WO2004090541A1 - ６７ｋＤａラミニン・レセプターを用いた薬物のスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a drug screening method using a 67 kDa laminin receptor and a drug obtained by the method.
  • the 67 kDa Laminin 'receptor (hereinafter sometimes referred to as “67 LR”) is a protein translated from mRNA encoding 295 amino acids.
  • the 7 kDa precursor protein is converted to a homodimer or heterodimer to 67 kDa by an intracellular acylation polymerization reaction with fatty acids, etc. Yes, it translocates to the cell membrane surface together with integrins and functions as a laminin 'receptor (Biochemistry, 1995, 34: 11276-11287, TH Landowski et al. J. Cell. Biochem, 1998, 69: 244 251, S. Buto et al.).
  • the 37 kDa precursor protein is involved in protein synthesis as ribosome-related protein p40, and is also involved in multidrug resistance-related protein (MGr1-Ag). ) Is the same as what was reported as) (Cell. Mol. Life Sci., 2002, 59:
  • the 67 LR low-expressing cell line prepared by introducing 67 LR antisense RNA into a cancer cell line, has significantly reduced tumor growth ability in mice in vivo compared to the original parent cell line, and It has been reported that the translocation ability is reduced, and as a result, the survival rate of mouse individuals is improved (British Journal of Cancer, 1999, 80: 1115-1122, III. Satoh et al.). Furthermore, it has been reported that low 67 LR-expressing cell lines have lower tumor angiogenesis and lower production of VEGF, a pro-angiogenic factor, than the parental cell line (Cancer Letters, 2000, 153: 161—168, M.
  • Laminin-derived peptides that bind to 67 LR (cystin monophosphate, arginic acid-proline-glycine-cysteine-one), where neovascular hyperplasia induced in an ischemic animal model binds to 67 LR Solylcin-glycine-serine-arginine and EGF-derived peptides (cysteine-palinine-isolecin-darin-cin-tyrosine-serine-darin-rinse-noise) (Am. J. Pathol, 2002, 160: 307-313, D.).
  • 67 LR acts as a receptor for the prion protein, which is thought to be the pathogenesis of Creutzfeld-Jakob disease, and binds to prion to bind to the protein. Is reported to be inhibited by its secretion and secretion of miuant 67 LR lacking the membrane domain. (EMBO J, 2001, 20: 5863-5875, S. Gauczynski et al.).
  • 67 LR is also a subset of T cells, a subset of CD45RO + / CD45RA— cells. A subset of cells, CD4 + CD8— or CD4—CD8 +. It has been reported that it is expressed in a group, suggesting that 67 LR may have an effect on the immune system (J. Immunol, 1999, 163: 3430-3440, SM Canfield et al.).
  • epigalo catechin gallate (hereinafter sometimes referred to as ⁇ EGCGJ) is a main ingredient that accounts for about 50% of the tea catechin.
  • epigallocatechin, epicatechin gallate, epicatechin (hereinafter also referred to as ⁇ ECC, ⁇ ECG, and “EC”, respectively) may be included.
  • tea catechins including EGCG include antioxidant, anticancer, suppression of plasma cholesterol increase, suppression of blood pressure increase, suppression of platelet aggregation, suppression of blood sugar increase, prevention of dementia, It has been reported that ulcers, anti-inflammatory, anti-allergic, antibacterial and anti-caries, anti-virus, anti-virus, detoxification, improvement of intestinal rollers, deodorization, etc. (Tea function, edited by Keiichiro Muramatsu et al. , 2002).
  • catechins such as EGCG inhibit angiogenesis closely related to tumor growth. It has been shown that the mechanism is that catechin inhibits phosphorylation of VEGFR-1, a receptor for VEGF, a growth factor for vascular endothelial cells. It has been reported that this does not depend on the antioxidant and antiradical activities of catechins (Cancer Res, 2002, 62: 381-385, Lamy et al.).
  • catechins inhibit the phosphorylation of PDGF-Rbeta in vascular smooth muscle cells by PDGF-BB, another growth factor, which can inhibit vascular hypertrophy.
  • PDGF-BB another growth factor, which can inhibit vascular hypertrophy.
  • catechins have been clarifying various physiological actions at the molecular level.
  • EGCG inhibits gnorecose production in hepatocytes, and inhibits insulin receptor and IRS
  • EGCG functions as a cell growth inhibitory factor through 67 LR, and has a cell growth inhibitory effect and the like by targeting 67 LR.
  • the availability of small molecule compounds for drug screening is now being discussed. No reports have been made until now.
  • Non-Patent Document 3 (Non-Patent Document 3)
  • Non-patent document 4 (Non-patent document 4)
  • Non-Patent Document 5 (Non-Patent Document 5)
  • Non-Patent Document 6 (Non-Patent Document 6)
  • Non-Patent Document 7 (Non-Patent Document 7)
  • Non-Patent Document 8 (Non-Patent Document 8)
  • Non-Patent Document 9 (Non-Patent Document 9)
  • Non-Patent Document 9 (Non-Patent Document 9)
  • Non-Patent Document 10 (Non-Patent Document 10)
  • Non-Patent Document 14 J. Biol. Chem., 1999, 274: 15996-16002
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and found that 67 LR has cell growth inhibitory effect, angiogenesis inhibitory effect, cancer cell metastatic activity inhibitory effect, neuroprotective effect, anti-allergic effect, anti-atherosclerosis effect.
  • the present invention has been found to be usable as a target of a drug having an inhibitory effect on Z or Z or Crofelt-Jakob disease infection, and has completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the degree of binding between the test compound and the 67 kDa Ramin 'receptor was qualitatively or quantitatively measured, and the test compound power was determined based on the measurement results.
  • the test compound inhibits cell growth, inhibits angiogenesis, inhibits metastasis of cancer cells, protects neurons, has an anti-allergic effect, an anti-atherosclerotic effect, and / or Cell growth inhibitory effect, angiogenesis inhibitory effect, cancer cell transfer activity inhibitory effect, neuroprotective effect, anti-allergic effect, including the step of judging that it is a drug having a Croatzfeldt-Jakob disease infection inhibitory effect.
  • the anti-artery A method for screening a drug having a sclerosing action and / or an inhibitory action on Creutzfeld-Jakob disease infection.
  • [7] Cell proliferation inhibitory effect, angiogenesis inhibitory effect, cancer cell metastasis inhibitory effect, neuroprotective effect, anti-allergic effect, anti-atherosclerotic effect, and / or Creutz-Felt-Jacob infection
  • [10] A process for producing the drug according to any one of [3] to [9] by a chemical synthesis method, and combining a pharmaceutically acceptable carrier. Production method.
  • the degree of binding between the compound having a galloyl group and the test compound and the 67 kDa laminin receptor was qualitatively or quantitatively determined.
  • the degree of binding between the test compound and the 67 kDa laminin receptor was determined based on the results of the measurement, and the degree of binding between the test compound and the 67 kDa laminin receptor If the degree of binding of the catechins exceeds the degree of binding of the catechins, it is determined that the test compound is a drug having the same pharmacological action as that of the catechins. .
  • the test As a result of competition between the binding of the compound having a galloyl group to the 67 kDa laminin receptor and the binding of the test compound to the 67 kDa laminin receptor, the test The site where the compound binds to the 67 kDa laminin 'receptor and the site where the compound having a galloyl group binds to the 67 kDa laminin receptor are the same.
  • a method of screening a drug comprising a step of determining that the test compound is a drug having the same action as the pharmacological action of the compound having a galloyl group.
  • the pharmacological action of the compound having a galloyl group has cell growth inhibitory action, angiogenesis inhibitory action, cancer cell metastasis activity inhibitory action, neuroprotective action, anti-allergic action, anti-atherosclerotic action, And / or the screening method according to [12] or [13], which has an inhibitory effect on Croyfert-Jakob disease infection.
  • the pharmacological action of the compound having a galloyl group is a cell growth inhibitory action, an angiogenesis inhibitory action, and a metastatic activity inhibitory action of Z or cancer cells [12] or [13].
  • a pharmaceutical composition comprising a step of producing the drug according to any one of [18] to [21] by a chemical synthesis method, and a step of mixing a pharmaceutically acceptable carrier. Manufacturing method.
  • a cell growth inhibitor comprising the compound according to any one of [24] to [26].
  • An angiogenesis inhibitor comprising the compound according to any one of [24] to [26].
  • FIG. 3 is a view showing a measurement result by the surface plasmon resonance sensor of Example 1.
  • FIG. 2 is a view showing the results of a cell proliferation test in Example 1.
  • FIG. 2 is a view showing the results of a cell proliferation test in Example 1.
  • FIG. 9 is a diagram showing an analysis result by a flow site metric of Example 2.
  • FIG. 9 is a view showing the results of a cell proliferation test in Example 3.
  • FIG. 9 is a view showing a measurement result by the surface plasmon resonance sensor of Example 3.
  • FIG. 9 is a view showing a measurement result by the surface plasmon resonance sensor of Example 4.
  • FIG. 7 is a view showing the results of a cell proliferation test in Example 4. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention provides a novel method for screening drugs targeting 67 LR.
  • the degree of binding between the test compound and 67 LR is qualitatively or quantitatively measured, and when the test compound binds to 67
  • the test compound inhibits cell proliferation, inhibits angiogenesis, inhibits metastasis of cancer cells, inhibits neuroprotection, inhibits allergy, inhibits atherosclerosis, and / or inhibits Croats-Jakob disease infection Cell growth inhibitory action, angiogenesis inhibitory action, cancer cell metastasis activity inhibitory action, neuroprotective action, anti-allergic action, anti-atherosclerotic action, and / or And a screening method for a drug having an inhibitory effect on Creutzfeld-Jakob disease infection.
  • 67 LR used in the present invention is a protein known per se, for example, a sequence encoding the present protein based on the GenBank Accession No.
  • PCR PCR-derived DNA sequence
  • 67 LR cDNA DNA sequence obtained by introducing the obtained cDNA into various commercially available vectors in a form capable of expressing the protein, it is possible to construct a cell line that easily expresses the present protein and to construct the present protein itself. Acquisition is possible.
  • Several other reports of cDNA acquisition and protein expression have been reported (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 6394, H. You et al., British Journal of Cancer, 1999, 80: 1115-1122). , K. Satoh et al., Biochemistry, 1995, 34: 11276-11287, TH Lando ski et al.).
  • 67 LR is a 37 kDa 40S liposome binding protein, but it is known to be 67 kDa when expressed in a membrane.
  • a protein that is 67 kDa when expressed on a membrane Any protein having an adhesive property that binds to is defined as 67 LR in the present invention, and not only a complete protein but also a partial peptide thereof can be used.
  • 67 LR may be used as a purified protein, as a soluble protein, as a form bound to a carrier, or as another protein, depending on the screening means. It can be used as appropriate as a fusion protein of and.
  • the test compound by binding the test compound to 67LR, a cell growth inhibitory effect, an angiogenesis inhibitory effect, a metastatic activity inhibitory effect on cancer cells, a neuroprotective effect, an anti-allergic effect, an anti-arterial pulse are obtained. Screening for a drug that has a sclerosing action and / or an inhibitory action on infection of mouth-Joffert-Jakob disease.
  • the test compound may be in the form of a cell extract, a cell culture supernatant, a fermented microorganism product, a biological extract, a plant extract, a purified or crude protein, a peptide, or a non-peptide compound.
  • drugs such as a synthetic low molecular compound, a natural compound, a gene library and the like.
  • the method of binding the test compound to 67LR is selected according to the form of the test compound.
  • the test compound may be added to a 67LR-expressing cell culture medium. Can be done.
  • the degree of binding between the test compound and 67LR is measured.
  • the measurement method used here can be either qualitative means or quantitative means. is there.
  • the means for measuring the degree of coupling there is a method using a surface plasmon resonance sensor as described in Examples described later.
  • the test compound when the test compound substantially binds to 6-ma LR, the test compound has an inhibitory effect on cell growth, an inhibitory effect on angiogenesis, and an inhibitory effect on metastatic activity of cancer cells.
  • Neuroprotective, anti-allergic, anti-atherosclerotic, and Z it is determined to be a drug having an inhibitory effect on Creutzfeld-Jakob disease infection.
  • the screening method of the present invention is used for screening a drug having a cell growth inhibitory action, an angiogenesis inhibitory action, and / or a cancer cell metastasis activity inhibitory action. Is preferred.
  • the inhibitory effect on cell growth As shown in the Examples below, the inhibitory effect on cell growth, the inhibitory effect on angiogenesis, the inhibitory effect on the metastatic activity of cancer cells, the neuroprotective effect, the anti-allergic effect, the anti-atherosclerotic effect, and / or A compound having a galloyl group, which has been suggested to have an inhibitory action on Leutzfeldt-Jakob disease infection, binds to 67 LR and remarkably suppresses its cell proliferation.
  • the compound having a galloyl group functions as a cell growth factor via the 67 LR, and furthermore, the compound having a galloyl group has the same function as the compound having a galloyl group.
  • the binding substance has the same action as a compound having a galloyl group, that is, an inhibitory action on cell proliferation, an angiogenesis inhibitory action, an inhibitory action on metastatic activity of cancer cells, a neuroprotective action, an anti-allergic action, an anti-atherosclerotic action, And / or is considered to have an inhibitory effect on Kusztella fetakojab disease infection.
  • the test compound that binds to 67 LR may have a cell growth inhibitory effect, an angiogenesis inhibitory effect, a cancer cell metastasis inhibitory effect, a neuroprotective effect, and an anti-allergy. It can be determined that the drug has an action, an anti-atherosclerotic action, and an action of inhibiting Creutzfeldt-Jakob disease infection.
  • Examples of the compounds having a galloyl group include catechins having a galloyl group, such as epigallo catechin gallate and its 3-methinole-substituted catechinine gallate, and polypheno having a galloyl group. , Trigaroyl darcose, pentagalloyno regorae, strictin, piroga Rolls and the like are preferable, and epigallocatechin gallate is preferable.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for screening a drug using a compound having a galloyl group in addition to 67 LLR. That is, the degree of binding between the compound having a galloyl group and the test compound and 67LR is qualitatively or quantitatively measured, and based on the measurement results, the degree of binding between the test compound and 67LR is determined. If the degree of binding between the compound having the formula (1) and 67LR is greater than the step of determining that the test compound is a drug having the same pharmacological action as the compound having the galloyl group. There is a method of screening drugs.
  • the method of screening for a drug comprises a step of determining that the test compound is a drug having the same action as the pharmacological action of the compound having a galloyl group ′.
  • a monoclonal antibody against 67 LR inhibits the binding of a compound having a galloyl group to 67 LR, and as a result, suppresses the cell growth of a compound having a galloyl group. Inhibiting the effect.
  • compounds having a galloyl group inhibit the binding of anti-67 LR antibody to 67 LR. That is, the binding site of the compound having a galloyl group and the antibody recognition site overlap. Are in use. Based on this, when the test compound binds to the same site as the compound having the galloyl group by subjecting the compound having the galloyl group and the test compound to a competitive reaction with 67LR. Therefore, it is considered that the test compound has the same action as that of the compound possessed by the galloyl group.
  • the compound having a galloyl group to be used for screening can be used, for example, by appropriately diluting it with Buf fer such as PBS as described in Examples below. Then it is possible.
  • Buf fer such as PBS
  • the addition of the test compound and the compound having a galloyl group is performed. There is no particular limitation on the order.
  • Drugs screened as described above have cell growth inhibitory effects, angiogenesis inhibitory effects, cancer cell metastatic activity inhibitory effects, neuroprotective effects, anti-allergic effects, anti-atherosclerotic effects, And / or it can be used as a drug for a disease that can be prevented and / or treated by its inhibitory effect on Creutzfeld-Jakob disease infection.
  • the most suitable disease in the present invention includes cancer.
  • the drug can be manufactured by a usual chemical synthesis method or the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be compounded. That is, in the present invention, a step of producing a drug obtained by the above-described screening method by a chemical synthesis method, and a pharmaceutically acceptable method. Also included in the gist of the present invention is a method for producing a pharmaceutical composition, which comprises a step of mixing a carrier to be contained, and a pharmaceutical composition obtained by the production method.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes, for example, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer and the like. It is possible to provide a drug by appropriately combining the drug and the drug. For administration to patients, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., and oral administration are also possible, depending on the drug, and the patient's weight, age, symptoms, etc. Can be selected as appropriate. Similarly, an appropriate dose can be selected according to the drug or the patient's weight, age, symptoms, and the like. If the test compound can be coded by DNA, the DNA can be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • a compound which binds to 67 LR and in which a compound having a galloyl group binds at the same site as the site to which the 67 LR binds is also included in the gist of the present invention.
  • these monoclonal antibodies against 67 LR inhibit the binding of a compound having a galloyl group to 67 LR, and as a result, a compound having a galloyl group
  • the compound having a galloyl group inhibits the binding of the anti-67 LR antibody to the 67 LR antibody; that is, the compound having a galloyl group.
  • the fact that the binding site and the antibody recognition site overlap is well supported. Since these compounds are considered to have the same action as the compound having a galloyl group, they have cell growth inhibitors, angiogenesis inhibitors, cancer cell metastasis activity inhibitors, that is, anticancer drugs. It can be used as Example
  • the human lung dysfunction cell line A549 (ATCC Number: CCL-185) used in this experiment was 10% fetal bovine serum (FBS) (BioSource
  • Caro ERDF culture medium (Kyokuto Pharmaceutical) at 37 ° C, water vapor saturated 5% C0 2 under conditions passages were maintained. NaHCO 3 of ERDF medium 1 in L 1.125 g (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) and 'was added. Cells were maintained in culture during the exponential growth phase.
  • the human-kittolymphoma cell line DND39 was subcultured and maintained under 2 conditions of calo RPMI-1640 medium (Nissui, Japan) supplemented with 5% FBS at 37 ° C and 5% C0 steam-saturated. .
  • Green tea power technology epigallocatecnin-3-O-gallate EG and G
  • epicatechin-3-0-gallate ECii
  • epigal locatecnin EirC
  • epicatechin EC
  • epigallocatechin—3— (3-0—methyl) _gallate (EGCG3 ⁇ Me) was dissolved in phosphate buffer (PBS) to a concentration of 5 mM or 5 mM. When used, it was appropriately thawed and used. PBS is against ultrapure water 1 L, NaCl (Nacalai tesque, Inc.) 8.0 g, KC1 (Nacalai tesque, Inc.) 0.2 g, Na 2 HP0 4 (Nacalai tesque, Inc.) 1.15 g, KH 2 P0 4 (Nacalai tesque, Inc.) was dissolved in 0.2 were prepared.
  • PBS phosphate buffer
  • Caffeine and quercetin were purchased from Nacalai tes que, Inc., and the former was suspended in PBS and the latter was suspended in dimethyl sulfoxide (DMS0) (Nacalai tesque, Inc.) at a concentration of 5 mM.
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • Trypan blue (Wako Pure Chemical Industries) was suspended in PBS to a concentration of 1%, and sterilized by autoclave at 121 ° C for 20 minutes.
  • All-trans-retinoic acid was purchased from Sigma (St. Louis, MO) and dissolved in ethanol.
  • TRIzol used for RNA extraction was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA). 0.1% getyl pyrocarbonate (DEPC) water was introduced from Sigma (St. Louis, ⁇ 0). The DEPC solution used for RNA melting was added to distilled water, stirred for 2 hours so that the final concentration of DEPC became 0.1%, and then prepared by autoclaving.
  • DEPC getyl pyrocarbonate
  • the LB medium was prepared by dissolving 10 g of Bacto Tryptone (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA), 5 g of Bacto Yeast Extract (DIFCO LABORATORIES, Detroit, MI), and 5 g of NaCl in 1 L of ultrapure water and autoclaving. . After cooling to 60 ° C, apply 150 mg / mL ampicillin (ampicillin sodium (Wako Pure Chemical) in ultrapure water to 150 mg / mL).
  • ampicillin ampicillin sodium (Wako Pure Chemical) in ultrapure water to 150 mg / mL).
  • the LB plate contained 2 g of Bacto Tryptone, 1 g of Bacto Yeast Extract, 2 g of NaCl, and 5 g of Bacto Agar (DIFCO), and was dissolved in 200 mL of ultrapure water and autoclaved. After cooling to 60 ° C, 200 mg of 150 mg / mL ampicillin was weighed and dispensed into 10 mL dishes (Falcon) by 10 portions. Isopropyl-bD (_)-thiogalactopyranoside (IPTG) was purchased from Hakko Pure Chemicals and adjusted to 0.1 M.
  • ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) was used. At that time, ABI PRISM BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits Version 2.0 (Alied Biosystems) was used. Template Support Reagent (TSR) was purchased from Applied Biosystems. Gene transfer was performed using FuGENE "6 Transfection Reagent (Roche Diagnistics GmbH, Mannheim, Germany).
  • Anti-human Laminin Receptor antibody for flow cytometry angle precipitation was purchased from NEOMARKERS (Fremont, CA).
  • Mouse IgM antibodies for negative control antibodies were obtained from Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA). Fluorescein
  • FITC isothiocyanate
  • the cells that had been treated with 1 mM ATRA at 37 ° C for 24 hours were washed with PBS, and then 1 x 10 7 cells were immediately suspended in 1 inL of Trizol, immediately suspended, and completely dissolved. After standing at room temperature for 5 minutes, the mixture was vigorously inverted and stirred with 0.2 mL of a clog-mouthed form B. After standing at room temperature for 3 minutes, the mixture was centrifuged at 12000 xg and 4 ° C for 15 minutes. 0.5 mL of 2-propanol was added to the centrifugal supernatant, and the mixture was vigorously inverted and stirred.
  • cDNA synthesis was as described below. First, add 0.5 mg / mL (dT) 2 to 10 mg total RNA. After adding 1 mL of the primer and keeping it at 70 ° C for 10 minutes, annealing was performed by immediately cooling it with ice.
  • DND39 cells were treated with 1 mM ATRA at 37 ° C for 2 hours, and RNA was extracted to synthesize cDNA.
  • Primers were prepared with reference to Fun-length cDNA (Yow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85: 6394-6398 (1988)) (H-LamininR-F;
  • PCR was performed by suspending 1 mL of synthesized cDNA, 0.1 mL of Ex Taq, 2 mL of 10 ⁇ Taq buffer, 1.6 mL of 2.5 mM dNTP, 0.5 mL of each primer, and 14.3 mL of dH20.
  • the conditions were: initial denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation reaction at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, extension reaction at 72 ° C for 30 seconds, denaturation reaction, annealing, and The extension and extension reactions were performed for 25 cycles. Electrophoresis was performed on a 1.2% agarose gel, and the target band was purified using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). We performed this sequence and confirmed that it was the purpose.
  • Reverse PCR was performed by colony PCR, and the colonies were picked up with platinum loops, transferred to LB medium, and incubated at 37 ° C. C.
  • the cells were cultured with shaking at 150 rpm, collected, purified using the EndoFree Plasmid Maxi Kit, and sequenced to confirm that they were 67LR.
  • the constructed 67LR expression vector (PT AI-GE T-LamininR) was introduced into A549 Itoda vesicle using FuGENE TM 6 Transfection Reagent. Details are described below. 1 x 10 4 cells Cells were adjusted to cells / mL (10% FBS-ERDF medium) and seeded. After placing the cells at 37 ° C for 24 hours to allow the cells to adhere, fresh ERDF medium was added to the tube, and FuGENE TM 6 (3 times the amount of gene) was added directly and mixed gently. Next, pT ARGE T-hLamininR was mixed with force D (relaxation force) and left at room temperature for 30 minutes. This was added to the medium and placed at 37 ° C for 48 hours. After washing with the medium, the medium was changed to fresh medium.
  • 67LR transiently expressing cells Various components were added to 67LR transiently expressing cells at various concentrations, and the cells were treated with ERDF medium containing 5% FBS at 37 ° C for 48 hours. After the treatment, the number of cells was measured and the survival rate was measured by the trypan blue staining method.
  • anti-67LR antibody at a final concentration of 10 ⁇ g / mL (ERDF medium containing 1% FBS) was treated at 37 ° C for 30 minutes, followed by EGCG treatment, and the effect on antibody-treated cells was also examined. did. As the value Gatineau Buko down door roll even mouse l g M was subjected to the same treatment.
  • the cells were adjusted to 3 ⁇ 10 5 cells / mL (PBS which is a flower), 20 ⁇ L was dropped on the gold film, and the cells were fixed at room temperature for 30 minutes. Thereafter, green tea catechin diluted to 1, 10, 25, or 50 ⁇ 50 with PBS was injected, and the change in surface plasmon resonance angle (Angle) was measured to monitor the binding to cells.
  • PBS surface plasmon resonance angle
  • the binding competition test between EGCG and anti-67LR antibody was performed by treating anti-67LR antibody at a final concentration of 10 ⁇ g / mL (ERDF medium containing 1% FBS) at 37 ° C for 30 minutes and then placing the cells on a gold membrane. Immobilization was performed in the same manner as above using a surface plasmon resonance sensor. At this time, the same treatment was performed using mouse igM as a negative control, and measurement was performed.
  • LR Detected by flow cytometry analysis using an antibody. Collect the cells, adjust to a total volume of 100 ⁇ L 1% FBS-PBS in a 1.5 mL Eppendorf tube so that the cells contain 1 ⁇ 10 6 cells, and use the anti-human LR antibody as the primary antibody. was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL. After incubating at 4 ° C for 30 minutes, it was washed once with PBS. Next, an anti-mouse IgM FITC-labeled antibody that recognizes the isotype of the LR antibody as a secondary antibody was added to a final concentration of 12.5 ⁇ g / mL in a total volume of 25 ⁇ l of 1% FBS-PBS.
  • cells were treated with EGCG-supplemented 1% FBS-PBS adjusted to a final concentration of 50 ⁇ before the primary antibody was allowed to act. And placed at 37 ° C. for 30 minutes. This was washed once with PBS. Thereafter, the above-described action was performed from the primary antibody, and measurement was performed. In addition, the cells were treated with 1% FBS-PBS without EGCG as a control group.
  • the R expression vector ( pTARGE T-hLamininR) was introduced into A549 Itoda cells using FuGENE TM 6 Transfection Reagent by the following method. The cells were adjusted to 1 ⁇ 10 4 cells / mL (10% FBS-ERDF medium) and seeded. Twenty-four hours later, a fresh ERDF medium was placed in the tube, and FuGENE TM 6 (three times the amount of the gene) was added directly, followed by gentle mixing. Next, pT ARGE T-hLamininR at various concentrations was mixed gently with kojiro and left at room temperature for 30 minutes. This was added to the medium, and the culture was continued at 37 ° C for 48 hours.
  • EGCG was added at various concentrations to the 67LR-overexpressing cells and treated at 37 ° C for 48 hours in an ERDF medium containing 5% FBS. After the treatment, the number of cells was measured, and the survival rate was measured by the trypan blue staining method.
  • EGCG concentration-dependent cell growth suppression was observed in cells in which 67LR was transiently expressed.
  • suppression of cell proliferation was observed in proportion to the amount of the 67LR gene introduced into the cells.
  • 67LR is a membrane protein present in the cell membrane, and the enhanced effect of EGCG in cells transfected with this gene expression vector may be due to increased EGCG binding. . Therefore, the binding of EGCG to these cells was measured using a surface plasmon resonance sensor. EGCG was used at 5 ⁇ .
  • Example 2 Measurement of cell surface expression of 67LR
  • the expression level of 67LR on the cell surface was measured. Some expression of the control was observed in A549 cells. In the cells into which empty vector (0.5 ⁇ g) was introduced, almost no effect was observed on the expression level. However, in the cells into which the 67LR expression vector (0.5 ⁇ g) was introduced, the expression level was significantly increased, indicating that 67LR was expressed on the cell surface. Was revealed.
  • Fig. 4 shows the results of Example 2.
  • Example 3 Effects of anti-67 on the binding and growth inhibitory activity of EGCG
  • EGCG binds to cells via 67LR and expresses a growth inhibitory activity.
  • the cells that had been forced to express 67LR were treated in advance with anti-67LR antibodies, and examined to determine whether there was any effect on the binding and growth inhibitory activity of EGCG. went.
  • Example 4 Effect of 67LR expression on binding and growth inhibitory activity of other tea components
  • ECG ECG, EGC, EC, C as a major green tea catechin and EGCG3 "Me, which has been reported to have a strong antiallergic effect and to be stably present in vivo
  • Caffeine which has various physiological functions like catechin, and quercetin, a kind of flavanols whose many physiological functions have been reported, were also examined.
  • Example 4 The results of Example 4 are shown in FIGS. Industrial applicability

Abstract

６７ｋＤａラミニン・レセプターを用いた薬物の新規なスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物を提供する。　被験化合物と６７ｋＤａラミニン・レセプターとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物が６７ｋＤａラミニン・レセプターに結合する場合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断する工程を含む、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のスクリーニング方法、並びに、それにより得られる薬物。

Description

明細書
6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセプターを用いた薬物のス ク リ ー二 ン,グ方法及びそれに よ り 得られる薬物 技術分野
本発明は 6 7 k D a ラ ミ ニ ン · レセプターを用いた薬物の ス ク リ ーニング方法及びそれに よ り 得 られる薬物に関する。 背景技術
6 7 k D a ラ ミ ニ ン ' レセプター （以下、 「 6 7 L R」 と 称する こ と も ある。 ） は、 2 9 5 個のア ミ ノ 酸をコー ドする m R N Aか ら翻訳された 3 7 k D a 前駆体蛋白質が、 細胞内 で脂肪酸等に よ る ァシル化重合反応を受けてホモ二量体また はへテ ロ 二量体化によ り 6 7 k D a と なった蛋白質であ り 、 それがイ ンテグ リ ン類と と も に細胞膜表面へ移行しては じめ て ラ ミ ニ ン ' レセプター と して機能する （Biochemistry, 1995, 34： 11276-11287 , T. H. Landowski ら、 J. Cell. Bioch em, 1998, 69: 244 251， S. Buto ら）。 また、 3 7 k D a 前 駆体蛋白質は、 リ ボソーム関連蛋白質 p 4 0 と して蛋白合成 に関与している こ と が、 さ ら には多剤耐性関与蛋白質 (M G r 1 - A g ) と して報告されていたも の と 同一である こ と 力 S 明 ら力 に さ ^ tている （Cell. Mol. Life Sci. ， 2002, 59:
1577-1583, Y. Shi ら） 。 こ の ラ ミ ニ ン ' レセプターの多 く の癌細胞での高発現と い う データ によ り 、 汎腫瘍特異的移植 抗原 と しての T細胞の免疫原 と して、 腫瘍胎児抗原である と 見な されている（Anticancer Research, 1999, 19: 5535— 5542， J. H. Coggin, Jr ら） 。 ラ ミ ニ ン ' レセプターは既に 6 7 L R以外に 1 0 数種類報告されている が、 その中でも 6 7 L R の癌 と の関連が強く 示唆されている。 6 7 L Rは多く の癌において癌細胞での検出の有無から、 ヒ ト癌患者の悪性度を示す重要な予後因子と して知 られてお り 、 Breast Cancer Research and ι' reatment , 1998， o2： 137-145 , S. Menard ら、 Clinical Cancer Research, 1997, 3： 227-231 , G. Fontanini ら、Clinical Cancer Research, 1996,
2： 1777-1780, F. Basolo ら、 J. Natl. Cancer Inst , 1991 , 83: 29-36， V. Cioce ら） 、 動物モデル等では癌細胞の増殖、 移動、 浸潤、 転移等に関与する こ と が示唆されている。 た と えば、 乳癌患者においては 6 7 L Rポジティ ブの患者の生存 率はネガティ ブな患者よ り 有為に低いこ と が報告されている。 6 7 L Rの リ ガン ドである ラ ミ ニンの発現は予後には影響な いが、 レセプター 6 7 L Rの発現は予後に負の結果をもた ら すこ と カ 不 れてレヽる (Breast Cancer Research and
Treatment , 1998, 52： 137-145 , S. Menard ら） 。
これらの知見を下に、 6 7 L Rの発現を抑制する こ と で抗 腫瘍効果を示すこ と を期待して行われた実験が幾つか報告さ れてレヽる。 6 7 L R のア ンチセ ンス R N Aを癌細胞株に導入 して作製した 6 7 L R低発現細胞株は、 元の親株細胞よ り も マ ウ ス のイ ンビボにおいて有為に腫瘍増殖能の低下並びに転 移能の低下が起 り 、 その結果マウス個体の生存率が改善する こ と が報告されている (British Journal of Cancer , 1999 , 80： 1115-1122, Κ. Satoh ら） 。 さ らには、 低 6 7 L R発現 細胞株は親株よ り も腫瘍血管新生の低下並びに血管新生促進 因子である V E G F の産生そのものも低下している こ と が報 告されている ( Cancer Letters , 2000, 153: 161— 168， M.
Tanaka ら） 。 同様に、 6 7 L Rに対する抗体を用いた腫瘍転 移実験においても、 ア ンチセ ンス実験と 同様な効果が見と め られている ( Jpn. J. Cancer Res. , 1999， 90: 425-431 , Κ. Narumi ら ) 。 非腫瘍関連においても、 6 7 L Rの機能について幾つか報 告がな されている。 虚血動物モデルにおいて誘導される新生 血管の増生が 6 7 L R と結合する ラ ミ ニ ン由来ぺプタイ ド (システィ ン一 ァ ス ノ、。ラ ギン酸一プロ リ ンー グ リ シンーチ ロ シン一イ ソ ロイ シン一 グ リ シンーセ リ ン一 アルギニ ン） や、 E G F 由来ぺプタイ ド （システィ ン一パ リ ン一イ ソ ロイ シン 一 ダ リ シン一チ ロ シン一セ リ ン一 ダ リ シンー ァスノヽ。ラギン酸 一アルギニン一 システィ ン） によ って抑制 さ れる こ と が報告 されている （Am. J. Pathol , 2002, 160： 307— 313, D.
Gebarowska ら） 。 血管内皮細胞に対する剪断力によ って誘導 される動脈硬化 と の関与が指摘されている e N O S発現 と N O産生が、 6 7 L R と結合する ラ ミ ニ ン由来ペンタぺプタイ ド （チ ロ シ ン一イ ソ ロ イ シ ン一 グ リ シ ン— セ リ ン一アルギニ ン）によ って抑制する こ と が報告されている（ J. Biol. Chem. ， 1999 , 274: 15996-16002, T. Gloe ら） 。
最近の報告では、 6 7 L Rがク ロイ ツ フ ェル ト ヤコ ブ病の 病因 と考え られている プ リ オン蛋白質の レセプター と して働 き、プ リ ォンが結合 してィ ンタナ リ ゼ一シ ョ ンされる こ と が、 その結合 と ィ ンタナ リ ゼーシ ョ ンが膜 ドメ イ ンを欠いた ミ ユ ータ ン ト 6 7 L R の分泌に よ って阻害される こ と が報告さ れている (EMBO J， 2001 , 20: 5863-5875, S. Gauczynski ら ) 。
6 7 L R はまた、 T細胞のサブセ ッ ト である C D 4 5 R O + / C D 4 5 R A— のメ モ リ 一細胞の C D 4 + C D 8 — また は C D 4 — C D 8 +のサブセ ッ ト群で発現 している こ と が報 告され、 6 7 L R の免疫系への作用が示唆されている （J. I mmunol , 1999， 163: 3430-3440, S. M. Canfield ら） 。
6 7 L Rの m R N A発現に関する報告も幾つか存在する。 癌抑制因子である P 5 3 ゃ抗癌因子である T N F —アルフ ァ 一、 I F N—ガンマ一によ つてその発現が抑制 される こ と が 幸 告されている ( Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1998, 251： 564-569, N. Clausse ら） 。 ただ し、 こ のよ う な多用な 機能に関与する と推定されている 6 7 L Rに対する低分子化 合物の報告はない。
一方、 カテキン類の う ち、 ェ ピガロ カテキ ンガ レー ト (以 下、 Γ E G C G J と称する こ と も ある。 ) は、 茶のカ テキ ン の約 5 0 %を占める主用成分である。 他に、 ェ ピガロ カテキ ン、 ェ ピカテキ ンガレー ト 、 ェ ピカテキ ン (以下それぞれ、 Γ E G C ] 、 Γ E C G ] 、 「 E C」 と称する こ と も ある） 等 が含まれる。
茶は古来よ り 薬と して用い られて来た古い歴史があ り 、 近 代よ り その効能 と成分の関係が解析されてき た。 その う ち E G C Gは 1 9 4 7 年、 A. Bradfield ら によ って発見された成 分である ( J. Chem. Soc. , 1947, 32： 2249, A. E. Bradf ie Id ら） 。
E G C G を含めて茶のカ テキ ン類の生理作用 と しては、 抗 酸化、 抗癌、 血漿コ レス テ ロ ール上昇抑制、 血圧上昇抑制、 血小板凝集抑制、 血糖上昇抑制、 痴呆予防、 抗潰瘍、 抗炎症、 抗ア レルギー、 抗菌 · 抗虫歯、 抗ウィルス、 解毒、 腸内フ ロ ーラ改善、 消臭等が報告されている (茶の機能、 村松敬一 郎 ら編、 学会出版セ ンター、 2002) 。
こ の う ち、 抗癌作用は非常に多 く 報告されてお り 、 抗変異 作用、 抗発癌プ ロ モーシ ョ ン作用、 抗腫瘍増殖抑制作用、 抗 浸潤 · 転移阻害作用、 抗血管新生阻害作用がある。 最近の報 告では、 E G C Gは白血病細胞の D N A合成を阻害 しアポ ト 一シス を誘導する こ と が （ Int. J. Mol. Med. , 2001， 7: 645-652, D. M. Smith ら） 、 また E G C Gが乳癌細胞株の増 殖を抑制する こ と が報告されている （J. Cell. Biochem. , 2001， 82: 387— 398， K. T. Kavanagh ら） 。 さ ら には、 E G C Gが正常細胞 と比べて癌細胞の増殖を強く 抑制する な どの 幸 告カ Sな されてレヽる （Arch. Biochem. Biophys , 2000, 376： 338-346, Ν. Ahmad ら） 。
浸潤 ' 転移に関 しては、 カテキン類がマ ト リ ゲルを用いた 浸潤試験で高転移性細胞の浸潤を抑制する こ と が、 また、 癌 細胞のフ ィ ブロ ネ ク チンゃラ ミ ニ ンへの接着を E G C Gが阻 害する こ と 力 S幸艮告されている （Cancer Lett. , 1995， 98: 27 - 31， M. Suzuka ら、 Cell Biol. Int.， 1993， 17: 559-564, M. Isemura ら、 Cancer Lett. , 2001 , 173： 15 - 20， Y. Suzuki ら） 。
さ ら に、 これらカテキ ン作用の分子 レベルの解析が最近報 告されてき ている。 た と えば、 E G C Gは癌 と の関連が示唆 されている H e r 一 2 抗原高発現細胞の増殖を濃度依存的に 抑制する。 その作用機序は H e r — 2 の リ ン酸化抑制によ る その下流シグナル伝達の阻害だ と報告されている （Cancer Res. ， 2002， 62： 652-655， S. Pianett i ら） 。
また、 腫瘍増殖と密接な関連がある血管新生を E G C G等 カ テキ ンが阻害する こ と が報告されている。 そのメ カ ニズム はカテ'キ ンが血管内皮細胞の増殖因子である V E G F の レセ プター V E G F R — 1 の リ ン酸化を抑制する こ と にある と 示 されている。 これはカテキ ンの抗酸化 · 抗ラ ジカル活性には 依存しない と幸艮告されている（ Cancer Res， 2002， 62: 381— 385， ώ . Lamy ら ) 。
同様に、 他の増殖因子である P D G F — B B によ る血管平 滑筋細胞での P D G F — Rベータの リ ン酸化をカテキ ン類が 抑制する こ と で、 血管の肥厚を抑制する こ と が報告されてい る ( FASEB J, 2002, 16: 893 - 895， A. Sachinidis ら） 。 さ らに、 E G F _ 2 によ るイ ンビポでの血管新生並びに内 皮細胞の增殖を E G C Gが抑制する こ と が報告されている
(Nature, 1999, 389： 381， Y. Cao ら） 。 E G C Gがアポ ト 一シスを誘導する F a s 蛋白質と結合する とい う報告がある 力 S (Biochem. Biophys. Res. Commun, 2001 , 285： 1102 - 1106， S. Hayakawa ら） 、 上記 E G C Gの作用が F a s を関与した ものなのか明 らかにされてお らず、 他に E G C G と相互作用 する因子の存在が示唆されている。
カテキンには抗腫瘍効果以外にも、 種々 の生理作用が分子 レベルで明 らかになってきている。 E G C Gは肝細胞でのグ ノレコース産生を抑制 し、 かつイ ンス リ ンレセプター と I R S
- 1 のチ ロ シン リ ン酸化を促進する こ と で抗糖尿病的作用 が報告されている ( J. Biol. Chem. ， 2002, 277: 34933-34940, M. E. Wal tner-Law ら ) 。
また、 パーキンソ ン モデル マウスにおいて E G C Gは 強く 神経保護作用を示す報告から （J. Biol. Chem. , 2002, 277: 30574-30580, Y. Levi tes ら ) 、 多く の神経障害を抑制 する こ と が期待されている。 了 レルギ一の要因である好塩基 球での F c ィ プシロ ン R I の発現を E G C Gやそのメ チルイ匕 体が抑制する こ と を ( J. Agric. Food Chem, 2002, 50:
5729-5734, Y. Fuj imura ら） 、 さ らには軟骨において I L 一 1 ベータ によ って誘導される C O X— 2や N O合成酵素 2 の 発現を E G C Gが抑制する こ と が報告されている (Free Radical Biology & Medicin, 2002， 33: 1097 - 2002， S. Ahmed ら） 。
しかし、 本発明者らが知る限 り 、 E G C Gが 6 7 L Rを介 して細胞増殖抑制因子等と して機能する こ と、 また、 6 7 L Rをターゲッ ト と して細胞増殖抑制作用等を有する低分子化 合物の薬物ス ク リ ーニングに利用可能なこ と に関 しては、 今 まで一切報告されていない。
(非特許文献 1 )
Biochemistry, 1995， 34 : 11276-11287
(非特許文献 2 )
J. Cell. Biochem, 1998, 69 : 244-251
(非特許文献 3 )
Cell. Mol. Life Sci. 2002, 59 : 1577-1583
(非特許文献 4 )
Anticancer Research 1999， 19 : 5535-5542
(非特許文献 5 )
Breast Cancer Research ana Treatment , 1998， o2： 1^7-145
(非特許文献 6 )
し linical cancer Research, 丄 997 3 : 227-231
(非特許文献 7 )
し linical し ancer Research, 上 996 2 : 1777-1780
(非特許文献 8 )
J. Natl. Cancer 丄 ris t， 1991， 8 29-36
(非特許文献 9 )
Breast し ancer Research and Treatment 1998 , 52 : 137-145
(非特許文献 9 )
British Journal of し ancer， 上 999， 80： 1115-1122
(非特許文献 1 0 )
し ancer Letters , 2000 , 153： 161-168
(非特許文献 1 1 )
Jpn. J. し ancer Res. ， 1999， 90 : 425-431
(非特許文献 1 2 )
Am. J. Pathol , 2002， 160： 307-313
(非特許文献 1 3 )
J. Biol. Chem. ， 1999， 274 : 15996-16002 (非特許文献 1 4 )
EMBO J, 2001 , 20: 5863-5875
(非特許文献 1 5 )
J. Immunol , 1999， 163: 3430 - 3440
(非特許文献 1 6 )
B i 0 chem. Biophys. Res. Commun. ， 1998 , 251： 564-569
(非特許文献 1 7 )
J. Chem. Soc. ， 1947, 32: 2249
(非特許文献 1 8 )
茶の機能、 村松敬一郎 ら編、 学会出版セ ンター、 2002
(非特許部件 1 9 )
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(非特許文献 3 3 )
Free Radical Biology & Medicin, 2002, 33: 1097 - 2002 発明の開示
本発明者は、 上記課題に鑑み鋭意検討した結果、 6 7 L R が細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活性 阻害作用、 神経保護作用、 抗ァ レルギ一作用、 抗動脈硬化作 用、 及び Zまたは、 ク ロイ ッフ ェル ト ヤコブ病感染阻害作用 を有する薬物のターゲッ ト と して使用可能なこ と を見出 し本 発明を完成するに至った。
即ち本発明は下記の通 り である。
[ 1 ] 被験化合物と 6 7 k D a ラ ミ ュン ' レセ プター と の結 合の度合いを定性的または定量的に測定し、 その測定結果よ り 被験化合物力 S 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセプターに結合する 場合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害 作用、 癌細胞の転移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レル ギー作用、 抗動脈硬化作用、 及びノまたは、 ク ロイ ツフ ェル ト ヤコブ病感染阻害作用を有する薬物である と判断する工程 を含む、 細胞増殖抑制作用 、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転 移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈 硬化作用、 及び/または、 ク ロイ ツフ ェル トヤコブ病感染阻 害作用を有する薬物のスク リ 一二ング方法。
[ 2 ]薬物が、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び/ または、 癌細胞の転移活性阻害作用を有する薬物である [ 1 ] 記載のス ク リ ーニング方法。
[ 3 ] [ 1 ]または [ 2 ]に記載のス ク リ ーユング方法によ り 得ら れる薬物。
[ 4 ]有効成分がガロイル基を有する化合物である [ 1 ]から [ 3 ]のいずれかに記載の薬物。
[ 5 ]化合物が、 カテキン類である [ 4 ]記載の薬物。
[ 6 ]カテキン類がェ ピガロ カテキン ガレー ト である [ 5 ]記 載の薬物。
[ 7 ]細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活 性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬化 作用、 及び/または、 ク ロ イ ツ フ エル ト ヤコブ病感染阻害作 用によ り 予防及び/または治療し得る疾患のために用い られ る [ 3 ]から [ 6 ]のいずれかに記載の薬物。
[ 8 ]細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び Zまたは、 癌細胞の転移活性阻害作用によ り 予防及び/または治療し得 る疾患のために用い られる [ 3 ]から [ 6 ]のいずれかに記載の 薬物。
[ 9 ]疾患が癌である [ 8 ]記載の薬物。
[ 1 0 ] [ 3 ]から [ 9 ]のいずれかに記載の薬物を化学合成方法 によ り製造する工程、 及び、 薬学的に許容され得る担体を配 合する工程を含む、 医薬品組成物の製造方法。
[ 1 1 ] [ 1 0 ]記載の製造方法によ り 得られる 医薬品組成物。
[ 1 2 ]ガロイル基を有する化合物及び被験化合物と 6 7 k D a ラ ミ ニン · レセ プターと の結合の度合いを定性的または定 量的に測定し、 その測定結果よ り 被験化合物と 6 7 k D a ラ ミ ニン . レセプター と の結合の度合いが、 ガロイノレ基を有 する化合物と 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセ プター と の結合の度 合いを上回る場合には、 その被験化合物がカテキン類が有す る薬理学的作用 と 同一の作用を有する薬物である と判断する 工程を含む、 薬物のス ク リ ーニ ング方法。
[ 1 3 ]ガロイル基を有する化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニン · レ セプターに対する結合と、 被験化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニ ン · レセ プターに対する結合と を競合させた結果、 被験化合 物の 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセ プターへの結合するサイ ト と 、 ガロイル基を有する化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニン · レセプタ —への結合するサイ ト と が、 同一の場合には、 その被験化合 物は、 ガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用 と 同 一の作用を有する薬物である と判断する工程を含む、 薬物の ス ク リ ーニ ング方法。
[ 1 4 ]ガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用が、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活性阻 害作用、神経保護作用、抗ア レルギー作用、抗動脈硬化作用、 及び/または、 ク ロイ ッフ ェル ト ヤコブ病感染阻害作用であ る [ 1 2 ]または [ 1 3 ]に記載のス ク リ ーニ ング方法。
[ 1 5 ]ガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用が、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び Zまたは、 癌細 胞の転移活性阻害作用である [ 1 2 ]または [ 1 3 ]に記載のス ク リ 一二ング方法。
[ 1 6 ]化合物がガロイル基を有するカテキン類である [ 1 2 ] から [ 1 5 ]のいずれかに記載のスク リ ーニング方法。
[ 1 7 ]カテキン類がェピガロ カテキン ガレー トである [ 1 2 ]から [ 1 5 ]のいずれかに記載のスク リ ーニング方法。 [ 1 8 ] [ 1 2 ]力 ら [ 1 7 ]のいずれかに記載のス ク リ ーニング 方法によ り 得られる薬物。
[ 1 9 ]細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移 活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬 化作用、 及び/または、 ク ロイ ツフ ェル トヤコブ病感染阻害 作用によ り 予防及び/または治療し得る疾患のために用い ら れる [ 1 8 ]に記載の薬物。
[ 2 0 ]細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、及び/または、 癌細胞の転移活性阻害作用によ り 予防及び/または治療し得 る疾患のために用い られる [ 1 8 ]または [ 1 9 ]に記載の薬物。
[ 2 1 ]疾患が癌である [ 2 0 ]記載の薬物。
[ 2 2 ] [ 1 8 ]から [ 2 1 ]のいずれかに記載の薬物を化学合成 方法によ り 製造する工程、 及び、 薬学的に許容され得る担体 を配合する工程を含む、 医薬品組成物の製造方法。
[ 2 3 ] [ 2 2 ]に記載の製造方法によ り 得られる医薬品組成物。
[ 2 4 ] 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセ プターと結合する化合物で あって、 ガロイル基を有する化合物が該 6 7 k D a ラ ミ ニ ン · レセ プターに結合するサイ ト と 同一のサイ トで結合する 化合物。
[ 2 5 ]化合物がカテキン類である [ 2 4 ]記載の化合物。
[ 2 6 ]カテキン類がェ ピガロ カテキン ガレー トである [ 2 6 ]記載の化合物。
[ 2 7 ] [ 2 4 ]から [ 2 6 ]のいずれかに記載の化合物を含む細 胞増殖抑制剤。
[ 2 8 ] [ 2 4 ]から [ 2 6 ]のいずれかに記載の化合物を含む血 管新生阻害剤。
[ 2 9 ] [ 2 4 ]から [ 2 6 ]のいずれかに記載の化合物を含む癌 細胞の転移活性阻害剤。
[ 3 0 ] [ 2 4 ]から [ 2 6 ]のいずれかに記載の化合物を含む抗 癌剤。 ' 図面の簡単な説明
第 1 図
実施例 1 の表面プラズモ ン共鳴センサによ る測定結果を示 す図である。
第 2 図
実施例 1 の細胞増殖試験の結果を示す図である。
第 3 図
実施例 1 の細胞増殖試験の結果を示す図である。
第 4 図
実施例 2 の フ ロ ーサイ ト メ ト リ 一によ る解析結果を示す図 である。
第 5 図
実施例 3 の細胞増殖試験の結果を示す図である。
第 6 図
実施例 3 の表面プラズモ ン共鳴セ ンサ によ る測定結果を示 す図である。
第 7 図
実施例 4 の表面プラズモ ン共鳴セ ンサ によ る測定結果を示 す図である。
第 8 図
実施例 4 の細胞増殖試験の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下本発明について詳細に説明する。
本発明は、 6 7 L Rをターゲッ ト とする薬物の新たなス ク リ 一二ング方法を提供する ものである。 本発明の一つの態様と しては、 被験化合物と 6 7 L R と の 結合の度合いを定性的または定量的に測定し、 その測定結果 よ り 被験化合物が 6 7 L Rに結合する場合にはその被験化合 物が細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活 性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬化 作用、 及び/または、 ク ロイ ツフ ェル トヤコプ病感染阻害作 用を有する薬物である と判断する工程を含む、 細胞増殖抑制 作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活性阻害作用、 神経 保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬化作用、 及び/また は、 ク ロイ ツフェル トヤコブ病感染阻害作用を有する薬物の ス ク リ ーユング方法が挙げられる。
本発明で用い られる 6 7 L Rはそれ自体公知の蛋白質であ り 、 例 ば、 G e n B a n k A c c e s s i o n N o . NM_002295登録 c D N A配列をも と に、 常法に従い本蛋白質 をコー ドする配列を挟み込むよ う にして種々のライ ブラ リ ー をテ ンプレー ト と して P C Rを行 う こ とで、 6 7 L Rの c D N Aを取得する こ と が容易に可能である。 また、 こ こ で得ら れた c D N Aを市販の種々の V e c t o r に蛋白発現が可能 な形で揷入する こ と で、 容易に本蛋白質を発現する細胞株 構築な らびに本蛋白質本体の取得が可能である。 これ以外に いく つかの c D N A取得と蛋白質発現の報告がある （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.， 1988， 85: 6394, H. You ら、 British Journal of Cancer , 1999， 80: 1115-1122， K. Satoh ら ， Biochemistry, 1995 , 34: 11276 - 11287， T. H. Lando ski ら）。
なお、 6 7 L Rは、 遺伝子と しては 3 7 k D a の 4 0 S リ ポソーム結合蛋白質であるが、 膜 発現する場合には 6 7 k D a と なる こ と が知 られている。 本発明においては、 膜に発 現する場合には 6 7 k D a と なる蛋白質であって、 ラ ミ ニン と結合する接着性を有する蛋白質であれば、 すべて本発明に おける 6 7 L R と して定義され、 完全な蛋白質だけでな く 、 その部分ペプチ ドを用いる こ と も可能である。 また、 6 7 L Rは、 ス ク リ ーニングの手段に応じて、 例えば、 精製した蛋 白質と して、 可溶型蛋白質と して、 担体に結合させた形態と して、 また、 他の蛋白質と の融合蛋白質と して、 適宜用いる こ と ができ る。
本発明においては被験化合物と 6 7 L R と を結合させる こ と によ り 、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の 転移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動 脈硬化作用、 及び/または、 ク 口イ ツフ ェル ト ヤコブ病感染 阻害作用を有する薬物をスク リ 一ユングする。 この と き、 被 験化合物の形態 と しては、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵 微生物産生物、 生物抽出物、 植物抽出物、 精製または粗精製 蛋白質、 ペプチ ド、 非ペプチ ド性化合物、 合成低分子化合物 、 天然化合物、 遺伝子ライ ブラ リ 一等、 通常薬物のス ク リ ー ユングに使用 される形態であれば良く 、特に制限はされない。
被験化合物と 6 7 L R と の結合は、 被験化合物の形態に応 じて適した手段が選択されるが、 例えば、 被験化合物を 6 7 L R発現細胞培養液中へ添加する方法等で行う こ と ができ る。 上記のよ う に して、 被験化合物と 6 7 L R と の結合の度合 いを測定するが、 こ こ で用い られる測定方法は、 定性的手段 及び定量的手段のいずれも用いる こ と が可能である。 結合度 合いを測定する手段の一例と しては、 後述の実施例で示すよ う な表面プラズモン共鳴センサを用いる方法が挙げられる。
こ う して結合度合いを測定した結果、 被験化合物が 6マ L Rに実質的に結合する場合には、 その被験化合物が、 細胞増 殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬化作用、 及び Z または、 ク ロイ ツフェル トヤコブ病感染阻害作用を有する薬 物である と判定される。 なかでも、 本発明のス ク リ ーニング 方法は、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び/また は、 癌細胞の転移活性阻害作用を有する薬物のス ク リ ーニ ン グに用いる こ と が好適である。
後述の実施例に示すよ う に、 細胞増殖抑制作用、 血管新生 阻害作用、 癌細 '胞の転移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ァ レルギ一作用、 抗動脈硬化作用、 及び/または、 ク ロ イ ツ フ エル トヤコブ病感染阻害作用を有する こ と が示唆されている ガロイル基を有する化合物が、 6 7 L Rに結合し、 その細胞 増殖を著しく 抑制している。
こ のこ と力 ら、 ガロイル基を有する化合物は、 6 7 L Rを 介して細胞増殖因子と して機能する こ とが示唆され、さ らに、 ガロイル基を有する化合物と 同様に 6 7 L Rに結合する物質 は、 ガロイル基を有する化合物と 同様の作用、 すなわち、 細 胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活性阻害 作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬化作用、 及び/または、 ク 口 イ ツ フ ェル ト ャコブ病感染阻害作用を有 する と考え られる。
従って、 本発明のス ク リ ーニ ング方法において、 6 7 L R と結合する被験化合物は、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害 作用、 癌細胞の転移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レル ギー作用、 抗動脈硬化作用、 及び、 ク ロ イ ツ フ ェル トヤコブ 病感染阻害作用を有する薬物である と判断でき る。
なお、 上記で挙げたガロイル基を有する化合物と しては、 ェピガロ カテキン ガレー ト及びその 3 —メ チノレ置換体ゃェ ピカテキン ガレー ト等のガロイル基を有するカテキン類、 ガロイル基を有するポ リ フエ ノ ール類、 ト リ ガロイルダルコ ース 、 ペ ンタガロイノレグノレ コ ー ス 、 ス ト リ ク チニ ン、 ピ ロ ガ ロール等が挙げられ、 好適には、 ェ ピガロ カテキン ガレー トが挙げられる。
次に本発明のス ク リ ーニング方法と して、 別の態様につい て説明する。
本発明における別の態様と しては、 6 7 L Rに加え、 さ ら にガロイル基を有する化合物を用いた薬物のス ク リ 一二ング 方法を提供する。 すなわち、 ガロイル基を有する化合物及び 被験化合物と 6 7 L R との結合の度合いを定性的または定量 的に測定し、 その測定結果よ り 被験化合物と 6 7 L R と の結 合の度合いが、 ガロイル基を有する化合物と 6 7 L R と の結 合の度合いを上回る場合には、 その被験化合物がガロイル基 を有する化合物が有する薬理学的作用 と 同一の作用を有する 薬物である と判断する工程を含む、 薬物のス ク リ 一二ング方 法が挙げられる。
また、 ガ口 ィ ノレ基を有する化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニン · レセプタ一に対する結合と、 被験化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニ ン · レセ プターに対する結合と を競合させた結果、 被験化合 物の 6 7 k D a ラ ミ ニ ン' レセプターへの結合するサイ ト と 、 ガロイル基を有する化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセプタ 一への結合するサイ ト とが、 同一の場合には、 その被験化合 物は、 ガロイル基'を有する化合物が有する薬理学的作用 と 同 一の作用を有する薬物である と判断する工程を含む、 薬物の ス ク リ 一二ング方法が挙げられる。
後述の実施例に示すよ う に、 6 7 L Rに対するモノ ク ロ一 ナル抗体は、 ガロイル基を有する化合物の 6 7 L Rへの結合 を阻害し、 その結果ガロイル基を有する化合物の細胞増殖抑 制効果を阻害している。 逆に、 ガロイル基を有する化合物は 抗 6 7 L R抗体の 6 7 L Rへの結合を阻害している。 即ち、 ガロイル基を有する化合物の結合部位と抗体認識部位が重な つ ている。 こ のこ と から、 ガロイル基を有する化合物及び被 験化合物を、 6 7 L Rへの競合反応に供する こ と によ り 、 被 験化合物がガロイル基を有する化合物と 同一のサイ ト に結合 する場合には、 その被験化合物はガロイル基が有する化合物 が有する作用 と 同一の作用を有する と考え られる。
本発明の別の態様である、 ガロイル基を有する化合物を使 用 しないス ク リ 一二ング方法についての詳細な説明を前述し たが、 それらの記载は、 ガロイル基を有する化合物を使用す る本発明の態様の場合にも適用 される。 なお、 こ こ で述べる 本発明の態様においてス ク リ ーユングに供されるガロィ'ル基 を有する化合物は、 例えば、 後述の実施例に示すよ う に P B S等の Buf f e r で適宜希釈して使用する と が可能である。また、 被験化合物と ガロイル基を有する化合物と を、 6 7 R L発現 細胞培養液中へ添加する こ と によ り それらの競合反応をおこ させる場合において、 被験化合物とガロイル基を有する化合 物の添加順序に特に制限はない。
上記のよ う に してス ク リ 一二ングされた薬物は、 細胞増殖 抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬化作用、 及び/ または、 ク ロイ ツフ ェル トヤコブ病感染阻害作用によ り 予防 及び/または治療し得る疾患のための薬物と して使用可能で ある。 これらの疾患の う ち、 本発明において最も好適な疾患 と しては癌が挙げられる。
なお、 本発明においては、 一旦薬物がス ク リ ーニングによ つて選択された後は、 その薬物は通常の化学合成方法等によ り 製造する こ と が可能である。 また、 薬学的に許容され得る 担体を配合する こ と も可能である。 すなわち、 本発明におい ては、 上記で示したス ク リ ーニング方法によ り 得られる薬物 を、 化学合成方法によ って製造する工程、 及び、 薬学的に許 容される担体を配合する工程を含む、医薬組成物の製造方法、 並びに、 当該製造方法によ り 得られる 医薬組成物もその要旨 に含まれる。
医薬組成物と して用いる場合において、 薬学的に許容され る担体と しては、 例えば、 生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸 濁剤、 界面活性剤、 安定化剤な どが挙げられ、 これら と薬物 と を適宜組合わせて製剤化して提供する こ と が可能である。 また、 患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射な どのほか、 経口的投与も可能であ り 、 薬物に応じ て、 また、 患者の体重や年齢、 症状等によ り 適宜選択する こ と ができ る。 投与量についても同様に、 薬物に応じて、 また は、 患者の体重や年齢、 症状等に応じて、 適当な投与量を選 択する こ と が可能である。 なお、 被験化合物が D N Aによ り コー ドされ得る も のであれば、 当該 D N Aを遗伝子治療用べ ク タ一に組込み、 遺伝子治療を行 う こ と も可能である。
本発明においては、 6 7 L R と結合する化合物であって、 ガロイル基を有する化合物が該 6 7 L Rに結合するサイ ト と 同一のサイ ト で結合する化合物も本発明のその要旨に含まれ る。 これらは、 後述の実施例に示すよ う に、 6 7 L Rに対す るモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 ガロイル基を有する化合物の 6 7 L Rへの結合を阻害し、 その結果ガロイル基を有する化合物 の細胞増殖抑制効果を阻害している こ と ； 逆に、 ガロイル基 を有する化合物は抗 6 7 L R抗体の 6 7 L Rへの結合を阻害 している こ と ； 即ち、 ガロイル基を有する化合物の結合部位 と抗体認識部位が重なっている こ と によ り 、 十分裏付け られ ている。 これらの化合物は、 ガロイル基を有する化合物が有 する作用 と 同一の作用を有する こ とが考え られるため、 細胞 増殖抑制剤、 血管新生阻害剤、 癌細胞の転移活性阻害剤、 す なわち、 抗癌剤 と しての使用が可能である。 実施例
以下に実施例を拳げて本発明を さ ら に詳細に説明する が、 本発明はこれに限定される も のではない。
材料および方法
( 1 ) . 細胞および細胞培養
本実験に用いた ヒ 卜肺力 ん細胞株 A549 ( ATCC Number： CCL-185) は 10% ゥ シ胎児血清 (FBS) (Bio Source
International ， Camarillo, CA) 添カロ ERDF 培地 （極東製薬） で 37°C、 水蒸気飽和 した 5 % C02 条件下で継代、 維持した。 ERDF 培地 1 L 中に 1.125 g の NaHC03 (和光純薬， Osaka, Japan) 'を加えた。 細胞は対数増殖期で培養維持 した。 ヒ ト パ —キ ッ ト リ ンパ腫細胞株 DND39 は、 5% FBS 添カロ RPMI— 1640 培地 (Nissui , Japan) で 37°C、 水蒸気飽和 した 5% C02 条 件下で継代、 維持した。 RPMI- 1640 培地中には 100 U/mL ぺ ニシ リ ン Meiji pharmaceutical し ompany, Tokyo , japanノ、 100 mg/mL ス 卜 レプ ト マイ シ ン (Meiji pharmaceutical Company) , 12.5 mM NaHC03 (和光純薬）、 そ して 10 mM HEPES (和光純薬） を添加 した。
( 2 ) . 緑茶カ テキ ン
緑茶力 テ キ ン epigallocatecnin-3-O-gallate (EGし G)、 epicatechin-3-0-gallate (ECii)、 epigal locatecnin (EirC)、 epicatechin ( EC )ヽ catechin (し)、
epigallocatechin— 3— (3— 0— methyl)_gallate (EGCG3〃Me) fま 5 mM の濃度 と な る よ う に リ ン酸バ ッ フ ァー （PBS ) に溶解 した。 使用する 際には適宜解凍して用いた。 PBS は、 超純水 1 L に 対し、 NaCl (Nacalai tesque , Inc. ) 8.0 g、 KC1 (Nacalai t esque , Inc. ) 0.2 g、 Na2HP04 (Nacalai tesque, Inc. ) 1.15 g、 KH2P04 (Nacalai tesque, Inc. ) 0.2 を溶解し調製 した。 Caffeine および quercetin は Nacalai t e s que , Inc. よ り 購入し、 前者は PBS に後者はジメ チルスルホキシ ド（DMS0 ) (Nacalai tesque, Inc. ) に 5 mM の濃度 と なる よ う に懸濁 し 調製 した。
( 3 ) . 試薬および機器
ト リ パンブルー （和光純薬） を 1 %の濃度 と なる よ う に PBS に懸濁し、 121°C、 20 分オー ト ク レーブ滅菌 した。
All-trans-retinoic acid ( ATRA) は Sigma (St. Louis , MO) よ り 購入しエタ ノ ールに溶解した。
RNA 抽出に用レヽた TRIzol は Invitrogen (Carlsbad, CA) よ り 購入した。 0.1 %ジェチルピロ カーボネー ト （ DEPC ) 水は Sigma (St. Louis , Μ0) カ ら貝冓入した。 RNA溶角军に用いた DEPC 溶液は DEPC が終濃度 0.1% と なる よ う に蒸留水に加えて 2 時間攪拌 した後、 ォー ト ク レーブして調製した。
01igotex-dT30 およびヒ ト月台盤由来 RNase イ ン ヒ ビター ^ Takar a (Kyoto, Ja an よ り 、 Mo 1 oney mur ine leukemia virus (MMLV)—逆転写酵素は Amer sham Pharmacia Biotech (Bu ckinghamshire , UK) よ り 購入した。 プライ マ ー等のオ リ ゴヌ ク レオチ ドは BIOSYNTHESIS (Japan) に合成を依頼 した。 Taq DNA polymerase は Fermentas (Vilnius , L ι thuani aノ、 Ex Taq は Takar a よ り 購入 した。 Polymerase chain reaction ( PGR ) は GeneAmp PGR System 2400 、 Park in - E lme r， Tokyo , Japan) を使用 した。 ァガロ ー ス はウル ト ラ ピュ アァガロ ー ス
( Sawaday recnnology , Tokyo , Japan ) を使用 した。
ク ロ ーニングのベク ターは、 pTAI!GETTM Mammalian
Expression Vector System ^ r omega , Madison, W I ) を用い た。 精製には QIAGEN Plasmid Midi Kit または、 EndoFree Plasmid Maxi Kit (と も に QIAGEN) を用いた。 LB 培地は Bacto Tryptone (Becton Dickinson, Sunnyvale , CA) 10 g および Bacto Yeast Extract (DIFCO LABORATORIES, Detroit , MI) 5 g、 NaCl 5 g を超純水で 1 L に溶解し、 ォ 一 ト ク レーブした。 60°Cに冷ま して力、 ら、 150 mg/mL の ア ン ピシ リ ン (ア ンピシ リ ンナ ト リ ウ ム (和光純薬） を 150 mg/mL と なる よ う に超純水に溶解後、フ ィ ルター滅菌 した） を 1000 mL カロえた。 LB プレー ト は Bacto Tryptone 2 g、 Bacto Yeast Extract 1 g、 NaCl 2 g、 Bacto Agar (DIFCO) 5 g カロ え、 超純水 200 mL に溶解しオー ト ク レーブした。 60°Cに冷 ま して力、 ら、 150 mg/mL のア ンピシ リ ンを 200 mLカロえ、 10 mL dish (Falcon) に 10 ずつ分注した。 I sopr opyl-b-D (_)- thiogalactopyranoside ( IPTG) は禾ロ光純薬よ り 購入 し、 0.1 M になる よ う に調製 した。
5-Bromo-4-chloro-J-indolyl-b-D-galactopyranoside
(X gal) (和光純薬） を 20 mg/mL と なる よ う に N - N-dimethy 1-f ormamide (禾ロ光純薬） ίこ溶角军した。 S0C 【ま、 Bacto Tryptone 3 g、 Bacto Yeast Extract 0.75 g、 NaCl 0.078 g、 KC1 0.027 g、 H20 を全量が 148.5 mL になる まで加えた。 こ の溶液をォ 一 ト ク レーブした。 これと は別にオー ト ク レーブした 2 M Mg2+ 液 (12.324 g の MgS04 · 7H20、 10.165 g の MgCl2 · 6H20 を超純水に混ぜ 50 mL に した） を 1.5 mL カ卩えた。 こ の溶液 100 mL に 1 mL の 2 M グル コ ース を加えて作成 した。
DNA シーケ ンサ一は ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Tokyo , Japan) を用レヽ、 その際、 ABI PRISM B i gDy e™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits Version 2.0 (A lied Biosystems) を用いた。 Template Sup r e s s i on Reagent (TSR) は Applied Biosystems よ り 購 入した。 遺伝子導入には、 FuGENE" 6 Transfection Reagent (Roche Diagnistics Gmbh , Mannheim, Germany ) を用いて行った。
フ ロ ーサイ ト メ ト リ ー角旱析用の抗ヒ ト Laminin Receptor 抗体は NEOMARKERS(Fremont， CA) よ り購入した。 ネガティ ブ コ ン ト ロ ーノレ抗体のマウス IgM抗体は Zymed Laboratories , Inc. , San Francisco , CA) を用レヽに。 Fluorescein
isothiocyanate (FITC) 標識抗マ ウス IgM ャギ抗体は
Southern Biotechnolo y Associates , Inc (Birmingham, Aし) よ り購入した。 フ ロ ーサイ ト メ ーターには、 FACSCalibur (Becton Dickinson) を使用 した。
( 4 ) . RNA 抽出および cDNA 合成
あ らかじめ 1 mM ATRAで 37°C、 24時間処理した細胞を PBS で洗浄した後、 1 X 107 cells に対し 1 inL の Trizol をカロ えて速やかに懸濁して完全に溶解させた。 室温に 5分間静置 後、 0.2 mL のク ロ 口 ホルムを添力 B して激しく 転倒攪拌した。 室温に 3分間静置後、 12000 x g、 4°Cで 15分間遠心した。 遠 心上清に 0.5 mL の 2-プロパノ ールを添加して激しく 転倒攪 拌し、 室温に 10 分間静置後、 12000 X g、 4°Cで 10 分間遠心 した。 こ の上淸を除去し、 1 mL の 75 %エタ ノ ールで沈殿を リ ンス した。 12000 X g、 4°Cで 5分間遠心後、 上淸のエタ ノ ールを出来る限 り 除去し、 沈殿した トータル RNA を 20 mL の DEPC 水に溶解させた。 cDNA 合成は以下に示すよ う に した。 まず、 10 mg の ト ータル RNA に 0.5 mg/mL の （dT)2。 プラ イマ一を 1 mL 加え、 70°Cに 10分間置いた後、 直ちに氷冷す る こ とでアニー リ ングを行った。 次に、 10 mM dNTP を 2 mL、 RNase inhibitor ¾r 0.1 mL、 MMLV 逆転写酵素に添付された 5 X ノ ッ フ ァーを 4 mL カ卩え、 DEPC 水で全量力 S 20mL と なる よ う に した。 こ の混合液を 37°Cに 1 時間置き cDNA を合成し、 97°Cに 5分間置き酵素を失活させた。 ( 5 ) . 67 kD a Lam inin receptor (67LR) 発現ベク ターの構 築
DND39 細胞を 1 mM ATRA で 37 °C、 2 時間処理 した後、 RNA 抽出を行い cDNA を合成 した。 Fun- length cDNA (Yow et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 85: 6394 - 6398 (1988) ) を参 考に してプライ マーを作成した (H-LamininR-F;
5 ATGTCCGGAGCCCTTGATGTCC - 3'、 H-LamininR-R； 5 '- TTAAGACCAGTCAGTGGTTGCTC — 3' )。 プライ マー ま 20 mM iこ調整 した。 合成した cDNA 1 mL、 Ex Taq 0.1 mL、 10 x Taq ノ ッ フ ァー 2 mL、 2.5 mM dNTP 1.6 mL, プライ マーをおのおの 0.5 mL、 dH20 14.3 mL を懸濁 して、 PCR を行った。 条件は、 初期 変性 95°Cで 5分間、 変性反応 94°Cで 30秒間、 ァニー リ ング 58°Cで 30秒間、 伸長反応 72°Cで 30秒間行い、 変性反応、 ァ ニー リ ングおよ び伸長反応を 25サイ クル行った。 1.2 %ァガ ロ ースゲルで電気泳動を行い、 目 的のバ ン ドを Wizard SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega) を用いて精製した。 こ のシーケ ンス を行い、 目 的も のである こ と を確認した。 T4 DNA Li gas e 10 x b u i f e r 丄 mし、 TARGE i "M Vector 1 mし、 T DNA L ι as e 1 mL および PCR 産物 2.82 mし、 dH20 4.18 mL 加えて 4°Cに —晚置き ライ ゲーシ ヨ ンを行った。 以下は、 サブク ロ ーニ ン グ と 同様の操作を行った。 コ ロ ニー PCR で正逆判定を行い、 コ ロ ニーを白金耳で拾って LB培地に移し、 37°C、 150 rpmで ー晚振と う 培養 した。 これを集菌 し、 EndoFree Plasmid Maxi Kit で精製 した。 こ のシーケ ンス を行い、 67LRである こ と を 確認した。
( 6 ) . 67LR の一過性発現系の構築
構築した 67LR 発現ベク ター （PTAI?GET- hLamininR) を FuGENE™ 6 Transfection Reagent を用レヽて A549 糸田胞 ίこ導 入した。 詳細は以下に述べる と お り である。 細胞を 1 X 104 cells/mL (10% FBS-ERDF 培地） に調整して播き込んだ。 24 時間、 37°Cに置き細胞を接着させた後、 チューブに新たに ERDF 培地を取 り FuGENETM 6 (遺伝子量の 3倍） を直接加え、 穏やかに混ぜた。 次に pTARGET- hLamininR を力 Dぇ穏ゃ力、に混 ぜ、 室温に 30分間置いた。 これを、 培地中に加え 48時間、 37°Cに置いた。 培地で洗浄後、 新鮮な培地に変えた。
( 7 ) . 67LR 強制発現細胞に及ぼす各種成分の影響
67LR一過性発現細胞に対して、 各種成分を種々 の濃度添加 し、 5%FBS 含有 ERDF 培地で 37°C、 48.時間処理した。 処理 後、 細胞数の計測および ト リ パ ンブルー染色法によ る生存率 の測定を行った。
また、 EGCG 前処理に関しては、 終濃度 10 μ g/mL (1% FBS 含有 ERDF培地） の抗 67LR抗体を 37°C、 30分間処理した後、 EGCG処理を行い、 抗体処理細胞に対する影響も検討した。 ネ ガティ ブコ ン ト ロールと してマウス lgM でも同様の処理を 行った。
( 8 ) . 67LR 強制発現細胞に対する各種成分の結合性解析 各種成分 5 IX U と細胞と の結合性を表面プラズモ ン共鳴セ ンサ SPR670 (Nippon Laser and Electronic Lab .， Nagoya , Japan) によ り 測定した。 測定はまず、 タ ンパク質等の標準的 な固定化法を用レ、て細胞を金膜（Nippon Laser and
Electronic Lab. ) に固定した。 10 mM の 4, 4-Dithio dibutyric acid ； DDA (東京化成工業， Tokyo , Japan) エタ ノール溶液 （10 mLの 99%エタ ノ ール中に 2.38 mg の DDA を 溶解し、 エタ ノ ールでさ らに 1/100 に希釈した） に金膜を浸 して （金の面を上に） 穏やかに室温で 30分間攪拌した。次に、 エタ ノールで 2 回、 金表面に水圧をかけないよ う に洗浄し自 己組織化膜 （ SA 膜） を導入した。 25 mg 水溶性カルボジィ ミ ド ； EDC (和光純薬） を 1 mL 超純水に、 15 mg N-hydroxysuc cinimide ； NHS (禾ロ光純薬） を 9 mL 1 , 4-Dioxane (Nacalai tesque , Inc. ) にそれぞれ溶解した。 それぞれの溶液を混合 し、 SA 膜処理済の金膜を浸して、 穏やかに室温で 10分間攪 拌した。 これに 10 mL の超純水を加え、 さ らに室温で 5分 間攪拌した。 超純水で 2 回、 金表面に水圧をかけないよ う に 洗浄し、 乾燥 （風乾）させてカー ト リ ッ ジにマウ ン ト した。 細 胞を 3 X 105 cells/mL (フ ロ ーパッ フ ァーである PBS) に調 整し、 金膜上に 20 μ L滴下し 30分間室温において細胞を固 定化した。 その後、 PBS で 1、 10、 25、 50 μ Μ に希釈した緑 茶カテキンを注入し、 表面プラズモン共鳴角度 （Angle) の変 化を測定する こ と で細胞への結合性をモニター した。
また、 EGCG と抗 67LR抗体と の結合競合性試験は、 終濃度 10 μ g/mL (1% FBS含有 ERDF 培地） の抗 67LR 抗体を 37°C、 30分間処理した後、 細胞を金膜に固定化し表面プラズモン共 鳴センサを用いて上記同様に行った。 こ の際、 ネガティ ブ コ ン ト ロールと してマウス igM でも同様の処理を行い測定 した。
( 9 ) . フ ロ ーサイ ト メ ト リ ー解析
67LR は細胞表面に発現している こ と が知 られている ので、 糸田胞表面上【こ発現した 67LR を抗ヒ 卜 Laminin Receptor
(LR) 抗体を用いたフ ローサイ ト メ ト リ ー解析によ り検出 し た。細胞を回収し、 1.5 mLエツペン ドルフチューブで総量 100 μ L の 1% FBS-PBS 中に細胞カ S 1 X 106 cells 含まれる よ う に調整し、 1 次抗体と して抗ヒ ト LR抗体を終濃度 10 μ g/mL となる よ う に添加した。 4°Cで 30分間イ ンキュベー ト した後、 PBS で一回洗浄した。 次に、 2次抗体と して LR 抗体のアイ ソタイ プを認識する抗マウス IgM FITC 標識抗体を総量 25 μ し の 1% FBS-PBS 中で終濃度 12.5 μ g/mL と なる よ う に添 加した。 4°Cで 30分間ィ ンキュベー ト した後に PBSで 2 回洗 浄し、 再び、 PBS に再懸濁しフ ロ ーサイ ト メ一ターによ り解 析を行った。 ネガティ ブコ ン ト ロ ール IgM 抗体を同じ濃度 (10 IX g/mL) で反応させた。 細胞表面 67LR 発現量は LR の 蛍光強度の中央値で示した。
また、 EGCG処理が 67LR細胞表面発現に及ぼす影響を検討 するために、 1 次抗体を作用 させる前に、 終濃度 50 μ Μ と なる よ う に調製した EGCG添カ卩 1% FBS- PBS で細胞を処理し、 37 °Cに 30分間置いた。 これを、 PBS で一度洗浄した。 以降は 上述の作用を 1 次抗体から行い、測定を行った。また、 EGCG を 含まない 1 % FBS-PBS でも処理を行い、 対照群と した。
( 1 0 ) . 統計計算
実験結果の統計処理には、 Student's, t 検定を用いた。 実施例 1 EGCG の細胞結合性および増殖活性に及ぼす 67LR 遺伝子導入の影響
67し R 発現べク ター (pTARGET- hLamininR) を FuGENE™ 6 Transf ect ion Reagent を用いて 以下の方法によ り A549 糸田 胞に導入した。 細胞を 1 X 104 cells/mL (10% FBS-ERDF 培 地） に調整して播種した。 24時間後、 チューブに新たに ERDF 培地を取 り FuGENETM 6 (遺伝子量の 3倍） を直接加え、 穏ゃ かに混ぜた。 次に種々 の濃度で pTARGET- hLamininR を力卩ぇ穏 やかに混ぜ、 室温に 30分間置いた。 これを、 培地中に加え 48時間、 37°Cに培養を継続した。 こ の 67LR —過性発現細胞 に対して、 EGCG を各種濃度で添加し、 5%FBS 含有 ERDF 培 地で 37°C、 48時間処理した。 処理後、 細胞数の計測および ト リ パ ンブルー染色法によ る生存率の測定を行った。
結果、 67LR を一過性に発現させた細胞において EGCG濃度 依存的に細胞増殖抑制が認め られた。 また、 細胞に導入させ た 67LR遺伝子量に比例 して細胞増殖の抑制も認め られた。 67LRは細胞膜に存在する膜タ ンパク質であ り、 こ の遺伝子 の発現ベク ターを導入した細胞で EGCG の効果が増強された こ と は、 EGCG の結合性が増大したためではないかと考え られ る。 そこで、 この細胞に対する EGCG の結合性を表面プラズ モン共鳴セ ンサによ り 測定した。 EGCG は 5 μ Μ で用いた。
まず、空ベク ターを導入した Α549細胞では、若干 の Angle の変化 （結合量） しか観察されなかったのに対し、 67LR発現 ベク ターを導入した細胞では、 0.25 IX g 導入細胞ですでに Angl e の大幅な増大が認め られ、 さ らに 0.5 μ g 導入した細 胞ではよ り いっそ う の増大が認め られた。 こ の こ と によ り 、 67LR発現べク ター導入によ り EGCGの細胞表面への結合性が 増大する こ と が示された。
実施例 1 の結果を図 1 、 図 2及び囪 3 に示す。 実施例 2 67LR の細胞表面発現量の測定
67LR 発現べク ターを導入する こ とで、 EGCG の細胞表面へ の結合性が増大する こ と は示された。 そこ で、 こ の結合性の 増大が実際に細胞膜上に 67LR 発現が増大したためであるか フ ロ ーサイ ト メ ト リ一を用いて検討した。
まず、 細胞表面の 67LR の発現量の測定を行った。 コ ン ト ロールの A549 細胞で若干の発現が認め られた。 この細胞に 空ベク ター (0.5 μ g ) を導入した細胞ではその発現量にほと んど影響は認め られなかった。 と こ ろが、 67LR発現べク ター (0.5 μ g) を導入した細胞では、発現量が大幅に増えてお り 、 こ のこ と力ゝら、 細胞表面に 67LR が発現している こ と が明 ら かになった。
さ らに、 EGCG がこ の 67LR を介して結合しているかを明白 にするため、 抗 67LR 抗体を作用 させる前に EGCG を作用さ せた。 する と、 コ ン ト ロール細胞で認め られていた 67LR の 発現が見かけ上、 無く なつていた。 また、 こ の現象は、 空べ ク タ一を導入した細胞でも同様であった。 さ らに、 67LR導入 細胞でも同様であった。 こ のこ と は、 EGCG をあ らかじめ細胞 に作用 させる こ と で、 細胞表面の 67LR に EGCG が先に結合 して しまい、 抗 67LR 抗体が細胞膜上の 67LR に結合できな く なつたため、 みかけ上 67LR の発現が検出されなかった と 考え られる。
これらの結果から、 67LR発現ベク ターを導入する こ とで細 胞表面の 67LR発現が増大する こ と が明 らかにな り 、 EGCGの 結合性の増大が 67LR の細胞膜発現増大である こ と が示され た。 また、 こ の 67し R を介して EGCG は細胞へ結合する こ と が示唆された。 すなわち、 67LRが EGCG の受容体である と示 された。
実施例 2 の結果を図 4 に示す。 実施例 3 EGCG の結合性および増殖抑制活性に及ぼす抗 67
LR 抗体の影響
こ こ までで、 67LR を介して EGCG が細胞へ結合し、 増殖抑 制活性を発現している こ と が示された。 これをよ り 明 らかに するため、 今度は 67LR 強制発現細胞に抗 67LR 抗体であ ら かじめ処理を行った上で、 EGCG の結合性および増殖抑制活性 に影響が認め られないか検討を行った。
まずは、 結合性に及ぼす抗体の影響を表面プラズモ ン共鳴 センサによ り 検討した。 抗 67LR抗体を作用 させる と、 Angle の変化量から EGCG の結合速度および結合量自体の減少が認 め られた。 そ う した効果は陰性コ ン ト ロール抗体では見られ なかった。
また、 EGCGのがん細胞増殖抑制に及ぼす抗体の影響も検討 した。 67LR 強制発現細胞ではわずか 0. 1 μ M の濃度の EGCG でも増殖抑制活性が認め られるが、 EGCG を作用 させる前に抗 体処理を行った と こ ろ、 その増殖抑制効果が消失した。 こ の 時、 生存率には影響は認め られなかった。 この結果よ り 、 EGCG の結合のみな らず、 増殖抑制活性も 67LR への EGCG の結合 を介して行われる こ と が示された。
実施例 3 の結果を図 5及び図 6 に示す。 実施例 4 他の茶成分の結合性および増殖抑制活性に及ぼす 67LR 発現の影響
EGCG 力 s 67LR を介して細胞膜に結合する こ と 、 また、 がん 細胞増殖抑制活性を発現している こ と を示してきた。 こ の 67LR を介した効果が EGCG特有のものか検討を行った。 そこ で、他の茶成分と して、主要な緑茶カテキンと して ECG、EGC、 EC、 C および強い抗ァ レルギ一作用を持ち生体内で安定に存 在する と報告がある EGCG3"Me を用いた。カテキン同様に様々 な生理機能を有している caffeine, また、 同様に多く の生理 機能が報告されている フラバノ ール類の一種であ quercetin も検討した。
まず、 67LR 強制発現細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。 これまでと 同様に、 0.5 μ g の pTARGET- hLamininR を A549細 胞に リ ポフエ ク シ ヨ ン法によ り 導入し、 48時間、 37°Cで培養 後の細胞に対して各種の茶成分を終濃度 5 μ Μ と なる よ う に 作用させた。 この状態で、 さ らに 37°Cで 48時間培養後の細 胞数および生存率の測定を行った。 その結果、 C、 EC、 EGC、 caffeine および quercetin では遺伝子の導入の有無に関わ らず、 生存率および細胞数には影響は認め られなかった。 一 方、 EGCG 同様にガロイル基を有してレヽる ECG および
EGCG3"Me では、 EGCG 同様な増殖抑制効果が認め られた。 こ の結果から、 ガロイル基を有する よ う な成分は 67LR 強制発 現細胞で増殖抑制活性を発現する こ とが示唆された。
また、 67LR強制発現細胞への各種茶成分の結合性を表面プ ラズモン共鳴バイ オセンサによ り測定した。 A549細胞に対し て C、 EC, EGC は結合性を示さず、 これは 67LR 強制発現細 胞でも変化は認め られなかった。 また、 c af f e i ne および Q uercetin も細胞結合性を示さず、 強制発現細胞でも変化は認 め られなかった。 ECG および EGCG〃3Me はいずれも EGCG ほ どではないも のの、 細胞結合性を示してお り 、 67LR強制発現 細胞ではこ の結合性が増大する こ と が明 らかになった。
実施例 4 の結果を図 7及び図 8 に示す。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセプターをター ゲッ ト とする薬物の新規なス ク リ ーニ ング方法が提供可能で める。 なお、 本出願は、 特願 2 0 0 3 — 0 9 7 6 5 2号を優先権 主張して出願されたものである。

Claims

請求の範囲
1 . 被験化合物と 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセ プターと の結合 の度合いを定性的または定量的に測定し、 その測定結果よ り 被験化合物が 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセ プターに結合する場 合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作 用、 癌細胞の転移活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギ 一作用、 抗動脈硬化作用、 及び/または、 ク ロイ ツフェル ト ヤコブ病感染阻害作用を有する薬物である と判断する工程を 含む、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移 活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬 化作用、 及び/または、 ク ロ イ ツ フ ェル トヤコブ病感染阻害 作用を有する薬物のス ク リ 一二ング方法。
2 . 薬物が、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び/ または、 癌細胞の転移活性阻害作用を有する薬物である請求 項 1 記載のス ク リ ーユング方法。
3 . 請求項 1 または 2 に記載のス ク リ ーニ ング方法によ り 得 られる薬物。
4 . 有効成分がガロイル基を有する化合物である請求項 1 か ら 3 のいずれかに記載の薬物。
5 . 化合物が、 カテキン類である請求項 4記載の薬物。
6 . カテキン類がェピガロ カテキン ガレー ト である請求項
5記載の薬物。 '
7 . 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活 性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬化 作用、 及び/または、 ク ロイ ツ フ ェル トヤコプ病感染阻害作 用によ り 予防及び/または治療し得る疾患のために用い られ る請求項 3 から 6 のいずれかに記載の薬物。
8 . 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び/または、 癌細胞の転移活性阻害作用によ り 予防及び/または治療し得 る疾患のために用い られる請求項 3 から 6 のいずれかに記载 の薬物。
9 . 疾患が癌である請求項 8記載の薬物。
1 0 . 請求項 3 から 9 のいずれかに記載の薬物を化学合成方 法によ り 製造する工程、 及び、 薬学的に許容され得る担体を 配合する工程を含む、 医薬品組成物の製造方法。 求項 0記載の製造方法によ り 得られる 医薬品組成 物
1 2 . ガロイル基を有する化合物及び被験化合物と 6 7 k D a ラ ミ ニン · レセ プターと の結合の度合いを定性的または定 量的に測定し、 その測定結果よ り被験化合物と 6 7 k D a ラ ミ ニン ' レセ プター と の結合の度合いが、 ガロイル基を有す る化合物と 6 7 k D a ラ ミ ニン · レセ プター と の結合の度合 いを上回る場合には、 その被験化合物がガロイル基を有する 化合物が有する薬理学的作用 と 同一の作用を有する薬物であ る と判断する工程を含む、 薬物のス ク リ ーニ ング方法。
1 3 . ガロイル基を有する化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニン * レ セプタ一に対する結合と、 被験化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニ ン ' レセ プターに対する結合と を競合させた結果、 被験化合 物の 6 7 k D a ラ ミ ニン'レセプターへの結合するサイ ト と、 ガロイル基を有する化合物の 6 7 k D a ラ ミ ニン . レセプタ 一への結合するサイ ト と が、 同一の場合には、 その被験化合 物は、 ガロイル基が有する化合物が有する薬理学的作用 と 同 一の作用を有する薬物である と判断する工程を含む、 薬物の ス ク リ 一二ング方法。
1 4 . ガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用が、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移活性阻 害作用、神経保護作用、抗ア レルギー作用、抗動脈硬化作用、 及び/または、 ク 口イ ツフ ェル ト ヤコブ病感染阻害作用であ る請求項 1 2 または 1 3 に記載のス ク リ ーニング方法。
1 5 . ガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用が、 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び/または、 癌細 胞の転移活性阻害作用である請求項 1 2 または 1 3 に記載の ス ク リ ーニ ング方法。
1 6 . 化合物がカテキン類である請求項 1 2 から 1 5 のいず れかに記載のス ク リ ーニ ング方法。 ' 1 7 . カテキン類がェピガロ カテキン ガレー トである請求 項 1 2 から 1 5 のいずれかに記載のス ク リ ーニング方法。
1 8 . 請求項 1 2 から 1 7 のいずれかに記載のス ク リ ーニ ン グ方法によ り 得られる薬物。
1 9 . 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 癌細胞の転移 活性阻害作用、 神経保護作用、 抗ア レルギー作用、 抗動脈硬 化作用、 及び/または、 ク ロイ ツフ ェル ト ヤコブ病感染阻害 作用によ り 予防及び/または治療し得る疾患のために用い ら れる請求項 1 8 に記載の薬物。
2 0 . 細胞増殖抑制作用、 血管新生阻害作用、 及び、 癌細胞 の転移活性阻害作用によ り予防及び/または治療し得る疾患 のために用い られる請求項 1 8 または 1 9 に記載の薬物。
2 1 . 疾患が癌である請求項 2 0記載の薬物
2 2 . 請求項 1 8 から 2 1 のいずれかに記載の薬物を化学合 成方法によ り 製造する工程、 及び、 薬学的に許容され得る担 体を配合する工程を含む、 医薬品組成物の製造方法。
2 3 . 請求項 2 2 に記載の製造方法によ り 得られる医薬品組 成物。 2 4 . 6 7 k D a ラ ミ ニン · レセプターと結合する化合物で あって、 ガロイル基を有する化合物が該 6 7 k D a ラ ミ ニ ン · レセ プターに結合するサイ ト と 同一のサイ トで結合する 化合物。 2 5 . 化合物がカテキ ン類である請求項 2 4記載の化合物。
2 6 . カテキン類がェピガロ カテキン ガレー トである請求 項 2 5記載の化合物。
2 7 . 請求項 2 4から 2 6 のいずれかに記載の化合物を含む 細胞増殖抑制剤。
2 8 . 請求項 2 4 から 2 6 のいずれかに記載の化合物を含む 血管新生阻害剤。
2 9 . 請求項 2 4 から 2 6 のいずれかに記載の化合物を含む 癌細胞の転移活性阻害剤。 3 0 . 請求項 2 4 から 2 6 のいずれかに記載の化合物を含む 抗癌剤。
PCT/JP2004/004772 2003-04-01 2004-04-01 ６７ｋＤａラミニン・レセプターを用いた薬物のスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物 WO2004090541A1 (ja)

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AT04725184T ATE499613T1 (de) 2003-04-01 2004-04-01 Verfahren zum screening eines arzneistoffs unter verwendung eines 67 kda grossen lamininrezeptors
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