CN100352940C - Dna扩增方法及其使用的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种使用正义引物和反义引物通过PCR扩增DNA的方法，该方法在存在如上附加引物的条件下进行：具有寡脱氧核苷酸的附加正义引物，所述寡脱氧核苷酸具有连接到所述正义引物的5′末端的第一附加序列，以及具有寡脱氧核苷酸的附加反义引物，所述寡脱氧核苷酸具有连接到所述反义引物的5′末端的与所述第一附加序列互补的第二附加序列，其中所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值，以及在PCR中最初将退火温度控制在所述附加序列无法退火的水平，然后控制在所述附加序列互相退火的水平。

Description

DNA扩增方法及其使用的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于扩增DNA的方法及其使用的试剂盒和一种使用所述DNA扩增方法及其使用的试剂盒检测DNA的方法。
背景技术
在遗传筛选等领域中，诸如基因的DNA扩增是一种重要技术，且已知使用DNA聚合酶的扩增方法，如PCR和LAMP。
PCR是一种热循环DNA扩增方法，其中通过使用一种耐热DNA聚合酶和两种引物重复进行DNA的变性、退火和延伸步骤(例如，参考日本专利出版物(特公平)4-67957(K0koku))。
LAMP是一种DNA扩增方法，其中通过使用一种链置换型DNA聚合酶和四种识别六个区域的引物在恒温条件下扩增DNA(例如，参见WO00/28082)。
发明内容
常用的DNA扩增方法受下列问题所困扰。就PCR而言，原则上DNA扩增的最大效率是每一循环两倍。就LAMP而言，设计引物很困难。
因此，本发明的一个目的是要提供一种用于扩增DNA的方法，其提供了高扩增效率并能容易地设计其中所用的引物。
本发明人发现前述目的可通过在PCR中除使用常规引物对外，还使用一种在5′末端具有互补序列的附加引物对并改变部分条件，因此完成了本发明。
本发明提供了下列各项。(1)一种使用正义引物和反义引物进行PCR扩增DNA的方法，其中PCR在存在如下附加引物的条件下进行：附加正义引物，其包含所述正义引物和一种具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，以及附加反义引物，其包含所述反义引物和一种具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸；所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值；以及在PCR中退火温度最初设定为所述附加序列无法退火的温度，并在PCR过程中改变至所述附加序列互相退火的温度。
(2)根据(1)所述的方法，其中所述附加序列的Tm值较所述正义引物和反义引物的Tm值低5℃或更多。
(3)一种用于(1)所述的方法的试剂盒，该试剂盒包含所述附加正义引物，其包含所述正义引物和所述具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，以及所述附加反义引物，其包含所述反义引物和所述具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，其中所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值。
(4)根据(3)所述的试剂盒，其中所述附加序列的Tm值较所述正义引物和反义引物的Tm值低5℃或更多。
(5)一种用于检测目标DNA的方法，其包含用(1)所述的方法扩增目标DNA并检测扩增产物。
(6)根据(5)所述的方法，其中通过实时PCR完成所述检测。
(7)一种用于(5)所述的方法的试剂盒，该试剂盒包含所述附加正义引物，其包含所述正义引物和所述具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，以及所述附加反义引物，其包含所述反义引物和所述具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，其中所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值。
(8)根据(7)所述的试剂盒，其包含用于实时PCR的探针。
根据本发明内容，除了另外使用一对在5′末端具有寡脱氧核苷酸互补序列的附加引物对所述PCR可以类似于常规PCR的方法进行，与LAMP相比引物可更容易设计。此外，因为扩增产物通过所述附加引物的附加部分连接，所以扩增的序列增加速率高于每一循环两倍。由于扩增效率增加，因此减少了使用探针进行实时检测的时间并可望增加信号。此外，除了常规PCR所需设备之外无需另加专用设备。
附图简述
图1-3是本发明方法原理的说明图。
图4显示了扩增产物的生产时间过程。虚线显示了使用常规引物+附加引物所获得的结果，实线显示了单独使用常规引物所获得的结果。
实现本发明的最佳方式
在本说明书中，术语“正义”和“反义”用于表示双链DNA中一条链及其互补链之间的相对关系，所述正义链并不一定指的是具有与转录产物核苷酸序列相同的核苷酸序列的链。此外，所述Tm值是通过对毗邻碱基对分析所获得的值。
<1>本发明的扩增方法及其使用的试剂盒
本发明的扩增方法是一种使用正义引物和反义引物通过PCR扩增DNA的方法，所述PCR的特点是在存在如下附加引物的条件下进行：附加正义引物，其包含所述正义引物和一种具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，以及附加反义引物，其包含所述反义引物和一种具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸的条件下进行；所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值；以及在PCR中退火温度最初设定为所述附加序列无法退火的温度，并在PCR过程中改变至所述附加序列互相退火的温度。
本发明的扩增方法通常包含下列步骤。
(a)提供模板、正义引物、反义引物、包含所述正义引物和一种具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸的附加正义引物、以及包含所述反义引物和一种具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸的附加反义引物的步骤。在该步骤中，设计上述附加序列使得该附加序列的Tm值应当低于所述正义引物和反义引物的Tm值。
(b)在所述附加正义引物和附加反义引物存在下，使用所述模板、正义引物和反义引物进行PCR的步骤。在该步骤中，退火温度最初设定为上述附加序列无法退火的温度，并在PCR过程中改变至上述附加序列互相退火的温度。
除了使用包括所述附加正义引物和附加反义引物的附加引物对，以及在PCR过程中退火温度较低之外，可依照常规PCR方法实施本发明的扩增方法。
可用与设计常规PCR引物方法相同的方法设计包含所述正义引物和反义引物的引物对。所述正义引物和反义引物的长度和Tm值通常为15-40个核苷酸和50-72℃，优选25-32个核苷酸和55-70℃。所述正义引物和反义引物的长度可不相同。然而，优选所述正义引物和反义引物的Tm值是几乎相同的(相差通常不超过2℃)。
通过将一种具有第一附加序列的寡脱氧核苷酸连接到所述正义引物的5′末端可获得所述附加正义引物，以及通过将一种具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列的寡脱氧核苷酸连接到所述反义引物的5′末端可获得所述附加反义引物。只要能获得本发明扩增方法的结果，在所述附加序列和正义或反义引物序列之间就可以存在插入序列。通常来说，可存在1-10个核苷酸的序列。该插入序列的长度可不同于所述附加正义引物和附加反义引物。
所述第一附加序列通常具有15-30个核苷酸的长度和45-67℃的Tm值，优选18-23个核苷酸的长度和50-65℃的Tm值。因为所述第二附加序列与所述第一附加序列互补，所以所述第二附加序列的长度和Tm值与所述第一附加序列相同。所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值(如果它们的Tm值不同，进行比较得到的较低的Tm)，优选低5℃或更多。除了所述附加序列应当具有上述Tm值外，它们可以与常用引物设计相同的方法来设计，但应考虑诸如避免可形成分子内高级结构的要求。
所述附加正义引物和附加反义引物的比率优选1∶1(摩尔比率)。包含所述正义引物和反义引物的附加引物对的量通常为包含所述正义引物和反义引物的引物对量的0.1-1倍。
通过重复双链DNA变性以获得单链DNA(变性步骤)、将引物退火至单链DNA上(退火步骤)以及用DNA聚合酶从所述引物的3′末端方向延伸该链(延伸步骤)以进行PCR。
在本发明的扩增方法中，所述退火温度在PCR最初阶段设定为上述附加序列无法退火的温度，并在PCR过程中改变至上述附加序列互相退火的温度。
这些步骤可通过在一个热循环中使用一种反应混合物，以与常用PCR相同的方法进行。
所述PCR反应混合物组合物的一个典型实例如下。
表1
DNA片段(模板)    102-105个分子，或1-1000ng/μl
引物                 200-1000nM
附加引物             200-1000nM
核苷酸               每种200μM
DNA聚合酶            0.5-2.5U/μl
Tris-HCl(pH7-8)      10-20mM
MgCl2                1.5-5mM
KCl                  50-100mM
表面活性剂或明胶     0.1-2％
(终体积：25-100μl)
此外，所述温度循环的典型实例如下.该温度循环通常重复25-35次。
(1)变性：94-98℃，持续10-30秒，
(2)退火：对于最初阶段(通常在最初5-15个循环)，50-65℃持续10-30秒，以及对于随后阶段，60-95℃持续10-30秒，
(3)延伸：70-74℃，持续20-60秒.
本发明扩增方法原理说明于图1-3中.
基于靶序列，引物(1)和(2)设计为所述正义引物和反义引物.此外，根据所设计的引物(1)和(2)，引物(3)和(4)设计为所述附加正义引物和附加反义引物.通过添加第一附加序列(附加序列1)到所述引物(1)5′末端以获得所述引物(3)，通过添加第二附加序列(附加序列2)到所述引物(2)5′末端以获得所述引物(4).所述附加序列1和附加序列2互补.
因为在PCR起始阶段其退火温度无法对所述附加序列退火，所以通过PCR扩增了靶位(单体)(图1中<1>).由于所述附加单体具有一附加序列，其很难退火至起始模板DNA上，所述起始模板DNA包括作为其一部分的靶位.然而，随着单体数量增加，所述附加引物也开始退火(图1中<2>)。在该过程中(和改变退火温度后)，具有引物(1)和(2)的单体扩增也继续进行直至反应到达平台期(图1中<3>).
当所述退火温度改变到附加序列互相退火的温度时，附加序列发生退火。由末端带有附加序列的单链DNA退火产生的杂交链作为引物和模板以产生双链DNA(连接产物，图2中<4>).此外，附加引物可杂交到所述连接产物的单链DNA上，且通过该杂交反应所获得的杂交分子也产生了双链DNA。因为能发生上述不同的反应，所以总体反应很难到达平台期，因此较通过进行常规PCR所能获得的量而言，目标序列被扩增至更多数量(图3中<5>).因此，在使用特异于目标序列的探针的检测方法中，则所述探针应杂交的部分被大量扩增，因此能获得强信号(图1中<3>和图2中<4>)。
本发明也提供了一种用于本发明扩增方法的试剂盒(本发明的扩增试剂盒)。该试剂盒特点在于包括上述附加正义引物和附加反义引物.
这些附加正义引物和附加反义引物描述于如前对本发明扩增方法的说明中。
除所述附加正义引物和附加反义引物外，本发明的扩增试剂盒可包括进行PCR所必需的试剂.
在本发明的扩增试剂盒中，所述引物和其它试剂可分开存放，或它们的一部分可以混合物形式存放.
<2>本发明的检测方法及其使用的试剂盒
本发明的检测方法包括用本发明扩增方法扩增目标DNA和检测扩增产物.
在本发明的检测方法中，可以根据检测扩增产物的常规方法检测所述扩增产物检测。但是，因为在一个分子扩增产物中目标序列数量并不恒定，所以优选使用特异于所述目标序列的检测方法.例如，可通过实时PCR进行检测，其中在存在用荧光染料标记的寡核苷酸条件下进行PCR，以便当其结合至扩增产物时，荧光应改变(例如，设计一种可杂交到单链DNA上，且当其杂交时，其荧光强度应改变的杂交探针等)，并测量荧光.
因为在本发明扩增方法中目标序列的扩增效率增加，所以优选使用取决于目标序列数量的检测方法.这种检测方法的实例包括，例如，使用探针的实时检测。所述使用探针的实时检测中可望减少检测时间及增加信号。
本发明也提供了一种用于本发明检测方法的试剂盒(本发明的检测试剂盒).该试剂盒特点在于包括上述附加正义引物和附加反义引物。
这些附加正义引物和附加反义引物描述于如前对本发明扩增方法的说明中。
除所述附加正义引物和附加反义引物之外，本发明的检测试剂盒可进一步包括进行PCR和/或扩增产物检测所必需的试剂。本发明检测试剂盒优选包括用于实时检测的探针.
在本发明的检测试剂盒中，所述引物和其它试剂可分开存放，或它们的一部分可以混合物形式存放。
实施例
在下文中，根据如下实施例本发明将得到更清楚地说明。
实施例1：衣原体(Chlamydia)(沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis))隐性质粒pLGV440的检测
根据已知的衣原体隐性质粒pLGV440核苷酸序列(GenBank登记号X06707)，制备具有如下所列核苷酸序列的引物(1)-(4)和探针。引物(3)和(4)中附加序列1和附加序列2互补.所述引物(1)和(2)的Tm值分别是65℃和64.8℃。附加序列的Tm值是60.6℃。通过毗邻碱基对分析获得此处所用的Tm值。通过常规方法用BODIPYFL(Molecular Probe公司)标记探针的5′末端。
表2
引物
(1)：AGCTCTGGGAGCATGTTCTTAGTCTCAGCAG(SEQ IDNO：1，相应于X06707的核苷酸编号5171-5200)
(2)：TCGCGTAGGGCTTAGAATCACCTTCTCGTAC(SEQ IDNO：2，相应于X06707的核苷酸编号5276-5246)
(3)：CCTGATCAGGGTGCTTGCGAGAGCTCTGGGAGCATGTTCTTAGTCTCAGCAG(SEQ ID NO：3，附加序列1+(1))
(4)：CTCGCAAGCACCCTGATCAGGTCGCGTAGGGCTTAGAATCACCTTCTCGTAC(SEQ ID NO：4，附加序列2+(2))
探针
(BODIPY FL)-CAAAGCTAGAACAACGCCGCCTTCCATTCTTGATGC-(磷酸化)  (SEQ ID NO：5，相应于X06707的核苷酸编号5245-5210)
使用常规方法从ATCC菌株CT-VR878分离纯化衣原体基因组DNA，将其用作为模板来扩增DNA，所用的反应混合物组合物和反应条件如下.
表3
反应混合物组合物
H2O                             18.375μl
10x Gene Taq缓冲液              2.5μl
ATP、UTP、GTP、CTP每种各2.5mM   2μl
探针(5μM)                      0.5μl
引物(1)(100μM)                 0.125μl
引物(2)(100μM)                 0.125μl
引物(3)(100μM)                 0.125μl
引物(4)(100μM)                 0.125μl
Gene Taq (5U/μl)               0.125μl
基因组DNA(200拷贝)              1μl
终体积                          25μl
*Gene Taq(Nippon Gene)
表4
反应条件
95℃持续1分钟
(95℃持续15秒，67℃持续15秒，72℃持续30秒)×10个循环
(95℃持续15秒，62℃持续15秒，72℃持续30秒)×40个循环
72℃持续3分钟
于反应步骤的67℃持续15秒和62℃持续15秒时，检测到荧光(激发：495nm，检测：525nm)。在这些条件下，当探针与扩增产物杂交时，荧光淬灭，因此通过荧光强度的减少量可检测扩增产物的产量。
此外，除引物(1)和(2)单独用作为引物之外，扩增也可在相同的条件下进行。
结果示于图4，虚线表示使用引物(1)-(4)所得到的结果(常规引物+附加引物)，实线表示单独使用引物(1)和(2)所得到的结果(单独使用常规引物)。这些结果显示：除引物(1)和(2)之外，通过使用引物(3)和(4)增加了扩增产物的产量.因此，显然可以更高的灵敏度测定隐性质粒pLGV440的存在或不存在。
工业实用性
提供了一种用于扩增DNA的方法，其具有高扩增效率且可容易地设计用于该方法的引物。
序列表
<110>Arkray，Inc.
<120>DNA扩增方法及其使用的试剂盒
<130>G863-0P1745
<150>JP 2003-61841
<151>2003-03-07
<160>5
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
 agctctggga gcatgttctt agtctcagca g                                         31
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
tcgcgtaggg cttagaatca ccttctcgta c                                          31
<210>3
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
cctgatcagg gtgcttgcga gagctctggg agcatgttct tagtctcagc ag               52
<210>4
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
ctcgcaagca ccctgatcag gtcgcgtagg gcttagaatc accttctcgt ac               52
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>5
caaagctaga acaacgccgc cttccattct tgatgc                                 36
1
2

Claims (8)

1.一种包含使用正义引物和反义引物进行PCR扩增DNA的方法，其中PCR在存在如下附加引物的条件下进行：附加正义引物，其包含所述正义引物和一种具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，以及附加反义引物，其包含所述反义引物和一种具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸；所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值；以及在PCR中退火温度最初设定为所述附加序列无法退火的温度，并在PCR过程中改变至所述附加序列互相退火的温度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述附加序列的Tm值较所述正义引物和反义引物的Tm值低5℃或更多。
3.一种用于权利要求1所述的方法的试剂盒，该试剂盒包含附加正义引物，其包含所述正义引物和所述具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，以及附加反义引物，其包含所述反义引物和所述具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，其中所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述附加序列的Tm值较所述正义引物和反义引物的Tm值低5℃或更多。
5.一种用于检测目标DNA的方法，其包含用权利要求1所述的方法扩增目标DNA并检测扩增产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中通过实时PCR完成所述检测。
7.一种用于权利要求5所述的方法的试剂盒，该试剂盒包含附加正义引物，其包含所述正义引物和所述具有第一附加序列并连接到所述正义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，以及附加反义引物，其包含所述反义引物和所述具有与所述第一附加序列互补的第二附加序列并连接到所述反义引物的5′末端的寡脱氧核苷酸，其中所述附加序列的Tm值低于所述正义引物和反义引物的Tm值。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其包含用于实时PCR的探针。
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