WO2004055186A1 - Guanosine triphosphate-binding protein-coupled receptor - Google Patents

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WO2004055186A1
WO2004055186A1 PCT/JP2003/016245 JP0316245W WO2004055186A1 WO 2004055186 A1 WO2004055186 A1 WO 2004055186A1 JP 0316245 W JP0316245 W JP 0316245W WO 2004055186 A1 WO2004055186 A1 WO 2004055186A1
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dna
polynucleotide
present
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PCT/JP2003/016245
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Inventor
Makiko Suwa
Kiyoshi Asai
Yutaka Akiyama
Hiroyuki Aburatani
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Toudai Tlo, Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide belonging to the family 1 of a guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor (hereinafter referred to as “GPCR”), a polynucleotide encoding the polypeptide, and production and use of these molecules.
  • GPCR guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor
  • GPCR (Baldwin, J. J Curr. Op in. Cell Biol. 6, 180-190 (1994)., Strader, CD, et al. FASEB. J. 9, 745-754 (1995)., Bockaert, J., Pin, JP EM BO. Drugs targeting J. 18, 1723-1729 (1999).) Are the majority. For this reason, GPCR is one of the most important targets for discovering genes for drug design.
  • GPCRs are involved in signal transduction induced by specific ligands such as adrenaline and acetylcholine, and the characteristics of their binding mechanisms have been extensively investigated by experiments (Watson, S & Arkinsrtall, S. The G-prote in Linked receptor Facts Book. (Academic Press, London)).
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and its purpose is to develop an automatic method for efficiently extracting GPCR sequences from human genome sequences, thereby comprehensively identifying novel GPCRs. There is.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the novel GPCR identified as described above.
  • One preferred embodiment of the novel GPCR provides an application for screening for drug candidate compounds such as ligands.
  • the present invention provides a method for examining a disease using the mutation or abnormal expression of the novel GPCR as an index.
  • the present invention provides a novel GPCR or a molecule that modulates its activity for use in the treatment of diseases.
  • the first step is gene prediction, ie, translation from genomic sequence to amino acid sequence.
  • Many of the known GPCR genes do not contain introns, so 6-frame expansion of nucleotide sequences can be supported to some extent, but for sequences with multiple exons, the entire gene structure can be predicted using a gene discovery program. There is a need to.
  • the second stage consists of a triple analysis of the amino acid sequence. That is, (1) searching for sequences for known GPCR devices, (2) motif and domain assignment, and (3) transmembrane helix (TMH) prediction.
  • TMH transmembrane helix
  • the former two techniques are used to find closely related GPCR homologues, while TMH prediction is used to deal with distantly related GPCR homologues.
  • the candidate sequences are screened by taking the union of the results of each of the three analyses. The present inventors used union to maximize the number of candidate sequences at the screening stage.
  • the third step is to further refine the quality of the candidate gene by deleting duplicate sequences or fusing fragment sequences separated by misprediction.
  • This automated system allows efficient and comprehensive discovery of GPCR sequences.
  • a major advantage of this automatic system is that it can be detected even with GPCR sequences consisting of Marchexon and distantly related homolog sequences that were difficult to find with conventional methods.
  • the inventors succeeded in identifying 1215 new GPCR sequences guaranteed with high reliability from the entire human genome by using this automated system developed uniquely, and cDNA for one of these clones was identified. Isolated.
  • the discovery of new GPCR sequences is based on the discovery of ligands, antagonists or antagonists that are expected to be useful as pharmaceuticals. Enables cleaning. GPCRs are thought to have important functions in vivo, and abnormal expression or function can cause various diseases. For this reason, it is possible to examine such diseases by using inappropriate activity or expression of the identified GPCR as an index. Identified GPCRs, the polynucleotides that encode them, and ligands, antagonists or agonists for the identified GPCRs would be suitable therapeutics for these diseases.
  • the present invention relates to a novel GPCR and its gene, and their production and use. More specifically, the present invention provides the following (1) to (32).
  • the polynucleotide according to any one of (a) to (d).
  • the method for producing the polypeptide according to (5) comprising the step of culturing the host cell according to (4) and recovering the produced polypeptide from the host cell or a culture supernatant thereof. .
  • a kit comprising at least one molecule according to (a) or (b).
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount above.
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount above.
  • step (d) The process of comparing the base sequence of DM determined in step (c) with the control.
  • GPCR guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor
  • polynucleotide means a ribonucleotide or deoxynucleotide, which is a polymer composed of a plurality of bases or base pairs.
  • Polynucleotides include single and double stranded DNA. Polynucleotides are unmodified from their naturally occurring state, and modified Is meant to include both. Modified bases include, for example, tritylated bases and special bases such as inosine.
  • polypeptide means a polymer composed of a plurality of amino acids. Thus, oligopeptides and proteins are also included in the polypeptide concept. Polypeptide is meant to include both unmodified and modified from the naturally occurring state.
  • Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, phosphatidylinositol Covalent bond, crosslinking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, covalent bridge formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, alpha-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, RNA-mediated addition of amino acids to proteins such as hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolysis, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, arginylation, Includes ubiquitination.
  • isolated refers to a substance (eg, a polynucleotide or polypeptide) that has been removed from its original environment (eg, the natural environment if it occurs naturally). It has been changed by human hands. “Isolated” is meant to include compounds present in a sample substantially enriched in the compound of interest and compounds present in a sample in which Z or the compound of interest is partially or substantially purified. As used herein, the term “substantially purified” is separated from its natural environment and is free of at least 60%, preferably 75%, and most preferably 90% of other components associated with nature. Refers to a compound (eg, a polynucleotide or polypeptide).
  • a “mutation” is an amino acid change in an amino acid sequence or a base change in a base sequence (ie, single or multiple amino acids). Or nucleotide substitution, deletion, addition or insertion). Accordingly, a “variant” as used herein refers to an amino acid sequence in which one or more amino acids are changed or a base sequence in which one or more bases are changed. This change in the base sequence of the mutant may or may not change the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide.
  • the mutant may be a naturally occurring mutant such as an allelic mutant or a mutant that is not known to exist naturally. A variant may have conservative changes in which the substituted amino acid has similar structural or chemical properties.
  • the variant may have non-conservative substitutions.
  • Guidance on determining which and how many amino acid residues to replace, insert, or delete without inhibiting biological or immunological activity is well known in the art. It can be found using a computer program such as DNA Star software.
  • a “deletion” is an amino acid or nucleotide sequence in which one or more amino acid or nucleotide residues are not present compared to the amino acid sequence or nucleotide sequence of a naturally occurring GPCR or GPCR-related polypeptide, respectively. Any change.
  • an “insertion” or “addition” is an amino acid or nucleotide to which one or more amino acid or nucleotide residues are added, respectively, compared to the amino acid sequence or nucleotide sequence of a naturally occurring GPCR or GPCR-related polypeptide. It is a sequence change.
  • substitution is an amino acid or nucleotide sequence in which one or more amino acids or nucleotides are replaced with different amino acids or nucleotides as compared to the amino acid sequence or nucleotide sequence of a naturally occurring GPCR or GPCR-related polypeptide. It is a change.
  • hybridization refers to the process by which a nucleic acid strand binds to a complementary strand through base pairing.
  • treatment generally means obtaining a pharmacological and / or physiological effect. The effect may be prophylactic in that the disease or symptom is completely or partially prevented, or may be therapeutic in that the symptom of the disease is completely or partially treated.
  • treatment includes all treatment of diseases in mammals, particularly humans. In addition, the term includes prevention of the onset of a subject who is predisposed to the disease but has not yet been diagnosed, suppressing the progression of the disease, or reducing the disease.
  • ligand means a molecule that binds to a polypeptide of the invention.
  • Ligand includes natural and synthetic ligands.
  • Antist means a molecule that binds to and activates a polypeptide of the invention.
  • an evening gonist means a molecule that inhibits activation of the polypeptide of the present invention.
  • the present invention provides a novel polypeptide belonging to the GPCR family.
  • the nucleotide sequence of a human-derived polynucleotide identified by the present inventors contained in the present invention is shown in SEQ ID NO: 19 and the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the polynucleotide is shown in SEQ ID NO: 20.
  • GPCR has the activity to transmit intracellular hesidanal through the activation of G protein by the action of its ligand, including genetic diseases, cranial nervous system, circulatory system, digestive system, immune system, exercise It is associated with a vast number of diseases, including the genital system and the urogenital system. Therefore, the polypeptide of the present invention can be used for screening of a ligand, an agonis moth or an antagonism moth that regulates its function, and is an important target for the development of a pharmaceutical for the above diseases.
  • the present invention also provides polypeptides that are functionally equivalent to the polypeptides identified by the present inventors.
  • “functionally equivalent” means that the subject polypeptide has the same biological characteristics as the polypeptide identified by the present inventors. Means that.
  • Biological properties of GPCRs include the ability to transduce signals into cells through the binding activity of ligands and the activation of trimeric GTP-binding proteins. Trimeric GTP-binding proteins are classified into three types: GQ type that increases Ca ' 2+ , Gs type that increases cAMP, and Gi type that suppresses cAMP, depending on the type of intracellular transmission system that is activated. Classified into categories (Trends Pharmacol. Sci. (99) 20: 118). Therefore, whether or not the polypeptide of interest has the same biological characteristics as the polypeptide identified by the present inventors can be determined by, for example, determining the intracellular cAMP concentration or calcium by activation. It can be evaluated by detecting changes in concentration.
  • One embodiment of a method for preparing a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors is a method of introducing a mutation into an amino acid sequence in a protein.
  • Such methods include, for example, site-directed mutagenesis (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publ is h. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)).
  • amino acid mutations in polypeptides may occur in nature.
  • one or more amino acids are substituted in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) of the polypeptide identified by the present inventors, whether artificial or naturally occurring.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution from the viewpoint of maintaining the function of the protein.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Tn are all classified as nonpolar amino acids, and thus are considered to have similar properties.
  • uncharged properties include Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin.
  • acidic amino acids include Asp and Glu
  • examples of basic amino acids include Lys, Arg, and His.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in these polypeptides are retained. There are no restrictions as far as possible.
  • the number of mutations will typically be within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids.
  • the stringent hyperprecipitation conditions for isolating DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors are usually “lxSSC, 0.13 ⁇ 4 SDS , 37 '', more severe conditions are ⁇ 0.5xSS 0.1 3 ⁇ 4 SDS, 42t: '', and more severe conditions are ⁇ 0.2xSSC, 0.1% SDS '' It is a condition of “about 65”. As the hybridization conditions become more severe, the isolation of DNA having a high homology with the probe sequence can be expected.
  • the above combinations of SS SDS and temperature conditions are examples, and those skilled in the art will determine the stringency of the hybridization.
  • the above-mentioned or other factors for example, probe concentration, probe length, hybridization reaction time, etc. can be combined as appropriate to achieve the same stringency as described above.
  • Polypeptides encoded by DNA isolated using such hybridization technology usually have high homology in amino acid sequence with the polypeptides identified by the present inventors.
  • High homology means at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably at least 95% or more, more preferably at least 97% or more (e.g. 98-99%).
  • the identity of amino acid sequences can be determined, for example, by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2 264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, by Karl in and Altschul, 1993).
  • BLASTX a product called BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990).
  • score 50
  • wordlength 3 for example.
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov.).
  • a primer is designed based on a part of the DNA sequence (SEQ ID NO: 19), and a DNA fragment highly homologous to the DNA sequence encoding the polypeptide identified by the present inventors is isolated, It is also possible to obtain a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors based on DNA.
  • polypeptides of the present invention may be in the form of a “mature” protein or may be part of a larger protein, such as a fusion protein.
  • Polypeptide of the present invention may include secretory or leader sequences, pro sequences, sequences useful for purification, such as multiple histidine residues, or additional sequences that ensure stability during recombinant production.
  • the present invention also provides fragments of the polypeptides of the present invention.
  • a fragment is a polypeptide having an amino acid sequence which is entirely the same as a part of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention but not the same.
  • the polypeptide fragment of the present invention is a polypeptide fragment consisting of a sequence of usually 8 amino acid residues or more, preferably 12 amino acid residues or more (for example, 15 amino acid residues or more). Suitable fragments include, for example, deletion of a series of residues containing an amino terminus or a series of residues containing a carboxyl terminus, or a series of residues containing an amino terminus and a series of residues containing a carboxyl terminus.
  • fragments having amino acid sequences deleted of duplicate residues.
  • ⁇ -helix and ⁇ -helix formation region [] 3 sheet and / 3 sheet formation region, turn and turn formation region, coil and coil formation region, hydrophilic region, hydrophobic region, lyophilic region, / 3 parents
  • fragments characterized by structural or functional properties, such as fragments comprising a basal region, a variable region, a surface forming region, a substrate binding region, and a high antigen index region.
  • Other suitable fragments are biologically active fragments.
  • Biologically active fragments are those that mediate the activity of a polypeptide of the invention, including fragments with similar activity, fragments with enhanced activity, or fragments with reduced undesirable activity.
  • a fragment having an activity of binding a ligand to perform signal transduction into a cell can be mentioned.
  • fragments that are antigenic or immunogenic in animals, particularly humans are also included.
  • These polypeptide fragments preferably retain the biological activity of the polypeptide of the present invention, including antigenic activity.
  • Variants of the identified sequences and fragments also form part of the present invention.
  • Preferred variants are those that differ from the target by conservative amino acid substitutions, that is, a residue that is substituted with another residue of similar nature. Typical Such substitutions are between Ala, Val, Leu and lie, between Ser and Thr, between acidic residues Asp and G1 u, between Asn and Gin, between basic residues Lys and Arg, or aromatic Occurs between residues Phe and Tyr.
  • a fragment that binds to a ligand and does not perform signal transduction in a cell is useful because it can be a competitive inhibitor of the polypeptide of the present invention, and such a fragment is also included in the present invention.
  • polypeptides of the present invention can be produced by any suitable method.
  • Such polypeptides include an isolated naturally occurring polypeptide, a recombinantly produced polypeptide, a synthetically produced polypeptide, or a polypeptide produced by a combination of these methods. Is included. Means for the production of such polypeptides are well understood in the art.
  • a recombinant polypeptide can be prepared, for example, by introducing a vector inserted with the polynucleotide of the present invention into a suitable host cell and purifying the polypeptide expressed in the transformant.
  • a naturally-occurring polypeptide can be prepared, for example, by using a affinity ram bound with an antibody against the polypeptide of the present invention described later (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. al. (1 987) Publish. John Wiley & Sons Section 16.1-16.19).
  • the antibody used for affinity purification may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • In vitro translation see, for example, “0n the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbi t reticulocyte lysate syste m.
  • polypeptide of the present invention It is also possible to prepare the polypeptide of the present invention by, for example.
  • the polypeptide fragment of the present invention can be produced, for example, by cleaving the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20; a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19; A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 but comprising a base sequence different from the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 due to the degeneracy of the genetic code is included.
  • the polynucleotide of the present invention further encodes a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide encoded by these polynucleotides, and is at least 40% or more, preferably 60%, in the polynucleotide sequence and its total length. More preferably, 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more (for example, 98 to 99%) including a polynucleotide containing the same base sequence. It is.
  • the identity of the base sequence can be determined by, for example, the algorithm BLAST (Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Pro Nat l. Acad. Sci.
  • the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the above-mentioned polynucleotide.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained by standard cloning and screening, for example, from a cDNA library derived from mRNA in cells.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained from a natural source such as a genomic DNA library, and can also be synthesized using known techniques that are commercially available.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having a significant homology with the polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors can be obtained by, for example, hybridization technology (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.). al. (1987) Publish.
  • a primer is designed based on a part of the polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors, and is highly homologous to the polynucleotide sequence.
  • the polynucleotide can be isolated. Therefore, the present invention includes a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 19 under stringent conditions. Stringent-end hybridization conditions are usually about “lxSS 0.13 ⁇ 4 SDS, 37”, and more severe conditions are about “0.5xSS 0.13 ⁇ 4 SDS, 42”. For example, the condition is about 0.2xSS (:, 0.13 ⁇ 4 SDS, 65).
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having significant homology with the polynucleotide sequence identified by the present inventors is mutated to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 (For example, site-specific mutagenesis (Current Protocols in Molecular Biology ed. Ausube let al. (1987) Publ i sh. John Wiley & Sons Sect i on 8.1) -8. It can also be prepared using 5)).
  • Such polynucleotides can also be caused by mutations in nature.
  • polypeptide in which one or a plurality of amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is substituted, deleted, inserted and / or added due to such mutation of the base sequence is used.
  • a polynucleotide that encodes is included.
  • the polynucleotide of the present invention when used for the recombinant production of the polypeptide of the present invention, the polynucleotide includes a mature polypeptide coding sequence or a fragment thereof alone, other coding sequences (eg, leader or secretory sequence). , Pre-, pro-, or pre-mouth protein sequences, or coding sequences for mature polypeptides that are in the same reading frame as those that encode other fusion peptide moieties) or fragments thereof. For example, a marker sequence that facilitates purification of the fusion polypeptide can be encoded.
  • the marker sequence is provided by the pcDNA3.1 / Myc-His vector (Invitrogen) and Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1989) 86:82 ⁇ 824. Hexa-histidine peptide as described in Myc tag.
  • the polynucleotide may also include 5 'and 3' non-coding sequences, such as transcribed but not translated sequences, splicing and polyadenylation signals, ribosome binding sites, and mRNA stabilizing sequences.
  • the present invention relates to a nucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, which is complementary to the polynucleotide identified by the present inventors (polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 19 or its complementary strand).
  • polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 19 or its complementary strand.
  • complementary strand refers to the other strand of one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs.
  • “Complementary” means at least 15 consecutive It is not limited to a completely complementary sequence in the nucleotide region, and at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and even more preferably 95% or more of the homology on the base sequence is sufficient. .
  • the algorithm described in this specification may be used.
  • Such a nucleotide can be used as a probe for detecting and isolating the polynucleotide of the present invention and as a primer for amplifying the nucleotide of the present invention. When used as a primer, it usually has a chain length of 15 to 100 nucleotides, preferably 15 to 35 nucleotides.
  • nucleotides having a chain length of at least 15 nucleotides, preferably at least 30 nucleotides, including at least a part or all of the sequence of the DNA of the present invention are used.
  • Such nucleotides are preferably those that specifically hybridize to the DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • “Specifically hybridize” means to hybridize with the nucleotide (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors under normal hybridization conditions, preferably under stringent conditions. It means not hybridizing with DNA encoding another polypeptide.
  • nucleotides include polynucleotides that suppress the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention.
  • polynucleotides include antisense DNA (DNA encoding antisense RNA complementary to the transcription product of the gene encoding the polypeptide of the present invention) or ribozyme (transcription of gene encoding the polypeptide of the present invention).
  • transcription initiation inhibition by triplex formation, and formation of a hybrid with a site where an open loop structure was locally created by RNA polymerase Transcriptional suppression by RNA Transcriptional inhibition by hybridization with RNA, which is being synthesized
  • Splicing suppression by formation of hybrid at the junction of intron and exon Splicing suppression by formation of hybrid with spliceosome formation site
  • Splicing with mRNA Suppression of transition from nucleus to cytoplasm due to hybridization suppression of splicing by hybridization with a capping site or poly (A) addition site, suppression of translation initiation by formation of a hybrid with a translation initiation factor binding site, ribosome binding site near the initiation codon Translational inhibition by the formation of hyperids, inhibition of peptide chain elongation by the formation of hybrids with mRNA translation regions and polymerase binding sites, and suppression of gene expression by the formation of hybrids between nucleic acid
  • the antisense DNA used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above.
  • designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of a gene would be effective in inhibiting gene translation.
  • a sequence complementary to the coding region or 3 'untranslated region is also used.
  • the DNA containing the antisense sequence of not only the translated region of the gene but also the sequence of the untranslated region is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the target gene or a part thereof, but may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcription product of the target gene.
  • the antisense DNA has a chain length of at least 15 bp, preferably 100 bp, more preferably 500 bp or more in order to cause an antisense effect. Have Usually, it has a chain length of 3000 bp or less, preferably 2000 bp or less.
  • antisense DNA may be applied to gene therapy for diseases caused by abnormality (functional abnormality or expression abnormality) of the polypeptide of the present invention.
  • the antisense DNA is, for example, based on the sequence information of DNA encoding the polypeptide of the present invention (for example, SEQ ID NO: 19) (Stein, 1988 Physicochemi cal roperties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids). Res 16, 3209-21 (1988)) and the like.
  • ribozyme is an RNA molecule that has catalytic activity.c Some ribozymes have various activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made site-specific cleavage of RNA possible. The target ribozyme can be designed.
  • Liposomes include group I introns and M1RNAs of RNaseP that are over 400 nucleotides in size, but the hammer-head type hairpin type has an active domain of about 40 nucleotides. Some have (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, (1990) Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves on the 3 'side of C15 of G13U14C15, but it is important for activity that U14 forms a base pair with A at position 9, and the base at position 15 Has been shown to be cleaved by A or cocoons in addition to C (M. Koizum i et al., (1988) FEBS Lett. 228: 225).
  • the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, a restriction enzyme-like RNA cleavage ribozyme that recognizes the U (:, UU or M sequence in the target RNA can be created.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention.
  • Type ribozymes are found, for example, in the negative strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (JMBuzayan Nature 323: 349, 1986) D It has been shown that this liposome can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Y. Kikuchi and N. Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751, Hiroshi Kikuchi, (1992) Chemistry and Biology 30: 112).
  • the polynucleotide that suppresses the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention can be used for gene therapy, for example, a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • -It is possible to administer to patients by ex vivo or in method using non-viral vectors such as
  • the present invention also provides a vector containing the polynucleotide of the present invention, a host cell carrying the polynucleotide of the present invention or the vector, and a method for producing the polypeptide of the present invention using the host cell. .
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it stably holds the inserted DNA.
  • E. coli is used as the host
  • the pBluescript vector (Stratagene) is used as the cloning vector. Is preferred.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses the polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in organisms.
  • the PBEST vector Promega PET vector (Invitrogen) for E. coli
  • pME18S-FL3 vector GenBank Accession No.
  • telomere sequence for cultured cells, pME18S vector (Mol Cell Biol. 8 for organisms) : 4 66-472 (1988)).
  • the DNA of the present invention can be inserted into the vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish). . John Wiley & Sons. Sect ion 11. 4-11. 11).
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • the cells for expressing the polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, St. phyllococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila S2). Spodoptera SF9), animal cells (eg, CH0, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • bacterial cells eg, Streptococcus, St. phyllococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus
  • insect cells eg, Drosophila S2). Spodoptera SF9
  • animal cells eg, CH0, COS, HeLa
  • Vectors can be introduced into host cells by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocol s in Mol e biar biology ed. Ausube let al. (1987) Publ i sh. John Wiley & Sons. Sec t ion 9. 1-9. 9), a ribofectamine method (GIBCO-BRL), a microinjection method and the like.
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest.
  • These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or they may be heterologous signals.
  • the polypeptide of the present invention is recovered when the polypeptide of the present invention is secreted into the medium.
  • the polypeptide of the present invention is produced intracellularly, the cell is first lysed, and then the polypeptide is recovered.
  • ammonium sulfate or ethanol precipitation acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Known methods can be used, including two-dimensional chromatography, seven droxyl apatite chromatography, and lectin chromatography.
  • the present invention provides a method for examining a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the polypeptide of the present invention or abnormal activity of the polypeptide of the present invention.
  • GPCRs are thought to have important functions in vivo, and abnormalities in their expression and function can cause various diseases. Therefore, it is possible to examine such diseases by using inappropriate activity or expression of the polypeptide of the present invention as an index.
  • “disease test” refers not only to a test for developing a treatment strategy for a subject exhibiting a symptom of a disease, but also to determine whether or not the subject is susceptible to a disease. Also included are preventive tests.
  • test method of the present invention is a method comprising detecting a mutation in a gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof in a subject.
  • a DNA sample is first prepared from a subject.
  • DNA samples can be prepared based on chromosomal DNA or RNA extracted from a subject's cells, such as blood, urine, saliva, tissue biopsy or autopsy material.
  • a chromosomal DNA can be cleaved with an appropriate restriction enzyme and cloned into a vector to prepare a genomic library.
  • reverse cDNA can be used to prepare a cDNA library from RNA.
  • a DNA encoding a gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof is isolated. Isolation of the DNA can be performed by screening a genomic library or cDNA library using a probe that hybridizes to the gene encoding the polypeptide of the present invention or DNA containing the expression control region thereof. it can. In addition, a genomic DNA library, a cDNA library, or RNA is selected using a primer that hybridizes to a gene encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region. It can also be isolated by typed PCR. In this method, the base sequence of the isolated DNA is then determined. The base sequence of the selected DNA can be determined by methods known to those skilled in the art.
  • control refers to the base sequence of a DNA containing a normal (wild type) gene encoding the polypeptide of the present invention or its expression control region. If the base sequence of the subject's DNA is different from the control as a result of such comparison, the subject is determined to be suffering from or at risk of developing the disease.
  • test method of the present invention various methods can be used in addition to the method for directly determining the base sequence of DNA derived from a subject as described above.
  • a DNA sample is first prepared from a subject.
  • the prepared DNA sample is cleaved with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments are then separated according to their size.
  • the size of the detected DNA fragment is then compared to a control.
  • a DNA sample is first prepared from a subject.
  • the gene encoding the polypeptide of the present invention or DNA containing its expression control region is amplified.
  • the amplified DNA is cleaved with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control.
  • Such methods include, for example, restriction fragment length polymorphism in the (Res tr ict ion Fragme nt Length Polymorphi sm / RFLP) c Specifically method and PCR-RFLP method, and the like utilizing, restriction enzymes If there is a mutation at the recognition site, or if there is a base insertion or deletion in the DNA fragment produced by the restriction enzyme treatment, the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment will vary compared to the control. By amplifying the portion containing this mutation by PCR and treating with each restriction enzyme, these mutations can be detected as the difference in mobility of bands after electrophoresis.
  • the chromosomal DNA is treated with these restriction enzymes, electrophoresed, and then the probe DNA of the present invention.
  • the presence or absence of mutation can be detected by performing Southern blotting using.
  • the restriction enzyme used can be appropriately selected according to each mutation.
  • RNA prepared from the subject in addition to genomic DNA, can be converted to cDNA using reverse transcriptase, cut with restriction enzyme, and then subjected to Southern blotting. It is also possible to amplify a DNA encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region by PCR using this cDNA as a saddle, cut it with a restriction enzyme, and then examine the difference in mobility. is there.
  • Another method is to first prepare a DNA sample from the subject. Next, a gene encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region is amplified. In addition, dissociate the amplified DNA into single-stranded DNA. The dissociated single-stranded DNA is then separated on a non-denaturing gel. Compare the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with the control.
  • Such methods include, for example, PCR-SSCP (single-strand conformation poly morphism) (Cloning and polymerase chain reaction-signal-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p5 3 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation pol ymorphism analysis of polymerase chain react ion products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6 (8 ): 1313-1318 ⁇ , Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling., PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282.).
  • PCR-SSCP single-strand conformation poly morphism
  • This method is particularly convenient for screening a large number of DNA samples because it is relatively easy to operate and has advantages such as a small amount of test sample.
  • the principle is as follows. When a double-stranded DNA fragment is dissociated into single strands, each strand forms its own higher-order structure that depends on the base sequence. When this dissociated DNA strand is electrophoresed in a polyacrylamide gel that does not contain a denaturing agent, single-stranded DNA with the same complementary strand length moves to a different position depending on the difference in each higher-order structure. To do. Monosalt The higher-order structure of this single-stranded DNA is also changed by group substitution, and shows different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting this change in mobility, it is possible to detect the presence of mutations due to point mutations, deletions or insertions in DNA fragments.
  • DNA containing the gene encoding the polypeptide of the present invention or its expression control region is amplified by PCR or the like.
  • a length of about 200 to 400 bp is usually preferable.
  • the amplified DNA product can be labeled by using a primer labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin.
  • the amplified DNA product can be labeled by adding a substrate base labeled with an isotope such as the above, a fluorescent dye, or piotin to the PCR reaction solution.
  • labeling can also be performed by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin using a Klenow enzyme after the PCR reaction to the amplified DNA fragment.
  • the labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like and electrophoresed on a polyacrylamide gel containing no denaturing agent such as urea.
  • the conditions for separating DNA fragments can be improved by adding an appropriate amount (about 5 to 10%) of glycerol to the polyacrylamide gel. Electrophoretic conditions vary depending on the nature of each DNA fragment, but are usually performed at room temperature (20 to 25). If favorable separation is not obtained, 4 to 3 (provides optimal mobility at temperatures up to TC).
  • the mobility of DNA fragments is detected by autoradiography using an X-ray film, or a scanner that detects fluorescence, etc. Bands with differences in mobility If this is detected, the band can be directly excised from the gel, amplified again by PCR, and sequenced directly to confirm the presence of the mutation. Dye the gel after electrophoresis with ethidium bromide or silver staining method. The band can be detected by.
  • Yet another method is to first prepare a DNA sample from a subject. Next, the gene encoding the polypeptide of the present invention or DNA containing its expression control region is amplified. C Further, the amplified DNA is separated on a gel in which the concentration of the DNA denaturant is gradually increased. Next, the mobility of the separated DNA on the gel is compared with the control.
  • Examples of such a method include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method).
  • the DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel with a denaturing agent concentration gradient, and the DNA fragments are separated according to the difference in instability.
  • DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel with a denaturing agent concentration gradient, and the DNA fragments are separated according to the difference in instability.
  • a mismatched unstable DNA fragment migrates to a certain denaturant concentration in the gel, the DNA sequence around the mismatch is partially dissociated into single strands due to the instability.
  • the mobility of this partially dissociated DNA fragment is very slow and can be separated from the mobility of a complete double-stranded DNA without a dissociated part.
  • a gene encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region is amplified by a PCR method using the primer of the present invention, and the concentration of denaturing agents such as urea is transferred. Electrophorese in a polyacrylamide gel that gradually increases as you proceed and compare to the control. In the case of a DNA fragment with mutation, the DNA fragment becomes single-stranded at a lower denaturant concentration position, and the movement speed becomes extremely slow, so the presence or absence of mutation is detected by detecting this difference in mobility. can do.
  • the allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position. If an oligonucleotide containing a nucleotide sequence that is considered to have a mutation is prepared and hybridized with this sample DNA, the hybridization efficiency will be reduced if the mutation exists. This can be detected by the Southern plot method or the method of using a special fluorescent reagent that quenches by intercalating into the hybrid gap. Also, Detection by the ribonuclease A mismatch cleavage method is also possible.
  • a DNA containing a gene encoding the polypeptide of the present invention is amplified by a PCR method or the like, and a labeled RNA and a hybridization prepared from a control cDNA incorporated into a plasmid vector or the like are used. Do. Since the hybrid has a single-stranded structure in the part where the mutation exists, the presence of the mutation can be detected by cleaving this part with liponuclease A and detecting this part by radiography etc.
  • test method of the present invention is a method comprising detecting the expression level of a gene encoding the polypeptide of the present invention.
  • gene expression includes transcription and translation.
  • expression product includes mRNA and protein.
  • RNA sample is prepared from a subject.
  • the amount of RNA encoding the polypeptide of the present invention contained in the RNA sample is measured.
  • the measured amount of RNA encoding the polypeptide of the present invention is then compared to a control.
  • Examples of such a method include Northern blotting using a probe that hybridizes to a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, or RT using a primer that hybridizes to a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • -A PCR method etc. can be illustrated.
  • a DNA array (new genetic engineering handbook, Masaaki Muramatsu, Masaru Yamamoto, Yodosha, P280-284) can be used for the examination at the transcription level of the gene encoding the polypeptide of the present invention.
  • a cDNA sample prepared from a subject and a substrate on which a polynucleotide probe that hybridizes with a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention is immobilized are provided.
  • the polynucleotide probe immobilized on the substrate may be of a plurality of types in order to detect a plurality of types of polynucleotides encoding the polypeptide of the present invention.
  • CD from the subject The preparation of the NA sample can be performed by a method well known to those skilled in the art.
  • total RNA is first extracted from the subject's cells.
  • the cells for example, blood, urine, saliva, tissue biopsy or autopsy material cells can be exemplified. Extraction of c total RNA can be performed, for example, as follows. Existing methods and kits can be used as long as they can prepare high-purity total RNA. For example, after pretreatment using Ambion's RNA RNA, total RNA is extracted using Nibonbon Gene's Isoge. Specific methods may follow those attached protocols.
  • cDNA synthesis is performed using reverse transcriptase to prepare a cDNA sample.
  • Synthesis of cDNA from total RNA can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can be detected, and examples thereof include fluorescent substances and radioactive elements. Labeling can be performed by methods commonly used by those of ordinary skill in the art (L Luo et al., Gene express ion prof iles of laser-captured acent neuronal subtypes. Nat Med. 1999, 117-122). .
  • the “substrate” means a plate-like material on which a polynucleotide can be immobilized.
  • the substrate of the present invention is not particularly limited as long as the polynucleotide can be immobilized. Ifi, a substrate generally used in DNA array technology can be preferably used.
  • DNA array technology is that the amount of hybridization solution is very small, and very complex evenings containing cDNA derived from total cellular RNA can be hybridized to immobilized nucleotide probes.
  • a DNA array consists of thousands of nucleotides that are densely printed on a substrate. Usually these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate. The surface layer of the substrate is generally glass, but a porous membrane such as a nitrocellulose membrane can be used.
  • nucleotide immobilization There are two types, one is a polynucleotide-based array developed by Ai iymetrix, and the other is a cDNA array developed mainly at Stanford University.
  • the polynucleotides are usually synthesized in situ (/ '/ ?.
  • photoli thiographic technology Al iyme tr ix
  • inkjet Raset ta Inpharmat for immobilizing chemicals
  • the in situ synthesis method of polynucleotides by the technology etc. is already known, and any technique can be used for the production of the substrate of the present invention.
  • the polynucleotide probe of the present invention includes a polynucleotide or cDNA, as long as it specifically hybridizes with a gene that encodes a polypeptide.
  • “To hybridize” means substantially hyper-hydidized with a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, Other polynucleotides mean that they do not substantially hybridize If a specific hybridization is possible, the polynucleotide probe will be completely complementary to the base sequence of the polynucleotide to be detected.
  • the length of the polynucleotide probe that binds to the substrate is usually 100 to 4000 base, preferably 200 to 4000 base, more preferably 500 to 4000 base when cDNA is immobilized. When immobilizing a synthetic polynucleotide, it is usually 15 to 500 bases, preferably 30 to 200 bases, more preferably 50 to 200 bases.
  • the power that can be printed as follows: Print several polynucleotide probes in one region of the 4.5 dragon x 4. 5 thigh, using a single pin to print each array. Therefore, when using a 48-pin tool, it is possible to print an array of 48 iterations on a standard microscope slide.
  • the cDNA sample is then brought into contact with the substrate.
  • a cDNA sample is hybridized to a nucleotide probe on a substrate that can specifically hybridize with DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • the hybridization reaction solution and reaction conditions may vary depending on various factors such as the length of the nucleotide probe immobilized on the substrate, it can generally be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention contained in the cDNA sample is then detected by detecting the intensity of the hybridization between the cDNA sample and the nucleotide probe immobilized on the substrate. Measure. Further, the measured expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention is compared with the control.
  • the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention can be measured by detecting the strength of hybridization between the polynucleotide probe and the cDNA. Detection of the intensity of hybridization between the polynucleotide probe and the cDNA can be appropriately performed by those skilled in the art depending on the type of substance labeled with the cDNA sample. For example, when cDNA is labeled with a fluorescent substance, it can be detected by reading a fluorescent signal with a scanner.
  • a cDNA sample derived from a subject and a control is labeled with a different fluorescent substance, so that the gene encoding the polypeptide of the present invention in each measurement can be obtained in a single measurement.
  • the expression level can be measured simultaneously.
  • one of the above cDNA samples can be labeled with Cy5 as a fluorescent substance and the other with Cy3.
  • the relative intensity of each fluorescent signal indicates the relative amount according to the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention in the subject and the control (Duggan et al., Nat. Genet. 21: 10- 14, 1999).
  • a polypeptide sample is prepared from the subject.
  • the polypep The amount of the polypeptide of the present invention contained in the tide sample is measured.
  • the measured amount of the inventive polypeptide is then compared to a control.
  • Such methods include SDS polyacrylamide electrophoresis and Western blotting, dot blotting, immunoprecipitation, enzyme-linked immunoassay (ELI SA) using antibodies that bind to the polypeptide of the present invention. ), And immunofluorescence.
  • ELI SA enzyme-linked immunoassay
  • the subject when the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention is significantly changed compared to the control, the subject suffers from a disease associated with abnormal expression of the gene. Or is at risk of developing the disease. >
  • the present invention also provides a test for a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the polypeptide of the present invention or abnormal activity of the polypeptide of the present invention.
  • One embodiment thereof is a test agent comprising an oligonucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, which hybridizes to a polynucleotide encoding the above-described polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof.
  • the oligonucleotide is a gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof as a probe for detecting the gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof in the test method of the present invention. It can be used as a primer for amplifying.
  • the oligonucleotide of the present invention can be prepared by, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled.
  • T4 polynucleotide kinase is used to phosphorylate the 5 ′ end of oligonucleotide with phosphorylation, and a DNA polymerase such as Klenow enzyme is used to randomly hexamer oligonucleotide.
  • Isotope such as 32 P, fluorescent dye, or piotin Examples thereof include a method of incorporating a substrate base labeled by a method such as a random prime method.
  • test drug of the present invention is a test drug containing an antibody that binds to the polypeptide of the present invention described later.
  • the antibody is used for detecting the polypeptide of the present invention in the test method of the present invention.
  • the form of the antibody is not limited as long as it can detect the polypeptide of the present invention.
  • Antibodies for testing include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. The antibody may be labeled as necessary.
  • oligonucleotides and antibodies which are active ingredients, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oils, surfactants, lipids, solubilizers, buffers, protein stabilizers (such as BSA and gelatin) ) Preservatives and the like may be mixed as necessary.
  • the present invention provides antibodies that bind to the polypeptides of the present invention.
  • “Antibodies” as used herein include polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, human antibodies, and Fab fragments that include the products of Fab or other immunoglobulin expression libraries.
  • polypeptides of the invention or fragments or analogs thereof, or cells expressing them can also be used as immunogens to produce antibodies that bind to the polypeptides of the invention.
  • the antibody is preferably immunospecific for the polypeptide of the invention. “Immunospecific” means that the antibody has a substantially higher affinity for a polypeptide of the invention than its affinity for other polypeptides.
  • an antibody that binds to the polypeptide of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows.
  • the polypeptide of the present invention or its fusion protein with GST Serum is obtained by immunizing small animals such as herons. This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column in which the polypeptide of the present invention is coupled, or the like.
  • the polypeptide of the present invention is immunized to a small animal such as a mouse, the spleen is excised from the mouse, and this is ground to separate cells, and mouse myeloma cells and polyethylene dallicol.
  • a clone that produces an antibody that binds to the polypeptide of the present invention is selected from the fused cells (hypridoma) produced by the fusion with a reagent such as the above.
  • the obtained hybridoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, the present invention. It can be prepared by purifying it with an affinity ram or the like obtained by coupling a polypeptide.
  • the antibody of the present invention can be used for isolation, identification, and purification of the polypeptide of the present invention and cells expressing the polypeptide.
  • the antibody that binds to the polypeptide of the present invention can also be used for measuring the expression level of the polypeptide of the present invention in the examination of diseases associated with abnormal expression of the polypeptide of the present invention.
  • polypeptides of the invention can be used in the identification of their ligands, agonists or antagonists. These molecules to be identified may be of natural origin or may be artificially synthesized structural or functional mimetics.
  • the polypeptides of the present invention are responsible for many biological functions, including many pathologies. Accordingly, it is desirable to discover compounds that activate the polypeptides of the present invention and compounds that can inhibit the activation of the polypeptides of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention is brought into contact with the candidate compound, and then whether or not the candidate compound binds to the polypeptide of the present invention is detected.
  • the test sample is not particularly limited.
  • various known compounds and peptides with unknown GPCR ligand activity for example, those registered in a chemical file
  • phage display method J. Mol. Biol. (1991) 222, 301-31 0
  • culture supernatants of microorganisms and natural components derived from plants and marine organisms are also subject to screening.
  • Other examples include, but are not limited to, biological tissue extracts such as brain, cell extracts, and gene library expression products.
  • binding to a candidate compound can be detected using the purified polypeptide of the present invention.
  • a method in which a test sample is brought into contact with the affinity column of the polypeptide of the present invention to purify a compound that binds to the polypeptide of the present invention and many well-known methods such as West Western plotting are used. The method can be used.
  • the candidate compound is appropriately labeled, and binding to the polypeptide of the present invention can be detected using this label.
  • a cell membrane that expresses the polypeptide of the present invention is prepared, immobilized on a chip, and the dissociation of the trimeric GTP-binding protein upon ligand binding is indicated by surface plasmon resonance.
  • the binding activity between the candidate compound and the polypeptide of the present invention can be detected using a signal serving as an index of activation of the polypeptide of the present invention as an index.
  • signals include, for example, changes in intracellular Ca "levels, changes in intracellular cAMP levels, changes in intracellular pH, changes in intracellular adenylate cyclase levels, It is not limited to these.
  • a cell membrane expressing the polypeptide of the present invention is labeled with 35 S in 2 OmM HEPES (pH 7.4), lOOm NaCl, lOmM MgCl 2 , 50 i M GDP solution. After mixing with GTP r S 400pM, incubating in the presence and absence of the test sample, filtration (fil trat ion) is performed, and the radioactivity of the bound GTP r S is compared. Can be.
  • GPCRs also share a system that transmits signals into cells through the activation of trimeric GTP-binding proteins.
  • Trimeric GTP-binding proteins are classified into three types, GQ type that increases Ca 2+ , Gs type that increases cAMP, and Gi type that suppresses cAMP, depending on the type of intracellular transmission system that is activated. Applying this, chimerize GQ protein and other G protein ⁇ subunits, or use the promiscuous Ga protein, Gal5, G ⁇ 16 to give positive signals for ligand screening in GQ cells It can be attributed to Ca 2+ elevation, an internal transmission pathway.
  • Elevated Ca "levels indicate changes in reporter gene systems with upstream TRE (TPA responsive element) or MRE (multiple responsive element), staining indicators such as Fura-2 and Fluo-3, and fluorescent protein aequorin Similarly, Gs protein ⁇ -subunit and chimera of other G protein ⁇ -subunit are chimerized, and the positive signal is attributed to the increase of cAMP, the intracellular transmission pathway of Gs, and CRE (cAMP-responsiv e It is also possible to use changes in the repo overnight gene system having (element) upstream as an index (Trends Pharmacol. Sci. (99) 20: 118).
  • the host cell that expresses the polypeptide of the present invention there are no particular limitations on the host cell that expresses the polypeptide of the present invention, and various host cells may be used depending on the purpose.
  • mammals such as COS cells, CH0 cells, HEK293 cells, etc.
  • Examples include animal cells, yeast, Drosophila cells, or E. coli cells.
  • Examples of the vector for expressing the polypeptide of the present invention in vertebrate cells include a promoter located upstream of the gene encoding the polypeptide of the present invention, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence.
  • Those having a replication origin and the like can be suitably used.
  • pSV2dhfr Mol. Cell. Biol.
  • Encodes the polypeptide of the present invention into vector DNA insertion can be performed by a ligase reaction using a restriction enzyme site by a conventional method (Current protocol s in Molecular Biology ed i.Ausube l et al. (198 7) Publ i sh. John Wi l ey & Sons. Sect ion 11.4-11.11).
  • vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Curren t protocol in Molecule Biology ed. Ausube let al. (1987) Publ i sh. Jo hn Wiley & Sons. Section 9. 1-9. 9), Lipofuectamine method (GIBC0-BRL), FuGENE6 reagent (Boehringer Mannheim), microinjection method and the like.
  • a cell expressing the polypeptide of the present invention is brought into contact with the candidate compound, and the candidate compound outputs a signal that serves as an indicator of activation of the polypeptide of the present invention. Detect whether to generate. That is, in the above-described method for identifying a ligand using a cell that expresses the polypeptide of the present invention, a compound that generates a signal that serves as an indicator of activation of the polypeptide of the present invention by the action of a candidate compound. Identify. Such a compound is a candidate for agonis for the polypeptide of the present invention.
  • a cell expressing the polypeptide of the present invention is contacted with an agonist to the polypeptide of the present invention in the presence of the candidate compound. It is detected whether or not the signal indicating the activation of the polypeptide of the present invention is decreased as compared with the case where it is detected in the absence of the compound (control). That is, in the above-described method for identifying a ligand using a cell that expresses the polypeptide of the present invention, the cell of the polypeptide of the present invention in response to agonist stimulation is prepared by allowing agonis to act on the cell in addition to the candidate compound. Identify compounds that suppress the generation of signals that are indicators of activation.
  • Such a compound is a candidate for an antagonist to the polypeptide of the present invention.
  • potential antagonists of the polypeptides of the present invention include antibodies, in some cases, polypeptides closely related to the ligand (eg, fragments of the ligand), or polypeptides of the present invention. Small molecules that bind to the peptide but do not induce a response (thus preventing the activity of the receptor).
  • the present invention also provides a kit for use in the identification method.
  • This kit includes a polypeptide of the present invention or a cell expressing the polypeptide of the present invention or a cell membrane thereof.
  • the kit may contain a GPCR ligand, agonist, or compound that is a candidate for an antagonist.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating a patient in need of increasing or suppressing the activity or expression of the polypeptide of the present invention.
  • an agonist for the polypeptide of the present invention, the polynucleotide of the present invention, and a vector into which the polynucleotide of the present invention is inserted. Can be used.
  • an antagonist of the polypeptide of the present invention an endogenous polypeptide of the present invention in vivo Polynucleotides that suppress the expression of the encoded gene can be used.
  • Antagonists include soluble forms of the polypeptide of the invention that are capable of binding a ligand in competition with an endogenous polypeptide of the invention.
  • a typical example of such a competitor is a fragment of the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotide that suppresses the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention includes the above-described antisense DNA and ribozyme.
  • a therapeutic compound When a therapeutic compound is used as a pharmaceutical, it can be administered as a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method, in addition to directly administering the compound itself to a patient.
  • pharmaceutical compositions or tablets obtained by mixing with pharmacologically acceptable carriers (excipients, binders, disintegrants, flavoring agents, flavoring agents, emulsifiers, diluents, solubilizers, etc.), pills , Powder, granule, capsule, troche, syrup, liquid Prescription in a form suitable for oral or parenteral use as a preparation for preparations, emulsions, suspensions, injections (solutions, suspensions, etc.), suppositories, inhalants, transdermal absorption agents, eye drops, eye ointments, etc. Is done.
  • pharmacologically acceptable carriers excipients, binders, disintegrants, flavoring agents, flavoring agents, emulsifiers, diluents, solubilizer
  • Administration to a patient can be generally performed by methods known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA, it can be considered to incorporate the DNA into a gene therapy vector and perform gene therapy.
  • vector therapy vectors examples include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and non-viral vectors such as liposomes.
  • the target DNA can be administered to the patient by ex w'ra method or /// r / ra method.
  • the present invention provides a mammal into which the polynucleotide of the present invention has been introduced or a mammal in which the expression of the endogenous polynucleotide is artificially suppressed. Production of these mammals can be performed by techniques known to those skilled in the art. These mammals are preferably rodents, most preferably mice. These mammals can be used as, for example, model animals for diseases associated with the polynucleotide of the present invention. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows the relationship between a pair of GPCR sequences that were plotted against E values when a known GPCR sequence was searched against an evaluation database containing 1,054 GPCR sequences and 64,154 non-GPCR sequences.
  • FIG. 5 is a diagram showing the number and the number of pairs of GPCR sequences and non-GPCR sequences.
  • Figure 2 is an electrophoretogram showing the results of analyzing the expression of clone 13860 in each organ.
  • the graph is from left, heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, kidney, Spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, white blood cell, lung cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, colon cancer, ovarian cancer, knee cancer.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present inventors have found all candidates of 6-frame translation sequences existing between the start codon and the stop codon from the rabbit genome sequence.
  • (6F expansion sequence) The longest sequence was selected when multiple starting codons (ATG) were found on the same sequence.
  • a gene discovery program (GeneDecoder) (Asai, K., et al. Pacific Symposium on Biocomputing 98, pp. 228-239 (PSB9 8, 1998) ).) was used to discover the protein coding region (GD sequence). Since GPCR protein has seven transmembrane helices of about 20 residues in length, we set the condition that both sequences require more than 150 residues (> 20 * 7).
  • 375,412 sequences were predicted by 6-frame translation and 95,900 sequences were predicted by GeneDecoder.
  • the former sequence corresponds to the case where no intron is included, and the latter is mainly composed of multiple exons.
  • GeneDecoder is a gene discovery program using a Hidden Markov Model (HMM), which also uses information on sequence similarity and exon length distribution.
  • HMM Hidden Markov Model
  • PFAM is a protein domain design described by the Hidden Markov Model (HMM).
  • HMM Hidden Markov Model
  • HMMER Bossar, A., et al. Nucleic Acids Res. 28, 263-2 66 (2000).
  • PR0SITE is a motif pattern described by regular expressions.
  • the present inventors used the (P value) multiplied by the appearance probability of each residue as an index. For example, the regular expression pattern A- [T, S] if a -G, P value is P A * (P t + P s I * P G.
  • TMWindows is the inventor's original program for TMH prediction. This is based on the hydrophobicity index of En gelman-Stai tz-Goldman (Engelman, DM, et al. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 321-353. (1986)) for each amino acid residue. And scan the entire sequence with nine different window widths (19-27 residues). This index is the most suitable index for membrane protein analysis through comparison of all indices included in the AAindex database (Tomi i, K. & Kanehi sa, M. Protein Eng. 9, 27-36 (1996).) As determined. For each window width, a continuous region with an average hydrophobicity index> 2.5 is predicted as the transmembrane helix. The number predicted for each different window set means the range of the number of helices. On the other hand, Mitaku's method predicts the number of helices using physical chemistry parameters.
  • the threshold values used in these analyzes were obtained by the inventor's evaluation of each method.
  • the reference data set used for the evaluation was obtained by excluding the fragment sequence from SWISSPR0T version 39 (Ba i roch, A. & Apweiler, R. Nucleic Acids Res. 28, 45-48 (2000).) The obtained sequence. This includes 1,054 known GPCR sequences and 64,154 non-GPCR sequences. The specific evaluation procedure for the analysis method is shown below.
  • TMH prediction tools are generally not very accurate in predicting the true number of helices. However, if the expected number of helices is wide, such as 6-8, 5-9, or 4-10, etc., the sensitivity to detect true seven transmembrane helix types can be increased. It can obviously increase. For both TMWindows and Mitaku methods, we consider 4 ranges, 7, 6-8, 5-9, 4-10, and true for all combinations of each other (16 ways). The sensitivity and selectivity of detecting 7 transmembrane helices were calculated.
  • the best sensitivity threshold is intended to achieve near 100% sensitivity with minimal false positives, while the latter is intended to achieve nearly 100% selectivity with minimal false negatives. .
  • Figure 1 shows the evaluation of the BLASTP threshold.
  • the line indicated by the left arrow indicates the number of pairs of GPCRs, and the line indicated by the right arrow indicates a pair of GPCR and non-GPCR sequence.
  • the E value is less than 10-5Q
  • almost all pairs were between GPCR sequences except for some unrelated pairs around the boundary. This corresponds to the best selectivity threshold.
  • these false positives were caused by matching the LDL receptor domain or the EGF factor domain that is characteristic of receptors with only one transmembrane helix.
  • the E value was less than 10-1 kg , there were 115 false positives, but almost all GPCRs were included. This boundary area corresponds to the best sensitivity threshold.
  • the most reliable data is the union of sequences obtained from the best selectivity thresholds of BLASTP, PF AM, and PROSITE.
  • GPCR candidates were screened from the sequences generated in the first stage using the thresholds shown in Table 1. However, these sequences still included the following duplicate examples, so it was necessary to narrow down the number of candidates in the end.
  • Case 1 Perfect match or overlap at the same gene position. They consist of two sequence generation methods: (1) 6-frame translation and (2) GeneDecoder The result of the prediction. We considered them to be the same gene.
  • Case 3 Two or more sequences that partially hit some long known sequence. The reason why these were generated is thought to be mis-splicing by the gene discovery program. The inventors of the present invention originally decided to fuse them as the same gene.
  • the present inventors first raised the accuracy of candidate genes by examining each of the above cases.
  • Vasopressin / oxytocin receptors 4 ⁇ 1 883 We classified the sequences by 30% sequence similarity. This is generally considered to be an evolutionarily related family threshold. The largest family was an olfactory receptor containing 53 7 members. Major families of more than 20 members include adrenaline, dopamine and serotonin receptors (38), family 2B receptors (20), family 3 C receptors (30) chemokines and chemotaxis receptors (31), and orphans It was a receptor (76).
  • Sequences A, B, and C are based on the best selectivity data set (level A), level B data set, and level C data set, respectively. After refining, the new sequence was obtained by searching the UNIGENE and nr-aa databases.
  • the cDNA of clone 13860 was similarly isolated using the 5′-RACE, 3′-RACE method.
  • the 3'-end cDNA is 3, by the -RACE method, Marathon-Ready cDNA (CLONT ECH) derived from H. Hela cells is used as a saddle, and API (SEQ ID NO: 1 1) and 3 'R13860 (sequence) No. 1) was used as a primer for the first PCR, and in the second PCR, AP2 (SEQ ID NO: 1 2) and 3 ′ R13860-nest (SEQ ID NO: 2) were used as primers.
  • the 5'-end cDNA was converted to the first PCR using 5'-RACE method, using Marathon-Ready cDNA derived from H. Hela cells as a saddle, and API and 5 'R13860 (SEQ ID NO: 3) as primers.
  • AP2 and 5 ′ R13860-nest (SEQ ID NO: 4) were used as primers.
  • Advantage 2 Polymerase Mix manufactured by CLONOTECH
  • CLONOTECH Advantage 2 Polymerase Mix
  • cDNA prepared from human brain (manufactured by Clontech) was used as the vertical DNA, Amplification was attempted by PCR.
  • the PCR primer 13860-8 (SEQ ID NO: 7) used for the first PCR in 5'-RACE and the PCR primer 13860-6 (SEQ ID NO: 8) used for the second PCR were designed.
  • Marathon-Ready cDNA manufactured by Clontech
  • 5′-RACE was performed in the same manner as described above.
  • 13860-8 (SEQ ID NO: 7) and API primer were used, and in the second PCR, 13860-6 (SEQ ID NO: 8) and AP2 primer were used.
  • the approximately 1 kbp product amplified by PCR was inserted into the PGEM-T Easy vector, and the nucleotide sequence was determined (SEQ ID NO: 17).
  • the translation start codon The amino acid sequence was inferred from a single reading frame (SEQ ID NO: 1 8), and a sequence considered to be an extracellular secretion signal sequence was also found at the amino terminus. It was.
  • PCR of the region assumed to be the coding region of 13860 Amplification and confirmation of the nucleotide sequence were performed.
  • the primer used for PCR is 13860- ATG (SEQ ID NO: 9) designed to hybridize to the sequence near the translation initiation codon as a primer in the sense direction and to have the restriction enzyme EcoRI recognition sequence and the Kozak sequence (CCACC).
  • 13860-TGA2 As a primer in the antisense direction, 13860-TGA2 (SEQ ID NO: 1 0) designed to hybridize to the sequence downstream of the expected nucleotide end of 13860 and to have the restriction enzyme Sail recognition sequence, respectively.
  • the PCR conditions used were as follows.
  • PCR reaction solution was desalted using PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN), PCR primers were removed, elution was performed with 40 zL of TE solution, and secondary amplification with PCR was performed again. That is, 5 L of 10 X PCR buffer (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), dNTPs (2 mM each), 2 L of 25 mM magnesium sulfate, 10 pmole of 13860-ATG Prepared to contain 13860-TGA2 primer, 10 xL of the first PCR-purified product, and L KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo) First, incubate at 94 ° C for 2 minutes, then perform 10 cycles of 94 for 15 seconds, 60 for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes 30 seconds, and finally 72 minutes for 2 minutes.
  • R13860 nest GCTGGCAAAGCACCGAGTTCTC (SEQ ID NO: 2)
  • R13860 nes t AGGTAGAGCCCCAGGGTGACAC (SEQ ID NO: 4)
  • MRNA expression in human organs and tumor tissues of clone 13860 was analyzed by RT-PCR.
  • MTC multi-tip cDNA panes (Human I, Human I I, Human Tumor, CLONTECH) were used, and the target clone was amplified under the following PCR conditions.
  • the present invention provides a novel GPCR, a polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the vector, and a method for producing the polypeptide. Further provided are methods for identifying compounds that bind to the polypeptide or modify its activity.
  • the polypeptide or polynucleotide of the present invention, or a compound that binds to or modifies the activity of the polypeptide of the present invention is expected to be used for the development of new preventive or therapeutic agents for diseases associated with the polypeptide of the present invention. Is done.
  • the present invention provides a method for examining a disease comprising detecting mutation or expression of a gene encoding the polypeptide of the present invention.
  • GPCR is one of the most important and attracting attention in the fields of drug development and medicine. The comprehensive provision of new GPCRs in the present invention is expected to make dramatic progress in these fields. Even for GPCR researchers, the present invention will be a valuable source

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Abstract

Using an automatic system for finding a GPCR sequence having been proprietarily developed, novel 1215 novel GPCR’s are successfully identified from the whole human genome. Concerning one of these clones, cDNA is isolated.

Description

明細書 グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の受容体 技術分野  Guanosine triphosphate binding protein coupled receptor Technical Field
本発明は、 グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型受容体 （以下、 「GPCR」 と称する） ファミリ一に属する新規なポリペプチド、 該ポリペプチドをコードす るポリヌクレオチド、 並びにこれら分子の製造および用途に関する。 背景技術  The present invention relates to a novel polypeptide belonging to the family 1 of a guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor (hereinafter referred to as “GPCR”), a polynucleotide encoding the polypeptide, and production and use of these molecules. . Background art
これまでに世界の製薬企業により創られてきた薬剤は、 その 9割以上が細胞外 空間での相互作用を標的としており、 その中でも膜貫通へリックス 7本を有する GPCR (Baldwin, J. Μ· Curr. Op in. Cell Biol. 6， 180-190 (1994). ， Strader, C. D. , et al. FASEB. J. 9, 745-754 (1995). , Bockaert, J., Pin, J. P. EM BO. J. 18, 1723-1729 (1999). ) を標的とする薬剤が大部分を占めている。 この ため GPCRは、 ドラッグデザィンを行うための遺伝子を発見する最も重要な標的の 一つである。 GPCRは、 アドレナリン、 アセチルコリンのような特異的リガンドに よって誘導されるシグナル伝達に関係しており、 その結合メカニズムの特徴は実 験によって精力的に調べられている（Watson, S & Arkinsrtall, S. The G-prote in Linked receptor Facts Book. (Academic Press, London) )。  To date, more than 90% of the drugs created by pharmaceutical companies around the world are targeted for interaction in the extracellular space, and among them, GPCR (Baldwin, J. J Curr. Op in. Cell Biol. 6, 180-190 (1994)., Strader, CD, et al. FASEB. J. 9, 745-754 (1995)., Bockaert, J., Pin, JP EM BO. Drugs targeting J. 18, 1723-1729 (1999).) Are the majority. For this reason, GPCR is one of the most important targets for discovering genes for drug design. GPCRs are involved in signal transduction induced by specific ligands such as adrenaline and acetylcholine, and the characteristics of their binding mechanisms have been extensively investigated by experiments (Watson, S & Arkinsrtall, S. The G-prote in Linked receptor Facts Book. (Academic Press, London)).
しかしながら、 cDNA、 EST, およびマイクロアレイ分析のような膨大なデ一夕 源によっても、 今までに発見された新規配列はごく限られたファミリーに過ぎな い（Lee, D. K. et al. Brain Res. Mol. Brain Res. 31, 13-22 (2001).、 Mizus hi ma, K. , et al. Genomics. 69, 314-321 (2000).、 Mat sumo to, M. et al. Gen e. 28, 183-189 (2000). , Marchese, A., et al. Trends Pharmacol Sci. 20, 4 47 (1999).、 Lee, D. K. , FEBS. Lett. 446, 103-107 (1999).、 Yonger, R. M, et al. Genome Research. 11, 519-530 (2001). , Horn, F醫, et al. Nucleic Aci ds Res. 29, 346-349 (2001).)。 GPCRdb (Lee, D. K. et al. Brain Res. Mol. B rain Res. 31, 13-22 (2001) .)および PSI- BLASTによるコレクション（Joseison, L. G. Gene. 239, 333-340 (1999) .)のような既知の GPCR配列の大規模分類によ つてもなお、 ゲノム全体レベルの幅広い解釈に至っていない。 However, even with the vast array of sources such as cDNA, EST, and microarray analysis, the new sequences discovered so far are only a limited family (Lee, DK et al. Brain Res. Mol. Brain Res. 31, 13-22 (2001)., Mizus hi ma, K., et al. Genomics. 69, 314-321 (2000)., Mat sumo to, M. et al. Gen e. 28, 183-189 (2000)., Marchese, A., et al. Trends Pharmacol Sci. 20, 4 47 (1999)., Lee, DK, FEBS. Lett. 446, 103-107 (1999)., Yonger, R M et al. Genome Research. 11, 519-530 (2001)., Horn, F 醫, et al. Nucleic Acids Res. 29, 346-349 (2001).). GPCRdb (Lee, DK et al. Brain Res. Mol. B rain Res. 31, 13-22 (2001).) And PSI-BLAST collection (Joseison, LG Gene. 239, 333-340 (1999).) Such large-scale classification of known GPCR sequences still does not lead to a broad interpretation at the genome level.
従って、 全体の 90%以上がすでに決定されているヒトゲノム配列（Internation al Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis o f the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001). , Venter, J, C. et al. S cience. 291, 1304- 1351 (2001) .)をスキャンすることによって、 GPCRファミリ 一全体を解明することは重要である。 発明の開示  Therefore, more than 90% of the whole human genome sequence has already been determined (Internation al Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001)., Venter, J, C. It is important to elucidate the entire GPCR family by scanning et al. Science. 291, 1304- 1351 (2001).). Disclosure of the invention
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 ヒトゲ ノム配列から効率的に GPCR配列を抽出する自動的手法を開発し、 これにより新規 GPCRを網羅的に同定することにある。  The present invention has been made in view of such circumstances, and its purpose is to develop an automatic method for efficiently extracting GPCR sequences from human genome sequences, thereby comprehensively identifying novel GPCRs. There is.
また、 本発明は、 このようにして同定された新規 GPCRの用途を提供することを も目的とする。 新規 GPCRの好ましい用途の一つの態様として、 リガンドなどの医 薬品候補化合物のスクリーニングのための用途を提供する。 さらに、 新規 GPCRの 好ましい用途の他の態様として、 本発明は、 新規 GPCRの変異や発現異常を指標と した疾患の検査方法を提供する。  Another object of the present invention is to provide the use of the novel GPCR identified as described above. One preferred embodiment of the novel GPCR provides an application for screening for drug candidate compounds such as ligands. Furthermore, as another embodiment of the preferred use of the novel GPCR, the present invention provides a method for examining a disease using the mutation or abnormal expression of the novel GPCR as an index.
さらに、 本発明は、 新規 GPCRまたはその活性を調節する分子の疾患の治療のた めの用途を提供する。  Furthermore, the present invention provides a novel GPCR or a molecule that modulates its activity for use in the treatment of diseases.
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 まず、 配列検索 (Altschul, S. F. e t al. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997).)、 モチーフおよびドメイン 帰属（Bateman, A. , et al. Nucleic Acids Res. 28, 263-266 (2000). , Bairoch, A. Nucreic Acids Res. 20, 2013-2018 (1992).)、 膜貫通へリックスの予測（Hi rokawa, T.， e t al. Bioinformat ics. 14, 378-379 (1998) . )のための解析方法 を注意深く評価しながら、 ヒトゲノム全体において GPCR配列を発見するための自 動システムを開発した。 この自動システムは以下の 3つの段階からなる。 In order to solve the above problems, the present inventors firstly performed sequence search (Altschul, SF et al. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997).), Motif and domain assignment (Bateman, A., et al. al. Nucleic Acids Res. 28, 263-266 (2000)., Bairoch, A. Nucreic Acids Res. 20, 2013-2018 (1992).), prediction of transmembrane helix (Hi Rokawa, T., et al. Bioinformatics. 14, 378-379 (1998).) While carefully evaluating the analysis method, we developed an automated system for finding GPCR sequences in the entire human genome. This automated system consists of the following three stages.
第一段階は遺伝子の予測、 すなわち、 ゲノム配列からアミノ酸配列への翻訳で ある。 既知の GPCR遺伝子の多くはイントロンを含まないためヌクレオチド配列の 6-フレーム展開を行うことでもある程度は対応できるが、 一方、 複数のェキソン を有する配列では、 遺伝子発見プログラムを用いて遺伝子構造全体を予測する必 要がある。  The first step is gene prediction, ie, translation from genomic sequence to amino acid sequence. Many of the known GPCR genes do not contain introns, so 6-frame expansion of nucleotide sequences can be supported to some extent, but for sequences with multiple exons, the entire gene structure can be predicted using a gene discovery program. There is a need to.
第二段階は、 アミノ酸配列の三重解析からなる。 即ち、 ①既知の GPCRデ一夕べ —スに対する配列の検索、 ②モチーフおよびドメイン帰属ならびに③膜貫通ヘリ ックス （TMH) の予測である。 前者の 2つの技法は、 近縁の GPCR相同体を発見す るために用いられ、 一方、 TMH予測は遠縁の GPCR相同体を扱うために用いられる。 次に、 3つの解析のそれぞれの結果の和集合をとることによって、 候補配列をス クリーニングする。 本発明者らは、 スクリーニングの段階では候補配列の数をで きる限り最大限にするために和集合を用いた。  The second stage consists of a triple analysis of the amino acid sequence. That is, (1) searching for sequences for known GPCR devices, (2) motif and domain assignment, and (3) transmembrane helix (TMH) prediction. The former two techniques are used to find closely related GPCR homologues, while TMH prediction is used to deal with distantly related GPCR homologues. Next, the candidate sequences are screened by taking the union of the results of each of the three analyses. The present inventors used union to maximize the number of candidate sequences at the screening stage.
第三段階は、 重複配列を消去することによって、 または誤予測によって分離さ れた断片配列を融合することによって、 遺伝子候補の質をさらに精密化する段階 である。  The third step is to further refine the quality of the candidate gene by deleting duplicate sequences or fusing fragment sequences separated by misprediction.
この自動システムによれば効率的かつ網羅的に GPCRの配列を発見することがで きる。 従来の方法では発見が困難であったマルチェキソンからなる GPCRの配列や 遠縁のホモ口グ配列であっても発見することができる点もこの自動システムの大 きな利点である。  This automated system allows efficient and comprehensive discovery of GPCR sequences. A major advantage of this automatic system is that it can be detected even with GPCR sequences consisting of Marchexon and distantly related homolog sequences that were difficult to find with conventional methods.
本発明者らは、 独自に開発したこの自動システムを利用して、 ヒトゲノム全体 から高い信頼度で保証された 1215の新規 GPCR配列を同定することに成功し、 その うちの 1つのクローンについて cDNAを単離した。 新規 GPCR配列の発見は、 医薬品 としての有用性が期待されるリガンド、 アンタゴニス卜あるいはァゴニストのス クリーニングを可能とする。 また、 GPCRは、 生体内で重要な機能を有すると考え られ、 その発現や機能の異常は、 種々の疾患の原因となり得る。 このため、 同定 された GPCRの不適当な活性または発現を指標とすることにより、 このような疾患 の検査を行なうことも可能である。 同定された GPCRやそれらをコードするポリヌ クレオチド、 および同定された GPCRに対するリガンド、 アン夕ゴニストあるいは ァゴニストは、 これら疾患に対する好適な治療薬となろう。 The inventors succeeded in identifying 1215 new GPCR sequences guaranteed with high reliability from the entire human genome by using this automated system developed uniquely, and cDNA for one of these clones was identified. Isolated. The discovery of new GPCR sequences is based on the discovery of ligands, antagonists or antagonists that are expected to be useful as pharmaceuticals. Enables cleaning. GPCRs are thought to have important functions in vivo, and abnormal expression or function can cause various diseases. For this reason, it is possible to examine such diseases by using inappropriate activity or expression of the identified GPCR as an index. Identified GPCRs, the polynucleotides that encode them, and ligands, antagonists or agonists for the identified GPCRs would be suitable therapeutics for these diseases.
本発明は、 新規な GPCRおよびその遺伝子、 並びにそれらの製造及び用途に関し、 より詳しくは、 以下の （1) から （32) を提供するものである。  The present invention relates to a novel GPCR and its gene, and their production and use. More specifically, the present invention provides the following (1) to (32).
( 1 ) グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の受容体をコードする下記  (1) The following encoding guanosine triphosphate binding protein coupled receptor
(a) から （d) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。  The polynucleotide according to any one of (a) to (d).
( a ) 配列番号： 20に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド  (a) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
(b) 配列番号： 19に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオ チド  (b) a polynucleotide comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19
(c) 配列番号： 20に記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数のァ ミノ酸が置換、 欠失、 付加および Zまたは挿入したアミノ酸配列か らなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド  (c) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and Z or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
(d) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる DNAにストリンジェン卜 な条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド  (d) a polynucleotide that hybridizes to a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 under stringent conditions
(2) 配列番号： 20に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片をコー ドするポリヌクレオチド。  (2) A polynucleotide encoding a fragment of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
(3) (1) または （2) に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。  (3) A vector comprising the polynucleotide according to (1) or (2).
(4) (1) または （2) に記載のポリヌクレオチドまたは （3) に記載のべク 夕一を保持する宿主細胞。  (4) A host cell that retains the polynucleotide according to (1) or (2) or the vector according to (3).
(5) (1) または （2) に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリべ プチド。 (6) (4) に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から、 産生させたポリペプチドを回収する工程を含む、 （5) に記載のポリぺプ チドの製造方法。 (5) A polypeptide encoded by the polynucleotide according to (1) or (2). (6) The method for producing the polypeptide according to (5), comprising the step of culturing the host cell according to (4) and recovering the produced polypeptide from the host cell or a culture supernatant thereof. .
(7) (5) に記載のポリペプチドに結合する抗体。  (7) An antibody that binds to the polypeptide according to (5).
(8) (5) に記載のポリペプチドに対するリガンドの同定方法であって、(8) A method for identifying a ligand for the polypeptide according to (5),
(a) (5) に記載のポリペプチドまたは （5) に記載のポリペプチドを 発現している細胞若しくはその細胞膜と候補化合物とを接触させる 工程、 および (a) contacting the candidate compound with a cell expressing the polypeptide according to (5) or the polypeptide according to (5) or a cell membrane thereof, and
(b) 候補化合物が （5) に記載のポリペプチドまたは （5) に記載のポ リペプチドを発現している細胞若しくはその細胞膜に結合するか否 かを検出する工程、  (b) a step of detecting whether the candidate compound binds to the polypeptide described in (5) or the cell expressing the polypeptide described in (5) or its cell membrane;
を含む方法。  Including methods.
(9) (5) に記載のポリペプチドに対するァゴニストの同定方法であって、 (9) A method of identifying an agonist for the polypeptide according to (5),
(a) (5) に記載のポリペプチドを発現している細胞と候補化合物とを 接触させる工程、 および (a) contacting a cell expressing the polypeptide according to (5) with a candidate compound; and
(b) 候補化合物が （5) に記載のポリペプチドの活性化の指標となるシ グナルを発生させるか否かを検出する工程、  (b) a step of detecting whether the candidate compound generates a signal that serves as an indicator of activation of the polypeptide according to (5),
を含む方法。  Including methods.
(1 0) (5) に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストの同定方法であつ て、  (10) A method for identifying an antagonist to the polypeptide according to (5), comprising:
(a) 候補化合物の存在下で （5) に記載のポリペプチドを発現してい る細胞と （5) に記載のポリペプチドに対するァゴニス卜とを接触 させる工程、 および  (a) contacting a cell expressing the polypeptide according to (5) in the presence of a candidate compound with an agonis spore against the polypeptide according to (5); and
(b) 候補化合物の非存在下で検出した場合と比較して、 （5) に記載 のポリぺプチドの活性化の指標となるシグナルが減少するか否かを 検出する工程、 を含む方法。 (b) a step of detecting whether or not a signal serving as an index for the activation of the polypeptide according to (5) is decreased as compared with the case where the detection is performed in the absence of the candidate compound, Including methods.
(1 1) (8) に記載の方法により同定されたリガンド。  (1 1) A ligand identified by the method according to (8).
(12) (9) に記載の方法により同定されたァゴニスト。  (12) An agonist identified by the method according to (9).
(13) (10) に記載の方法により同定されたアンタゴニスト。  (13) An antagonist identified by the method according to (10).
(14) (8) から （10) に記載の方法に用いるためのキットであって、 下記 (14) A kit for use in the method described in (8) to (10).
(a) または （b) に記載の少なくとも一つの分子を含むキット。 A kit comprising at least one molecule according to (a) or (b).
(a) (5) に記載のポリペプチド (a) the polypeptide according to (5)
(b) (4) に記載の宿主細胞またはその細胞膜  (b) The host cell or cell membrane thereof according to (4)
(1 5) (5) に記載のポリペプチドの活性または発現を増加させる必要がある 患者を治療するための医薬組成物であって、 下記 （a) から （c) に記 載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。  (1 5) A pharmaceutical composition for treating a patient who needs to increase the activity or expression of the polypeptide described in (5), wherein the molecule described in (a) to (c) below is treated. A pharmaceutical composition comprising an effective amount above.
(a) (5) に記載のポリペプチドに対するァゴニスト  (a) an agonist for the polypeptide according to (5)
(b) (1) または （2) に記載のポリヌクレオチド  (b) The polynucleotide according to (1) or (2)
(c) (3) に記載のベクタ一  (c) The vector described in (3)
(16) (5) に記載のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患 者を治療するための医薬組成物であって、 下記 （a) または （b) に記 載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。 (16) A pharmaceutical composition for treating a patient who needs to suppress the activity or expression of the polypeptide described in (5), wherein the molecule described in (a) or (b) below is treated. A pharmaceutical composition comprising an effective amount above.
(a) (5) に記載のポリペプチドに対するアン夕ゴニスト (a) An antagonist against the polypeptide according to (5)
(b) 生体内において、 内因性の （5) に記載のポリペプチドをコード する遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド (b) a polynucleotide that suppresses the expression of a gene encoding the polypeptide according to (5) that is endogenous in vivo.
(1 7) (5) に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または  (1 7) Abnormal expression of the gene encoding the polypeptide according to (5) or
( 5 ) に記載のポリぺプチドの活性の異常に関連した疾患の検査方法で あって、 被検者における該遺伝子またはその発現制御領域の変異を検出 することを含む方法。  (5) A method for examining a disease associated with abnormal activity of a polypeptide according to (5), comprising detecting a mutation in the gene or its expression control region in a subject.
(1 8) 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 （1 7) に記載の検査方法。 (1 8) The inspection method according to (1 7), including the following steps (a) to (d):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程 (b) (5) に記載のポリペプチドをコードする DNAまたはその発現制 御領域を単離する工程 (a) A step of preparing a DNA sample from a subject (b) a step of isolating the DNA encoding the polypeptide according to (5) or its expression control region
(c) 単離した DNAの塩基配列を決定する工程  (c) determining the base sequence of the isolated DNA
(d) 工程 （c) により決定した DMの塩基配列を、 対照と比較するェ 程  (d) The process of comparing the base sequence of DM determined in step (c) with the control.
(19) 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 （1 7) に記載の検査方法。  (19) The inspection method according to (17), including the following steps (a) to (d):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程  (a) A step of preparing a DNA sample from a subject
(b) 調製した DNA試料を制限酵素により切断する工程  (b) A step of cleaving the prepared DNA sample with a restriction enzyme
(c) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程  (c) A step of separating DNA fragments according to their size
(d) 検出された DNA断片の大きさを、 対照と比較する工程 (d) The step of comparing the size of the detected DNA fragment with the control
(20) 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 （17) に記載の検査方法。 (20) The inspection method according to (17), including the following steps (a) to (e):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程  (a) A step of preparing a DNA sample from a subject
(b) (5) に記載のポリペプチドをコードする DNAまたはその発現制 御領域を増幅する工程  (b) Amplifying the DNA encoding the polypeptide according to (5) or its expression control region
(c) 増幅した DNAを制限酵素により切断する工程  (c) Cleaving the amplified DNA with a restriction enzyme
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程  (d) Separating DNA fragments according to their size
(e) 検出された DNA断片の大きさを、 対照と比較する工程 (e) A step of comparing the size of the detected DNA fragment with the control
(2 1) 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 （1 7) に記載の検査方法。 (2 1) The inspection method according to (17), including the following steps (a) to (e):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程  (a) A step of preparing a DNA sample from a subject
(b) (5) に記載のポリペプチドをコードする DNAまたはその発現制 御領域を増幅する工程  (b) Amplifying the DNA encoding the polypeptide according to (5) or its expression control region
(c) 増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程  (c) Dissociating amplified DNA into single-stranded DNA
( d ) 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程  (d) Separating the dissociated single-stranded DNA on a non-denaturing gel
(e) 分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程 ( 22 ) 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 （1 7) に記載の検査方法。  (e) The step of comparing the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with the control (22) The method according to (17), comprising the following steps (a) to (d):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程 (b) (5) に記載のポリペプチドをコードする DNAまたはその発現制 御領域を増幅する工程 (a) A step of preparing a DNA sample from a subject (b) Amplifying the DNA encoding the polypeptide according to (5) or its expression control region
(c) 増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離す る工程  (c) Separating amplified DNA on a gel with increasing concentration of DNA denaturant
(d) 分離した DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程 (d) Step of comparing the mobility of the separated DNA on the gel with the control
(23) (5) に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常に関連し た疾患の検査方法であって、 被検者における該遺伝子の発現量を検出す ることを含む方法。 (23) A method for examining a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the polypeptide according to (5), which comprises detecting the expression level of the gene in a subject.
(24) 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 （23) に記載の検査方法。 (24) The inspection method according to (23), including the following steps (a) to (c):
(a) 被検者から RNA試料を調製する工程  (a) Step of preparing an RNA sample from a subject
(b) 該 RNA試料に含まれる （5) に記載のポリペプチドをコードする R NAの量を測定する工程  (b) a step of measuring the amount of RNA encoding the polypeptide according to (5) contained in the RNA sample
(c) 測定された RNAの量を対照と比較する工程  (c) comparing the measured amount of RNA with the control
(25) 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 （23) に記載の検査方法。  (25) The inspection method according to (23), including the following steps (a) to (d):
(a) 被検者から調製した cDNA試料、 および （5) に記載のポリべプチ ドをコードする DNAとハイブリダィズするヌクレオチドプローブ が固定された基板を提供する工程  (a) providing a substrate on which a cDNA sample prepared from a subject and a nucleotide probe that hybridizes with DNA encoding the polypeptide described in (5) are immobilized;
(b) 該 cDNA試料と該基板を接触させる工程  (b) contacting the cDNA sample with the substrate
( c ) 該 cDNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブ リダィズの強度を検出することにより、 該 cDNA試料に含まれる (c) By detecting the intensity of hybridization between the cDNA sample and the nucleotide probe immobilized on the substrate, it is contained in the cDNA sample.
( 5 ) に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定 する工程 (5) a step of measuring the expression level of the gene encoding the polypeptide described in
(d) 測定された （5) に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発 現量を対照と比較する工程  (d) a step of comparing the measured expression level of the gene encoding the polypeptide described in (5) with a control
( 26 ) 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 （23) に記載の検査方法。 (26) The inspection method according to (23), including the following steps (a) to (c).
(a) 被検者からタンパク質試料を調製する工程 W (a) A step of preparing a protein sample from a subject W
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(b) 該タンパク質試料に含まれる （5) に記載のポリペプチドの量を 測定する工程 (b) a step of measuring the amount of the polypeptide according to (5) contained in the protein sample
( c ) 測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程  (c) comparing the measured amount of polypeptide with a control
(27) (5) に記載のポリペプチドをコードする DNAまたはその発現制御領域 にハイブリダィズし、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴ ヌクレオチド。  (27) An oligonucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, which hybridizes to the DNA encoding the polypeptide according to (5) or an expression control region thereof.
(28) (27) に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 （5) に記載のポリぺプ チドをコードする遺伝子の発現の異常または （5) に記載のポリべプチ ドの活性の異常に関連した疾患の検査薬。  (28) Containing the oligonucleotide according to (27), which is associated with abnormal expression of the gene encoding the polypeptide according to (5) or abnormal activity of the polypeptide according to (5) Disease testing agent.
(29) (7) に記載の抗体を含む、 （5) に記載のポリペプチドをコードする 遺伝子の発現の異常または （5) に記載のポリペプチドの活性の異常に 関連した疾患の検査薬。  (29) A test agent for a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the polypeptide according to (5) or the abnormal activity of the polypeptide according to (5), comprising the antibody according to (7).
(30) (1) または （2) に記載のポリヌクレオチドが導入された哺乳動物。 (31) 内因性の （1) に記載のポリヌクレオチドの発現が人為的に抑制された 哺乳動物。  (30) A mammal into which the polynucleotide according to (1) or (2) has been introduced. (31) A mammal in which the expression of the polynucleotide according to (1) is artificially suppressed.
(32) マウスである、 （30) または （31) に記載の哺乳動物。  (32) The mammal according to (30) or (31), which is a mouse.
以下に本明細書に規定された用語の定義を示すが、 これらは、 本明細書中で使 用される用語の理解を容易にする目的で記載されたものであり、 本発明を限定す る目的で用いられるべきではないことは理解されたい。  The definitions of the terms defined in this specification are shown below, but these are described for the purpose of facilitating the understanding of terms used in this specification and limit the present invention. It should be understood that it should not be used for purposes.
本明細書において 「グアノシン三リン酸結合蛋白質共役型受容体 （GPCR) 」 と は、 GTP結合蛋白質の活性化を介して細胞内にシグナルを伝達する細胞膜受容体 を指す。  As used herein, “guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor (GPCR)” refers to a cell membrane receptor that transmits a signal into a cell through activation of a GTP binding protein.
本明細書において用いられる 「ポリヌクレオチド」 とは、 リボヌクレオチドも しくはデォキシヌクレオチドであって、 複数の塩基または塩基対からなる重合体 を意味する。 ポリヌクレオチドには、 一本鎖型および二本鎖型の DNAを含む。 ポ リヌクレオチドは、 天然に存在する状態から修飾されていないもの、 および修飾 されているものの双方を含む意である。 修飾された塩基としては、 例えば、 トリ チル化された塩基およびィノシンのような特殊な塩基がある。 As used herein, “polynucleotide” means a ribonucleotide or deoxynucleotide, which is a polymer composed of a plurality of bases or base pairs. Polynucleotides include single and double stranded DNA. Polynucleotides are unmodified from their naturally occurring state, and modified Is meant to include both. Modified bases include, for example, tritylated bases and special bases such as inosine.
本明細書において用いられる 「ポリペプチド」 は、 複数のアミノ酸からなる重 合体を意味する。 従って、 オリゴペプチドおよび蛋白質もまた、 ポリペプチドの 概念に含まれる。 ポリペプチドは、 天然に存在する状態から修飾されていないも の、 および修飾されているものの双方を含む意である。 修飾としては， ァセチル 化、 ァシル化、 ADP-リボシル化、 アミド化、 フラビンの共有結合、 ヘム部分の共 有結合、 ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、 脂質または脂質誘 導体の共有結合、 ホスファチジルイノシトールの共有結合、 架橋、 環化、 ジスル フィ ド結合の形成、 脱メチル化、 共有架橋の形成、 シスチンの形成、 ピログル夕 メートの形成、 ホルミル化、 ァ-カルボキシル化、 グリコシル化、 GPIアンカー形 成、 ヒドロキシル化、 ヨウ素化、 メチル化、 ミリストイル化、 酸化、 タンパク質 分解処理、 リン酸化、 プレニル化、 ラセミ化、 セレノィル化、 硫酸化、 アルギニ ル化のようなタンパク質へのァミノ酸の転移 RNA媒介付加、 ュビキチン化などが 含まれる。  As used herein, “polypeptide” means a polymer composed of a plurality of amino acids. Thus, oligopeptides and proteins are also included in the polypeptide concept. Polypeptide is meant to include both unmodified and modified from the naturally occurring state. Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, phosphatidylinositol Covalent bond, crosslinking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, covalent bridge formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, alpha-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, RNA-mediated addition of amino acids to proteins such as hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolysis, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, arginylation, Includes ubiquitination.
本明細書において 「単離」 とは、 本来の環境 （たとえば自然に発生するのであ ればその自然環境） から取り出された物質 （例えば、 ポリヌクレオチドまたはポ リペプチド） を指し、 その自然状態から 「人の手によって」 変えられたものであ る。 「単離」 とは、 対象化合物に実質的に富む試料中に存在する化合物および Z または対象化合物が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合 物を含むことを意味する。 ここで 「実質的に精製した」 という用語は、 その天然 の環境から切り離されて、 天然に関連している他の成分を少なくとも 60 %、 好ま しくは 75 %、 および最も好ましくは 90 %含まない化合物 （例えば、 ポリヌクレオ チドまたはポリペプチド） を指す。  As used herein, “isolated” refers to a substance (eg, a polynucleotide or polypeptide) that has been removed from its original environment (eg, the natural environment if it occurs naturally). It has been changed by human hands. “Isolated” is meant to include compounds present in a sample substantially enriched in the compound of interest and compounds present in a sample in which Z or the compound of interest is partially or substantially purified. As used herein, the term “substantially purified” is separated from its natural environment and is free of at least 60%, preferably 75%, and most preferably 90% of other components associated with nature. Refers to a compound (eg, a polynucleotide or polypeptide).
本明細書において用いられる 「変異」 とは、 アミノ酸配列におけるアミノ酸の 変化または塩基配列における塩基の変化 （すなわち単一または複数のアミノ酸ま たはヌクレオチド置換、 欠失、 付加または挿入） を指す。 従って、 本明細書にお いて用いられる 「変異体」 は、 一つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列 または一つ以上の塩基が変化している塩基配列を指す。 この変異体の塩基配列の 変化は、 基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配 列を変更しても、 しなくてもよい。 変異体はァレリック変異体のように天然に存 在するものでも、 天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。 変異体は、 置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する保存的 変化を有しうる。 よりまれに、 変異体は、 非保存的置換を有しうる。 生物学的ま たは免疫学的活性を阻害することなく、 いずれの、 およびどれほど多くのァミノ 酸残基を置換、 挿入、 または欠失するかを決定する手引きは、 当技術分野におい て周知のコンピュータ一プログラム、 例えば DNAスター · ソフトウエアを用いて 発見することができる。 As used herein, a “mutation” is an amino acid change in an amino acid sequence or a base change in a base sequence (ie, single or multiple amino acids). Or nucleotide substitution, deletion, addition or insertion). Accordingly, a “variant” as used herein refers to an amino acid sequence in which one or more amino acids are changed or a base sequence in which one or more bases are changed. This change in the base sequence of the mutant may or may not change the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. The mutant may be a naturally occurring mutant such as an allelic mutant or a mutant that is not known to exist naturally. A variant may have conservative changes in which the substituted amino acid has similar structural or chemical properties. More rarely, the variant may have non-conservative substitutions. Guidance on determining which and how many amino acid residues to replace, insert, or delete without inhibiting biological or immunological activity is well known in the art. It can be found using a computer program such as DNA Star software.
「欠失」 はその中で 1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ、 天然に存在する GPCRまたは GPCR関連ポリぺプチドのアミノ酸配列またはヌクレオ チド配列と比較して存在しない、 アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの 変化である。  A “deletion” is an amino acid or nucleotide sequence in which one or more amino acid or nucleotide residues are not present compared to the amino acid sequence or nucleotide sequence of a naturally occurring GPCR or GPCR-related polypeptide, respectively. Any change.
「挿入」 または 「付加」 は、 天然に存在する GPCRまたは GPCR関連ポリペプチド のァミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、 それぞれァミノ酸またなヌ クレオチド残基 1つ以上が付加されたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化で ある。  An “insertion” or “addition” is an amino acid or nucleotide to which one or more amino acid or nucleotide residues are added, respectively, compared to the amino acid sequence or nucleotide sequence of a naturally occurring GPCR or GPCR-related polypeptide. It is a sequence change.
「置換」 とは、 天然に存在する GPCRまたは GPCR関連ポリペプチドのアミノ酸配 列またはヌクレオチド配列と比較して、 アミノ酸またはヌクレオチド 1つ以上が それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドに入替えられたアミノ酸またはヌク レオチド配列の変化である。  A “substitution” is an amino acid or nucleotide sequence in which one or more amino acids or nucleotides are replaced with different amino acids or nucleotides as compared to the amino acid sequence or nucleotide sequence of a naturally occurring GPCR or GPCR-related polypeptide. It is a change.
本明細書において用いられる 「ハイブリダィズ」 とは、 核酸鎖が塩基対形成を 通じて相補鎖と結合するプロセスを意味する。 本明細書で用いられる 「治療」 とは、 概して、 薬理学的なおよび/または生理 学的な効果を得ることを意味する。 効果とは、 疾患や症状を完全にあるいは部分 的に妨げる点で予防的であってもよく、 疾患の症状を完全にあるいは部分的に治 療する点で治療的であっても良い。 本明細書で用いられる 「治療」 という用語は、 哺乳類、 特にヒトにおける疾患の治療すベてを含んでいる。 そしてさらに、 疾患 の素因があるが未だ発病していると診断されていなぃ被検者の発病の予防、 疾患 の進行を抑制すること、 または疾患を軽減させることなどもこの用語に含まれる。 本明細書で用いられる 「リガンド」 とは、 本発明のポリペプチドに結合する分 子を意味する。 リガンドには、 天然リガンドおよび合成リガンドが含まれる。 「ァゴ二スト」 とは、 本発明のポリペプチドに結合し、 それを活性化する分子を 意味する。 一方、 「アン夕ゴニスト」 とは、 本発明のポリペプチドの活性化を阻 害する分子を意味する。 As used herein, “hybridization” refers to the process by which a nucleic acid strand binds to a complementary strand through base pairing. As used herein, “treatment” generally means obtaining a pharmacological and / or physiological effect. The effect may be prophylactic in that the disease or symptom is completely or partially prevented, or may be therapeutic in that the symptom of the disease is completely or partially treated. The term “treatment” as used herein includes all treatment of diseases in mammals, particularly humans. In addition, the term includes prevention of the onset of a subject who is predisposed to the disease but has not yet been diagnosed, suppressing the progression of the disease, or reducing the disease. As used herein, “ligand” means a molecule that binds to a polypeptide of the invention. Ligand includes natural and synthetic ligands. “Agonist” means a molecule that binds to and activates a polypeptide of the invention. On the other hand, “an evening gonist” means a molecule that inhibits activation of the polypeptide of the present invention.
<ポリペプチド > <Polypeptide>
本発明は、 GPCRファミリ一に属する新規なポリペプチドを提供する。 本発明に 含まれる、 本発明者等により同定されたヒト由来のポリヌクレオチドの塩基配列 を配列番号： 1 9に、 該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸 配列を配列番号： 2 0に示す。  The present invention provides a novel polypeptide belonging to the GPCR family. The nucleotide sequence of a human-derived polynucleotide identified by the present inventors contained in the present invention is shown in SEQ ID NO: 19 and the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the polynucleotide is shown in SEQ ID NO: 20.
GPCRは、 そのリガンドの作用により G蛋白質の活性化を通じて細胞内ヘシダナ ル伝達を行なう活性を有しており、 遺伝的疾患を始めとして、 脳神経系、 循環器 系、 消化器系、 免疫系、 運動器系、 泌尿器生殖器系などの非常に多くの領域の疾 患に関連している。 従って、 本発明のポリペプチドは、 その機能を調節するリガ ンド、 ァゴニス卜あるいはアン夕ゴニス卜などのスクリ一ニングに利用すること ができ、 上記疾患に対する医薬品の開発の重要な標的となる。  GPCR has the activity to transmit intracellular hesidanal through the activation of G protein by the action of its ligand, including genetic diseases, cranial nervous system, circulatory system, digestive system, immune system, exercise It is associated with a vast number of diseases, including the genital system and the urogenital system. Therefore, the polypeptide of the present invention can be used for screening of a ligand, an agonis moth or an antagonism moth that regulates its function, and is an important target for the development of a pharmaceutical for the above diseases.
本発明は、 また、 本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等な ポリペプチドを提供する。 ここで 「機能的に同等」 とは、 対象となるポリべプチ ドが本発明者らにより同定されたポリペプチドと同等の生物学的特性を有してい ることを意味する。 GPCRが持つ生物学的特性としては、 リガンドとの結合活性や 三量体型 GTP結合蛋白質の活性化を介して細胞内へシグナル伝達を行なう活性が 挙げられる。 三量体型 GTP結合蛋白質は、 活性化する細胞内伝達系の種類によつ て、 Ca'2+を上昇させる GQ型、 cAMPを上昇させる Gs型、 そして cAMPを抑制する Gi型 の 3種類のカテゴリーに分類される （Trends Pharmacol. Sci. (99) 20:118)。 従 つて、 対象となるポリペプチドが本発明者らにより同定されたポリペプチドと同 等の生物学的特性を有しているか否かは、 例えば、 その活性化による細胞内の cA MP濃度もしくはカルシウム濃度の変化を検出することにより評価することが可能 である。 The present invention also provides polypeptides that are functionally equivalent to the polypeptides identified by the present inventors. Here, “functionally equivalent” means that the subject polypeptide has the same biological characteristics as the polypeptide identified by the present inventors. Means that. Biological properties of GPCRs include the ability to transduce signals into cells through the binding activity of ligands and the activation of trimeric GTP-binding proteins. Trimeric GTP-binding proteins are classified into three types: GQ type that increases Ca ' 2+ , Gs type that increases cAMP, and Gi type that suppresses cAMP, depending on the type of intracellular transmission system that is activated. Classified into categories (Trends Pharmacol. Sci. (99) 20: 118). Therefore, whether or not the polypeptide of interest has the same biological characteristics as the polypeptide identified by the present inventors can be determined by, for example, determining the intracellular cAMP concentration or calcium by activation. It can be evaluated by detecting changes in concentration.
本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調 製するための方法の 1つの態様としては、 蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入 する方法が挙げられる。 このような方法には、 例えば、 部位特異的変異誘発法（C urrent Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publ is h. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)) が含まれる。 また、 ポリペプチド中の アミノ酸の変異は、 自然界において生じることもある。 本発明には、 このように 人工的か自然に生じたものかを問わず、 本発明者らにより同定されたポリべプチ ドのアミノ酸配列 （配列番号： 20) において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入およびノもしくは付加などにより変異した蛋白質であって、 本発明者 らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドが含まれる。 置換されるアミノ酸は、 蛋白質の機能の保持の観点から、 置換前のアミノ酸と 似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。 例えば、 Ala、 Val、 Leu, Ile、 Pro, Met、 Phe、 Tn)は、 共に非極性アミノ酸に分類されるため、 互いに似た性質 を有すると考えられる。 また、 非荷電性としては、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 A sn、 Ginが挙げられる。 また、 酸性アミノ酸としては、 Aspおよび Gluが、 塩基性 アミノ酸としては、 Lys、 Arg、 Hisが挙げられる。  One embodiment of a method for preparing a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors is a method of introducing a mutation into an amino acid sequence in a protein. Such methods include, for example, site-directed mutagenesis (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publ is h. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)). Also, amino acid mutations in polypeptides may occur in nature. In the present invention, one or more amino acids are substituted in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) of the polypeptide identified by the present inventors, whether artificial or naturally occurring. And a protein mutated by deletion, insertion and addition or addition, and a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors. The amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution from the viewpoint of maintaining the function of the protein. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Tn) are all classified as nonpolar amino acids, and thus are considered to have similar properties. Examples of uncharged properties include Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin. Examples of acidic amino acids include Asp and Glu, and examples of basic amino acids include Lys, Arg, and His.
これらポリペプチドにおけるァミノ酸の変異数や変異部位は、 その機能が保持 される限り制限はない。 変異数は、 典型的には、 全アミノ酸の 10%以内であり、 好ましくは全アミノ酸の 5 %以内であり、 さらに好ましくは全アミノ酸の 1 %以内 であると考えられる。 The number of amino acid mutations and mutation sites in these polypeptides are retained. There are no restrictions as far as possible. The number of mutations will typically be within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids.
本発明者らにより同定されたポリぺプチドと機能的に同等なポリぺプチドを調 製するための方法の他の態様としては、 ハイブリダィゼーシヨン技術あるいは遺 伝子増幅技術を利用する方法が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 ハイブリダ ィゼ一シヨン技術 (Current Protocol s in Mol ecul ar Biology ed i t. Ausubel e t al. (1987) Publ i sh. Jhon Wi ly & Sons Sec t ion 6. 3-6. 4)を利用して本発明 者らにより同定されたポリペプチドをコードする DNA配列 （配列番号： 1 9 ) ま たはその一部をもとに同種または異種生物由来の DNA試料から、 これと相同性の 高い MAを単離して、 該 DNAから本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能 的に同等なポリペプチドを得ることは、 通常行いうることである。 このように本 発明者らにより同定されたポリペプチドをコードする DNAとハイブリダィズする D NAによりコ一ドされるポリぺプチドであって、 本発明者らにより同定されたポリ ペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明のポリペプチドに含まれる。 このようなポリペプチドを単離するための生物としては、 ヒト以外に、 例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ブタ、 ゥシ等が挙げられるが、 これらに制 限されない。  As another aspect of the method for preparing a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors, a method using a hybridization technique or a gene amplification technique Is mentioned. That is, a person skilled in the art can understand the hybridization technology (Current Protocols in Molecule Biology ed. Ausubel et al. (1987) Publ i sh. Jhon Wily & Sons Section 6. 3- 6.4) Using the DNA sequence encoding the polypeptide identified by the present inventors using 4) (SEQ ID NO: 19) or a DNA sample derived from the same or different organism based on a part thereof, It is usually possible to isolate a highly homologous MA and obtain a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors from the DNA. Thus, a polypeptide encoded by DNA that hybridizes with DNA encoding the polypeptide identified by the present inventors, which is functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors. Such polypeptides are also included in the polypeptides of the present invention. Examples of organisms for isolating such polypeptides include, but are not limited to, rats, mice, rabbits, chickens, pigs, and ushi as well as humans.
本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコ 一ドする DNAを単離するためのストリンジェン卜なハイプリダイゼーシヨン条件 としては、 通常 「lxSSC、 0. 1¾ SDS、 37で」 程度の条件であり、 より厳しい条件 としては 「0. 5xSS 0. 1¾ SDS、 42t:」 程度の条件であり、 さらに厳しい条件と しては 「0. 2xSSC、 0. 1% SDS、 65で」 程度の条件である。 このようにハイブリダ ィゼ一シヨンの条件が厳しくなるほどプロ一ブ配列と高い相同性を有する DNAの 単離を期待しうる。 但し、 上記 SS SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示で あり、 当業者であれば、 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーを決定す る上記若しくは他の要素 （例えば、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 ハイブリダ ィゼーシヨン反応時間など） を適宜組み合わせることにより、 上記と同様のスト リンジエンシーを実現することが可能である。 The stringent hyperprecipitation conditions for isolating DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors are usually “lxSSC, 0.1¾ SDS , 37 '', more severe conditions are `` 0.5xSS 0.1 ¾ SDS, 42t: '', and more severe conditions are `` 0.2xSSC, 0.1% SDS '' It is a condition of “about 65”. As the hybridization conditions become more severe, the isolation of DNA having a high homology with the probe sequence can be expected. However, the above combinations of SS SDS and temperature conditions are examples, and those skilled in the art will determine the stringency of the hybridization. The above-mentioned or other factors (for example, probe concentration, probe length, hybridization reaction time, etc.) can be combined as appropriate to achieve the same stringency as described above.
このようなハイブリダィゼ一シヨン技術を利用して単離される DNAがコードす るポリペプチドは、 通常、 本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸 配列において高い相同性を有する。 高い相同性とは、 少なくとも 40%以上、 好ま しくは 60%以上、 さらに好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 さら に好ましくは少なくとも 95%以上、 さらに好ましくは少なくとも 97%以上 （例え ば、 98〜99%) の配列の相同性を指す。 アミノ酸配列の同一性は、 例えば、 Karl in and Altschul によるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2 264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決 定することができる。 このアルゴリズムに基づいて、 BLASTXと呼ばれるプロダラ ムが開発されている（Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。 BLAS TXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフォルトパラメ一ターを用いる。 これらの解析方法の具体的な 手法は公知である (http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov. )。  Polypeptides encoded by DNA isolated using such hybridization technology usually have high homology in amino acid sequence with the polypeptides identified by the present inventors. High homology means at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably at least 95% or more, more preferably at least 97% or more (e.g. 98-99%). The identity of amino acid sequences can be determined, for example, by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2 264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, by Karl in and Altschul, 1993). Based on this algorithm, a product called BLASTX has been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). When analyzing the amino acid sequence by BLAS TX, the parameter is set to score = 50, wordlength = 3, for example. When using BLAST and Gapped BLAST programs, use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http: 〃 www.ncbi.nlm.nih.gov.).
また、 遺伝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology ed it. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4) を 用いて本発明者らにより同定されたポリペプチドをコードする DNA配列 （配列番 号： 1 9) の一部を基にプライマ一を設計し、 本発明者らにより同定されたポリ ペプチドをコードする DNA配列と相同性の高い DNA断片を単離し、 該 DNAを基に本 発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを得るこ とも可能である。  It also encodes the polypeptide identified by the present inventors using PCR (Current protocols in Molecular Biology ed it.Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4). A primer is designed based on a part of the DNA sequence (SEQ ID NO: 19), and a DNA fragment highly homologous to the DNA sequence encoding the polypeptide identified by the present inventors is isolated, It is also possible to obtain a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors based on DNA.
本発明のポリペプチドは 「成熟」 タンパク質の形であっても、 融合タンパク質 のような、 より大きいタンパク質の一部であってもよい。 本発明のポリペプチド には、 分泌すなわちリーダー配列、 プロ配列、 多重ヒスチジン残基のような精製 に役立つ配列、 または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが含ま れていてもよい。 The polypeptides of the present invention may be in the form of a “mature” protein or may be part of a larger protein, such as a fusion protein. Polypeptide of the present invention These may include secretory or leader sequences, pro sequences, sequences useful for purification, such as multiple histidine residues, or additional sequences that ensure stability during recombinant production.
ぐポリペプチドの断片 > Polypeptide fragments>
本発明は、 また、 本発明のポリペプチドの断片を提供する。 こうした断片は全 体的に前記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、 全部と は同一でないアミノ酸配列を有するポリぺプチドである。 本発明のポリぺプチド 断片は、 通常、 8アミノ酸残基以上、 好ましくは 12アミノ酸残基以上 （例えば、 1 5アミノ酸残基以上） の配列からなるポリペプチド断片である。 好適な断片とし ては、 例えば、 ァミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一 連の残基の欠失、 またはァミノ末端を含む一連の残基とカルボキシル末端を含む 一連の残基の二連の残基の欠失したアミノ酸配列を有するトランケーシヨン（t ru neat ion)ポリペプチドが含まれる。 また、 αヘリックスと αヘリックス形成領域、 ]3シートと /3シート形成領域、 ターンとターン形成領域、 コイルとコイル形成領 域、 親水性領域、 疎水性領域、 ひ両親媒性領域、 /3両親媒性領域、 可変性領域、 表面形成領域、 基質結合領域、 および高抗原指数領域を含む断片のような、 構造 的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である。 その他の好適な断 片は生物学的に活性な断片である。 生物学的に活性な断片は、 同様の活性をもつ 断片、 その活性が向上した断片、 または望ましくない活性が減少した断片を含め て、 本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。 例えば、 リガンドが結 合して細胞内へシグナル伝達を行なう活性を有する断片が挙げられる。 さらに、 動物、 特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。 これらの ポリペプチド断片は、 抗原活性を含めた本発明のポリべプチドの生物学的活性を 保持することが好ましい。 特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を 構成する。 好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、 すなわ ち、 ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。 典型的なこ うした置換は、 Ala, Val， Leu と lieの間、 Ser と Thr の間、 酸性残基 Aspと G1 u の間、 Asn と Gin の間、 塩基性残基 Lysと Arg の間、 または芳香族残基 Pheと Tyr の間で起こる。 The present invention also provides fragments of the polypeptides of the present invention. Such a fragment is a polypeptide having an amino acid sequence which is entirely the same as a part of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention but not the same. The polypeptide fragment of the present invention is a polypeptide fragment consisting of a sequence of usually 8 amino acid residues or more, preferably 12 amino acid residues or more (for example, 15 amino acid residues or more). Suitable fragments include, for example, deletion of a series of residues containing an amino terminus or a series of residues containing a carboxyl terminus, or a series of residues containing an amino terminus and a series of residues containing a carboxyl terminus. Included are truncation polypeptides having amino acid sequences deleted of duplicate residues. Α-helix and α-helix formation region,] 3 sheet and / 3 sheet formation region, turn and turn formation region, coil and coil formation region, hydrophilic region, hydrophobic region, lyophilic region, / 3 parents Also suitable are fragments characterized by structural or functional properties, such as fragments comprising a basal region, a variable region, a surface forming region, a substrate binding region, and a high antigen index region. Other suitable fragments are biologically active fragments. Biologically active fragments are those that mediate the activity of a polypeptide of the invention, including fragments with similar activity, fragments with enhanced activity, or fragments with reduced undesirable activity. For example, a fragment having an activity of binding a ligand to perform signal transduction into a cell can be mentioned. Also included are fragments that are antigenic or immunogenic in animals, particularly humans. These polypeptide fragments preferably retain the biological activity of the polypeptide of the present invention, including antigenic activity. Variants of the identified sequences and fragments also form part of the present invention. Preferred variants are those that differ from the target by conservative amino acid substitutions, that is, a residue that is substituted with another residue of similar nature. Typical Such substitutions are between Ala, Val, Leu and lie, between Ser and Thr, between acidic residues Asp and G1 u, between Asn and Gin, between basic residues Lys and Arg, or aromatic Occurs between residues Phe and Tyr.
また、 リガンドに結合して細胞内にシグナル伝達を行なわない断片は、 本発明 のポリペプチドの競合阻害剤になり得るため有用であり、 このような断片も本発 明に含まれる。  In addition, a fragment that binds to a ligand and does not perform signal transduction in a cell is useful because it can be a competitive inhibitor of the polypeptide of the present invention, and such a fragment is also included in the present invention.
<ポリペプチドの製造 > <Production of polypeptide>
本発明のポリべプチドは任意の適当な方法で製造することができる。 このよう なポリペプチドには、 単離された天然に存在するポリペプチド、 組換え的に生産 されたポリペプチド、 合成的に製造されたポリペプチド、 またはこれらの方法の 組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。 このようなポリペプチドの製 造のための手段は当業界でよく理解されている。 組み換え的なポリペプチドは、 例えば、 本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入 し、 形質転換体内で発現したポリぺプチドを精製することにより調製することが 可能である。 一方、 天然由来のポリペプチドは、 例えば、 後述する本発明のポリ ぺプチドに対する抗体を結合したァフィ二ティ一力ラムを利用して調製すること 力でさる (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1 987) Publish. John Wiley & Sons Section 16.1-16.19)。 ァフィ二ティ一精製 に用いる抗体は、 ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても よい。 また、 インビ卜ロトランスレーシヨン （例えば、 「0n the fidelity of m RNA translation in the nuclease - treated rabbi t reticulocyte lysate syste m. Dasso, M. C. , Jackson, R. J. (1989) NAR 17:3129-3144」 参照） などにより本発 明のポリぺプチドを調製することも可能である。 本発明のポリベプチドの断片は、 例えば、 本発明のポリペプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによって製 造することができる。  The polypeptides of the present invention can be produced by any suitable method. Such polypeptides include an isolated naturally occurring polypeptide, a recombinantly produced polypeptide, a synthetically produced polypeptide, or a polypeptide produced by a combination of these methods. Is included. Means for the production of such polypeptides are well understood in the art. A recombinant polypeptide can be prepared, for example, by introducing a vector inserted with the polynucleotide of the present invention into a suitable host cell and purifying the polypeptide expressed in the transformant. On the other hand, a naturally-occurring polypeptide can be prepared, for example, by using a affinity ram bound with an antibody against the polypeptide of the present invention described later (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. al. (1 987) Publish. John Wiley & Sons Section 16.1-16.19). The antibody used for affinity purification may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In vitro translation (see, for example, “0n the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbi t reticulocyte lysate syste m. Dasso, MC, Jackson, RJ (1989) NAR 17: 3129-3144”) It is also possible to prepare the polypeptide of the present invention by, for example. The polypeptide fragment of the present invention can be produced, for example, by cleaving the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase.
ぐポリヌクレオチド > 本発明は、 また、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供 する。 本発明のポリヌクレオチドには、 配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列か らなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 配列番号： 1 9に記載の塩 基配列のコ一ド領域を含むポリヌクレオチド、 遺伝コードの縮重により配列番 号： 1 9に記載の塩基配列と異なる塩基配列からなるが配列番号： 2 0に記載の アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。 本発明のポリヌクレオチドには、 さらに、 これらポリヌクレオチドがコードする ポリべプチドと機能的に同等なポリべプチドをコードし、 該ポリヌクレオチドの 配列とその全長において少なくとも 40 %以上、 好ましくは 60 %以上、 さらに好ま しくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上、 さら に好ましくは 97%以上 （例えば、 98〜99% ) 同一である塩基配列を含むポリヌク レオチドが含まれる。 塩基配列の同一性は、 例えば、 Karl in and Al tschul によ るアルゴリズム BLAST (Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA 87 : 2264-2268, 1990、 Pro Nat l. Acad. Sc i. USA 90 : 5873-5877, 1993)によって決定することができる。 このアルゴリズムに基づいて、 BLASTNと呼ばれるプログラムが開発されている（A l tschul et al. J. Mol. Biol. 215 : 403-410, 1990)。 BLASTNによって塩基配列を 解析する場合には、 パラメ一夕一はたとえば score = 100、 wordlength = 12とす る。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフォ ル卜パラメータ一を用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ht t p：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov. )。 本発明のポリヌクレオチドには、 上記のポリヌク レオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。 本発明のポリヌクレオチドは、 標準的なクローニングおよびスクリーニングに より、 例えば， 細胞中の mRNAから誘導された cDNAライブラリーから得ることがで きる。 また、 本発明のポリヌクレオチドはゲノム DNAライブラリ一のような天然 源から得ることができ、 商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成することも できる。 本発明者らにより同定されたポリヌクレオチドの配列 （配列番号： 1 9) と有 意な相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、 例えば、 ハイブリダ ィゼーシヨン技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel e t al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.3-6.4)や遺伝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (19 87) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4) を利用して調製することが できる。 即ち、 ハイブリダィゼーシヨン技術を利用して、 本発明者らにより同定 されたポリヌクレオチドの配列 （配列番号： 1 9) またはその一部をもとに同種 または異種生物由来の DNA試料から、 これと相同性の高レ NAを単離することがで きる。 また、 遺伝子増幅技術を用いて、 本発明者らにより同定されたポリヌクレ ォチドの配列 （配列番号： 1 9) の一部を基にプライマ一を設計し、 該ポリヌク レオチドの配列と相同性の高いポリヌクレオチドを単離することができる。 従つ て、 本発明には、 配列番号： 1 9に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドが含まれる。 ストリンジエンドなハイブリダィゼ一シヨン条件としては、 通常 「lxSS 0.1¾ SDS、 37で」 程度の条件であり、 より厳しい条件としては 「0.5xSS 0.1¾ SDS、 42で」 程度の条件であり、 さらに厳しい条件としては 「0.2xSS (：、 0.1¾ SDS、 6 5で」 程度の条件である。 このようにハイブリダィゼーシヨンの条件が厳しくな るほどプローブ配列と高い相同性を有する DNAの単離を期待しうる。 但し、 上記 S S SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、 当業者であれば、 ハイブ リダィゼーシヨンのストりンジエンシーを決定する上記若しくは他の要素 （例え ば、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 ハイブリダィゼーシヨン反応時間など） を 適宜組み合わせることにより、 上記と同様のストリンジエンシーを実現すること が可能である。 Polynucleotide> The present invention also provides a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention. The polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20; a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19; A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 but comprising a base sequence different from the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 due to the degeneracy of the genetic code is included. The polynucleotide of the present invention further encodes a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide encoded by these polynucleotides, and is at least 40% or more, preferably 60%, in the polynucleotide sequence and its total length. More preferably, 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more (for example, 98 to 99%) including a polynucleotide containing the same base sequence. It is. The identity of the base sequence can be determined by, for example, the algorithm BLAST (Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Pro Nat l. Acad. Sci. USA 90 by Karl in and Altschul. : 5873-5877, 1993). Based on this algorithm, a program called BLASTN has been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). When analyzing the base sequence by BLASTN, for example, parameter = 100, wordlength = 12. When using BLAST and Gapped BLAST programs, use the default parameter for each program. Specific methods of these analysis methods are known (ht tp: 〃 www.ncbi.nlm.nih.gov.). The polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the above-mentioned polynucleotide. The polynucleotide of the present invention can be obtained by standard cloning and screening, for example, from a cDNA library derived from mRNA in cells. In addition, the polynucleotide of the present invention can be obtained from a natural source such as a genomic DNA library, and can also be synthesized using known techniques that are commercially available. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having a significant homology with the polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors can be obtained by, for example, hybridization technology (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.). al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.3-6.4) and Gene Amplification Technology (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (19 87) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4) Can be prepared. That is, using a hybridization technique, a polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors or a part thereof, from a DNA sample derived from the same species or a different organism, Highly homologous NAs can be isolated. In addition, using a gene amplification technique, a primer is designed based on a part of the polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors, and is highly homologous to the polynucleotide sequence. The polynucleotide can be isolated. Therefore, the present invention includes a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 19 under stringent conditions. Stringent-end hybridization conditions are usually about “lxSS 0.1¾ SDS, 37”, and more severe conditions are about “0.5xSS 0.1¾ SDS, 42”. For example, the condition is about 0.2xSS (:, 0.1¾ SDS, 65). In this way, DNA with higher homology with the probe sequence can be isolated as the hybridization conditions become more severe. However, the above combinations of SS SDS and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will recognize the above or other factors that determine the hybridization severity (eg, probe concentration, probe length). In addition, it is possible to achieve the same stringency as described above by appropriately combining the hybridization reaction time and the like.
本発明者らにより同定されたポリヌクレオチドの配列と有意な相同性を有する 塩基配列からなるポリヌクレオチドは、 配列番号： 1 9に記載の塩基配列に変異 を導入する方法 （例えば、 部位特異的変異誘発法（Current Protocol s in Mol ecu l ar Biology ed i t. Ausube l e t al. (1987) Publ i sh. John Wi l ey & Sons Sect i on 8. 1-8. 5) ) を利用して調製することもできる。 また、 このようなポリヌクレ ォチドは、 自然界における変異により生じることもある。 本発明には、 このよう な塩基配列の変異により、 配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列において 1もし くは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および/もしくは付加などされたポリべ プチドをコ一ドするポリヌクレオチドが含まれる。 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having significant homology with the polynucleotide sequence identified by the present inventors is mutated to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 (For example, site-specific mutagenesis (Current Protocols in Molecular Biology ed. Ausube let al. (1987) Publ i sh. John Wiley & Sons Sect i on 8.1) -8. It can also be prepared using 5)). Such polynucleotides can also be caused by mutations in nature. In the present invention, a polypeptide in which one or a plurality of amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is substituted, deleted, inserted and / or added due to such mutation of the base sequence is used. A polynucleotide that encodes is included.
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え生産のために用い る場合、 そのポリヌクレオチドには、 成熟ポリペプチドのコード配列またはその 断片単独、 他のコード配列 （例えば、 リーダーもしくは分泌配列、 プレ-、 プロ - もしくはプレブ口-タンパク質配列、 または他の融合べプチド部分をコードする もの） と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列また はその断片が含まれる。 例えば、 融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー 配列がコードされ得る。 本発明のこの態様の好ましい具体例として、 マーカー配 列は、 pcDNA3. 1/Myc- Hi sベクター（Invi t rogen社）により提供されかつ Gentz ら， Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA (1989) 86 : 82卜 824に記載されるようなへキサ -ヒ スチジンペプチド、 または Mycタグである。 また、 このポリヌクレオチドは 5'お よび 3'非コード配列、 例えば、 転写されるが翻訳されない配列、 スプライシング およびポリアデニル化シグナル、 リボソーム結合部位、 および mRNA安定化配列を 含んでいてもよい。  When the polynucleotide of the present invention is used for the recombinant production of the polypeptide of the present invention, the polynucleotide includes a mature polypeptide coding sequence or a fragment thereof alone, other coding sequences (eg, leader or secretory sequence). , Pre-, pro-, or pre-mouth protein sequences, or coding sequences for mature polypeptides that are in the same reading frame as those that encode other fusion peptide moieties) or fragments thereof. For example, a marker sequence that facilitates purification of the fusion polypeptide can be encoded. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the marker sequence is provided by the pcDNA3.1 / Myc-His vector (Invitrogen) and Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1989) 86:82 卜 824. Hexa-histidine peptide as described in Myc tag. The polynucleotide may also include 5 'and 3' non-coding sequences, such as transcribed but not translated sequences, splicing and polyadenylation signals, ribosome binding sites, and mRNA stabilizing sequences.
<プローブ · プライマー ·アンチセンス · リボザィム〉  <Probe · Primer · Antisense · Ribozyme>
本発明は、 本発明者らにより同定されたポリヌクレオチド （配列番号： 1 9に 記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖） に相補的な、 少な くとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するヌクレオチドを提供する。 ここで 「相補 鎖」 とは、 A: T (ただし RNAの場合は U) 、 G : Cの塩基対からなる 2本鎖核酸の一方 の鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なくとも 15個の連続し たヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なくとも 70%、 好ましくは少なくとも 80%、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95%以上の塩 基配列上の相同性を有すればよい。 相同性を決定するためのアルゴリズムは本明 細書に記載したものを使用すればよい。 このようなヌクレオチドは、 本発明のポ リヌクレオチドを検出、 単離するためのプローブとして、 また、 本発明のヌクレ ォチドを増幅するためのプライマ一として利用することが可能である。 プライマ 一として用いる場合には、 通常、 15〜100ヌクレオチド、 好ましくは 15〜35ヌク レオチドの鎖長を有する。 また、 プローブとして用いる場合には、 本発明の DNA の少なくとも一部若しくは全部の配列を含む少なくとも 15ヌクレオチド、 好まし くは少なくとも 30ヌクレオチドの鎖長のヌクレオチドが用いられる。 このような ヌクレオチドは、 好ましくは本発明のポリぺプチドをコ一ドする DNAに特異的に ハイブリダィズするものである。 「特異的にハイブリダィズする」 とは、 通常の ハイブリダィゼーシヨン条件下、 好ましくはストリンジェントな条件下で、 本発 明者らにより同定されたヌクレオチド （配列番号： 1 9 ) とハイブリダィズし、 他のポリペプチドをコードする DNAとはハイブリダィズしないことを意味する。 これらヌクレオチドは、 本発明のポリべプチドの活性の異常ゃ該ポリペチドを コ一ドする遺伝子の発現の異常を検査 ·診断するために利用できる。 The present invention relates to a nucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, which is complementary to the polynucleotide identified by the present inventors (polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 19 or its complementary strand). I will provide a. Here, “complementary strand” refers to the other strand of one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs. “Complementary” means at least 15 consecutive It is not limited to a completely complementary sequence in the nucleotide region, and at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and even more preferably 95% or more of the homology on the base sequence is sufficient. . As an algorithm for determining homology, the algorithm described in this specification may be used. Such a nucleotide can be used as a probe for detecting and isolating the polynucleotide of the present invention and as a primer for amplifying the nucleotide of the present invention. When used as a primer, it usually has a chain length of 15 to 100 nucleotides, preferably 15 to 35 nucleotides. When used as a probe, nucleotides having a chain length of at least 15 nucleotides, preferably at least 30 nucleotides, including at least a part or all of the sequence of the DNA of the present invention are used. Such nucleotides are preferably those that specifically hybridize to the DNA encoding the polypeptide of the present invention. “Specifically hybridize” means to hybridize with the nucleotide (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors under normal hybridization conditions, preferably under stringent conditions. It means not hybridizing with DNA encoding another polypeptide. These nucleotides can be used for examining and diagnosing abnormalities in the expression of genes encoding the polypeptides of the present invention.
また、 これらヌクレオチドには、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の 発現を抑制するポリヌクレオチドが含まれる。 このようなポリヌクレオチドには、 アンチセンス DNA (本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物と相補 的なアンチセンス RNAをコードする DNA) ゃリボザィム （本発明のポリペプチドを コードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNAを コードする DNA) が含まれる。  These nucleotides include polynucleotides that suppress the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention. Such polynucleotides include antisense DNA (DNA encoding antisense RNA complementary to the transcription product of the gene encoding the polypeptide of the present invention) or ribozyme (transcription of gene encoding the polypeptide of the present invention). DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the product.
アンチセンス DNAが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、 以下のような 複数の要因が存在する。 すなわち、 三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメ ラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイプリッド形成 による転写抑制、 合成の進みつつある RNAとのハイブリツ ド形成による転写阻害、 イントロンとェキソンとの接合点でのハイプリッド形成によるスプライシング抑 制、 スプライソソーム形成部位とのハイプリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイブリツド形成による核から細胞質への移行抑制、 キヤッビング部位 やポリ （A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、 翻訳開始 因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始抑制、 開始コドン近傍のリボ ソーム結合部位とのハイプリッド形成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソ ーム結合部位とのハイブリツド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、 および核酸と タンパク質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発現抑制などで ある。 これらは、 転写、 スプライシング、 または翻訳の過程を阻害して、 標的遺 伝子の発現を抑制する（平島および井上 「新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺伝子の複 製と発現」 ， 日本生化学会編，東京化学同人， pp. 319-347, 1993)。 There are several factors that can suppress the expression of target genes by antisense DNA. In other words, transcription initiation inhibition by triplex formation, and formation of a hybrid with a site where an open loop structure was locally created by RNA polymerase Transcriptional suppression by RNA, Transcriptional inhibition by hybridization with RNA, which is being synthesized, Splicing suppression by formation of hybrid at the junction of intron and exon, Splicing suppression by formation of hybrid with spliceosome formation site, Splicing with mRNA Suppression of transition from nucleus to cytoplasm due to hybridization, suppression of splicing by hybridization with a capping site or poly (A) addition site, suppression of translation initiation by formation of a hybrid with a translation initiation factor binding site, ribosome binding site near the initiation codon Translational inhibition by the formation of hyperids, inhibition of peptide chain elongation by the formation of hybrids with mRNA translation regions and polymerase binding sites, and suppression of gene expression by the formation of hybrids between nucleic acid and protein interaction sites. These inhibit the transcription, splicing, or translation process and suppress the expression of the target gene (Hirashima and Inoue, “Nuclear Chemistry Laboratory 2 Duplication and Expression of Nucleic Acid IV Genes”, edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Doujin, pp. 319-347, 1993).
本発明で用いられるアンチセンス DNAは、 上記のいずれの作用で標的遺伝子の 発現を抑制してもよい。 一つの態様としては、 遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳 領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果的であ ろう。 しかし、 コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し る。 このように、 遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス 配列を含む DNAも、 本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。 使用される アンチセンス DNAは、 適当なプロモーターの下流に連結され、 好ましくは 3'側に 転写終結シグナルを含む配列が連結される。 アンチセンス DNAの配列は、 標的遺 伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、 遺伝子の発現を有 効に阻害できる限り、 完全に相補的でなくてもよい。 転写された RNAは、 標的と する遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上の 相補性を有する。 アンチセンス配列を用いて、 効果的に標的遺伝子の発現を阻害 するには、 アンチセンス DNAは、 アンチセンス効果を引き起こすために、 少なく とも 15bp以上、 好ましくは 100bp、 さらに好ましくは 500bp以上の鎖長を有し、 通 常、 3000bp以内、 好ましくは 2000bp以内の鎖長を有する。 The antisense DNA used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above. In one embodiment, designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of a gene would be effective in inhibiting gene translation. However, a sequence complementary to the coding region or 3 'untranslated region is also used. Thus, the DNA containing the antisense sequence of not only the translated region of the gene but also the sequence of the untranslated region is also included in the antisense DNA used in the present invention. The antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the target gene or a part thereof, but may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited. The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcription product of the target gene. In order to effectively inhibit the expression of the target gene using the antisense sequence, the antisense DNA has a chain length of at least 15 bp, preferably 100 bp, more preferably 500 bp or more in order to cause an antisense effect. Have Usually, it has a chain length of 3000 bp or less, preferably 2000 bp or less.
このようなアンチセンス DNAには、 本発明のポリペプチドの異常 （機能異常や 発現異常） などに起因した疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。 該アンチセ ンス DNAは、 例えば、 本発明のポリペプチドをコードする DNA (例えば、 配列番 号： 19) の配列情報を基にホスホロチォネート法 （Stein, 1988 Physicochemi cal roperties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 16, 3209-21 (1988)) などにより調製することが可能である。  Such antisense DNA may be applied to gene therapy for diseases caused by abnormality (functional abnormality or expression abnormality) of the polypeptide of the present invention. The antisense DNA is, for example, based on the sequence information of DNA encoding the polypeptide of the present invention (for example, SEQ ID NO: 19) (Stein, 1988 Physicochemi cal roperties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids). Res 16, 3209-21 (1988)) and the like.
内在性遺伝子の発現の抑制は、 また、 リボザィムをコードする DNAを利用して 行うことも可能である。 リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう c リボザィムには種々の活性を有するものがあるが、 中でも RNAを切断する酵素と してのリボザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィ ムの設計が可能となった。 リポザィムには、 グループ Iイン卜ロン型や、 RNaseP に含まれる M1RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、 ハンマ —へッド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメィンを有する ものもある（小泉誠および大塚栄子， （1990) 蛋白質核酸酵素， 35:2191)。  Inhibition of endogenous gene expression can also be achieved using DNA encoding a ribozyme. A ribozyme is an RNA molecule that has catalytic activity.c Some ribozymes have various activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made site-specific cleavage of RNA possible. The target ribozyme can be designed. Liposomes include group I introns and M1RNAs of RNaseP that are over 400 nucleotides in size, but the hammer-head type hairpin type has an active domain of about 40 nucleotides. Some have (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, (1990) Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191).
例えば、 ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15 の 3'側を切断するが、 活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とさ れ、 15位の塩基は Cの他に Aまたは ϋでも切断されることが示されている（M. Koizum iら， (1988) FEBS Lett.228:225)。 リボザィムの基質結合部を標的部位近傍の RNA 配列と相補的になるように設計すれば、 標的 RNA中の U (：、 UUまたは Mという配列 を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することが可能である（M. Ko i z umiら， (1988) FEBS Lett. 239:285、 小泉誠および大塚栄子， (1990) 蛋白質核酸 酵素， 35:2191、 M. Koizumiら, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。 本発明者 らにより同定されたポリヌクレオチド （配列番号： 19) 中には標的となりうる 部位が複数存在する。  For example, the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves on the 3 'side of C15 of G13U14C15, but it is important for activity that U14 forms a base pair with A at position 9, and the base at position 15 Has been shown to be cleaved by A or cocoons in addition to C (M. Koizum i et al., (1988) FEBS Lett. 228: 225). If the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, a restriction enzyme-like RNA cleavage ribozyme that recognizes the U (:, UU or M sequence in the target RNA can be created. (M. Ko iz umi et al., (1988) FEBS Lett. 239: 285, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, (1990) Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191, M. Koizumi et al., (1989) Nucleic Acids Res 17: 7059) In the polynucleotide (SEQ ID NO: 19) identified by the present inventors, there are a plurality of sites that can be targeted.
また、 ヘアピン型リボザィムも、 本発明の目的のために有用である。 型リボザィムは、 例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイ ナス鎖に見出される（J.M.Buzayan Nature 323:349, 1986) D このリポザィムも、 標的特異的な RNA切断を起こすように設計できることが示されている（Y. Kikuchi および N.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、 菊池洋， (1992) 化学と 生物 30:112)。 Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Type ribozymes are found, for example, in the negative strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (JMBuzayan Nature 323: 349, 1986) D It has been shown that this liposome can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Y. Kikuchi and N. Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751, Hiroshi Kikuchi, (1992) Chemistry and Biology 30: 112).
本発明のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド は、 遺伝子治療に用いる場合には、 例えば、 レトロウイルスベクタ一、 アデノウ ィルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクターゃリポソ —ムなどの非ウィルスベクタ一などを利用して、 ex vivo や in 法などによ り患者へ投与を行うことが考えられる。  The polynucleotide that suppresses the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention can be used for gene therapy, for example, a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector. -It is possible to administer to patients by ex vivo or in method using non-viral vectors such as
<ベクター、 宿主細胞、 ポリペプチドの製造〉  <Manufacture of vectors, host cells, and polypeptides>
本発明はまた、 本発明のポリヌクレオチドを含有するべクタ一、 本発明のポリ ヌクレオチドまたは該ベクターを保持する宿主細胞、 および該宿主細胞を利用し た本発明のポリペプチドの生産方法を提供する。  The present invention also provides a vector containing the polynucleotide of the present invention, a host cell carrying the polynucleotide of the present invention or the vector, and a method for producing the polypeptide of the present invention using the host cell. .
本発明のベクタ一としては、 挿入した DNAを安定に保持するものであれば特に 制限されず、 例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、 クローニング用ベクタ一 としては pBluescriptベクタ一（Stratagene社製） などが好ましい。 本発明のポリ ぺプチドを生産する目的においてべクタ一を用いる場合には、 特に発現ベクター が有用である。 発現べクタ一としては、 試験管内、 大腸菌内、 培養細胞内、 生物 個体内でポリペプチドを発現するべクタ一であれば特に制限されないが、 例えば、 試験管内発現であれば PBESTベクタ一 （プロメガ社製） 、 大腸菌であれば pETべク 夕一 (Invitrogen社製) 、 培養細胞であれば pME18S- FL3ベクター (GenBank Acce ssion No. AB009864) 、 生物個体であれば pME18Sベクター (Mol Cell Biol. 8:4 66-472(1988)) などが好ましい。 ベクタ一への本発明の DNAの挿入は、 常法によ り、 例えば、 制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる （Cu rrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wi ley & Sons. Sect ion 11. 4-11. 11)。 The vector of the present invention is not particularly limited as long as it stably holds the inserted DNA. For example, if E. coli is used as the host, the pBluescript vector (Stratagene) is used as the cloning vector. Is preferred. In the case of using a vector for the purpose of producing the polypeptide of the present invention, an expression vector is particularly useful. The expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses the polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in organisms. For example, in the case of in vitro expression, the PBEST vector (Promega PET vector (Invitrogen) for E. coli, pME18S-FL3 vector (GenBank Accession No. AB009864) for cultured cells, pME18S vector (Mol Cell Biol. 8 for organisms) : 4 66-472 (1988)). The DNA of the present invention can be inserted into the vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish). . John Wiley & Sons. Sect ion 11. 4-11. 11).
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 目的に応じ て種々の宿主細胞が用いられる。 ポリペプチドを発現させるための細胞としては、 例えば、 細菌細胞 （例：ストレプトコッカス、 ス夕フイロコッカス、 大腸菌、 ス トレブトミセス、 枯草菌） 、 真菌細胞 （例：酵母、 ァスペルギルス） 、 昆虫細胞 (例： ドロソフイラ S2、 スポドプテラ SF9) 、 動物細胞 （例： CH0、 COS, HeLa、 C 127、 3T3、 BHK、 HEK293, Bowes メラノ一マ細胞） および植物細胞を例示するこ とができる。 宿主細胞へのベクタ一導入は、 例えば、 リン酸カルシウム沈殿法、 電気パルス穿孔法 (Current protocol s in Mol ecul ar Biology edi t. Ausube l e t al. (1987) Publ i sh. John Wi ley & Sons. Sec t ion 9. 1-9. 9) 、 リボフェク夕 ミン法 （GIBCO- BRL社製） 、 マイクロインジェクション法などの公知の方法で行 うことが可能である。  The host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose. Examples of the cells for expressing the polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, St. phyllococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila S2). Spodoptera SF9), animal cells (eg, CH0, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells. Vectors can be introduced into host cells by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocol s in Mol e biar biology ed. Ausube let al. (1987) Publ i sh. John Wiley & Sons. Sec t ion 9. 1-9. 9), a ribofectamine method (GIBCO-BRL), a microinjection method and the like.
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、 細胞周辺腔に、 ま たは細胞外の環境に分泌させるために、 適当な分泌シグナルを目的のポリべプチ ドに組み込むことができる。 これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内 因性であっても、 異種シグナルであってもよい。  In order to secrete the polypeptide expressed in the host cell into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space, or into the extracellular environment, an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest. These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or they may be heterologous signals.
本発明のポリペプチドの回収は、 本発明のポリペプチドが培地に分泌される場 合は、 培地を回収する。 本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、 そ の細胞をまず溶解し、 その後にポリペプチドを回収する。  The polypeptide of the present invention is recovered when the polypeptide of the present invention is secreted into the medium. When the polypeptide of the present invention is produced intracellularly, the cell is first lysed, and then the polypeptide is recovered.
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、 硫酸アン モニゥムまたはエタノール沈殿、 酸抽出、 ァニオンまたはカチオン交換クロマト グラフィ一、 ホスホセルロースクロマトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグ ラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 七ドロキシルアパタイトクロマ トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ とができる。  To recover and purify the polypeptide of the present invention from recombinant cell culture, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Known methods can be used, including two-dimensional chromatography, seven droxyl apatite chromatography, and lectin chromatography.
ぐ検査方法 > 本発明は、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または本発 明のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査方法を提供する。 GPCRは、 生体内で重要な機能を有すると考えられ、 その発現や機能の異常は、 種々の疾患 の原因となり得る。 従って、 本発明のポリペプチドの不適当な活性または発現を 指標とすることにより、 このような疾患の検査を行なうことも可能である。 本発明において 「疾患の検査」 とは、 疾患の症状を呈している被検者の治療戦 略を立てるための検査のみならず、 被検者が疾患にかかりやすいか否かを判断す るために行う予防のための検査も含まれる。 Inspection method> The present invention provides a method for examining a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the polypeptide of the present invention or abnormal activity of the polypeptide of the present invention. GPCRs are thought to have important functions in vivo, and abnormalities in their expression and function can cause various diseases. Therefore, it is possible to examine such diseases by using inappropriate activity or expression of the polypeptide of the present invention as an index. In the present invention, “disease test” refers not only to a test for developing a treatment strategy for a subject exhibiting a symptom of a disease, but also to determine whether or not the subject is susceptible to a disease. Also included are preventive tests.
本発明の検査方法の一つの態様は、 被検者における本発明のポリペプチドをコ ードする遺伝子またはその発現制御領域における変異を検出ことを含む方法であ る。  One embodiment of the test method of the present invention is a method comprising detecting a mutation in a gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof in a subject.
一つの方法は、 被検者における本発明のポリペプチドをコードする遺伝子また はその発現制御領域の塩基配列を直接決定することによって検査を行う方法であ る。 この方法においては、 まず、 被検者から DNA試料を調製する。 DNA試料は、 被 検者の細胞、 例えば血液、 尿、 唾液、 組織の生検または剖検材料から抽出した染 色体 DNAあるいは RNAを基に調製することができる。 染色体 DNAから本方法の DNA試 料を調製するには、 例えば染色体 DNAを適当な制限酵素で切断し、 ベクターにク ローニングして、 ゲノムライブラリーを作製すればよい。 RNAから本方法の DNA試 料を調製するには、 例えば、 逆転写酵素を用いて、 RNAから cDNAライブラリ一を 作製すればよい。 本方法においては、 次いで、 本発明のポリペプチドをコードす る遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAを単離する。 該 DNAの単離は、 本発明 のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAにハイブ リダィズするプローブを用いて、 ゲノムライブラリーや cDNAライブラリ一のスク リーニングをすることにより行うことができる。 また、 本発明のポリペプチドを コードする遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAにハイブリダィズするブラ イマ一を用いて、 ゲノム DNAライブラリ一、 cDNAライブラリ一、 あるいは RNAを錶 型とした PCRによって単離することもできる。 本方法においては、 次いで、 単離 した DNAの塩基配列を決定する。 選択した DNAの塩基配列の決定は、 当業者に公知 の方法で行うことができる。 本方法においては、 次いで、 決定した DNAの塩基配 列を、 対照と比較する。 本方法における 「対照」 とは、 正常な （野生型の） 本発 明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAの塩基 配列を言う。 このような比較の結果、 被検者の DNAの塩基配列が対照と異なって いた場合には、 被検者は、 疾患に罹患しているまたは発症の危険があると判定さ れる。 One method is to test by directly determining the base sequence of the gene encoding the polypeptide of the present invention or its expression control region in the subject. In this method, a DNA sample is first prepared from a subject. DNA samples can be prepared based on chromosomal DNA or RNA extracted from a subject's cells, such as blood, urine, saliva, tissue biopsy or autopsy material. To prepare the DNA sample of this method from chromosomal DNA, for example, a chromosomal DNA can be cleaved with an appropriate restriction enzyme and cloned into a vector to prepare a genomic library. To prepare the DNA sample of this method from RNA, for example, reverse cDNA can be used to prepare a cDNA library from RNA. In this method, next, a DNA encoding a gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof is isolated. Isolation of the DNA can be performed by screening a genomic library or cDNA library using a probe that hybridizes to the gene encoding the polypeptide of the present invention or DNA containing the expression control region thereof. it can. In addition, a genomic DNA library, a cDNA library, or RNA is selected using a primer that hybridizes to a gene encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region. It can also be isolated by typed PCR. In this method, the base sequence of the isolated DNA is then determined. The base sequence of the selected DNA can be determined by methods known to those skilled in the art. In this method, the determined DNA base sequence is then compared with a control. The “control” in this method refers to the base sequence of a DNA containing a normal (wild type) gene encoding the polypeptide of the present invention or its expression control region. If the base sequence of the subject's DNA is different from the control as a result of such comparison, the subject is determined to be suffering from or at risk of developing the disease.
本発明の検査方法は、 上記の如く直接被検者由来の DNAの塩基配列を決定する 方法以外に、 種々の方法を用いることができる。  In the test method of the present invention, various methods can be used in addition to the method for directly determining the base sequence of DNA derived from a subject as described above.
その一つの方法においては、 まず、 被検者から DNA試料を調製する。 次いで、 調製した DNA試料を制限酵素により切断する。 次いで、 DNA断片をその大きさに応 じて分離する。 次いで、 検出された DNA断片の大きさを、 対照と比較する。 また、 他の一つの態様においては、 まず、 被検者から DNA試料を調製する。 次いで、 本 発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAを増 幅する。 さらに、 増幅した DNAを制限酵素により切断する。 次いで、 DNA断片をそ の大きさに応じて分離する。 次いで、 検出された DNA断片の大きさを、 対照と比 較する。  In one method, a DNA sample is first prepared from a subject. Next, the prepared DNA sample is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control. In another embodiment, a DNA sample is first prepared from a subject. Next, the gene encoding the polypeptide of the present invention or DNA containing its expression control region is amplified. Furthermore, the amplified DNA is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control.
このような方法としては、 例えば、 制限酵素断片長多型 （Res t r ict ion Fragme nt Length Polymorphi sm/RFLP) を利用した方法や PCR—RFLP法等が挙げられる c 具体的には、 制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、 あるいは制限酵素処理 によって生じる DNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、 制限酵素処理後に 生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。 この変異を含む部分を PCR法に よって増幅し、 それぞれの制限酵素で処理することによって、 これらの変異を電 気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。 あるいは、 染色体 DNAをこれらの制限酵素によって処理し、 電気泳動した後、 本発明のプローブ DNA を用いてサザンブロッティングを行うことにより、 変異の有無を検出することが できる。 用いられる制限酵素は、 それぞれの変異に応じて適宜選択することがで きる。 この方法では、 ゲノム DNA以外にも被検者から調製した RNAを逆転写酵素で cDNAにし、 これをそのまま制限酵素で切断した後、 サザンブロッテイングを行う ことも可能である。 また、 この cDNAを铸型として PCRで本発明のポリペプチドを コードする遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAを増幅し、 それを制限酵素 で切断した後、 移動度の差を調べることも可能である。 Such methods include, for example, restriction fragment length polymorphism in the (Res tr ict ion Fragme nt Length Polymorphi sm / RFLP) c Specifically method and PCR-RFLP method, and the like utilizing, restriction enzymes If there is a mutation at the recognition site, or if there is a base insertion or deletion in the DNA fragment produced by the restriction enzyme treatment, the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment will vary compared to the control. By amplifying the portion containing this mutation by PCR and treating with each restriction enzyme, these mutations can be detected as the difference in mobility of bands after electrophoresis. Alternatively, the chromosomal DNA is treated with these restriction enzymes, electrophoresed, and then the probe DNA of the present invention. The presence or absence of mutation can be detected by performing Southern blotting using. The restriction enzyme used can be appropriately selected according to each mutation. In this method, in addition to genomic DNA, RNA prepared from the subject can be converted to cDNA using reverse transcriptase, cut with restriction enzyme, and then subjected to Southern blotting. It is also possible to amplify a DNA encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region by PCR using this cDNA as a saddle, cut it with a restriction enzyme, and then examine the difference in mobility. is there.
別の方法は、 まず、 被検者から DNA試料を調製する。 次いで、 本発明のポリべ プチドをコ一ドする遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAを増幅する。 さら に、 増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる。 次いで、 解離させた一本鎖 DNAを非 変性ゲル上で分離する。 分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を対照と比較す る。  Another method is to first prepare a DNA sample from the subject. Next, a gene encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region is amplified. In addition, dissociate the amplified DNA into single-stranded DNA. The dissociated single-stranded DNA is then separated on a non-denaturing gel. Compare the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with the control.
このような方法としては、 例えば PCR-SSCP (single-strand conformation poly morphism, 一本貝咼次 造多型） (Cloning and polymerase chain reaction-si ngle-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1； 12 (1) : 139-146.、 Detection of p5 3 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation pol ymorphism analysis of polymerase chain react ion products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8)： 1313-1318·、 Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling. 、 PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5)： 275- 282.)が挙げ られる。 この方法は操作が比較的簡便であり、 また被検試料の量も少なくて済む 等の利点を有するため、 特に多数の DNA試料をスクリーニングするのに好適であ る。 その原理は次の通りである。 二本鎖 DNA断片を一本鎖に解離すると、 各鎖は その塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。 この解離した DNA鎖を、 変 性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、 それぞれの高次構 造の差に応じて、 相補的な同じ鎖長の一本鎖 DNAが異なる位置に移動する。 一塩 基の置換によってもこの一本鎖 DNAの高次構造は変化し、 ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動において異なる移動度を示す。 従って、 この移動度の変化を検出する ことにより DNA断片に点突然変異や欠失、 あるいは挿入等による変異が存在する ことを検出することができる。 Such methods include, for example, PCR-SSCP (single-strand conformation poly morphism) (Cloning and polymerase chain reaction-signal-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p5 3 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation pol ymorphism analysis of polymerase chain react ion products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6 (8 ): 1313-1318 ·, Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling., PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282.). This method is particularly convenient for screening a large number of DNA samples because it is relatively easy to operate and has advantages such as a small amount of test sample. The principle is as follows. When a double-stranded DNA fragment is dissociated into single strands, each strand forms its own higher-order structure that depends on the base sequence. When this dissociated DNA strand is electrophoresed in a polyacrylamide gel that does not contain a denaturing agent, single-stranded DNA with the same complementary strand length moves to a different position depending on the difference in each higher-order structure. To do. Monosalt The higher-order structure of this single-stranded DNA is also changed by group substitution, and shows different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting this change in mobility, it is possible to detect the presence of mutations due to point mutations, deletions or insertions in DNA fragments.
具体的には、 まず、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現 制御領域を含む DNAを PCR法等によって増幅する。 増幅される範囲としては、 通常 200〜400bp程度の長さが好ましい。 PCRは、 当業者においては反応条件等を適宜 選択して行うことができる。 PCRの際に、 32P等のアイソトープ、 蛍光色素、 また はピオチン等によって標識したプライマ一を用いることにより、 増幅 DNA産物を 標識することができる。 あるいは PCR反応液に 等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識された基質塩基を加えて PCRを行うことにより、 増幅 DNA産物を標識することも可能である。 さらに、 PCR反応後にクレノウ酵素等 を用いて、 32P等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識さ れた基質塩基を、 増幅 DNA断片に付加することによつても標識を行うことができ る。 こうして得られた標識された DNA断片を、 熱を加えること等により変性させ、 尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。 この際、 ポリアクリルアミドゲルに適量 （5から 10%程度） のグリセロールを添 加することにより、 DNA断片の分離の条件を改善することができる。 また、 泳動 条件は各 DNA断片の性質により変動するが、 通常、 室温 （20から 25で） で行い、 好ましい分離が得られないときには 4から 3(TCまでの温度で最適の移動度を与え る温度の検討を行う。 電気泳動後、 DNA断片の移動度を、 X線フィルムを用いた オートラジオグラフィーや、 蛍光を検出するスキャナ一等で検出し、 解析を行う。 移動度に差があるバンドが検出された場合、 このバンドを直接ゲルから切り出し、 PCRによって再度増幅し、 それを直接シークェンシングすることにより、 変異の 存在を確認することができる。 また、 標識した DNAを使わない場合においても、 電気泳動後のゲルをェチジゥムブロマイドや銀染色法などによって染色すること によって、 バンドを検出することができる。 Specifically, first, DNA containing the gene encoding the polypeptide of the present invention or its expression control region is amplified by PCR or the like. As a range to be amplified, a length of about 200 to 400 bp is usually preferable. Those skilled in the art can perform PCR by appropriately selecting reaction conditions and the like. In PCR, the amplified DNA product can be labeled by using a primer labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin. Alternatively, the amplified DNA product can be labeled by adding a substrate base labeled with an isotope such as the above, a fluorescent dye, or piotin to the PCR reaction solution. Furthermore, labeling can also be performed by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin using a Klenow enzyme after the PCR reaction to the amplified DNA fragment. The The labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like and electrophoresed on a polyacrylamide gel containing no denaturing agent such as urea. At this time, the conditions for separating DNA fragments can be improved by adding an appropriate amount (about 5 to 10%) of glycerol to the polyacrylamide gel. Electrophoretic conditions vary depending on the nature of each DNA fragment, but are usually performed at room temperature (20 to 25). If favorable separation is not obtained, 4 to 3 (provides optimal mobility at temperatures up to TC). After the electrophoresis, the mobility of DNA fragments is detected by autoradiography using an X-ray film, or a scanner that detects fluorescence, etc. Bands with differences in mobility If this is detected, the band can be directly excised from the gel, amplified again by PCR, and sequenced directly to confirm the presence of the mutation. Dye the gel after electrophoresis with ethidium bromide or silver staining method. The band can be detected by.
さらに別の方法は、 まず、 被検者から DNA試料を調製する。 次いで、 本発明の ポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含む DNAを増幅する c さらに、 増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。 次 いで、 分離した DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。 Yet another method is to first prepare a DNA sample from a subject. Next, the gene encoding the polypeptide of the present invention or DNA containing its expression control region is amplified. C Further, the amplified DNA is separated on a gel in which the concentration of the DNA denaturant is gradually increased. Next, the mobility of the separated DNA on the gel is compared with the control.
このような方法としては、 例えば、 変性剤濃度勾配ゲル （denaturant grad ien t gel electrophoresis： DGGE法） 等を例示することができる。 DGGE法は、 変性 剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、 DNA断片の混合物を泳動し、 それぞれの不安定性の違いによって DNA断片を分離する方法である。 ミスマッチ のある不安定な DNA断片が、 ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、 ミ スマッチ周辺の DNA配列はその不安定さのために、 部分的に 1本鎖へと解離する。 この部分的に解離した DNA断片の移動度は、 非常に遅くなり、 解離部分のない完 全な二本鎖 DNAの移動度と差がつくことから、 両者を分離することができる。 具 体的には、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を 含む DNAを本発明のプライマー等を用いた PCR法等によって増幅し、 これを尿素な どの変性剤の濃度が移動するに従つて徐々に高くなつているポリアクリルアミド ゲル中で電気泳動し、 対照と比較する。 変異が存在する DNA断片の場合、 より低 い変性剤濃度位置で DNA断片が一本鎖になり、 極端に移動速度が遅くなるため、 この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。  Examples of such a method include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method). The DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel with a denaturing agent concentration gradient, and the DNA fragments are separated according to the difference in instability. When a mismatched unstable DNA fragment migrates to a certain denaturant concentration in the gel, the DNA sequence around the mismatch is partially dissociated into single strands due to the instability. The mobility of this partially dissociated DNA fragment is very slow and can be separated from the mobility of a complete double-stranded DNA without a dissociated part. Specifically, a gene encoding the polypeptide of the present invention or a DNA containing its expression control region is amplified by a PCR method using the primer of the present invention, and the concentration of denaturing agents such as urea is transferred. Electrophorese in a polyacrylamide gel that gradually increases as you proceed and compare to the control. In the case of a DNA fragment with mutation, the DNA fragment becomes single-stranded at a lower denaturant concentration position, and the movement speed becomes extremely slow, so the presence or absence of mutation is detected by detecting this difference in mobility. can do.
上記の方法以外にも、 特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的ォ リゴヌクレオチド （Al lele Speci f ic 01 igonucleot ide/ASO) ハイブリダィゼー シヨン法が利用できる。 変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌク レオチドを作製し、 これと試料 DNAでハイブリダィゼーシヨンを行わせると、 変 異が存在する場合、 ハイブリッド形成の効率が低下する。 それをサザンプロット 法や、 特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーシヨンするこ とにより消光する性質 ^利用した方法、 等により検出することができる。 また、 リボヌクレアーゼ Aミスマッチ切断法による検出も可能である。 具体的には、 本 発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含む DNAを PCR法等によって増幅し、 こ れをプラスミドベクター等に組み込んだ対照 cDNA等から調製した標識 RNAとハイ ブリダィゼーシヨンを行う。 変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本 鎖構造となるので、 この部分をリポヌクレアーゼ Aによって切断し、 これをォー 卜ラジオグラフィ一等で検出することによって変異の存在を検出することができ る。 In addition to the above method, the allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position. If an oligonucleotide containing a nucleotide sequence that is considered to have a mutation is prepared and hybridized with this sample DNA, the hybridization efficiency will be reduced if the mutation exists. This can be detected by the Southern plot method or the method of using a special fluorescent reagent that quenches by intercalating into the hybrid gap. Also, Detection by the ribonuclease A mismatch cleavage method is also possible. Specifically, a DNA containing a gene encoding the polypeptide of the present invention is amplified by a PCR method or the like, and a labeled RNA and a hybridization prepared from a control cDNA incorporated into a plasmid vector or the like are used. Do. Since the hybrid has a single-stranded structure in the part where the mutation exists, the presence of the mutation can be detected by cleaving this part with liponuclease A and detecting this part by radiography etc. The
本発明の検査方法の他の態様は、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の 発現量を検出することを含む方法である。 ここで 「遺伝子の発現」 には、 転写お よび翻訳が含まれる。 従って、 「発現産物」 には、 mRNAおよびタンパク質が含ま れる。  Another embodiment of the test method of the present invention is a method comprising detecting the expression level of a gene encoding the polypeptide of the present invention. Here, “gene expression” includes transcription and translation. Thus, “expression product” includes mRNA and protein.
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写レベルにおける検査法におい ては、 まず、 被検者から RNA試料を調製する。 次いで、 該 RNA試料に含まれる本発 明のポリペプチドをコードする RNAの量を測定する。 次いで、 測定された本発明 のポリペプチドをコード RNAの量を対照と比較する。  In the test method at the transcription level of the gene encoding the polypeptide of the present invention, first, an RNA sample is prepared from a subject. Next, the amount of RNA encoding the polypeptide of the present invention contained in the RNA sample is measured. The measured amount of RNA encoding the polypeptide of the present invention is then compared to a control.
このような方法としては、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドにハイブリダィズするプローブを用いたノーザンブロッティング法、 または本 発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイプリダイズするプライ マーを用いた RT-PCR法等を例示することができる。  Examples of such a method include Northern blotting using a probe that hybridizes to a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, or RT using a primer that hybridizes to a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention. -A PCR method etc. can be illustrated.
また、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写レベルにおける検査に おいては、 DNAアレイ （新遺伝子工学ハンドブック、 村松正實 · 山本雅、 羊土社、 P280-284) を利用することもできる。 具体的には、 まず、 被検者から調製した cD NA試料、 および本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイプリ ダイズするポリヌクレオチドプロ一ブが固定された基板を提供する。 基盤に固定 されるポリヌクレオチドプローブは、 複数種の本発明のポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドを検出するために、 複数種であってもよい。 被検者からの cD NA試料の調製は、 当業者に周知の方法で行うことができる。 cDNA試料の調製の好 ましい態様においては、 まず被検者の細胞から全 RNAの抽出を行う。 細胞として は、 例えば血液、 尿、 唾液、 組織の生検または剖検材料の細胞などが例示できる c 全 RNAの抽出は、 例えば次のようにして行うことができる。 純度の高い全 RNAが調 製できる方法であれば、 既存の方法およびキット等を用いることが可能である。 例えば Ambion社 ' RNA l ater'を用い前処理を行った後、 二ツボンジーン社' Isoge を用いて全 RNAの抽出を行う。 具体的方法にはそれらの添付プロトコールに従 えばよい。 次いで、 抽出した全 RNAを铸型として、 逆転写酵素を用いて cDNAの合 成を行い、 cDNA試料を調製する。 全 RNAからの cDNAの合成は、 当業者に周知の方 法で実施することができる。 調製した cDNA試料には、 必要に応じて、 検出のため の標識を施す。 標識物質としては、 検出可能なものであれば特に制限はなく、 例 えば、 蛍光物質、 放射性元素等を挙げることができる。 標識は、 当業者によって 一般的に rわれる方法（L Luo e t al. , Gene express ion prof i les of l aser-cap turedadj acent neuronal subtypes. Nat Med. 1999, 117-122)で実施することが できる。 In addition, a DNA array (new genetic engineering handbook, Masaaki Muramatsu, Masaru Yamamoto, Yodosha, P280-284) can be used for the examination at the transcription level of the gene encoding the polypeptide of the present invention. Specifically, first, a cDNA sample prepared from a subject and a substrate on which a polynucleotide probe that hybridizes with a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention is immobilized are provided. The polynucleotide probe immobilized on the substrate may be of a plurality of types in order to detect a plurality of types of polynucleotides encoding the polypeptide of the present invention. CD from the subject The preparation of the NA sample can be performed by a method well known to those skilled in the art. In a preferred embodiment of cDNA sample preparation, total RNA is first extracted from the subject's cells. As the cells, for example, blood, urine, saliva, tissue biopsy or autopsy material cells can be exemplified. Extraction of c total RNA can be performed, for example, as follows. Existing methods and kits can be used as long as they can prepare high-purity total RNA. For example, after pretreatment using Ambion's RNA RNA, total RNA is extracted using Nibonbon Gene's Isoge. Specific methods may follow those attached protocols. Next, using the extracted total RNA as a saddle, cDNA synthesis is performed using reverse transcriptase to prepare a cDNA sample. Synthesis of cDNA from total RNA can be performed by methods well known to those skilled in the art. Label the prepared cDNA sample for detection, if necessary. The labeling substance is not particularly limited as long as it can be detected, and examples thereof include fluorescent substances and radioactive elements. Labeling can be performed by methods commonly used by those of ordinary skill in the art (L Luo et al., Gene express ion prof iles of laser-captured acent neuronal subtypes. Nat Med. 1999, 117-122). .
本発明において 「基板」 とは、 ポリヌクレオチドを固定することが可能な板状 の材料を意味する。 本発明の基板は、 ポリヌクレオチドを固定することが可能で あれば特に制限はない ifi、 一般に DNAァレイ技術で使用される基板を好適に用い ることができる。  In the present invention, the “substrate” means a plate-like material on which a polynucleotide can be immobilized. The substrate of the present invention is not particularly limited as long as the polynucleotide can be immobilized. Ifi, a substrate generally used in DNA array technology can be preferably used.
DNAアレイ技術の利点は、 ハイブリダィゼ一シヨンの溶液量が非常に少なく、 固定されたヌクレオチドプローブに、 細胞の全 RNAに由来する cDNAを含む非常に 複雑な夕ーゲットをハイブリダィズすることができることである。 一般に DNAァ レイは、 高密度に基板にプリン卜された何千ものヌクレオチドで構成されている。 通常これらの DNAは非透過性（non- porous)の基板の表層にプリントされる。 基板 の表層は、 一般的にはガラスであるが、 透過性（porous)の膜、 例えばニトロセル ロースメンブレムを使用することができる。 ヌクレオチドの固定 （アレイ） には 2つのタイプがあり、 一つは Ai iymet r ix社開発によるポリヌクレオチドを基本と したアレイであり、 もう一つは主として Stanford大学で開発された cDNAのアレイ である。 ポリヌクレオチドのアレイにおいて、 ポリヌクレオチドは通常インサイ チュ（/'/? で合成される。 例えば、 photol i thographicの技術 (Ai iyme t r ix 社） 、 および化学物質を固定させるためのインクジェット（Roset ta Inpharmat ic s社)技術等によるポリヌクレオチドのィンサイチュ合成法が既に知られており、 いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。 基板に固定するポ リヌクレオチドプローブは、 本発明のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子と特異的 にハイプリダイズするものであれば特に制限はない。 本発明のポリヌクレオチド プローブには、 ポリヌクレオチド、 または cDNAが含まれる。 ここで 「特異的にハ イブリダィズする」 とは、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド と実質的にハイプリダイズし、 それ以外のポリヌクレオチドとは実質的にハイブ リダィズしないことを意味する。 特異的なハイブリダィズが可能であれば、 ポリ ヌクレオチドプローブは、 検出の対象となるポリヌクレオチドの塩基配列に対し、 完全に相補的である必要はない。 基板に結合するポリヌクレオチドプローブの長 さは、 通常 cDNAを固定する場合 100〜4000ベースであり、 好ましくは 200〜4000ベ —スであり、 さらに好ましくは 500〜4000ベースである。 合成ポリヌクレオチド を固定する場合は、 通常 15〜500ベースであり、 好ましくは 30〜200ベースであり、 さらに好ましくは 50〜200ベースである。 基板へのポリヌクレオチドの固定のェ 程は、 一般に 「プリント」 とも呼ばれる。 具体的には、 例えば以下ようにプリン 卜することができる力 これに限定されるものではない。 数種のポリヌクレオチ ドプローブを 4. 5 龍 x4. 5 腿の一つの領域内にプリントする。 その際、 それぞれ のアレイをプリン卜するのには一つのピンを用いて行うことが可能である。 従つ て 48ピンのツールを用いた場合、 48回の繰り返したアレイを一つの標準的な顕微 鏡用スライ ドにプリントすることが可能である。 The advantage of DNA array technology is that the amount of hybridization solution is very small, and very complex evenings containing cDNA derived from total cellular RNA can be hybridized to immobilized nucleotide probes. In general, a DNA array consists of thousands of nucleotides that are densely printed on a substrate. Usually these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate. The surface layer of the substrate is generally glass, but a porous membrane such as a nitrocellulose membrane can be used. For nucleotide immobilization (array) There are two types, one is a polynucleotide-based array developed by Ai iymetrix, and the other is a cDNA array developed mainly at Stanford University. In an array of polynucleotides, the polynucleotides are usually synthesized in situ (/ '/ ?. For example, photoli thiographic technology (Ai iyme tr ix), and inkjet (Roset ta Inpharmat for immobilizing chemicals) The in situ synthesis method of polynucleotides by the technology etc. is already known, and any technique can be used for the production of the substrate of the present invention. The polynucleotide probe of the present invention includes a polynucleotide or cDNA, as long as it specifically hybridizes with a gene that encodes a polypeptide. “To hybridize” means substantially hyper-hydidized with a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, Other polynucleotides mean that they do not substantially hybridize If a specific hybridization is possible, the polynucleotide probe will be completely complementary to the base sequence of the polynucleotide to be detected. The length of the polynucleotide probe that binds to the substrate is usually 100 to 4000 base, preferably 200 to 4000 base, more preferably 500 to 4000 base when cDNA is immobilized. When immobilizing a synthetic polynucleotide, it is usually 15 to 500 bases, preferably 30 to 200 bases, more preferably 50 to 200 bases. In general, it is also called “printing.” Specifically, for example, the power that can be printed as follows: Print several polynucleotide probes in one region of the 4.5 dragon x 4. 5 thigh, using a single pin to print each array. Therefore, when using a 48-pin tool, it is possible to print an array of 48 iterations on a standard microscope slide.
本方法においては、 次いで、 該 cDNA試料と該基板を接触させる。 本工程により、 本発明のポリペプチドをコードする DNAと特異的にハイブリダィズ可能な基板上 のヌクレオチドプローブに対し、 cDNA試料をハイブリダィズさせる。 ハイブリダ ィゼーションの反応液および反応条件は、 基板に固定するヌクレオチドプローブ の長さ等の諸要因により変動しうるが、 一般的に当業者に周知の方法により行う ことができる。 In this method, the cDNA sample is then brought into contact with the substrate. Through this process, A cDNA sample is hybridized to a nucleotide probe on a substrate that can specifically hybridize with DNA encoding the polypeptide of the present invention. Although the hybridization reaction solution and reaction conditions may vary depending on various factors such as the length of the nucleotide probe immobilized on the substrate, it can generally be performed by methods well known to those skilled in the art.
本方法においては、 次いで、 該 cDNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプロ ーブとのハイプリダイズの強度を検出することにより、 該 cDNA試料に含まれる本 発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する。 さらに、 測定され た本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を対照と比較する。  In the present method, the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention contained in the cDNA sample is then detected by detecting the intensity of the hybridization between the cDNA sample and the nucleotide probe immobilized on the substrate. Measure. Further, the measured expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention is compared with the control.
本発明においては、 cDNA試料中に本発明のポリペプチドをコードする遺伝子由 来の cDNAが存在する場合、 基板に固定されたヌクレオチドプローブと該 cDNAとが ハイブリダィズする。 従って、 ポリヌクレオチドプローブと該 cDNAとのハイプリ ダイズの強度を検出することにより、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子 の発現量を測定することができる。 ポリヌクレオチドプローブと該 cDNAとのハイ ブリダィズの強度の検出は、 cDNA試料を標識した物質の種類に応じて当業者にお いては適宜行うことができる。 例えば、 cDNAが蛍光物質によって標識された場合、 スキャナ一によって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。 本発明の方法においては、 被検者および対照 （健常者） 由来の cDNA試料につい て、 異なる蛍光物質で標識を施すことにより、 1回の測定でそれぞれにおける本 発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を同時に測定することができる。 例えば、 上記それぞれの cDNA試料の一方を蛍光物質である Cy5で、 他方を Cy3で標 識することができる。 それぞれの蛍光シグナルの相対強度は、 被検者および対照 での本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量に応じた相対量を示す (D uggan et al. , Nat. Genet. 21 : 10-14, 1999)。  In the present invention, when the cDNA derived from the gene encoding the polypeptide of the present invention is present in the cDNA sample, the nucleotide probe immobilized on the substrate hybridizes with the cDNA. Therefore, the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention can be measured by detecting the strength of hybridization between the polynucleotide probe and the cDNA. Detection of the intensity of hybridization between the polynucleotide probe and the cDNA can be appropriately performed by those skilled in the art depending on the type of substance labeled with the cDNA sample. For example, when cDNA is labeled with a fluorescent substance, it can be detected by reading a fluorescent signal with a scanner. In the method of the present invention, a cDNA sample derived from a subject and a control (healthy person) is labeled with a different fluorescent substance, so that the gene encoding the polypeptide of the present invention in each measurement can be obtained in a single measurement. The expression level can be measured simultaneously. For example, one of the above cDNA samples can be labeled with Cy5 as a fluorescent substance and the other with Cy3. The relative intensity of each fluorescent signal indicates the relative amount according to the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention in the subject and the control (Duggan et al., Nat. Genet. 21: 10- 14, 1999).
一方、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳レベルにおける検査に おいては、 まず、 被検者からポリペプチド試料を調製する。 次いで、 該ポリぺプ チド試料に含まれる本発明のポリペプチドの量を測定する。 次いで、 測定された 本発明のポリべプチドの量を対照と比較する。 On the other hand, in the examination at the translation level of the gene encoding the polypeptide of the present invention, first, a polypeptide sample is prepared from the subject. The polypep The amount of the polypeptide of the present invention contained in the tide sample is measured. The measured amount of the inventive polypeptide is then compared to a control.
このような方法としては、 SDSポリアクリルアミド電気泳動法、 並びに本発明 のポリペプチドに結合する抗体を用いた、 ウエスタンブロッテイング法、 ドット ブロッテイング法、 免疫沈降法、 酵素結合免疫測定法 (ELI SA)、 および免疫蛍光 法を例示することができる。  Such methods include SDS polyacrylamide electrophoresis and Western blotting, dot blotting, immunoprecipitation, enzyme-linked immunoassay (ELI SA) using antibodies that bind to the polypeptide of the present invention. ), And immunofluorescence.
上記の方法において、 対照と比較して、 本発明のポリペプチドをコードする遺 伝子の発現量が有意に変化していた場合、 被検者は、 該遺伝子の発現異常に関連 した疾患を罹患している、 または該疾患を発症する危険を有すると判定される。 ぐ検査薬 >  In the above method, when the expression level of the gene encoding the polypeptide of the present invention is significantly changed compared to the control, the subject suffers from a disease associated with abnormal expression of the gene. Or is at risk of developing the disease. >
本発明はまた、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または 本発明のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査薬を提供する。  The present invention also provides a test for a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the polypeptide of the present invention or abnormal activity of the polypeptide of the present invention.
その一つの態様は、 上記した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドまたはその発現制御領域を含む DNAにハイブリダイズし、 少なくとも 15ヌク レオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬である。 該オリゴヌク レオチドは、 上記本発明の検査方法において、 本発明のポリペプチドをコードす る遺伝子またはその発現制御領域を検出するためのプローブとして、 本発明のポ リペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を増幅するためのプライ マーとして用いることができる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、 例えば市販の オリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。 プローブは、 制限酵素 処理等によつて取得されるの二本鎖 DNA断片として作製することもできる。 本発 明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、 適宜標識して用いるこ とが好ましい。 標識する方法としては、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、 ォリゴヌクレオチドの 5'端を でリン酸化することにより標識する方法、 およ びクレノウ酵素等の DNAポリメラーゼを用い、 ランダムへキサマーオリゴヌクレ ォチド等をプライマーとして32 P等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン 等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法 （ランダムプライム法等） を 例示することができる。 One embodiment thereof is a test agent comprising an oligonucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, which hybridizes to a polynucleotide encoding the above-described polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof. The oligonucleotide is a gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof as a probe for detecting the gene encoding the polypeptide of the present invention or an expression control region thereof in the test method of the present invention. It can be used as a primer for amplifying. The oligonucleotide of the present invention can be prepared by, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer. The probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like. When the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled. As a labeling method, T4 polynucleotide kinase is used to phosphorylate the 5 ′ end of oligonucleotide with phosphorylation, and a DNA polymerase such as Klenow enzyme is used to randomly hexamer oligonucleotide. Isotope such as 32 P, fluorescent dye, or piotin Examples thereof include a method of incorporating a substrate base labeled by a method such as a random prime method.
本発明の検査薬の他の一つの態様は、 後述する本発明のポリぺプチドに結合す る抗体を含む検査薬である。 該抗体は、 上記の本発明の検査方法において、 本発 明のポリペプチドを検出するために用いられる。 抗体は、 本発明のポリペプチド を検出可能であればその形態に制限はない。 検査のための抗体には、 ポリクロー ナル抗体およびモノクロ一ナル抗体が含まれる。 抗体は必要に応じて標識されて いてもよい。  Another embodiment of the test drug of the present invention is a test drug containing an antibody that binds to the polypeptide of the present invention described later. The antibody is used for detecting the polypeptide of the present invention in the test method of the present invention. The form of the antibody is not limited as long as it can detect the polypeptide of the present invention. Antibodies for testing include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. The antibody may be labeled as necessary.
上記の検査薬においては、 有効成分であるオリゴヌクレオチドゃ抗体以外に、 例えば、 滅菌水、 生理食塩水、 植物油、 界面活性剤、 脂質、 溶解補助剤、 緩衝剤、 タンパク質安定剤 （BSAやゼラチンなど） 、 保存剤等が必要に応じて混合されて いてもよい。  In the above-mentioned test agents, in addition to oligonucleotides and antibodies, which are active ingredients, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oils, surfactants, lipids, solubilizers, buffers, protein stabilizers (such as BSA and gelatin) ) Preservatives and the like may be mixed as necessary.
<抗体 > <Antibody>
本発明は、 本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。 ここで 「抗体」 には、 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、 キメラ抗体、 一本鎖抗体、 ヒ 卜化抗体、 さらに Fabまたは他の免疫グロプリン発現ライブラリ一の産物を含む F abフラグメントが含まれる。  The present invention provides antibodies that bind to the polypeptides of the present invention. “Antibodies” as used herein include polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, human antibodies, and Fab fragments that include the products of Fab or other immunoglobulin expression libraries.
本発明のポリぺプチドまたはその断片もしくは類似体、 またはそれらを発現す る細胞は、 本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原として も使用することができる。 抗体は、 好ましくは、 本発明のポリペプチドに免疫特 異的である。 「免疫特異的」 とは、 その抗体が他のポリペプチドに対するその親 和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意 味する。  The polypeptides of the invention or fragments or analogs thereof, or cells expressing them can also be used as immunogens to produce antibodies that bind to the polypeptides of the invention. The antibody is preferably immunospecific for the polypeptide of the invention. “Immunospecific” means that the antibody has a substantially higher affinity for a polypeptide of the invention than its affinity for other polypeptides.
本発明のポリぺプチドに結合する抗体は、 当業者に公知の方法により調製する ことが可能である。 ポリクロ一ナル抗体であれば、 例えば、 次のようにして得る ことができる。 本発明のポリペプチドあるいはその GSTとの融合タンパク質をゥ サギ等の小動物に免疫し血清を得る。 これを、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のポリべプチ ドをカツプリングしたァフィ二ティーカラム等により精製することにより調製す る。 また、 モノクローナル抗体であれば、 例えば、 本発明のポリペプチドをマウ スなどの小動物に免疫を行い、 同マウスより脾臓を摘出し、 これをすりつぶして 細胞を分離し、 マウスミエローマ細胞とポリエチレンダリコールなどの試薬によ り融合させ、 これによりできた融合細胞 （ハイプリ ドーマ） の中から、 本発明の ポリペプチドに結合する抗体を産生するクローンを選択する。 次いで、 得られた ハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水を回収し、 得られた モノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のポリべプチドをカツプリングした ァフィ二ティ一力ラム等により精製することで、 調製することが可能である。 本発明の抗体は、 本発明のポリペプチドやこれを発現する細胞の単離、 同定、 および精製に利用することができる。 本発明のポリペプチドに結合する抗体は、 本発明のポリペプチドの発現異常に関連した疾患の検査において、 本発明のポリ ペプチドの発現量を測定するために用いることもできる。 An antibody that binds to the polypeptide of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, a polyclonal antibody can be obtained as follows. The polypeptide of the present invention or its fusion protein with GST Serum is obtained by immunizing small animals such as herons. This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column in which the polypeptide of the present invention is coupled, or the like. In the case of a monoclonal antibody, for example, the polypeptide of the present invention is immunized to a small animal such as a mouse, the spleen is excised from the mouse, and this is ground to separate cells, and mouse myeloma cells and polyethylene dallicol. A clone that produces an antibody that binds to the polypeptide of the present invention is selected from the fused cells (hypridoma) produced by the fusion with a reagent such as the above. Subsequently, the obtained hybridoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, the present invention. It can be prepared by purifying it with an affinity ram or the like obtained by coupling a polypeptide. The antibody of the present invention can be used for isolation, identification, and purification of the polypeptide of the present invention and cells expressing the polypeptide. The antibody that binds to the polypeptide of the present invention can also be used for measuring the expression level of the polypeptide of the present invention in the examination of diseases associated with abnormal expression of the polypeptide of the present invention.
<リガンド、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストの同定〉 <Identification of Ligand, Agonist, Engonist>
本発明のポリペプチドは、 そのリガンド、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストの 同定において使用することができる。 同定の対象となるこれら分子は、 天然由来 であっても、 人工的に合成された構造的または機能的な模擬物であってもよい。 本発明のポリペプチドは多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与している。 従って、 本発明のポリペプチドを活性化する化合物および本発明のポリペプチド の活性化を阻害し得る化合物を発見することが望まれる。  The polypeptides of the invention can be used in the identification of their ligands, agonists or antagonists. These molecules to be identified may be of natural origin or may be artificially synthesized structural or functional mimetics. The polypeptides of the present invention are responsible for many biological functions, including many pathologies. Accordingly, it is desirable to discover compounds that activate the polypeptides of the present invention and compounds that can inhibit the activation of the polypeptides of the present invention.
本発明のポリペプチドに対するリガンドの同定においては、 まず、 本発明のポ リペプチドと候補化合物とを接触させ、 次いで、 候補化合物が本発明のポリぺプ チドに結合するか否かを検出する。 被検試料としては、 特に制限はなく、 例えば、 種々の GPCRのリガンド活性につ いては不明の公知化合物やペプチド （例えば、 ケミカルファイルに登録されてい るもの） あるいはファージ ·ディスプレイ法 （J. Mol. Biol. (1991) 222, 301-31 0) などを応用して作成されたランダム ·ペプチド群を用いることができる。 ま た、 微生物の培養上清や、 植物、 海洋生物由来の天然成分などもスクリーニング の対象となる。 その他、 脳をはじめとする生体組織抽出物、 細胞抽出液、 遺伝子 ライブラリーの発現産物などが挙げられるが、 これらに制限されない。 In identifying a ligand for the polypeptide of the present invention, first, the polypeptide of the present invention is brought into contact with the candidate compound, and then whether or not the candidate compound binds to the polypeptide of the present invention is detected. The test sample is not particularly limited. For example, various known compounds and peptides with unknown GPCR ligand activity (for example, those registered in a chemical file) or phage display method (J. Mol. Biol. (1991) 222, 301-31 0) etc. can be used for random peptide groups. In addition, culture supernatants of microorganisms and natural components derived from plants and marine organisms are also subject to screening. Other examples include, but are not limited to, biological tissue extracts such as brain, cell extracts, and gene library expression products.
本方法においては、 精製された本発明のポリペプチドを用いて候補化合物との 結合を検出することができる。 結合の検出には、 例えば、 本発明のポリペプチド のァフィ二ティーカラムに被検試料を接触させ本発明のポリべプチドに結合する 化合物を精製する方法やウェストウエスタンプロッティング法など多くの公知の 方法を利用することができる。 これら方法を利用する場合には、 候補化合物は適 宜標識し、 この標識を利用して本発明のポリペプチドとの結合を検出することが できる。 また、 本発明のポリペプチドを発現する細胞膜を調製して、 これをチッ プ上に固定し、 リガンド結合時に三量体型 GTP結合蛋白質が解離する事を、 表面 プラズモン共鳴 （surface pl asmon resonance) の変化で検出する方法 （Nature Biotechnology (99) 17 : 1105) を用いることも可能である。 さらに、 候補化合物 と本発明のポリペプチドとの結合活性は、 本発明のポリペプチドの活性化の指標 となるシグナルを指標に検出することもできる。 このようなシグナルとしては、 例えば、 細胞内の Ca "レベルの変化、 細胞内の cAMPレベルの変化、 細胞内の pHの 変化、 細胞内のアデ二ル酸シクラ一ゼレベルの変化が挙げられるが、 これらに制 限されない。  In this method, binding to a candidate compound can be detected using the purified polypeptide of the present invention. For the detection of binding, for example, a method in which a test sample is brought into contact with the affinity column of the polypeptide of the present invention to purify a compound that binds to the polypeptide of the present invention, and many well-known methods such as West Western plotting are used. The method can be used. When using these methods, the candidate compound is appropriately labeled, and binding to the polypeptide of the present invention can be detected using this label. In addition, a cell membrane that expresses the polypeptide of the present invention is prepared, immobilized on a chip, and the dissociation of the trimeric GTP-binding protein upon ligand binding is indicated by surface plasmon resonance. It is also possible to use a method of detecting by change (Nature Biotechnology (99) 17: 1105). Furthermore, the binding activity between the candidate compound and the polypeptide of the present invention can be detected using a signal serving as an index of activation of the polypeptide of the present invention as an index. Such signals include, for example, changes in intracellular Ca "levels, changes in intracellular cAMP levels, changes in intracellular pH, changes in intracellular adenylate cyclase levels, It is not limited to these.
この方法の 1つの実施例として、 本発明のポリペプチドを発現させた細胞膜を 2 OmM HEPES (pH7. 4) , lOOm NaCl, lOmM MgCl2, 50 i M GDP溶液中で、 35 Sで標識さ れた GTP r S 400pMと混合させ、 被検試料存在下と非存在下でインキュベーション 後、 濾過 （f i l trat ion) を行い、 結合した GTP r Sの放射活性を比較する手法を用 いることができる。 As one example of this method, a cell membrane expressing the polypeptide of the present invention is labeled with 35 S in 2 OmM HEPES (pH 7.4), lOOm NaCl, lOmM MgCl 2 , 50 i M GDP solution. After mixing with GTP r S 400pM, incubating in the presence and absence of the test sample, filtration (fil trat ion) is performed, and the radioactivity of the bound GTP r S is compared. Can be.
また GPCRは、 三量体型 GTP結合蛋白質の活性化を介して細胞内にシグナルを伝 達するシステムを共有している。 三量体型 GTP結合蛋白質は、 活性化する細胞内 伝達系の種類によって、 Ca2+を上昇させる GQ型、 cAMPを上昇させる Gs型、 そして cAMPを抑制する Gi型の 3種類に分類される。 このことを応用して GQ蛋白質ひサブ ュニッ卜と他の G蛋白質 αサブュニッ卜とをキメラ化し、 あるいは promiscuousな Ga蛋白質、 Gal5、 G α 16を用いてリガンドスクリーニングの際の陽性シグナル を GQの細胞内伝達経路である、 Ca2+上昇に帰結させることが可能である。 上昇し た Ca"レベルは、 TRE (TPA responsive element) または MRE (multiple respons ive element) を上流に有するレポーター遺伝子系、 Fura- 2、 Fluo- 3などの染色 指示薬そして蛍光蛋白 aequorinなどの変化を指標として検出ができる。 同様に、 Gs蛋白質 αサブュニッ卜と他の G蛋白質 αサブュニットとをキメラ化し、 陽性シ グナルを Gsの細胞内伝達経路である、 cAMP上昇に帰結させ、 CRE(cAMP- responsiv e element)を上流に有するレポ一夕一遺伝子系での変化を指標とすることも可能 である (Trends Pharmacol. Sci. (99) 20:118)。 GPCRs also share a system that transmits signals into cells through the activation of trimeric GTP-binding proteins. Trimeric GTP-binding proteins are classified into three types, GQ type that increases Ca 2+ , Gs type that increases cAMP, and Gi type that suppresses cAMP, depending on the type of intracellular transmission system that is activated. Applying this, chimerize GQ protein and other G protein α subunits, or use the promiscuous Ga protein, Gal5, G α16 to give positive signals for ligand screening in GQ cells It can be attributed to Ca 2+ elevation, an internal transmission pathway. Elevated Ca "levels indicate changes in reporter gene systems with upstream TRE (TPA responsive element) or MRE (multiple responsive element), staining indicators such as Fura-2 and Fluo-3, and fluorescent protein aequorin Similarly, Gs protein α-subunit and chimera of other G protein α-subunit are chimerized, and the positive signal is attributed to the increase of cAMP, the intracellular transmission pathway of Gs, and CRE (cAMP-responsiv e It is also possible to use changes in the repo overnight gene system having (element) upstream as an index (Trends Pharmacol. Sci. (99) 20: 118).
このスクリーニング系において本発明のポリべプチドを発現させる宿主細胞と しては特に制限はなく、 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられるが、 例えば、 COS細胞、 CH0細胞、 HEK293細胞などの哺乳動物細胞、 酵母、 ショウジヨウバエ由 来の細胞、 または大腸菌細胞を例示することができる。 本発明のポリペプチドを 脊椎動物細胞で発現させるためのベクターとしては、 本発明のポリペプチドをコ ードする遺伝子の上流に位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、 ポリア デニル化部位および転写終結配列や複製起点等を有するものを好適に用いること ができる。 例えば、 SV40の初期プロモーターを有する pSV2dhfr (Mol. Cell. Biol. (1981) 1, 854-864) や、 EF-BOS (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) 、 pCDM8 (Nature (1987) 329, 840-842) 、 pCEP4 (Invi trogen社) などは、 GPCRを発現させ るのに有用なベクターである。 ベクタ一への本発明のポリべプチドをコードする DNAの挿入は常法により制限酵素サイトを用いたリガ一ゼ反応により行うこと力 できる (Current protocol s in Molecular B iology ed i t. Ausube l et al. (198 7) Publ i sh. John Wi l ey & Sons. Sect ion 11. 4〜11. 11) 。 また、 宿主細胞への ベクター導入は、 例えば、 リン酸カルシウム沈殿法、 電気パルス穿孔法 （Curren t protocol s in Molecu l ar Biology ed i t. Ausube l e t al. (1987) Publ i sh. Jo hn Wi l ey & Sons. Sec t ion 9. 1-9. 9) 、 リポフエクタミン法 （GIBC0-BRL社製） 、 FuGENE6試薬 （ベーリンガーマンハイム社） 、 マイクロインジェクション法など の公知の方法で行うことが可能である。 In this screening system, there are no particular limitations on the host cell that expresses the polypeptide of the present invention, and various host cells may be used depending on the purpose. For example, mammals such as COS cells, CH0 cells, HEK293 cells, etc. Examples include animal cells, yeast, Drosophila cells, or E. coli cells. Examples of the vector for expressing the polypeptide of the present invention in vertebrate cells include a promoter located upstream of the gene encoding the polypeptide of the present invention, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence. Those having a replication origin and the like can be suitably used. For example, pSV2dhfr (Mol. Cell. Biol. (1981) 1, 854-864) having the early promoter of SV40, EF-BOS (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), pCDM8 (Nature (1987) 329 840-842) and pCEP4 (Invitrogen) are useful vectors for expressing GPCRs. Encodes the polypeptide of the present invention into vector DNA insertion can be performed by a ligase reaction using a restriction enzyme site by a conventional method (Current protocol s in Molecular Biology ed i.Ausube l et al. (198 7) Publ i sh. John Wi l ey & Sons. Sect ion 11.4-11.11). In addition, vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Curren t protocol in Molecule Biology ed. Ausube let al. (1987) Publ i sh. Jo hn Wiley & Sons. Section 9. 1-9. 9), Lipofuectamine method (GIBC0-BRL), FuGENE6 reagent (Boehringer Mannheim), microinjection method and the like.
本発明のポリペプチドに対するァゴニス卜の同定においては、 本発明のポリべ プチドを発現している細胞と候補化合物とを接触させ、 候補化合物が本発明のポ リペプチドの活性化の指標となるシグナルを発生させるか否かを検出する。 即ち、 上記した、 本発明のポリペプチドを発現する細胞を用いたリガンドの同定法にお いて、 候補化合物の作用により、 本発明のポリペプチドの活性化の指標となるシ グナルを発生させる化合物を同定する。 このような化合物は、 本発明のポリぺプ チドに対するァゴニス卜の候補となる。  In the identification of the agonis for the polypeptide of the present invention, a cell expressing the polypeptide of the present invention is brought into contact with the candidate compound, and the candidate compound outputs a signal that serves as an indicator of activation of the polypeptide of the present invention. Detect whether to generate. That is, in the above-described method for identifying a ligand using a cell that expresses the polypeptide of the present invention, a compound that generates a signal that serves as an indicator of activation of the polypeptide of the present invention by the action of a candidate compound. Identify. Such a compound is a candidate for agonis for the polypeptide of the present invention.
本発明のポリべプチドに対するアン夕ゴニス卜の同定においては、 候補化合物 の存在下で本発明のポリぺプチドを発現している細胞と本発明のポリぺプチドに 対するァゴニストとを接触させ、 候補化合物の非存在下で検出した場合 （対照） と比較して、 本発明のポリペプチドの活性化の指標となるシグナルが減少するか 否かを検出する。 即ち、 上記した、 本発明のポリペプチドを発現する細胞を用い たリガンドの同定法において、 該細胞に対し、 候補化合物に加えてァゴニス卜を 作用させ、 ァゴニスト刺激に応答した本発明のポリペプチドの活性化の指標とな るシグナルの発生を抑制する化合物を同定する。 このような化合物は、 本発明の ポリペプチドに対するアン夕ゴニストの候補となる。 本発明のポリペプチドの潜 在的なアンタゴニストの例としては、 抗体、 ある場合には、 リガンドと密接な関 係があるポリペプチド （例えば、 リガンドの断片） 、 または本発明のポリべプチ ドと結合するが応答を誘導しない （それゆえ該受容体の活性を妨げる） 小分子な どが挙げられる。 In the identification of Angogonis spp. To the polypeptide of the present invention, a cell expressing the polypeptide of the present invention is contacted with an agonist to the polypeptide of the present invention in the presence of the candidate compound. It is detected whether or not the signal indicating the activation of the polypeptide of the present invention is decreased as compared with the case where it is detected in the absence of the compound (control). That is, in the above-described method for identifying a ligand using a cell that expresses the polypeptide of the present invention, the cell of the polypeptide of the present invention in response to agonist stimulation is prepared by allowing agonis to act on the cell in addition to the candidate compound. Identify compounds that suppress the generation of signals that are indicators of activation. Such a compound is a candidate for an antagonist to the polypeptide of the present invention. Examples of potential antagonists of the polypeptides of the present invention include antibodies, in some cases, polypeptides closely related to the ligand (eg, fragments of the ligand), or polypeptides of the present invention. Small molecules that bind to the peptide but do not induce a response (thus preventing the activity of the receptor).
本発明は、 また、 上記同定方法に用いるためのキットを提供する。 このキット は、 本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを発現する細胞若しくは その細胞膜を含む。 該キットには、 GPCRのリガンド、 ァゴニスト、 あるいはアン 夕ゴニストの候補となる化合物が含まれていてもよい。  The present invention also provides a kit for use in the identification method. This kit includes a polypeptide of the present invention or a cell expressing the polypeptide of the present invention or a cell membrane thereof. The kit may contain a GPCR ligand, agonist, or compound that is a candidate for an antagonist.
ぐ疾患の治療のための医薬組成物 > Pharmaceutical composition for the treatment of
本発明は、 本発明のポリペプチドの活性または発現を増加または抑制させる必 要がある患者を治療するための医薬組成物を提供する。  The present invention provides a pharmaceutical composition for treating a patient in need of increasing or suppressing the activity or expression of the polypeptide of the present invention.
本発明のポリペプチドの活性または発現を増加させるための、 医薬組成物の有 効成分としては、 本発明のポリペプチドに対するァゴニスト、 本発明のポリヌク レオチド、 本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクターを用いることができ る。 一方、 本発明のポリペプチドの活性または発現を抑制させるための、 医薬組 成物の有効成分としては、 本発明のポリペプチドに対するアン夕ゴニスト、 生体 内において、 内因性の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制す るポリヌクレオチドを用いることができる。 アンタゴニストには、 内因性の本発 明のポリペプチドとの競合状態でリガンドと結合する能力がある可溶性形態の本 発明のポリペプチドが含まれる。 このような競合物質の典型的な例は、 本発明の ポリペプチドの断片である。 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を 抑制するポリヌクレオチドとしては、 上記したアンチセンス DNAやリボザィムが 含まれる。  As an effective component of the pharmaceutical composition for increasing the activity or expression of the polypeptide of the present invention, an agonist for the polypeptide of the present invention, the polynucleotide of the present invention, and a vector into which the polynucleotide of the present invention is inserted. Can be used. On the other hand, as an active ingredient of a pharmaceutical composition for suppressing the activity or expression of the polypeptide of the present invention, an antagonist of the polypeptide of the present invention, an endogenous polypeptide of the present invention in vivo Polynucleotides that suppress the expression of the encoded gene can be used. Antagonists include soluble forms of the polypeptide of the invention that are capable of binding a ligand in competition with an endogenous polypeptide of the invention. A typical example of such a competitor is a fragment of the polypeptide of the present invention. The polynucleotide that suppresses the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention includes the above-described antisense DNA and ribozyme.
治療用化合物を医薬品として用いる場合には、 該化合物自体を直接患者に投与 する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行う ことも可能である。 例えば、 薬理学上許容しうる担体 （賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 矯味剤、 矯臭剤、 乳化剤、 希釈剤、 溶解補助剤等） と混合して得られる医薬組成 物または錠剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 トローチ剤、 シロップ剤、 液 剤、 乳剤、 懸濁剤、 注射剤 （液剤、 懸濁剤等） 、 坐剤、 吸入剤、 経皮吸収剤、 点 眼剤、 眼軟膏等の製剤として経口または非経口に適した形態で処方される。 When a therapeutic compound is used as a pharmaceutical, it can be administered as a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method, in addition to directly administering the compound itself to a patient. For example, pharmaceutical compositions or tablets obtained by mixing with pharmacologically acceptable carriers (excipients, binders, disintegrants, flavoring agents, flavoring agents, emulsifiers, diluents, solubilizers, etc.), pills , Powder, granule, capsule, troche, syrup, liquid Prescription in a form suitable for oral or parenteral use as a preparation for preparations, emulsions, suspensions, injections (solutions, suspensions, etc.), suppositories, inhalants, transdermal absorption agents, eye drops, eye ointments, etc. Is done.
患者への投与は、 一般的には、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射な ど当業者に公知の方法により行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法 などにより変動するが、 当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能 である。 また、 該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝 子治療用べクタ一に組込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。  Administration to a patient can be generally performed by methods known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection. The dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose. In addition, if the compound can be encoded by DNA, it can be considered to incorporate the DNA into a gene therapy vector and perform gene therapy.
遺伝子治療用べクタ一としては、 例えば、 レトロウイルスベクター、 アデノウ ィルスべクタ一、 アデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクタ一ゃリポソ ームなどの非ウィルスベクタ一などを例示することができる。 該ベクターを利用 して、 ex w'ra法や/// r/ra法などにより患者へ目的の DNAの投与を行うことがで さる。  Examples of vector therapy vectors include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and non-viral vectors such as liposomes. Using this vector, the target DNA can be administered to the patient by ex w'ra method or /// r / ra method.
<トランスジエニック動物、 ノックアウト動物〉  <Transgenic animals, knockout animals>
本発明は、 上記本発明のポリヌクレオチドが導入された哺乳動物または内因性 の該ポリヌクレオチドの発現が人為的に抑制された哺乳動物を提供する。 これら 哺乳動物の作製は、 当業者に公知の手法で行うことができる。 これら哺乳動物は、 好ましくはげつ歯類であり、 最も好ましくはマウスである。 これら哺乳動物は、 例えば、 本発明のポリヌクレオチドが関連する疾患のモデル動物としての利用が 可能である。 図面の簡単な説明  The present invention provides a mammal into which the polynucleotide of the present invention has been introduced or a mammal in which the expression of the endogenous polynucleotide is artificially suppressed. Production of these mammals can be performed by techniques known to those skilled in the art. These mammals are preferably rodents, most preferably mice. These mammals can be used as, for example, model animals for diseases associated with the polynucleotide of the present invention. Brief Description of Drawings
図 1は、 既知の GPCR配列を、 GPCR配列 1, 054個および非 GPCR配列 64, 154個を含 む評価用データベースに対して検索した際、 E値に対してプロッ卜した GPCR配列 同士対の数および GPCR配列と非 GPCR配列の対の数を示す図である。  Figure 1 shows the relationship between a pair of GPCR sequences that were plotted against E values when a known GPCR sequence was searched against an evaluation database containing 1,054 GPCR sequences and 64,154 non-GPCR sequences. FIG. 5 is a diagram showing the number and the number of pairs of GPCR sequences and non-GPCR sequences.
図 2は、 クローン 13860の各臓器における発現を解析した結果を示す電気泳動 写真である。 グラフは、 左から、 心臓、 脳、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎、 瞵臓、 脾臓、 胸腺、 前立腺、 精巣、 卵巣、 小腸、 大腸、 白血球、 肺癌、 大腸癌、 肺癌、 前立腺癌、 大腸癌、 卵巣癌、 膝癌である。 Figure 2 is an electrophoretogram showing the results of analyzing the expression of clone 13860 in each organ. The graph is from left, heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, kidney, Spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, white blood cell, lung cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, colon cancer, ovarian cancer, knee cancer.
図 3は、 図 2の結果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 3 is a graph showing the results of FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 実施例により、 本発明のポリペプチドの同定に関して詳細に説明する。  The following examples further illustrate details for identifying the polypeptides of the present invention.
[実施例 1〗 ヒ卜ゲノムデータからのアミノ酸配列の抽出  [Example 1) Extraction of amino acid sequence from baboon genome data
本発明者らは、 GPCR遺伝子発見のための第一段階、 即ち、 配列抽出段階におい て、 ヒ卜ゲノム配列から開始コドンおよび停止コドンのあいだに存在する 6フレ ーム翻訳配列の全ての候補体を選択した （6F展開配列） 。 同一の配列上で開始コ ドン （ATG) が多数見つかる場合には最も長い配列を選択した。 一方、 複数のェ キソンを有する配列を検出するために、 遺伝子発見プログラム （GeneDecoder) (Asai, K. , e t al. Pac i f ic Sympos ium on Biocomput ing 98, pp. 228-239 (PSB9 8, 1998) . )を用いて、 蛋白質コード領域を発見した（GD配列）。 GPCR蛋白質は、 長 さが約 20残基程度の 7個の膜貫通へリックスを有するため、 双方の配列ともに 15 0残基以上 （〉20*7) 必要であるとの条件をつけた。  In the first step for GPCR gene discovery, that is, in the sequence extraction step, the present inventors have found all candidates of 6-frame translation sequences existing between the start codon and the stop codon from the rabbit genome sequence. Was selected (6F expansion sequence). The longest sequence was selected when multiple starting codons (ATG) were found on the same sequence. On the other hand, a gene discovery program (GeneDecoder) (Asai, K., et al. Pacific Symposium on Biocomputing 98, pp. 228-239 (PSB9 8, 1998) ).) Was used to discover the protein coding region (GD sequence). Since GPCR protein has seven transmembrane helices of about 20 residues in length, we set the condition that both sequences require more than 150 residues (> 20 * 7).
6-フレーム翻訳により 375, 412配列および、 GeneDecoderにより 95, 900配列を予 測した。 前者の配列はイントロンを含まない場合に対応し、 後者は主に複数のェ キソンで構成される。  375,412 sequences were predicted by 6-frame translation and 95,900 sequences were predicted by GeneDecoder. The former sequence corresponds to the case where no intron is included, and the latter is mainly composed of multiple exons.
なお、 GeneDecoderは隠れマルコフモデル （HMM) を用いた遺伝子発見プロダラ ムであり、 配列類似性とェキソン長の分布に関する情報も利用する。 このプログ ラムを、 複数のェキソンから成る配列 462個およびェキソン 2, 843個を含む Gense t 98 (ht tp//bio informat ics we i zmann. ac. i l/databases/gensets/Human/) を用レ て評価したところヌクレオチドレベルで 97. 6%の感度と 40. 4%の選択性を示し、 一方、 正しいェキソン境界を検出するために 64. 2 %の感度、 21. 3%の選択性を示 すことがわかった。 [実施例 2] 三重解析 GeneDecoder is a gene discovery program using a Hidden Markov Model (HMM), which also uses information on sequence similarity and exon length distribution. This program was compiled using Gense t 98 (ht tp // bio informatics we i zmann.ac.il/databases/gensets/Human/) containing 462 sequences consisting of multiple exons and 2,843 exons. Evaluation showed 97.6% sensitivity and 40.4% selectivity at the nucleotide level, while showing 64.2% sensitivity and 21.3% selectivity to detect correct exon boundaries. I understood that [Example 2] Triple analysis
三重解析の段階において、 本発明者らは、 配列検索のために BLASTP(Altschul， S. F. et al. ucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997).)、 ドメインおよび モチーフの帰属のために PFAMデータベース（Bateman, A. , et al. Nucleic Acids Res. 28, 263-266 (2000) .)および PROSITE (Bairoch, A. , Nucreic Acids Res. 20, 2013-2018 (1992) .)データベース、 ならびに TMH予測には本発明者らの独自 のアルゴリズムである TMWindowsを用い、 さらに Mitakuの方法（Hirokawa, T.， et al. Bioinformatics. 14, 378-379 (1998) .)を加味した。 具体的には、 以下の 通りである。  At the triple analysis stage, we used BLASTP (Altschul, SF et al. Ucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)) for sequence searches, PFAM database for domain and motif assignment. (Bateman, A., et al. Nucleic Acids Res. 28, 263-266 (2000).) And PROSITE (Bairoch, A., Nucreic Acids Res. 20, 2013-2018 (1992).) Database, and TMH prediction In addition, TMWindows, a unique algorithm of the present inventors, was used, and Mitaku's method (Hirokawa, T., et al. Bioinformatics. 14, 378-379 (1998).) Was added. Specifically, it is as follows.
(1) BLASTPを用いて、 配列抽出段階で得たアミノ酸配列 （6F展開配列、 GD配 列） を SWISSPR0Tデータベースに対して検索し、 6値<10— 1 ()または 10一 5 0 で既知の GPCR配列と一致する配列を列挙した。 (1) using BLASTP, the amino acid sequence (6F development sequence, GD sequence) obtained in sequence extraction step was searched against SWISSPR0T database, 6 values <10-1 () or 10 one 5 0 known Sequences matching the GPCR sequence were listed.
(2) HMMERプログラムを用いて 6F展開配列、 GD配列に PFAMデータベース中の GPC Rに特有なドメインを E値ぐ 1.0またはく 10— 1Gで帰属できた配列を列挙した c 同時に PROSITE (Bairoch, A.， Nucreic Acids Res. 20, 2013-2018 (199(2) 6F deployment sequence using HMMER program listed sequences could assigned a unique domain in E Negu 1.0 The foil 10- 1G to GPC R in PFAM database GD sequence c simultaneously PROSITE (Bairoch, A ., Nucreic Acids Res. 20, 2013-2018 (199
2) .)データベース中の GPCRに特有なモチーフパターンを？値 < 2 x 10— 3ま たは <10—5で帰属できた配列を列挙した。 2).) What are the unique motif patterns for GPCRs in the database? Value <2 x 10- 3 or is listed an array that can be attributed in <10- 5.
(3) TMWindowsおよび Mitakuの方法を用いて、 6F展開配列、 GD配列の膜貫通へ リックス本数を予測した。 例えば TMWindowsによって 7本と予測した結果お よび Mitakuの方法で 6本〜 8本の範囲で予測された結果の和集合の関係を (3) Using the method of TMWindows and Mitaku, the number of transmembrane helices of 6F expansion sequence and GD sequence was predicted. For example, the relationship of the union of the results predicted by TMWindows and the results predicted by Mitaku's method from 6 to 8
(TMW i ndows (7)または M i t aku (6-8) )と記載するとして、 ITMW i ndows (7)また は Mi taku (6-8) )、 (TMWindows (7)または Mi t aku (7) )ならびに (TMWindows (7) かつ Mitaku (7)1として用意した各条件に一致した配列を列挙する。 (TMW i ndows (7) or M it aku (6-8)), ITMW i ndows (7) or Mi taku (6-8)), (TMWindows (7) or Mi t aku (7 )) And (TMWindows (7) and Mitaku (7) 1 prepared sequences are listed according to each condition.
以上の解析において使われたプログラムやデータベースについて詳細を記述す る。 PFAMは、 隠れマルコフモデル （HMM) によって記述された蛋白質ドメインデ 一夕ベースであり、 HMMER (Bateman, A., et al. Nucleic Acids Res. 28, 263-2 66 (2000) . )は、 それらを配列に帰属し、 その有意性を E値でスコア付けする。 一 方、 PR0SITEは、 正規表現によって記述されたモチーフパターンである。 本発明 者らは帰属の有意性をスコア付けするため、 各残基の出現確率を乗算した （P 値） を指標とした。 例えば、 正規表現パターンが A- [T, S] -Gである場合、 P値は P A* (P t +P s I *PGである。 Describe in detail the programs and databases used in the above analysis. PFAM is a protein domain design described by the Hidden Markov Model (HMM). HMMER (Bateman, A., et al. Nucleic Acids Res. 28, 263-2 66 (2000).) Assign them to sequences and score their significance by E value. On the other hand, PR0SITE is a motif pattern described by regular expressions. In order to score the significance of attribution, the present inventors used the (P value) multiplied by the appearance probability of each residue as an index. For example, the regular expression pattern A- [T, S] if a -G, P value is P A * (P t + P s I * P G.
TMWindowsは、 TMH予測に関する本発明者独自のプログラムである。 これは、 En gelman-Stai tz-Goldman (Engelman, D. M. , et al. Annual Review of Biophys ic s and Biophys ical Chemist ry. 15, 321-353. (1986) · )の疎水性指数をアミノ酸 残基ごとに割り付け、 9つの異なるウィンドウ幅 （19〜27残基） で全配列をスキ ヤンする。 この指標は AAindexデ一夕ベース（Tomi i, K. & Kanehi sa, M. Protein Eng. 9, 27-36 (1996) . )に含まれたあらゆる指数の比較を通して膜タンパク質 解析に最も適した指標として決定した。 それぞれのウィンドウ幅に関して、 平均 疎水性指数 >2. 5である連続領域を、 膜貫通へリックスとして予測する。 それぞ れの異なるウィンドウセッ卜で予測される数は、 ヘリックスの本数の範囲を意味 する。 一方、 Mi takuの方法は、 物理化学パラメ一夕を用いてヘリックスの本数を 予測する。  TMWindows is the inventor's original program for TMH prediction. This is based on the hydrophobicity index of En gelman-Stai tz-Goldman (Engelman, DM, et al. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 321-353. (1986)) for each amino acid residue. And scan the entire sequence with nine different window widths (19-27 residues). This index is the most suitable index for membrane protein analysis through comparison of all indices included in the AAindex database (Tomi i, K. & Kanehi sa, M. Protein Eng. 9, 27-36 (1996).) As determined. For each window width, a continuous region with an average hydrophobicity index> 2.5 is predicted as the transmembrane helix. The number predicted for each different window set means the range of the number of helices. On the other hand, Mitaku's method predicts the number of helices using physical chemistry parameters.
これらの解析で使われた閾値は、 本発明者がそれぞれの方法を評価することで 得たものである。 評価に用いた参考データセットは、 SWISSPR0Tバージョン 39 (Ba i roch, A. & Apwei ler, R. Nucle ic Ac ids Res. 28, 45-48 (2000) . )から断片配 列を除外することによって得た配列である。 これは、 既知の GPCR配列 1, 054個お よび非 GPCR配列 64， 154個を含む。 以下に解析法の具体的な評価手順を示す。  The threshold values used in these analyzes were obtained by the inventor's evaluation of each method. The reference data set used for the evaluation was obtained by excluding the fragment sequence from SWISSPR0T version 39 (Ba i roch, A. & Apweiler, R. Nucleic Acids Res. 28, 45-48 (2000).) The obtained sequence. This includes 1,054 known GPCR sequences and 64,154 non-GPCR sequences. The specific evaluation procedure for the analysis method is shown below.
( 1 ) BLASTPを用いて、 既知の GPCR配列 1, 054個を評価用データセットに対して 検索し、 正確および非正確な対の識別に関する感度、 選択性を各 E値に対 して計算した。  (1) Using BLASTP, 1,054 known GPCR sequences were searched against the evaluation data set, and sensitivity and selectivity for accurate and inaccurate pair discrimination were calculated for each E value. .
( 2 ) HMMERを用いて、 GPCRに特有な PFAMドメインを評価用データセットの配列 に帰属し、 E値の感度および選択性を正確および非正確帰属の数に対して 計算した。 一方、 PR0SITEパターンに関して、 P値の感度および選択性を、 正確および非正確帰属の数に関して計算した。 (2) Using HMMER, assign the PFAM domain specific to GPCR to the sequence of the evaluation data set, and adjust the sensitivity and selectivity of E value to the number of correct and inaccurate assignments. Calculated. On the other hand, for the PR0SITE pattern, the sensitivity and selectivity of the P value were calculated with respect to the number of exact and inaccurate assignments.
( 3 ) TMH予測ツールは、 一般的にヘリックスの真の数を予測することにおいて あまり正確ではない。 しかし、 予測されるへリックスの本数を、 6〜8本、 5〜9本、 または 4〜 10本等というように広く取れば、 真の 7本の膜貫通ヘリ ックスタイプを検出するための感度を明らかに増加できる。 TMWindowsお よび Mi takuの方法のいずれに関しても、 われわれは 4通りの範囲、 7、 6〜8、 5〜9、 4〜10を考慮し、 お互いの全ての組合せ （16通り） に対して、 真の 7 本の膜貫通ヘリックスを検出する感度および選択性を計算した。  (3) TMH prediction tools are generally not very accurate in predicting the true number of helices. However, if the expected number of helices is wide, such as 6-8, 5-9, or 4-10, etc., the sensitivity to detect true seven transmembrane helix types can be increased. It can obviously increase. For both TMWindows and Mitaku methods, we consider 4 ranges, 7, 6-8, 5-9, 4-10, and true for all combinations of each other (16 ways). The sensitivity and selectivity of detecting 7 transmembrane helices were calculated.
評価を通じて、 本発明者らは 2つの閾値すなわち最善感度閾値と最善選択性閾 値に重点を置いた。 前者の閾値は、 疑陽性が最小になりほぼ 100%の感度を得る ことを意図しており、 一方、 後者は疑陰性が最小になりほぼ 100%の選択性を得 ることを意図している。  Through the evaluation, we focused on two thresholds: the best sensitivity threshold and the best selectivity threshold. The former threshold is intended to achieve near 100% sensitivity with minimal false positives, while the latter is intended to achieve nearly 100% selectivity with minimal false negatives. .
例えば、 BLASTPの閾値の評価を図 1に示す。 左矢印が示す線は GPCR同士の対の 個数を表し、 右矢印が示す線は GPCRと非 GPCR配列との対を示す。 E値が 10— 5Q未満 である領域では、 境界域周辺のいくつかの無関係な対を除いてほぼ全ての対が GP CR配列同士のものであった。 これは最善選択性閾値に対応する。 興味深いことに、 これらの疑陽性は、 膜貫通へリックスを 1本だけ持つ受容体に特徴的な LDL受容 体ドメインまたは EGF因子ドメインとの一致によって引き起こされた。 E値が 10_1ϋ 未満の場合、 疑陽性は 115個であつたがほとんど全ての GPCRが範囲に含まれた。 この境界域は最善感度閾値に対応する。 For example, Figure 1 shows the evaluation of the BLASTP threshold. The line indicated by the left arrow indicates the number of pairs of GPCRs, and the line indicated by the right arrow indicates a pair of GPCR and non-GPCR sequence. In the region where the E value is less than 10-5Q , almost all pairs were between GPCR sequences except for some unrelated pairs around the boundary. This corresponds to the best selectivity threshold. Interestingly, these false positives were caused by matching the LDL receptor domain or the EGF factor domain that is characteristic of receptors with only one transmembrane helix. When the E value was less than 10-1 kg , there were 115 false positives, but almost all GPCRs were included. This boundary area corresponds to the best sensitivity threshold.
同様に、 本発明者らは、 表 1に要約したように、 それぞれのツールの閾値を評 価しそれらを基に 4つのレベルのデータセットを作成した。 し evel A Level B Level C Level D Similarly, as summarized in Table 1, we evaluated the thresholds of each tool and created a four-level data set based on them. Evel A Level B Level C Level D
LU S (最n i善選択性） (最善感度）  LU S (n i best selectivity) (best sensitivity)
BLASTP E く 50 E <10"10 E <10"10 E く 10— 10 BLASTP E rather than 50 E <10 "10 E < 10" 10 E rather than 10- 10
(99%, 蘭)  (99%, orchid)
ョ《 (100%, 90.1%) (100%, 90.1%) (100%, 90.1%) (<< 100%, 90.1%) (100%, 90.1%) (100%, 90.1%)
PFAM PFAM
PROSITE P く 10—5 P く 2x 10— 3 P く 2x 10— 3 P く 2x 10— 3 PROSITE P 10— 5 P <2x 10— 3 P <2x 10— 3 P <2x 10— 3
(90%, 100%) (100%, 95.0%) (100%, 95.0%) (100%, 95.0%) (90%, 100%) (100%, 95.0%) (100%, 95.0%) (100%, 95.0%)
TMH 予測 不使用 {T隨 indows (7) {TMW indows (7) {TMW indows (7) or and Mitaku(7)} or Mitaku(7)} Mitaku(6-8)} (36.0%. 70.6%) (86.8%, 44.61) (99.3%, 28.8%) m 2 TMH prediction Not used {T 隨 indows (7) {TMW indows (7) {TMW indows (7) or and Mitaku (7)} or Mitaku (7)} Mitaku (6-8)} (36.0%. 70.6%) (86.8%, 44.61) (99.3%, 28.8%) m 2
ここで、 各プログラムの閾値の下の括弧内には、 βへその閾値を用いたときの感度 (左） と選択性 （右） を表す。 S o  Here, in the parentheses below the threshold of each program, the sensitivity (left) and selectivity (right) when using the threshold for β are shown. S o
最も信頼の置けるデータ （レベル A，最善選択性データセット） は、 BLASTP、 PF AM, および PROSITEの最善選択性閾値から得られた配列の和集合に o  The most reliable data (level A, best selectivity data set) is the union of sequences obtained from the best selectivity thresholds of BLASTP, PF AM, and PROSITE.
S vよって得られ た。 これに加え、 関係の遠い GPCR配列を発見するために、 TMH予測閾値の 3つのレ ベル （表 1) による結果と BLASTP、 PFAMおよび PROSITEの最善感度閾値による結果 との和集合を得た。 次に、 最も感度の高いデータセットを最善感度データセット として準備した （レベル D) 。 本発明者らが評価した方法によれば、 最善選択性 データセッ卜において発見された如何なる配列も膜貫通ヘリックス 7本を有する 蛋白質であり、 そのほとんどがグアノシン三リン酸結合夕ンパク質共役型である 可能性が極めて高い。  Obtained by S v. In addition, in order to find distantly related GPCR sequences, we obtained a union of the results from the three TMH prediction thresholds (Table 1) and the results from the best sensitivity thresholds for BLASTP, PFAM and PROSITE. Next, the most sensitive data set was prepared as the best sensitivity data set (level D). According to the methods evaluated by the inventors, any sequence found in the best selectivity dataset is a protein with seven transmembrane helices, most of which are guanosine triphosphate-binding protein conjugates. Very likely.
[実施例 3] 遺伝子数の精密化  [Example 3] Refinement of the number of genes
第一の段階において生成した配列から、 表 1に示す閾値を用いて GPCR候補物質 をスクリーニングした。 しかしこれらの配列は、 なおも以下の重複例を含んでい たため、 最終的に候補数をより絞り込む必要があつた。  GPCR candidates were screened from the sequences generated in the first stage using the thresholds shown in Table 1. However, these sequences still included the following duplicate examples, so it was necessary to narrow down the number of candidates in the end.
ケース 1 ： 同じ遺伝子の位置での完全なマッチまたは重なり。 それらは 2つの 配列生成方法、 すなわち （1) 6-フレーム翻訳および （2) GeneDecoderによる 予測、 の結果である。 本発明者らはそれらを同じ遺伝子であると見なした。 Case 1: Perfect match or overlap at the same gene position. They consist of two sequence generation methods: (1) 6-frame translation and (2) GeneDecoder The result of the prediction. We considered them to be the same gene.
ケース 2 ：異なる染色体間または同じ染色体上の異なる位置の間での多数のコ ピー。 生物学的観点から、 本発明者らはそれらを異なる遺伝子と見なした。 重複 遺伝子の最大数は染色体 2と 1 1とのあいだに多く認められた。  Case 2: Multiple copies between different chromosomes or between different positions on the same chromosome. From a biological point of view, we considered them different genes. The largest number of duplicate genes was found between chromosomes 2 and 1 1.
ケース 3 ：何らかの長い既知の配列に部分的にヒッ卜する 2つ以上の配列。 こ れらが生成された理由は、 遺伝子発見プログラムによるミススプライシングであ ると考えられる。 本発明者らはそれらを本来は同じ遺伝子として融合するべきと した。  Case 3: Two or more sequences that partially hit some long known sequence. The reason why these were generated is thought to be mis-splicing by the gene discovery program. The inventors of the present invention originally decided to fuse them as the same gene.
本発明者らは、 上記の各ケースを検討することによつてまず候補遺伝子の精度 を上げた。 具体的なアルゴリズムとして本発見者らは、 染色体番号を (：、 フレー ム番号を Fおよびゲノム配列上の位置を Rとして配列を S ( F、 R) と記述し、 2 つの配列 i， jが = 、 F i =F j、 η ; =η e i -t j <0 ( i <j ) で、 50残基以上 9 9%以上の類似度でァラインされた場合に、 2つの配列を同じ遺伝子であると見な した。 （ここで nがコンテイダ番号であって、 t， eがコンテイダ配列での Nおよび C 末端での相対的位置である場合、 位置 R=R (n， t, e)である）。 The present inventors first raised the accuracy of candidate genes by examining each of the above cases. As a specific algorithm, the present inventors described the sequence as S (F, R), where the chromosome number is (:, the frame number is F and the position on the genome sequence is R, and the two sequences i and j are =, F i = F j, η; = η e i -t j <0 (i <j), and two sequences are the same gene when aligned at a similarity of 50 residues or more and 9% or more (Where n is the container number and t, e are the relative positions at the N and C ends in the container sequence, position R = R (n, t, e) Is).
上記のような篩い分けを行った後、 さらに、 生物学的知見も加えて最終的に本 発明者らは 883および 2293配列を含む最善選択性および最善感度デ一夕セッ 卜を それぞれ得、 さらにその他のレベルのデータセットも得た。 各データセットに対 して染色体ごとの GPCR候補体の数を表 2にまとめる。 After sieving as described above, and further adding biological knowledge, we finally obtained the best selectivity and best sensitivity settings including 883 and 2293 sequences, respectively. Other levels of data sets were also obtained. Table 2 summarizes the number of GPCR candidates per chromosome for each data set.
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Figure imgf000050_0001
Q I 1 I Q I 1 I
00 I· LL V V υ n 11  00 ILL V V υ n 11
r 1 r 1
U U u u Λ U U u u Λ
07 h 1 V 07 h 1 V
L V y G G Λ a I 71 L V y G G Λ a I 71
D 1· 0 c 77  D 1 0 c 77
G 0 G 0
Q o V u I 7 Q o V u I 7
I· 0 I · 0
■b Q I 1 ■ b Q I 1
Co L UG Co L UG
J I I QQ CQ J I I QQ CQ
V V v oo Vo A 1 V V v oo Vo A 1
07 7 Q O I 07 7 Q O I
Do y 6 oC O J- n 1 KG / I Do y 6 oC O J- n 1 KG / I
O il 06 L V  O il 06 L V
11 rc C 1 Q I
Figure imgf000050_0002
11 rc C 1 QI
Figure imgf000050_0002
DL n uoy 1 71  DL n uoy 1 71
V V  V V
1 c Q7 c 1  1 c Q7 c 1
00 01- n 1 p 1 op I QQ 70 7 I  00 01- n 1 p 1 op I QQ 70 7 I
V L 60 0 1· nop GP 1 1 y oo o7o D C  V L 60 0 1 ・ nop GP 1 1 y oo o7o D C
QC OO 07  QC OO 07
oo 06 C 1 n 1  oo 06 C 1 n 1
71 QC n CO a  71 QC n CO a
Uc 00 D nc 6し 07 1 7  Uc 00 D nc 6 and 07 1 7
6 Q 0 6 Q 0
70 Ci7 1
Figure imgf000050_0003
70 Ci7 1
Figure imgf000050_0003
ΠΠ 1 CC vc c ΠΠ 1 CC vc c
99 6ε LI 17 99 6ε LI 17
96 6 ε
Figure imgf000050_0004
96 6 ε
Figure imgf000050_0004
06L 09 L 06 L απθΛ8ΐ 0L| 9A9 | ai i8A9i 06L 09 L 06 L απ θΛ8 ΐ 0L | 9A9 | ai i 8A9 i
- 6 -  -6-
Sl7Z9l0/C00Zdf/X3d 請 OAV 全てのレベルのデータセッ卜において染色体 11は GPCR候補体の最大数を有し、 染色体 1、 6、 19も多数の GPCR候補体を示すことがわかる。 一方、 染色体 21および Yでは、 GPCR候補は極めて少ない。 しかもこの傾向は、 これまで毎月データを更 新する過程でも変わらなかった。 Sl7Z9l0 / C00Zdf / X3d contract OAV It can be seen that in all levels of data sets, chromosome 11 has the largest number of GPCR candidates, and chromosomes 1, 6 and 19 also represent a large number of GPCR candidates. On the other hand, on chromosomes 21 and Y, there are very few GPCR candidates. Moreover, this trend has not changed in the process of updating the data every month.
最善選択性データセッ卜に関するさらなる分析を表 3に要約する。 Further analysis on the best selectivity dataset is summarized in Table 3.
表 3 ファミリ一名 データ数 計Table 3 Family name Number of data Total
Acetychol ine (muscarinic) receptors 12Acetychol ine (muscarinic) receptors 12
Adenosine and adenine nucleotide receptors 17Adenosine and adenine nucleotide receptors 17
Adrenergic Dopamine Serotonin receptors 38Adrenergic Dopamine Serotonin receptors 38
Angiotensin receptors 5Angiotensin receptors 5
Bradykinin receptors 3Bradykinin receptors 3
Cannab inoids receptors 1Cannab inoids receptors 1
Chemokines and chemotact ic factors receptors 31Chemokines and chemotact ic factors receptors 31
Cholecystokinin / gastrin receptors 3Cholecystokinin / gastrin receptors 3
Endothel in receptors 2Endothel in receptors 2
Fami ly 2 (B) receptors 20Fami ly 2 (B) receptors 20
Fami ly 3 (C) receptors 30Fami ly 3 (C) receptors 30
Family fz/smo receptors 11Family fz / smo receptors 11
Glycoprotein hormones receptors 5Glycoprotein hormones receptors 5
Histamine receptors 3Histamine receptors 3
Melanocort i ns receptors 5Melanocort i ns receptors 5
Melanotonin receptors 5Melanotonin receptors 5
Neuropeptide Y receptors 7Neuropeptide Y receptors 7
Neurotensin receptors 6 no swi ssprot 7tm 16Neurotensin receptors 6 no swi ssprot 7tm 16
Odorant/o 1 factory and gustatory receptors 537Odorant / o 1 factory and gustatory receptors 537
Opioid peptides receptors 5Opioid peptides receptors 5
Opsins 6Opsins 6
Orphan receptors 76Orphan receptors 76
Other receptors 4Other receptors 4
Platelet acti ating factor receptors 3Platelet acti ating factor receptors 3
Prostanoids receptors 8Prostanoids receptors 8
Prote i nase-act i vated receptors 5Prote i nase-act i vated receptors 5
Releasing hormones receptors 4Releasing hormones receptors 4
Somatostatin receptors 8Somatostatin receptors 8
Tachykinin receptors 3Tachykinin receptors 3
Vasopressin/oxytocin receptors 4 ϊΝίί 1 883 本発明者らは、 30%の配列類似性によって配列を分類した。 これは一般的に、 進化的に関連したファミリーの閾値であると考えられる。 最大のファミリ一は 53 7メンバーを含む嗅覚受容体であった。 20メンバ一以上の主要なファミリ一は、 アドレナリン、 ドーパミンおよびセロトニン受容体 （38) 、 ファミリー 2B受容体 (20) 、 ファミリー 3 C受容体 （30) ケモカインおよび化学遊走受容体 （31) 、 ならびにォーファン受容体 （76) であった。 Vasopressin / oxytocin receptors 4 ϊΝίί 1 883 We classified the sequences by 30% sequence similarity. This is generally considered to be an evolutionarily related family threshold. The largest family was an olfactory receptor containing 53 7 members. Major families of more than 20 members include adrenaline, dopamine and serotonin receptors (38), family 2B receptors (20), family 3 C receptors (30) chemokines and chemotaxis receptors (31), and orphans It was a receptor (76).
[実施例 4 ] 新規配列の抽出  [Example 4] Extraction of new sequence
配列を UNIGENE (Schuler, G. D. J. Mol Med. 75, 694-698 (1997) . )および nr- a a (f tp ://ncbi. njJL njjL gov/bl as t/db/README)データベースに対して検索した。 調べた配列中の少なくとも 100残基以上が既知配列に対して連続してァラインさ れ、 その領域のアミノ酸同一性が 96%以上であれば、 本発明者らはこの配列を既 知の配列であると判断し、 この基準で、 本発明者らは、 新規 GPCR候補を得た。 こ れらのデータセットは、 定常的な再計算により、 将来にわたり、 維持、 更新され るものである。  Sequences were searched against UNIGENE (Schuler, GDJ Mol Med. 75, 694-698 (1997).) And nr- aa (f tp: //ncbi.njJL njjL gov / bl as t / db / README) databases . If at least 100 residues or more in the examined sequence are continuously aligned with a known sequence, and the amino acid identity of the region is 96% or more, the present inventors used this sequence as a known sequence. Based on this criterion, the present inventors obtained new GPCR candidates. These data sets will be maintained and updated in the future through routine recalculation.
本発明者らは、 抽出した新規配列を下記 A群、 B群、 C群に分類した （表 4から表 6) 。 配列 A群、 B群、 C群は、 三重分析で得られた配列セットのうち、 それぞれ最 善選択性データセット（レベル A)、 レベル Bデ一夕セット、 レベル Cデータセット を基にして個数の精密化を行った後、 UNIGENEおよび nr-aaデータベースに対する 検索に従って新規配列を求めたものである。 The present inventors classified the extracted novel sequences into the following groups A, B, and C (Tables 4 to 6). Sequences A, B, and C are based on the best selectivity data set (level A), level B data set, and level C data set, respectively. After refining, the new sequence was obtained by searching the UNIGENE and nr-aa databases.
表 4 配列 A群 （ 表 1の最善選択性データセット （l evel A)を基にした） Table 4 Sequence A (based on the best selectivity dataset in Table 1 (l evel A))
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Figure imgf000054_0001
A-1 6 FI己列を相同性検索にて解析した配列セット。（ もっとも簡易な方法の利用） A-2 G D配列の利用により、 マルチェキソンからなるアミノ酸配列分が増加した。  A-1 6 Sequence set of FI sequence analyzed by homology search. (Use of the simplest method) The use of the A-2GD sequence increased the amino acid sequence composed of marquexons.
A-3 モチーフ、 ドメイン帰属の利用によって初めて発見された配列セット。  A-3 Sequence set first discovered through the use of motifs and domain attribution.
通常の配列検索では見出せない非常に遠いホモ口グを検出している。 表 5 配列已群（ 表 1 の Level Bを基にした）  A very far homolog that cannot be found by normal sequence search is detected. Table 5 Sequence already group (based on Level B in Table 1)
Figure imgf000054_0002
Figure imgf000054_0002
B-1 6 F配列を相同性検索にて解析した配列セット。（ もっとも簡易な方法の利用） B-2 G D配列の利用により、 マルチェキソンからなるアミノ酸配列分が増加した。  Sequence set of B-1 6 F sequence analyzed by homology search. (Use of the simplest method) The use of the B-2GD sequence increased the amino acid sequence consisting of multiexons.
B-3 モチーフ、 ドメイン帰属の利用によって初めて発見された配列セット。  B-3 Sequence set first discovered using motifs and domain attribution.
通常の配列検索では見出せない非常に遠いホモログを検出している。  A very distant homolog that cannot be found by normal sequence search is detected.
B-4 膜貫通ヘリックス予測法の利用によリ初めて発見された配列セット。  B-4 Sequence set discovered for the first time by using the transmembrane helix prediction method.
通常の相同性検索モチーフ、 ドメイン帰属でさえも見つからないような配列も 発見している。 表 6 配列 ( 群（ 表 1 の Level Cを基にした） We have also found sequences that cannot be found even in normal homology search motifs and domain assignments. Table 6 Sequence (Group (Based on Level C in Table 1)
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C-1 6 F配列を相同性検索にて解析した配列セッ卜。（ もっとも簡易な方法の利用） C-2 GD配列の利用により、 マルチェキソンからなるアミノ酸配列分が増加した。  Sequence set of C-1 6 F sequence analyzed by homology search. (Use of the simplest method) Use of the C-2 GD sequence increased the amino acid sequence consisting of multiexons.
C-3 モチーフ、 ドメイン帰属の利用によって初めて発見された配列セット。  C-3 Sequence set first discovered using motifs and domain attribution.
通常の配列検索では見出せない非常に遠いホモログを検出している。  A very distant homolog that cannot be found by normal sequence search is detected.
C-4 膜貫通ヘリックス予測法の利用により初めて発見された配列セット。  C-4 Sequence set discovered for the first time using the transmembrane helix prediction method.
通常の相同性検索モチーフ、 ドメイン帰属でさえも見つからないような配列も 発見している。 以下、 本発明者が同定したクローンのうち、 クローン 13860について解析を進 めた。  We have also found sequences that cannot be found even in normal homology search motifs and domain assignments. Hereinafter, among the clones identified by the present inventor, analysis was performed on clone 13860.
[実施例 5] クローン 13860の cDNAの単離  [Example 5] Isolation of cDNA of clone 13860
5.1. 5' -RACE, 3' -RACE法によるクローン 13860 cDNAの単離  5.1. Isolation of clone 13860 cDNA by 5'-RACE, 3'-RACE method
クローン 13860の cDNAは同様に 5' -RACE, 3' -RACE法を用いて単離した。 3' - 端側の cDNAは 3， -RACE法により、 H. Hela細胞由来の Marathon- Ready cDNA (CLONT ECH社製） を銬型とし、 API (配列番号： 1 1) と 3' R13860 (配列番号： 1) を プライマーとして第一 PCRを行い、 さらに第二 PCRにおいては AP2 (配列番号： 1 2) と 3' R13860-nest (配列番号： 2) をプライマーとして用いた。 続いて、 5' -端側の cDNAは 5' -RACE法により、 H. Hela細胞由来の Marathon- Ready cDNAを 铸型とし、 APIと 5' R13860 (配列番号： 3) をプライマーとして第一 PCRを行い、 さらに第二 PCRにおいては AP2と 5' R13860-nest (配列番号： 4) をプライマー として用いた。 また、 それぞれの PCRにおいては Advantage 2 Polymerase Mix (C L0NTECH社製） を DNAポリメラーゼとして用いた。 これらの PCRにより得られた DNA 断片は pGEM- T Easyベクター （Promega社製） に挿入した後、 塩基配列の決定を行 つた。 なお、 Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社製) を用いた PCR反応は M arathon Ready cDNAに添付の方法に従い行った。 The cDNA of clone 13860 was similarly isolated using the 5′-RACE, 3′-RACE method. The 3'-end cDNA is 3, by the -RACE method, Marathon-Ready cDNA (CLONT ECH) derived from H. Hela cells is used as a saddle, and API (SEQ ID NO: 1 1) and 3 'R13860 (sequence) No. 1) was used as a primer for the first PCR, and in the second PCR, AP2 (SEQ ID NO: 1 2) and 3 ′ R13860-nest (SEQ ID NO: 2) were used as primers. Next, the 5'-end cDNA was converted to the first PCR using 5'-RACE method, using Marathon-Ready cDNA derived from H. Hela cells as a saddle, and API and 5 'R13860 (SEQ ID NO: 3) as primers. In the second PCR, AP2 and 5 ′ R13860-nest (SEQ ID NO: 4) were used as primers. In each PCR, Advantage 2 Polymerase Mix (manufactured by CLONOTECH) was used as a DNA polymerase. DNA obtained from these PCRs The fragment was inserted into pGEM-T Easy vector (Promega), and the nucleotide sequence was determined. The PCR reaction using Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) was performed according to the method attached to Marathon Ready cDNA.
続いて、 上記にて単離、 同定した塩基配列について 5' -側の cDNAの塩基配列を さらに詳細に解析するために、 ヒト脳より調製した cDNA (Clontech社製） を铸型 DNAとして用い、 PCRにより増幅を試みた。 すなわち、 50 L の PCR反応液中に 5 Lの 10 X ExTaq buffer, 5j Lの dNTPs (各 2.5 πιΜ) 、 10 pmoleのセンスプライマ -13860-1 (配列番号： 5) ならびに 10 pmoleのアンチセンスプライマ一 13860-4 (配列番号： 6) 、 2.5 Lのヒ卜脳 cDNA (Clontech社製） 、 1/xLの TaKaRa ExTa α (宝酒造社製） 、 ならびに lAiLの TaciStart Antibody (宝酒造社製） をそれぞれ 含むように調製した後、 初めに 96でで 4分インキュベートし、 続いて 96 で 20秒、 72 で 1分の反応からなるサイクルを 5回、 96 で 20秒、 70でで 1分の反応からな るサイクルを 5回、 さらに 96でで 20秒、 68 で 1分の反応からなるサイクルを 30回 行い、 最後に 72 で 2分間インキュベートした。 PCRにより増幅された約 800 bpの 産物は pGEM-T Easyベクター （Promega社製） に挿入し、 塩基配列を詳細に決定し た （配列番号： 1 5) 。 その結果、 上記の方法により増幅された領域は単一の読 み枠で途中に停止コドンが入ることなくアミノ酸配列 （配列番号： 1 6) を類推 することができたことよりクローン 13860の開始コドンはさらに上流に存在する ことが推定された。 そこで、 再度 5' -RACE法により 5' -側の cDNAの単離、 同定を 試みた。 5' -RACEの際の第一 PCRに用いる PCRプライマ一 13860- 8 (配列番号： 7) ならびに第二 PCRに用いる PCRプライマー 13860-6 (配列番号： 8) をそれぞ れ設計した。 ヒト脳由来の Marathon- Ready cDNA (Clontech社製） を铸型として 用い、 上記と同様に 5' -RACEを行った。 なお、 第一 PCRでは 13860-8 (配列番号： 7) と APIプライマ一を、 第二 PCRでは 13860-6 (配列番号： 8) と AP2プライマ一 をそれぞれ用いた。 PCRにより増幅された約 1 kbpの産物は PGEM- T Easyベクター に挿入し、 塩基配列を決定した （配列番号： 1 7) 。 その結果、 翻訳開始コドン から単一の読み枠でアミノ酸配列が類推され （配列番号： 1 8) 、 そのアミノ末 端には細胞外分泌シグナル配列と考えられる配列も認められたことより、 正しい 翻訳開始点が決定できたと考えられた。 Subsequently, in order to analyze the nucleotide sequence of the 5'-side cDNA in more detail with respect to the nucleotide sequence isolated and identified above, cDNA prepared from human brain (manufactured by Clontech) was used as the vertical DNA, Amplification was attempted by PCR. That is, 5 L of 10 X ExTaq buffer, 5 jL of dNTPs (each 2.5 πιΜ), 10 pmole of sense primer -13860-1 (SEQ ID NO: 5) and 10 pmole of antisense primer in a 50 L PCR reaction solution 13860-4 (SEQ ID NO: 6), 2.5 L human camphor cDNA (Clontech), 1 / xL TaKaRa ExTa α (Takara Shuzo), and lAiL TaciStart Antibody (Takara Shuzo), respectively First, incubate at 96 for 4 minutes, followed by 5 cycles of 96 at 20 seconds, 72 at 1 minute, 96 at 20 seconds, 70 at 1 minute. 5 cycles, 96 for 20 seconds, 68 for 1 minute, 30 cycles, and finally 72 for 2 minutes. The approximately 800 bp product amplified by PCR was inserted into pGEM-T Easy vector (Promega), and the nucleotide sequence was determined in detail (SEQ ID NO: 15). As a result, the region amplified by the above method was able to infer the amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) without any stop codon in the middle of a single reading frame, and therefore the start codon of clone 13860. Was estimated to exist further upstream. Therefore, another attempt was made to isolate and identify the 5'-side cDNA by the 5'-RACE method. The PCR primer 13860-8 (SEQ ID NO: 7) used for the first PCR in 5'-RACE and the PCR primer 13860-6 (SEQ ID NO: 8) used for the second PCR were designed. Marathon-Ready cDNA (manufactured by Clontech) derived from human brain was used as a cage and 5′-RACE was performed in the same manner as described above. In the first PCR, 13860-8 (SEQ ID NO: 7) and API primer were used, and in the second PCR, 13860-6 (SEQ ID NO: 8) and AP2 primer were used. The approximately 1 kbp product amplified by PCR was inserted into the PGEM-T Easy vector, and the nucleotide sequence was determined (SEQ ID NO: 17). As a result, the translation start codon The amino acid sequence was inferred from a single reading frame (SEQ ID NO: 1 8), and a sequence considered to be an extracellular secretion signal sequence was also found at the amino terminus. It was.
5.2. クローン 13860全長 cDNAの単離 5.2. Isolation of clone 13860 full-length cDNA
上記の RACE法により決定したクローン 13860の塩基配列を基に類推された 13860 の cDNA配列に相当する mRNAが存在するかどうかを確認するために、 13860のコ一 ディング領域と想定される部分の PCRによる増幅、 ならびに塩基配列の確認を行 つた。 PCRに用いるプライマーはセンス方向のプライマーとして翻訳開始コドン 近傍の配列にハイブリダィズし、 かつ制限酵素 EcoRI認識配列ならびにコザック 配列 （CCACC) を持つように設計した 13860- ATG (配列番号： 9) を、 またアンチ センス方向のプライマ一としては 13860のカルボキシル末端と想定される配列の 下流の配列にハイブリダィズし、 且つ制限酵素 Sail認識配列を持つように設計し た 13860-TGA2 (配列番号： 1 0) をそれぞれ用い、 PCRの条件は以下のようにし て行った。 すなわち、 50/iLの反応液中に 5 iLの 10 X PCR buffer (東洋紡社製） 、 5/ の dNTPs (各 2 ） 、 2 Lの 25 mM硫酸マグネシウム、 各 10 pmoleずつの 1386 0-ATGならびに 13860- TGA2プライマ一、 5/iLの He la細胞より調製した cDNA (Clont ech社製） 、 及び の KOD-Plus MAポリメラーゼ （東洋紡社製） を含むように 調製し、 初めに 94°Cで 2分インキュベートした後、 94 で 15秒、 72°Cで 2分 30秒か らなるサイクルを 5回、 続いて 94でで 15秒、 70でで 2分 30秒からなるサイクルを 5 回、 さらに 94でで 15秒、 68 で 2分 30秒からなるサイクルを 25回行い、 最後に 7 2でで 2分間インキュベートした。 PCR反応液は PCR Purification Kit (QIAGEN社 製） を用い脱塩、 PCRプライマーを除去した後、 40 zLの TE溶液で溶出し、 再度 PC Rによる二次増幅を行った。 すなわち、 50^Lの反応液中に 5 Lの 10 X PCR buffe r (東洋紡社製） 、 の dNTPs (各 2 mM) 、 2 Lの 25 mM硫酸マグネシウム、 各 1 0 pmoleずつの 13860- ATGならびに 13860-TGA2プライマー、 10 xLの第一 PCR精製産 物、 及び Lの KOD-Plus DNAポリメラ一ゼ （東洋紡社製） を含むように調製し、 初めに 94°Cで 2分インキュベートした後、 94 で 15秒、 60でで 30秒、 さらに 72°C で 2分 30秒からなるサイクルを 10回行い、 最後に 72 で 2分間インキュベートした < その結果、 約 3. 4 kbpの単一のバンドが増幅された。 得られた PCR産物の塩基配列 を決定した結果、 完全長のアミノ酸配列をコードすることが確認された。 最終的 に得られたクローン 13860の塩基配列を配列番号： 1 9に、 それより類推される アミノ酸配列を配列番号： 2 0に示した。 In order to confirm whether the mRNA corresponding to the cDNA sequence of 13860 estimated from the base sequence of clone 13860 determined by the above RACE method exists, PCR of the region assumed to be the coding region of 13860 Amplification and confirmation of the nucleotide sequence were performed. The primer used for PCR is 13860- ATG (SEQ ID NO: 9) designed to hybridize to the sequence near the translation initiation codon as a primer in the sense direction and to have the restriction enzyme EcoRI recognition sequence and the Kozak sequence (CCACC). As a primer in the antisense direction, 13860-TGA2 (SEQ ID NO: 1 0) designed to hybridize to the sequence downstream of the expected nucleotide end of 13860 and to have the restriction enzyme Sail recognition sequence, respectively. The PCR conditions used were as follows. That is, 5 iL of 10 X PCR buffer (Toyobo Co., Ltd.), 5 / dNTPs (2 each), 2 L of 25 mM magnesium sulfate, 10 pmole of 1386 0-ATG and 50 / iL of reaction solution Prepared to contain 13860- TGA2 primer, cDNA prepared from 5 / iL Hela cells (Clont ech), and KOD-Plus MA polymerase (Toyobo). After 5 minutes of incubation, 94 cycles for 15 seconds, 72 ° C for 2 minutes 30 seconds, 5 cycles followed by 94 for 15 seconds, 70 for 2 minutes 30 seconds, 5 more cycles 25 cycles of 15 seconds at 68, 2 minutes 30 seconds at 68, and finally 2 minutes at 72. The PCR reaction solution was desalted using PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN), PCR primers were removed, elution was performed with 40 zL of TE solution, and secondary amplification with PCR was performed again. That is, 5 L of 10 X PCR buffer (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), dNTPs (2 mM each), 2 L of 25 mM magnesium sulfate, 10 pmole of 13860-ATG Prepared to contain 13860-TGA2 primer, 10 xL of the first PCR-purified product, and L KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo) First, incubate at 94 ° C for 2 minutes, then perform 10 cycles of 94 for 15 seconds, 60 for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes 30 seconds, and finally 72 minutes for 2 minutes. As a result, a single band of about 3.4 kbp was amplified. As a result of determining the base sequence of the obtained PCR product, it was confirmed that it encodes the full-length amino acid sequence. The nucleotide sequence of the finally obtained clone 13860 is shown in SEQ ID NO: 19 and the amino acid sequence deduced therefrom is shown in SEQ ID NO: 20.
'一配列 >  'One array>
3， R13860 CTGCCTTGCTGCCGCCTTCCTC (配列番号： 1 ) 3, R13860 CTGCCTTGCTGCCGCCTTCCTC (SEQ ID NO: 1)
3， R13860— nest GCTGGCAAAGCACCGAGTTCTC (配列番号： 2 )  3, R13860— nest GCTGGCAAAGCACCGAGTTCTC (SEQ ID NO: 2)
5， R13860 TAGTACCAGCCCATTCACGCCTATG (配列番号： 3 )  5, R13860 TAGTACCAGCCCATTCACGCCTATG (SEQ ID NO: 3)
5， R13860— nes t AGGTAGAGCCCCAGGGTGACAC (配列番号： 4 )  5, R13860— nes t AGGTAGAGCCCCAGGGTGACAC (SEQ ID NO: 4)
13860-1 CGGCTACAAGGCTGTGACACACAAG (配列番号： 5 )  13860-1 CGGCTACAAGGCTGTGACACACAAG (SEQ ID NO: 5)
13860-4 TGGGGATGCAGCAGCTCAGCTGGAA (配列番号： 6 )  13860-4 TGGGGATGCAGCAGCTCAGCTGGAA (SEQ ID NO: 6)
13860-8 GTTCGGGATGGCTGAAGACAAGGCAG (配列番号： 7 )  13860-8 GTTCGGGATGGCTGAAGACAAGGCAG (SEQ ID NO: 7)
13860-6 GGCAGATGCTGGTGTTCCACTGGTAG (配列番号： 8 )  13860-6 GGCAGATGCTGGTGTTCCACTGGTAG (SEQ ID NO: 8)
13860-ATG CTGAATTCCACCATGGTCTGTTCGGCTGCCCCACTG (配列番号： 9 ) 13860-ATG CTGAATTCCACCATGGTCTGTTCGGCTGCCCCACTG (SEQ ID NO: 9)
13860-TGA2 TAGTCGACGAGGGACCAATTAACTTCACCTTTTCC (配列番号 : 1 0 )13860-TGA2 TAGTCGACGAGGGACCAATTAACTTCACCTTTTCC (SEQ ID NO: 1 0)
API CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC (配列番号 : 1 1 ) API CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO: 1 1)
AP2 ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC (配列番号 : 1 2 )  AP2 ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC (SEQ ID NO: 1 2)
[実施例 6 ] クローン 13860の発現解析 [Example 6] Expression analysis of clone 13860
クローン 13860のヒト各臓器ならびに腫瘍組織における mRNAの発現を RT-PCR法 により解析した。 铸型としては Mu l t iple Ti ssue cDNA (MTC) Pane l s (Human I、 Human I I、 Human Tumor、 CLONTECH社製） をそれぞれ用い、 以下の PCR条件で目的 のクローンを増幅した。  MRNA expression in human organs and tumor tissues of clone 13860 was analyzed by RT-PCR. As clones, multi-tip cDNA (MTC) panes (Human I, Human I I, Human Tumor, CLONTECH) were used, and the target clone was amplified under the following PCR conditions.
PCRプライマーとして、 13860-1 rcTCACTGGTCTTCTGGGAT (配列番号： 1 3 ) 」 と 13860 - 2 rTCTTGTTCCGCACCACGAC (配列番号： 1 4 ) 」 を用い、 94でで 1分反応 させた後、 「94 で 30秒、 56°Cで 30秒、 72でで 30秒」 からなるサイクルを 40サイ クル行った。  Using 13860-1 rcTCACTGGTCTTCTGGGAT (SEQ ID NO: 1 3) and 13860-2 rTCTTGTTCCGCACCACGAC (SEQ ID NO: 1 4) as PCR primers, react at 94 for 1 minute, then at 94 for 30 seconds, 56 ° A cycle consisting of “30 seconds for C and 30 seconds for 72” was performed for 40 cycles.
その結果、 クローン 13860は脳、 小腸、 大腸において発現が高いことが明らか になった。 産業上の利用の可能性 As a result, clone 13860 was found to be highly expressed in the brain, small intestine and large intestine. Industrial applicability
本発明により、 新規な GPCR、 該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含むベクター、 該ベクターを含む宿主細胞、 該ポリべプチ ドの製造方法が提供された。 さらに、 該ポリペプチドに結合するあるいはその活 性を修飾する化合物の同定方法が提供された。 本発明のポリペプチドやポリヌク レオチド、 または本発明のポリペプチドに結合若しくはその活性を修飾する化合 物は、 本発明のポリペプチドが関連する疾患の新しい予防薬や治療薬の開発への 利用が期待される。 さらに本発明によって、 本発明のポリペプチドをコードする 遺伝子の変異や発現を検出することを含む疾患の検査方法が提供された。 GPCRは 医薬品開発や医療の分野において最も重要かつ注目されている分子の一つであり、 本発明において新規 GPCRが網羅的に提供されたことにより、 これら分野の飛躍的 な発展が期待される。 GPCRの研究者にとっても、 本発明は貴重な情報源となろう。  The present invention provides a novel GPCR, a polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the vector, and a method for producing the polypeptide. Further provided are methods for identifying compounds that bind to the polypeptide or modify its activity. The polypeptide or polynucleotide of the present invention, or a compound that binds to or modifies the activity of the polypeptide of the present invention is expected to be used for the development of new preventive or therapeutic agents for diseases associated with the polypeptide of the present invention. Is done. Furthermore, the present invention provides a method for examining a disease comprising detecting mutation or expression of a gene encoding the polypeptide of the present invention. GPCR is one of the most important and attracting attention in the fields of drug development and medicine. The comprehensive provision of new GPCRs in the present invention is expected to make dramatic progress in these fields. Even for GPCR researchers, the present invention will be a valuable source of information.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の受容体をコードする下記1. Encoding a guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor
(a) から （d) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 The polynucleotide according to any one of (a) to (d).
(a) 配列番号： 20に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドをコード するポリヌクレオチド  (a) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
(b) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチ F  (b) a polynucleotide F comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19
(c) 配列番号： 20に記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミ ノ酸が置換、 欠失、 付加およびノまたは挿入したアミノ酸配列からな るポリべプチドをコードするポリヌクレオチド  (c) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and inserted or deleted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
(d) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる DNAにストリンジェン卜な 条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド  (d) a polynucleotide that hybridizes to DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 under stringent conditions
2. 配列番号： 20に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片をコー ドするポリヌクレオチド。  2. A polynucleotide encoding a fragment of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
3. 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。  3. A vector comprising the polynucleotide according to claim 1 or 2.
4. 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドまたは請求項 3に記載のべク 夕一を保持する宿主細胞。  4. A host cell carrying the polynucleotide of claim 1 or 2 or the vector of claim 3.
5. 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリぺプ チド。  5. A polypeptide encoded by the polynucleotide of claim 1 or 2.
6. 請求項 4に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から、 産生させたポリべプチドを回収する工程を含む、 請求項 5に記載のポリぺプ チドの製造方法。  6. The method for producing a polypeptide according to claim 5, comprising a step of culturing the host cell according to claim 4 and recovering the produced polypeptide from the host cell or a culture supernatant thereof. .
7. 請求項 5に記載のポリぺプチドに結合する抗体。  7. An antibody that binds to the polypeptide of claim 5.
8. 請求項 5に記載のポリベプチドに対するリガンドの同定方法であつて、8. A method for identifying a ligand for the polypeptide of claim 5, comprising:
( a ) 請求項 5に記載のポリぺプチドまたは請求項 5に記載のポリぺプチドを 発現している細胞若しくはその細胞膜と候補化合物とを接触させる工程、 および (a) The polypeptide of claim 5 or the polypeptide of claim 5 Contacting the expressing cell or its cell membrane with a candidate compound, and
(b) 候補化合物が請求項 5に記載のポリべプチドまたは請求項 5に記載のポ リペプチドを発現している細胞若しくはその細胞膜に結合するか否かを 検出する工程、  (b) a step of detecting whether the candidate compound binds to the cell or the cell membrane expressing the polypeptide of claim 5 or the polypeptide of claim 5,
を含む方法。  Including methods.
9. 請求項 5に記載のポリペプチドに対するァゴニス卜の同定方法であって、 9. A method for identifying an agonis against the polypeptide of claim 5, comprising:
( a ) 請求項 5に記載のポリぺプチドを発現している細胞と候補化合物とを 接触させる工程、 および (a) contacting the candidate compound with a cell expressing the polypeptide of claim 5; and
(b) 候補化合物が請求項 5に記載のポリペプチドの活性化の指標となるシ グナルを発生させるか否かを検出する工程、  (b) a step of detecting whether or not the candidate compound generates a signal that serves as an indicator of activation of the polypeptide of claim 5,
を含む方法。  Including methods.
10. 請求項 5に記載のポリペプチドに対するアン夕ゴニス卜の同定方法であ つて、  10. A method of identifying an Anonymous moth against the polypeptide of claim 5, comprising:
(a) 候補化合物の存在下で請求項 5に記載のポリペプチドを発現してい る細胞と請求項 5に記載のポリぺプチドに対するァゴニス卜とを接 触させる工程、 および  (a) contacting a cell expressing the polypeptide of claim 5 in the presence of the candidate compound with an agonis moth against the polypeptide of claim 5; and
(b) 候補化合物の非存在下で検出した場合と比較して、 請求項 5に記載 のポリべプチドの活性化の指標となるシグナルが減少するか否かを 検出する工程、  (b) a step of detecting whether or not a signal serving as an index of activation of the polypeptide according to claim 5 is reduced as compared with a case where detection is performed in the absence of a candidate compound;
を含む方法。  Including methods.
1 1. 請求項 8に記載の方法により同定されたリガンド。  1 1. A ligand identified by the method of claim 8.
12. 請求項 9に記載の方法により同定されたァゴニス卜。  12. Agonis moth identified by the method of claim 9.
13. 請求項 10に記載の方法により同定されたアン夕ゴニス卜。  13. An evening gonis moth identified by the method of claim 10.
14. 請求項 8から 1 0に記載の方法に用いるためのキットであって、 下記 (a) または （b) に記載の少なくとも一つの分子を含むキット。 (a) 請求項 5に記載のポリペプチド 14. A kit for use in the method according to claims 8 to 10, comprising at least one molecule according to (a) or (b) below. (a) the polypeptide of claim 5
(b) 請求項 4に記載の宿主細胞またはその細胞膜  (b) The host cell or the cell membrane according to claim 4
1 5. 請求項 5に記載のポリペプチドの活性または発現を増加させる必要があ る患者を治療するための医薬組成物であって、 下記 （a) から （c) に記 載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。  1 5. A pharmaceutical composition for treating a patient in need of increasing the activity or expression of the polypeptide of claim 5, wherein the molecule described in (a) to (c) below is treated. A pharmaceutical composition comprising an effective amount above.
(a) 請求項 5に記載のポリペプチドに対するァゴニスト  (a) an agonist against the polypeptide of claim 5
(b) 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチド  (b) the polynucleotide of claim 1 or 2
(c) 請求項 3に記載のベクタ一  (c) The vector set forth in claim 3
16. 請求項 5に記載のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある 患者を治療するための医薬組成物であって、 下記 （a) または （b) に記 載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。  16. A pharmaceutical composition for treating a patient who needs to suppress the activity or expression of the polypeptide of claim 5, wherein the molecule described in (a) or (b) below is therapeutically effective A pharmaceutical composition comprising a suitable amount.
( a ) 請求項 5に記載のポリベプチドに対するアン夕ゴニスト  (a) An evening gonist for the polypeptide of claim 5
(b) 生体内において、 内因性の請求項 5に記載のポリペプチドをコード する遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド  (b) a polynucleotide that suppresses the expression of a gene encoding the polypeptide of claim 5 that is endogenous in vivo.
1 7. 請求項 5に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または 請求項 5に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査方法で あって、 被検者における該遺伝子またはその発現制御領域の変異を検出す ることを含む方法。 1 7. A method for testing abnormal expression of a gene encoding the polypeptide of claim 5 or a disease associated with abnormal activity of the polypeptide of claim 5, wherein the gene or Detecting a mutation in the expression control region.
18. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 1 7に記載の検査方法。  18. The inspection method according to claim 17, comprising the following steps (a) to (d):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程  (a) A step of preparing a DNA sample from a subject
(b) 請求項 5に記載のポリべプチドをコードする DNAまたはその発現制 御領域を単離する工程  (b) a step of isolating the DNA encoding the polypeptide of claim 5 or its expression control region
(c) 単離した DNAの塩基配列を決定する工程  (c) determining the base sequence of the isolated DNA
(d) 工程 （c) により決定した DNAの塩基配列を、 対照と比較する工程。  (d) A step of comparing the DNA base sequence determined in step (c) with a control.
19. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 1 7に記載の検査方法。 19. The inspection method according to claim 17, comprising the following steps (a) to (d):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程 (b) 調製した DNA試料を制限酵素により切断する工程 (a) A step of preparing a DNA sample from a subject (b) A step of cleaving the prepared DNA sample with a restriction enzyme
(c ) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程  (c) A step of separating DNA fragments according to their size
(d) 検出された DNA断片の大きさを、 対照と比較する工程  (d) The step of comparing the size of the detected DNA fragment with the control
2 0. 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 請求項 1 7に記載の検査方法。  20. The inspection method according to claim 17, comprising the following steps (a) to (e):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程  (a) A step of preparing a DNA sample from a subject
( b ) 請求項 5に記載のポリぺプチドをコ一ドする DNAまたはその発現制 御領域を増幅する工程  (b) Amplifying the DNA encoding the polypeptide of claim 5 or its expression control region
(c ) 増幅した DNAを制限酵素により切断する工程  (c) cleaving the amplified DNA with a restriction enzyme
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程  (d) Separating DNA fragments according to their size
(e) 検出された DNA断片の大きさを、 対照と比較する工程  (e) A step of comparing the size of the detected DNA fragment with the control
2 1. 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 請求項 1 7に記載の検査方法。  2 1. The inspection method according to claim 17, comprising the following steps (a) to (e):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程  (a) A step of preparing a DNA sample from a subject
(b) 請求項 5に記載のポリべプチドをコ一ドする DNAまたはその発現制 御領域を増幅する工程  (b) A step of amplifying the DNA encoding the polypeptide of claim 5 or its expression control region
(c) 増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程  (c) Dissociating amplified DNA into single-stranded DNA
(d) 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程  (d) Separating the dissociated single-stranded DNA on a non-denaturing gel
(e) 分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程 (e) Step of comparing the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with the control
2 2. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 1 7に記載の検査方法。 2 2. The inspection method according to claim 17, comprising the following steps (a) to (d):
(a) 被検者から DNA試料を調製する工程  (a) A step of preparing a DNA sample from a subject
(b) 請求項 5に記載のポリペプチドをコードする DNAまたはその発現制 御領域を増幅する工程  (b) Amplifying the DNA encoding the polypeptide of claim 5 or its expression control region
(c) 増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する 工程  (c) Separating amplified DNA on a gel with increasing concentration of DNA denaturant
(d) 分離した DNAのゲル上での移動度を対照と比較する工程  (d) Step of comparing the mobility of the separated DNA on the gel with the control
2 3. 請求項 5に記載のポリべプチドをコードする遺伝子の発現の異常に関連 した疾患の検査方法であって、 被検者における該遺伝子の発現量を検出す ることを含む方法。 2 3. A method for examining a disease associated with abnormal expression of a gene encoding the polypeptide according to claim 5, wherein the expression level of the gene in a subject is detected. A method comprising:
4. 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 2 3に記載の検査方法。 4. The inspection method according to claim 23, comprising the following steps (a) to (c).
(a) 被検者から RNA試料を調製する工程  (a) Step of preparing an RNA sample from a subject
( b ) 該 RNA試料に含まれる請求項 5に記載のポリペプチドをコードする R NAの量を測定する工程  (b) measuring the amount of RNA encoding the polypeptide of claim 5 contained in the RNA sample
(c) 測定された RNAの量を対照と比較する工程  (c) comparing the measured amount of RNA with the control
5. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 2 3に記載の検査方法。 5. The inspection method according to claim 23, comprising the following steps (a) to (d).
(a) 被検者から調製した cDNA試料、 および請求項 5に記載のポリべプチ ドをコードする DNAとハイプリ +ダイズするヌクレオチドプローブが 固定された基盤を提供する工程  (a) a step of providing a base on which a cDNA sample prepared from a subject, and a DNA encoding the polypeptide of claim 5 and a nucleotide probe for hypridation and soybeans are immobilized;
(b) 該 cDNA試料と該基板を接触させる工程  (b) contacting the cDNA sample with the substrate
(c ) 該 cDNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイプリ ダイズの強度を検出することにより、 該 cDNA試料に含まれる請求項 5に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定するェ 程  (c) measuring the expression level of the gene encoding the polypeptide of claim 5 contained in the cDNA sample by detecting the intensity of hybridization between the cDNA sample and a nucleotide probe immobilized on the substrate. About
( d ) 測定された請求項 5に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発 現量を対照と比較する工程  (d) a step of comparing the measured expression level of the gene encoding the polypeptide of claim 5 with a control
6. 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 2 3に記載の検査方法。 6. The inspection method according to claim 23, comprising the following steps (a) to (c).
(a) 被検者からタンパク質試料を調製する工程  (a) A step of preparing a protein sample from a subject
(b) 該タンパク質試料に含まれる請求項 5に記載のポリペプチドの量を 測定する工程  (b) a step of measuring the amount of the polypeptide according to claim 5 contained in the protein sample
( c ) 測定されたポリべプチドの量を対照と比較する工程  (c) comparing the measured amount of the polypeptide to the control.
7. 請求項 5に記載のポリペプチドをコードする DNAまたはその発現制御領 域にハイブリダイズし、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するォリゴ ヌクレオチド。 7. An oligonucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, which hybridizes to the DNA encoding the polypeptide of claim 5 or an expression control region thereof.
8. 請求項 2 7に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 請求項 5に記載のポリ 055186 8. The polynucleotide of claim 5 comprising the oligonucleotide of claim 27. 055186
- 6 4 - ペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または請求項 5に記載のポリべ プチドの活性の異常に関連した疾患の検査薬。 6. A test agent for diseases associated with abnormal expression of a gene encoding a peptide or an abnormal activity of a polypeptide according to claim 5.
請求項 7に記載の抗体を含む、 請求項 5に記載のポリペプチドをコード する遺伝子の発現の異常または請求項 5に記載のポリぺプチドの活性の異 常に関連した疾患の検査薬。  A test agent for an abnormality in expression of a gene encoding the polypeptide according to claim 5 or a disease associated with abnormality in the activity of the polypeptide according to claim 5, comprising the antibody according to claim 7.
請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドが導入された哺乳動物。 内因性の請求項 1に記載のポリヌクレオチドの発現が人為的に抑制され た哺乳動物。  A mammal into which the polynucleotide according to claim 1 or 2 has been introduced. A mammal in which the expression of the polynucleotide according to claim 1 is artificially suppressed.
マウスである、 請求項 3 0または 3 1に記載の哺乳動物。  The mammal according to claim 30 or 31, which is a mouse.
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