年、 98巻、 p. 1519— 1526) 、ミトタンが 3 j3HSDを阻害する (50%阻害濃度 8 M) こと（ォジマ、ェム、日本内分泌学会雑誌、 19 85年、 61巻、 p. 168- 178) 、さらには酢酸メドロキシプロゲステロンがヒトの 3 iSHSDを阻害する（K i = 3 tM) こと（リー，ティー. シ一. （Le e， T. C. ) 等、ザジャーナルォブクリニカルェンドクリノロジーアンドメタポリズム（Th e J o u r n a l o f C l i n i c a l Endo c r i n o l ogy and Me t abo l i sm) , 1999年、 84巻、 p. 2104-2110) が報告されている。

しかしながら、 3 ;8HSDが巨核球からの PPFおよび血小板産生に重要な役割を果たすことはこれまで知られておらず、本発明者らによつて新たに見出された知見であり、したがって、 3 )3 HSDの活性化作用を有する物質あるいは 3 i3HSDの阻害作用を有する物質が、巨核球からの血小板産生の促進あるいは阻害の調節剤として作用することは、本発明で初めて見出されたものである。

なお、第一の態様の調節剤に含有される 3 HSD活性作用を有する物質として市販品を使用してもよい。例えば、リオチロニンはナトリウム塩の形で、甲状腺機能低下症等の治療剤サイロニン（大正製薬株式会社）等として日本国内で市販されている。同様に、第二の態様の調節剤に含有される 3 /3 HSD阻害作用を有する物質として、市販品を使用してもよい。例えば、トリロスタンは、特発性アルドステロン症等の治療剤デソパン錠 ^TM (持田製薬株式会社）として日本国内で市販されており、クッシング症候群治療剤モドラスタン（mo d 0 r a s t a n e™) (サノフィ（SANOF I) ) 、肺癌治療剤のモドレナール（mod r en a l^TM) (ピオエンビィジョン（b i o e n V i s i on) ) として国外で市販 ·開発されている。ミトタンは、副腎癌等の治療剤オペプリム ^TM (株式会社ヤクルト) として、日本国内で巿販されている。メドロキシプロゲステロンは、酢酸塩の形で、無月経等の治療剤ヒスロン ^TM (協和発酵工業株式会社）等として日本国内で市販されている。上記薬剤はいずれも安全性の高い医薬品であり、かつ入手可能である。第一の態様および第二の態様の調節剤は、巨核球から血小板産生のメカ二ズムを研究する実験用の調節剤として有用である。したがって、本発明は、第一の態様または第二の態様の調節剤を用いた、巨核球からの血小板産生の調節方法を第三の態様として提供する。本発明の調節方法では、ヒトのまたはマウス等の哺乳動物の巨核球を培養する際に、第一の態様または第二の態様の調節剤を培養環境に添加することで、第一の態様の調節剤を添加した場合には、培養後における巨核球からの PPFを増加させて、血小板産生を増加させる。一方、第二の態様の調節剤を添加した場合には、培養後における巨核球からの PPFを減少させて、血小板産生を減少させる。すなわち、本発明の調節方法によれば、巨核球からの血小板産生を選択的に増加または減少させることができる。

また、第一の態様および第二の態様の調節剤は、血小板減少あるいは増加を伴う疾患に関する治療 ·研究等への応用が可能であり、これらの調節剤の血小板の減少あるいは増加を伴う疾患に関する治療への応用は、本発明の調節剤の好適用途である。

すなわち、本発明の第四の態様は、 3 ]3 H S D活性化作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する本発明の第一の態様の調節剤を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少を伴う疾患の治療用組成物であり、本発明の第五の態様は、 3 i3 H S D阻害作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する本発明の第二の態様の調節剤を該調節剤を有効成分として含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物である。

本明細書において、「血小板の減少を伴う」の語は、原因のいかんを問わず血中の血小板数が正常値に満たない状態であり、ヒトであれば例えば 1 0 万個以下に減少した状態である。「血小板の減少を伴う疾患」としては、例えば、血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、血管腫、骨髄線維症、溶血性尿毒症症候群、発作性夜間へモグロビン尿症、播種性血管内凝固症候群、サルコイドーシス、門脈亢進症、肝硬変、巨赤芽球性貧血、骨髄巨核球低形成（ファンコ一二症候群、トロンポポェチン欠乏症、新生児風疹）、放射線および制癌剤や骨髄抑制剤等の薬物の副作用、敗血症、結核症、ウィルス性感染症、自己免疫性溶血性貧血合併症、全身性エリスマト一デス、リンパ増殖性疾患、脾機能亢進症、先天性血小板減少症、大量出血、輸血後紫斑病あるいは体外循環等が挙げられる。血小板の減少を伴う疾患では、出血傾向があり、外傷による大量出血や臓器内出血の危険性が増大する。また、可視粘膜に紫斑が多発したり、貧血等を呈する。

「血小板の増加を伴う」の語は、原因のいかんを問わず血中の血小板数が正常値より増加した状態であり、ヒトであれば例えば 4 0万個 Z L以上に増加した状態である。「血小板の増加を伴う疾患」としては、例えば、血小板増多症、鉄欠乏性貧血などの造血亢進、癌、血小板血症、慢性骨髄性白血病、骨髄線維症、本態性血小板増加症、真正赤血球増加症あるいは慢性骨髄増殖症候群等が挙げられる。

血小板の増加を伴う疾患では、血栓傾向があり、脳血栓や心筋梗塞の危険性が増大する。一方、血小板数が多いにもかかわらず血小板機能異常を伴い出血症状を呈する例もある。また、一過性脳虚血発作様、手足のしびれあるいは狭心症様の症状があらわれることがある。

血小板の減少あるいは増加を伴う疾患は、コールターカウン夕一等の血球計数装置あるいは顕微鏡下で血中の血小板数を計数することで容易に診断できる。

「治療用組成物」とは、既に血小板の減少あるいは増加を呈した状態で投与する場合に限らず、血小板の減少あるいは増加が予想される状態で予防的に投与する組成物を含む。また、血小板産生メカニズムは哺乳動物で共通していると考えられることから、本発明の治療用組成物はヒトに限らず、ィヌ、ネコ、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギあるいはネズミ等の哺乳動物に使用することができる。

第四の態様および第五の態様の治療用組成物は、有効成分を化合物（精製の際に不可避的に含まれる他の成分を含む場合もある）単独で投与するか、あるいは、有効成分の化合物に一般的に用いられる適当な担体または媒体の類、例えば賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、香味剤、必要に応じて滅菌水や植物油、更には無害性有機溶媒あるいは無害性溶解補助剤（たとえばダリセリン、プロピレングリコール）、乳化剤、懸濁化剤（例えばツイ一ン 8 0、アラビアゴム溶液）、等張化剤、 p H調整剤、安定化剤、無痛化剤などと適宜選択組み合わせて適当な医薬用製剤に調製することができる。また、調節剤のところで例示した市販の製剤を投与することもできる。

さらには、血小板の減少を伴う疾患の場合、副腎皮質ステロイド剤、摘脾、免疫グロブリンや血小板輸血および Zまたはイン夕一ロイキン 3、 6、 7あるいは 1 1、エリスロポエチンや T P O等の巨核球の分化 ·成熟を促進する物質と併用することができる。一方、血小板の増加を伴う疾患の場合、 6— メルカプトプリン、ブスルファン、メルファラン、ニトロソゥレア、ヒドロキシゥレア、ラニムスチン等の骨髄抑制剤やアスピリン、チクロビジン、ジピリダモール等の抗血小板剤と併用することができる。「併用」とは、本発明の血小板の減少あるいは増加を伴う疾患の治療用組成物の有効成分である化合物と巨核球の分化 ·成熟を促進する物質、あるいは骨髄抑制剤および/ または抗血小板剤とを各々が別個に含有される複数剤とし、この複数剤を同時投与すること、もしくは逐次投与すること、またはこれらを混合して一剤の形で同時投与することを包含する。

製剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液体製剤、坐剤、シロップ剤、吸入剤、点眼剤、軟膏、注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性）、あるいは用時乳濁または懸濁して用いる固形注射剤の形で、経口および静脈内あるいは動脈内、吸入、点眼、直腸内、膣内あるいは外用を問わず患者に投与される。予防的な効果が望まれる場合は経口投与が好ましく、比較的速効性が望まれる場合は静脈内あるいは動脈内投与が好ましい。また、体外血液循環に添加すること、および吸入剤として公知のネブライザ一等を用いて投与することもできる。

本発明の血小板の減少あるいは増加を伴う疾患の治療用組成物の投与量は対象となる作用を現すのに十分な量とされるが、その有効成分、剤形、投与方法、 1日当たりの投与回数、症状の程度、体重、年齢、性別、他剤併用条件等によつて適宜増減することができる。

例えば、リオチロニンナトリウムを経口投与する場合には、成人には 0. 1 gZ日〜 50 O gZ日、好ましくは 5 gZ日〜 75 gZ日を 1回あるいは 2〜3回に分割投与することが好ましい。トリロスタンを経口投与する場合には、成人には 1 OmgZ日〜 500 OmgZ日、好ましくは 24 OmgZ日〜 48 OmgZ日を 1回あるいは 2〜4回に分割投与することが好ましい。ミトタンを経口投与する場合には、成人には 10 OmgZ日〜 1 O g/日、好ましくは 1. 5 gZ日〜 3 g/日を 1回あるいは 2〜3回に分割投与することが好ましい。酢酸メドロキシプロゲステロンを経口投与する場合には、成人には 0. lmgZ日〜 50 Omg/日、好ましくは 2. 5 m gZ日〜 1 5 m gZ日を 1回あるいは 2〜 3回に分割投与することが好ましレ^ 吉草酸エストラジオールを筋肉内注射する場合には、成人には l m g〜 5 O m gを、好ましくは 5 m g ~ l O mgを 1〜4週ごとに投与することが好ましい。

いずれにおいても、血中の血小板数をモニターしながら投与量 ·回数 ·期間を調節することが好ましい。

本発明の第四の態様の治療用組成物は、下記（a ) の形態で使用することができる。（a ) 個体から分離した造血幹細胞、巨核球系前駆細胞、巨核芽球、前巨核球あるいは巨核球のいずれかを含む細胞の培養環境に該治療用組成物を添加することでインビトロで血小板産生を増加させ、産生された血小板を回収し、血小板の減少をともなう疾患を有する同一個体あるいは他の個体に血小板輸血する。この培養環境にはインターロイキン 3， 6 , 7あるいは 1 1、エリスロポエチンや T P O等の巨核球の分化 ·成熟を促進する物質をさらに添加して培養することもできる。

該治療用組成物の上記使用形態における添加量は対象となる作用を現すのに十分な量とされるが、その有効成分、培養環境、他剤併用条件等によって適宜増減することができ、 P P F形成状況や産生された血小板数をモニタ一しながら添加量を調節することが好ましい。

本発明の第六の態様は、エストロゲン受容体ァゴニストを含有し、巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する調節剤である。

ここで、エストロゲン受容体ァゴニストとしては、例えば、ェストラジオール、ゲニスティンが挙げられる。本発明の第七の態様は、エストロゲン受容体アン夕ゴニストを含有し、巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する調節剤である。

ここで、エストロゲン受容体アンタゴニストとしては、夕モキシフェン、クェン酸夕モキシフェン、メチピオスタン、トレミフェン、クロミフェン、 I C I 1 8 2 7 8 0が挙げられる。

なお、本発明の第六の態様の調節剤に含有されるエストロゲン受容体ァゴニストおよび本発明の第七の態様の調節剤に含有されるエストロゲン受容体アン夕ゴニストは、市販品を使用してもよい。このような市販品としては、例えば、エストロゲン受容体ァゴニストであるエストラジオールは、例えば吉草酸とのエステルの形で、無月経等の治療薬ペラニン ^TM (持田製薬株式会社）等として日本国内で市販されている。一方、エストロゲン受容体アン夕ゴニストであるクェン酸タモキシフェンは、抗乳癌剤ノルパテックス ^TMおよびノルバテックス ^TMD (ァストラゼネカ株式会社）等として日本国内で市販されている。これ以外にも、メピチォスタンは、抗乳癌剤チォデロン ^TM (塩野義製薬株式会社）として、トレミフェンはクェン酸塩の形で抗閉経後乳癌剤フェアスト ^TM (日本科薬株式会社）、クロミフェンはクェン酸塩の形で不妊症の排卵誘発剤スパクロミン ^TM (株式会社科薬）として日本国内で市販されており、 I C I 1 8 2 7 8 0は抗乳癌剤フルバストラン（F a s 1 o d e x ^TM、 A s t r a Z e n e c a ) として米国で市販されている。

本発明の第六の態様および第七の態様の調節剤は、本発明の第一の態様および第二の態様の調節剤と同様に、巨核球から血小板産生のメカニズムを研究する実験用の調節剤として有用である。したがって、本発明は、第六の態様および第七の態様の調節剤を用いた巨核球からの血小板産生の調節方法を第八の態様として提供する。具体的な調節方法については、本発明の第三の態様で記載したのと同様である。すなわち、第六の態様または第七の態様の調節剤をヒトまたはマウス等のほ乳動物の巨核球の培養環境に添加することで、第六の態様の調節剤を添加した場合には、培養後における巨核球からの P P Fを増加させて、血小板産生を増加させることができる。一方、第七の態様の調節剤を添加した場合には、培養後における巨核球からの P P Fを減少させて、血小板産生を減少させることができる。

また、本発明の第六の態様および第七の態様の調節剤は、血小板減少あるいは増加を伴う疾患に関する治療，研究等への応用が可能であり、これらの調節剤の血小板の減少あるいは増加を伴う疾患に関する治療への応用は、本発明の調節剤の好適用途である。

すなわち、本発明の第九の態様は、エストロゲン受容体ァゴニストを含有し、巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する本発明の第六の態様の調節剤を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少を伴う疾患の治療用組成物であり、本発明の第十の態様は、エストロゲン受容体アン夕ゴニストを含有し、巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する本発明の第七の態様の調節剤を有効成分として含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物である。

なお、本発明の第九の態様および第十の態様の治療用組成物の使用形態は、それぞれ本発明の第四の態様および第五の態様の治療用組成物の使用形態と同様である。本発明の第十一の態様は、 3 jSHSD活性化作用を有する物質を有効成分として含有する血小板の減少を伴う疾患の治療用組成物または 30HSD阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物のスクリーニング方法である。

本発明の第十一の態様のスクリーニング方法では、 3 j3HSDにその基質となる物質および被検物質を添加して 3 βΗ S Dの酵素活性を測定する。

3 /3HSDの酵素活性は、精製された 3 jSHSDあるいは副腎ミクロゾーム等の 33 H S Dを含有する試料にその基質およびニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、「NAD+」と略記することがある。）またはニコチンァデニンジヌクレオチドリン酸（以下、「NADP+」と略記することがある。）を添加し反応させ、脱水素され変換された物質量あるいは還元されたニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、「NADH」と略記することがある。）または還元されたニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、「NADPH」と略記することがある。 ) を吸光度等で測定することにより測定することができる。

3 /3HSDは、例えば、ゥシ副腎ミクロゾームから常法により精製することができる。また、マウスやラットの副腎ミクロゾームのホモジネートを用いることもできる。 30HSDの基質および脱水素され変換された物質の組み合わせとしては、例えば、 Δ 5—プレダネノロンからプロゲステロン、 1 7—ヒドロキシプレダネノロンから 17 α—ヒドロキシプロゲステロンおよびデヒドロェピアンドロステロンから Δ 4—アンドロステンジォンが挙げられる。 NADHあるいは NADPHの定量は、例えば、波長 260 nmあるいは 340 nmでの吸光度を測定することで算出することができる。

本発明の第十一の態様のスクリーニング方法では、さらに、ヒト、マウス、ラット等の哺乳類の巨核球培養系に被検物質を添加して P P Fの変動を測定することができる。例えば、巨核系培養系における、巨核球からの PPFを 100%とし、その際に、インターロイキン 3、 6、 7あるいは 11、エリスロポェチンや TP〇等の巨核球の分化 ·成熟を促進する物質を添加することもできる。

これらの測定系に被検物質を添加した場合の 3 ]3 H S D活性の変動あるいは PPF変動を測定および評価することにより、 3 ^—ヒドロキシ脱水素酵素活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物のスクリー二ングを行うことができる。

例えば、被検物質の中から、 ImM以下、好ましくは 0. ImM以下、より好ましくは 0. 0 ImM以下の添加により、対照の 3 HSDの酵素活性を 10%以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 70%以上活性化または阻害する被検物質を選定し、その物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物をスクリーニングすることができる。さらに、上記で選定された被検物質の中から、 10mM以下、好ましくは ImM以下、より好ましくは 0. ImM以下の添加により、巨核球からの PPFを 10%以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 30%以上、さらに好ましくは 50% 以上活性化または阻害する被検物質を選定し、その物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物をスクリーニングすることができる。

(実施例）

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されない。

(実施例 1) 3 J3HSD活性化作用を有する物質を含有する調節剤によるマウスの巨核球における血小板産生能への影響

正常マウス（BDF 1マウス、 6〜8週齢）の骨髄腔を CATCH培地 (ImM アデノシン（シグマ（S i gma) 、セントルイス（S t. L u i s) , ミズーリ、米国）、 2mM テオフィリン（ヮコ一、大阪、日本）および 13. 6mM クェン酸ナトリウム水和物（ナカライタスク、京都、日本）含有のハンクスバランスド塩溶液（Han k' s b a l anc e d s a l t s o l u t i on) (ギブコ（G i b c o) — BRL、グランドアイランド（Gr and I s l and) 、ニューヨーク、米国）で洗浄して骨髄細胞を取得し、巨核球を調製した。調製した巨核球（3 X 10³ 個ノ ml) に、 3 /3HSD活性化作用を有する物質としてリオチロニン（1 00 pM) を含有する調節剤を添加して、 1%ゥシ血清アルブミン含有無血清 Sクローン培地（S— c 1 on e、サンコ一、日本）で 37°C、 24時間培養し、顕微鏡写真を撮影して、 PPFを起こしている細胞数を計測し、その割合を求めた。同様に、リオチロニンを添加せずに、マウス巨核球を 24 時間培養して、顕微鏡写真を撮影して、 PPFを起こしている細胞数を計測し、その割合を求めた（対照）。図 2は、 PPFの測定結果を示したグラフであり、対照での PPFを 10 0%として示している。図 2に示すように、 3 HSD活性化作用を有する物質としてリオチロニンを含有する調節剤を添加して培養したマウス巨核球では、 PPFが約 50%増加しており、血小板産生能が促進されたことが確認された。

(実施例 2) 3 /3HSD阻害作用を有する物質を含有する調節剤によるマウスの巨核球における血小板産生能への影響

正常マウス（BDF 1マウス、 6〜8週齢）の骨髄腔を CATCH培地で洗浄して骨髄細胞を取得し、巨核球を調製した。調製した巨核球（3X 10 ³個 Zml) に、 33HSD阻害作用を有する物質としてトリロスタンを濃度 0. 09mM、 0. 45mMおよび 0. 9mMで溶媒 DMS Oに溶解させた調節剤を添加して、 1 %ゥシ血清アルブミン含有無血清 Sクローン培地で 37°C、 24時間培養し、顕微鏡写真を撮影して、 PPFを起こしている細胞数およびその割合を計測した。同様に、トリロスタンを添加せずに、マウス巨核球を 24時間培養したもの（対照）、および DMSOのみを添加して 24時間培養したもの（溶媒）について、顕微鏡写真を撮影して、 PPFを起こしている細胞数およびその割合を計測した。

図 3は、 PPFの計測結果を示したグラフであり、対照での PPFを 10 0%として示している。図 3に示すとおり、 3 )8 HSD阻害作用を有する物質としてトリロスタンを含有する調節剤を添加して培養したマウス巨核球では、濃度依存的に PPFが減少しており、血小板産生能が阻害されたことが確認された。なお、 DMSOのみを添加して培養したもの（溶媒）では、対照とほぼ同程度の P P Fを有することが確認された。

(実施例 3) ステロイドによるマウスの巨核球における血小板産生能への影響

巨核球の前駆細胞の c— k i t+CD41+細胞をオダ，ェム（Od a， M. ) 等、ジーンズツーセルズ（Ge ne s t o Ce l l s) 、 2 003年、 8巻、 p. 9— 16に記載の方法に準じて正常マウスの骨髄より調製した。すなわち、 BDF— 1マウス骨髄細胞を蛍光イソチアネート結合抗マウス CD41抗体（ビーディ一ファーミンゲン（BD Ph a rmi n g e n) 、サンディエゴ（S an D i e go) 、カリフォルニァ、米国）および A PC結合抗マウス CD 117 (c -k i t) 抗体（ビーディーファーミンゲン（BD Ph a rm i n g e n) 、サンディエゴ（S an D i e o) 、カリフォルニア、米国）と水上で 1時間インキュベートした。細胞を、 0. 05% N a N₃および 2%ゥシ胎児血清含有のリン酸緩衝生理食塩水で 2回洗浄し、 c一 k i t⁺CD41+細胞を FACS Va t ag e SE (ビーディ一ファーミンゲン（BD Ph a rmi nge n) 、サンディエゴ（S an D i e go) 、カリフォルニア、米国）を用いて調製した。

調製した c— k i t+CD41+細胞（2X 10³個 Zm 1 ) に、副腎皮質ホルモンの代謝経路で形成されるステロイドであるエストラジオール、テストステロンもしくはプロゲステロン、または合成ステロイドであるデキサメ夕ゾンを各々濃度 2. 3nM、 23nM、 230 nMおよび 2. 3 Mで添加して、 1 %ゥシ胎児血清およびマウス TP O (50単位 /ml) 含有 Sクローン培地で 37°C、 5日間培養し、顕微鏡写真を撮影して、 PPFを起こしている細胞数を計測し、その割合を求めた。また、同様に、ステロイドを添加せずに、マウス巨核球を 24時間培養したものについて、顕微鏡写真を撮影して、 PPFを起こしている細胞数を計測し、その割合を求めた（対照）。

P P Fの測定の結果、エストロゲン受容体ァゴニストであるェストラジオ —ルを添加して培養したものについては、対照に比べて P P Fの増加が確認されたが、他のステロイドを添加して培養したものでは、対照と有意な違いは認められなかった。

図 4は、エストラジオールを添加した例での PPFの測定結果を示したグラフであり、対照での PPFを 100%として示している。図 4に示すとおり、ェストラジオ一ルを添加して培養した例では、添加したェストラジオ一ルに対して、濃度依存的に PPFが増加しており、血小板産生能が促進されたことが確認された。

(実施例 4) エストロゲン受容体アン夕ゴニストの i n v i vo投与によるマウスの末梢血中の血小板数への影響

エストロゲン受容体アン夕ゴニストとして、夕モキシフェン（シグマ（S i gma) 、セントルイス（S t. Lu i s) , ミズーリ、米国）または I C I 182780 (トクリス（To c r i s) 、ブリストル（B r i s t o 1 ) 、英国）を溶媒（ゴマ油：エタノール = 19 : 1) に 2. 5mg/mL の濃度で溶解させた溶液 100 Lを正常マウス（BDF Iマウス、 8週齢、雄、 n = 7) の腹腔内に 1日 1回 9日間連続投与した。投与開始後、尾静脈から採血（2 L) を行い、末梢血中の血小板数をブレヒャ一一クロンカイト（B r e c h e r— C r onk i t e) 法で測定した（0、 2、 4、 6、 8、 11、 14および 20日目（1日 1回））。また、対照として、ェストロゲン受容体アンタゴニストの代わりに 100 Lの溶媒（ゴマ油：ェタノ —ル =19 : 1) のみを BDF Iマウスの腹腔内に 1日 1回 9日間連続投与し、尾静脈から採血（2^L) を行い、末梢血中の血小板数をブレヒャ一— クロンカイト（B r e c he r— C r onk i t e) 法で測定した（0、 2、 4、 6、 8、 11、 14および 20日目（ 1日 1回））。

図 5は、末梢血中の血小板数の測定結果を示したグラフであり、対照での血小板数の測定値を 100 %としている。

図 5から明らかなように、投与開始から 5〜6日後から血小板数が減少し始め、エストロゲン受容体アンタゴニストの投与を続ける限り、血小板数はさらに減少した。そして、投与開始から 8〜1 1日後に血小板数は最も減少した。血小板数は、夕モキシフェンを投与した例では、対照に比べて最大で 45 %減少し、 I C I 182780を投与した例では対照に比べて最大で 2 5%減少した。投与終了後、 5日以内で血小板数は元のレベルに戻った。マウスの血小板の半減期は 5〜6日であるので、エストロゲン受容体アンタゴニスト投与から末梢血中の血小板数の減少が認められるまでに 5〜6日間を要したことは、エストロゲン受容体アンタゴニス卜の投与によって、新たに産生された血小板の巨核球から末梢血中への放出が抑制されたことを示している。これらの結果から、エストロゲン受容体アン夕ゴニストを i n v i v oで投与した場合に、血小板産生を抑制することが確認された。 (実施例 5) 33 HSD活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物のスクリーニング

正常ラット（S p r a g u e— D aw 1 e y、雄性）副腎ミクロゾームのホモジネートを用い、ポッツ、ジー. ォー. （Po t t s, G. O. ) 等、ステロィズ（S t e r o i d s) , 32卷、 257— 267頁、 1978年に記載の方法に準拠して、被検物質の 3 i3HSD活性に及ぼす影響を測定することで、 3 HSD活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物をスクリーニングする。

すなわち、 70mM ショ糖、 1 1. 5mM N a C 1 5. 4mM KC 1、 5mgZml ゥシ血清アルブミン、 0. 84mM NAD+、 8. 5〜68 /Μ Δ 5—プレダネノロン含有の 75mM グリシン緩衝液（p H9. 5) lm 1にラット副腎ミクロゾームのホモジネート（副腎 6. 7m g相当分）と、被検物質（0. 1 M、 1 0 Mおよび ImM) を添加し、これを室温でィンキュベートしながら波長 340 nmでの吸光度変化を測定し、被検物質を添加しない対照の測定結果と比較することで活性化作用あるいは阻害作用の強度を算出する。

その結果、リオチロニンナトリウム塩に 3 )3 HSD活性化作用が、トリ口スタン、ミトタンおよび酢酸メドロキシプロゲステロンに 3 )3HSD阻害作用が確認される。さらに、実施例 2で使用した方法と同様の手順で、培養巨核球に被検物質を添加して P P Fを測定して得られる結果と合わせて評価することにより、これら被検物質が本発明の 3 j8 H S D活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物に成り得ることのスクリーニングを行うことができる。

以下、実施例 6〜 9では、本発明の 3 iS H S D活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物から医薬用製剤を製造した製造例を示す。 (実施例 6) リオチロニン除放性錠剤

リオチロニンナトリウム 0. 005 g

メトセル K 100M (顆粒内） 16. 125 g

リン酸 2カルシウム · 2水和物 181. 670 g

メトセル K 100M (顆粒間） 16. 125 g

ステアリン酸マグネシウム 1. 075 g

本実施例では、 3 /3HSD活性化作用を有する物質としてリオチロニンを含有することを特徴とする血小板の減少を伴う疾患の治療用組成物の錠剤を製造した。実際の手順としては、リオチロニンナトリウムのエタノール溶液をリン酸 2カルシウム · 2水和物に注いで乾燥させ、メトセル K 1 00M (顆粒内）、メトセル K100M (顆粒間）およびステアリン酸マグネシゥムと共に、各成分を上記の量で混合した。これを圧縮して 2 15mgの錠剤を製造した。

(実施例 7) トリロスタン錠剤

卜リロスタン 6. 0 g ラクトース 6. 0 g

ポリビニルピロリドン 0. 4 g

ステアリン酸マグネシウム 0. 1 g

本実施例では、 3 /3HSD阻害作用を有する物質としてトリロスタンを含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物の錠剤を製造した。実際の手順としては、上記各成分を抨量後混合し、湿式造粒装置で造粒した。これを打錠機を用いて 125mgの錠剤を製造した。

(実施例 8) ミトタンカプセル剤

本実施例では、 3 /3HSD阻害作用を有する物質としてミトタンを含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物のカプセル剤を製造した。実際の手順としては、ミトタン 50 Omgを秤量して 0号ゼラチンカプセルに封入し、カプセル剤を製造した。

(実施例 9) 酢酸メドロキシプロゲステロン錠剤

酢酸メドロキシプロゲステロン 0. 5 g

コーンスターチ 1. 5 g

ヒドロキシプロピルセルロース 0. 3 g

ステアリン酸マグネシウム 0. 2 g

乳糖 12. 5 g

本実施例では、 3 j3HSD阻害作用を有する物質として酢酸メドロキシプロゲステロンを含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物の錠剤を製造した。実際の手順として、上記各成分を秤量後混合し、湿式造粒装置で造粒した。これを打錠機を用いて 15 Omgの錠剤を製造した。産業上の利用可能性

本発明の巨核球から血小板産生量を増加させる、または減少させることを特徴とする調節剤は、巨核球から血小板産生のメカニズムを研究する実験用の試薬として有用である。また、本発明の調節剤は、血小板減少あるいは増加を伴う疾患に関する治療 ·研究等への応用が可能である。

本発明の調節剤を有効成分として含有する血小板の減少あるいは増加を伴う疾患の治療用組成物は、ヒトおよび動物において血小板数の正常化が必要な疾患、例えば、血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、急性白血病、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群や血小板増多症、血小板血症、慢性骨髄増殖症候群等に対して、他の血球成分への影響等の副作用の少ない治療剤として有用である。

また、本発明の 3 jS H S D活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物のスクリーニング方法は、上記のような各種疾患の治療剤、および血小板減少あるいは増加を伴う疾患に関する治療 ·研究に用いるための物質を効率よく識別する方法として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 3 /3—ヒドロキシ脱水素酵素活性化作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を増加させる作用を有する調節剤。

2 . 3 /3—ヒドロキシ脱水素酵素阻害作用を有する物質を含有し、巨核球から血小板産生を減少させる作用を有する調節剤。

3 . 請求の範囲第 1項に記載の調節剤を有効成分として含有する血小板の減少を伴う疾患の治療用組成物。

4. 前記有効成分が、リオチロニンである請求の範囲第 3項に記載の治療用組成物。

5 . 前記血小板の減少を伴う疾患が、血小板減少性紫斑病、再生不良性貧血、白血病、溶血性尿毒症症候群、播種性血管内凝固症候群および放射線 ·制癌剤 ·骨髄抑制剤による副作用からなる群から選択されるいずれか 1つである請求の範囲第 3項または第 4項に記載の治療用組成物。

6 . 請求の範囲第 2項に記載の剤を有効成分として含有することを特徴とする血小板の増加を伴う疾患の治療用組成物。

7 . 前記有効成分が、トリロスタン、ミトタンおよびメドロキシプロゲステロンからなる群から選択される少なくとも 1種である請求の範囲第 6項に記載の治療用組成物。

8 . 前記有効成分が、トリロスタンである請求の範囲第 6項に記載の治療用組成物。

9 . 前記血小板の増加を伴う疾患が、血小板増多症、血小板血症、慢性骨髄性白血病および慢性骨髄増殖症候群からなる群から選択されるいずれか 1つである請求の範囲第 6項ないし第 8項のいずれか 1つに記載の治療用組成物。

1 0 . 下記工程（A) 、または（A) および（B) を含むことを特徴とする 3 )3 一ヒドロキシ脱水素酵素活性化作用または阻害作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする血小板の減少または増加を伴う疾患の治療用組成物のスクリーニング方法。

(A) 3 —ヒドロキシ脱水素酵素にその基質となる物質および被検物質を添加して 3 |S—ヒドロキシ脱水素酵素の活性を測定する工程

(B) 培養巨核球に被検物質を添加して胞体突起形成を測定する工程