WO2004078972A1 - キメラ受容体、及び該受容体のリガンド又は阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

本発明者らは、ヒトNPR-A/マウスG-CSFRキメラ受容体発現ベクターおよびヒトNPR-B/マウスG-CSFRキメラ受容体発現ベクターを構築し、マウスBa/F3細胞へと導入することにより、ヒトANPに感受性の高いキメラANP受容体発現細胞株およびヒトCNPに感受性の高いキメラCNP受容体発現細胞株をそれぞれ得ることに成功した。これらの細胞を用いることにより、該キメラ受容体のリガンド又は阻害物質のスクリーニングが可能である。

Description

明細 キメラ受容体、 及び該受容体のリガンド又は阻害物質のスクリ一二ング方法 技術分野

本発明は、 キメラ受容体及び該受容体のリガンド又は阻害物質のスクリ一ニン グ方法に関する。 背景技術

ナトリウム利尿ペプチドファミリ一は、 心房性ナトリウム利尿ペプチド (ANP) 、 B型ナトリウム利尿ペプチド (BNP) 、 C型ナトリウム利尿ペプチド (CNP) の 3 種類のナトリゥム利尿べプチドで構成され、 ナトリゥム利尿べプチドは共通な 17 残基の環状構造を有している。

一方、 ナトリゥム利尿べプチド受容体は、 NPR- A、 NPR- B、 NPR- Cで構成される。 NPR-A, NPR- Bは I型膜蛋白の膜型グァニル，サイクレース （guanylate cyclase) であり、 産生される cGMPがナトリウム利尿ペプチドの生理作用を惹起する。 NPR - A、 NPR- Bは、 腎、 血管、 副腎、 脳、 肺、 腸管、 心臓など全身に広く分布している。 ANP/BNPは、 主に NPR- Aを介して、 末梢血管拡張作用及びナトリゥム利尿作用によ る降圧、 レニン ·アルドステロン分泌抑制、 直接的心臓線維化抑制を示す。 NPR-A K0マウスでは、 高血圧を伴う著明な心肥大 ·線維化が認められ、 突然死が頻発す る （非特許文献 1参照） ことから、 NPR- Aを介するシグナルの生理機能の重要性が 相計られる。

NPR- Bのリガンドは CNPであり、 主にその血管系局所ホルモンとしての作用 （血 管系細胞増殖抑制） を媒介する。

NPR-Cは細胞内ドメインが 37アミノ酸残基のみであり、 グァニル ·サイクレース 活性を示さないが、 ANP、 BNP, CNPとの結合親和性は NPR- A、 NPR-Bと同等であり、 所謂クリアランス型の受容体として存在するものと考えられている （ナトリゥム 利尿ペプチド受容体の 95%以上が NPR-C) 。

NPR-Aは細胞膜上では二量体 （ダイマー） として存在しており、 細胞外ドメイン への MP/BNPの結合によってコンフオメーシヨンの変化が起こる。 この変化は膜貫 通ドメインを介して細胞内の kinase相同ドメイン (KHD)の変化を起こし、 ATPの結 合を促す。 この ATPの結合がグァニル ·サイクレース活性の抑制を解除することに より、 NPR- Aを活性化するとされる （非特許文献 2参照） 。 NPR- Aは、 受容体鎖の オリゴマー化及びコンフオメーション変化によってシグナルが伝達される点でサ ィトカイン受容体と類似している。

上述のように、 ANP/BNPは、 主に NPR- Aを介して、 末梢血管拡張作用及びナトリ ゥム利尿作用による降圧、 レニン ·アルドステロン分泌抑制、 直接的心臓線維化 抑制を示すことから、 NPR- Aのリガンドは心不全治療に有効であると考えられてい る。 又、 ANPトランスジエニックマウスでは肺高血圧抑制 （非特許文献 3参照） 、 ANPノックアウトマウスでは肺高血圧促進 (非特許文献 4参照) が認められること から、 NPR - Aのリガンドは肺高血圧治療剤の可能性もあると考える。 さらに、 NPR - Aのリガンドである BNPの過剰発現マウスの 5/6腎摘モデルでは、 糸球体肥大ゃメサ ンギゥム増加の明らかな抑制と蛋白尿および腎機能の改善を認め、 慢性腎障害の 際に共通して見られる機能ネフロン減少に対して ANP/BNPが腎保護作用を示すこと (非特許文献 5参照) 、 BNP過剰発現マウスの抗糸球体基底膜腎炎モデルでは、 降 圧作用とは無関係に、 蛋白尿、 腎組織像および腎機能に対し著しい改善作用を示 し、 増殖性腎炎において ANP/BNPが腎保護作用を発揮する可能性が報告されている (非特許文献 6参照） 。

NPR- Bはそのリガンド C- type natriuret ic pept ide (CNP)と結合して細胞内 cGMP 濃度を上昇させてシグナルを伝達する。 CNPは全身でュビキタスに発現しており、 パラクリンに作用するファクタ一として理解されている。 CNPは神経ペプチドとし ての作用のほか、 血管内皮ゃマク口ファージから分泌され血管損傷の修復効果が 注目されている （非特許文献 7参照） 。 最近、 京都大学のグループにより、 NPR - B が軟骨形成に重要であることが報告され （非特許文献 8参照） 、 CNPもしくは NPR - Bのリガンドが軟骨形成不全症治療薬となる可能性が報告されている （非特許文献 9参照） 。

従って、 NPR- Aのリガンド又は NPR- Bのリガンドは様々な疾患の治療薬になり得 る為、 そのような物質を効率的に取得する為のスクリーニングする方法が望まれ ていた。 しかしながら、 NPR- Aのリガンド又は NPR- Bのリガンドを効率的にスクリ —ニングする方法は確立されていない。

〔非特許文献 1〕

P. M. Oliver, J. E. Fox, R. Kim, H. A. ockman, H. S. Kim, R. L. Reddick, K. N. Pandey, S. L. Milgram, 0. Smithies, and N. Maeda.著、 「Hyper tens ion, cardiac hypertrophy, and sudden death in mice lacking natriuretic peptide receptor A. J 、 Proc Natl Acad Sci USA, 1997年、 Vol.94、 p.14730-14735.

〔非特許文献 2〕

L R. Potter and T, Hunter著、 Guanylyl Cyclase- 1 inked Natriuretic Peptide Receptors: Structure and Regulation.」 、 J Biol Chem、 2001年、 Vol.276、 p.6057-6060.

〔非特許文献 3〕

J. R. Klinger, R. D. Petit, L. A. Curt in, R. R. Warburton, D. S. Wrenn, M. E. Stein elper, L. J. Field, and N. S. Hill著、 （"Cardiopulmonary

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〔非特許文献 4〕

J. R. Klinger, R. R. Warburton, LA. Pietras, R. Swift, S. John, and N. S. Hi 11著、 「Exaggerated pulmonary hypertensive responses during chronic hypoxia in mice with gene-targeted reductions in atrial natriuretic peptide. J 、 Chest, 1998年、 Vol.1.14、 79S-80S.

〔非特許文献 5〕

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〔非特許文献 6〕

T. Suganami, Μ. Mukoyama, A. Sugawara, K. Mori, T. Nagae, M. Kasahara, K. Yahata, H. Makino, Y. Fuj inaga, Y. Ogawa, I. Tanaka, and K. Nakao著、

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〔非特許文献 7〕

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〔非特許文献 8〕

M. Suda, Y. Ogawa, K. Tanaka, N. Tamura, A. Yasoda, T. Takigawa, M.

Uehira, H. Nishimoto, H. It oh, Y. Saito, K. Shiota, and K. Nakao著、 「SkeletaI overgrowth in transgenic mice that overexpress brain

natriuretic peptide. J 、 Proc Natl Acad Sci USA, 1998年、 Vol.95、 p.2337- 〔非特許文献 9〕

A. Yasoda, Y. Komatsu, H. C usho, T. Miyaz wa, A. Ozawa, M. Miura, T.

Kurihara, T. Rogi, S. Tanaka, M. Suda, N. Tamura, Y. Ogawa, and K. Nakao 著、 「Overexpress ion of CNP in chondrocytes rescures achondroplas ia through a MAPK- dependent pathway. J 、 Nat Med、 2004年、 Vol. 10、 p. 80-86. 発明の開示

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 膜型グァ ニル ·サイクレース由来の細胞外領域と、 膜型グァニル ·サイクレース以外の受 容体由来の細胞内領域からなるキメラ受容体を提供することにある。 さらに、 該 受容体を利用した膜型グァニル ·サイクレースのリガンド及び阻害物質をスクリ 一ニングする方法、 ならびに該方法により得られる物質の提供を目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するため、 鋭意研究を行った。 本発明者らは、 ま ず、 膜型グァニル ·サイクレースであるナトリウム利尿ペプチドの細胞外領域と、 マウス G-CSFの細胞内領域からなるキメラ受容体の作製を行った。 より具体的には、 PCRによるヒト NPR - A (hNPR-A) 遺伝子のクロ一ニング後、 該遺伝子断片を錡型と して PCRを行い、 hNPR- Aの細胞外領域及びマウス G- CSF受容体の一部をコ一ドする 遺伝子断片を取得した。 次いで、 該遺伝子断片をマウス G-CSF受容体の膜貫通領域 から下流の遺伝子配列を持つ発現べクタ一に挿入した。 プラスミドのインサート 部分の塩基配列を確認し、 ヒト NPR- A/マウス G- CSFRキメラ受容体発現べクタ一

(pCV/hNPR-A-mGCSFR) を構築した。

次に、 該発現ベクターを直鎖状にし、 エレクト口ポーレーシヨンによってマウ ス Ba/F3細胞へと導入し、 キメラ受容体発現細胞株の樹立を試みた。 リガンドとし てヒト ANP (心房性ナトリウム利尿ペプチド） を添加した培地にて、 エレクトロボ —レーシヨン処理細胞を培養し、 生細胞数を指標とした細胞増殖活性をもとに、 ヒト ANPに感受性の高い細胞株を取得し、 リガンド依存性増殖を示すキメラ A P受 容体発現細胞株を得ることに成功した。

さらに、 本発明者らは、 PCRによるヒト NPR- B ( NPR-B) 遺伝子のクロ一ニング 後、 該遺伝子断片を铸型として PCRを行い、 hNPR- Bの細胞外領域及びマウス G- CSF 受容体の一部をコードする遺伝子断片を取得した。 次いで、 該遺伝子断片をマウ ス G-CSF受容体の膜貫通領域から下流の遺伝子配列を持つ発現ベクターに挿入した プラスミドのィンサート部分の塩基配列を確認し、 ヒト NPR-B/マウス G-CSFRキメ ラ受容体発現ベクターを構築した。 次に、 該発現ベクターを直鎖状にし、 エレク トロポ一レーシヨンによってマウス Ba/F3細胞へと導入し、 キメラ受容体発現細胞 株の樹立を試みた。 リガンドとしてヒト CNPを添加した培地にて、 エレクト口ポー レーシヨン処理細胞を培養し、 生細胞数を指標とした細胞増殖活性をもとに、 ヒ ト CNPに感受性の高い細胞株を取得し、 リガンド依存性増殖を示すキメラ CNP受容 体発現細胞株を得ることに成功した。

本発明によって提供されるキメラ受容体、 及び該受容体を発現する細胞は、 膜 型グァニル ·サイクレース、 特にナトリゥム利尿べプチド受容体のリガンド又は 阻害物質のスクリーニングに有用と考えられる。 本発明のナトリウム利尿べプチ ド受容体を用いたスクリーニング方法は、 本発明者らによって初めて開発された ものである。

即ち本発明は、 膜型グァニル ·サイクレース、 例えば、 ナトリウム利尿べプチ ド受容体の細胞外領域と、 それ以外の受容体、 例えば、 G - CSF等の細胞内領域から なるキメラ受容体に関し、 より'具体的には、 '

〔1〕 膜型グァニル，サイクレース由来の細胞外領域と、 膜型グァニル ·サイ クレース以外の受容体由来の細胞内領域を含むキメラ受容体、

〔2〕 膜型グァニル ·サイクレースがナトリウム利尿ペプチド受容体である 〔1〕 に記載のキメラ受容体、

〔3〕 ナトリウム利尿ペプチド受容体が NPR- Aである 〔2〕 に記載のキメラ受容 体、 〔4〕 ナトリウム利尿ペプチド受容体が NPR-Bである 〔2〕 記載のキメラ受容 体、

〔5〕 膜貫通領域をさらに含む 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれかに記載のキメラ受容 体、

〔6〕 膜型グァニル，サイクレース以外の受容体がサイトカイン受容体である 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載のキメラ受容体、

〔7〕 サイト力イン受容体が顆粒球コロニー刺激因子受容体である 〔6〕 に記 載のキメラ受容体、

〔8〕 〔1〕 〜 〔7〕 のいずれかに記載のキメラ受容体をコードする DNA、 〔9〕 〔8〕 に記載の DNAを含有するベクター、

〔1 0〕 〔9〕 に記載のベクターを含有する細胞、

〔1 1〕 〔1〕 〜 〔7〕 のいずれかに記載のキメラ受容体を発現する細胞、 〔1 2〕 ナトリウム利尿ペプチド依存性増殖を示す、 〔2〕 〜 〔4〕 のいずれ かに記載のキメラ受容体を発現する細胞、

〔1 3〕 以下の工程を含む受容体のリガンドのスクリーニング方法、

(a) 〔1〕 〜 〔7〕 のいずれかに記載のキメラ受容体に被検物質を接触 させる工程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被 検物質を選択する工程 '

〔1 4〕 以下の工程を含む受容体のリガンドのスクリーニング方法、

(a) 〔1 0〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載の細胞に被検物質を接触させ る工程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被 検物質を選択する工程 〔1 5〕 以下の工程を含む受容体の阻害物質のスクリーニング方法、

(a) 〔1〕 〜 〔7〕 のいずれかに記載のキメラ受容体に被検物質及び該 キメラ受容体のリガンドを接触させる工程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被 検物質を選択する工程

〔1 6〕 以下の工程を含む受容体の阻害物質のスクリーニング方法、

(a) 〔1 0〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載の細胞に被検物質及び該キメ ラ受容体のリガンドを接触させる工程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被 検物質を選択する工程

〔1 7〕 〔1 3〕 〜 〔1 6〕 のいずれかに記載のスクリーニング方法により単 離された物質、

を提供するものである。

本発明は、 膜型グァニル ·サイクレース由来の細胞外領域と、 膜型グァニル · サイクレース以外の受容体由来の細胞内領域を含むキメラ受容体を提供する。

本発明で用いられる膜型グァニル ·サイクレースは特に限定されず、 どのよう な膜型グァニル ·サイクレースを用いてもよいが、 好ましくは、 ナトリウム利尿 ペプチド受容体である。 ナ卜リゥム利尿べプチド受容体は、 NPR - A、 NPR- B、 NPR-C のいずれでもよい力 NPR-Aまたは NPR- Bを用いることが好ましい。 hNPR- A配列の GenBankァクセッション番号は、 腿— 000906、 hNPR- Bは丽ー000907又は NM— 003995. 2、 hNPR- Cは匪— 000908である。 尚、 hNPR- A配列に関しては、 J i l l R Schoenield et al. , Molecul ar Pharmacology, 47 : 172-180 (1995)に記載がある。 又、 MPR - Bに 関しては、 Duda, T et al. , Biochemis try 32 (6) , 1391-1395 (1993)に記載がある。 又、 ナトリウム利尿ペプチドは、 心房性ナトリウム利尿ペプチド （ANP) 、 B型ナ トリウム利尿ペプチド （BNP) 、 C型ナトリウム利尿ペプチド （CNP) のいずれで もよく、 又、 それらの断片や、 アミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加等された改変 体であってもよい。

本発明のキメラ受容体に用いられる受容体の細胞外領域としては、 膜型グァニ ル ·サイクレース、 好ましくはナトリゥム利尿べプチド受容体の細胞外領域を用 いることができる。 受容体の細胞外領域は、 細胞外領域全体であってもよいし、 その一部であってもよいが、 生理活性を適切に反映できる点で細胞外領域全体を 用いることが好ましい。 受容体の細胞外領域の一部を用いる場合、 リガンド結合 部位であってもよいし、 細胞膜近傍領域の 20アミノ酸以上、 好ましくは 50ァミノ 酸以上、 さらに好ましくは 100アミノ酸以上の部分配列を用いることができる。 ま た、 キメラ受容体に用いる細胞外領域は、 キメラ受容体にリガンドが結合した場 合に、 生理活性の変化を誘導し得る限りどのような部分構造 ·部分配列であって もよく、 細胞外領域を構成するアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加があってもよ い。 あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、 当業者によ く知られた方法としては、 タンパク質に変異を導入する方法が知られている。 例 えば、 当業者であれば、 部位特異的変異誘発法 (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zol ler, MJ, and Smi th, M. (1983) Methods

Enzymol. 100, 468 - 500、 Kramer, . et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fri tz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488 - 492、 Kunkei (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) などを用いて作製することができる。

このような変異体における、 変異するアミノ酸数は、 通常、 50アミノ酸以内で あり、 好ましくは、 30アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 20アミノ酸以内で あり、 さらに好ましくは 10アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内であると考えられる。

変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎 水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水酸 基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ) 、 '硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 Μ) 、 カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩 基含有側鎖を有するアミノ酸 （R、 K、 Η) 、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 （Η、 F、 Y、 W) を挙げることができる (括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表 す） 。

あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び Z又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質が その生物学的活性を維持することはすでに知られている (Mark, D. F. et al. , Proc. Nat l. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zol ler, M. J. & Smi th, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487 - 6500、 Wang, A. et al. , Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413) 。

本発明のキメラ受容体の細胞内領域は、 キメラ受容体にリガンドが結合した場 合に、 生理活性の変化を誘導し得る限り特に制限されず、 どのような受容体由来 でもよい。 受容体の具体的な例としては、 例えば、 細胞膜受容体、 核内受容体、 細胞内受容体等を挙げることができる。 細胞外領域として用いられるナトリウム 利尿べプチドが細胞膜受容体であることから、 細胞内領域も細胞膜受容体の細胞 内領域を用いることが好ましい。 細胞膜受容体とは、 細胞膜表面に発現し、 細胞 外領域にリガンドが結合すると、 細胞内にシグナルが伝達され、 何らかの生理的 変化を誘導する受容体である。 又、 細胞膜受容体の細胞内領域を用いる場合、 細 胞内領域全体であってもよいし、 その一部であってもよい。 受容体の細胞内領域 の一部を用いる場合、 シグナル伝達領域を含むことが好ましい。

受容体の具体的な例としては、 造血因子受容体ファミリー、 サイト力イン受容 体ファミリ一、 チロシンキナーゼ型受容体ファミリ一、 セリン /スレオニンキナ ーゼ型受容体ファミリー、 TNF受容体ファミリ一、 Gタンパク質共役型受容体ファ ミリ一、 GPIアンカー型受容体ファミリー、 チロシンホスファタ一ゼ型受容体ファ ミリ一、 接着因子ファミリ一、 ホルモン受容体ファミリー、 等の受容体ファミリ 一に属する受容体などを挙げることができる。

これら受容体ファミリーに属する受容体及びその特徴に関しては多数の文献が 存在し、 例えば、 Cooke BA. , King RJB. , van der Molen HJ. ed. New

Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV. , New York, USA, Pat thy L. (1990) Cell, 61: 13-14.、 Ullrich A., et al. (1990) Cell, 61: 203-212.、 Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067-1070.、 Miyaj ima A. , et al. (1992) A画. Rev. Immunol., 10: 295-331.、 Taga T. and Kishimoto T. (1992) FASEB J. , 7: 3387-3396. , Fantl WI. , et al. (1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 453- 481.、 Smith CA. , et al. (1994) Cell, 76: 959-962.、 Flower DR. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207-234. , 宮坂昌之監修， 細胞工学別冊ハンドプックシリ —ズ 「接着因子ハンドブック」 (1994) 秀潤社, 東京, 日本、 等が挙げられる。 上 記受容体フ ミリ一に属する具体的な受容体としては、 例えば、 ヒ卜'又はマウス エリスロポエチン (EP0)受容体、 ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF) 受容体、 ヒト又はマウストロンポェチン（TP0)受容体、 ヒト又はマウスインスリン 受容体、 ヒト又はマウス Fit- 3リガンド受容体、 ヒ卜又はマウス血小板由来増殖因 子 （PDGF) 受容体、 ヒト又はマウスインターフェロン （IFN) -ひ、 j3受容体、 ヒ ト又はマウスレブチン受容体、 ヒト又はマウス成長 ルモン (GH) 受容体、 ヒト 又はマウスインターロイキン （IL) -10受容体、 ヒト又はマウスインスリン様増殖 因子 （IGF) - 1受容体、 ヒト又はマウス白血病抑制因子 （LIF) 受容体、 ヒト又は マウス毛様体神経栄養因子 （CNTF) 受容体等を例示することができ、 本発明にお いてはこれら受容体を好適に使用することができる。 これらの受容体の配列は公 知である (hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35.； mEPOR:

D' Andrea, AD. Et al. (1989) Cel l 57, 277-285.； hG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702-8706.； mG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cel l 61， 341-350.； hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644.； mTPOR: Skoda, C. Et al. (1993) 12, 2645-2653.； lns :

Ul lrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761.； hFl t-3 : Smal l, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 459-463.； hPDGFR: Gronwald, GK. Et al. (1988) Proc. Nat l. acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.； hIFN a/ j3 R: Uze, G. et al. (1990) Cel l 60, 225— 234.及び Novick, D. at al. (1994) Cel l 77, 391-400. ) 。

核内受容体とは、 リガンドの結合により特定の DNA配列に結合し、 mRNAの転写活 性の増減を誘導する活性を有する受容体であり、 ステロイド受容体ファミリー、 レチノィド X受容体ファミリ一等を使用することができる。 ステロイド受容体フ アミリーには、 ダルココルチコイド受容体、 ミネラルコルチコィド受容体、 プロ ゲステロン受容体、 アンドロゲン受容体、 エストロゲン受容体が含まれる。 また. レチノイド X受容体ファミリーには、 レチノイン酸受容体、 甲状腺ホルモン受容 体、 ビタミン D3受容体が含まれる。 細胞内受容体は、 細胞内に存在し、 種々のリ ガンドが結合し、 生理活性を誘導する受容体を意味する。

本発明のキメラ受容体の細胞内領域としては、 構造と機能が詳細に検討されて いる点で、 G-CSF受容体の細胞内領域を用いることが好ましく、 特に々ウス G- CSF 受容体の細胞内領域を用いることが好ましい。 マウス G- CSF受容体は 813個のアミ ノ酸からなり、 単一の膜貫通領域によって細胞外領域と細胞内領域に分けられて いる（Fukunaga, R. Cel l (1990) 61, 341-350)。 また、 G- CSF受容体遺伝子を骨髄 球前駆細胞株である FDC- P1や pro- B細胞株である Ba/F3細胞で発現させると、 発現 された G-CSF受容体が細胞増殖シグナルを伝達し、 G-CSF依存性の増殖活性が認め られることも示されている。 さらに、 増殖シグナルの伝達には細胞内領域の 76ァ ミノ酸からなる領域が必須であることが明らかになつている（Fukunaga, R. EMB0 J. (1991) 10, 2855-2865) o 従って、 当該 76アミノ酸をシグナル伝達領域として 含有するキメラ受容体を作製し、 Ba/F3細胞に発現させることで、 検出指標を細胞 増殖活性とすることが可能である。

ヒト G- CSF受容体では、 716番目以降のアミノ酸を欠失変異させることで、 受容 体の内在化が抑制され、 細胞表面に発現する G-CSF受容体数が増加するために、 G - CSF刺激時のシグナル伝達効率が著しく促進されることが示されている（Me l issa G. , Blood (1999) 93, 440-446) ₀ 欠失領域には、 内在化に必要なモチーフと想定 される配列を含む box3と呼ばれる領域が含まれており、 一方、 シグナル伝達に必 要な box 1、 box2は保存されている。 したがって、 マウス G-CSF受容体においても当 該領域すなわち box2を含まず、 box3を含む領域を欠失させることにより G- CSF受容 体刺激時のシグナル伝達効率を高めることが可能であることは容易に予想される。 また、 本発明のキメラ受容体の細胞内領域は、 キメラ受容体にリガンドが結合 した場合に、 生理活性の変化を誘導し得る限り、 構成するアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加があってもよい。 アミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加は上述の方法に より行うことが可能である。

本発明のキメラ受容体においては、 好ましくは膜貫通領域を含む。 キメラ受容 体に使用する膜貫通領域は、 特に限定されず、 キメラ受容体の細胞外領域に使用 した受容体由来でもよいし、 細胞内領域に使用した受容体由来であってもよい。 また、 全く別の細胞膜受容体に由来したものであってもよい。 複数の'キメラ受容 体を簡便に作製できる点で、 キメラ受容体の膜貫通領域としては、 細胞内領域に 使用した受容体に由来する膜貫通領域を使用することが好ましい。

本発明のキメラ受容体をコードする DNA、 及び該 DNAの転写産物 RNAもまた、 本発 明に含まれる。 本発明のキメラ受容体をコードする DNAは、 当業者に公知の方法に より調製することができる。 例えば、 本発明で細胞外領域、 細胞内領域、 膜貫領 域として用いられる受容体を発現している細胞より cDNAライブラリ一を作製し、 目的とする文献既知の DNA配列の一部をプローブにしてハイブリダィゼーシヨンを 行うことにより、 細胞外領域、 細胞内領域、 膜貫通領域をコードする DNAを調製で きる。 それぞれ調製された DNAを結合することにより目的のキメラ受容体を調製す ることが可能である。 cDNAライブラリ一は、 例えば Sambrook, J. et al. ,

Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法 により調製してもよいし、 市販の DNAライブラリ一を用いてもよい。 また、 受容体 を発現している細胞より RNAを調製し、 逆転写酵素により cDNAを合成した後、 目的 とする DNAの配列に基づいてオリゴ DNAを合成し、 これをプライマーとして用いて PCR反応を行い、 受容体をコードする cDNAを増幅させることにより調製することも 可能である。

調製された目的とする DNA断片を、 ベクタ一 DNAと連結する。 さらに、 これより 組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換え ベクタ一を調製する。 DNA断片を保持するためのベクター DNAには、 公知のもの (例えば、 pUC19、 pBluescript等） を用いることができる。 また、 大腸菌は公知 のもの （例えば DH5 a、 JM109等） を用いることができる。 目的とする DNAの塩基配 列は、 公知の方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネ一ション 法 (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) により確認することができる。 本発明では、 自動塩基配列決定装 置 (丽 A Sequencer PRISM 377もしくは DNA Sequencer PRISM 310， Perkin- Elmer) などを用いることができる。 '

また、 本発明の DNAにおいては、 発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮し て、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる （Grantham, R. et al. , Nucel ic Acids Research (1981) 9, r43-74) 。 また、 本発明の MAは、 市販のキ ットゃ公知の方法によって改変することができる。 改変としては、 例えば、 制限 酵素による消化、 合成オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの挿入、 リン カーの付加、 開始コドン （ATG) 及び/又は終止コドン （TM、 TGA、 又は TAG) の 挿入等が挙げられる。

キメラ受容体発現のためには、 ェンハンサーノプロモーターのごとき発現制御 領域のもとでキメラ受容体をコードする MAを含む発現べクタ一を作製する。 この 発現ベクターにより宿主細胞を同時形質転換して細胞にキメラ受容体を発現させ る。

哺乳動物細胞で発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。 例えば、 ヒ卜 ·ポリペプチドチェーン ·ェロンゲ一シヨンファクター 1 α (HEF-1 ) を使用するのが好ましい。 HEF- l aプロモーターを含有する発現べクタ一の例 には pEF- BOS (Mizushima, S. et al. (1990) Nuc. Ac id Res. 18, 5322) が含ま れる。 また、 その他に本発明のために用いることのできる遺伝子プロモーターと しては、 サイトメガロウィルス、 レトロウィルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノ ウィルス、 シミアンウィルス 40 (SV40) 等のウィルスプロモーターや、 哺乳動物 細胞由来のプロモーターがある。 例えば、 SV40のプロモーターを使用する場合は、 Mul l iganらの方法 (Nature (1990) 277, 108) に従えば容易に実施することがで きる。

宿主細胞系中への遺伝子導入のため、 発現ベクターは選択マーカー遺伝子 （例 えば、 ホスホ卜ランスフェラ一ゼ APH (3' ) II又は I (neo)遺伝子、 チミジンキナー ゼ遺伝子、 大腸菌キサンチンーグァニンホスホリボシルトランスフェラ一ゼ

(Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （DHFR) 遺伝子等） を含むことができ る。 '

遺伝子導入には公知の方法、 例えばリン酸カルシウム法 （Chen, C. et al.

(1987) Mol. Cel l. Biol. 7, 2745-272) 、 リポフエクシヨン法 (Feigner, PL. et al. (1987) Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 84, 7413—) 、 エレクト口ボーレ一 シヨン法 (Pot ter, H. (1988) Anal. Biochem. 174, 361-373) 等を用いることが できる。 本発明ではエレクト口ポーレーシヨン法による遺伝子導入装置 （Gene Pul ser, Bio-Rad) を用いることができる。 また本発明は、 本発明の DNAを含有するベクター、 及び該ベクタ一を含有する細 胞に関する。 本発明で用いられるベクターは当業者が適宜選択することでき、 特 に限定されないが、 例えば、 COSl (W098/13388) , pME18S (Med. immunol. 20 : 27- 32 (1990) )、 pEF-BOS (Nucleic Acids Res. 18 : 5322 (1990) )、 pCDM8 (Nature 329 : 840-842 (1987) )、 pRSVneo, pSV2 - neo、 pcDNAI/Amp (Invi trogen) , pcDNAL pAMoERC3Sc、 pCDM8 (Nature 329 : 840 (1987) )、 pAGE107 (Cytotechnology 3 : 133 (1990) )、 pREP4 (Invi trogen) , pAGE103 (J. Biochem. 101 : 1307 (1987) )、 AMoA, PAS3-3, pCAGGS (Gene 108 : 193-200 (1991) )、 pBK - CMV、 pcDNA3. 1 (Invi rtogen) , pZeoSV (Stratagene)等を用いることができる。

また本発明は、 本発明のキメラ受容体を発現する細胞に関する。 該細胞の好ま しい態様においては、 本発明の上記ベクターを含み、 本発明のキメラ受容体を発 現する細胞である。 本発明で用いられる細胞は当業者が適宜選択することができ， 動物細胞、 大腸菌、 酵母など特に限定されないが、 動物細胞が好ましく、 特に哺 乳動物細胞が好ましい。 細胞の具体的な例としては、 例えば、 BaF3、 醫0、 FDCP-K FDCP- 2、 CTLL- 2、 DA-K KT- 3、 32D等を挙げることができる。 本発明の細 胞の一例を示せば、 ナトリゥム利尿ぺプチド依存性増殖を示す細胞を挙げること ができる。

さらに本発明は、 受容体のリガンド、 及び受容体の阻害物質のスクリーニング 方法を提供する。

本発明のキメラ受容体を用いた、 膜型グァニル ·サイクレース、 特にナ卜リウ ム利尿ぺプチド受容体のリガンド又は阻害物質のスクリーニング方法は、 被検物 質を本発明のキメラ受容体もしくは本発明の細胞に接触させ （工程（a) ) 、 生理活 性を測定し （工程 (b) ) 、 被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変 化させる被検物質を選択する （工程（c) ) 。 上記工程（c)における 「変化」 とは、 通常生理活性の上昇 （亢進） あるいは低下を意味する。 一般的に、 被検物質を接 触させない場合と比較して、 生理活性を上昇 （亢進） させる物質は、 リガンドで あると考えられる。 一方、 生理活性を低下させる物質は、 阻害物質であるものと 考えられる。 本発明の上記方法を用いることにより、 当業者においては、 指標と する生理活性の種類を考慮して、 適宜、 生理活性を変化させる被検化合物につい てリガンドもしくは阻害物質であるか否かの判定を行うことが可能である。 また、 上記工程（a)においては、 特に限定はされないが、 通常、 本発明のキメラ受容体は 細胞膜上に発現した状態で被検物質と接触させる。

本発明において生理活性とは、 生体、 組織、 細胞、 タンパク質、 DNA、 RNA等に 量的及び Z又は質的な変化、 影響をもたらすことが可能な活性である。 本発明の スクリーニング方法においては、 どのような生理活性を用いてもよい。 生理活性 としては、 サイト力イン活性、 酵素活性、 転写活性、 膜輸送活性、 結合活性等を 用いることができる。 酵素活性としては、 例えば、 タンパク質分解活性、 リン酸 化 Z脱リン酸化活性、 酸化還元活性、 転移活性、 核酸分解活性、 脱水活性がある - また、 結合活性としては、 例えば、 抗原と抗体との反応、 細胞接着因子どうしの 結合及び Z又は活性化がある。

本発明において、 生理活性の変化を測定する為に用いる検出指標としては、 量 的及び/又は質的な変化が測定可能である限り使用することができる。 例えば、 無細胞系（cel l free assay)の指標、 細胞系（eel l_based assay)の指標、 組織系の 指標、 生体系の指標を用いることができる。 無細胞系の指標としては、 酵素反応 やタンパク質、 脆、 RNAの量的及び/又は質的な変化を用いることができる。 酵 素反応としては、 例えば、 アミノ酸転移反応、 糖転移反応、 脱水反応、 脱水素反 応、 基質切断反応等を用いることができる。 また、 タンパク質のリン酸化、 脱リ ン酸化、 二量化、 多量化、 分解、 乖離等や、 DNA、 RNAの増幅、 切断、 伸長を用い ることができる。 例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸 化を検出指標とすることができる。 細胞系の指標としては、 細胞の表現型の変化、 例えば、 産生物質の量的及び Z又は質的変化、 増殖活性の変化、 形態の変化、 特 性の変化等を用いることができる。 産生物質としては、 分泌タンパク質、 表面抗 原、 細胞内タンパク質、 mRNA等を用いることができる。 形態の変化としては、 突 起形成及び/又は突起の数の変化、 偏平度の変化、 伸長度ノ縦横比の変化、 細胞 の大きさの変化、 内部構造の変化、 細胞集団としての異形性/均一性、 細胞密度 の変化等を用いることができる。 これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認す ることができる。 特性の変化としては、 足場依存性、 サイト力イン依存応答性、 ホルモン依存性、 薬剤耐性、 細胞運動性、 細胞遊走活性、 拍動性、 細胞内物質の 変化等を用いることができる。 細胞運動性としては、 細胞浸潤活性、 細胞遊走活 性がある。 また、 細胞内物質の変化としては例えば、 酵素活性、 mRNA量、 Ca²⁺や c崖 P等の細胞内情報伝達物質量、 細胞内タンパク質量等を用いることができる。 また、 細胞膜受容体に対するリガンドを選択したい場合、 受容体の刺激によって 誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。 組織系の指標とし ては、 使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。 生体系の 指標としては組織重量変化、 血液系の変化、 例えば血球細胞数の変化、 タンパク 質量や、 酵素活性、 電解質量の変化、 また、 循環器系の変化、 例えば、 血圧、 心 拍数の変化等を用いることができる。

これらの検出指標を測定する方法としては、 特に制限はなく、 発光、 発色、 蛍 光、 放射活性、 蛍光偏光度、 表面プラズモン共鳴シグナル、 時間分解蛍光度、 質 量、 吸収スペクトル、 光散乱、 蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる , これらの測定方法は当業者にとつては周知であり、 目的に応じて、 適宜選択する ことができる。 例えば、 吸収スペクトルは一般的に用いられるフォドメ一夕ゃプ レートリーダ等、 発光はルミノメ一夕等、 蛍光はフルォロメータ等で測定するこ とができる。 質量は質量分析計を用いて測定することができる。 放射活性は、 放 射線の種類に応じてガンマ力ゥン夕一などの測定機器を用いて、 蛍光偏光度は BEACON (宝酒造） 、 表面プラズモン共鳴シグナルは BIAC0RE、 時間分解蛍光、 蛍光 共鳴エネルギー移動などは ARV0などにより測定できる。 さらに、 フローサイトメ 一夕なども測定に用いることができる。 これらの測定方法は、 一つの測定方法で 2 種以上の検出指標を測定しても良く、 簡便であれば、 2種以上の測定を同時及び Z 又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能で ある。 例えば、 蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルォロメ一夕で測定す ることができる。

本発明において、 好ましい検出指標は、 細胞増殖活性の変化である。 細胞の増 殖活性の変化は、 MTT法やトリチウム標識チミジン法を用いて測定することができ る。 例えば G- CSF受容体、 EP0受容体、 EGF受容体、 TP0受容体の細胞内領域を用い， これらの受容体の刺激によって誘導される細胞増殖活性を検出指標とすることが できる。 例えば、 成長ホルモン受容体の細胞外領域と G-CSF受容体の細胞内領域と を有するキメラ受容体では、 成長ホルモン依存性の細胞増殖が誘導されることが 示されている（Fuh, G. Science (1992) 256, 1677-1680) ₀

また、 細胞増殖活性を検出指標として測定する場合、 検出感度を上げることを 目的として、 リガンドの非存在下では死滅する細胞株が好ましく、 特に、 継代が 容易である点でサイトカイン依存性細胞株が好ましい。 例えば、 IL - 2依存性細胞 株である CTLL- 2細胞や、 IL-3依存性細胞株である 32D細胞、 FDC- P1細胞、 Ba/F3細 胞を用いることができる。 これらの細胞株は、 IL- 2あるいは IL-3等の増殖に必要 なサイトカインを培養液から除去することで、 培養開始 2日目力、3日目には細胞が 死滅する特徴を有する。 マウス G-CSF受容体細胞内領域を有するキメラ受容体を発 現させた FDC- P1細胞や Ba/F3細胞を用いることが好ましい。

また、 細胞は、 スクリーニングの感度の向上を目的として加工して用いること ができる。 細胞の高感度化の方法としては、 例えば、 キメラ受容体が高発現する ように適切な発現制御領域及びポリ A付加シグナルを用いてキメラ受容体遺伝子を 発現させたり、 mRNA不安定化シグナルを除去して安定なものに置換する等である。 また、 開始コドンの周辺を Kozakのコンセンサス配列 （CCACC) に改変したキメラ 受容体遺伝子を用いることができる。 また、 適切な選択マ一カーと組み合わせる ことで、 高発現細胞株の取得を容易に行うことも可能である。 例えば、 ジヒドロ 葉酸還元酵素 (DHFR)欠損細胞株では、 DHFRを選択マ一力一として用いることによ り、 メトトレキセ一卜で DHFRを阻害して目的の遺伝子を高発現する細胞株を取 if する方法や、 プロモータ一を欠いたチミジンキナーゼ遺伝子を選択マーカーとす ることで、 目的の遺伝子を高発現する細胞株を効率的に選択する方法が知られて いる。 また、 蛍光抗体標識抗受容体抗体や GFP (green f luorescence protein)の共 発現などを用いてセルソーターなどにより高発現細胞株を選別することなどが可 能である。 さらに、 受容体の代謝機構に改良を加えることで高感度の検出系にす ることができる。 例えば、 マウス G-CSF受容体では C末端を欠失させた受容体は細 胞内への取り込みが減少し、 発現量が増加することが知られている。 また、 一般 に、 プロリン、 グルタミン酸、 セリン、 スレオニンの含有率の高いタンパク質は 分解が速いとされており、 このようなァミノ酸の偏りを減少させるようにァミノ 酸に変異を加えることも可能である。

ナトリゥム利尿べプチド受容体の阻害物質をスクリ—ニングする場合、 被検物 質以外にナトリゥム利尿べプチド受容体のリガンドも添加することが好ましい。 即ち、 この場合においては、 上記工程（a)において、 本発明のキメラ受容体もしく は本発明の細胞に、 被検物質及び該キメラ受容体のリガンドを接触させる。 添加 されるリガンドは公知のリガンドを用いることができ、 例えば、 ANP、 BNP、 CNPな どを用いることができる。

本発明において 「リガンド」 とは、 受容体に結合する活性を有し、 かつ当該受 容体を介して生理活性を誘導することができる物質を意味する。 リガンドのうち， 生体自身が産生し、 生体内において生理活性を有する物質を天然リガンドと称す る。

本発明において、 「阻害物質」 とは、 リガンドが受容体に結合し、 生理活性を 誘導することを阻害する物質を意味する。

本発明の方法に用いる被検物質としては、 生理活性を検出したい所望の物質を 用いることができる。 例示すれば、 細胞抽出物、 細胞培養上情、 発酵微生物産生 物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製若しくは粗精製タンパク質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられるが、 これらに 制限されるものではない。

本発明のキメラ受容体は、 公知の様々なスクリーニング方法 （例えば、 国際公 開公報 WO02/06838、 特願 2002- 127260、 など） に応用することも可能である。 本発明のスクリーニング方法により単離されるリガンド又は阻害物質は、 その 生理活性に応じて、 各種疾患の治療や予防のための医薬として用いることが考え られる。 例えば、 リガンドであれば、 慢性心不全、 肺高血圧症、 高血圧、 腎不全、 軟骨形成不全などの治療 ·予防に有用であると考えられる。 本発明のスクリ一二 ング方法により単離される物質もまた本発明に含まれる。

これらリガンドゃ阻害物質をヒトゃ哺乳動物、 例えばマウス、 ラット、 モルモ ット、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーの医薬として使用する場合には、 それ自体を直接患者に投与する以 外に、 公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。 例え ば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤-. マイクロカブ セル剤として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液と の無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬 理学上許容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結 合剤などと適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される単位用量 形態で混和することによって製剤化することが考えられる。 これら製剤における 有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 —スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D -マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリ ゥムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非ィ オン性界面活性剤、 例えばポリソルベー卜 80 (TM) 、 HC0- 50と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。

患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 又は経口的に当業者に公知の方法により 行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業 者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。

投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 (体 重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0. 1から 500mg、 好ましくは約 1. 0から lOOmg, より好ましくは約 1. 0から 20mgであると考えられる。

非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとし て） においては、 通常、 1日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 よ り好ましくは約 0. 1から lOmg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考 えられる。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面積 あたりに換算した量を投与することができる。

図面の簡単な説明 図 1は、 ヒト NPR- A/マウス G- CSFRキメラ受容体の塩基配列 （上段） 及びアミノ 酸配列 （下段） を示した図である。 ヒト NPR- Aアミノ酸配列は四角で囲み、 マウス G-CSF受容体アミノ酸配列は何も付さずに示した。 マウス G-CSF受容体の膜貫通領 域を下線で示した。

図 2は、 図 1の続きの図である。

図 3は、 図 2の続きの図である。

図 4は、 ヒト NPR-Aおよびヒ卜 NPR-BZマウス G- CSFRキメラ受容体発現ベクター のベクターマップを示す図である。 図 5は、 ヒ卜 NPR- B/マウス G- CSFRキメラ受容体の塩基配列 (上段) 及びアミノ 酸配列 (下段) を示したものである。 ヒト NPR- Bアミノ酸配列を斜体で、 マウス G- CSF受容体の膜貫通領域を下線で示した。

図 6は、 図 5の続きの図である。

-図 7は、 NPRAGの、 ァゴニス卜活性を示すグラフである。 吸光度を縦軸に、 ヒト ANP濃度を横軸に示す。

図 8は、 NPRBGの、 ヒト CNPに対する細胞増殖活性を示すグラフである。 吸光度 を縦軸に、 ヒト CNP濃度を縦軸に示す。

図 9は、 NPRAGのヒ 1、CNP及びヒト ANPに対する細胞増殖活性を示すグラフである < 吸光度を縦軸に、 ヒ卜 CNP及びヒ卜 ANP濃度を縦軸に示す。

図 1 0は、 NPRBGのヒト CNP及びヒト ANPに対する細胞増殖活性を示すグラフであ る。 吸光度を縦軸に、 ヒト CNP及びヒト ANP濃度を縦軸に示す。

発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。 〔参考実施例〕 PCVベクタ一の作製

発現プラスミドベクタ一 pCVは、 pCOSl (国際特許公開番号 1)98/13388 「Ant ibody agains t human parathormone related pept idesJ 参照) の; oly (A)付 加シグナルをヒト G-CSF由来のものに置換し構築した。 pEF- BOS (Mizushima S. et al. (1990) Nuc. Acid. Res. , 18, 5322) を Eco RIおよび Xba Iで切断し、 ヒト G- CSF由来の poly (A)付加シグナル断片を得た。 この断片を pBacPAK8 (CL0NTECH) に Eco RI/Xba I部位で挿入した。 これを Eco RIで切断したのち両端を平滑化し、 Bam HIで消化した。 これにより、 5'末端に Bam HI部位が付加し、 3'末端が平滑化され たヒ卜 G- CSF由来の poly (A)付加シグナルを含む断片を得た。 この断片と pCOSlの poly (A)付加シグナル部分を Bam HI/Eco RV部位で置換し、 これを pCVとした。

〔実施例 1〕 ヒト NPR- A/マウス G- CSFR キメラ受容体発現べク夕一の作製 h腿 an kidney cDNA (Marathon ready cDNA, CL0NTECH) を铸型にして以下のプ ライマー

NPR-5'： ATGCGCCCCGCTGGCTCCCGCC (配列番号： 5 )

匪 - 3' ： CAGGGAGCCGTAATTGGAGCCTC (配列番号： 6 )

を用いて PCRを行い、 hNPR- A遺伝子 （アミノ酸 1〜539) をクローニングした。

次に、 この遺伝子断片を踌型に、 以下のプライマー '

hNPR-5' -No t l ： TTGCGGCCGCCACCATGCGCCCCGCTGGCTCCCG (配列番号： 7 )

hNPR-3' -Bgl I I ：

ACCAGATCTCCAGGAAAATGTTTAAGTCAGATGGATCGGTGGAAAGGTGATCTTGGTTGC (配列番号： 8 )

を用いて PCRを行い、 hNPR- Aの細胞外領域 （アミノ酸卜 467) と、 マウス G- CSF受容 体の膜貫通領域直前から下流領域 （アミノ酸 598 - 812 (Fulomaga, R. et al. , (1990) Ce l l, 61, 341-350) ) の cDNAを連結し、 ヒト NPR- AZマウス G- CSFRキメラ 受容体 GDNAを作製した。 これを発現プラスミドベクター pCVの HEFlaプロモー夕一 の下流に挿入し、 ヒト NPR-A/マウス G- CSFRキメラ受容体発現ベクターを構築した _c 本発現ベクターが発現する蛋白、 すなわちヒト NPR-A/マウス G-CSFRキメラ受容 体の塩基配列、 およびアミノ酸配列を図 1〜図 3に、 ヒト NPR- AZマウス G-CSFRキ メラ受容体発現べクタ一のべクタ一マップを図 4 (ベクターマップ) に示した。 また、 ヒト NPR- AZマウス G-CSFRキメラ受容体の塩基配列を配列番号： 1、 ァミノ 酸配列を配列番号： 2にそれぞれ示す。

〔実施例 2〕 ヒト NPR- B/マウス G- CSFRキメラ受容体発現べクタ一の作成 human ki dney cDNA (CL0NTECH) を踌型にして以下のプライマー

NotNPRB-s : AGCGGCCGCTATCCCATGGCGCTGCCATCACTTCTGC (配列番号： 9 )

BglNPR2-a： CTGAGAAGATCTCCAGGAAAATGTTTAAAATTGCCAGGGTTGAAAGTGGAGT (配列番 号： 1 0 )

を用いて PCRを行い、 PR- B遺伝子の細胞外領域 （アミノ酸 1—458) を増幅した。 このフラグメントをマウス G - CSF受容体の膜貫通領域及びその下流領域 (アミノ酸 602-812) の cDNAと連結し、 ヒト NPR- B/マウス G- CSFRキメラ受容体 cDNAを得た。 こ れを発現プラスミドベクタ一 pCVの EFlaプロモーターの下流に挿入し、 ヒト NPR - B/ マウス G- CSFRキメラ受容体発現べクタ一を構築した。

本ベクターが発現する蛋白、 すなわちヒト NPR-B/マウス G- CSFRキメ'ラ受容体の 塩基配列、 およびアミノ酸配列を図 5および 6に、 ヒト NPR-B/マウス G- CSFRキメ ラ受容体発現べクタ一のベクターマップを図 4に示した。 また、 ヒト NPR- B/マウ ス G- CSFRキメラ受容体の塩基配列を配列番号： 3、 アミノ酸配列を配列番号： 4 にそれぞれ示す。

〔実施例 3〕 キメラ受容体発現細胞株の樹立 エレクトロボ一レーシヨン装置 （Gene Pul ser： Bio Rad) により、 直鎖状にし たヒト NPR-A/マウス G-CSFRキメラ受容体発現遺伝子ベクターをマウス Ba/F3細胞 (理化学研究所より購入： Cel l No. RCB0805) に導入した。 Ba/F3細胞をダルべッ □ PBS (以下、 PBSと称す） で 2回洗浄したのち、 PBSに約 1 X 10⁷細胞/ mLの細胞密度 になるように懸濁した。 この懸濁液 0. 8inLに直鎖状にした発現べクタ一 DNAを 加えてジーンパルサーキュべット (Bio Rad, 0. 4cm, Cat No. 165-2088) に移した。 ジーンパルサー （Bio Rad) を用いて、 0. 33kV、 960 Fの静電容量にてパルスを与 えた。

室温にて約 10分間静置したのち、 エレクトロボ一レーシヨン処理した細胞を 0. 2ng/mLのマウス IL-3を含む培地 Aに懸濁し、 96穴マイクロウェル平底プレー卜 (Falcon) に IOO L/穴となるように播種した。 C0₂インキュベーター （C0₂濃度： 5¾) で約 24時間培養し、 これに 3x10— ¾1/Lのヒト ANP (ハンプ注射用 1000、 ゼリア 新薬工業) を含む培地 Aを 100 L/穴加え、 C0₂インキュベーター （C0₂濃度： 5%) で 培養した。 培地 Aは 10%ゥシ胎児血清 (HyClone, Cat No. SH30071. 03, Lot

No. AKE11829) 及びぺニシリン 100単位/ mLならびにストレプトマイシン 0. lmg/niL (GIBC0) を含む RPMI 1640培地 (GIBC0) を用いた。 培養開始から約 1週間後に検鏡 し、 単コロニーの穴から細胞を回収し、 3xl0-¾ol/Lあるいは 3x10— ¾ol/Lのヒト ANPを含む培地 Aで継代培養した。 継代培養は、 1週間に 2あるいは 3回程度の頻度で 実施し、 細胞密度が lxl0^Bcel l s/mLを超えないようにした。 細胞を培地 Bで 2回洗浄 したのち、 5 X 10⁴細胞/ mLの細胞密度になるように培地 Bに懸濁した。 培地 Bは、 CH0- S- SFMII培地 （GIBC0) 、 10%ゥシ胎児血清を含む RPMI 1640培地、 あるいは 10% ゥシ胎児透析血清 （HyClone, Cat No. SH30079, Lot No. ALA13106) を含む RPMI 1640培地を用いた。 ヒト ANPを培地 Bで適当に希釈し、 細胞懸濁液 25 ^ 17穴、 希釈したヒト ANP 25 L/穴を 96穴マイクロウェル平底ハーフエリアプレート

(Costar) に分注し、 C0₂インキュベーター （C0₂濃度： 5%) で 3日間培養した。 培 養後、 WST- 8試薬 （Cel l Count ing Ki卜 8：同仁化学研究所） を 10 L/穴加え、 C0₂ インキュベータ一 （C0₂濃度： 5%) で 2時間インキュベートし、 吸光マイクロプレ ートリーダ— (Sunrise class ic : Wako) を用いて測定波長 450nm、 対照波長 655nm の吸光度を測定した。 2時間後の吸光度を縦軸に、 ヒト ANP濃度を横軸にとり、 生 細胞数を指標にした細胞増殖活性をもとに、 ヒト ANPに感受性の高い細胞株を選択 し、 これをキメラ ANP受容体発現細胞株 NPRAGとした （図 7 ) 。

〔実施例 4〕 ヒト NPR- B/マウス G- CSFRキメラ受容体発現細胞株の樹立

実施例 3と同様の手順でヒト NPR-B/マウス G- CSFRキメラ受容体発現遺伝子べク ターをマウス Ba/F3細胞に遺伝子導入した。

室温にて約 10分間静置したのち、 エレクト口ポーレーシヨン処理した細胞を終 濃度 1 nraol/mLのヒト CNPを含む培地 Aに懸濁した。 これを 96穴マイクロウェル平底 プレート (Falcon) に 100 /iL/穴となるように播種し、 C0₂インキュベーター (C0₂ 濃度： 5 ) で培養した。 培養開始から約 1週間後に検鏡し、 単コロニーの穴から細 胞を回収し、 終濃度 l nmol/mLのヒト CNPを含む培地 Aで継代培養した。 継代培養は、 1週間に 2あるいは 3回程度の頻度で実施し、 細胞密度が kl0⁶cel l s/niLを超えない ようにした。 細胞を培地 Cで 2回洗浄したのち、 5 X 10⁴細胞/ mLの細胞密度になるよ うに培地 Cに懸濁した。 培地 Cは、 5%ゥシ胎児血清及びペニシリン 100単位/ mLなら びにストレプトマイシン 0. Img/mL (GIBCO) を含む RPMI 1640培地 (GIBC0) を用い た。 ヒト CNPを培地 Cで適当に希釈し、 細胞懸濁液 50 i L/穴、 希釈したヒト CNP 50 L/穴を 96穴マイクロウェル平底プレート (Falcon) に分注し、 C0₂インキュベー 夕一 (C0₂濃度： 5%) で 3日間培養した。 培養後、 WST - 8試薬 (Cel l Count ing Ki ts '.同仁化学研究所） を 10 L/穴加え、 C0₂インキュベーター （C0₂濃度： 5%) で 3時 間インキュベートし、 ARV0マイクロプレートリーダ一 （Wal lac) を用いて測定波 長 450nmの吸光度を測定した。 吸光度を縦軸に、 ヒト CNP濃度を横軸にとり、 生細 胞数を指標にした細胞増殖活性をもとに、 ヒト CNPに感受性の高い細胞株を選択し、 これをキメラ CNP受容体発現細胞株 NPRBGとした （図 8 ) 。 〔実施例 5〕 キメラ受容体発現細胞株 NPRAG及び NPRBGのリガンド特異的細胞増 殖性

樹立したキメラ ANP受容体発現細胞株 NPRAG及びキメラ CNP受容体発現細胞株 NPRBGを培地 Cで 2回洗浄したのち、 5 X 細胞/ mLの細胞密度になるように培地 Cに 懸濁した。 細胞懸濁液 50 L/穴、 及び培地 Cで適当に希釈したヒト ANPあるいはヒ ト CNP 50 /2 L/穴を 96穴マイクロウェル平底プレー卜 (Falcon) に分注し、 C0₂イン キュベータ一 （C0₂濃度： 5%) で 3日間培養した。 培養後、 実施例 4と同様に WST- 8 試薬にて細胞増殖アツセィを実施し、 リガンド特異的な細胞増殖性を測定した (図 9および 1 0 ) 。 産業上の利用の可能性

本発明により、 膜型グァニル ·サイクレース由来の細胞外領域と、 膜型グァニ ル ·サイクレース以外の受容体由来の細胞内領域からなるキメラ受容体が提供さ れた。 該受容体を利用することで., 膜型グァニル ·サイクレース、 特にナトリウ ム利尿べプチド受容体のリガンド又は阻害物質のスクリ—ニングが可能となり、 該物質は様々な疾患の治療薬になり得ることが期待される。

Claims

請求の範囲

I . 膜型グァニル 'サイクレース由来の細胞外領域と、 膜型グァニル 'サイク レース以外の受容体由来の細胞内領域を含むキメラ受容体。

2 . 膜型グァニル ·サイクレースがナトリゥム利尿べプチド受容体である請求 項 1に記載のキメラ受容体。

3 . ナトリゥム利尿べプチド受容体が NPR-Aである請求項 2に記載のキメラ受容 体。

4. ナトリゥム利尿べプチド受容体が NPR- Bである請求項 2に記載のキメラ受容 体。

5 . 膜貫通領域をさらに含む請求項 1〜4のいずれかに記載のキメラ受容体。

6 . 膜型グァニル ·サイクレース以外の受容体がサイトカイン受容体である請 求項 1〜 5のいずれかに記載のキメラ受容体。

7 . サイトカイン受容体が顆粒球コロニー刺激因子受容体である請求項 6に記 載のキメラ受容体。

8 · 請求項 1〜 7のいずれかに記載のキメラ受容体をコ一ドする DNA。

9 . 請求項 8に記載の DNAを含有するベクター。

1 0 . 請求項 9に記載のベクターを含有する細胞。

I I . 請求項 1〜 7のいずれかに記載のキメラ受容体を発現する細胞。

1 2 . ナトリゥム利尿べプチド依存性増殖を示す、 請求項 2〜 4の'いずれかに 記載のキメラ受容体を発現する細胞。

1 3 . 以下の工程を含む受容体のリガンドのスクリーニング方法。

(a)請求項 1〜 7のいずれかに記載のキメラ受容体に被検物質を接触させ る工程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被検 物質を選択する工程 .

1 4 . 以下の工程を含む受容体のリガンドのスクリーニング方法。

(a)請求項 1 0〜1 2のいずれかに記載の細胞に被検物質を接触させるェ 程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被検 物質を選択する工程

1 5 . 以下の工程を含む受容体の阻害物質のスクリーニング方法。

(a)請求項 1〜 7のいずれかに記載のキメラ受容体に被検物質及び該キメ ラ受容体のリガンドを接触させる工程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被検 物質を選択する工程

1 6 . 以下の工程を含む受容体の阻害物質のスクリーニング方法。

(a)請求項 1 0〜 1 2のいずれかに記載の細胞に被検物質及び該キメラ受 容体のリガンドを接触させる工程、

(b)生理活性を測定する工程、

(c)被検物質を接触させない場合と比較して、 生理活性を変化させる被検 物質を選択する工程

1 7 . 請求項 1 3〜： L 6のいずれかに記載のスクリ—ニング方法に'より単離さ れた物質。