WO2004055051A1

WO2004055051A1 - 転写制御因子ｚｈｘ３

Info

Publication number: WO2004055051A1
Application number: PCT/JP2003/009164
Authority: WO
Inventors: Kaoru Miyamoto; Kazuya Yamada
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2004-07-01
Also published as: JP2004196700A; JP4140951B2; CA2499354C; EP1574519B1; EP1574519A1; CA2499354A1; DE60331169D1; US20070014790A1; EP1574519A4

Abstract

発明者らが既に見出していた転写リプレッサーとして機能するＺＨＸ１の生物学的役割を決定するために、酵母２−ハイブリッドシステムを用いて、ＺＨＸ１と相互作用するタンパク質の探索を行った。　その結果、新規なタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡの分子クローニング及びヌクレオチド配列を決定したところ、配列番号１から成る新規なタンパク質が見出された。このタンパク質（ＺＨＸ３）は、ＺＨＸ１と同様に、２つのジンクフィンガー（Ｚｎｆ）モチーフ及び５つのホメオドメイン（ＨＤｓ）を含み、、転写抑制活性を有することが明らかになった。

Description

明細書転写制御因子 ZHX 3 技術分野

この発明は、転写抑制活性を有するタンパク質に関し、より詳細には、肝癌に特異的な遺伝子の転写制御因子 Z HX 3に関する。従来技術

解糖系酵素遺伝子であるピルピン酸キナーゼ（PK) M遺伝子や I I型へキソキナゼ（HK I I) 遺伝子は、正常肝では発現が抑制されているが、肝発癌により誘導される。両者に共通の転写因子は、 Nuclear Factor-Y (NF— Y) であるが、正常肝細胞と肝癌細胞における N F— Yの発現には差異が認められない。従って、 NF—Yと相互作用する因子が肝癌に特異的な遺伝子発現に関与していると考えられる。

そこで、 NF—Yで特に重要である Aサブユエット（NF—YA) と相互作用する蛋白質の検索を行ったところ、 873個のアミノ酸から成り、 2つのジンクフィンガー（Zn f) モチーフと 5つのホメォドメイン (HD) を有する ZHX 1をクローユングしてきた (Yamada, . , Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) FEBS Lett. 460, 41-45)。 ZHX1は、ホメォボックスタンノク質スーパーフアミリの Z n f クラスに属し、ヒト ZHX 1の HD 1から HD 2領域を含む 272〜564のアミノ酸配列は、 NF— YAの N末端グルタミンーリツチ ADとの相互作用に必要である（Yamada, K. , Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) FEBS Lett. 460, 41 - 45)。このノザンプロット分析を行つた結果、 ZHX 1転写産物が普遍的に発現していることがわかった（Yamada, K., Printz, R. L. , Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) Bioc em. Biophys . Res . Commun . 261, 614-621; Hirano, S., Yamada, . , Kawata, H. , S ou, Z. , Mizutani, T. , Yazawa, T. , Kajitani, T. , Sekiguchi, T., Yoshino, M. , Shigematsu, Y., Mayumi , M. , and Miyamoto, K. (2002) Gene 290, 107-114)。このヒ卜 Z HX 1遺伝子は染色体 8 q上、マーカー CHLC. GATA5 OB 06及び CHLC. GATA7 GO 7の間に局在する（Yamada, K. , Printz, R. L., Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biop ys . Res . Commun . 261, 614-621)。発明者らは、この ZHX 1が転写リブレッサーとして機能し、そして核内に局在することを報告した（Yamada, K., Kawata, H., Matsuura, K., Shou, Z . , Hirano, S . , Mizutani, T . , Yazawa, T. , Yoshino, M. , Sekiguchi, T. , Kajitani, T. , and Miyamoto. . (2002) Biochem. Biophys . Res. Comm. 279, 368 - 374)。

なお、後述する本発明者らが発見した新規な転写制御因子（ZHX3) をコードすると思われる塩基配列を含む配列 (GenBank/XM 029734) 及ぴその一部 (DDBJ/ AB007855) は既にデータベースに登録されているが、前者はデータべース上で散在していた部分配列をつなげて、推定上の蛋白質として報告されたものであり、蛋白質をコードしている可能 I¹生を示唆したに過ぎない。また後者は部分的にクローユングされていた配列である力機能解析は行われていなかった。即ち、これら公開された塩基配列のコードするタンパク質が転写抑制活性を有することは全く知られておらず、またこれらの開示情報から推測することも不可能であった。発明が解決しょうとする課題

発明者らは、 ZHX1の生物学的役割を決定することを目的として、 ZHX1 が N F— Y A以外のタンパク質と相互作用し、そして遺伝子転写を制御するかどうかを調べた。そのため、発明者らは、酵母 2—ハイプリッドシステムを用いて、ラット肝臓及び卵巣顆粒膜細胞の cDNAライブラリ一において ZHX 1と相互作用するタンパク質の探索を行った。課題を解決するための手段

その結果、 ZHX1、転写共因子、 DNA結合タンパク質、 Zyx i n、アンドロゲン誘発性アルドース還元酵素のような核タンパク質、 11一 19リジン一リッチ白血病遺伝子、及ぴその他の未知のタンパク質がクローユングされ、新規なタンパク質が見出された。この新規タンパク質をコードする全長 c DNAの分子クローニング及びヌクレオチド配列を決定したところ、その新規なタンパク質は 956アミノ酸残基（配列番号 1) から成り、 ZHX1と同様に、 2つのジンクフィンガー（Zn f) モチーフ及び 5つのホメォドメイン（HDs) を含むことが明らかになった。

発明者らはこの新規なタンパク質が ZHX1と共に ZHXファミリーを形成することと結論し、そしてそれを ZHX 3と名付けた。 ZHXファミリ一は、互いにホモダイマーやへテロダイマーを形成することにより、遺伝子発現の調節に関与していると推察される。

ZHX3は、 ZHX1及び ZHX3の両方と二量体を形成するのみでなく、上記 NF— YAの ADとも相互作用する。さらに分析したところ、この ZHX3は核内に局在する普遍的な転写リブレッサーであり、そして二量体として機能することが明らかになった。

即ち、本発明は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号 1で表されるァミノ酸配列の機能部分若しくは該機能部分において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列を含むァミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はぺプチドである。

ヒトとマウスの ZHX3のアミノ酸配列を比べると、その相同性は 85. 3% であり、ヒトとラット型 ZHX3のァミノ酸配列の相同性は 87.3 %であった。ラット型 ZHX 3のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。このアミノ酸配列はヒト ZHX 3でいうところのアミノ酸配列 1 14番から 642番目までに相当する領域と考えられる。従って、 ZHX3のアミノ酸配列（配列番号 1) と 85%以上相同のアミノ酸配列を有するタンパク質はヒトの ZHX 3と同一の転写抑制機能を有するタンパク質であると考えられる。

従って、本発明はまた、配列番号 1で表されるアミノ酸配列若しくは該ァミノ酸配列に少なくとも 85 %相同のァミノ酸配列、又は配列番号 1で表されるアミノ酸配列の機能部分若しくは該機能部分に少なくとも 8 5 %相同のァミノ酸配列を含むァミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はぺプチドと表すことができる。

後述の実施例でも明らかにされるが、配列番号 1のァミノ酸配列の 3 0 3〜 5 0 2番目のアミノ酸配列はその転写抑制機能を担う部分であるといえる。従って、上記配列番号 1で表されるアミノ酸配列の機能部分は、配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 3 0 3〜 5 0 2番目のァミノ酸配列であることが好ましい。

肝癌細胞では専ら亢進した解糖系に依存してエネルギー代謝を行っていること、 Z HX 3が正常肝では肝癌特異的アイソザム遺伝子群の発現を抑制しており、癌化に伴い Z HX 3の発現が低下する力 \ 又は、 Z HX 3蛋白質が修飾されて活性を失うものと考えられる。従って、 Z HX 3の存在を検出する物質や機能を調節する薬剤を開発することにより、肝癌の診断と治療へ応用することができる。

即ち、本発明は、また、上記のタンパク質又はペプチドを有効成分とする、転写抑制を目的とする薬剤である。更に、本発明は、肝癌細胞でのみ発現する遺伝子の転写を抑制する上記いずれかのタンパク質又はべプチドである。この遺伝子は I I型へキソース又はピルビン酸キナーゼ Mであってもよい。また、本発明は、このタンパク質又はペプチドを有効成分とする肝癌の治療薬である。更に、本発明は、このタンパク質又はペプチドを用いて転写抑制因子の欠如に起因する疾患、特に肝癌を治療する方法である。

また、本発明は、上記いずれかのペプチド又はタンパク質を特異的に認識することができる抗体である。更に、本発明は、この抗体を有効成分とする、転写抑制活性を有する薬剤のスクリーニング剤である。図面の簡単な説明

第 1図は、ヒト Z HX 3の推測されるアミノ酸配列のヒト Z HX 1との比較を示す。 Z H X 3及び Z HX 1のアミノ酸配列を比較する。 2つの Z n fモチーフ及ぴ 5つの HDをそれぞれプラスの印及ぴ下線で示す。アステリスクはアミノ酸同一性を示す。破線はそれぞれのタンパク質に対応するアミノ酸配列が存在しないときのギャップを示す。それぞれ、 114〜642、 242〜615、及び 4 95〜 956のヒト ZHX 3のアミノ酸配列に対応する、クローン G 58及ぴ G 23、並びに K I A A 0395の推測されるァミノ酸配列を示す。

第 2図は、ヒト ZHX3 mRNAの組織分布を示す。それぞれのレーンは、示された組織から単離された 2 // gのポリ A+— RNAを含む。サイズマーカーは k bで左側に示す。レーン 1、心臓；レーン 2、脳；レーン 3、胎盤；レーン 4、 m-,レ―ン 5、 I S1；レ―ン 6、骨格筋；レ―ン 7、腎臓；レ―ン 8、膝臓；レーン 9、脾臓；レーン 10、胸腺；レーン 11、前立腺；レーン 12、精巣；レーン 13、卵巣；レーン 14、小腸；レーン 15、結腸；レーン 16、白血球。第 3図は、酵母 2—ハイブリッドシステム又は GSTプ^/ダウン分析を用いた、 ZHX1及び ZHX 3間の最小へテロ二量体化ドメインの同定を示す。ヒト ZH XI及び GAL4 AD-ZHX1融合構築物の図解表示は左側に示す。 Z n f 及ぴ HDはそれぞれ、ジンクフィンガーモチーフ及びホメォドメインを示す。 + 及び一のシンボルは、 GAL4 DBDに融合したヒト ZHX3の 242〜48 8のアミノ酸配列を発現する、 pDBD— G 23、及び u ACT 2の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、 ]3—ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。

第 4図は、酵母 2—ハイプリッドシステム又は GSTプルダウン分析を用いた、 ZHX 1及び Z H X 3間の最小へテ口二量体化ドメインの同定を示す。ヒト Z H X 3及び G A L 4 AD-ZHX3融合構築物の図角表示は左側に示す。 Z n f、 HD、及び Eは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメォドメイン、及びグルタミン酸一リッチ領域を示す。 +及ぴーのシンボルは、 GAL4 DBDに融合したヒト ZHX1の全コード領域を発現する、 pDBD— ZHXl (1— 8

73 )、及び p A C T 2の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、ーガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。

第 5図は、酵母 2—ハイプリッドシステム又は G S Tプノレダウン分析を用いた、

ZHX 1及ぴ Z HX 3間の最小へテロ二量体化ドメィンの同定を示す。 G S Tプルダウン分析を用いた、 Z HX 1及ぴ Z HX 3間の in vitroのへテロ二量体化。 in vitro で翻訳された³⁵ S—標識された、全長ヒト Z HX 1又は Z HX 3を、結合した GSTのみ（レーン 1、 5、及び 8) 及ぴ GSTに融合した ZHX 3の 242〜615のアミノ酸配列（レーン 3)、ヒト ZHX3 (レーン 6)又はヒト ZHX1 (レーン 9) タンパク質の全コード配列を含むセファロースビーズとィンキュベートした。上記ビーズを激しく洗浄し、そして結合したタンパク質を溶出し、そして: L O%SDS— PAGEにより分析した。相互作用シグナルはォートラジオグラフィーにより検出された。レーン 2、 4、及ぴ 7、他のレーンで示される上記反応に添加されたタンパク質の 10%がのせられた。

第 6図は、酵母 2—ハイプリッドシステム又は GSTプダウン分析を用いた、 ΖΗΧ 3の最小ホモ二量体化ドメインの同定を示す。ヒト ΖΗΧ3及ぴ GAL4 AD-ZHX3融合構築物の図解表示は左側に示す。 Z n f 、 HD、及び Eは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメォドメイン、及びグルタミン酸ーリツチ領域を示す。 +及び一のシンボルは第 3図についての説明において示すものと同じものを示す。

第 7図は、酵母 2—ハイブリッドシステム又は G S Tプノレダウン分析を用いた、 ZHX 3の最小ホモ二量体化ドメインの同定を示す。 GSTプルダウン分析を用いた、 ZHX3の in vitro のホモ二量体化。 in vitro で翻訳された、 ³⁵ S —標識された、全長ヒト ZHX3を、結合した GSTのみ（レーン 2) 又は GS Tに融合したヒト ZHX 3タンパク質の全コード配列（レーン 3) を含むセファロースビーズとインキュベートした。続く手順は第 5図についての説明において示されたともの同じである。レーン 1、他のレーンで示される上記反応に添加されたタンパク質の 10%がのせられた。

第 8図は、酵母 2—ハイブリッドシステムを用いた NF— YA及び ZHX3間の相互作用ドメインのマッピングを示す。ヒト ZHX3及ぴ GAL4 AD— Z HX 3融合構築物の図解表示は左側に示す。 Z η ί、 HD、及ぴ Eは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメォドメイン、及びグ^/タミン酸一リツチ領域を示す。 +及ぴ一のシンボルは、 GAL4 DBDに融合した NF— YAの活性化ドメインを発現する、 ρΥΑ1— 269、及び p ACT 2の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、ーガラクトシダーゼ活性の増加した及ぴ変化のない値を示す。第 9図は、酵母 2—ハイプリッドシステムを用いた NF— YA及び ZHX3間の相互作用ドメィンのマッビングを示す。 N F一 Y A及ぴ G A L 4 D B Dに融合したその欠失変異体の図解表示は左側に示す。 Q及び S Tは、それぞれ、グルタミン一リツチ及ぴセリンスレオン一リツチ領域を示す。 S I D及び D B Dは、それぞれ、サブユニット相互作用及び DN A結合ドメインを示す。 +及び一のシンポルは、； DBD及び、 GAL4 ADに融合したヒト Z HX 3の 24 2〜488のアミノ酸配列を発現する、 pAD— ZHX3 (242— 488) の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、 β—ガラクトシダーゼ活性の増加した及ぴ変化のない値を示す。

第 10図は、 ΖΗΧ 3は転写リプレッサーであることを示す。 ΗΕΚ293細胞を 2 n gの pRL— CMV、 50 n gの（カラム上に示す） SV40プロモーターダイレクティッド発現ベクター、及び 100 n gの 5 XGAL4— ; GL 3 Co n t r o 1又は pGL3— Co n t r o 1レポータープラスミドで共トランスフエタトした。 p SG424及び pGAL4— ZHX3 (1— 956) は、それぞれ、 GAL4 DBDのみ及ぴ GAL4 D BDに融合したヒト Z HX 3の全コード配列を発現する。 100 %のィ直は、それぞれ、 50 n gの p SG424 の存在下におけるレポータープラスミドについてのプロモーター活性に示された。第 11図は、 ZHX 3は転写リプレッサーであることを示す。 HEK293細胞を 2 n gの pRL— CMV、 50 n gの（カラム上に示す） SV40プロモーターダイレクティッド発現ベクター、 100 n gの 5 XGAL4— : GL 3 C o n t r o 1レポータープラスミド、示された量の p CIVIV— ZHX 1 (242 一 432)発現プラスミドで共トランスフエクトした。プラスミド（202 n g) の総量は、必要であれば、： cDNA3. lHi s— C2の添加により調節された。 100%の値は、 50 n gの p SG424及ぴ 50 n gの p c DNA3. 1 H i s— C 2の存在下におけるレポータープラスミドのプロモーター活 1"生に示された。トランスフエクシヨン 48時間後、上記細胞を回収し、そしてホタノレ及ぴゥミシィタケルシフェラーゼ活性を決定した。ホタルルシフェラーゼ活性は全ての実験にぉヽてゥミシィタケノレシフェラーゼ活†生により正規化された。それぞれのカラム及び棒は少なくとも 5のトランスフエクション実験の平均及び標準偏差を示す。

第 12図は、 ZHX 3の最小リプレッサードメインの決定を示す。 SG42 4及びさまざまな pGAL4— ZHX3構築物は、それぞれ、 GAL4 DBD のみ及び GAL4 DBDに融合したヒト ZHX 3のさまざまな欠失変異体を発現する。条件は第 10図についての説明において示されたものと同じである。それぞれの力ラム及び棒は少なくとも 5のトランスフエクション実験の平均及び標準偏差を示す。

第 13図は、 HEK293細胞における Z HX 3の細胞内局在及び核移行シグナルの決定を示す。 GFPのみ又は GFPの C末端に融合されたさまざまな切断された ZHX3タンパク質をコードする、発現プラスミド（300n g) を HE K293細胞にトランスフエタトした。トランスフエクシヨン 48時間後、 GF P融合タンパク質の細胞内局在を観察した。構築物はそれぞれのパネルの上部に示す。

第 14図は、 ZHX 3の機能ドメインを示す。 Zn f、ジンクフィンガーモチーフ； HD、ホメォドメイン； E、グルタミン酸一リッチ領域； DD、二量体化ドメイン； ID、 NF—YAとの相互作用ドメイン； RD、リプレツサードメイン； N L S、核移行シグナル。以下、実施例により本発明を例証するが、これらは本発明を制限することを意図したものではない。

実施例

本実施 ί列こおレヽて、酵母 2—ノヽイブリツドシステム、 pDsRedl— C1、X— α— gal、ヒト精巣マラソン一レディ c DNA、Advantage2PCR キット、ヒト Multiple Tissue Northern Blot及び BlotII、ExpressHybノヽイブリダィゼーシヨン溶液、及び pEGFP- C1は Clontec (Palo Alto、CA)力ら購入した。 pGEX - 4T - 2、 PGEX-5X— 1、ひ—³² PdCTP(lllTBq/腿 ol)、グノレタチオンーセファロ—ス 4 Βヽ及び a s s— メチォニン（37TBq/諷 ol) は Amers am Pharmacia Biotech (Cleveland,〇H)力ら '購入した。 HEK293 糸田包、ヒト台¾賢糸田包系【ま American Tvpe Culture Collection (Manassas、 VA) 力ら購入し。 TRIOZOL 試薬、 Superscriptェェ、 pcDNA3.1His— C プラスミド、、及び LIPOFECTAMINE PLUSは Invitrogen (Groningen、Netherlands)力ら購入した。 ExTaqD皿ポリメラーゼ、 pT7Blue-T2ベクター、及ぴ BcaBestDNAラベリングキットは TaKaRa BIOMEDICALS力、ら入手した。 pGEM— T Easyべクター、 T7 TNT Quick-結合転写 Z翻訳系、 pGL3- Control、pRL- CMV、及び二重ルシフェラーゼ分析系は Proiaega (Madison、 WI )力ら購入した。 Big Dye terminator FS cycle シークェンシングキットは Applied Biosystems Japan (Tokyo、 Japan)力ら購人した。 OPP3 IfflJJStt Stragene (La Jolla、CA)力ら人手した。 QIAGENプラスミドキトは QIAGEN (Hilden、 Germany)から購入した。

本実施例において行った試験の手順を以下に示す。試験例 1 プラスミドの構築

PACT2B 1プラスミドを既報に従って作製した（Yamada, K., Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) FEBS Lett. 460, 41 - 45)。

クローンィ匕された G 23プラスミド、 pAD— G23を E c oR iZXh o I 又は S f i I_ Bg 1 IIで消化し、それぞれの断片を pGEX— 4T— 2ベクタ一の E c oR I/Xh o Iサイト又は pGBKT 7ベクターの S f i I/B am HIサイト中へサブクローユングし、それぞれ pGST— G23及び pDBD— G 23を得た。

p AD-G 23の 250 b pの Ec oR I /H i n dill断片を pD s R e d 1— C 1の E c o R I/H i n dillサイト中へサブクローユングし、 pD s R 6 (1—逆向き023 (HD 1) を作製した。上記 S—D s R e d 1 C 1— H i n d III (配列番号 3) 及ぴ上記 A s-D s Re d lC l-S a 1 Iオリゴヌタレォチド（配列番号 4) をその後、ァユーリングし、リン酸化し、そして pD s R e d 1— C 1の H i n dlllZS a 1 Iサイト中へ挿入し、 pDs Re d l—C 1 E 1を得た。 pD s R e d—逆向き G23 (HD 1) の E c o R I "B g 1 II 断片を pD sRe d l— C 1E 1の E c oR I /B amH I中へサブクローニングし、 pD s Re d— r ZHX3 (HD 1) を作製した。生ずるプラスミドの E c oR I/Xh o I断片を pACT 2の E c o R I/Xh o Iサイト中へサブクローニングし、 _PAD_ZHX3 (242-488) を得た。

p B S lI- K I AA O 3 9 5は Dr.Takahiro Nagase (KAZUSA DNA RESEARCH INSTITUTE Japan)から賦与された。上記プラスミドの 1. 2 k b の S a 1 I /A a I断片を pD s R e d l— C 1 E 1の S a 1 I /A p a Iサイト中へサブクローユングし、 pD s Re d— ZHX3 (HD 2-5) を作製した。生ずるものの B g l II B amH I断片をpACT 2B 1の B amH Iサイト中へサブクローユングし、 PAD— ZHX 3 (498-903) を得た。 p AD-ZHX 1 (142— 873)、 pAD-ZHXl (272— 8 73)、 p AD-ZHX 1 (565— 873)、 p AD-ZHX 1 (272— 564)、 p AD-ZHX 1 (272— 432)、 p AD-ZHX 1 (430— 564)、 p A D-ZHX 1 (345— 463)、 pDBD、 pYAl— 26 9、 p YA 1- 14 0、 pYA 1— 1 1 2、 pYA141— 26 9、 p YA 1 72— 269、及び p YA 205-269を既報に従って作製した（Yamada, K. , Osawa, Η. , and Granner, D. Κ. (1999) FEBS Lett. 460, 41-45; Yamada, K. , Printz, R. L. , Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) Bioc em. Biophys . Res. Commun . 261, 614-621)

HE 293細胞からのトータル RNAを製造業者のプロトコルに従って TR I ZOL試薬を用いて調製した。逆転写一ポリメラーゼ鎖反応 (RT-PCR s) を若干の改変を伴って以前に示したように行った（Yamada, K., Printz, R. L. , Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biophys . Res . Commun. 261, 614-621)。ポリメラーゼ鎖反応 (PGR) 条件は ExT a qD NAポリメラーゼの使用を除いては、以前に示した（Yaiaada, K., Printz, R. L. , Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biophys . Res . Commun. 261, 614-621)。 S— hZHX3— Ap a I 2 (配列番号 5) 及ぴ A s— hZHX3— STOP4 (配列番号 6)、 S_hZHX3— Nc o l (配列番号 7)及ぴ A s—hZHX3— B smB I 2 (配列番号 8)、 S— hZHX3— M e t (配列番号 9 )及び A s -hZHX 3-Nc o I (配列番号 10)、 S _ h Z HX 3-HD 1 (配列番号 1 1 )及ぴ A s—hZHX3— HD 2 (配列番号 1 2)、 S-hZHX3-HD 1 (配列番号 1 1 ) 及ぴ A s— h Z HX 3— 1 506 (配列番号 13)、 S-hZHX3-l 090 (配列番号 14)及ぴ As— hZHX3 -HD 2 (配列番号 12)、 S-hZHX3-HD2 (配列番号 15 )及ぴ A s— hZHX3-HD 2 (配列番号 12)、 S— hZHX3— HD 1 (配列番号 11) 及び A s -hZHX3 -HD 1 (配列番号 16 )、及び S -hZHX3N (配列番号 17) 及ぴ As— hZHX3N (配列番号 18) の組み合わせをプライマーとして用いた。

これらの生成物を p GEM— T E a s yベクター中へサブクローユングし、それぞれ、 pGEM—T Ea s y ZHX 3 (A p a I/STOP)_N p GEM -T E a s y ZHX 3 (N c o I /B srtiB I), pGEM-T E a s y Z HX 3 (Me t /N c o I )、 p GEM— T Ea s y ZHX 3 (HD 1— 2)、 pGEM-T E a s y ZHX3 (HD 1-1506), pGEM-T E a s y ZHX3 (1090— HD2)、 pGEM-T Ea s y ZHX 3 (HD 2)、 pGEM-T E a s y ZHX 3 (HD 1 )、及び p G EM— T Ea s y Z HX3Nを得た。

GBKT 7MC S 1 (配列番号 19) 及び GB KT 7MC S 2オリゴヌクレオチド（配列番号 20) をアニーリングし、リン酸化し、そして p GBKT 7の E c o R lZB amH Iサイト中へサブクローユングし、 p G B KT 7 B 1を得た。上記 pGEM— T Ea s y Z HX 3 (A p a I ZS T O P) の A p a I /B amH I断片を pD s R e d— ZHX 3 (HD2— 5) の Ap a lZB amHI サイト中へサブクローユングし、 pD s Re d— ZHX3 (HD 2— STOP) を得た。 pGEM— T E a s y ZHX 3 (N c o I /B s mB I ) の E c o R IZB smB I断片を pD s Re d— ZHX3 (HD2— STOP) の E c o R lZB s mB Iサイト中へサブクローユングし、 pD s Re d— ZHX3 (N c o I -STOP) を得た。

S-GBKT 7-Nd e I (配列番号 έ 1 ) 及ぴ A s— G B KT 7— N c o I オリゴヌクレオチド（配列番号 22 ) をァニーリングし、リン酸化し、そして p GBKT7B 1の Nd e I /N c o Iサイト中へ挿入し、 pGBKT7NENを得た。 pD s Re d— ZHX3 (N c o l— STOP) の 2 k bの Nc o lZB amHI断片をpGBKT7NENのNc o I/BamHIサイト中へサブクロ一ユングし、： p GBKT 7— ZHX3 (Nc o l— STOP) を得た。上記！) G EM-T E a s y Z HX 3 (M e t ZN c o I ) を N c o Iで消化し、 96 0 b pの断片を: GBKT 7— ZHX3 (Nc o I—STOP) の N c o Iサイト中へサブクローユングし、 pDBD— ZHX3 (1-956) を得た。生ずるプラスミドを B a mH Iで消化し、 K 1 e n o w反応により平滑末端処理し、そしてその後 E c oR Iで消化した。上記 2. 9 k bの断片を pGEX— 5X— 1 ベクターの E c oR l/Sma lサイト中へサブクローユングし、 pGST— Z HX 3 (1-9 56) を得た。 pGST— ZHX 3 (1— 9 56) の E c oR I /Xh o I断片を pACT 2B 1の E c oR l/Xh o Iサイト中へサブクローニングし、 pAD— ZHX3 (1 -9 56) を得た。 PCRは S— hZHX3H D 1 (配列番号 1 1) 及ぴ As—hZHX3— HD 1— E c o (配列番号 23) の組み合わせをプライマーとして、： DBD— ZHX3 (1 -956) を鑤 ½として用いて行われた。 E c oR Iでの消化後、上記断片を p ACT2B 1の E c oR Iサイト中へサブクローユングし、 pAD— ZHX3 (303-364) を得た。

p SG424、 p SG424B l、 5 XGAL4-pGL 3 Co n t r o l , 及び p EGFP— C 1 E 1プラスミドは以前に示された（6、 1 3〜1 5)。 pD BD-ZHX 3 (1— 956) の 2. 9 k bの E c o R I ZB a mH I断片を p SG424B 1又は p EGF P— C 1 E 1ベクターの E c o R I /B a mH Iサイト中へサブクローユングし、それぞれ、 pGAL4— ZHX3 (1— 956) 及び pGFP— ZHX3 (1-956) を得た。 pD s R e d— ZHX 3 (HD 2— 5) の B g 1 Il/B amHI断片をp SG424B 1の B amHIサイト中へサブクローユングし、 pGAL4— ZHX3 (498〜903) を得た。： G EM-T E a s y ZHX 3 (HD 1-2), p GEM~T E a s y ZHX 3 (HD 1- 1 506)、 pGEM—T E a s y ZHX 3 (1090—HD 2)、及び pGEM— T E a s y ZHX 3 (HD 2) の E c o R I /B a mH I断片を p SG424B 1又は pEGFP— C 1 E 1ベクターの E c oR I/B am H Iサイト中へサブクローニングし、それぞれ、 pGAL4-ZHX3 (303 -555), PGAL4-ZHX3 (303— 502)、 pGFP— ZHX3 (3 03— 555)、 p GF P-ZHX 3 (303— 502)、 p GF P-ZHX 3 (3 64— 555)、 p GF P-ZHX 3 (497— 5 55) を得た。 pGEM— T E a s y ZHX 3 (HD 1) の E c o R I /B a mH I断片を p S G 424 B 1 ベクターの E c o R I/B amHIサイト中へサブクローニングし、 pGAL4 一 ZHX 3 (303- 364) を得た。

PCRは S— hZHX3— Me t 3 (配列番号 24) 及ぴ As— hZHX3— 909 (配列番号 25)、 S-hZHX3-Me t 3 (配列番号 24 )及び A s _ hZHX3-435 (配列番号 26)、 S— hZHX3— 436 (配列番号 27) 及び A s -hZHX3-909 (配列番号 25)、 S-h ZHX 3—M e t 3 (配列番号 24)及ぴ A s— hZHX3— 3 21 (配列番号 28)、 S— h ZHX 3— 322 (配列番号 29 )及び A s-hZHX3-435 (配列番号 26)、及び S -hZHX3- 1663 (配列番号 30) 及ぴ A s— h Z HX 3— B s mB I— 2 (配列番号 3 1) の組み合わせをプライマーとして、 pDBD— ZHX3 (1 — 956) を鎊型として用いて、そして S— hZHX3— 1 090 (配列番号 1 4) 及び As— hZHX3— 1 506 (配列番号 1 3) の組み合わせをプライマ一として、 pGFP— ZHX3 (303-555)を鎊型として用いて行われた。増幅された DNAも pGEM— T E a s y又は p T 7 B 1 u e _ 2 T—ベタター中へサブクローユングし、 pGEM— T E a s y ZHX3 (Me t/9 09)、 p GEM-T E a s y ZHX 3 (Me t/435) p GEM-T E a s y ZHX 3 (436/909)、 p T 7B l u e— 2 T ZHX 3 (Me t/321)、 pT 7 B l u e-2 T ZHX 3 (322,435)、 p GEM -T E a s y ZHX 3 ( 1 663/2022)、及ぴ p GEM— T E a s y ZHX 3 (1090/1 506) をそれぞれ得た。これらのプラスミドの E c o R I /B amH I断片を p SG424 B 1又は p EGFP— C 1 E 1ベクターの E c o R I/B amH Iサイト中へサブクローユングし、： GAL4— ZHX3 (1— 145)、 pGAL4-ZHX3 (146— 303)、 pGFP-ZH 3 (1— 303)、 pGFP-ZHX3 (1— 107)、 pGFP-ZHX3 (1 0 8— 145)、及ぴ p GFP-ZHX3 (146-303) をそれぞれ得た。 p G EM— T E a s y ZHX 3 (1090/1 506) の E c oR l/B amti I断片を p SG424B 1の Ec oR l/B a mH Iサイト中へサブクローニングし、 pGAL4— ZHX3 (364— 502) を得た。 pGEM— T Ea s y ZHX 3 (1663/2022) の E c o R I /B s mB I断片を p D s R e d— ZHX3 (HD 2-STOP) の E c o R Iノ B s mB Iサイト中へサブクローユングし、 pD s Re d— ZHX3 (1663— STOP) を得た。生ずるプラスミドの Ec oR IZB amHI断片をpEGFP— C l E lのEc oR IZB amH Iサイト中へサブクローユングし、 pGFP— ZHX3 (555- 956) を得た。

H i s CMC S 1 (配列番号 32) 及び H i s CMC S 2オリゴヌクレオチド (配列番号 33) をアニーリングし、リン酸化し、そして p cDNA3. 1H i s— Cの Kpn I /E c oR Iサイト中へサブクローユングし、： cDNA3. 1H i s— C 2を得た。上記 p GST— ZHX 1 (272— 432) は以前に示された（12)。 p GS T-ZHX 1 (272— 432) の 480b pの B amH I断片を p cDNA3. lH i s_C2の B amH Iサイト中へサブクローニングし、 pCMV— ZHX 1 (272-432) を得た。

以上全てのプラスミドのヌクレオチド配列を DN Aシークェンサ一 3100 (Applied Biosystems}を用いて確認した。試験例 2 ライブラリしスクリーユング

酵母転写因子 GAL 4の DN A結合ドメイン（DBD) に融合した、ヒト ZH X 1の全コード配列を発現する、 pDBD— ZHX 1 (1— 873) (pGB T 7-ZHX1 (1— 873))、及びラット顆粒膜細胞及び肝 c DNAライブラリ一の構築は既報に従って行った（Hirano, S., Yamada, K. , Kawata, Η., Shou, Ζ., Mizutani, Τ., Yazawa, Τ., Ka j itani , T., Sekiguchi, T. , Yoshino, M., S igematsu, Y., Mayumi , M. , and Miyamoto, K. (2002) Gene 290, 107- 114等）。 AH 109酵母細胞を上記 p D B D— Z HX 1 (1 -873) プラスミドで形質転換した。上記株は cDNAライブラリーをスクリ一二ングするためのおとりとして使用された。 TE/L i Ac—に基づいた高効率形質転換法がライブラリースクリ一エングに使用された（Yamada, K. , Wang, J.-C. , Osawa, Η·, Scott, D. K. , and Granner, D. K. (1998) BioTechnic^ies 24, 596 - 600)。肝及び顆粒膜細胞 c DN Aライブラリーの 1 500万及ぴ 1 100万の独立のクローンがそれぞれ、 4mM 3—ァミノトリァゾール及び X— a— g a 1で補充された、ヒスチジン一、トリプトファン一、ロイシン一、及ぴアデニン一なしの合成デキストロースプレート上にプレートされた。 33及ぴ 109の陽性クローンがそれぞれ第一形質転換体から得られた。量ィ'匕可能な 1 a c Zレポーターを含む、上記酵母株 S FY 526、及び p GBK T 7又は pDBD— ZHX 1 (1— 873) プラスミドのいずれかを、第一スクリーユング又は親ベクター、 p ACT 2における陽性クローンから単離されたプラスミドで形質転換した。第ニスクリ一二ングでは、肝及び顆粒膜細胞 c D N A ライブラリーの、それぞれ、 16及び 25のクローンが再現可能な高 —ガラクトシダーゼ活性を特に示した。 ο—二ト口フエ-ルー β _D—ガラクドシドを用いる、計量可能な )3—ガラクトシダーゼ分析を、既報に示されたように（Yamada, K. , Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) FEBS Lett. 460, 41-45; Yamada, K. , Printz, R. L. , Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biophys . Res. Commun. 261, 614— 621等）、、浸透された糸田 J3包こついて行つた。それぞれの陽性クローンからのヌクレオチド配列を B L A S T配列探索及ぴ比較プログラムを用いて G e nB a n kデータベース内に入っているものと比較した。試験例 3 cDNA末端の高速増幅（RACE)

ヒト ZHX3 cDNAの 5，末端を得るために、ヒト精巣マラソン一レディ c DNA及ぴ Ad v a n a g e 2 PCRキットを用いて 5，一RACE法を使用した。 2つの遺伝子特異的プライマー、 hZHX3— 5RACE— As 1 (配列番号 34)、及ぴ hZHX3— 5RACE— As 2 (配列番号 35 ) を使用した。上記 5' —RACE手順は製造業者が推奨するプロトコルに従って行われた。増幅された DNA断片を p GEM— T E a s yベクター中にサブクローングし、そしてそれらのヌクレオチド配列を決定した。試験例 4 P o l v (A) +RNAブロット分析

ヒト Mu 1 t i ρ 1 e T i s s u e No r t h e r n B l o t及び B l o t llを、 p GEM— T E a s y h Z HX 3 N プラスミドから単離された、ヒト ZHX 3 c DNAの0. 6 1)のー³² d C T P—標識 E c o R I断片とハイブリダィゼーシヨンし、そして B c a B e s t DNA標識キットで標識した。 E X J) r e s s H y bハイプリダイゼーション溶液を前ハイブリダイゼーション及ぴハイブリダイゼーションに使用した。前ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及ぴ洗浄の手順は供給者により提供されるプロトコルに従って行われた。試験例 5 酵母 2—ハイブリッドシステム及ぴ液体 ί3—ガラタトシダーゼ分析 ZHX 3との ZHX 1のへテロ二量体化ドメインを分析するために、 pDBD 又は PDBD— G 2 3を含む S FY5 26酵母株を、 GAL 4 ADを融合した ZHX 1のさまざまな切り取られた形態、又は!) ACT 2で形質転換した。 ZH X 1との ZHX 3のへテロ二量体化ドメイン又は ZHXのホモ二量体化ドメインをマッピングするために、 pDBD、 pDBD-ZHX 1 (1 -8 7 3) 又は p DBD— G 2 3を含む S FY5 26酵母株を、 GAL4 ADを融合した ZHX 3のさまざまな切り取られた形態、又は pACT 2で形質転換した。 ZHX 3の NF—YAとの相互作用ドメインを調べるために、 1)080又は1) 1— 2 6 9を含む S FY 5 26酵母株を、 GAL 4 ADに融合された ZHX 3のさまざまな切り取られた形態で形質転換した。 N F— Y Aの Z HX 3との相互作用ドメインをマッピングするために、 pAD— ZHX 3 (242-488) を含む S F Y5 2 6酵母株を、 GAL 4 DBDに融合された NF— YAのさまざまな切り取られた形態で形質転換した。

これらの 13—ガラクトシダーゼ活性は既報 (Yamada, K., Osawa, Η· , and Granner, D. K. (1999) FEBS Lett. 460, 41-45; Yamada, K. , Printz, R. L. , Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biop ys . Res. Commun. 261, 614-621; Hirano, S. , Yamada, K. , Kawata, H., Shou, Z. , Mizutani, T. , Yazawa, T. , ajitani, T. , Sekiguchi, T. , Yoshino, M. , Shigematsu, Y. , Mayumi, M. , and Miyamoto, K. (2002) Gene 290, 107-114) 【こ示されたよう^:、決定された。試験例 6 グルタチオン一 S—トランスフェラーゼ（GST) プルダウン分析 pGST— ZHXl (l— 873)プラスミドを既報に従って作製した（Hirano, S . , Yamada, K. , Kawata, Η. , Shou, Ζ . , Mizutani, Τ,, Yazawa, Τ. , Kajitani, Τ., Sekiguchi, Τ., Yoshino, Μ. , Shigematsu, Υ. , Mayumi, Μ. , and Miyamoto, Κ. (2002) Gene 290, 107-114)。 ΤΟΡΡ 3細胞を pGEX— 5X—1、 pGST-ZHX 1 (1— 873)、 pGST— G23又は PGST-ZHX3 (1-956) 融合タンパク質発現プラスミドで形質転換した。上記 GST融合タンパク質の調製、 in vitroで翻訳された ZHX1の³⁵ S 一標識及ぴプルダウン分析は以前に示された（Yamada, K., Printz, R. L., Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biophys . Res . Commun. 261, 614-621; Hirano, S. , Yamada, K. , Kawata, H., Shou, Z., Mizutani, T. , Yazawa, T. , Kajitani, T., Sekiguchi, T. , Yoshino, M. , Shigematsu, Y. , Mayumi , M. , and Miyamoto, K. (2002) Gene 290, 107 - 114)。上記 p D B D— Z HX 3 ( 1— 956 ) プラスミドを in vitroで翻訳された、 ³⁵ S—標識された、 Z HX 3の調製のために使用した。最後に、ビーズを等体積の 2 XSDSサンプル緩衝液に再懸濁し、そしてそれぞれの上清を前染色分子量マーカーと共に、 10°/oSDS— PAGEゲノレにのせた。上記ゲルを乾燥させ、そして FU J I X画像化プレート（Kanagawa、 Japan)に露出した。相互作用シグナルを FUJ I X BAS- 2000画像分析システムを用いて検出した。それぞれの融合タンパク質の比較の純度及ぴ量はクマシーブリリアントプル一 R— 250でのゲル染色により決定された。試験例 7 細胞培養及ぴ D NAトランスフエクシヨン

HEK293細胞を 10%ゥシ胎児血清で補充した Dulbecco, s modified Eagles- medium中で 37°Cで 5 % C O ₂インキュベータ一中で培養した。

DNAトランスフエクシヨンは L I POFECTAMI NE PLUS試薬を用いて行われた。トランスフエクシヨンに使用された全てのプラスミドは Q IA GENプラスミドキットを用いて調製され、続いて C s C 1勾 ^遠心分離を行つた。細胞（ゥエル当たり 5 X 10⁴) をトランスフエクシヨンの前日に 24ゥエルプレート中で接種した。上記 5 XGAL4-pGL 3 Con t r o lは既報に従って作製した（Tanaka, T., Inazu. T. , Yamada, Κ., Myint, Ζ. , Keng, V. W., Inoue, Y., Taniguchi, N. , and Noguchi, T. (1999) Biochem. J. 339, 111-117 )。 5 XGAL4— pGL 3 C o n t r o 1又は pGL3— Co n t r o lはレポータープラスミドとして使用された。 ZHX3 の転写活性の決定のために、 100 n gのレポータープラスミド、 211 の 1 L-CMW, 及び示された量の GAL 4 D B D— Z HX 3融合タンパク質発現プラスミドをトランスフエタトした。プラスミドの総量（152 n g) を、必要であれば、 p SG424の添加により調節した。 ZHX 3の ZHX 1とのへテロ二量体化の、 Z HX 3の転写活性への効果の分析のために、 100 n gのレポ一タープラスミド、 2 n gの; RL— CMW、 50ngの GAL4 DBD融合タンパク質発現プラスミド、及び示された量のヒト ZHX1のェ量体化ドメインの発現プラスミド、 pCMV— ZHX1 (272-432) をトランスフエタトした。プラスミドの総量（202n g) を、必要であれば、 p cDNA3. 1H i s— C 2の添加により調節した。緑色蛍光タンパク質（GFP) —融合タンパク質の観察のために、 300 n gの示された GFPプラスミドをトランスフエクトした。トランスフエクシヨン 3時間後、培地を変えた。 48時間後、上記細胞をノレシフェラーゼ分析にカけ又は Laser microscope (Olympus)で観察した ( 1 5 )。ホタノレ及びゥミシィタケルシフェラーゼ分析を製造業者の推奨するプロトコノレ（Promega) こ従って行った。ノレシフェラーゼ活†生を Berthold Lumat model LB 9501 (Wildbadヽ Germany)により決定した。ホタノレノレシフェラーゼ活†生（比較光単位）をゥミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化した。実施例 1

本実施例では、 Z HX 1による転写抑制の分子メ力二ズムを分析し、ヒト Z H X 1が既知の又は新規の転写因子と相互作用するかという問題を調べるために、 ZHX 1相互作用タンパク質のスクリーニングを行った。ヒト ZHX1の全コード配^ Jを GAL4 DBDに融合し、そしてこのキメラタンパク質を酵母 2—ハイブリツドシステム（試験例 5 ) を用いてラット肝及び顆粒膜細胞 c D N Aライブラリーをスクリーユングするためのおとりとして使用した（試験例 2)。それぞれのライブラリーの約 1. 5 10⁷及ぴ1. 1 X 10⁷の独立のクローンをスクリーユングし、そして 16及び 25クローンが再現可能な H i s+、 Ad e+、及び a— g a 1陽性特性をそれぞれ示した。これらのクローンから G A L 4 AD 融合タンパク質をコードするプラスミドを単離した。それらのヌクレオチド配列の決定後、それらを BLAST探索プログラムを用いて Ge nB a n kデータべースと比較した。その結果を表 1に示す。

The ZHXl-interacttng proteins

Protein Number of clone

BS69 corepressor 9

Nuclear protein, ataxia-telangiectasia-like protein 5

Androgen-induced alsose reductase 3

ATF-IP 2

Spinocerebellar ataxia type I 2

Z xin 2

Elf-1 1

£leven-nineteen lysine-rich leukemia gene 1

ZHX1 8

unknown 8 表 1に示すように、 BS 69共リブレッサー、核タンパク質、毛細血管拡張性運動失調様タンパク質、アンドロゲンで誘発されるアルドース還元酵素、活性化転写因子（ATF)相互作用タンパク質（ATF— I P)、脊髄小脳性運動失調 I 型、ジキシン、 E l f — 1、 11— 19リジン一リツチ白血病遺伝子、及び ZH X 1が既知のタンパク質としてクローユングされた（Hirano, S., Yamada, K., Kawata, H. , Shou, Z., Mizutani, T. , Yazawa, T. , Kajitani, T. , Sekiguchi, T., Yoshino, M., Shigematsu, Y. , Mayumi, M. , and Miyamoto, K. (2002) Gene 290, 107 - 114等）。 8クローンは未知のタンパク質をコードした。興味深いことに、 3クローン、 G23、 G58、及ぴ L 2 6は Z n f及ぴ HDモチーフの両方をコードした。詳細なヌクレオチド配列分析は、 G 23のヌクレオチド配列が G 58のそれに含まれており、そして上記ヌクレオチド配列ははじめにクローユングされたヒト KI AA0395 cDNAのそれと相似性を示したことを示した。発明者らはこの研究においてこれらのクローンの分析に焦点をおいた。 K I AA0395とは異なる上記 L 26クローンは ZHX2として他の報告において現れるであろう。次に、ヒト K I AAO 395 cDNAの 5' —非コード配列及び残りのコード領域を単離するために、 5' —RACE法（試験例 3) を用いた。遺伝子特異的プライマー及びアダプタープライマーの組み合わせを用いて、 c DNA断片をヒト精巣マラソン cDNAを錶型として PC Rにより得た。最後に、全長 cDNA の大きさが 9， 302 b pであることが決定された。

非常に興味深いことに、全長_CDNAは965アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを有し、そしてそのタンパク質の推定されたァミノ酸配列は Z H X 1に加えて 2つの C y s ₂-H i s ₂—型 Z n fモチーフ及び 5つの HDを含む。このアミノ酸配列を配列番号 1に示す。発明者らはこのタンパク質を ZHX 3と呼ぶ。記号 ZHX 3は、ジンクフィンガー及びホメォボックス 3の名前から、 HUGO Nomenclature Committeeに提示された。第 1図にこのヒト ZHX3の推測されるァミノ酸配列のヒト Z H X 1との比較を示す。

このヒト ZHX3タンパク質は予測された分子量 104. 7キロダルトン及び等電点 5. 68を有する。上記 pAD— G58及び pAD— G23がそれぞれ Z HX3の 114〜642の及び 242〜615のアミノ酸配列をコードする一方で、上記 KI AA0395はヒト ZHX 3の 498〜 956のアミノ酸配列をコ一ドする。転写制御ドメインとして働きうるグルタミン酸一リツチ領域は 670 〜 710のァミノ酸配列中に存在し、そして推定される核移行シグナルは存在しない。 ZHX 3及ぴ ZHX 1の間のコード領域におけるヌクレオチド配列及びァミノ酸配列における相同性は、それぞれ 46. 9%及ぴ 34. 4%であった。次に、ヒト Z HX 3 mRNAの組織分布をノザンブロット分析（試験例 4) により決定した。第 2図に示すように、ヒト ZHX 3 mRNAは複数のバンド、長さ 9. 4、 7. 3、 5. 0、及ぴ 4. 6 kbとして検出された。発明者らのクローニングされた揷入物の大きさは 9， 302 b pであったので、それは最長の転写物とほぼ同じである。強さは組織間でさまざまであつたが、これらの転写物は調べた全ての組織において観察された。このことはヒト ZHX3 mRNAは普遍的に発現されることを示している。実施例 2

本実施例では、 Z H X 1のどのドメインが Z H X 3との相互作用に必要とされるかという問題を調べるために、 ZHX 1及ぴ ZHX3の間の最小へテロ二量体化ドメインのマッピングを行った。酵母株 SFY526を、 GAL4 DBDのみを発現する pDBD又は GAL4 D BDに融合された Z HX 3のアミノ酸残基 242〜6 1 5をコードする pDBD— G23で形質転換した。上記 2つの酵母株はレポーター酵母として使用された。 GAL4 ADのみを発現する p AC T 2又は GAL 4 ADに融合された ZHX 1のさまざまな切断された形態をコードするいくつかのプラスミドは獲物プラスミドとして使用された。 pDBDを含むレポーター酵母をこれらの獲物プラスミドで形質転換したとき、それらは低 /3_ガラクトシダーゼ活个生を示した（データは示していない）。さらに、 pDBD 一 G23を含むレポーター酵母を pACT2、 p AD-ZHX 1 (56 5— 87 3)、 p AD-ZHX 1 (430— 564)又は p AD— ZHX 1 (345— 46 3) で形質転換したとき、これらの酵母も低 —ガラクトシダーゼ活性を示した (第 3図）。対照的に、上記酵母を pAD— ZHX 1 (142— 873)、 p AD -ZHX 1 (272— 873)、 p AD-ZHX 1 (272-564) 又は pAD -ZHXl (272— 43 2) で形質転換したとき、高 ]3—ガラクトシダーゼ活性が観察された。上記 pAD— ZHX l (272-432) は ZHXlの 242 〜43 2のアミノ酸残基をコードする。

次に、 ZHX 3のどのドメインが ZHX 1との相互作用に必要とされるかの問題を決定した。酵母株 SFY526を、 GAL4 D B Dに融合された Z HX 1 の全コード配列をコードする pDBD— ZHX 1 (1-873) 又は pDBDで形質転換した。上記 2つの酵母株はレポーター酵母として使用された。上記 pA CT 2又は GAL 4 ADに融合された ZHX 3のさまざまな切断された形態をコードするいくつかのプラスミドは獲物プラスミドとして使用された（第 4図)。 pDBDを含むレポータ一酵母をこれらの獲物プラスミドで形質転換したとき、それらは低 /3—ガラクトシダーゼ活性を示した（データは示していない)。これらの酵母は pDBD— ZHX 1 (1-873) を含むレポーター酵母を p AD— G 23又はpAD— ZHX3 (242-488) で形質転換したときのみ、高 j3— ガラクトシダーゼ活性を示した。上記 pAD— ZHX3 (242— 488) は Z HX3の 242〜488のアミノ酸残基をコードする。

これらの結果は ZHX 1及ぴ ZHX 3は HD 1を含むそれぞれの領域を通してへテ口二量体化することを示す。

次に、 ZHX1及び ZHX 3の間の特異的相互作用を実証するために in vitro GSTプノレダウン分析 (試験例 6) を行った。発明者らは 4つのプラスミド、 G 3丁のみを発現する 0£ ー5 ー1、 GSTに融合されたヒト ZHX3の 2 42〜6 1 5のアミノ酸配列をコードする pGST— G23、 GSTに融合されたヒト ZHX3タンパク質の全コード領域を発現する pGST— ZHX 3 (1— 956)、及び GSTに融合されたヒト ZHX1タンパク質の全コード領域を発現する pGST— ZHX 1 (1 -873) をそれぞれ使用した。これらのタンパク質を大腸菌で発現させ、そしてグルタチオンーセファロースビーズに固定した。上記 in vitroで翻訳した、 ³⁵ S—標識した、全長ヒト ZHX 1は、 GST— G. 23及ぴ03丁一∑^[ 3 (1-956) に結合するが、 GSTのみには結合しないことがわかった（第 5図、レーン 3及び 6)。さらに、上記 in vitroで翻訳した、 ³⁵S—標識した、全長ヒト ZHX3は GST— ZHX 1 (1— 873) に結合するが、 GSTのみには結合しないことがわかった（第 5図、レーン 9)。対照的に、プログラム化されていない網状赤血球溶解物は上記タンパク質のいずれにも結合しなかった（データは示していない)。

これらの結果は、 ZHX 1は in vivo及び in vitroの両方で、 ZHX 3とへテ口二量体を形成することができることを示す。実施例 3

本実施例では、 Z HX 1はホモ二量体を形成するので、酵母 2—ハイブリッドシステム（試験例 5) を用いて ZHX 3のホモ二量体の形成を調べるために、 Z HX3の最小ホモ二量体化ドメィンのマッビングを行った。 p D B D又は p D B D-G23を含む 2つの SFY526酵母株をレポーター酵母として使用した。発明者らはさまざまな獲物プラスミド、 pACT 2、 pAD— G23、及ぴ pA D-ZHX3 (242— 488)、 p AD-ZHX 3 ( 303— 364 )、及び p AD-ZHX 3 (498-903) をそれぞれ調製した。これらのプラスミドをレポーター酵母に形質転換し、そしてーガラタトシダーゼ活性をそれぞれの場合において決定した（第 6図）。 pDBDを含むレポーター酵母を上記プラスミドで形質転換したとき、それらは低 13—ガラクトシダーゼ活性を示した（データは示していない）。さらに、 £)080— 023を含むレポーター酵母を1) 〇丁2、 p AD-ZHX 3 (303— 364)、及び pAD— ZHX3 (498— 903) で形質転換したときも、非常に低い一ガラクトシダーゼ活性が検出された。対照的に、 pAD_G23又は pAD— ZHX3 (242— 488) で形質転換した酵母は高 ]3—ガラタトシダーゼ活性を示した。これらの結果は、 Z HX 3は 2 42〜 488の領域を介してホモ二量体を形成することができることを示す。次に、 ZHX 3のホモ二量体化を実証するために in vitro GSTプルダウン分析を行った。発明者らは 2つのプラスミド、 pGEX— 5X—1及ぴ pGS T-ZHX3 (1-956) をそれぞれ使用した。これらのタンパク質を大腸菌で発現させ、そしてダルタチオン一セファロースビーズに固定した。上記 in vitroで翻訳された、 ³⁵ S—標識された、全長ヒト ZHX3は GST— ZHX3 (1 -956)に結合するが GSTのみには結合しないことがわかった（第 7図）。対照的に、プログラム化されていない網状赤血球溶解物は上記タンパク質のいずれにも結合しなかった（データは示していない）。これらの結果は、 ZHX3は in vivo及び iv vitroでホモ二量体を形成することができることを示す。実施例 4

本実施例では、 Z HX 3が NF— YAの ADとも相互作用することを調べた。ヒト ZHX 1ははじめに NF— YAと相互作用するタンパク質としてクローェングされた（Yamada, K. , Printz, R. L. , Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biophys . Res. Co扁 un. 261, 614 - 621)。本実施例では、 ZHX3の NF—YAとの相互作用を酵母 2一ハイブリッドシステム（試験例 5) を用いて調べた。発明者らはそれぞれ pDBD又は pYAl— 269で形質転換した 2つのレポーター酵母株を使用した。上記 p Y A 1— 269は GA L4 DBDと融合した NF— YAの ADを発現する。上記 pACT2、 p AD 一 G23、 p AD-ZHX 3 (498— 903)、 p AD-ZHX 3 (242— 4 88)、 p AD-ZHX3 ( 303— 364)、及ぴ p AD— Z HX 3 (1— 95 6) をレポーター酵母株に形質転換し、そしてそれらの /3—ガラクトシダーゼ活性を決定した。 pDBDを含むレポーター酵母をこれらのプラスミドで形質転換したとき、それらの |3—ガラクトシダーゼ活性はかなり低いことがわかった（データは示していない)。第 8図中に示すように、 p YA1— 269を含むレポータ一酵母を pACT2、 p AD-ZHX 3 (498— 903) 又は pAD— ZHX 3 (303-364) で形質転換したときも、それらの —ガラクトシダーゼ活性低かった。しかしながら、上記酵母を pAD— G23、 pAD-ZHX3 (1 — 956) 又は pAD_ZHX3 (242-488) で形質転換したとき、高い値の β—ガラクトシダーゼ活性が検出された。これらの結果は、 Ζ ΗΧ 3は N F — ΥΑの ADと相互作用し、そして残基 242〜488のアミノ酸配列がこの相互作用に重要であることを示す。

次に、酵母 2—ハイブリッドシステム（試験例 5) を用いて NF— ΥΑの ΖΗ X 3との最小相互作用ドメインを同定した。第 9図に示すように、 NF— ΥΑの A Dはそれぞれグルタミンーリツチ及びセリン/スレオニン一リッチドメインから成る。 PAD— ZHX3 (242-488) を含む S FY 526酵母株がレポ一ター酵母として使用された。 GAL4 DBDに融合された NF— YAの切断された形態を発現する、さまざまなプラスミドを上記酵母に形質転換し、そしてそれらのガラクトシダーゼ活性を決定した。その結果、どちらも NF— YA の 141〜269のアミノ酸配列を含む、： YAl— 269又は pYAl 41- 269を含む酵母のみが高レ、値の一ガラタトシダーゼ活性を示した。これらの結果は、 NF— YAのセリン /スレオニン一リツチ ADは ZHX3との最小相互作用ドメインを表すことを示す。実施例 5

本実施例では、 ZHX 3が転写リプレッサーであることを確認するために、哺乳類のヮンハイブリッドシステム（試験例 7 ) を用いて Z HX 3の転写の役割を決定した。 GAL4—結合部位の 5つのコピーが pGL 3— C o n t r o 1の S V40プロモーターの上流に揷入された、上記 5 XGAL4-pGL 3 C o n t r o 1プラスミドを、レポータープラスミドとして使用された（14)。 2つのェフエクタ一プラスミド、 GAL4 DBDのみを発現する p SG424、及び G AL4 DBDの C末端に融合されたヒト ZHX 3の全コード領域を発現する p GAL4-ZHX3 (1 -956) を調製した。第 10図及び第 1 1図に示すように、 5 XGAL4— pGL 3C o n t r o 1及びさまざまな量の p G A L 4— ZHX 3 (1- 956) を HEK293細胞中に共トラスフエタトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は用量依存的な様式で減少された。上記最高阻害は 50 n gの PGAL4— ZHX 1 (1— 956) で得られた。対照的に、 GAL4—結合部位の 5つのコピーを欠く上記 p GL 3— C o n t r o 1を p SG424又は PGAL4-ZHX3 (1— 956) でトラスフエタトしたとき、上記ルシフエラーゼ活性は変化しなかった（第 10図）。これらの結果は、上記 GAL4— ZH X 3融合タンパク質は GA L 4結合部位依存的な様式でルシフェラーゼ活性を減少させることを示し、 ZHX3は転写リブレッサーとしてはたらくことを示す。発明者らはその後 ZHX3の ZHX 1とのへテロ二量体化はその転写リプレツサー活性に必要であるかどうかの問題を調べた。発明者らは、 ZHX1の 272 〜423のアミノ酸配列が発現される、 pCMV— ZHX3 (272— 432) を調製した。この領域は ZHX 1の ZHX3との二量体化ドメインと一致する 1S ZHX 1のリプレッサードメインは含まない（Yamada, K., Kawata, H., Matsuura, K. , Shou, Ζ . , Hirano, S . , Mizutani, Τ. , Yazawa, Τ., Yoshino, Μ. , Sekiguchi, Τ . , Kajitani, . , and Miyamoto . Κ. (2002) Biochem. Biophys . Res. Comm. 279, 368-374 )。従って、このタンノク質の過剰発現は ZHX 1のドミナントネガティブ形として機能する。上記プラスミドを上記分析システムにおいて共トラスフエクトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は用量依存的な様式で増加された（第 1 1図)。対照的に、 p cDNA3. 1H i s C— 2の共トランスフエクトはルシフェラーゼ活性に全く影響しなかつた。これらの結果は、 ZHX3の ZHX 1とのへテロ二量体化はリプレッサー活 4の必要条件であることを示す。

最後に、 ZHX 3の最小リプレッサードメインを決定するために、上記 5 XG AL4-pGL 3 Co n t r o 1をさまざまなプラスミド、 pGAL4— ZHX 3 (1— 145)、 pGAL4-ZHX3 (146— 303)、 p GAL 4-ZH X 3 (303— 555) 又は pGAL4— ZHX3 (498— 903) でトランスフエタトした（第 1 2図)。残基 303〜555のアミノ酸配列を発現する pG AL4-ZHX 3 (303— 555) のみが、ルシフェラーゼ活性における減少を引き起こした。

より詳細な分析のために、発明者らはエフェクタープラスミド、： pGAL4— ZHX3 (303— 502)、 pGAL4-ZHX 3 (303- 364) 又は pG AL 4-ZHX 3 (364-502) を調製した。： GAL4— ZHX 3 (30 3-502) を上記レポータープラスミドでトランスフエタトしたときのみ、上記ノレシフェラーゼ活性は減少された（第 1 2図)。これらの結果は、 Z H X 3の残基 303〜 502のァミノ酸配列はリプレッサー活性に重要であることを示す。実施例 6

本実施例では、 ZHX 3タンパク質の細胞内局在を調べるために、 GFP— Z HX3融合タンパク質発現系を使用して、 Z HX 3の細胞内局在の決定及び核移行シグナル（NLS) のマッピングを行った。このため、 GFPに融合したZH X 3のさまざまな切断された形態を調製した。これらのプラスミドを HEK29 3細胞中にトランスフエクトし、そして GFP融合タンパク質の細胞内局在を観察した。 GFPタンパク質のみをコードする pEGFP— C 1 E 1は細胞全体において観察された（第 1 3図）。対照的に、全長 ZHX3が GFPの C末端に融合された GFP— ZHX3 (1-956) は核内に局在した。 2«[ 3の：^1^3を決定するために、さまざまなプラスミドをトランスフエタトした。 pGFP— Z HX 3 (1— 303)、 pGFP-ZHX 3 ( 303— 555 )、及び p G F P— ZHX3 (555-956) をトランスフエタトしたとき、 pGFP— ZHX3 (1— 303) 及び pGFP— ZHX 3 (303— 555) の両方が核内に局在した。対照的に、 pGFP— ZHX3 (555-956) をトランスフエタトしたとき、上記タンパク質は核外に局在した。これらの結果は、 ZHX3は 2つの NL S及び核輸出シグナル (NES) を含むことを示す。最小の N L S sをマツビングするために、さまざまなプラスミドを構築した。 3のプラスミド、 pGF P-ZHX3 (1— 107)、 pGFP-ZHX3 ( 364— 555 )、及び p G FP-ZHX3 (497- 555) をトランスフエタトしたときのみ、 ZHX3 の核局在が観察された。これらの結果は、 ZHX3は GFP融合タンパク質として核内に局在することができ、そして ZHX3の 2つの NL Sはそれぞれ 1~1 07、及ぴ 49 7〜 555のァミノ酸配列に位置することを示す。上記実施例にて、 ZHX—1相互作用タンパク質の探索を行い、主にそれらのうち新規転写リブレッサー ZHX3を分析し、そしてその機能ドメインをマツピングした。 ZHX 3の最小機能ドメインは第 14図に要約される。 ZHX1はもちろん、 ZHX 3は 2つの Z n fモチーフ及び 5つの HDを含み、ホモ二量体を形成し、 NF— YAの ADと相互作用し、そして核内に局在する。さらに、 ZH X3 mRNAは普遍的に発現される。この発見から、発明者らは、 ZHX 1及び ZHX 3の両方が同じファミリー、すなわち、 ZHXファミリーの構成員であることを結論づけた。 ZHX 1及ぴ ZHX3の全アミノ酸配列の相同性は 34. 4%であったが、上記 2つの Zn fモチーフ及ぴ 5つの HDは高く保存されていた。 ZHX 1及ぴ ZHX 3の間の Z n f 1、 Zn f 2、 HD 1、 HD 2、 HD 3、 HD 4、及び HD 5のァミノ酸配列における相同性は、それぞれ 50. 0、 45. 5、 6 1. 7、 50. 0、 53. 3、 43. 3、及び 33. 3%であった。上記 HD4は他のドメインよりも非常に低い相同性示した。独特のグルタミン酸一リツチ酸性領域が ZHX 3の残基 670〜71 0のアミノ酸配列中に局在する（第 1図及ぴ第 9図）。一般的に、上記 Z n fモチーフ、 HD、及び酸性領域は転写因子の機能特性に責任がある。例えば、 60アミノ酸から成る、上記 Zn fモチーフ及び HDの両方は同族の DNA配列に結合するのに必要とされ、上記グルタミン酸一リツチ領域は転写活性に関係し、そして塩基性領域は上記 D B D又は N L Sでめる（Gehring, W. J., Affolter, M., and Burglin, T. (1994) Annu. Rev. Biochem. 63 , 487-526 等）。

ZHX 3は ZHX 1とへテロ二量体を形成するのみでなく、ホモ二量体をも形成する。 ZHX 3の242〜488のアミノ酸配列はこれらの二量体化に必要及び十分である (第 3図〜第 7図）。 ZHX 1の ZHX3とのホモ及びへテロ二量体化の最小ドメインは ZHX 1の 272〜432のアミノ酸配列にマッピングされた（第 3図〜第 5図)。これらの領域は HD 1を含む力 S、 HD1のみは二量体化できない（第 3図〜第 9図)。 HD1を含むより広範な領域が二暈体化に必要とされる。さらに、 ZHX3及ぴ ZHX 1の両方が NF—YAの ADと相互作用する；前者は上記 N F— Y Aのセリンスレオニン一リツチ ADと、そして後者はダルタミンーリツチ ADとそれぞれ相互作用する（第 8図、第 9図）。. ZHX3のNF 一 Y Aの ADとの相互作用ドメインは ZHX 3の二量体化ドメインと同じ領域にマッピングされた（第 8図、第 9図）。対照的に、ヒト ZHX1の HD1〜HD2 領域を含む 272〜5 64のアミノ酸配列はその相互作用に必要とされる (Yamada, . , Osawa, H. , and Granner, D. K. (1999) FEBS Lett. 460, 41-45)。 ZHX 1の ZHX 3とのへテロ二量体複合体が NF—YAの異なる A Dと相互作用するかどうかの問題は決定されないままである。

ZHX 3は転写リプレッサーである（第 10図〜第 12図)。 ZHX3の最小リプレッサードメインは二量体化及び相互作用ドメインの両方と重なる領域にマツビングされる。興味深いことに、 ZHX1のへテロ二量体化ドメインの過剰発現は、リプレッサー活性には責任はないが、 ZHX 3のリプレッサー活^における減少を引き起こした（第 11図)。このことは、 ZHX 3は本質的にリプレッサー活性をもたず、そして上記観察された活性は二量体化のパートナーである、リプレッサードメインが酸性領域の C末端に局在する（Yamada, K., Kawata, H., Matsuura, K. , Shou, Ζ . , Hirano, S., Mizutani, T. , Yazawa, Τ . , Yoshino, Μ. , Sekiguchi, Τ·, Ka itani, Τ., and Miyamoto . Κ. (2002) Biochem. Biophys . Res. Comm. 279, 368-374) ZHX 1のリプレッサー活 1 "生に因るものであることを示唆する。しかしながら、 ZHX3の二量体化ドメインは真実にリブレッサー活性を有することを証明することはできない。 ZHX 3が DNA結合タンパク質であるかどうかは明らかでない。その結果として、 H D 1領域を含む Z HX 3の領域は多面発現性のドメイン；ホモ及び Z HX 1とのヘテロ二量体化ドメイン、 NF— YAの ADとの相互作用ドメイン、及ぴリプレッサードメインであるように見える。転写制御領域は転写リブレッサ^"として機能するために共因子と相互作用する (Hu, X., and Lazar, M. A. (2000) Trends Endocrinol . Metab. 11, 6- 10等)。これらの共因子は mS i n 3 A/B, ヒストンデァセチレース、及び受容体転写の核共リプレッサー（N— C o R)/サイレンシング仲介物質を含む。 ZHX1相互作用タンパク質として、発明者らは 2つの共リプレッサー、 BS 6 9及び ATF— I P (表 1)をクローニングした（Hateboer, G., Gennissen, A. , Ramos, Υ. F. Μ. , Kerkhoven, R. Μ. , Sonntag-Buck, V., Stunnenberg, Η. G. , and Bernards . R. (1995) EMBO J. 14, 3159-3169 等）。 B S 69ははじめに 289 Rアデノウイルスタイプ 5 E l Aタンパク質の ADと直接相互作用するタンパク質として同定された。 BS 69は、少なくとも部分的には、 B S 69の MYNDドメインの共リプレッサー N— C o Rとの相互作用を通して、抑制を仲介することも報告されている（Masselink, H., and Bernards, R. (2000) Oncogene 19, 1538-1546)。対照的に、 ATF— I Pは、 RN Aポリメラーゼ I Iホロェンザィムを含む、基本の転写機構（TF I I E及び TF I I H)のいくつかの成分と相互作用する（DeGraeve, F., Bahr, A. , Chatton, Β., and Kedinger, C. (2000) Oncogene 10, 1807 - 1819)。 ZHX1及び ZHX3が転写リプレッサーとしてはたらくとき、これらの共リプレッサーと相互作用することができ、それゆえ遺伝子転写を抑制する。

さらに、 ZHX 1及ぴ ZHX3の両方は NF— YA相互作用タンパク質である。 NF— Yは共ァクチベータ一、 p 300及び p 300Z環状 AMP応答エレメントー結合タンパク質一結合タンパク質一関連因子（P/CAF) と関連すること力 ^s報告されてヽる (Mantovani, R. (1999) Gene 239, 15—27)。特に、ヒストンァセチルトランスフェラーゼ活性を伴う PZCAFは NF— YAと相互作用し、転写的に活性な NF—Y複合体を形成する（Mantovani, R. (1999) Gene 239, 15-27)。それゆえ、 ZHX1、 ZHX 3、及び NF— YA間の相互作用の組み合わせは N F一 Yの転写活性に影響するようである。例えば、 Z H X 1又は ZHX3のどちら力、又は両方は、 PZCAFの上記 NF— Yとの関連を高め又は妨害することができ、それゆえ NF— Y活性を制御する。さらに、共リブレツサーを伴う転写リプレッサー、 ZHXファミリーの構成員は、上記 NF— YAと直接関連することができ、それゆえ、 NF— Y活性を阻害する。どちらの場合においても、 Z H Xタンパク質カ^、くつかの N F— Y制御可能な遺伝子の制御に参加する可能性がある。

ZHX3 mRNAは普遍的に発現される力骨格筋、腎臓、及び精巣においてより高く発現されることがわかった（第 2図)。 ZHX3 mRNAの大きさはノザンブロット分析により決定されるように複数であった。クロー-ングされた挿入物は 9， 302 b pを含み、そして上記大きさは ZHX 3の最も大きな転写物と同じである。ヒト ZHX 3遺伝子の探索がヒトゲノムプロジェクトにより編集されたデータベースを用いて行われたとき、それは染色体 20 qに局在することがわかった。このことは、 ZHX 3遺伝子はハプロイドヒトゲノム当たり単一のコピーとして存在することを;^す。 ZHX3 c DNAのヌクレオチド配列は、複数のポリアデニル化シグナルが 3，一非コ一ド領域内に存在することを明らかにした。それゆえ、より小さな大きさの mRNAは、他の ZHX3関連の mRN Aの存在よりもむしろ単一の遺伝子からの異なるポリアデニル化シグナルの使用により産生されうるようである。

ZHX3の全コード領域が上記 GF Pの C末端に融合されたとき、それは核内に局在した（第 13図）。 ZHX3の2っのNLS、それぞれ 1〜107、及ぴ 4 97〜555のアミノ酸配列があった。その一方で、上記 GFPに融合された Z ΗΧ· 3の 498〜 956のァミノ酸配列は細胞全体ではなく、核外に排他的に局在する。 GFPのみ又は NLSを欠く GFP— ZHX 1融合タンパク質は細胞全体に局在する（第 13図）。このことは、 ∑«[ 3の領域は £3を含むことを示す。それゆえ、 ΖΗΧ 3は 1つの分子内に 2つの NLS及び 1つの NE Sを含む、より複雑なタンパク質である。 ZHX 1を含む多くの他のタンパク質においては、上記 N L Sは塩基ァミノ酸残基のクラスターにマッピングされたことが報告されてヽる Yamada, K. , Kawata, H. , Matsuura, Κ. , Shou, Ζ., Hirano, S., Mizutani, T., Yazawa, T. , Yoshino, Μ. , Sekiguchi, Τ. , Kajitani, Τ. , and Miyamoto . Κ. (2002) Biochem. Biophys . Res. Co腿. 279, 3⁶⁸ - 374等)。この領域はインポルチン aの如き、核輸入タンパク質と関連し、そしてそれから細胞質から核へ移行される（Kaffman, A., and 0* Shea, E. K. (1999) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 291 - 339)。し力、しながら、 2^1 3の2っの]^1^は塩基性領域には局在せず、そして以前に報告された NE Sとは相同 1"生を示さないので、 ZHX 3は核へ移行されるための他の分子と関連しうる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列若しくは該ァミノ酸配列にぉ、て 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号 1で表されるァミノ酸配列の機能部分若しくは該機能部分において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列を含むァミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はぺプチド。

2 . 前記機能部分が、配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 3 0 3〜 5 0 2番目のアミノ酸配列である請求項 1に記載のタンパク質又はぺプチド。

3 . 請求項 1又は 2に記載のタンパク質又はペプチドを有効成分とする、転写抑制を目的とする薬剤。

4 . 肝癌細胞でのみ発現する遺伝子の転写を抑制する請求項 1又は 2に記載のタンパク質又はべプチド。

5 . 前記遺伝子が I I型へキソース又はピルビン酸キナーゼ Mである請求項 4 に記載のタンパク質又はぺプチド。

6 . 請求項 4又は 5に記載のタンパク質又はべプチドを有効成分とする肝癌の治療薬。

7 . 請求項 1又は 2に記載のぺプチド又はタンパク質を特異的に認識することができる抗体。

8 . 請求項 7に記載の抗体を有効成分とする、転写抑制性を有する薬剤のスクリーニング剤。