WO2004079009A1 - Ｄｎａ増幅法およびそのためのキット - Google Patents

Ｄｎａ増幅法およびそのためのキット Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a DNA amplification method and a kit therefor, and a method for detecting DNA using the DNA amplification method and a kit therefor.
  • Amplification of DNA such as a gene is an important technique in genetic testing and the like, and amplification methods such as PCR and LAMP using DNA polymerase are known.
  • the PCR method is a method of amplifying DNA by using a heat-resistant DNA polymerase and two primers to repeat the denaturation, annealing, and elongation reactions in a temperature cycle (for example, (Refer to 4-1-1 67957) o
  • the LAMP method is a method of amplifying DNA at a constant temperature using a strand displacement type DNA polymerase and four primers recognizing six regions (for example, see WO 00/28082 pamphlet). ). Disclosure of the invention
  • the conventional method has the following problems.
  • the amplification efficiency of DNA is, in principle, twice as high per cycle.
  • the LAMP method designing primers is difficult.
  • an object of the present invention is to provide a method for amplifying DNA, which has high amplification efficiency and allows easy primer design.
  • the present inventors have solved the above-mentioned problems by using a pair of additional primers having a complementary sequence at the 5 ′ end in addition to a normal pair of primers in the PCR method and partially changing the conditions.
  • the present invention was completed.
  • the present invention provides the following.
  • a method for detecting a target DNA comprising amplifying the target DNA by the method of (1) and detecting an amplification product.
  • kits for use in the method of (5), wherein an additional sense primer and an antisense having an oligodeoxyribonucleotide having a first additional sequence linked to the 5 ′ end of the sense primer An additional antisense primer in which an oligodeoxyribonucleotide having a second additional sequence complementary to the first additional sequence is linked to the 5 'end of the primer, wherein the Tm of the additional sequence is a sense
  • the kit which is lower than the Tm of the primer and the antisense primer.
  • the kit of (7) including a probe for real-time PCR.
  • oligodeoxyribonucleotides having complementary sequences can be performed in the same manner as in ordinary PCR, except that a pair of additional primers added to the terminus are additionally used, and the primer design is easier than in the LAMP method. Furthermore, the amplified products are linked to each other by the additional portion of the additional primer, so that the number of amplified sequences increases more than two-fold per cycle. As the amplification efficiency increases, it is expected that the time for real-time detection using a probe will be shortened and the signal will increase. And, no special additional equipment is required in addition to the equipment required to carry out normal PCR. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 4 is a diagram showing the progress of generation of an amplification product. Dotted line: normal primer pair + additional primer pair, solid line: normal primer pair only. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • sense and antisense are used to indicate the relative relationship between one strand of double-stranded DNA and its complementary strand, and the sense strand is not necessarily the transcript. It does not indicate a chain having the same base sequence. The value is calculated by the nearest neighbor method.
  • Add invention amplification method is a method of amplifying a D NA by PCR using sense and antisense primers, oligo de O carboxymethyl ribonucleotides having a first additional sequence 5 5 end of the sense primer is linked PCR was performed in the presence of an additional antisense primer to which an oligodeoxyribonucleotide having a second additional sequence complementary to the first additional sequence was linked to the 5 'end of the sense primer and the antisense primer.
  • the Tm of the additional sequence is lower than the Tm of the sense primer and the antisense primer, and the annealing temperature in PCI is initially a temperature at which the additional sequence does not anneal. It is characterized in that the annealing temperature is changed.
  • the amplification method of the present invention usually comprises the following steps.
  • the annealing temperature is initially set to a temperature at which the additional sequence does not anneal, and is changed to a temperature at which the additional sequence anneals in the middle.
  • the amplification method of the present invention uses an additional primer pair consisting of an additional sense primer and an additional antisense primer, and is performed in accordance with a normal PCR method except that the annealing temperature is lowered during the PCR. Can be.
  • a primer pair consisting of a sense primer and an antisense primer can be set in the same manner as a general method for setting a primer pair in PCR.
  • the length and Tm of the sense primer and the antisense primer are usually 50 to 72 ° C for a 15mer to 40mer, preferably 55 to 70 ° C for a 25mer to 32mer.
  • the lengths of the sense primer and the antisense primer need not be the same, the tin of the sense primer and the antisense primer may be almost the same (usually, the distance is within 2 ° C). preferable.
  • the additional sense primer is one in which an oligodeoxyribonucleotide having the first additional sequence is linked to the 5 'and 5' ends of the sense primer, and the additional antisense primer is provided at the 5 'end of the antisense primer.
  • An oligodeoxyribonucleotide having a second additional sequence complementary to the first additional sequence is linked.
  • An intervening sequence may exist between the additional sequence and the sequence of the sense or antisense primer as long as the effect of the amplification method of the present invention can be obtained. Usually 1 to 10 A sequence of bases may be present. The length of this intervening sequence may be different between the additional sense primer and the additional antisense primer.
  • the first additional sequence is usually at 45 to 67 ° C. for a 15 mer to 30 mer, preferably at 50 to 65 ° C. for an 18 mer to 23 mer. Since the second additional sequence is complementary to the first additional sequence, the length and Tm are the same as the first additional sequence.
  • the Tm of the additional sequence is lower than the Tm of the sense primer and the antisense primer (the lower Tm when both Tm are different), and preferably 5 ° C or more.
  • the design of the additional sequence is similar to the design of a normal primer except that it has a Tm as described above, and other necessary conditions such as avoiding a sequence that may form an intramolecular higher-order structure are used. It can be done with consideration.
  • the ratio between the additional sense primer and the additional antisense primer is preferably 1: 1 (molar ratio).
  • the amount of the additional primer pair consisting of the additional sense primer and the additional antisense primer is usually 0.1 to 1 times (molar) the amount of the primer pair consisting of the sense primer and the antisense primer. Ratio).
  • the annealing temperature is a temperature at which the additional sequence does not anneal at the beginning of PCR, and is changed to a temperature at which the additional sequence anneals in the middle of PCR.
  • DNA fragment 10 2 to 10 5 molecules or 1 ⁇ mOng / ⁇ .1
  • primers (1) and (2) are designed as a sense primer and an antisense primer.
  • primers (3) and (4) are designed as additional sense primers and additional antisense primers.
  • Primer (1) with the first additional sequence (additional sequence 1) added to the 5 'end has primer (3)
  • primer (2) has the second additional sequence (additional sequence 2) added to the 5 and 5 ends.
  • the result is primer (4).
  • Additional sequence 1 and additional sequence 2 are complementary.
  • annealing is performed at a temperature at which the additional sequence does not anneal, so that the target site (monomer) is amplified by the PCR reaction (1> in Fig. 1).
  • the additional monomer has an additional sequence, it is difficult for the first type MA containing the target site as a part to be easily annealed, but as the number of monomers increases, the additional primer also anneals ( Figure 1 middle 2>).
  • the amplification of the monomers by the primers (1) and (2) also proceeds until the reaction reaches a plateau (3> in FIG. 1).
  • the present invention also provides a kit for use in the amplification method of the present invention (the amplification kit of the present invention).
  • This kit is characterized by containing the additional sense primer and the additional antisense primer described above.
  • the additional sense primer and the additional antisense primer are as described above with respect to the amplification method of the present invention.
  • the amplification kit 1 of the present invention may further contain, in addition to the additional sense primer and the additional antisense primer, reagents required for performing PCR.
  • each primer and other reagents may be housed separately, or a part of them may be a mixture.
  • the detection method of the present invention includes amplifying a target DNA by the amplification method of the present invention and detecting an amplification product.
  • Detection of an amplification product in the detection method of the present invention can be performed according to a general method for detecting an amplification product, but since the number of target sequences in one molecule of the amplification product is not constant, specific detection of the target sequence is performed. It is preferable to use a simple detection method. For example, oligonucleotides labeled with fluorescent dyes that change their fluorescence when bound to amplification products Real-time PCR that measures the fluorescence by performing PCR in the presence of a peptide (for example, a hybridization probe designed to hybridize to single-stranded DNA and change the fluorescence intensity when hybridized) You may go for it.
  • a detection method since the amplification efficiency of the target sequence increases, it is preferable to use a detection method depending on the number of the target sequences.
  • a detection method includes, for example, real-time detection using a probe. Real-time detection using a probe is expected to shorten the detection time and increase the signal.
  • the present invention also provides a kit for use in the detection method of the present invention (the detection kit of the present invention).
  • This kit is characterized by containing the additional sense primer and the additional antisense primer described above.
  • the additional sense primer and the additional antisense primer are as described above with respect to the amplification method of the present invention.
  • the detection kit of the present invention may further contain, in addition to the additional sense primer and the additional antisense primer, reagents required for detecting the PCR and the amplification product. Preferably, it contains a probe for real-time detection.
  • each primer and other reagents may be housed separately, or a part of them may be a mixture.
  • Primers (1) to (4) and probes having the following nucleotide sequences were prepared based on the nucleotide sequence of known chlamydia latent plasmid pLGV440 (GenBank accession number X06707).
  • the additional sequence 1 and the additional sequence 2 in the primers (3) and (4) are complementary.
  • the Tm of the primers (1) and (2) are 65 ° C and 64.8 respectively. C, and the Tm of the additional sequence was 60.6 ° C.
  • Tm was calculated according to the nearest base pair method. 5.
  • Modification of the end of the probe with BOD IPY FL (Molecular Probes) is the usual method. Was performed according to Table 2
  • Genomic DNA (200 copies) 1 jul
  • Fluorescence (excitation: 495 nm, detection: 525 nm) was detected in steps of 15 sec. Under these conditions, the fluorescence is quenched when the probe hybridizes to the amplification product, and the production of the amplification product can be detected by a decrease in the fluorescence intensity.
  • Fig. 4 shows the results.
  • the dotted line shows the results when primers (1) to (4) were used (normal primer pair + additional primer pair), and the solid line shows the results when only primers (1) and (2) were used (normal primer pair only).
  • Each result is shown. From these results, it was found that the use of the primers (3) and (4) in addition to the primers (1) and (2) increased the production of amplification products. Therefore, it is clear that the presence or absence of the latent plasmid PLGV440 can be determined with higher sensitivity.
  • a method for amplifying DNA which has high amplification efficiency and allows easy primer design.

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Abstract

センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲによるＤＮＡの増幅方法において、センスプライマーの５’末端に第１の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端に、第１の付加配列に相補的な第２の付加配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライマーの存在下でＰＣＲを行い、前記付加配列のTmは、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーのTmよりも低く、ＰＣＲにおけるアニーリングの温度は、初期においては前記付加配列がアニーリングしない温度とし、途中で前記付加配列がアニーリングする温度に変更する。

Description

明細書
DNA増幅法およびそのためのキヅト 技術分野
本発明は、 DNA増幅法およびそのためのキットならびにその DNA増幅法を 利用した DN Aの検出法およびそのためのキットに関する。 背景技術
造伝子等の DNAの増幅は、 遺伝子検査等において重要な技術であり、 DNAポ リメラ一ゼを利用した、 PCR法、 LAMP法等の増幅法が知られている。
PCR法は、 耐熱性の DNAポリメラ一ゼ、 2つのプライマーを用いて、 温度サ ィクルにより DNAの変性、 ァニ一リング及び伸長の反応を繰り返して D N Aを 増幅する方法である （例えば、 特公平 4一 67957号公報参照） o
LAMP法は、 鎖置換型 DNAポリメラ一ゼ、 6つの領域を認識する 4つのブラ イマ一を用いて、 一定温度で DNAを増幅する方法である （例えば、 国際公開第 WO 00/28082号パンフレツト参照） 。 発明の開示
従来の方法には、 以下のような問題点がある。 PCR法は、 DNAの増幅効率 は原理的に 1サイクル当たり最大で 2倍である。 LAMP法は、 プライマーの設 計が難しい。
従って、 本発明は、 増幅効率が高く、 かつ、 プライマーの設計が容易な D N A の増幅方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、 P CR法において、 通常のプライマ一対に加えて、 5' 末端に 相補的な配列を有する追加プライマ一対を用いるとともに条件を一部変更するこ とによって、 上記課題が解決されることを見出し、 本発明を完成した。
本発明は、 以下のものを提供する。
( 1 ) センスプライマーおよびアンチセンスプライマ一を用いる P CRによる D N Aの増幅方法において、 センスプライマーの 5， 末端に第 1の付加配列を有す るオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマーおよびァ ンチセンスプライマーの 5， 末端に、 第 1の付加配列に相補的な第 2の付加配列 を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスプライ マ一の存在下で P CRを行い、 前記付加配列の Tmは、 センスプライマ一およびァ ンチセンスプライマーの Tmよりも低く、 P CRにおけるァニ一リングの温度は、 初期においては前記付加配列がァニーリングしない温度とし、 途中で前記付加配 列がァニーリングする温度に変更する前記方法。
(2) 前記付加配列の Tmが、 センスプライマ一およびアンチセンスプライマーの Tmよりも 5 °C以上低い、 ( 1 ) の方法。
(3) ( 1) の方法に用いるためのキットであって、 センスプライマ一の 5， 末 端に第 1の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加 センスプライマ一およびアンチセンスプライマ一の 53 末端に、 第 1の付加配列 に相補的な第 2の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレ才チドが連結され た追加アンチセンスプライマーを含み、 前記付加配列の Tmは、 センスプライマー およびアンチセンスプライマーの Tmよりも低い、 前記キヅト。
(4) 前記付加配列の ¾が、 センスプライマ一およびアンチセンスプライマーの Tmよりも 5 °C以上低い、 (3) のキッ ト。
(5) (1) の方法により目的 DNAを増幅し、 増幅産物を検出することを含む、 目的 DNAの検出方法。
(6) 検出を、 リアルタイム PCRにより行う ( 5 ) の方法。
(7) (5) の方法に用いるためのキットであって、 センスプライマ一の 5 ' 末 端に第 1の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加 センスプライマ一およびアンチセンスプライマ一の 5， 末端に、 第 1の付加配列 に相補的な第 2の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結され た追加アンチセンスプライマ一を含み、 前記付加配列の Tmは、 センスプライマー およびアンチセンスプライマーの Tmよりも低い、 前記キヅ ト。
(8) リアルタイム P CR用のプローブを含む （7) のキット。
本発明によれば、 相補的な配列を有するオリゴデォキシリボヌクレ才チドを 5 ' 末端にそれそれ付加した追加プライマ一対を追加的に用いる以外は、 通常の P C Rと同様に実施でき、 プライマーの設計が L AM P法に比べて容易である。 さ らに、 追加プライマーの付加部分により増幅産物同士が連結するため、 増幅され る配列が 1サイクル当たり 2倍を超えて増加する。 増幅効率が増加するので、 プ ロープを用いたリアルタイム検出の時間短縮やシグナルの増加が期待される。 そ して、 通常の P C Rを実施するのに必要な装置に加えて特別な追加的装置を必要 としない。 図面の簡単な説明
図 1〜図 3は、 本発明の方法の原理の説明図である。
図 4は、 増幅産物の生成の経過を示す図である。 点線：通常プライマー対 +追 加プライマ一対、 実線：通常プライマー対のみ。 発明を実施するための最良の形態
本明細書において、 「センス」 および 「アンチセンス」 の語は、 二本鎖 D N A の一方の鎖とそれに相補的な鎖との相対的な関係を示す意味で用い、 センス鎖が 必ずしも転写産物と同じ塩基配列を有する鎖を示すものではない。 また、 値は 最近接塩基対 (Nearest Neighbor)法により算出した値である。
< 1 >本発明増幅方法およびそのためのキット
本発明増幅方法は、 センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いる P C Rによる D NAの増幅方法であって、 センスプライマーの 5 5 末端に第 1の 付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加センスブラ イマ一およびアンチセンスプライマーの 5 ' 末端に、 第 1の付加配列に相補的な 第 2の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加アン チセンスプライマーの存在下で P C Rを行い、 前記付加配列の Tmは、 センスプラ イマ一およびアンチセンスプライマーの Tmよりも低く、 P C I こおけるァニーリ ングの温度は、 初期においては前記付加配列がアニーリングしない温度とし、 途 中で前記付加配列がアニーリングする温度に変更することを特徴とする。 本発明増幅方法は、 通常には以下の工程を含んでなる。
(a) テンプレート、 センスプライマー、 アンチセンスプライマー、 センスプライ マーの 5 ' 末端に第 1の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連 結された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの 5 ' 末端に、 第 1の付加配列に相補的な第 2の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチ ドが連結された追加アンチセンスプライマーを準備する工程。 この工程において、 前記付加配列の Tmは、 センスプライマ一およびアンチセンスプライマーの Tmより も低い。
(b) 追加センスプライマーおよび追加アンチセンスプライマーの存在下で、 テン プレート、 センスプライマー、 および、 アンチセンスプライマーを用いる P C R を行う工程。 この工程において、 アニーリングの温度は、 初期においては前記付 加配列がァニーリングしない温度とし、 途中で前記付加配列がァニーリングする 温度に変更する。
本発明増幅方法は、 追加センスプライマ一と追加アンチセンスプライマ一から なる追加プライマー対を用い、 ァニ一リングの温度を P C Rの途中で低下させる ことの他は、 通常の P C Rの方法に従って行うことができる。
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなるプライマー対は、 通 常の P C Rにおけるブラィマー対の設定方法と同様にして設定することができる。 センスプライマー及びアンチセンスプライマ一の長さ及び Tmは、 通常には、 15me r〜40merで 50〜72°C、 好ましくは 25mer〜32merで 55~70°Cである。 センスプライ マー及びアンチセンスブラィマーの長さは同一でなくてもよいが、 センスプライ マーとアンチセンスプライマーの Tinはほぼ同一 (通常には、 相遠が 2 °C以内) で あることが好ましい。
追加センスプライマ一は、 センスプライマーの 5， 末端に第 1の付加配列を有 するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結されたものであり、 追加アンチセン スプライマーは、 アンチセンスプライマ一の 5 ' 末端に、 第 1の付加配列に相補 的な第 2の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結されたもの である。 付加配列とセンスまたはアンチセンスプライマーの配列との間には、 本 発明増幅方法の効果が得られる限り介在配列が存在してもよい。 通常には 1〜10 塩基の配列が存在してもよい。 この介在配列の長さは追加センスプライマーと追 加アンチセンスプライマーとの間で異なっていてもよい。
第 1の付加配列は、 通常には、 15mer〜30merで 45〜67°C、 好ましくは 18mer〜2 3merで 50〜65°Cである。 第 2の付加配列は第 1の付加配列と相補的なので、 長さ 及び Tmは第 1の付加配列と同じである。 付加配列の Tmは、 センスプライマー及び アンチセンスプライマーの Tm (両者の Tmが異なる場合に低い方の Tm) より低く、 好ましくは 5 °C以上低い。 付加配列の設計は、 上記のような Tmを有するようにす る他は、 通常のプライマーの設計と同様に、 分子内高次構造の形成の可能性のあ る配列を避けるなどの必要条件を考慮して行うことができる。
追加センスプライマーと追加アンチセンスプライマーとの比率は 1 ： 1 (モル 比） であることが好ましい。 追加センスプライマーと追加アンチセンスプライマ 一とからなる追加プラィマー対の量は、 センスプライマ一とアンチセンスプライ マ一とからなるプライマー対の量に対して、 通常には 0 . 1〜 1倍 (モル比) で ある。
P C Rは、 二本鎖 DNAを変性させ一本鎖 DNAにし (変性工程) 、 プライマーを一 本鎖 DNAと対合させ （アニーリング工程） 、 DNAポリメラーゼによりプライマーの 3'末端側へ鎖を伸長させる (伸長工程) ことを繰り返すことにより行われる。 本発明増幅方法においては、 アニーリングの温度は、 P C Rの初期においては 前記付加配列がァニーリングしない温度とし、 P C Rの途中で前記付加配列がァ ニーリングする温度に変更する。
これらの工程は、 一つの反応液を用いて、 通常の PCR法と同様にサ一マルサイ クラ一により行うことができる。
代表的な P C R反応液の組成を挙げれば、 以下の通りである。 表 1
DNA断片 （テンプレート） 102〜105分子または 1 ■mOng/μ.1
プライマ一 200〜； LOOOnM
追加プライマー 200〜； LOOOnM
ヌクレオチド 各 200〃M
DNAポリメラ一ゼ 0.5〜2.5単位/〃 1
Tris-HCl(pH 7〜8) 10〜20mM
MgC 12 1.5〜 5 mM
KC 1 50〜； lOOmM
界面活性剤またはゼラチン 0.：!〜 2%
25-100// 1) また、 代表的な温度サイクルを挙げれば、 以下の通りであり、 この温度サイク ルを通常 25〜35回繰り返す。
(1) 変性、 94〜98°C、 10〜30秒
(2) アニーリング、 初期 （通常には最初の 5〜15サイクル） ： 50〜65°Cヽ 10〜30 秒、 後期： 60〜95°C、 10~30秒
(3) 伸長、 70〜74°C、 20〜60秒
以下、 本発明増幅方法の原理を、 図 1〜 3を参照して説明する。
標的配列に基づき、 センスプライマ一及びアンチセンスプライマ一としてプラ イマ一（1)及び (2)を設計する。 また、 設計されたプライマー（1)及び (2)に基づき 追加センスプライマー及び追加アンチセンスプライマ一としてプライマー（3)及 び (4)を設計する。 プライマー（1)の 5'端に第 1の付加配列 (付加配列 1 ) を付加 したものがプライマー (3)、 プライマー (2)の 5，端に第 2の付加配列 （付加配列 2) を付加したものがプライマー (4)である。 付加配列 1と付加配列 2とは相補的で ある。
P CRの初期においては、 付加配列がァニーリングしない温度でァニーリング が行われるため、 PCR反応により標的部位 （モノマー） が増幅される （図 1中く 1>) 。 追加モノマ一は、 付加配列を有するため標的部位をその一部として含む最初の錶 型 MAにはァ二一リングしにくいが、 モノマーが増えてくるに従い、 追加プライ マーもアニーリングするようになる （図 1中く 2>) 。 この間 （及びアニーリング 温度変更後） 、 プライマ一（1 )及び (2)によるモノマーの増幅も反応がプラトーに 達するまで進む （図 1中く 3>) 。
ァニーリングの温度を付加配列がアニーリングする温度に変更すると、 付加配 列のァニーリングが生じる。 末端の付加配列で一本鎖 DNAがアニーリングして生 じたハイブリツ ドは、 各鎖がプライマー及びテンプレートとして機能して二本鎖 DNA (連結産物） を生じる （図 2中く 4>) 。 また、 追加プライマ一は、 連結産物の 一本鎖 DNAにハイプリダイズすることでき、 これにより生じたハイプリヅドもニ 本鎖 DNAを生じる。 このような様々な反応が起こり得るため、 全体としての反応 がブラトーに達しにく くなり、 通常の PCRを行うより目的配列が多量に増幅され る （図 3中 <5>) 。 従って、 目的配列に特異的なプローブを用いる検出方法を用 いた場合には、 そのプローブがハイプリダイズする部分が多量に増幅されるため、 強いシグナルが得られる （図 1中く 3>及び図 2中く 4>) o
本発明は、 本発明増幅方法に用いるためのキット （本発明増幅キット） も提供 する。 このキットは、 上記の追加センスプライマ一及び追加アンチセンスプライ マーを含むことを特徴とする。
追加センスプライマーおよび追加アンチセンスプライマ一については、 本発明 増幅方法に関し、 上記に説明した通りである。
本発明増幅キッ 1、は、 追加センスプライマーおよび追加アンチセンスプライマ 一の他に、 P C Rを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。 本発明増幅キットにおいて各プライマー及びその他の試薬類は、 別個に収容さ れていてもよいし、 それらの一部が混合物とされていてもよい。
< 2 >本発明検出方法およびそのためのキット
本発明検出方法は、 本発明増幅方法により目的 D N Aを増幅し、 増幅産物を検 出することを含む。
本発明検出方法における増幅産物の検出は、 通常の、 増幅産物の検出方法に従 つて行うことができるが、 増幅産物の一分子における目的配列の数は一定ではな いので、 目的配列に特異的な検出方法を用いることが好ましい。 例えば、 増幅産 物に結合した際に、 蛍光が変化するように蛍光色素で標識されたォリゴヌクレオ チド （例えば、 一本鎖 D N Aにハイブリダィズし、 ハイプリダイズしたときに蛍 光強度が変化するように設計されたハイブリダイゼ一ションプローブ等） の存在 下で P C Rを行って蛍光を測定するリアルタイム P C Rにより検出を行ってもよ い。
本発明増幅方法によれば、 目的配列の増幅効率が上昇するので、 目的配列の数 に依存する検出方法を用いることが好ましい。 このような検出方法としては、 例 えば、 プローブを用いるリアルタイム検出が挙げられる。 プローブを用いるリア ルタイム検出では、 検出の時間短縮やシグナルの増加が期待される。
本発明は、 本発明検出方法に用いるためのキット （本発明検出キット） も提供 する。 このキットは、 上記の追加センスプライマー及び追加アンチセンスプラィ マ一を含むことを特徴とする。
追加センスプライマ一及び追加アンチセンスプライマーについては、 本発明増 幅方法に関し、 上記に説明した通りである。
本発明検出キヅトは、 追加センスプライマ一および追加アンチセンスプラィマ 一の他に、 P C Rおよびノまたは増幅産物の検出を行うのに必要とされる試藥類 をさらに含んでいてもよい。 好ましくは、 リアルタイム検出用のプローブを含む。 本発明検出キットにおいて各プライマー及びその他の試薬類は、 別個に収容さ れていてもよいし、 それらの一部が混合物とされていてもよい。 実施例
以下に、 本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例 1 クラミジァ (Chlamydia trachomatis) の潜在プラスミ ド（cryptic plasmid) pLGV440の検出
既知のクラミジァの潜在プラスミ ド pLGV440の塩基配列 （GenBankァクセヅショ ン番号 X06707) に基づいて下記の塩基配列を有するプライマー（1 )〜（4)及びプロ —ブを調製した。 プライマー (3)及び (4)における付加配列 1と付加配列 2とは相 補的である。 プライマ一（1 )及び (2)の Tmはそれそれ 65°C及び 64.8。Cであり、 付加 配列の Tmは 60.6°Cであった。 ここで、 Tmは最近接塩基対法に従って算出した。 プ 口一ブの 5，末端の BOD IPY FL (モレキュラープロ一ブ社）による修飾は通常の方法 に従って行った。 表 2
プライマー
(1)： AGCTCTGGGAGCATGTTCTTAGTCTCAGCAG (配列番号 1 )
(X06707の塩基番号 5171〜5200に相当）
(2)： TCGCGTAGGGCTTAGAATCACCTTCTCGTAC (配列番号 2)
(X06707の塩基番号 5276〜5246に相当）
(3) ： CCTGATCAGGGTGCTTGCGAGAGCTCTGGGAGCATGTTCTTAGTCTCAGCAG (配列番号 3 ) (付加配列 1 +(1))
(4) ： CTCGCAAGCACCCTGATCAGGTCGCGTAGGGCTTAGAATCACCTTCTCGTAC (配列番号 4) (付加配列 2 +(2))
プローブ
(BODIPY FL)-CAAAGCTAGAACAACGCCGCCTTCCATTCTTGATGC-(リン酸化） （配列番号 5 ) (X06707の塩基番号 5245〜5210に相当）
ATCC株 CT- VR878から通常の方法により分離精製を行って得たクラミジァのゲノ ム DNAを錶型として、 下記の反応液組成及び反応条件で DNAの増幅を行った。 表 3
反応液組成
Figure imgf000011_0001
10x Gene Taq ノ s'ヅファ一 Z. ,5 μ\
各 2.5 mM ATP，UTP，GTP，CTP 2 jul
プローブ（5/iM) 0. ,5 μ\
プライマ一（1)(100〃M) 0. ,125 jul
プライマー（2)(100〃M) 0. ,125 ul
プライマ一（3)(100 /M) 0. ,125 ul
プライマー（4)(100〃M) 0. ,125 μ.1
Figure imgf000011_0002
ゲノム DNA(200コピー） 1 jul
最終液量 25 1
* Gene Taq (二ツボンジーン） 表 4
反応条件
95°C, 1 min
(95。C， 15 sec 67°C, 15 sec 72°C, 30 sec) x 10サイクル
(95°C3 15 sec 62°C， 15 sec 72°C, 30 sec) x40サイクル
72°C, 3 min
67°C， 15 secと 62。C， 15 secのステップで蛍光 （励起： 495nm、 検出： 525nm) を検出した。 この条件では、 増幅産物にプローブがハイブリダィズすると蛍光が 消光するので、 増幅産物の生成を蛍光強度の減少により検出できる。
また、 プライマーとしてプライマ一（1)及び (2)のみを用いる他は同条件で増幅 を行つ 7こ。
結果を図 4に示す。 点線は、 プライマ一（1)〜(4)を用いた場合 (通常プライマ 一対 +追加プライマー対) 、 実線は、 プライマ一（1)及び（2)のみを用いた場合 (通常プライマー対のみ) の結果をそれぞれを示す。 この結果から、 プライマ一 (1)及び (2)に加えてプライマー（3)及び (4)を用いることにより、 増幅産物の生成 が増加することが判明した。 従って、 潜在プラスミ ド PLGV440の有無をより高感 度で判別し得ることが明らかである。 産業上の利用の可能性
増幅効率が高く、 かつ、 プライマーの設計が容易な DN Aの増幅方法が提供さ れる。

Claims

請求の範囲
1 . センスプライマ一およびアンチセンスプライマ一を用いる P C Rによる D N Aの増幅方法において、 センスプライマーの 5 ' 末端に第 1の付加配列を有 するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加センスプライマ一および アンチセンスプライマーの 5 ' 末端に、 第 1の付加配列に相補的な第 2の付加配 列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結された追加アンチセンスブラ イマ一の存在下で p C Rを行い、 前記付加配列の Tmは、 センスプライマ一および ァンチセンスブラィマーの Tmよりも低く、 P C Rにおけるァニ一リングの温度は、 初期においては前記付加配列がァニーリングしない温度とし、 途中で前記付加配 列がァニーリングする温度に変更する前記方法。
2 . 前記付加配列の Tmが、 センスプライマーおよびアンチセンスプライマー の Tmよりも 5 °C以上低い、 請求項 1記載の方法。
3 · 請求項 1記載の方法に用いるためのキットであって、 センスプライマー の 5， 末端に第 1の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結さ れた追加センスプライマ一およびアンチセンスプライマーの 5， 末端に、 第 1の 付加配列に相補的な第 2の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが 連結された追加アンチセンスプライマーを含み、 前記付加配列の Tmは、 センスプ ライマ一およびアンチセンスプライマ一の Tmよりも低い、 前記キヅト。
4 . 前記付加配列の Tmが、 センスプライマ一およびアンチセンスプライマー の Tmよりも 5 °C以上低い、 請求項 3記載のキット。
5 . 請求項 1に記載の方法により目的 D N Aを増幅し、 増幅産物を検出する ことを含む、 目的 D N Aの検出方法。
6 . 検出を、 リアルタイム P C Rにより行う請求項 5記載の方法。
7 . 請求項 5に記載の方法に用いるためのキッ トであって、 センスプライマ 一の 5 ' 末端に第 1の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチドが連結 された追加センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの 5 ' 末端に、 第 1 の付加配列に相補的な第 2の付加配列を有するオリゴデォキシリボヌクレオチド が連結された追加アンチセンスプライマーを含み、 前記付加配列の Tmは、 センス プライマ一およびアンチセンスプライマーの Tmよりも低い、 前記キヅト。 · リアルタイム P CR用のプローブを含む請求項 7記載のキヅト。
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