WO2004050874A1 - 病原菌応答性プロモータ - Google Patents

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WO2004050874A1
WO2004050874A1 PCT/JP2003/015310 JP0315310W WO2004050874A1 WO 2004050874 A1 WO2004050874 A1 WO 2004050874A1 JP 0315310 W JP0315310 W JP 0315310W WO 2004050874 A1 WO2004050874 A1 WO 2004050874A1
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Hirofumi Yoshioka
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Definitions

  • the present invention relates to a promoter having responsiveness to a pathogenic bacterium, and a pathogen-resistant plant using the same.
  • isoprenide synthesis rapidly changes from sterol-dalico-alkaloid synthesis to sesquiterpine-differentialexin synthesis by inoculation with elicitor or incompatible race. This phenomenon is due to the coordinated regulation of squalene sesynthase and sesquiterpene cyclase, which are involved in the sterol-dalicoalkaloid synthesis pathway and the branching point of the isoprenoidalfalexin synthesis pathway, which are involved in the rate-limiting step of the isoprenoid synthesis system, respectively. (See Reference 8).
  • Potato sesquiterpene cyclase is a betispyradine synthase and was named potato betispyrazin synthase (PVS) (see Reference 53). It has been reported that the PVS activity of potato tuber tissue is significantly increased by inoculation and treatment with H1VC, an elicitor derived from the fungus body wall of potato blight (see Reference 54). It is also known that elicitor treatment activates the sesquiterpenoid synthesis pathway in tobacco plants and synthesizes psipsidiol, a kind of phytoalexin (see References 42 and 48). . Recently, these phenomena have become apparent at the gene expression level.
  • PVS and squalense synthase cDMA in potatoes were isolated and Northern analysis was performed using these clones as probes and RNA extracted from potato tubers. Transient accumulation induction was observed. On the other hand, it has been shown that squalense synthase induces mRNA accumulation by injury, but suppresses accumulation when affiliated with affinity and non-affinity races (Ref. 53) . However, this report contradicts the fact that phytoalexin is biosynthesized only in the inoculation of incompatible races and stops the progress of the bacteria (see Reference 40). Many plant genes form multigene families, and it is generally known that each isogene plays a different role in organ specificity and metabolic changes in response to stimuli. It has been reported that PVS genes in potato plants form a multigene family, and that members of PVS1 to 4 exist (see Reference 53). However, details on the expression trends of each of these members are unknown.
  • Rome is, T., Pi edras, P., Zhang, S., KI ess ig, DF, Hi rt, H. and Jones, JDG (1999) Rapid Avr9- and Cf-9-dependent activation of MAP kinase s in tobacco cel l cultures and leaves: convergence of res istance gene, eli ci tor, wound, and sal i cylate responses.
  • Po I y acry I am i de disc electrop ho res is of the soluble leaf proteins f rom N i co ti ana tabacum var. 'Sams un' and 'Samsun NN '. Vi rol ogy 40, 199-211.
  • MAPK group (2002) Mi togen-act i vated protein kinase cascades in plants: a new nomenc Iature. Trends Plant Sc i. 7: 301-308.
  • the present invention has been made in view of the above background, and describes a promoter (pathogen responsive mouse) specifically responding to infection with a pathogenic bacterium, and a method for producing a pathogen-resistant plant using the same. The purpose is to provide.
  • the present inventors have attempted to obtain, from a potato plant, a promoter having specific responsiveness to a disease-producing fungus, which is a representative of the pathogenic bacteria.
  • a potato genome library was constructed and used to attempt to decode the sequence of PVS3. After repeated screenings, the PVS3 genomic DNA sequence was successfully determined. Based on the determined sequence information, the PVS3 promoter region was estimated and its function was examined, and its responsiveness to Plasmodium was confirmed. In order to examine the function of the putative promoter region in more detail, first, a potato transformant in which the putative promoter overnight region was linked upstream of the GUS gene was created. As a result of various experiments using this transformant, GUS staining was not observed by excision (injury) of leaf tissue, while GUS staining was confirmed by inoculation of the disease-affecting race. Was confirmed to be responsive to epidemic bacteria, ie, pathogen-specific.
  • the present inventors succeeded in obtaining a promoter (pathogen-responsive promoter) that specifically responds to infection by a pathogenic bacterium.
  • the use of this promoter makes it possible to produce plants that express specific genes only when infected with pathogenic bacteria. That is, in the transformant obtained by introducing the gene linked to the promoter, the introduced promoter is specifically induced with respect to infection by a pathogenic bacterium, and as a result, the transgene is expressed.
  • a transgene that activates the defense response it is possible to create plants whose defense response is specifically activated against pathogen infection, that is, plants with high resistance to pathogen infection It becomes.
  • gene transcription is generally carried out by a number of salts called cis sequences in the promoter region. It is initiated by the binding of a protein factor called a transcriptional activator to a sequence of more than 10 bases from the base (Reference 66). Therefore, identifying the cis sequence is the first step in elucidating the transcription mechanism.
  • the present inventors next developed a chimeric gene (PVS3: GUS) of the PVS3 promoter sequence and the GUS gene, in which a part of the above-mentioned putative promoters that were successfully identified were sequentially deleted, into an agrobacterium (Agrobacterim t o faciens). ) was transiently introduced into leaf tissue to examine PVS3 promoter activity.
  • PVS3 is an enzyme that catalyzes the synthesis of phytolexin in potato plants.However, potato plants and other Solanaceae plants are common in that phytoalexin is a terpene-based compound. The pathway for synthesizing tolexin is common.
  • the promoter (PVS3 promoter) of the present invention is not limited to Solanaceae plants, but also to Brassicaceae (see Reference 57) in which the importance of SI PK and WlP orthologs has been reported. ), Leguminous plants (see Reference 58), and other wide-ranging plants are expected to be used as pathogen-responsive promoters as well.
  • the present invention has been completed based on the above research results and findings. Provide each configuration.
  • a DMA consisting of a contiguous portion of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and functioning as a pathogen-responsive promoter in plant cells;
  • one or more bases are substituted, deleted, inserted, or added, and comprise a base sequence, which functions as a pathogen-responsive promoter in plant cells.
  • a pathogen-responsive promoter comprising any one of the following DNAs (1) to (1) and functioning as a pathogen-responsive promoter in plant cells:
  • (I I I) DNA that hybridizes with the DNA of (I) or (II) under stringent conditions.
  • a DNA consisting of 10 or more consecutive nucleotide sequences in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 and having a pathogen-responsive promoter activity.
  • a vector comprising the DNA of [7] or [8].
  • a method for producing a transformed plant comprising the following steps:
  • a method for imparting pathogen resistance to a host plant comprising the following steps:
  • [2 1] A plant into which the pathogen-responsive promoter according to any one of [1;] to [6] is exogenously introduced.
  • pathogen-responsive promoter means a promoter that responds (is induced) to a pathogen infection.
  • promoter means under the control of Refers to a functional region that regulates the initiation of transcription of a gene at
  • exogenously introduced means that it has been externally introduced. Therefore, an ⁇ exogenously introduced promoter '' is a promoter introduced from the outside into a host cell, for example, when the host cell originally possesses the same promoter as the introduced promoter. In this method, only promoters that have the same configuration but are introduced are referred to as exogenously introduced promoters, and are distinguished from each other.
  • ATP adenosine 5 -triphosphate ⁇
  • BPB bromopheno I blue
  • BSA bovi ne serum albutniru
  • CBB coomass ie bri lli ant blue
  • CTP cytidi ne 5 '-triphosphate
  • DEPC die thy I py rocarbonate
  • DTT di thiothrei EGTA: ethy leneglycol bis ( ⁇ -amonoethy I ether) ethyl ened i am i ne-te t raace tic acid
  • FPP toK EDTA ethy Iene i am i ne-N, N ',' -tetraacetic acid.
  • a promoter induced by infection with a pathogenic bacterium When a gene is introduced using the promoter of the present invention, a desired gene can be specifically expressed in a transformed plant at the time of infection with a pathogenic bacterium. Therefore, for example, by using a gene involved in a defense response, it becomes possible to produce a pathogen-resistant plant that can rapidly respond to a defense response when infected with a pathogenic bacterium.
  • FIG. 1 shows the biosynthetic pathway of stimulus-responsive isoprenoid in potato tubers.
  • sesquiterpaidophytoalexin synthesis is actively performed, and injury-inducing sterol and steroid / dalico alkaloid synthesis are suppressed.
  • 'FIG. 2 is a diagram showing the expression states of the PVS (potato vetispi radiene synthase) gene and the PSS (potato sq ualene synthase) gene in an aging potato disc after infection with the plague fungus (Phytophthora infestans).
  • FIG. 9 is a view showing a result of RT-PCR. PVS1, PVS2, PVS3, and PVS4 were each subjected to PCR using clone-specific primers. Amplification products of 469 bp, 132 bp, 326 bp, and 469 bp were obtained for PVS1, PVS2, PVS3, and PVS4, respectively.
  • FIG. 4 shows total proteins extracted from aging potato discs after infection with non-affective P. infestans or P. infestans (in order: Incomp., Comp.) Or after water treatment (Mock).
  • FIG. 4 is a view showing the results of a Western plot analysis used. The total protein of each 10 ig was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and immunized with an antiserum against PVS. HRP-conjugated anti-mouse antibody and ECL detection kit were used for detection.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of RT-PCR using all the RMAs. Lane end Positive control using RT-PCR products obtained from potato tubers 6 hours after infection with incompatible disease-causing fungus. Primers specific to each member (PVS1, PVS2, PVS3, and PVS4) were used. As a result, 176 bp, 132 bp, 326 bp, and 131 bp products were obtained, respectively. RT-PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and transferred to a nylon membrane. Each PCR product labeled with 32 P was hybridized to the membrane after the transfer.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the PVS3 genomic clone. Note that FIG. 6 shows the estimated promotion area and a part of the code area. The amino acid sequence is shown below the base that encodes it. Non-coding regions are shown in lower case. The stop codon is indicated by an asterisk.
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the PVS3 genomic clone. FIG. 7 shows a part of the code region and the untranslated region following the code region. The amino acid sequence is shown below the base that encodes it. Non-coding regions are shown in lower case. The stop codon is indicated by an asterisk.
  • FIG. 8 shows a restriction map and a structural map of the PVS3 genomic clone and the PVS3CDMA clone. Code regions are represented by hollow boxes. Bold lines represent introns. Vertical bars correspond to intron positions.
  • FIG. 9 is a schematic diagram comparing the arrangement of the amino acid sequences of Nicotiana tabacum (TEAS) 3 ⁇ 4 Solatium tuberosum (PVS), Hyoscyamus muticus (HVS), and Capsium annum (PEAS).
  • TEAS Nicotiana tabacum
  • PVS Solatium tuberosum
  • HVS Hyoscyamus muticus
  • PEAS Capsium annum
  • Bold vertical bars indicate the positions of the introns in the .tabacum gene, the S. tuberosum gene, the H. muticus gene, and the .annum gene.
  • the numbers in the boxes indicate the number of amino acid residues coded by exon.
  • the percentage notation indicates the homology score between the compared domains, and H and DDXXD (or DDXX) indicate conserved residues rich in histidine, cysteine, and aspartic acid (known as substrate binding sites).
  • FIG. 10 shows the results of measuring luciferase activity in potato protoplasts after treatment with the bacterial wall component of the disease-causing fungus or after water treatment.
  • A shows the structure of the Luc gene used for transient atssay using the PVS3 promoter region.
  • B 35S treated the luciferase activity when using the CaMV 35S promoter region
  • HWC treated the luciferase activity when treated with the HWC using the putative promoter region
  • FIG. 11 is a diagram schematically showing a PVS3 promoter construct.
  • GUS is a reporter gene.
  • FIG. 12 shows the PVS3 promoter overnight induced GUS expression pattern in response to injury
  • FIG. 13 is a diagram showing the expression pattern of the PVS3 promoter in response to the infection with the disease-causing fungus.
  • Transformed potato leaf tissue (Makein) or a non-transformed potato leaf tissue (Rishiri) as a control for staining was infected with Race 0 (affinity for makein and non-affinity for Rishiri). GUS activity at 6, 12, 24, and 48 hours after infection was detected using a GUS staining solution. Observation was performed under a microscope.
  • FIG. 14 is a diagram showing the expression pattern of GUS induced by the PVS3 promoter in a transformed potato plant.
  • the GUS staining solution was used to detect the GUS activity of the transformed potato plants. Arrows indicate the disease-infected area (GUS staining control).
  • FIG. 15 is a diagram showing the expression pattern of GUS induced by PVS 3 promoter in response to arachidonic acid (AA). AA (5 mM) or water was injected into the transformed potato leaf tissue. GUS activity at 6, 12, and 24 hours after injection was detected using a GUS staining solution.
  • AA arachidonic acid
  • Figure 1 6 is a view to view the expression pattern of the GUS to be induced PVS 3 promoter in response to the H 2 0 2.
  • H 2 0 2 a (5 mM) was injected into the transformed potato leaf tissues.
  • GUS activity at 6, 12, 24, and 48 hours after injection was detected using a GUS staining solution.
  • FIG. 17 is a diagram showing the expression pattern of GUS induced by the PVS 3 promoter in response to glucose / glucose oxidase.
  • Glucose (5 mM) and Darcosian oxidase (0.5 U / ml) were injected into the transformed potato leaf tissue.
  • GUS activity at 6, 12, 24, and 48 hours after injection was detected using a GUS staining solution.
  • FIG. 18 shows the PUS 3 promoter-induced GUS expression pattern in response to salicylic acid (SA).
  • SA 0.5 mM
  • SA was injected into the transformed potato leaf tissue.
  • GUS activity at 6, 12, 24, and 48 hours after injection was detected using a GUS staining solution.
  • FIG. 19 is a view showing the expression pattern of GUS induced by PVS3 promoter in response to Cf-9 / Avr9 interaction or StMEK DD .
  • Transformed potato leaf tissue was inoculated with 35 s, Cf-9 / Avr9, StMEK DD , or an agrobacterium having a vector (control).
  • GUS activity at 2 days after inoculation of agrobacterium was detected using a GUS staining solution.
  • FIG. 20 is a diagram schematically showing the elicitor-induced signal transduction pathway.
  • MAPKKK mitogen-act ivated protein kinase kinase, MAPKK; mitogen-activated protein kinase kinase, MAPK; mitogen-act ivated protein kinase, SI PK; sa I icy I ic ac i d- induced protein kinase, Wl PK; wound-induced protein kinase, HGR; 3-hydroxy-3-methy l utary I CoA reductase, PVS; potato ve tisi rad i ene syn thase
  • FIG. 21 is a diagram showing the sequence of the coding region of the MEK gene (MEK) of a potato plant and the deduced amino acid sequence encoded thereby.
  • FIG. 22 shows the sequence of the coding region of the constitutively active MEK gene (StMEK DD ) and the deduced amino acid sequence encoded thereby.
  • FIG. 23 is a diagram showing the positions of primer sequences used in Examples.
  • the numbers described with arrows indicating the positions of the respective primers represent the sequence numbers (for example, a primer having the sequence of SEQ ID NO: 9 for P9).
  • P9, PI PI
  • FIG. 24 shows the sequence of the primer used to construct the deletion clones of pPVS3-1 to PPVS3-10.
  • F indicates the forward primer
  • R indicates the reverse primer
  • the underline indicates the position of the restriction enzyme.
  • Figure 25 shows the structure of the binary vector containing the PVS promoter region used for the transient assay.
  • the GUS gene contains introns.
  • FIG. 26 shows a method for examining PVS3 promoter activity for INF1 treatment or StMEKl DD expression.
  • PVS3 Inject the agroprotein containing GUSint into the leaves, and in the case of StMEKl DD , inject the mixture of PVS3: GUSint and XVE: StomaK1 DD into the leaves and let it stand for 1 day Yes (A). Then poured into leaves I MF1 solution For INF1, examined in the case of StMEK1 M / 3- es Bok Rajioru after injecting (B) an additional day to stand and to express StMEKl DD and by GUS activity (C).
  • Figure 27 shows the procedure for virus-induced gene silencing.
  • A shows the structure of silencing vector PGR106.
  • a gene fragment to be silenced in this case, a cDNA fragment of SIPK and WIPK, is used by inserting it into PGR106.
  • B is a schematic diagram showing virus infection due to inoculation of vector-containing agrobacterium.
  • FIG. 29 shows the nucleotide sequence of the PVS3 promoter and the positions of the deletions from PPVS3-1 to pPVS3-10.
  • the sequence between -1337 and -1287 where a cis sequence is likely to be present is shown in bold and the putative TATA and CAAT boxes are boxed.
  • FIG. 30 shows PVS3 promoter activity in response to StMEK1 DD expression.
  • -1337 pPVS3-2
  • -1287 pPVS3-3
  • Figure 31 shows the effect of MM PK and PVS 3 promoter activity on StMEK1 DD expression. Shows how to examine the effects of SIPK.
  • PVS3 GUSint and XVE: Inject a mixture of agrobacterium holding StMEK1 DD into the silencing leaves and allow to stand for 1 day (8). ; 8 - After injection of S. Bok Rajioru (B), and further expressing one day stand to StMEK1 DD examine GUS activity (C).
  • Figure 32 shows the effect of WIPK or SIPK on PVS3 promoter activity and TEAS gene expression induced by StMEKl DD expression.
  • Silencing of ⁇ or SK markedly suppressed PVS3 promoter activity induced by StMEK1 DD induction (A).
  • the expression of the sesquiterpene cyclase gene of Bensamiana was suppressed only in the sections in which ⁇ and SIPK were silenced (B).
  • a first aspect of the present invention relates to a pathogen-responsive promoter, and one embodiment thereof includes a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA is a sequence identified as a promoter region of the potato PVS3 gene, as described in Examples below, and has been confirmed to be responsive to an epidemic bacterium, a kind of pathogenic bacterium. As a result of further examination, it was confirmed that even a DNA consisting of about 1,300 bp (SEQ ID NO: 22), in which the upstream region of the DNA was deleted, retained the desired promoter activity.
  • a preferred embodiment of the present invention is a pathogen-specific promoter containing DMA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the deleted 50 bp (SEQ ID NO: 23) is a region that is extremely important for exhibiting the promoter activity, that is, a region containing the cis sequence of the PVS3 gene promoter.
  • the region (hereinafter, also referred to as “first DNA sequence”) is extremely useful for the construction of a pathogen-responsive promoter, and a DNA construct incorporating a pathogen-responsive promoter by using the region (for example, It is possible to design and construct a recombinant vector with a high degree of freedom, which is used to confer pathogen resistance to plants. Become.
  • the present invention provides a DNA sequence useful for constructing a pathogen-responsive promoter.
  • the cis sequence generally consists of a sequence of more than ten bases, it is considered that a part of the first DNA sequence is a cis sequence.
  • a DNA comprising a partial region of the first DNA sequence if it contains a cis sequence, is a DNA useful for construction of a pathogen-responsive promoter.
  • DNAs include, for example, 10 or more consecutive base sequences in the first DMA sequence, preferably 15 or more consecutive base sequences, and more preferably 20 or more consecutive base sequences. It is a DNA consisting of the above base sequence.
  • the first DNA sequence (or a continuous portion thereof, or a DNA obtained by subjecting the first DNA sequence or a continuous portion thereof to a desired modification under the condition that its function is maintained as described below (modified product) ),
  • a pathogen-responsive promoter can be constructed by combining other DNA sequences.
  • the other DNA sequence used herein is one that can construct a pathogen-responsive promoter by cooperating with the first DNA sequence (or a variant thereof).
  • the other A sequence shown in SEQ ID NO: 24 can be used.
  • This DNA sequence is the DNA sequence of the region flanked by the first DMA sequence and the coding region in the PVS3 gene (see FIG. 29). In this region, a CAAT box and a TATA box exist, and by using this region, the original PVS 3 promoter region is constructed. Pathogen-responsive promoter is obtained It will be.
  • the other DNA sequence is linked to the first DNA sequence directly or via another sequence.
  • pathogenic fungi refers to fungi that infect and cause damage to plants, including pathogenic fungi such as plague fungi and pathogenic bacteria.
  • the “microbes” are fungi belonging to the genus Phytophthora, and are classified according to the plant to be infected. Phytophthora infestans, Tano, 'Phytophthora ni coti anae', Phytophthora megas perma var.
  • pathogenic fungi other than the epidemic fungus include potato sclerotium fungus (Sc lerotinia sc Iero tio rum), ⁇ ⁇ (Magnaporthe grisea), and soybean rust (Phakopso ra pachyrhizi). be able to.
  • pathogenic bacteria include Ralstonia so Ianacearum (bacteria).
  • the promoter of the present invention (including DNA useful for constructing a pathogen-responsive promoter; the same applies to the following unless otherwise specified) has specific responsiveness to pathogen infection. Is preferred.
  • “specific” means that the specificity is high. Therefore, the promoter of the present invention has high specificity against pathogen infection, that is, a promoter having responsiveness to pathogen infection and substantially no responsiveness to diseases other than pathogen infection. Is preferred. (How to get a promoter)
  • the promoter of the present invention is obtained, for example, by extracting genomic DNA from a potato plant such as Danshaku (Splanum tuberosum L.) by a conventional method, and then conducting a gene amplification reaction such as PCR using a primer specific to the promoter of the present invention.
  • the promoter of the present invention can be prepared by the following procedure. First, the leaves or tubers of a potato plant that has been collected and frozen are ground in a mortar. Next, an appropriate amount of extraction buffer (eg, SDS-containing Tris-HCI buffer) is added to obtain an extract. Subsequently, genomic DNA is extracted and purified by phenol extraction and ethanol precipitation.
  • the target DMA can be obtained as an amplification product by performing a PCR method using the genomic DNA thus obtained as a type II and a primer specific to the promoter of SEQ ID NO: 1.
  • the primer for example, a pair of primers having the following sequences can be used.
  • Sense primer TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG (SEQ ID NO: 15)
  • Antisense primer TCTCCATGAGTCCTTACATG (SEQ ID NO: 16)
  • the primer is designed to specifically amplify the target DNA.
  • the following shows a primer set capable of specifically amplifying the DNA of SEQ ID NO: 22.
  • Sense primer CGGAATTCGTCCGCCCTTACTATTCCCATC (SEQ ID NO: 26)
  • Antisense primer CCATCGATTCCTCTTCATTGTTAAAGGGGA (SEQ ID NO: 35)
  • the method for preparing the promoter of the present invention is not limited to the above, and may be, for example, a commercially available potato genome library (for example, potato variety Desiree genome library ( Clontech)).
  • a commercially available potato genome library for example, potato variety Desiree genome library ( Clontech)
  • To isolate a promoter of interest from such a potato genomic library A plaque hybridization method or a colony hybridization method is used depending on the type of the DNA (see Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, etc.).
  • the Braak hybridization method is used for selection of a clone having the desired promoter region.
  • a probe having a promoter-specific sequence of the present invention is used.
  • the promoter of the present invention is transformed into a type II DMA by carrying out a PCR method using primers specific to the sequence of SEQ ID NO: 1, etc. It can be obtained as an amplification product.
  • the DNA contained in the obtained clone can be subcloned into an appropriate vector for further use. This allows, for example, construction of a recombinant vector for transformation (see the second aspect of the present invention described below), or construction of a plasmid suitable for base sequence decoding.
  • the method for preparing the promoter of the present invention is not limited to the above method.
  • the promoter of the present invention may be synthesized using a commercially available DNA synthesizer or the like.
  • sequence of SEQ ID NO: 1 is approximately 2600 bp and is considerably large as a promoter region, it is expected that some regions are directly involved in promoter activity. Considering this, even if a region consisting of a continuous part in the sequence of SEQ ID NO: 1 is recognized as having a function as a pathogen-responsive promoter, it constitutes the pathogen-responsive promoter of the present invention. obtain. Furthermore, considering that the functional region of the promoter is generally located immediately before the structural gene, for example, the region consisting of the bases at positions ⁇ 2000 to ⁇ 1 in the sequence of the PVS3 gene shown in FIGS.
  • SEQ ID NO: 2 preferably also a region consisting of bases at positions ⁇ 1500 to ⁇ 1 (SEQ ID NO: 3), More preferably, similarly, a region (SEQ ID NO: 4) consisting of the bases at positions ⁇ 1000 to ⁇ 1 is a strong candidate for the functional region.
  • SEQ ID NO: 22 a region of about 1300 bp located immediately before the structural gene was used.
  • upstream region 5 ⁇ 0 (SEQ ID NO: 23)
  • the promoter of the present invention preferably contains the sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • examples of such a body include the DMA (positions -13337 to -1 of the PVS3 gene) shown in SEQ ID NO: 22.
  • DMA positions -13337 to -1 of the PVS3 gene
  • SEQ ID NO: 22 the DNA constituting the promoter of the present invention (that is, the DNA represented by SEQ ID NO: 1 or the above-described DNA) may be maintained.
  • a DMA having a partially modified base sequence of DNA (hereinafter also referred to as “modified DNAJ”) as long as it has a function as a pathogen-responsive promoter.
  • modified DNAJ a partially modified base sequence of DNA
  • modified DNAs described above include restriction enzyme treatment, exonuclease DNA Treatment with ligase, etc., site-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Co Id Spring Harbor Laboratory Press, New York) and random mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • a DNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (or any of SEQ ID NOs: 2 to 4) or a DNA having the sequence of SEQ ID NO: 22 is hybridized under stringent conditions, and the pathogenic bacteria in plant cells DNA that functions as a responsive promoter can also be used as the DNA constituting the promoter of the present invention.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. The stringent conditions vary depending on the length of the sequence and the type of constituent bases.
  • a DNA construct that can be used to confer pathogen resistance to plants by linking a gene (transgene) that activates the defense response of the plant by expressing it under the control of the promoter. Is built.
  • a gene transgene
  • a gene having a function of activating the defense response of the plant when expressed in the plant into which the transgene is introduced is used.
  • a gene having a function of activating a signal transduction pathway that controls a plant defense response can be employed as the transgene.
  • a specific example of such a gene is a function of activating SIPK (salicyl ic acid induced protein kinase) or WIPK (Wound-1 nduced Protein Kinasae), which is a kind of mitogen-activated protein (MAP) kinase.
  • SIPK salicyl ic acid induced protein kinase
  • WIPK Wild-1 nduced Protein Kinasae
  • MAP mitogen-activated protein
  • an active protein is activated from the beginning as a protein that activates a defense response, and the defense reaction proceeds quickly and reliably.
  • the gene encoding the constitutively active protein is based on the sequence of the gene encoding the wild-type protein. Can be prepared by partially modifying the amino acid sequence to be mutated.
  • a constitutively active MEK (StMEK DD ) in which MEK is modified has been prepared, and the gene encoding StMEK DD can be used as a transgene in the present invention.
  • the sequence of the coding region of the StMEK DD gene (SEQ ID NO: 7) and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 8) are shown in FIG.
  • the type of the "protective response" in the above is not particularly limited, and includes, for example, phytorexin generation, expression of PR (Pathogenesis-Related) protein, generation of active oxygen, papilla formation, ligninization, etc. .
  • the vector used for the construction of the DMA construct as described above includes a promoter of the present invention and a transgene placed under the control of the promoter into a target cell (host cell).
  • a suitable plasmid vector, ⁇ phage vector or the like may be used depending on the purpose.
  • a Ti plasmid vector and a Ti plasmid binary vector having a DNA-DNA border sequence can be used.
  • various PUC plasmid vectors when used in a transformation method that does not require the intervention of an agrobacterium (electroporation method, particle gun method, etc.), various PUC plasmid vectors, various ⁇ phage vectors (ZAPI1, etc.), etc. are used.
  • ZAPI1, etc. various ⁇ phage vectors
  • a recombinant vector Numerous vectors are commercially available, and in the present invention, an appropriate one can be selected from them according to the purpose and used.
  • the vector containing the promoter of the present invention may be constructed first, and then the transgene may be ligated. That is, a highly versatile vector into which a desired transgene can be inserted.
  • a recombinant vector for transformation may be prepared using this vector.
  • a recombinant vector for transformation typically contains a transgene and an appropriate terminator in addition to the promoter of the present invention.
  • the promoter, the transgene, and the terminator are arranged in order from upstream to downstream so that proper transcription of the transgene by the promoter is achieved.
  • the recombinant vector may contain a selection marker, a sequence having an enhancer function, a sequence encoding a signal peptide, and the like.
  • a terminator is a sequence recognized as a signal that terminates mRNA synthesis.
  • a terminator that functions properly in plant cells is used. For example, Mos Termine overnight can be used.
  • Selectable markers are used to identify or select for transformed cells, tissues, calli, and the like.
  • Various selection markers are well known and include, for example, the npt gene (Herrera Estrel la, EMBO J. 2 (1983), 987-995) and the nptll gene (Messing & Vierra. Gene 1 9: 259-268 (1982)), hph gene that confers resistance to hygromycin (Blochinger & Diggl mann, MoI Cell Bio 4: 2929-2931), dh that confers resistance to metatrexate fr gene (Bourouis et al., EMBO J.
  • ⁇ -gluculinase GUS
  • GFP GFP gene
  • Luciferase Giacomin, P1. Sci. 116 (1996), 59-72; Sc ikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), etc.
  • Insertion of a promoter or transgene into a vector can be performed by a conventional method such as a method using restriction enzymes and DNA ligase (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, See New York).
  • the DMA construct or the recombinant vector of the present invention can be used for plant transformation. Transformation methods (gene transfer methods) include a method using agrobacterium (agropacterium method), a method using a polyethylene dalicol to introduce a gene, and a method using an electrical stimulus to introduce a gene ( (Electroport-poration method), and a method (particle gun method) of driving gene particles into plant tissue (cells). The details of each method are described in various literatures and written books. For example, the Agrobacterium method is described in Pro Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467-8471, and PI antol. Biol. 20 (1992). ), 96 3-976 and the like.
  • the method of Jefferson (1987) can also be employed.
  • the introduced promoter is induced by infection with a pathogenic bacterium, and as a result, the transgene under the control is expressed. Therefore, if a transgene that is effective in preventing pathogen infection is used, plants that are resistant to pathogenic bacteria (type Transformant) is obtained.
  • Transformed plants can be regenerated using the plant cells obtained as a result of the transformation.
  • Such a regeneration method can be performed according to a conventional method, depending on the type of plant. (Target plant)
  • the plant (target plant) subjected to transformation using the DNA construct or the recombinant vector of the present invention is not particularly limited, and may be any of dicotyledonous plants and monocotyledonous plants.
  • dicotyledonous plants include Solanaceae (Potato, Tobacco, Tomato), Rosaceae (Prunus, Peach, Apple, etc.), Legume (Soybean, Endo, etc.), Brassicaceae (Eg, radish), sesame and the like.
  • examples of monocotyledonous plants include grasses (eg, genus rice, genus wheat, rye, rye, barley). Plants classified into the genera, the genus Corn, the genus Saccharomyces, and the lily family (genus Allium, garlic, etc.).
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
  • Potato late blight [Phytophthora infestans (Mont.) De Bary] stored in the Plant Pathology Laboratory, Department of Bioresources, graduate School of Bioagriculture, Nagoya University Race 0 and Race 1.2.4. .
  • the potato late blight [Phytophthora infestans (Mont.) De Bary] race 1.2.3.4 was preserved in the same laboratory. used.
  • a zoospore suspension of the potato late blight was prepared as follows. Potatoes (variety Danshak) stored at 4 ° C were thoroughly washed with tap water and immersed in 1% sodium hypochlorite for about 10 minutes. The potato tubers were sliced (thickness: about 10 mm), washed with water, coated and inoculated with a zoospore suspension adjusted to about 10 4 spores / ml, and cultured in a humidified dark environment at 20 ° C for 6 days. Bacteria growing on the slice surface were scraped off with forceps and suspended in cold distilled water (4 ° C).
  • the spore suspension was filtered through a metal mesh (356 mesh) to remove mycelia, and suction-filtered using filter paper (ADVANTEC No. 5B).
  • the zoospores collected on the filter paper were washed with cold distilled water, suspended again in cold distilled water, and allowed to stand at 10 ° C for 2 hours.
  • the resulting precipitate was suspended in an equal volume of 50 mM acetate buffer (pH 4.5) and subjected to ultrasonic treatment and centrifugation again under the same conditions as above.
  • the obtained precipitate was suspended in a 0.1 M borate buffer (pH 8.8) equivalent to the weight of the original bacteria, sonicated under the same conditions as above, and then autoclaved at 120 ° C for 20 minutes. The supernatant was collected by centrifugation at 14,000 X g for 30 minutes. - How, precipitate was suspended again 0.1 M borate buffer (P H 8.8), after sonication and autoclaving, and centrifuged.
  • the obtained supernatant was combined with the above supernatant, and dialyzed against water for 24 hours at 4 ° C using a dialysis tube (exclusion limit molecular weight: 12,000).
  • the dialysis solution was mixed with an equal amount of getyl ether using a separatory funnel and allowed to stand.
  • the emulsion layer was collected, the ether was dried under reduced pressure using an evaporator, and an appropriate amount of water was added to the concentrate, followed by freeze-drying.
  • the obtained dried sample was used as an HWC in the following experiments. When HWC was used, it was suspended in water by sonication at 45 W for 3 minutes using a sonicator. 5.
  • Potato tuber disks were prepared as follows. Potato (variety Lisiri) tubers stored at 4 ° C were thoroughly washed with tap water and then immersed in 1% sodium hypochlorite for about 10 minutes. Tubers were punched out with a cork borer (diameter 20 mm) in the stem axis direction, and a columnar tissue ram was prepared from the soft tissue portion. From this column, a disc having a thickness of about 1 was prepared using a microtome. Immediately prepare the prepared disc with cold distilled water (approx. After washing at 4 ° C), they were arranged in a plastic chamber, left in a humidified dark place, and aged for 21 hours. This work was all performed in the dark.
  • the potato tuber disc prepared according to the method described in the above 5 was pretreated with distilled water at a rate of 100 ⁇ I per disc and allowed to stand for 3 hours. Each disc was then treated with ⁇ mg / ml HWC or ⁇ ⁇ ⁇ I control distilled water. Furthermore, when inoculated with Phytophthora infestans zoospores in Dace click, to maintain a zoospore concentration uniform and inoculated Iotaomikuron'omikuronmyu iota with stirring suspension (10 5 spores / ml). The potato leaf tissue was inoculated with distilled water at 500 ⁇ I per pot, and allowed to stand for 3 hours. Thereafter, the suspension was inoculated with 500 I while stirring to maintain a uniform zoospore concentration in each leaf tissue.
  • the treated and inoculated discs and leaf tissues were further allowed to stand still in a humidified dark at 20 ° C, and allowed to stand for a predetermined time. After the treatment, one set of three potato tuber disks and eight sets of leaf tissues were wrapped in aluminum foil, frozen and fixed in liquid nitrogen, and stored at -80 ° C.
  • RNA extraction was performed by the method of Yoshioka et al. (1996) (see Reference 52).
  • Potato leaf or tuber discs (2 g each) are ground in a mortar while adding liquid nitrogen, and 5 ml extraction buffer [100 mM Tris-HCI (pH 9.0), 100 mNaCI, 1% SDS], 1 tnl 2 -Place in a sterile DEPC-treated eccentric tube containing mercaptoethanol, 2.5 ml 1 M Tris (pH 9.0) saturated phenol, 2.5 ml I-cloth form / isoamyl alcohol (24: 1; v / v). After the suspension, the suspension was centrifuged (8,000 rpm, 15 minutes).
  • the precipitate obtained by centrifugation (8,000 rpnu for 15 minutes) was suspended in 300 I guanidinium salt buffer, an equal volume of isopropanol was added, and the mixture was allowed to stand at -20 ° C for 1 hour.
  • the precipitate obtained by centrifugation (12,000 rpnu for 15 minutes) was washed with sodium acetate (pH 5.2) at room temperature and centrifuged (12,000 rpm, 15 minutes). This washing operation was repeated twice, followed by washing with 500 ⁇ l of 70% ethanol and centrifugation (15,000 rpnu for 15 minutes).
  • the obtained precipitate was dried under vacuum and dissolved in 100 ⁇ l of DEPC-treated water, and this was used as a total RNA sample.
  • RNA was fractionated by formaldehyde agarose gel electrophoresis (see Reference 37), and then transferred and fixed to Hybond-+ nylon membrane (Amersham) by the alkaline plotting method (see Reference 36). PVS1 c DMA was used as a probe.
  • the nylon membrane to which the RNA was adsorbed was treated with a 42 ° C prehybridization solution [50% formamide, 5X Denhardt's solution (see Reference 37), 5X SSPE (see Reference 37), after standing one hour or more in 0.5% SDS, 100 / ig / ml heat denatured salmon sperm DMA (Pha rmac ia)], was added 32 P-labeled DNA probe, performed Haiburidize Chillon over 16 hours under 42 ° C Was.
  • a 42 ° C prehybridization solution [50% formamide, 5X Denhardt's solution (see Reference 37), 5X SSPE (see Reference 37), after standing one hour or more in 0.5% SDS, 100 / ig / ml heat denatured salmon sperm DMA (Pha rmac ia)]
  • This membrane is placed in 4 x SSPE containing 0.1% SDS at room temperature for 15 minutes (twice), in 4 X SSPE containing 0.1% SDS at 60 ° C for 15 minutes, and then in 1 x SSPE containing 0.1% SDS at 60 ° C. The bottom was washed sequentially for 15 minutes (once). Heat radiography was performed at -80 ° C using an X-ray film 0MAT-AR (Kodak) and an intensifying screen Lighting PI us (Dupont). 9. RT-PCR
  • Ding-PCR was performed using RT-PCR high-Plus (TOYOBO).
  • RT-PCR high-Plus TOYOBO
  • the primers used are as follows, and FIG. 23 shows the positions where each cDNA is annealed.
  • PVS1 5'-AGGAGATTGTTCGCCCCATA-3 '(SEQ ID NO: 9) and 5'-TCTCCATGAGTCCTTAC ATG-3' (SEQ ID NO: 10) (469 bp), or 5'-CATCGATTGTTTTGTACATCTG-3 '(SEQ ID NO: 11) and 5'-AATAATGATACAAAAAAAAATTAAGG- 3 '(SEQ ID NO: 12) (176 bp) PVS2: 5'-TATCAATTCACCAAGGAACACT-3' (SEQ ID NO: 13) and 5'-GAAGTAATTAAAT TTAAATATTATCAA-3 '(SEQ ID NO: 14) (132 bp) )
  • PVS3 5'-TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG-3 '(SEQ ID NO: 15) and 5'-TCTCCATGAGTCCTT ACATG-3' (SEQ ID NO: 16) (326 bp)
  • PVS4 5'-AGGACATTGTTCGACCTGTT-3 '(SEQ ID NO: 17) and 5'-TCTCCATGAGTCCTT ACATG-3' (SEQ ID NO: 18) (469 bp), or 5'-CATCCCTTAAAATTATAAGTATTC-3 '(SEQ ID NO: 19) and 5'-AATAATGATACAAAATAAATTAAGG-3 '(SEQ ID NO: 20) (131 bp)
  • the synthesized cDNA was fractionated by 2% agarose gel electrophoresis and stained with bromide medium to confirm the presence or absence of a band (see Reference 37).
  • potato PVS was expressed in E. coli.
  • the entire translatable region of the PVS1 cDNA was inserted into an expression vector pET-32b (+) (Takara Shuzo) digested with EcoR and Xhol, and the resulting vector was introduced into E. coli (BL21, Novagen).
  • This Escherichia coli was inoculated on an LB agar medium containing 50 g / ml carbenicillin and cultured at 37 ° C for a whole time.
  • the supernatant was removed, and the precipitate was resuspended in 5 ml of E. coli suspension [50 mM Tris-HCI (pH 8.0), 2 mM EDTA]. After induction of 100 I, fusion protein was used as the protein sample. It was used to confirm the induction of expression. The culture was centrifuged again (5,000 rpm, 10 minutes) to remove the supernatant, and the precipitate of E. coli was used to confirm the solubility of the fusion protein.
  • the precipitate of Escherichia coli in which the expression of the fusion protein was induced was washed with ice-cold 5 ml Binding Buf fer [5 mM imidazole, 0.5 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCI (pH 7 9)].
  • the suspension was transferred to a transparent centrifuge tube, and E. coli was disrupted with an ultrasonic disrupter while cooling the centrifuge tube on ice.
  • the cell suspension was centrifuged (12,000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was used as a soluble fraction.
  • the protein regeneration operation was performed as follows.
  • the urea fraction was transferred to a dialysis tube, and dialyzed against 200 ml of 4 M urea external solution [4 M urea, 10 mM Tris-HCI (pH 7.0), 5 mM DTT] at 4 ° C for 1 hour.
  • the dialysate was replaced with 200 ml of a 2 M urea dialysate (4 M urea dialysate with the urea concentration changed to 2 M) and dialyzed at 4 ° C for 1 hour.
  • dialysate was replaced with 200 ml of urea-free dialysate (4 M urea dialysate without urea) and dialyzed at 4 ° C for 1 hour.
  • the dialysate was replaced again with 200 ml of urea-free dialysate (4 M urea dialysate without urea) and dialyzed at 4 ° C.
  • This solution was transferred to an Eppendorf tube, subjected to eccentric separation (15,000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was transferred to a new tube.
  • This fraction was used as a regenerated fraction, and used as an antigen for producing an antibody.
  • 4 ml of the fusion protein of 8 mg / ml was obtained. 12.
  • mice After breeding mice (BALB / c, female, 4-week-old) for 5 days, an intraperitoneal injection of an emulsion mixed with an equal amount of a solution containing the fusion protein expressed in E. coli and complete Freund's adjuvant (DIFC0) was made. .
  • DIFC0 complete Freund's adjuvant
  • an emulsion containing 100 tg of the fusion protein and an equal amount of incomplete Freund's adjuvant (DIFC0) was injected into the 100 I intraperitoneal cavity.
  • the mouse tail was cut and blood was collected, and whether or not an antibody against HMGR was formed was examined by Western analysis.A t- antigen-antibody reaction was observed, and the fusion protein ⁇ and incomplete Freund's adjuvant were again observed.
  • the protein concentration of the sample was measured using a protein quantitative kit (BIO-RAD) according to the method of Bradford (1976). A calibration curve was created using BSA.
  • SDS-PAGE of the protein sample was performed according to the method of Laemmli (1970). Mix 10 I of sample with 10 tI of sample buffer [50 mM Tris-HCI (pH 8.5) containing 2% SDS, 10% mercaptoethanol, 0.002% BPB, 20% glycerol] and boil for 5 minutes After cooling on ice, electrophoresis was performed using a 10% polyacrylamide gel.
  • the dinitrocellulose membrane was shaken in a buffer containing 5% skim milk [50 mM Tris-HCI buffer (pH 7.6) containing 137 mM sodium chloride and 0.1% Tween 20 (pH 7.6)] for 10 minutes to block. went. After washing this membrane once in TBS-T for 15 minutes and twice for 5 minutes, anti-potato PVS antibody was used as the primary antibody.
  • Plasmids in which potato PVS1-4 cDNAs were incorporated were designated as type III, and amplified by PCR specific to the nucleotide sequence of each gene using the primers shown in FIG.
  • the reaction was carried out using TaKaRa TaqT (Takara Shuzo) and 2 ng of plasmid with insert DNA, DNA thermocycler-PJ2000 (Perk in Elmer Cetus) at 94 ° C for 1 minute (thermal denaturation), 53 ° C-
  • the test was performed under the conditions of 45 seconds (annealing), 72 ° C for 2 minutes (DNA extension reaction), and 25 cycles.
  • the size of the amplified DMA fragment was confirmed by 0.8% agarose gel electrophoresis.
  • the DMA fragment was purified from the gel using QIAquick Gel Extra Trade Kit (QIAGEN).
  • P2 E. coli XL1- Blue RA
  • the cells were overlaid on an agar medium (1% NZamine, 0.5% yeast extract, 10 mM magnesium sulfate, 0.5% sodium chloride, 1.5% agar powder). After culturing at 37 ° C until the plaque diameter became about 0.5 mm, the plate was allowed to stand at 4 ° C for 1 hour or more. The plaques on the medium are adsorbed on a Hybond-N + nylon membrane (Amersham), and neutralized with a denaturing solution (1.5 NaCI, 0.5 NaOH) for 7 minutes. [1.5 NaCl, 0.5 M Tris- HCI (H 7.2), 1 mM EDTA] for 3 minutes, and then washed with 2 ⁇ SSPE. Further, the DNA was fixed on the membrane with 0.4 M sodium hydroxide, and then washed with 5 ⁇ SSPE (twice). In total, the target clone was selected from 6.0 ⁇ 10 5 clones.
  • agar medium 1% NZamine, 0.5% yeast extract, 10
  • PVS1, PVS3, and PVS4 in which a band of the expected size was confirmed by PCR using primers specific to each member of PVS1 to PVS4 were selected and subjected to secondary and tertiary screening.
  • Isolation of phage DMA ⁇ Purification was performed by the following method based on the liquid culture method (see Reference 23) and the polyethylene glycol (PEG) precipitation method (see Reference 37).
  • the target plaque was recovered from the agar, and a 100 / il SM solution [50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 0.1 M sodium chloride, 7 mM magnesium sulfate, 0.01% gelatin] and 1 ⁇ l The mixture was transferred to a 1.5 ml tube containing loroform, left at 4 ° C for a while, and then suspended well.
  • the DNA-adsorbed Niopen membrane was placed in a 42 ° C prehybridization solution [5X Denhardt solution (see Reference 37), 5X SSPE (see Reference 37), 0.5% SDS, 100% iig / ml heat denatured salmon sperm DNA (Pha rmac ia)] was allowed to stand over 1 hour in, added 32 P-labeled DNA probes were High Priestess die See Chillon over 16 hours under 42 ° C. This membrane was sequentially washed in 2 ⁇ SSPE containing 0.1% SDS for 10 minutes (twice) and further in 1 ⁇ SSPE containing 0.1% SDS for 10 minutes (once). All washing was performed at room temperature. The radiography was performed at -80 ° C using an X-ray film 0MAT-AR (Kodak) and an intensifying screen Lighting Plus (Dupont).
  • 5X Denhardt solution see Reference 37
  • 5X SSPE see Reference 37
  • 0.5% SDS 100% iig
  • PBluescript KS + (Stratagene) was used for subcloning of the target DNA fragment for determining the nucleotide sequence.
  • the total DNA of the target clone is digested with the specified restriction enzyme (Takara Shuzo), fractionated by 0.8% agarose gel electrophoresis (see Reference 37), and the agarose gel containing the target DNA fragment is subjected to QIAquick Gel. Purification was performed using Extraction Kit (Qiagen).
  • the vector digested with the restriction enzymes was dephosphorylated (37 ° C, 1 hour) with Alkaline phosphatase E. coli C75 (Takara Shuzo), and then phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1, v / v / v), black form: isoamyl alcohol (24: 1, v / v).
  • the nucleotide sequence was determined using the PR ISM Dye Deoxy Termination Ion Cycle Sequencing Ready React ion Kit (Applied Biosystems) based on the dexterity termination method (see Reference 38).
  • An ABI 373S DNA sequencer ⁇ DNA sequence automatic analyzer (Applied Biosystems) was used for electrophoresis of the reaction product in denaturing polyacrylamide gel and reading the nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence binding and the homology between the amino acid sequence in the reading frame and the known gene were analyzed using the BLAST program (see Reference 1) on a large computer of the National Institute of Genetics Japan DNA Data Bank (DDBJ). . Amino acid sequence alignment was performed using the CLUSTALw program (see Reference 43). 21.
  • Potato Lumps-Transient Atsushi Using Protoplast The transient attraction using a potato tuber protoplast was performed as follows with reference to the method of Hashimoto et al. (1992) (see Reference 18).
  • Potatoes cultured cells derived solution pro Bok Plus Bok the containing 10 6 1 X of 800 microns I in (0.5 M mann i toi, 0.1 m MgS04, pH 7.0), a gene to be introduced 25 g was added, gently mix by pipetting And allowed to stand on ice for 10 minutes.
  • This solution was transferred to a pre-cooled cuvette, and electrophoretically transferred (60 v, 50 pon, 75 poff, 4 times) using a gene transfer device CUY21 (Tokki Science) under constant current conditions.
  • the excised stems are infected by immersing them in a culture medium of tumefaciens for 2 minutes, and on a 3C5ZR medium in a petri dish [Sucrose 30 g, GellanGum 2 g, MS mineral (10x) 100 ml, Fe-EDTA 5 ml, Myo-i nos i to I 100 m 1, 3C5ZR vi tamin (Thiamin HC I 1 mg / m I 1 ml, Ni cotinic acid 1 mg / m I 0.5 ml , Pyri doxine HCI 1 mg / m I 0.5 ml, Asparatic acid 1 mg / m I 0.4 ml) 2.4 ml, I AA (0.1 mg / m I) 5.3 ml, Zeat inr iboside (0.1 mg / m mI) 17.5 ml, pH 5.9, per 1000 nH] at 20 ° C for 3 days.
  • the cells were transferred onto a 3C5ZR medium containing kanamycin (100 g / ml) and Cefotaxime (300 g / ml). This was repeated weekly, and when a shot appeared, it was put on S1 regeneration medium (Sucrose 15 g, GellanGum 3 g, SI mineral (lOx) 100 ml, Fe-EDTA 5 ml, V2 vitamin 2.0 ml). , pH 5, 7, per 1000 ml) and confirm root regeneration.
  • S1 regeneration medium Sucrose 15 g, GellanGum 3 g, SI mineral (lOx) 100 ml, Fe-EDTA 5 ml, V2 vitamin 2.0 ml. , pH 5, 7, per 1000 ml
  • the plant tissue in a GUS staining solution (X-Glue (50 mg / ml in DMF) 100 ⁇ I, 500 mM Phosphate buf fer (pH 7.0) 1 ml, 100% Methanol 2 ml, 0.5% Triton X-100 7.9 ml, per 10 ml] under reduced pressure and stain overnight at 37 ° C in the dark. Thereafter, the stained tissue was boiled and decolorized in a decolorizing solution of acetic acid: ethanol: glycerol (1: 3: 1) and observed.
  • the decolorized tissue is boiled in lactphenol solution (lactic acid 10 ml, pheno I 10 g, glycerol 10 ml water 10 ml, 40 ml ethano I). And repeated this. Thereafter, the cells were decolorized and observed on a filter paper impregnated with saturated chloral (2.5 g / ml) at 4 ° C for 2 days (see Reference 49). 23. Agrobacterium tumef aciens-mediated translocation in potato leaf tissue
  • Tumefaciens LBA4404 containing a binary vector containing Cf-9 / Avr9 or StMEK D ° (SEQ ID NO: 7) introduced by electroporation is cultured with rifampicin (50 g / ml) and specified antibiotics did.
  • rifampicin 50 g / ml
  • Example 3 Western analysis of PVS proteins in potato tuber tissues inoculated with incompatible and affinity races To investigate whether the PVS mRNA accumulation trend is reflected in actual protein synthesis, anti-diga PVS antibodies were prepared and Western analysis was performed. Expression in E. coli was performed based on the deduced amino acid sequence to obtain an antigen for use in the production of the antibody.
  • the PVS1 cDNA translation region prepared by PCR was inserted into an expression vector and expressed in Escherichia coli as a fusion protein with thioredoxin. SDS-PAGE was performed for all proteins of E. coli before and after the induction of expression, and the gel was stained with a CBB solution. Since a band of about 83 kD was detected in the urea fraction, urea was removed from this fraction by dialysis and used as an antigen for producing antibodies.
  • a band showing significant accumulation of mRNA with an estimated size of 326 bp was detected only in PVS3 (FIG. 5).
  • bands were confirmed at estimated sizes of 176 bp, 132 bp, 326 bp, and 131 bp of PVS1 to 4, respectively (FIG. 5).
  • Potato genome size is haploid per 1.6 - 1.8 X is 10 9 bp (Arumuga nathan and Earle , 1991), that the size average of potato genomic library is 5 X 10 4 bp per plaque and potato Given that is tetraploid, screening at least 5.2 x 10 5 plaques is required to screen the entire potato chromosome. Therefore, 6.0 ⁇ 10 5 plaques were screened using the entire length of PVS1 cDMA as a probe. As a result of the primary screening, 87 clones were confirmed.
  • PVS1 to PVS4 were distinguished from each other, and primers were constructed at each member-specific site of PVS1 to PVS4 to obtain a putative promoter region, and the PCR product was electrophoresed.
  • PVS1, PVS3 and PVS4 were each selected for 3 clones and subjected to secondary and tertiary screening.
  • the clone obtained as a result of screening was digested with EcoRI, Hindi II or Xhol alone and subjected to Southern hybridization using the PCR product obtained by the primers used for screening as a probe. As a result, a band hybridizing with this probe was detected. Since it was confirmed that the desired clone was obtained, the hybridized EcoRI and Hindi II digested DMA fragment was subcloned into the pBluescript KS + vector, and the nucleotide sequence was determined.
  • both PVS1 and PVS4 were separated by five introns, which was different from PVS3 (Fig. 9).
  • the cultivar of potato plants is tetraploid, and it is known that there are multiple instances of each isogene in the genome (Reference 56). Since the PVS3 genomic clone obtained in this example was different from the PVS3 cDNA only in the 3 ′ untranslated region, it is considered to be a gene encoding one of the PVS3 subfamilies.
  • a PGL3 vector prepared by ligating the PVS3 putative promoter region upstream of luciferase was introduced by protoplasts using electorifice po- ration, and its responsiveness to HWC was examined (Fig. 10). Luciferase activity was significantly higher in the HWC-treated group than in the water-treated group, indicating that the 2,648 bp region upstream of the translation initiation codon used in this experiment responded to the elicitor.
  • a binary vector created by ligating the PVS3 putative promoter overnight to the upstream of the GUS gene was transformed into a make-in that does not have a genuine resistance gene against potato late blight.
  • introduced purpose of examining the response of PVS3 genes to produce the £ injury transformants were over time GUS stained excised part of transformed potato leaf tissue (FIG. 1 2).
  • the excision site was not GUS-stained even after 48 hours. Therefore, this promoter was shown not to respond to injury.
  • leaf tissue was treated with various elicitors and stained with GUS (Figs. 15, 16, 17, 18).
  • GUS a fatty acid constituting the membrane of potato late blight
  • arachidonic acid a fatty acid constituting the membrane of potato late blight
  • staining with GUS was confirmed after 24 hours (Fig. 15).
  • treatment with hydrogen peroxide which is one of the reactive oxygen species, glucose or glucose oxidase that produces hydrogen peroxide, or salicylic acid, which is involved in systemic acquired resistance, results in GUS No staining was observed ( Figures 16, 17, 18).
  • HMGR HMG-Co-Are uct ase
  • HMG1 contributes to steroid glycoalkaloid production in response to injury, while HMG2 and HMG3 are induced by disease signals and contribute to lysine synthesis (see Reference 9).
  • PVS gene in potato plants also forms a multigene family, and that members of PVS 1-4 exist (see Reference 53).
  • RT-PCR was performed using primers specific to each member to investigate the expression trends of PVS 1-4 members in potato tuber tissue and leaf tissue. Affinity and non-affinity of plague fungus RT-PCR was performed using total RNA extracted from potato tuber discs inoculated with race inoculation (Fig. 3). In all races inoculated, bands of all PVS 1-4 members were detected at the estimated size.
  • HMGR an enzyme that synthesizes mevalonic acid from 3-hydroxy-3-tnethylglutaryl CoA (HMG-CoA), and PVS, which synthesizes betispyradine from pharmacinyl diphosphate, are involved in biosynthesis of potato phylexin.
  • HMG-CoA 3-hydroxy-3-tnethylglutaryl CoA
  • PVS which synthesizes betispyradine from pharmacinyl diphosphate
  • PVS 3 genome isolated this time Comparison of the clone with the previously isolated PVS3 cDNA revealed that all deduced amino acid sequences were identical.
  • the restriction enzyme sites in the exon region were identical and corresponded (Fig. 8).
  • Potassidiol, a phytoalexin of tobacco and capsicum, and lysitine produced by hyos and potato are both synthesized by similar biosynthetic pathways (see references 4 and 29) (Fig. 1).
  • the sesquiterpene cyclase involved in the former synthesis is 5-epi-aristoloquine synthase (EAS), and the EASs of tobacco (TEAS) and capsicum (PEAS) are very similar at the amino acid level. See 5 3).
  • HMGR gene expression is controlled by SIPK, a species of mitogen-activated protein (MAP) kinase (see Reference 33).
  • SIPK mitogen-activated protein
  • StMEK DD constitutively active mutant enzyme that phosphorylates and activates SIPK and WIPK was similarly expressed, and GUS activity was observed (Fig. 19).
  • Fig. 19 GUS activity was observed.
  • fungus fungus Cladosporium fulvum When Avr9 and Cf-9, a resistance gene product of Tomato cultivars, were transiently expressed in leaf tissue via agrobacterium, GUS was stained (FIG.
  • MAPKKK located upstream of the MAPK cascade activates by phosphorylating MAPKK, and that MAPKK phosphorylates MAPK to cause various defense responses.
  • over-the constitutively active mutant enzyme StMEK1 ° D of StMEKI a MAPKK the base Nsamiana leaves, a kind of tobacco (Nico Tiana benthamiana) expression, SIPK and WIPK are activated, the tobacco plants It has been shown that the sesquiterene cyclase, 5-epi-aristol kinsynthase (TEAS), is induced (Reference 64). It is easily anticipated that the MAPK cascade is involved in the regulation of PVS genes in potatoes as in tobacco plants.
  • VIGS virus-induced gene silencing
  • PVX potato X virus
  • vensamiana systems have accumulated many research results as retrograde genetic function analysis methods (References 67 and 70). Therefore, SIPK or WIPK was knocked down by VIGS, and the above-mentioned PVS3: GUS was transiently introduced into leaf tissue by agrobacterium to examine PVS3 promoter activity.
  • the biological materials, reagents, experimental methods, and the like used in Examples 9 to 12 below are as follows. Incidentally, materials and the like that are not particularly described are the same as those used in the above embodiments.
  • Bensamiana (Nicotiana benthamiana), which was provided by Japan Tobacco Co., Ltd., was used as a test plant. Bensamiana seeds were sown in polyethylene pots containing Klehasoil (Kureha Chemical) and allowed to grow in a constant temperature room at 25 ° C for 24 hours under light conditions. For the transgenic plants through Agrobacterium tumefaciens, 6 to 8 leaves of the plant 30 to 35 days after sowing were used. 2. Preparation of INF1
  • the cells were transferred to a dialysis tube (exclusion limit molecular weight: 3,500) and dialyzed against sterilized distilled water at 4 ° C for 24 hours. The fraction obtained by the above procedure was adjusted to a protein concentration of 10 mg / ml.
  • an INF1 solution diluted 3 times with distilled water was used to prepare the FLAG-INF1 solution 3.
  • a binary vector containing the PVS3 promoter linked to the GUS gene was inserted. Construction
  • Construction The expression vector used for MUG Atsushi was constructed as follows: PVS3 genome Using the lone as a type II, a primer sequence to which a restriction enzyme site (fcoRI or Cla) was added (Fig.
  • Vector one The vector and insert prepared as described above were adjusted so that the vector: insert molar ratio was 1: 3, and religated with DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara). .
  • DNA Ligation Kit ver. 2 Takara
  • FIG. 25 shows a map of the binary vector into which the PVS3 promoter was inserted.
  • the putative promoter region and the PVS3 gene code are used.
  • the base sequence including the region start was amplified by PCR.
  • PCR was performed using K0D-Plus-DNA Polymerase (Toyobo) at an annealing temperature of 55 ° C and according to the attached protocol.
  • the preparation of the binary vector was carried out according to the above operation 3 and introduced into the agrobacterium by the method described in 6. It was confirmed that the nucleotide sequence of the resulting deletion clone was correct.
  • the construction of the expression vector used for MUG attestation in B. americana leaves was performed as follows. 5 'side nucleotide sequence of StMEK1 DD including untranslated regions (Reference 64), restriction enzyme sites (Zlpal or el) adding primers (5' -TTGGGCCCATGCGACCTCTTCAAC CACC-3 ' : SEQ ID NO: 3 6, 5' -GACTAGTACAAAAGAGTGTGGAATTAC -3 ': Amplified by PCR using SEQ ID NO: 37). KOD-Plus-DNA Polymerase (Toyo bo) was used for the PCR reaction, and the reaction was performed at an annealing temperature of 55 ° C according to the attached protocol. This PCR product is digested with Apa!
  • the vector to be introduced was adjusted to 10 ng / ⁇ I with TE and used for transformation of Agrobacterium.
  • Agro inf i 11 rat ion was performed by the following method.
  • the agrobacterium into which the binary vector was introduced was cultured with shaking at 28 ° C for 1 day in an LB liquid medium containing a predetermined antibiotic.
  • 1 ml of the culture was suspended in 8 ml of LB liquid medium containing antibiotics, and cultured with shaking at 28 ° C for 3 hours.
  • the density of agrobacterium in the suspension was measured using an ultraviolet-visible spectroscopy system (DU series 600, Beckman), and the absorbance at a wavelength of 600 nm was measured.
  • XVE using pER8 vector: StMEKl DD or PVS: when the GUSint retained Agurobakuteriu ⁇ you Agroinf i I t rat ion, respectively 0D 6 () Q 0.005 and 0D 6.
  • the suspension was allowed to stand at room temperature (20 ° C) for 1 hour, and then injected into the intercellular space of Bensamiana leaves using a needleless syringe. After the injection, the plant was allowed to stand at 25 ° C. for 24 hours under light conditions, and used for the following 9 MUG (4-methylumbel H feryl j8 -D-g Icuronide) Atsushi.
  • VGS virus-induced gene silencing
  • MUG 4-methy I umbe II if ery I ⁇ -D-glucuron i de
  • Agurohakuteri ⁇ 200 I extraction buffer a three benthamiana leaves 1 cm square injected after grinding in liquid nitrogen in [50mM NaHP0 4 (pH 7.0) , 10 mM ⁇ -mercaptoethano K 10 m EDTA, 0.1% sodium lauroy I sarcosine. 0.1% TritonX-100], and centrifuged (12,000 rpm, 4 ° C, 5 minutes) to recover the supernatant. Measure the protein concentration of the extract according to the protein quantification method described in 13 above.
  • the reaction mixture was added to the reaction stop solution 900 ⁇ ⁇ (0.2 M Ma 2 C0 3), it was used for measurement.
  • the emission spectrum at 455 nm was measured using a fluorescence spectrophotometer RF-5300PC (Shimadzu) with excitation light at 365 nm.
  • a calibration curve was prepared using 4-MU (7-hydroxy-4-methy lcoumarin), and the measured values were converted to 4-MU nM / min ⁇ mg protein.
  • a sample in which the enzyme was heat-denatured was prepared, and the GUS activity derived from the expression vector was calculated by taking the difference between the converted values.
  • Extraction of total RNA from B. safaria leaves was performed by the following method based on the SDS / phenol method. Grind 1 g of Bensamiana leaves in a mortar while adding liquid nitrogen. Extraction buffer (EB) [50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 150 mM sodium chloride, 5 mM EDTA, 5% SDS] 5 ml, PCI [Phenol I black-mouthed form I isoamyl alcohol (50: 49: 1, v / v / v)] 0.4 ml, added to a 50 ml sterile centrifuge tube containing mercaptoethanol 10 I, 1 The mixture was vigorously mixed for 1 minute, 4.8 ml of PCI was added, and the mixture was gently stirred.
  • EB Extraction buffer
  • PCI Phenol I black-mouthed form I isoamyl alcohol (50: 49: 1, v / v / v)
  • a resuspension buffer [50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.5% SDS] was added to the obtained precipitate, and the mixture was gently shaken for 15 minutes to suspend.
  • the suspension was added with 0.2 ml of 4 M sodium chloride and 4 ml of ethanol, allowed to stand at -20 ° C for at least 2 hours, and then centrifuged (1,300 X g, 15 minutes).
  • the precipitate obtained is washed with 1 ml of cold 703 ⁇ 4 ethanol, suspended in 1 ml of TE buffer [10 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA], transferred to an eppendle tube, and treated with 10 M chloride. 250 l of lithium was added and left on ice for 1 hour. The suspension was centrifuged at 4 ° C (22,000 ⁇ g, 15 minutes), and the RNA was collected as a precipitate. This J-thium precipitation procedure is repeated twice, and the resulting precipitate is suspended in TE buffer 300 ⁇ I, and chloroform I isoamyl alcohol (24: 1, ⁇ / ⁇ ) 100 ⁇ .I is added, followed by vigorous stirring.
  • RNA sample After centrifugation at 4 ° C (22,000 X g, 15 minutes). To the aqueous layer (upper layer), add 1/10 volume of 3 M sodium acetate (pH 5.2) and 2 volumes of ethanol, leave at -20 ° C for more than 2 hours, and centrifuge (2.2,000 X g , 5 minutes). The resulting precipitate was washed with cold 70% ethanol, air-dried for 10 minutes, and suspended in TE buffer 40 ⁇ I to obtain total RNA. This was stored at -80 ° C as an RNA sample.
  • 3 M sodium acetate pH 5.2
  • the nylon membrane to which RNA was adsorbed was placed at 42 ° C in a pre-equilibration solution [50% formamide, 5X Denhardt's solution (Reference 37), 5X SSPE (Reference 37), 0.5% SDS , 100 ⁇ g / ml heat-denatured salmon sperm DNA (Pharmacia)], followed by addition of a 32 P-labeled DNA probe, followed by hybridization at 42 ° C. for 16 hours or more.
  • a pre-equilibration solution [50% formamide, 5X Denhardt's solution (Reference 37), 5X SSPE (Reference 37), 0.5% SDS , 100 ⁇ g / ml heat-denatured salmon sperm DNA (Pharmacia)]
  • the membrane is placed in 4 x SSPE containing 0.1% SDS for 15 minutes at room temperature (twice), 4 x SSPE containing 0.1 3 ⁇ 4 SDS at 60 ° C for 15 minutes, and 60 ° C in 2 x SSPE containing 0.1 3 ⁇ 4 SDS. Washed sequentially under C for 15 minutes (once). Autoradiography was performed at -80 ° C using X-ray film OMAT-AR (Kodak) and intensifying screen Lighting Plus (Dupont).
  • Plasmid pTEAS (Facchini and Chappel, 19992) into which tobacco TEAS cDNA was incorporated was used as a type I primer. ) was used to amplify the TEAS cDMA fragment by PCR.
  • the reaction was performed using TaKaRa Taq TM (Takara Shuzo) and 2 ng of plasmid incorporating Insulin DNA in a DMA thermocycler (PJ2000, Perkin Elmer Cetus) at 94 ° C for 1 minute (thermal denaturation).
  • the reaction was performed at 53 ° C for 45 seconds (annealing), 72 ° C for 2 minutes (DMA extension reaction), and 25 cycles.
  • the size of the amplified DNA fragment was confirmed by 0.8 agarose electrophoresis.
  • the DMA fragment was purified from the gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). 32 P-labeled DNA probe random priming method (Literature 1 7) with [a- 32 P] dCTP (111 TBq / ram o I, I CN Biochemicals) Oyohi Megaprime DNA label l ing system (, Amersham) Produced. ⁇ Example 9> Response of PVS3 promoter deletion clone introduced by Agroinf i tration to INF1
  • INF1 a P. infestans-derived elicitor protein
  • Fig. 27 A binary vector in which the GUS gene containing the intron was ligated in-frame to the downstream of the PVS3 promoter was introduced into Bensamiana leaves by Agroinfir I tration, and GUS activity induced by INF1 induction was examined (Fig. 27). .
  • the binary vector PPVS3-1 into which the full length of the PVS3 promoter was inserted was introduced, a remarkable increase in GUS activity was observed as compared with the water-treated control (Fig. 28).
  • StMEK1 DD is a constitutively active mutant obtained by amino acid substitution of MAPKK, and it has been confirmed that SIPK and WIPK are induced when introduced into vensamiana leaves by Agroinfil tration (Reference 64).
  • Agroinfil tration Reference 64.
  • a binary vector in which the GUS gene containing intron was linked to the PVS3 promoter was analyzed by Agroinf i Introduced to Bensamiana.
  • Example 1 Effect of SIPK and WIPK silencing on PVS3 promoter activity induced by StMEK1 D °
  • the expression vector obtained by linking the StMEK1 DD gene to the 35S promoter overnight to Bensamiana silencing SIPK and WIPK was used by Agroinfritration. Introduced to Libensamiana and temporarily extracted all RMAs. Northern solution using TEAS cDI as probe We prayed that silencing of both SI PK and W1PK significantly suppressed TEAS mRNA accumulation (Fig. 3 2 'o This result indicates that SIPK and WIPK play a similar role in PVS3 promoter activity.
  • a PVS3 promoter was ligated upstream of the GUS gene to examine a promoter region important for PVS3 gene expression, and a delivery clone was constructed.
  • the GUS activity was measured after treatment with INF1 (Fig. 28). No increase was observed ( ⁇ 28) .It is known that gene transcription is induced by the binding of a protein, a transcription factor generated by stimulation, to a cis sequence in the promoter region. Yes It is thought that there is a cis sequence that binds to a transcription factor between Yong PPVS3-2 and pPVS 3-3 At this time, a known control motif is found in this 50 bp region (SEQ ID NO: 23). I could't do that (Fig. 29).
  • SIPK 3-hydroxy-3- methy Iglutary I CoA reductase
  • HMGR 3-hydroxy-3- methy Iglutary I CoA reductase
  • the pathogen-responsive promoter provided by the present invention can be used for specifically expressing a desired gene in plant cells at the time of infection with a pathogenic bacterium. Therefore, for example, by using a gene involved in a defense response, it becomes possible to produce a pathogen-resistant plant that can rapidly respond to a defense response when infected with a pathogenic bacterium.

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Abstract

　病原菌の感染に対して特異的に応答するプロモータ（病原菌応答性プロモータ）を提供する。ジャガイモ植物のPVS3プロモータ領域（配列番号１）からなるDNAを含む病原菌応答性プロモータが開示される。また、プロモータ活性に重要な領域（配列番号２３）が開示される。

Description

明 細 書 病原菌応答性プロモータ 技術分野
本発明は病原菌に対する応答性を有するプロモータ及びそれを利用した病原菌 耐性植物に関する。 背景技術
ジャガイモ疫病菌 （Phytophthora infestans) とジャガイモ植物との間におい ては、 明確なレース—品種間の特異的寄生関係が存在する。 このような特異的な 宿主一病原菌相互関係は、 菌の保有する非病原性遺伝子と、 宿主の持つ真性抵抗 性遺伝子の組み合わせによって決定する場合が多い。 非親和性レースが感染を試 みる場合、 宿主において動的抵抗反応が誘導される。 すなわち、 活性酸素生産、 過敏感細胞死、 フアイ 卜ァレキシン （ジャガイモにおいてはリシチン） の生成、 P R (Pathogenesis-Related) タンパク質の発現、 パピラ形成、 リグニン化などの過 敏感反応を伴う抵抗反応が感染組織において発現し、 菌の進展が停止する （文献 1 5、 3 2、 4 4、 4 5、及び 4 7を参照）。一方、 親和性レースが感染する場合、 これらの抵抗反応が誘導されず、 菌の侵入は進展し,、 ジャガイモ植物の致命的な 全身的感染症であるジャガイモ疫病が引き起こされる。 これら動的抵抗反応の中で、 最も重要で局所的な抵抗反応の一つがフアイ 卜ァ レキシンの蓄積であると考えられている。 フアイ 卜ァレキシンは病原菌の感染時 に蓄積誘導され、抗菌作用をもつ低分子の物質であり、感染成否の決定において、 重要な役割を果たすことが示されてきた（文献 1 2、 1 3、 2 1 、 2 8、 及び 4 6 を参照）。ジャガイモにおけるフアイ 卜ァレキシンはセスキテルペン化合物であリ、 イソプレノィ ド代謝系で合成される（図 1 )。
ジャガイモにおいて、 ェリシター処理や非親和性レースを接種することで、 ス テロール · ダリコアルカロイ ド合成からセスキテルぺノィ ドフアイ 卜ァレキシン 合成へとイソプレノィ ド合成が急激に転換することが知られている。この現象は、 イソプレノィ ド合成系の律速段階に関わるステロール · ダリコアルカロイ ド合成 経路とイソプレノイ ドフアイ 卜ァレキシン合成経路の分岐点にそれぞれ関わるス クアレンセシンターゼおよびセスキテルペンシクラーゼの協調的な制御によるも のであると考えられている（文献 8を参照）。 ジャガイモのセスキテルペンシクラ ーゼはべティスピラディンシンターゼであり、 ポテトべティスピラディンシン夕 ーゼ （PVS) と命名された （文献 5 3を参照）。ジャガイモ塊茎組織の PV S活性は、 菌接種およびジャガイモ疫病菌菌体壁由来のエリシターである H1VC処理によリ著 しく増加することが報告されている（文献 5 4を参照）。 また、 タバコ植物におい てもェリシター処理により、 セスキテルぺノイ ド合成経路が活性化し、 ファイ ト ァレキシンの一種である力プシジオールが合成されることが知られている（文献 4 2及び 4 8を参照）。最近になって、 これらの現象が遺伝子発現レベルで明らか となってきた。ジャガイモにおける PV Sとスクアレンセシンターゼの c DMAを単離 し、 これらのクローンをプローブとして、 ジャガイモ塊茎より抽出した RNAを用 いてノーザン解析したところ、 親和性および非親和性レース接種区において P V S mRNAの一過的な蓄積誘導が認められた。 その一方で、 スクアレンセシンターゼは 傷害によって m RNAの蓄積が誘導されるものの、親和性および非親和性レースを接 種すると蓄積抑制が観察されることが示されている（文献 5 3を参照）。 しかしな がら、 この報告は、 非親和性レースの接種においてのみファイ トァレキシンが生 合成され、 菌の進展が停止することと矛盾する（文献 4 0を参照）。 植物の遺伝子の多くは多重遺伝子族を形成しており、 各ァイソジーンが器官特 異性や刺激に応答した代謝変動に対して異なつた役割を果たすことが一般的に知 られている。ジャガイモ植物における PVS遺伝子は多重遺伝子族を形成しておリ、 PVS1〜4 のメンバーが存在することが報告されている（文献 5 3を参照）。 しかし ながら、 これらの各メンバーの発現動向についての詳細は未詳である。
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植物が備える抵抗反応を利用して病害耐性を強化する試みがなされている。 そ の一つとして、 病害応答性プロモータを利用して病害時特異的に抵抗性誘導物質 を生成させる方法が検討されている。 かかる方法によれば、 病害時に特異的かつ 迅速な抵抗性誘導物質の生成が行われ、これによつて効果的な防御が達成される。 過去にいくつかの病害応答性プロモータが発見されているが、 これまでに報告 されている病害応答性プロモータは病原菌の感染のみならず傷害又は生育段階に おいても誘導される場合が多い。 したがってこのようなプロモータを用いて抵抗 性誘導物質の生成に関与する遺伝子を導入した形質転換植物を作出したとしても、 病原菌の感染現場以外 （感染時以外） においても導入遺伝子が発現し、 これによ つて植物が害を受けることが予想される。 本発明は以上の背景の下なされたもの であって、 病原菌の感染に対して特異的に応答するプロモータ （病原菌応答性プ 口モー夕）、及びそれを利用した病原菌耐性植物の作出方法等を提供することを目 的とする。 本発明者は以上の課題に鑑み、 ジャガイモ植物から、 その病原菌の代表である 疫病菌に対して特異的な応答性を有するプロモータの取得を試みた。 まず、 ファ ィ 卜ァレキシンの生成に関与する遺伝子であるポテトべテイスビラディンシン夕 ーゼ （PVS) に注目し、 疫病菌の主な 1 次感染場所である葉組織における各 PVS メンバー （PVS 1〜PVS4) の発現動向を詳細に検討した。 その結果 PVS 3のみが親和 性レース又は非親和性レースのいずれを接種した場合においても著しく誘導され ることが分った。 即ち、 PVS 3のプロモータは親和性レースの感染に対しても応答 性を示すことが判明した。
次に、 ジャガイモゲノムライブラリーを構築し、 これを利用して PVS 3の配列の 解読を試みた。度重なるスクリーニングの末に PVS3ゲノム DNA配列を決定するこ とに成功した。決定された配列情報を基にして PVS 3プロモータ領域を推定しその 機能を検討したことろ、 疫病菌に対する応答性が確認された。 当該推定プロモー 夕領域の機能を更に詳細に調べるため、 まず GUS遺伝子の上流に当該推定プロモ 一夕領域を連結したものを導入したジャガイモ形質転換体を作出した。 この形質 転換体を用いて種々の実験を行った結果、 葉組織の切除 （傷害） によっては GUS 染色が認めらず、一方で疫病菌親和性レースの接種によって G U S染色が確認され、 このプロモータ領域が疫病菌特異的、 即ち病原菌特異的な応答性を示すことが確 認された。
以上のように、 本発明者は病原菌の感染に対して特異的に応答するプロモータ (病原菌応答性プロモータ） の取得に成功した。 このプロモータを利用すれば、 病原菌に感染したときにのみ特定の遺伝子を発現する植物を作出することが可能 となる。 即ち、 当該プロモー夕を連結した遺伝子を導入して得られる形質転換体 では、 病原菌の感染に対して、 導入したプロモータが特異的に誘導され、 その結 果導入遺伝子が発現する。 導入遺伝子として防御応答を活性化するものを採用す れば、 病原菌の感染に対して特異的に防御応答が活性化される植物、 即ち病原菌 の感染に対して高い耐性を有する植物の作出が可能となる。 ここで、 一般に遺伝子の転写は、 プロモー夕領域内のシス配列と呼ばれる数塩 基から十数塩基の配列に転写活性因子と呼ばれるタンパク質因子が結合すること によって開始される （文献 6 6 )。 したがって、 シス配列を特定することが転写機 構解明の第一歩となる。 このことに鑑み、 次に本発明者は、 同定に成功した上記 推定プロモータの一部を順次削除した PVS3プロモー夕配列と GUS遺伝子のキメラ 遺伝子 （PVS3:GUS) を、 ァグロパクテリゥ厶 (Agrobacterim t隱 faciens) によ り一過的に葉組織に導入して PVS3プロモータ活性を調べた。 その結果、 プロモー 夕活性に重要な領域である 50bp (配列番号 2 3 ) の領域を見出した。 即ち、 PVS3 プロモータ活性の発現に必須と考えられる 50bp の領域を同定することに成功し た。 尚、 現時点においてこの領域中に既知の制御モチーフを見出すことはできな かった。 本発明者が同定に成功した病原菌応答性プロモータ （PVS3プロモータ） はジャ ガイモ植物から得られたものであるが、 その適用対象はジャガイモ植物に限られ るものではないと考えられる。 まず第 1 に、 PVS3はジャガイモ植物においてファ イ トァレキシンの合成を触媒する酵素であるが、 ジャガイモ植物と他のナス科植 物はフアイ 卜ァレキシンがテルペン系の化合物である点で共通し、 またフアイ 卜 ァレキシンの合成経路も共通している。 さらに、 後述するように本遺伝子は SIPK および WIPKに依存して誘導されるが、一般に、 両酵素はナス科植物に限らず多く の植物に共通して防御応答に関与することが知られている。 このような多くの共 通点を考慮すれば、 本発明のプロモータ （PVS3プロモータ） は、 ナス科植物のみ ならず S I PKおよび Wl PKオルソログの重要性が報告されているアブラナ科 （文献 5 7を参照）、 マメ科植物 （文献 5 8を参照）を始めとして他の広範な植物におい ても同様に病原菌応答性プロモータとして利用できると予想される。 本発明は以上の研究成果及び知見に基づいて完成されたものであって、 以下の 各構成を提供する。
[1 ] 以下の（a)〜（c)のいずれかの DNAを含む病原菌応答性プロモータ、
(a) ： 配列番号 1 で示される塩基配列からなる DMA、
(b)：配列番号 1 で示される塩基配列において 1 若しくは複数の塩基が置換、 欠 失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロモ 一夕として機能する DNA、
(c)： (a)又は（b)の DNAとス卜リンジ Iン卜な条件下で八イブリダィズし、 植物 細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する DNA。
[2] 以下の（A)〜（C)のいずれかの DNAを含む病原菌応答性プロモー夕、 (A) ： 配列番号 2で示される塩基配列からなる DNA、
(B)：配列番号 2で示される塩基配列において Ί 若しくは複数の塩基が置換、 欠 失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロモ 一夕として機能する DNA、
(C)： (A)又は（B)の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、 植物 細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する DNA。
[3] 以下の（1)~(3)のいずれかの DNAを含む病原菌応答性プロモー夕、
(1)：配列番号 1 で示される塩基配列内の連続した一部分からなり、植物細胞内 で病原菌応答性プロモータとして機能する DMA、
(2) : (1)の DMAにおいて 1若しくは複数の塩基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加 された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する
DMA、
(3)： (1)又は（2)の DMAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、 植物 細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する DNA。
[4] 以下の（i)~ (ί i ί)のいずれかの DNAを含む病原菌応答性プロモータ、 (i) ： 配列番号 2 2で示される塩基配列からなる DNA、 (i i) :配列番号 2 2で示される塩基配列において 1 若しくは複数の塩基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロ モータとして機能する DMA、
(i i i) ： (i)又は（i i)の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 植物細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する DNA。
[5] 以下の（1)~(1リ） のいずれかの DNAを含み、植物細胞内で病原菌応答性 プロモータとして機能する病原菌応答性プロモータ、
(I) ： 配列番号 2 3で示される塩基配列からなる DNA、
(I I) :配列番号 2 3で示される塩基配列において 1若しくは複数の塩基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなる DMA、
(I I I) ： (I)又は（I I)の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする DNA。
[6] 疫病菌の感染に対して特異的に応答する、 ことを特徴とする Π ]~ [5 ] のいずれかに記載の病原菌応答性プロモータ。
[7] 配列番号 2 3で示される塩基配列からなる DNA。
[8] 配列番号 2 3で示される塩基配列の中の連続する 1 0個以上の塩基配列 からなり、 病原菌応答性プロモータ活性を有する DNA。
[9] [1；]〜 [6]のいずれかに記載の病原菌応答性プロモー夕を含むベクター t
[1 0] [7]又は [8]に記載の DNAを含むベクター。
[1 1 ] [1 ]~ [6]のいずれかに記載のプロモータと、 及び該プロモータの制 御下に連結される遺伝子であって、 植物内で発現して該植物の防御応答を活性化 する遺伝子と、 を含む DMAコンストラク ト。
[1 2 ] [7]又は [8]に記載の DNAと、 該 DNAと協同して病原菌応答性プロモ 一夕を構成する DNAと、 構築された病原菌応答性プロモータの制御下に連結され る遺伝子であって、 植物内で発現して該植物の防御応答を活性化する遺伝子と、 を含む DNAコンストラク ト。
[1 3] 前記遺伝子はその発現産物が植物の防御応答を制御する情報伝達経路 を活性化する機能を有する、 [ 1 1 ]又は [1 2]に記載の DNAコンストラク ト。
[1 4] 前記遺伝子はその発現産物が SIPK又は W1PKを活性化する機能を有す る、 [1 1 ]又は [1 2]に記載の DNAコンストラク ト。
[1 5 ] 前記遺伝子は、 恒常的活性型 MEKをコードする遺伝子である、 [1 1 ] 又は Π 2]に記載の DMAコンストラク 卜。
[1 6] [ 1 1：!〜 [1 5]のいずれかに記載の DNAコンストラク 卜で宿主植物を 形質転換して得られた形質転換体。
[1 7 ] 前記宿主植物がナス科に属する植物である、 [ 1 6]に記載の形質転換 体。
[1 8] 前記宿主植物がジャガイモ属に属する植物である、 [1 6]に記載の形 質転換体。
[1 9 ] 以下のステップを含む、 形質転換植物の作出方法、
[ 1 1：]〜 [ 1 5]のいずれかに記載の DNAコンストラク トで宿主植物を形質転換 するステップ。
[2 0] 以下のステップを含む、 宿主植物に病原菌耐性を付与する方法、
[1 1 ]~ [ 1 5]のいずれかに記載の DNAコンストラク トで宿主植物を形質転換 するステップ。
[2 1 ] [ 1；]〜 [6]のいずれかに記載の病原菌応答性プロモータが外来的に導 入されている植物。
[2 2] [7]又は [8]に記載の DNAが外来的に導入されている植物。 本発明において「病原菌応答性プロモータ」とは、 病原菌の感染に対して応答す る （誘導される） プロモー夕を意味する。 ここで「プロモータ」とは、 その制御下 にある遺伝子の転写の開始を調節する機能領域のことをいう。
本発明において「外来的に導入された」とは、 外部から導入されたものであるこ とを意味する。 したがって「外来的に導入されたプロモータ」とは、 宿主細胞に対 して外部から導入されたプロモー夕のことであり、 例えば導入するプロモータと 同一のプロモータを宿主細胞が初めから保有していた場合には、 同一の構成では あるが導入されたプロモータのみを外来的に導入されたプロモータと呼び両者を 区別する。
本発明において用語！" DNAを含む」は、「DNAからなる」の意味をも含む表現として 使用される。 したがって例えば、 「特定の DNAを含むプロモータ」といった場合に は、 それが意味するものとして「当該 DNAからなるプロモータ」も当然に考慮され る。
本明細書において使用される各略号の意味は次の通りとする。 ATP: adenosine 5 -triphosphate^ BPB： bromopheno I bl ue、 BSA: bovi ne serum albutniru CBB： coomass i e bri l l i ant blue、 CTP： cytidi ne 5' -triphosphate, DEPC： d i e thy I p y rocarbonate、 DTT: d i thiothrei toK EDTA： ethy I ened i am i ne-N, N, N' , ' - tetraacet i c acid. EGTA: ethy leneglycol bis (β-amonoethy I ether) ethyl ened i am i ne-te t raace t i c acid, FPP : f arnesy I diphosphate, GAP： I y ce ra I dehyde 3 - phosphate、 GTP： guanos i ne 5' -triphosphate, HMG-CoA: 3 - hydroxy - 3 - methy I gl utary I coenzyme A、 HMGR： 3-hydroxy-3-methy I gl utary I coenzyme A reduc ta se、 HWC： hypha I wal l components^ I : immnogl obu I i I PP: i sopenteny I dip hosphate、 I PTG： isopropyl-l-thio-j8 -D-t h iogalactoside, kD： ki lodal ton、 M OPS： 3 - (N-morpho 1 i no) propanesu I f on i c acid、 PAGE： po I y ac ry I am i de gel el ect rophores i sv PBS： phosphate-buffered sal i ne、 PCR： polymerase chai n rea ct ion、 PMSF： pheny I methy I su I f ony I f I uo r i de¾ PR: pathogenes is related、 SD S： sodium dodesy I su l fate, SHAM： sa I ycy I hyd roxam i c acid, SSPE： sodi um ch ro I i de-sod i um phosphate, EDTA、 TBE: tris - borate, EDTA、 TBS： tris-buf fere d sal ine、 TE： t r i s-EDTA, Tris: 2-N-t r i s (hydroxymethy I) ami nomethanev TT P： thiami ne 5'· - triphosphate、 X-ga I： 5-bromo-4-ch 1 oro-3-indolyl-/3 -D-ga I actos i deQ
尚、 特に記載のない限り、 以下における遺伝子工学的操作は、 Molecular Clon i ng (Thi rd Edi ti on, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或いは Current protocol s in mo I ecu I ar biology (edi ted by Frederick . Ausube I e t al .， 1987) を参考にして行うことができる。 本発明によれば、 病原菌の感染によって誘導されるプロモータが提供される。 本発明のプロモータを利用して遺伝子導入を行えば、 形質転換植物内において所 望の遺伝子を病原菌の感染時特異的に発現させることが可能となる。 従って、 例 えば防御応答に関与する遺伝子を用いることにより、 病原菌の感染時において迅 速な防御応答が行われる病原菌耐性植物の作出が可能となる。 図面の簡単な説明
図 1 はジャガイモ塊茎における、 刺激応答性イソプレノイ ドの生合成経路を示 す図である。 過敏反応中はセスキテルペイ ドフアイ トァレキシン合成が活発に行 われ、 傷害誘導性ステロール及びステロイ ド · ダリコアルカロイ ド合成は抑制さ れる。 ' 図 2は疫病菌 （Phytophthora infestans) 感染後における、 加齢ジャガイモデ イスク内の PVS (potato vetispi radiene synthase) 遺伝子及び PSS (potato sq ualene synthase) 遺伝子の発現状態を示す図である。 レース 0 (非親和性）、 若 しくはレース 1、 2、 3、 4 (親和性） の感染 （104遊走子 ディスク）、 又は水処理 に先立ちジャガイモディスクを 24時間加齢させた。 図 3は非親和性疫病菌 （P. infestans) 若しくは親和性疫病菌の感染後 （順に Incomp. % Comp.), 又は水処理後 （Mock) の加齢ジャガイモディスクから抽出した 全 RNAを使用した RT- PCRの結果を示す図である。 PVS1、 PVS2、 PVS3、 及び PVS4 についてそれぞれクローン特異的プライマーを用いて PCRを行った。 PVS1、PVS2、 PVS3、 及び PVS4についてそれぞれ 469bp、 132bp、 326bp、 及び 469bpの増幅産物 が得られた。
図 4は非親和性疫病菌 （P. infestans) 若しくは親和性疫病菌の感染後 （順に Incomp.、 Comp.), 又は水処理後 （Mock) 後の加齢ジャガイモディスクから抽出し た全タンパク質を用いたウェスタンプロッ 卜解析の結果を示す図である。 SDS-ポ リアクリルアミ ドゲル電気泳動によって各 10 ig の全タンパク質を分離し、 PVS に対する抗血清を用いて免疫プロッ 卜を行った。 検出には HRP結合抗マウス抗体 及び ECL検出キッ 卜を使用した。
図 5は水処理後 （Mock)、 傷害処理後 （Wound), 又は非親和性疫病菌 （P. infe stans) 若しくは親和性疫病菌の感染後 （順に Incomp.、 Comp. ) のジャガイモ葉 から抽出した全 RMAを用いた RT- PCRの結果を示す図である。 レーン了 非親和 性疫病菌の感染後 6時間経過させたジャガイモ塊茎から得られた RT- PCR 産物を 用いたポジティブコントロール。 各メンバ一 （PVS1、 PVS2、 PVS3、 及び PVS4) に 特異的なプライマーを使用した。 その結果、 176bp、 132bp、 326bp、 及び 131bp の産物がそれぞれ得られた。ァガロースゲル電気泳動によって RT-PCR産物を分離 し、 ナイロン膜に転写した。 転写後の膜に対して 32 P ラベルした各 PCR産物をハ イブリダィズさせた。
図 6は PVS3ゲノムクローンの塩基配列及び推定アミノ配列を示す図である。尚、 図 6では推定プロモー夕領域及びコード領域の一部が示される。 ァミノ酸配列は それをコードする塩基の下に表示されている。非コード領域は小文字で表される。 終止コ ドンはアスタリスクで示される。 図 7は同じく PVS3 ゲノムクローンの塩基配列及び推定アミノ配列を示す図で ある。 尚、 図 7ではコード領域の一部及びそれに続く非翻訳領域が示される。 ァ ミノ酸配列はそれをコードする塩基の下に表示されている。 非コード領域は小文 字で表される。 終止コ ドンはアスタリスクで示される。
図 8は PVS3ゲノムクローン及び PVS3CDMAクローンの制限酵素地図及び構造地 図を示す図である。 コード領域は中抜きボックスで表される。 太線はイン卜ロン を表す。 垂直バーはイントロン位置に対応する。
図 9は Nicotiana tabacum (TEAS) ¾ Solatium tuberosum (PVS) , Hyoscyamus mu ticus (HVS)、 及び Capsium annum (PEAS)のアミノ酸配列の配置を比較して示し た模式図である。 各ェクソンに対応する推定アミノ酸を使用した。 太字の垂直バ —は、 . tabacum遺伝子内、 S. tuberosum遺伝子内、 H. mu t i cus遺伝子内、 及 びじ. annum遺伝子内のイン卜ロン位置を示す。ボックス内の数字はェクソンによ つてコ一ドされるアミノ酸残基数を示す。 パーセン卜表示は比較されるドメイン 間の相同性スコアを示し、 H、 及び DDXXD (又は DDXX) はヒスチジン、 システ イン、 及びァスパラギン酸に富む （基質結合部位として知られる） 保存残基を示 す。
図 1 0は疫病菌菌体壁成分による処理後、 又は水処理後のジャガイモプロ 卜プ ラス卜内のルシフェラーゼ活性を測定した結果である。 （A) は PVS3プロモータ領 域を用いた卜ランジェン卜アツセィに使用した Luc遺伝子の構成を示す。 （B) に おいて、 35S は CaMV 35S プロモータ領域を用いた場合のルシフェラーゼ活性を、 HWCは推定プロモータ領域を用い HWCで処理した場合のルシフェラーゼ活性を、 W aterは HWCの代わりに水で処理した場合のルシフェラーゼ活性をそれぞれ表す。 図 1 1 は PVS3プロモータのコンストラク 卜を模式的に示す図である。 GUSはレ ポーター遺伝子である。
図 1 2は傷害に応答して PVS3プロモ一夕が誘導する GUSの発現パターンを示す 図である。 PVS 3プロモータを有する形質転換ジャガイモ葉組織を使用した。 図 1 3は疫病菌感染に応答した、 PVS 3プロモータの発現パターンを示す図であ る。 形質転換ジャガイモ葉組織 （メークイン） 又は染色対照区として非形質転換 ジャガイモ葉組織 （リシリ） をレース 0に感染させた （メークインに対して親和 性、 リシリに対しては非親和性）。 感染後 6時間、 1 2時間、 24時間、 及び 48時間 経過した時点での GUS活性を、 GUS染色溶液を用いて検出した。 顕微鏡下で観察 を行った。
図 1 4は形質転換ジャガイモ植物における、 PVS 3プロモータが誘導する GUSの 発現パターンを示す図である。 GUS染色溶液を用いて形質転換ジャガイモ植物の G US活性を検出した。 矢印は疫病菌感染領域 （GUS染色のコントロール） を示す。 図 1 5はァラキドン酸（AA) に応答して PVS 3プロモー夕が誘導する GUSの発現 パターンを示す図である。 AA ( 5 mM) 又は水を形質転換ジャガイモ葉組織に注入 した。 注入後 6時間、 12時間、 及び 24時間経過した時点での GUS活性を GUS染 色溶液を用いて検出した。
図 1 6は H202に応答して PVS 3 プロモータが誘導する GUSの発現パターンを示 す図である。 H202 ( 5 mM) を形質転換ジャガイモ葉組織に注入した。 注入後 6 時 間、 1 2時間、 24時間、 及び 48時間経過した時点での GUS活性を GUS染色溶液を 用いて検出した。
図 1 7はグルコース/グルコース才キシダーゼに応答して PVS 3 プロモータが 誘導する GUSの発現パターンを示す図である。 グルコース （5 mM) 及びダルコ一 ス才キシダーゼ （0. 5 U/m l ) を形質転換ジャガイモ葉組織に注入した。 注入後 6 時間、 1 2時間、 24時間、 及び 48時間経過した時点での GUS活性を、 GUS染色溶 液を用いて検出した。
図 1 8はサリチル酸（SA) に応答して PVS 3プロモー夕が誘導する GUSの発現パ ターンを示す図である。 SA ( 0. 5 mM) を形質転換ジャガイモ葉組織に注入した。 注入後 6時間、 12時間、 24時間、 及び 48時間経過した時点での GUS活性を GUS 染色溶液を用いて検出した。
図 1 9は Cf- 9/Avr9相互作用又は StMEKDDに応答して PVS3プロモー夕が誘導す る GUSの発現パターンを示す図である。 35s、 Cf- 9/Avr9、 StMEKDD、 あるいは空べ クタ一 （コントロール） を保有するァグロパクテリゥ厶を形質転換ジャガイモ葉 組織に接種した。 ァグロパクテリゥ厶接種後 2 日経過した時点での GUS活性を、 G US染色溶液を用いて検出した。
図 2 0はェリシター誘導シグナル伝達経路を模式的に示した図である。 MAPKKK; mi togen-act i vated protein kinase kinase kinase, MAPKK;mi togen - activated protein ki nase kinase, MAPK； m i togen-act i vated protein ki nase, S I PK ; sa I i c y I i c ac i d- i nduced protein kinase, Wl PK;wound-i nduced protein ki nase, H G R;3-hydroxy-3-methy l utary I CoA reductase, PVS;potato ve t i s i rad i ene syn thase
図 2 1 はジャガイモ植物の MEK遺伝子（MEK) のコード領域の配列及びそれによ つてコードされる推定アミノ酸配列を示す図である。
図 2 2は恒常的活性型 MEK遺伝子 （StMEKDD) のコード領域の配列及びそれによ つてコードされる推定アミノ酸配列を示す図である。
図 2 3は実施例において使用されるプライマー配列の位置を示す図である。尚、 各プライマー位置を示す矢印とともに記載される番号は配列番号を表す （例えば P9であれば配列番号 9の配列を有するプライマー）。 実施例 2においては P9、 PI
0、 P11、 P14、 P15、 P16、 P17、 及び P18を用いた。 他方、 実施例 4においては PI
1、 P12、 P13、 P14、 P15、 P16、 P19、 及び P20を用いた。
図 2 4は pPVS3- 1から PPVS3-10のデリーシヨンクローンの構築に使用したブラ イマ一配列を示す。 Fはフォワードプライマ一、 Rはリバースプライマーを示し、 下線は制限酵素の位置を示す。 図 2 5は卜ランジェン卜アツセィに使用した PVSプロモータ領域を含むバイナ リーべクタ一の構造を示す。 GUS遺伝子はイン卜ロンを含んでいる。
図 2 6は INF1処理または StMEKlDD発現に対する PVS3プロモータ活性を調べる 方法を示す。 INF1 の場合は PVS3： GUSint を保持したァグロパクテリゥ厶を葉に 注入し、 StMEKlDDの場合は PVS3： GUSint と XVE： S tMEK1 DDを保持したァグロパク テリゥムの混合液を葉に注入して 1 日間静置する （A)。 その後、 INF1 の場合は I MF1溶液を葉に注入し、 StMEK1Mの場合は /3-エス卜ラジオールを注入した後 （B) さらに 1 日静置して StMEKlDDを発現させて GUS活性を調べた （C)。
図 2 7はウィルス誘導型遺伝子サイレンシングの手順を示す。 （A) はサイレン シングベクターである PGR106の構造を示す。サイレンシングする目的の遺伝子断 片、 この場合は SIPKおよび WIPKの cDNA断片を PGR106 に挿入して用いる。 （B) はベクターを含むァグロパクテリゥ厶の接種によるウィルス感染を示した模式図 である。
図 2 8は、 INF1 処理に対する PVS3 プロモー夕活性を示す。 -1337 (pPVS3-2) では対照区に比べて INF1 を注入すると GUS活性が誘導された。 一方、 -1287 (pP VS3- 3)まで PVS3プロモー夕をデリ一シヨンすると INF1処理による GUS活性誘導 は顕著に減少した。
図 2 9は PVS3プロモータの塩基配列および PPVS3- 1 から pPVS3- 10までのデリ ーション位置を示す。シス配列が存在すると思われる- 1337と- 1287の間の配列を 太字で示し、 推定上の TATAボックスおよび CAATボックスを四角で囲んだ。
図 3 0は StMEK1DD発現に応答する PVS3プロモータ活性を示す。 -1337 (pPVS3- 2)では対照区に比べて j8-エス卜ラジオールを注入すると GUS活性が誘導された。 —方、 -1287 (pPVS3-3) まで PVS3プロモータをデリーシヨンすると -エストラ ジオール処理による GUS活性誘導は顕著に減少した。
図 3 1 は、 StMEK1DD発現で誘導される PVS 3 プロモータ活性に及ぼす MM PKまた は SIPKの影響を調べる方法を示す。 PVS3： GUSi nt と XVE： S tMEK1DDを保持したァ グロパクテリゥ厶の混合液をサイレンシング葉に注入して 1 日間静置する （八）。 ;8 -エス卜ラジオールを注入した後 （B)、 さらに 1 日静置して StMEK1DDを発現さ せて GUS活性を調べた （C)。
図 3 2は StMEKlDD発現で誘導される PVS3プロモータ活性および TEAS遺伝子発 現に及ぼす WIPKまたは SIPKの影響を示す。 ΙίΜΡΚまたは S Kをサイレンシング すると、 StMEK1DD誘導による PVS3プロモータ活性が著しく抑制された （A)。 さら に、 全 RNAを抽出してノーザン解析したところ、 ΙίΙΙΡΚおよび SIPKをサイレンシ ングした区においてのみべンサミアナのセスキテルペンシクラーゼ遺伝子発現が 抑制されていた （B)。 発明を実施するための最良の形態
(プロモータ）
本発明の第 1 の局面は病原菌応答性プロモータに関し、 その一態様は配列番号 1 で示される塩基配列からなる DNAを含んで構成される。 当該 DNAは、 後述の実 施例に説明されるように、ジャガイモ PVS3遺伝子のプロモータ領域として同定さ れた配列であって、病原菌の一種である疫病菌特異的な応答性が認められている。 更なる検討の結果、 当該 DNAの上流域を欠失した約 1，300bpからなる DNA (配列 番号 2 2 ) であっても目的のプロモータ活性を保持していることが確認された。 かかる知見を考慮すれば、 本発明の好ましい一態様は、 配列番号 2 2で示される 塩基配列からなる DMAを含む病原菌特異的プロモータである。 一方、 この DNA配 列 （配列番号 2 2 ) の上流域 50bp (配列番号 2 3 ) をさらに欠失させたところプ 口モータ活性の劇的な低下が認められた。このことから、この欠失させた 50bp (配 列番号 2 3 ) が、 当該プロモータ活性の発揮にとって極めて重要な領域、 即ち PV S3遺伝子プロモータのシス配列を含む領域であると予想される。 したがって、 当 該領域 （以下、 「第 1 DNA 配列」ともいう） は病原菌応答性プロモータの構築に極 めて有用であり、 また、 当該領域を用いることにより病原菌応答性プロモータを 組み込んだ DNAコンストラク ト （例えば、 植物に対して病原菌耐性を付与するこ とに利用される組み換えベクター。 詳しくは後述の DMAコンス卜ラク 卜の項を参 照されたい。）の設計及び構築を高い自由度で行うことが可能となる。 このように 本発明は他の態様として病原菌応答性プロモータの構築に有用な DNA配列を提供 する。 ここで、 一般にシス配列は十数塩基の配列からなる場合が多いことを考慮 すれば、 第 1 DNA配列の一部がシス配列であると考えられる。 このことは、 第 1 D NA配列の一部の領域からなる DNAであってもそれがシス配列を含む場合には、病 原菌応答性プロモータの構築に有用な DNAとなることを意味する。 このような DN Aとして想定されるものは例えば、第 1 DMA配列中の連続する 1 0個以上の塩基配 列、 好ましくは連続する 1 5個以上の塩基配列、 更に好ましくは連続する 2 0個 以上の塩基配列からなる DNAである。 第 1 DNA 配列 （若しくはその連続する一部、 又は後述するようにその機能が保 持される条件で第 1 DNA 配列若しくはその連続する一部に所望の改変を加えて得 られる DNA (改変体））を用いる場合、他の DNA配列を組み合わせることによって、 病原菌応答性プロモータを構築することができる。 ここでの他の DNA配列は、 第 1 DNA 配列 （又はその改変体） と協同することによって病原菌応答性プロモータ を構築できるものが使用される。 具体的には例えば他の A配列として配列番号 2 4に示されるものを使用することができる。当該 DNA配列は PVS 3遺伝子におい て第 1 DMA配列とコード領域とに挟まれる領域の DNA配列である（図 2 9を参照）。 この領域には CAATボックスや TATAボックスが存在し、 またこの領域を用いるこ とにより本来の PVS 3プロモータ領域が構築されることとなることから、このよう な態様によれば高いプロモー夕活性を有する病原菌応答性プロモータが得られる こととなる。 尚、 この例に限らず、 CAATボックスや TATAボックスなどを含む DM A 配列を採用すれば、 これら転写開始又は転写調節に関与する配列との協同作用 による良好なプロモ一夕機能の発揮を期待できる。尚、ここでの他の DNA配列は、 第 Ί DNA配列に直接又は他の配列を介して連結される。 ここに「病原菌」とは、 植物に感染して被害を与える菌類のことをいい、 疫病菌 をはじめとする病原糸状菌は勿論のこと病原性細菌が含まれる。 ここに Γ疫病菌」 とは Phytophthora属に属する菌類であって、感染対象の植物ごとに分類されてい る。 疫病菌の具体例としては、 ジャガイモ疫病菌 （Phytophthora infestans), タ ノ、'コ疫病菌 (Phytophthora ni coti anae), ダイズ茎疫病菌 (Phytophthora megas perma var. so j ae) リンゴ?殳病菌 (Phytophthora cactorum及び Phytophthora c ambivora) を挙げることができる。 一方、 疫病菌以外の病原糸状菌としては、 ジ ャガイモ菌核病菌 (Sc lerotinia sc I e ro t i o rum)、 ィ不いもち病囷' (Magnaporthe grisea)、 ダイズさび病菌（Phakopso ra pachyrhizi)を例示することができる。 ま た、 病原性細菌としては卜マ卜青枯病菌 （Ralstonia so I anacea rum, 細菌） を例 示することができる。
ここで、 本発明のプロモータ （病原菌応答性プロモータの構築に有用な DNAを 含む。 特に言及のない限り、 以下においても同様である。） は病原菌の感染に対し て特異的な応答性を有することが好ましい。 ここでの「特異的な」とは、 特異性が 高いことを意味する。 したがって、 本発明のプロモー夕は病原菌の感染に対して 高い特異性を有するもの、 即ち、 病原菌の感染に対する応答性を有し且つ病原菌 の感染以外の病害に対する応答性が実質的にないプロモータであることが好まし い。 (プロモータの取得方法） 本発明のプロモータは、 例えば、 ダンシャク （Splanum tuberosum L.) などの ジャガイモ植物から常法でゲノム DNAを抽出した後、 本発明のプロモータに特異 的なプライマーを用いた PCR法等の遺伝子増幅反応を利用して調製することがで きる。具体的には例えば次の手順で本発明のプロモータを調製することができる。 まず、 採取した後に凍結処理したジャガイモ植物の葉又は塊茎を乳鉢中で磨砕す る。 次に、 適当量の抽出用緩衝液 （例えば SDS含有 Tris- HCI緩衝液） を加えて抽 出液とする。 続いて、 フエノール抽出、 エタノール沈殿等によってゲノム DNAの 抽出、 精製を行う。 このようにして得られたゲノム DNAを錶型として配列番号 1 のプロモータに特異的なプライマーを用いた PCR法を実施することにより、 目的 の DMA (プロモータ） が増幅産物として得られる。 プライマ一としては例えば、 次の配列を有する一対のプライマーを使用することができる。
センスプライマー ： TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG (配列番号 1 5 )
アンチセンスプライマー ： TCTCCATGAGTCCTTACATG (配列番号 1 6 ) プライマーは、 目的の DNAを特異的に増幅できるように設計される。 以下に、 配列番号 2 2の DNAを特異的に増幅可能なプライマーセッ 卜を示す。
センスプライマー： CGGAATTCGTCCGCCCTTACTATTCCCATC (配列番号 2 6 )
アンチセンスプライマー ： CCATCGATTCCTCTTCATTGTTAAAGGGGA (配 列番号 3 5 ) 本発明のプロモータの調製方法は上記のものに限定されるものではなく、 例え ば市販のジャガイモゲノムライブラリー （例えば、 ジャガイモ品種 Desireeゲノ 厶ライブラリー （Clontech)) を利用して調製することもできる。 このようなジャ ガイモゲノムライプラリーから目的のプロモータを単離するには、 ライプラリー の種類に応じてプラークハイプリダイゼ一シヨン法あるいはコロニーハイプリダ ィゼ一シヨン法などが利用される （Molecular Cloning, Thi rd Edi tion, Cold Sp ring Harbor Laboratory Press, New York 等を参照）。 例えばファージを用いて 構築されたライブラリ一の場合を例に採ればブラークハイブリダイゼーシヨン法 が利用される。 目的のプロモータ領域を保有するクローンの選択には、 本発明の プロモー夕に特異的な配列を有するプローブが用いられる。
目的とするクローンが選択されれば、このクローンが保有する DMAを鏵型とし、 配列番号 1 の配列に特異的なプライマーを用いた PCR法等を実施することによリ、 本発明のプロモータを増幅産物として得ることができる。
得られたクローンが保有する DNAを適当なベクターにサブクローニングして以 降の利用に供することができる。 これによつて例えば、 形質転換用の組換えべク 夕一の構築 （後述の本発明の第 2の局面を参照） や、 或は塩基配列解読に適した プラスミ ドの構築ができる。
本発明のプロモータの調製方法は上記のものに限られるものではなく、 例えば 市販の DNA合成機などを利用して本発明のプロモータを合成してもよい。
(改変プロモータ）
配列番号 1 の配列はおよそ 2600 bpであってプロモータ領域としてはかなり大 きいことから、 プロモータ活性に直接関与しているのは一部の領域であると予想 される。 このことを考慮して、 配列番号 1 の配列内の連続した一部からなる領域 であっても病原菌応答性プロモータとしての機能が認められれば、 本発明におけ る病原菌応答性プロモー夕を構成し得る。 さらに、 一般にプロモータの機能領域 は構造遺伝子の直前に位置することが多いことを考慮すれば、 例えば、 図 6及び 7に示される PVS3遺伝子の配列において- 2000位〜- 1位の塩基からなる領域（配 列番号 2：)、好ましくは同様に- 1500位〜- 1位の塩基からなる領域（配列番号 3 )、 更に好ましくは同様に- 1 000位〜- 1位の塩基からなる領域 （配列番号 4 ) が機能 領域の有力な候補となる。 実際のところ、 後述の実施例に示すように、 構造遺伝 子の直前に位置する約 1 300 b pの領域（配列番号 2 2 ) を使用した場合においても プロモータ活性を有することが確認された。一方でこの約 1 300 b pの領域の上流域 5 (^ 0 (配列番号2 3 ) をさらに欠失させたところプロモータ活性の劇的な低下が 認められた。 即ち、 PV S 3 プロモータの機能領域の少なくとも一つはこの 50 b p 内 に存在することが判明した。 この事実を考慮すれば、 本発明のプロモータでは、 配列番号 2 3に示される配列を含むことが好ましい。 このようなプロモータの具 体例としては、 配列番号 2 2に示される DMA ( PV S 3遺伝子の- 1 3 37位〜- 1位） を 挙げることができる。 一方で、 一般に、 特定の機能を有する DNAの一部に改変を施した場合において もその機能が維持されることがある。 このことを考慮して、 以上の本発明のプロ モータを構成する DNA (即ち、配列番号 1 で示される D NA、或は上記の機能領域（配 列番号 2 3 ) を含む DMA (例えば配列番号 2 2で示される D NA) ) の一部を改変し た塩基配列を有する DMA (以下、 「改変 DNAJともいう） であっても、 病原菌応答性 プロモータとしての機能を有する限りにおいて本発明の病原菌応答性プロモータ を構成することができる。 別に言えば、 病原菌応答性プロモータ機能を維持する 限りにおいて一部の配列の改変が許容される。 ここでの「一部の改変」とは、 典型 的には、 配列番号 1 (又は配列番号 2 ~ 4のいずれか） に示される塩基配列、 又 は配列番号 2 2に示される塩基配列において 1 若しくは複数の塩基が置換、欠失、 挿入、 又は付加されることをいう。 このような改変は複数の部位に生じていても よい。 ここでの 「複数」 とは改変が行われる位置や改変の種類によっても異なる が例えば 2 ~ 1 0 0個、 好ましくは 2 ~ 5 0個、 より好ましくは 2 ~ 1 0個であ る。 以上のような改変 DNAは例えば、 制限酵素処理、 ェキソヌクレアーゼゃ DNA リガーゼ等による処理、 位置指定突然変異導入法 （Molecular Cloning, Third E d i t i on, Chapter 13 , Co I d Spring Harbor Laboratory Press, New York)やラン ダ厶突然変異導入法 （Molecular Cloning, Third Edi tion, Chapter 13 ，Cold S pring Harbor Laboratory Press, New York)による変異の導入などによって得ら れる。 配列番号 1 (又は配列番号 2 ~ 4のいずれか） の配列を有する DNA、 或いは配 列番号 2 2の配列を有する DNAとス卜リンジェン卜な条件下で八イブリダィズし、 かつ植物細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する DNAを本発明のプロモ —夕を構成する DNAとして用いることもできる。 また、 配列番号 1 の配列に上記 一部の改変を加えて得られる配列 （又は配列番号 2〜 4のいずれかの配列に上記 一部の改変を加えて得られる配列） を有する DNA、 或いは配列番号 2 2の配列に 上記一部の改変を加えて得られる配列とス卜リンジェン卜な条件下で八イブリダ ィズし、 かつ植物細胞内で病原菌応答性プロモ一夕として機能する DMAを用いる こともできる。 ここでいう 「ストリンジェン卜な条件」 とはいわゆる特異的なハ イブリツ ドが形成され、 非特異的なハイブリッ ドが形成されない条件をいう。 ス 卜リンジェン卜な条件は配列の長さや構成塩基の種類によっても変動するが、 例 えば、 ハイプリダイゼーション液 （50%ホルムアルデヒド、 10XSSC(0.15M NaCI, 15mM sodium c rate, pH 7.0)、 5XDenhardt溶液、 1% SDS、 10% デキストラ ン硫酸、 lO ig/ml の変性サケ精子 DNA、 50mM リン酸バッファー（pH7.5) ) を用い て 42°Cでィンキュベ一シヨンし、 その後 0· 1 XSSC、 0.1% SDSを用いて 68°Cで洗 浄する条件である。 更に好ましいストリンジェン卜な条件としては、 ハイブリダ ィゼーション液として 50%ホルムアルデヒド、 5XSSC(0.15M NaCI, 15m sodium ci trate, pH 7.0)、 1 X Denha rd t溶液、 1%SDS、 10%デキストラン硫酸、 lO g/ ml の変性サケ精子 DMA、 50mM リン酸バッファー（pH7.5) ) を用いる条件を例示す ることができる。 (DMAコンストラク ト）
本発明のプロモータの制御下に、 それが発現することにより植物の防御応答を 活性化する遺伝子 （導入遺伝子） を連結することにより、 植物に対して病原菌耐 性を付与することに利用できる DNAコンストラク 卜が構築される。 形質転換用の DNA コンストラク 卜とする場合には、 本発明のプロモータ及び導入遺伝子が適当 なベクター （プラスミ ド、 パクテリオファージ、 ウィルス等） に組込まれた状態 にあることが好ましい。
(導入遺伝子）
導入遺伝子としては、 それが導入された植物内で発現することにより当該植物 の防御応答を活性化する機能を有するものが用いられる。 例えば、 植物の防御応 答を制御する情報伝達経路を活性化する機能を有する遺伝子を導入遺伝子として 採用することができる。 このような遺伝子の具体例としては mi togen-activated protein(MAP)キナーゼの一種である SIPK (sal icyl ic ac i d-i nduced protein kin ase) 又は WIPK (Wound- 1 nduced Protein Kinasae) を活性化する機能を有する M EK遺伝子を挙げることができる。 MEK遺伝子の一例として、 ジャガイモ植物の ME K遺伝子 （StMEK) のコード領域の配列 （配列番号 5 ) 及びそれによつてコードさ れるアミノ酸配列 （配列番号 6 ) を図 2 1 に示す。
恒常的活性型のタンパク質をコードする遺伝子を導入遺伝子として採用するこ とが特に好ましい。 このような態様によれば、 形質転換体内において、 防御応答 を活性化するタンパク質として初めから活性型のものが生成され、 迅速かつ確実 に防御反応が進行するからである。 恒常的活性型のタンパク質をコ一ドする遺伝 子は、 野生型のタンパク質をコードする遺伝子の配列を基にして、 それがコード するアミノ酸配列の一部が変異するように一部の改変を施すことによリ作製する ことができる。 尚、 ジャガイモ植物においては MEKを改変した恒常的活性型 MEK (StMEKDD) が作製されており、 本発明においてこの StMEKDDをコードする遺伝子 を導入遺伝子として利用することもできる。 尚、 StMEKDD遺伝子のコード領域の配 列 （配列番号 7 ) 及びそれによつてコードされるアミノ酸配列 （配列番号 8 ) を 図 2 2に示す。
ここで、 上記における「防御応答」の種類は特に限定されず例えば、 ファイ トァ レキシンの生成、 PR (Pathogenesi s- Related) タンパク質の発現、 活性酸素の生 成、 パピラ形成、 リグニン化などが該当する。
(ベクター）
以上のような DMAコンストラク 卜の構築に利用されるベクターとしては、 本発 明のプロモータ及びその制御下に配置される導入遺伝子をターゲッ 卜細胞 （宿主 細胞） に導入することができ且つターゲッ 卜細胞内で導入遺伝子を発現させるこ とができるものであれば特に限定されず、 目的に応じて適当なプラスミ ドベクタ 一、 λファージベクターなどが利用される。 後述するァグロパクテリゥ厶を利用 した形質転換に使用するベクターを構築する場合には例えば Τ- DNA境界配列を有 する Ti プラスミ ドベクタ一、 Ti プラスミ ドバイナリベクタ一を利用することが できる。 他方、 ァグロパクテリゥ厶の介在を必要としない形質転換方法 （エレク トロポレーシヨン法、 パーティクルガン法など） に使用する場合には、 各種 PUC 系プラスミ ドベクター、 各種 λファージベクター （ZAPI 1 等） などを利用して組 換えベクターを構築することができる。 数多くのベクターが市販されており、 本 発明ではそれらの中から目的に応じて適切なものを選択して用いることができる。 尚、 まず本発明のプロモータを含有するベクターを構築し、 その後導入遺伝子 の連結を行ってもよい。 即ち、 所望の導入遺伝子を挿入可能な汎用性の高いべク ターを構築しておき、 これを利用して形質転換用の組換えベクターを作製しても よい。 形質転換用の組換えベクターには、 典型的には、 本発明のプロモータの他に導 入遺伝子及び適当なターミネータが含有される。 プロモータによる導入遺伝子の 適切な転写が達成されるように、 上流から下流に向かって順にプロモータ、 導入 遺伝子、 及びターミネータが配置される。 組換えベクター内に、 選択マーカーや ェンハンサー機能を有する配列、 シグナルペプチドをコードする配列などを含有 させてもよい。
(ターミネータ）
ターミネータとは mRNAの合成を終了させる信号として認識される配列である。 植物細胞内で適切に機能するターミネータが使用される。 例えば Mosターミネ一 夕を使用することができる。
(選択マーカー）
選択マーカーは、 形質転換した細胞、 組織、 カルスなどを識別あるいは選択す るために使用される。 各種の選択マ一カーが周知であって例えば、 カナマイシン 等に対する抵抗性を付与する npt遺伝子（Herrera Estrel la、 EMBO J. 2 (1983)、 987- 995)や nptl l 遺伝子（Messi ng & Vierra. Gene 1 9:259-268 (1982)) 、 ハイグ ロマイシンに対する抵抗性を付与する hph遺伝子（Blochinger & Diggl mann, Mo I Cel l Bio 4:2929-2931)、 メタ トレキセー卜に対する抵抗性を付与する dh f r遺 伝子（Bourouis et al. , EMBO J. 2 (7))、 β -グルク Ώニダ一せ (GUS) 遺伝子、 G FP遺伝子 （Gerdes、 FEBS Lett. 389 ( 1996)、 44-47)、 ルシフェラーゼ （Giacomi n、 P1. Sci. 116 ( 1996)、 59〜72 ; Sc ikantha、 J. Bact. 178 ( 1996)、 121) など を、 使用するベクター宿主系や使用目的などに応じて適宜選択して用いることが できる。 ベクターへのプロモータや導入遺伝子などの挿入は、 制限酵素及び DNA リガ一 ゼを用いた方法など、 常法に従い行うことができる （例えば、 Molecular Clonin g, Third Edition, 1.84， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York を 参照）。
(形質転換方法）
本発明の DMAコンストラク 卜又は組換えベクターを植物の形質転換に利用でき る。 形質転換方法 （遺伝子導入方法） としては、 ァグロパクテリゥ厶利用した方 法（ァグロパクテリゥ厶法）、 ポリエチレンダリコールを利用して遺伝子を導入す る方法、 電気的刺激を利用して遺伝子を導入する方法 （エレク ト口ポレーシヨン 法）、 及び遺伝子を結合させた金属粒子を植物組織 （細胞） に打ち込む方法 （パー ティクルガン法） などを用いることができる。 各方法についての詳細については 種々の文献や成書に記載があり、例えばァグロパクテリゥ厶法については Pro Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467 - 8471 や P I ant ol. Biol. 20 (1992), 96 3-976等を参照することができる。
尚、 ジャガイモ植物を形質転換する場合には Jefferson (1987) の方法 （文献 1 9を参照） を採用することもできる。 本発明のプロモータおよび導入遺伝子を含む DNAコンストラク 卜を導入して得 られた形質転換体では、 病原菌の感染によって導入したプロモータが誘導され、 その結果その制御下にある導入遺伝子が発現する。 従って、 導入遺伝子として病 原菌感染の防御に有効なものを採用すれば、 病原菌に対して耐性のある植物 （形 質転換体） が得られる。
形質転換の結果得られた植物細胞を用いて形質転換植物を再生することができ る。このような再生方法は、植物の種類に応じて、常法に従い行うことができる。 (ターゲッ ト植物）
本発明の DNAコンストラク 卜又は組換えベクターを用いた形質転換に供される 植物 （ターゲッ ト植物） は特に限定されず、 双子葉植物及び単子葉植物のいずれ に属するものであってもよい。 双子葉植物としては例えば、 ナス科 （ジャガイモ 属、 タバコ属、 卜マ卜属など）、 バラ科 （ウメ属、 モモ属、 リンゴ属など）、 マメ 科 （ダイズ属、 エンドゥ属など）、 アブラナ科 （ダイコン属など）、 ゴマ科などに 分類される植物が挙げられ、 一方単子葉植物としては例えば、 イネ科 （イネ属、 コムギ属、 ライ厶ギ類、 才才厶ギ類、 八卜厶ギ属、 トウモロコシ属、 サ卜ゥキビ 属など）、ユリ科（ネギ属、ニンニク属など）などに分類される植物が挙げられる。 以下、 実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
[実施例]
以下の実施例 1 ~ 8において使用される生物学的材料、 試薬、 実験方法等は次 の通りである。
1. 供試植物
ジャガイモ植物として、真正抵抗性遺伝子（Πを持たない栽培品種ダンシャク（S olanum tuberosum L. )および真正抵抗性遺伝子 R1 を持つ品種リシリ（So I anum tu berosum L.と野生種 S. demissum L.との種間雑種）を使用した。 品種ダンシャク は名古屋大学農学部付属農場で栽培し 7月に収穫した塊茎、 品種リシリは農林水 産省北海道農業試験場の圃場で栽培し 10月に収穫した塊茎を、 いずれも 4°Cに保 存し、 供試した。 形質転換植物を作製する際は、 真正抵抗性遺伝子を持たないメ 一クインを用いた。
2. 供試菌
名古屋大学大学院生命農学研究科資源生物機能学講座植物病理学研究室におい て保存されているジャガイモ疫病菌 [Phytophthora infestans (Mont. ) de Bary] レース 0およびレース 1· 2. 3. 4を使用した。 また、 ジャガイモ疫病菌菌体壁成 分（HWC)ェリシター調製に用いる菌として、同研究室で保存されているジャガイモ 疫病菌 [Phytophthora infestans (Mont.) de Bary]レース 1. 2. 3. 4 を使用し た。
3. 菌接種源の調製
ジャガイモ疫病菌の遊走子懸濁液は以下のように調製した。 4 °Cに保存してある ジャガイモ （品種ダンシャク） 塊茎を水道水でよく洗浄した後、 1%次亜塩素酸ナ トリウムに約 10分間浸潰した。 ジャガイモ塊茎をスライス （厚さ約 10 mm) し、 水洗した後、 約 104 胞子/ ml に調整した遊走子懸濁液を塗布接種して 20°Cの加湿 暗下で 6 日間培養した。 スライス表面に生育した菌をピンセッ トでかき取り、 冷 蒸留水 （4°C) に懸濁した。 胞子懸濁液を金属メッシュ （ 356メッシュ） で濾過し て菌糸を取り除き、 濾紙（ADVANTEC No. 5B)を用いて吸引濾過した。濾紙上に集め られた遊走子嚢を冷蒸留水で洗った後、 再び冷蒸留水に懸濁して 10°Cで 2時間静 置した。 遊走子懸濁液は、 紫外可視分光解析システム （DUシリーズ 600、 Beckma n) を用いて吸光度を測定し、 波長 500 nmにおける吸光度が 0.068 (105 胞子/ ml) となるように濃度調整した後、 これを接種源として使用した。
4. 菌体壁成分エリシターの調製
Doke and Tomiyama, (1980)の方法 （文献 1 4を参照） に従い、 疫病菌菌体壁成 分（HWC)を以下のように調製した。ジャガイモ疫病菌をライ厶ギ培地 30 ml の入つ た 100 ml 三角フラスコ中で、 20°Cで 1週間静置培養した。 回収した菌体マツ 卜を 水道水で洗浄した後、 水分を吸引濾過により除去し、 - 80°Cで凍結保存した。 凍結 菌体を乳鉢中で摩砕し、菌体重の 5倍量の 50 mM 酢酸緩衝液（pH 4.5)に懸濁した。 この懸濁液をソニケ一夕一（W- 225R Heat Sy s tem-U 11 rason i cs Inc.)を用いて出 力 45 Wで 5分間超音波処理した後、 14,000 X gで 30分間遠心分離した。 得られ た沈殿を先と等量の 50 mM 酢酸緩衝液（pH 4.5)に懸濁し、 再び先と同条件で超音 波処理と遠心分離を行った。得られた沈殿をもとの菌体重と等量の 0.1 M ホウ酸 緩衝液（pH 8.8)に懸濁し、 上記と同様な条件で超音波処理した後 120°Cで 20分間 オートクレープ処理し、 14,000 X gで 30分間遠心分離して上清を回収した。 - 方、 沈殿は再び 0.1 Mホウ酸緩衝液（PH 8.8)に懸濁し、 超音波処理およびオート クレープした後、 遠心分離した。 得られた上清を先の上清と合わせ、 透析チュー ブ （排除限界分子量 12,000) を用い、 水に対して 4°Cで 24時間透析した。 透析後 の溶液に等量のジェチルエーテルを分液ロートを用いて混合し、 静置した。 エマ ルジョン層を回収し、 エバポレーターを用いてエーテルを減圧乾燥し、 濃縮物に 適量の水を加えて凍結乾燥した。 得られた乾燥標品を HWCとして以下の実験に用 いた。 HWCの使用に際しては、 ソニケ一ターを用いて出力 45 Wで 3分間超音波処 理して水に懸濁した。 5. ジャガイモ塊茎ディスクの調製
ジャガイモ塊茎ディスクは以下のように調製した。 4°Cに保存してあるジャガイ モ （品種リシリ） 塊茎を水道水でよく洗浄した後、 1%次亜塩素酸ナトリウムに約 10分間浸潰した。 塊茎を茎軸方向にコルクボーラ一 （直径 20 mm) で打ち抜き、 柔組織部より円柱状の組織力ラムを作製した。 このカラムより、 ミクロ トー厶を 用いて、厚さ 1 關のディスクを調製した。調製したディスクは直ちに冷蒸留水（約 4°C) で洗浄した後、 プラスチックチャンバ一に並べ、 加湿暗下に静置し、 21 時 間加齢した。 尚、 この作業は全て暗黒下で行った。
6. HWC処理および菌接種
上記 5.の方法に従って調製したジャガイモ塊茎ディスクを、 1枚につき 100 β I ずつ蒸留水で前処理し、 3時間静置した。 その後、 各ディスクを 〗 mg/ml HWC, または対照の ΙΟΟμ I蒸留水で処理した。 また、 ジャガイモ疫病菌遊走子をデイス クに接種する際には、 遊走子濃度を均一に保っために、 懸濁液 （105 胞子/ ml) を 撹拌しながら ΙΟΟμ Ι 接種した。 ジャガイモ葉組織への菌接種は、 〗枚にっき 500 β I ずつ蒸留水で前処理し、 3 時間静置した。 その後、 各葉組織へ遊走子濃度を 均一に保っために、 懸濁液を撹拌しながら 500 I接種した。
処理および接種したディスク、 葉組織は、 さらに 20°C加湿暗下に静置し、 所定 時間静置した。 処理後、 静置したジャガイモ塊茎ディスク 3枚を 1 組、 葉組織 8 枚を 1組にしてアルミホイルに包み、液体窒素中で凍結固定し、- 80°Cで保存した。
7. ジャガイモ葉、 または塊室からの全 RNA抽出
全 RNA抽出は Yoshioka et al. ( 1996) の方法 （文献 5 2を参照） で行った。 ジャガイモ葉、 または塊茎ディスク各 2 gを乳鉢中で液体窒素を加えながら磨砕 し、 5 ml 抽出緩衝液 [100 mM Tris-HCI (pH 9.0), 100 m NaCI, 1 % SDS]、 1 tnl 2-メルカプトエタノール、 2.5 ml 1 M 卜リス（pH 9.0)飽和フエノール、 2.5 m I クロ口ホル厶 ·イソアミルアルコール （24:1； v/v)、 の入った DEPC処理済みの 滅菌違心管に入れ良く懸濁した後、 遠心分離 （8,000 rpm、 15 分間） した。 回収 した上清に対し 20分の 1量の 5 M 塩化ナトリウム、 5 ml のイソプロパノールを 加え、 -20°Cで 1 時間静置した。 遠心分離 （8，000 rpm、 15分間） により得られた 沈殿を 5 ml グァニジニゥ厶塩緩衝液 [4 M グァニジンチ才シァネ一卜、 25 m 酢 酸ナトリウム（pH 7.0)、 0.5% N-ラウロイルサルコシン、 20 mM 2-メルカプ卜ェ 夕ノール]、 500μ I 2Μ 酢酸ナトリウム（pH 4.0)、 5 ml 水飽和フエノール、 1 ml クロ口ホル厶■イソアミルアルコール （49:1, v/v) を加え、 良く懸濁し、 遠心分 離（8,000 rpm、 15分間） した。回収した上清に 5 ml のイソプロパノールを加え、 - 20°Cで 1 時間静置した。 遠心分離 （8，000 rpnu 15分間） により得られた沈殿を 300 I グァニジニゥ厶塩緩衝液に懸濁し、等量のィソプロパノ一ルを加え、- 20°C で 1 時間静置した。 遠心分離 （ 12,000 rpnu 15分間） により得られた沈殿を室温 下で、 500 1 3 酢酸ナトリウム（pH 5.2)で洗浄し、 遠心分離 （12,000 rpm、 15 分間） した。 この洗浄操作を 2回繰り返し、 さらに 500μ I の 70% エタノールで 洗浄し、 遠心分離 （ 15,000 rpnu 15分間） した。 得られた沈殿は真空乾燥後 100 μ I の DEPC処理水に溶解し、 これを全 RNA試料とした。
8. ノーザン解析
全 RNAをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動（文献 3 7を参照）で分画し た後、 アルカリプロッティング法（文献 3 6を参照）で Hybond- Ν+ナイロン膜（Amer sham)に転写 ·固定した。 プローブに葉 PVS1 c DMAを用いた。
R N Aを吸着させたナイロン膜を、 42 °Cのプレハイブリダィゼーシヨン溶液 [ 50 % ホルムアミ ド、 5 X デンハルト溶液 （文献 3 7を参照）、 5 X SSPE (文献 3 7を参 照）、 0.5% SDS、 100/ig/ml熱変性サケ精子 DMA (Pha rmac i a) ]中で 1 時間以上放置 した後、 32P標識 DNAプローブを添加し、 42°C下で 16時間以上ハイブリダィゼー シヨンを行った。 この膜を 0.1% SDS含有 4 X SSPE中で室温下 15分間 （2回）、 0.1 % SDS 含有 4 X SSPE中で 60°C下 15分間、 さらに 0.1 % SDS含有 1 x SSPE 中で 60°C下 15分間 （1 回） 順次洗浄した。 才ー卜ラジオグラフィーは、 X線フィ ル厶 0MAT- AR(Kodak)および増感紙 Lighting P I us (Dupont)を用いて、- 80°C下で行 つた。 9. RT-PCR
叮- PCRは RT- PCR high- Plus(TOYOBO)を用いて行った。 cDNA合成には全 RNA 1. 0/xg、 アンチセンスプライマー 10 pmol//z I およびアンチセンスプライマー 10 pm ol/μ Ι を用いて、 94°C(1分間）、 47°C (1分間）からなる増幅反応を 25サイクル行 つた。使用したプライマ一は以下のとおりであり、 図 2 3にそれぞれの cDNAにァ ニールする位置を示した。
PVS1： 5' -AGGAGATTGTTCGCCCCATA-3' (配列番号 9 ) 及び 5' - TCTCCATGAGTCCTTAC ATG-3' (配列番号 1 0 ) (469 bp)、 もしくは 5' -CATCGATTGTTTTGTACATCTG- 3' (配 列番号 1 1 ) 及び 5' -AATAATGATACAAAAAAAAATTAAGG- 3' (配列番号 1 2 ) (176 bp) PVS2: 5' -TATCAATTCACCAAGGAACACT-3' (配列番号 1 3 ) 及び 5' -GAAGTAATTAAAT TTAAATATTATCAA-3' (配列番号 1 4 ) (132 bp)
PVS3: 5' -TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG-3' (配列番号 1 5 ) 及び 5' - TCTCCATGAGTCCTT ACATG-3' (配列番号 1 6 ) (326 bp)
PVS4: 5' -AGGACATTGTTCGACCTGTT-3' (配列番号 1 7 ) 及び 5' -TCTCCATGAGTCCTT ACATG-3' (配列番号 1 8 ) (469 bp)、 もしくは 5' - CATCCCTTAAAATTATAAGTATTC- 3' (配列番号 1 9 ) 及び 5'- AATAATGATACAAAATAAATTAAGG-3' (配列番号 2 0) (131 bp)
合成された cDNAを 2%ァガロースゲル電気泳動により分画し、臭化工チジゥ厶 で染色してバンドの有無を確認した（文献 3 7を参照）。
10. ジャガイモ塊茎からの可溶性画分の調製
ジャガイモ塊茎ディスクからの可溶性画分の調製は Dixon and Ful ler, (197 8)の方法 （文献 1 3を参照） を一部改変して行った。
ジャガイモ塊茎ディスク 3枚を 1組にしてアルミホイルに包み、 液体窒素中で 凍結固定し- 80°C下保存した。凍結したジャガイモ塊蓥ディスクを乳鉢中で液体窒 素を加えながら乳棒により粉砕した。 得られたジャガイモ塊茎粉末に、 フエノー ル吸着剤であるポリクラ AT 2gを加え乳棒により攪拌した。その後 7 ml の抽出緩 衝液 [0.1M ホウ酸ナトリウム（pH 8.8) 1 mM PMSF (pheny I me thy I su I f ony I f luori de)、 10 mM 2-メルカプトエタノール]を加え懸濁した後冷却遠心 （14，000rpm 2 0分 4°C)。 得られた上清を- 80°C下で保存した。
11. 大腸菌での融合タンパク質の発現とその抽出
抗体の作製に用いる抗原を得るため、 ジャガイモ PVSの大腸菌内での発現を行 つた。 EcoRし および Xhol により切断した発現ベクター pET-32b(+) (宝酒造） に PVS1 cDNAの翻訳可能領域全長を挿入し、得られたベクターを大腸菌（BL21, Nova gen)に導入した。 この大腸菌を 50 g/ml カルべニシリンを含む LB寒天培地へ植 菌し、 37°Cで一晚培養した。 200 g/ml カルペニシリンを含む LB液体培地 50 ml を入れた 500 ml フラスコを 4本用意し、 培地上のシングルコロニーをかき取り、 各々のフラスコに懸濁した。 A6。Q = 0.6になるまで 37°Cで振盪培養（140 rpm)し、 このうち 250μ Ι を誘導前タンパク質試料として融合タンパク質の発現の確認に 用いた。 その後最終濃度 1 mMとなるように IPTGを添加してタンパク質の発現を 誘導し、 さらに 37°Cで 3時間振盪培養 （140 rpm) した。 氷上で 5分間冷却した 後、 培養液を遠心分離 （ 5, 000 rpm, 10分間） した。 上清を取り除き、 沈殿を 5 ml 大腸菌懸濁溶液 [50 mM Tri s-HCI (pH 8.0) , 2 mM EDTA]に再懸濁し、 このうち 100 I を誘導後夕ンパク質試料として融合夕ンパク質の発現誘導の確認に用い た。 再度培養液を遠心分離 （ 5, 000 rpm, 10 分間） し上清を取り除き、 大腸菌の 沈殿を融合タンパク質の可溶性の確認に用いた。
融合タンパク質の発現誘導の確認および可溶性の確認は以下のように行った。 上記のようにサンプリングした誘導前および誘導後タンパク質試料を遠心分離（ 5， 000 rpm、 30秒間） した後上清を取り除き、 沈殿を大腸菌懸濁溶液 100^ I に再懸 濁した。 各々の懸濁液より 10μ I ずつサンプリングした後、 SDS- PAGE、 ウェス夕 ン解析を行った。 SDS- PAGEおよびウエスタン解析は 14. SDS- PAGEおよびウェス タン解析の項目に従った。 発現誘導を確認した後、 融合タンパク質を発現誘導し た大腸菌の沈殿を、 あらかじめ氷冷した 5 ml Binding Buf fer[5 mM イミダゾー ル、 0.5 M 塩化ナトリゥ厶、 20 mM Tri s-HCI (pH 7· 9)]によく懸濁した。 懸濁液を 透明な遠心チューブに移し替え、 遠心チューブを氷冷しながら超音波破砕機で大 腸菌を破砕した。 菌体懸濁液を遠心分離 （12， 000 rpm、 10分間） し、 上清を可溶 性画分とした。 沈殿に 5 ml尿素入り Binding Buffer (6 M尿素を Binding Buf fe rに加えたもの） を加え再懸濁した後、 懸濁液を遠心分離 （ 12, 000 rpm、 10分間） し、 上清を尿素画分とした。 可溶性画分、 尿素画分から 10 i I ずつサンプリング した後、 SDS- PAGE、 ウエスタン解析を行った。 SDS- PAGEおよびウエスタン解析は 14. SDS-PAGEおよびウェスタン解析の項目に従った。
融合タンパク質が尿素画分に確認されたので、 尿素を徐々に抜き、 産生タンパ ク質の構造を再生した。 タンパクの再生作業は以下のように行った。 尿素画分を 透析チューブに移し、 200 ml の 4 M尿素透析外液 [4 M 尿素、 10 mM Tris-HCI (pH 7.0)、 5 mM DTT]に対して 4°Cで 1時間透析した。 透析外液を 200 ml の 2 M尿素 透析外液 （4 M尿素透析外液のうち尿素濃度を 2 Mに代えたもの） に交換し、 4°C で 1 時間透析した。 さらに透析外液を 200 ml の無尿素透析外液 （4 M尿素透析外 液のうち尿素を除いたもの） に交換し、 4°Cで 1 時間透析した。 再び透析外液を 2 00 ml の無尿素透析外液 （4 M尿素透析外液のうち尿素を除いたもの） に交換し、 4°Cでー晚透析した。 この溶液をエツペンドルフチューブに移し、 違心分離 （15， 000 rpm、 10 分間） した後、 上清を新しいチューブに移した。 この画分を再生画 分とし、 抗原として抗体の作製に用いた。 以上の操作で、 8 mg/ml の融合タンパ ク質が 4 ml得られた。 12. 抗 PVS抗体の作製
マウス （BALB/c、 雌、 4週齢） を 5 日間飼育した後、 大腸菌で発現させた融合 タンパク質 を含む溶液とコンプリートフロイン卜アジュバンド （DIFC0) を等量混合したェマルジヨンを I腹腔に注射した。 1週間後、 融合タンパク 質 100 tg とインコンプリートフロイン卜アジュバンド（DIFC0) を等量混合した ェマルジョンを 100 I腹腔に注射した。 その 10 日後マウスの尾を切断して採血 し、 HMGRに対する抗体ができているかどうかをウェスタン解析法を用いて調べた t 抗原抗体反応が認められたので再び融合タンパク質 ΙΟΟμε とインコンプリート フロイン卜アジュバンド（DIFC0)を等量混合したェマルジョンを ΙΟΟμ I腹腔に注 射した。 一週間後に採血し、 4°Cで一晚静置して血餅を沈殿させた。 この血液を遠 心分離 （10，000 rpm, 15分間） し、 上清を抗血清としてエツペンドルフチューブ に少量ずつ分注し、 -80°Cで保存した。 13. タンパク質の定量
試料のタンパク質濃度の測定は、 Bradford(1976)の方法によるタンパク質の定 量キッ 卜（BIO- RAD)を用いて行った。 検量線は BSAを用いて作成した。
14. SDS- PAGEおよびウェスタン解析
タンパク質試料の SDS- PAGEは Laemml i ( 1970) の方法に準じた。 試料 10 I を 試料緩衝液 [2% SDS、 10% メルカプ卜エタノール、 0.002% BPB、 20% グリセ口 ールを含む 50 mM Tris-HCI (pH 8.5) ] 10 t I と混合し、 5分間煮沸した後氷冷 し、 10% ポリアクリルアミ ドゲルを用いて電気泳動を行った。
ウエスタン解析は、 Towbin et al. ( 1979) の方法 （文献 5 5を参照） に従って 行った。 SDS- PAGE後のゲル、 濾紙、 ニトロセルロース膜 （PR0TPRAN, Schleicher and Schuel I) をそれぞれ転写用緩衝液（0.1 M Tris、 0.192 M グリシン、 20% メタノール、 0.1% SDS) に 30分間浸した後、 セミ ドライプロッター（ATT0)のス テ一ジに置き、 2 mA/cm2の定電流で 60分間通電してゲル中のタンパク質を二卜口 セルロース膜に転写した。 この二卜ロセルロース膜を 5%スキムミルクを含む TB S-T[137 mM塩化ナトリウム、 0.1% Tween 20を含む 50 mM Tr i s-HC I緩衝液 （pH 7.6)]中で一晚振盪し、 ブロッキングを行った。 この膜を TBS- T中で 15分間の洗 浄を 1 回、 5分間の洗浄を 2回行った後、 一次抗体として抗ジャガイモ PVS抗体
(2， 000倍希釈） を含む TBS- T中で 1 時間振盪した。 再び膜を TBS- T中で洗浄し た後、 二次抗体として抗マウス lg抗体（Amersham)を含む TBS-T中で 30分間振と うした。 膜を TBS-T中で洗浄後、 ECL検出キッ ト（Amersham)を用いて Hyper Fi lm (Amersham)上にシグナルの検出を行った。
15. プローブの作製
ジャガイモの PVS1~4 cDNAを組み込んだプラスミ ドを錶型とし、図 2 3に示す プライマーを用いてそれぞれの遺伝子の塩基配列に特異的な PCRにより増幅した。 反応は、 TaKaRa TaqT (宝酒造） およびインサート DNAを組み込んだプラスミ ド 2 ngを用い、 DNAサ一マルサイクラ一PJ 2000 (Perk in Elmer Cetus) で 94°C - 1 分間 （熱変性）、 53°C - 45秒間 （ァニーリング）、 72°C - 2 分間 （DNA伸長反応）、 25サイクルという条件下で行った。 0.8% ァガロースゲル電気泳動により増幅さ れた DMA断片のサイズを確認した。 QIAquick Gel Ex t rac t i on K i t (Q I AGEN)を用い てゲルより DMA断片を精製した。
16. ジャガイモゲノムライブラリーのスクリ一二ング
ゲノムライブラリ一は、 既製のジャガイモゲノムライブラリー （ジャガイモ品 種 Desiree, CI ontech) を用いた。 ファ一ジクローンの選抜はプラークハイプリダイゼーション法（文献 3 7を参 照）により行った。 1 プレー卜当たり 30，000 プラークとなるように調整したファ ージ溶液と 200 I の宿主大腸菌 XL1- Blue RA (P2) s t ra i n (10 mM 硫酸マグネシ ゥ厶、 A6D。 = 2) を混合し、 37°C下で 20分間静置した後、 3 ml NZYM トップァガ ロース （1% NZァミン、 0.5% 酵母エキス、 10 mM 硫酸マグネシウム、 0.5% 塩 化ナトリウム、 0.6% ァガロース） に混合し、 NZYM寒天培地 （1% NZァミン、 0. 5% 酵母エキス、 10 mM 硫酸マグネシウム、 0.5% 塩化ナトリウム、 1.5% 寒天 粉末） 上に重層接種した。 プラーク直径が約 0.5 mm になるまで 37°C下で培養し た後、 4°C下に一時間以上静置した。 培地上のプラークを Hybond- N+ナイロン膜（A mersham)に吸着させ、 変性溶液（1· 5 NaCI, 0.5 NaOH)で 7分間、 中和溶液 [1. 5 塩化ナ卜リゥ厶、 0.5 M Tris-HCI ( H 7.2)、1 mM EDTA]で 3分間処理した後、 2 X SSPEで洗浄した。 さらに、 0.4 M 水酸化ナトリゥ厶によって DNAを膜上に固 定した後、 5 X SSPE (2回） で洗浄した。 合計で 6.0 X 105クローンから目的のク ローンを選抜した。
1 次スクリーニングの後、 PVS1~4各メンバー特異的なプライマーを用いた PC Rにより想定されるサイズのバンドが確認された PVS1、PVS3および PVS4 を選び、 2次、 3次スクリーニングを行った。
プローブの作製、 ハイブリダィゼーシヨン、 洗浄およびオートラジオグラフィ 一は、 18. で述べるサザンハイブリダィゼ一シヨンの場合と同様に行った。
17. ファージ DNAの単離■精製
ファージ DMAの単離 ■精製は、 液体培養法（文献 2 3を参照）とポリエチレング リコール（PEG)沈殿法（文献 3 7を参照）に基づいて、 以下の方法により行った。 目 的のプラークを寒天より回収し、 100 /i l の SM溶液 [50 mM Tris-HCI (pH7.5)、 0.1 M 塩化ナトリウム、 7 mM 硫酸マグネシウム、 0.01% ゼラチン]および 1μ I ク ロロホルムを含む 1.5 ml チューブに移して 4°Cに一晚静置した後、よく懸濁した。
200 ml フラスコを用い、 宿主大腸菌 [XU- Blue MRA (P2) strain]を 80 ml NZYM (1% NZァミン、 0.5% 酵母エキス、 10 mM 硫酸マグネシウム、 0.5% 塩化ナ卜 リウ厶） で 30°C下で一晚振盪培養した。 遠心分離 （8,000 rpm、 3分間、 4°C) に より沈殿した宿主大腸菌を回収した後、 10 mM 硫酸マグネシウム溶液中に懸濁し、 A600=2に調整した。 このように調製した 500 μ I の宿主大腸菌懸濁液と 50μ I のフ ァージ懸濁液を混合し、 37°C下に 20分間静置した後、 50 ml NZYMを用いて 37°C 下で振盪培養し溶菌を確認した。 2.9 g塩化ナトリウムおよび 0.4 ml クロ口ホル 厶を添加し、 さらに 10分間振盪した。 遠心分離 （ 10,000 rpitu 10分間、 4°C) に より上清を回収し、 上清の 5分の 1 量の 50% PEG 6000を混合した後、 氷中に 1 時間静置した。 遠心分離 （12,000 rpm、 20分間、 4°C) により沈殿を回収し、 400 I Tris- g-NaCI [10 mM Tris-HCI (pH7.5)、 49.6 mM 塩化ナトリウム、 4.9 mM 塩化マグネシウム]に懸濁した。 この溶液に 4μ Ι の 10 mg/ml RNase A(Sigma)お よび 4 I の 10 mg/ml DNase I (S i gtna)を添加し、 37°C下で 1 時間処理した後、 ク ロロホルム抽出を 3回行った。 回収した上層と等量の 2 X STE[80 mM Tris-HCI (p H7.5), 2% SDS、 0.5 M EDTA]および 5分の 1 量の 10 mg/ml プロティナーゼ Kを 添加して、 65°C下で 10分間処理した後、 同容量の Tr is飽和フエノール、 フエノ —ル： クロ口ホルム ： イソアミルアルコール （25:24:1， v/v/v), クロ口ホルム ： イソアミルアルコール （24:1， v/v) によって、 順次抽出した。 回収した上層に 2 倍量の冷エタノールを加え、 - 20°C下で 30分間静置した後、 遠心分離 （ 12,000 r pm、 10分間、 4°C) により沈殿を回収した。 沈殿を 70% エタノールで洗浄後、 減 圧乾燥し、 100 I の H20に溶解した。
18. サザン解析
目的のクローンの全 DNAを所定の制限酵素 （宝酒造） により消化し、 0.8% ァ ガロースゲル電気泳動により分画した（文献 3 7を参照）。 分画した DMA断片をァ ルカリブロッテイング法（文献 3 6を参照）により Hybond- N+ナイロン膜（Amersha m)上に転写した。
32P標識 DNAプローブは、ランダムプライミング法（Feinberg and Vogelstein, 1983)によリ [a;- 32P] dCTP(ICN B i ochem i ca I s)および Megaprime DNA Label I ing sys tems (Amersham)を用いて作製した o
DNAを吸着させたナイ口ン膜を、 42°Cのプレハイプリダイゼーション溶液 [5 X デンハルト溶液 （文献 3 7を参照）、 5 X SSPE (文献 3 7を参照）、 0.5% SDS、 1 00 iig/ml 熱変性サケ精子 DNA (Pha rmac i a) ]中で 1 時間以上放置した後、 32P標 識 DNAプローブを添加し、 42°C下で 16時間以上ハイプリダイゼーシヨンを行った。 この膜を 0.1% SDS含有 2 X SSPE中で 10分間 （ 2回）、 さらに 0.1 % SDS含有 1 X SSPE中で 10分間 （1 回）順次洗浄した。なお、 洗浄はすべて室温下で行った。 才ー卜ラジオグラフィーは、 X線フイルム 0MAT-AR (Kodak)および増感紙 Lighting Plus(Dupont)を用いて、 - 80°C下で行った。
19. プラスミ ドの調製
塩基配列を決定するための目的 DNA断片のサブクローニングには、 pBluescrip t KS+ (Stratagene) を用いた。
目的のクローンの全 DNAを所定の制限酵素 （宝酒造） によリ消化し、 0.8% ァ ガロースゲル電気泳動により分画した後（文献 3 7を参照）、 目的の DNA断片を含 むァガロースゲルを QIAquick Gel Extraction K i t (Q i agen)を用いて精製した。 制限酵素により消化したベクターは、 Alkal ine phosphatase E. col i C75(宝酒造） による脱リン酸化処理 （37°C、 1 時間） を行った後、 フエノール： クロロホルム ： イソアミルアルコール （ 25:24:1， v/v/v), クロ口ホルム：イソアミルアルコール (24:1, v/v) によって、 順次抽出した。 回収した上層に 2倍量の冷エタノールお よび 20分の 1量の 3 M NaCI を加え、 - 20°C下で 30分間静置した後、 遠心分離 （1 2, 000 rptn、 10分間、 4°C) により沈殿を回収した。 沈殿を 70% エタノールで洗 浄後、減圧乾燥し、 20 μ I TE[10 tnM Tris-HCI (pH 8.0) , 1 mM EDTA]に溶解した。 以上のように調製したベクターおよびィンサ一卜を、 ベクター ： インサートのモ ル比が 1 : 1 となるように調整し、 DNA Ligat ion Ki t ver. 2 (宝酒造） によりライ ゲーシヨンした。 E. col i JM109 Competent Cel l (宝酒造） を、 ライゲーシヨンし たプラスミ ド DNAで形質転換した後、 LB/Amp/X- gal/IPTG寒天培地上 （1 % Bacto Tripton、 0.5% 酵母エキス、 1 % 塩化ナトリウム、 0.1 mg/tnl アンピシリン溶 液、 0.004% X- gal溶液、 0.5 mM IPTG溶液、 1.5% 寒天粉末） に接種し、 37°C下 で一晚培養した。 青白選択した単コロニーを LB/Amp液体培地 （2 ml LB、 0.1 mg /ml アンピシリン） で一晩培養し、 プラスミ ド DMAの単離を行った。 プラスミ ド DNAの抽出および精製は、 FlexiPrep K i t (Ame rsham Pharmacia B i o tech)を用いて 行った。 20. DNA塩基配列の決定とデータベース解析
塩基配列の決定は、 デ才キシターミネーシヨン法（文献 3 8を参照）に基づく PR ISM Dye Deoxy Terminat ion Cyc le Sequencing Ready React ion K i t (App I i ed B i osystems)を用いて行った。反応物の変性ポリアクリルアミ ドゲル中での電気泳動 と塩基配列の読みとりには、 ABI 373S DNAシーケンサー ■ DNAシーケンス自動解 析装置 （Appl ied Biosystems) を用いた。 塩基配列の結合、 読み枠のアミノ酸配 列と既知遺伝子との相同性について、 国立遺伝学研究所日本 DNAデータバンク（D DBJ)の大型コンピューターの BLASTプログラム（文献 1 を参照）を用いて解析した。 アミノ酸配列の整列には、 CLUSTALwプログラム（文献 4 3を参照）を用いた。 21. ジャガイモ塊荃プロ 卜プラストを用いた卜ランジェントアツセィ ジャガイモ塊茎プロ 卜プラス卜を用いた卜ランジェントアツセィは Hashimoto et al. (1992)の方法 （文献 1 8を参照） を参考に、 以下のように行った。 ジャ ガイモ培養細胞由来のプロ 卜プラス卜を 1 X 106個含む溶液 800μ I (0.5 M mann i toi, 0.1 m MgS04， pH 7.0)に、導入する遺伝子を 25 g加え、 ピペッティング により静かに混和し、 氷上で 10分間静置した。 この溶液を、 あらかじめ冷やして おいたキュベッ トに移し、 遺伝子導入装置 CUY21 (卜キヮサイエンス） を用いて 定電流条件でエレク トロボレ一卜（60v， 50 pon, 75 poff, 4 回）した。 溶液を違 心チューブに移し、 氷上に 10分間静置した後、 上清を取り除き、 900 μ Ι 培養液 を加え、 12 穴培養プレー卜に移し、 20°Cの暗所に 1 時間静置した。 その後 PVS3 の推定プロモータ領域を含むベクターをエレク 卜口ポレー卜したプロ 卜プラス卜 には、滅菌水を 100μ I もしくは 1 mg/ml HWCを ΙΟΟμ Ι 加えて 12時間静置した。 なお、ポジティブコントロールには CaMV 35Sプロモータ領域を含むベクターを用 い、 エレク ト口ポレー卜したプロ トプラストは、 12時間静置した。 上清を取り除 き、 プロ 卜プラス卜を 1 x PBSで洗浄した後、 Dua卜 Luc if erase Reporter Assay System (Proniega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
22. 形質転換植物の作製および GUS染色
形質転換植物の作製および GUS染色は Jefferson(1987)の方法 （文献 1 9を参 照） に準じた。 形質転換植物の作製には、 無菌的に培養されたメークインの茎を 用いた。形質転換ベクター pB II 21 (CI one tech)の CaMV35Sプロモータを削除し、翻 訳開始コ ドン上流 2648 bpの PVS 3推定プロモーター領域を GUS遺伝子の上流にィ ンフレームで GUSが翻訳されるように BamHI を介して連結した（図 1 1 )。 このべ クタ一を Agrobac ter i urn turaef ac i ens LBA4404 (Clonetech) にエレク 卜ロホレ —ション法で導入した。切除した茎を 2分間 tumefaciensの培養液中に浸すこ とで感染させ、 シャーレ中の 3C5ZR培地上 [Sucrose 30 g, Gel lanGum 2 g，， MS mi neral (10x) 100 ml , Fe-EDTA 5 ml , Myo-i nos i to I 100 m 1 , 3C5ZR vi tamin (Thiamin HC I 1 mg/m I 1 ml , Ni cotinic acid 1 mg/m I 0.5 ml , Py r i dox i ne HC I 1 mg/m I 0.5 ml, Asparat i c acid 1 mg/m I 0.4 ml) 2.4 ml, I AA (0.1 mg/m I) 5.3 ml , Zeat i n r ibos ide (0.1 mg/m I) 17.5 ml , pH 5.9， per 1000 nH]に 20°C 下で 3 日間静置した。 その後、 カナマイシン（100 g/ml)および Cefotaxime(300 g/ml)を含む 3C5ZR培地上に移した。 これを一週間ごとに繰り返し、 シユー卜が 出現したら S1再生培地上（Sucrose 15 g, Gel l anGum 3 g，， SI mi neral (lOx) 1 00 ml , Fe-EDTA 5 ml, V2 vi tamin 2.0 ml, pH 5, 7， per 1000 ml)に移して、 根 の再生を確認する。
GUS染色する際は、 植物組織を GUS染色溶液中 [X- Gl ue (50 mg/ml i n DMF) 100 μ I, 500 mM Phosphate buf fer (pH 7.0) 1 ml, 100% Methanol 2 ml, 0.5% T ri ton X-100 7.9 ml, per 10 ml]に減圧浸透し、 37°Cの暗黒条件下で一昼夜染色 する。 その後、 染色組織を酢酸： エタノール ： グリセロール （ 1 ： 3 ： 1 ) の脱 色液中で煮沸脱色して観察した。 また、 接種されたジャガイモ疫病菌を顕微鏡観 察する際は、 脱色した組織をラク 卜フエノール溶液中（lactic acid 10 ml, phen o I 10 g, glycerol 10 ml water 10 ml , 40 ml ethano I)で煮沸し、これを繰り返 した。 その後、 飽水クロラール（2.5 g/ml)を染み込ませた濾紙上で 2日間、 4°Cの 暗黒条件下で脱色して観察した（文献 4 9を参照）。 23. ジャガイモ葉組織における Agrobacterium tumef aciensを介した卜ランジェ ン卜アツセィ
A. tumefaciensを介した卜ランジェントアツセィは、 Chang et al . (2002)の方 法 （文献 7を参照） に準じて行った。 Cf- 9/Avr9または StMEKD° (配列番号 7 ) を 含むバイナリ一ベクターをエレク ト口ポレーシヨンにより導入した tumefaci ens LBA4404を、 リファンピシン（50 g/ml) および所定の抗生物質を加えて培養 した。 A. turaefaciensを遠心 （3, 000 rpm, 15分間） により集菌し、導入緩衝液（1 /1 Ox u rash i ge-Skoog sal ts, 1/1 Ox B5 vi tamins, 2% sucrose, 1 % glucose, 150 acetosyringone, 20 m MES pH 5.4)で懸濁して 0DS。。=0.1 になるよう に濃度を調整した。 1 ml のシリンジを用いて葉の裏から懸濁液を注入し、 2 日後 に GUS染色した。
<実施例 1 > 疫病菌接種したジャガイモ塊茎組織における PVS mRNA の蓄積動 向
ジャガイモ塊茎組織において、親和性、非親和性レース接種および、水処理後、 経時的にジャガイモ塊茎ディスク 3枚より全 RMAを抽出して、 PVS1 cDNAを用い てノーザン解析を行った。 解析結果を図 2に示す。 親和性菌処理区、 非親和性菌 処理区双方において、 PVS mRNAの蓄積が認められた。 く実施例 2 > 疫病菌接種したジャガイモ塊茎組織における PVS1〜4各メンバー 特異的な叮-PCR
ジャガイモ塊茎組織において、 PVS1〜4 のいずれのメンバーが発現しているの かを調べるために、 親和性、 非親和性レース接種および、 水処理後、 3、 6時間後 凍結したジャガイモ塊茎ディスク 3枚より全 RNAを抽出して、 PVS1~4各メンバ 一特異的なプライマー （配列番号 9、 1 0、 1 3、 1 4、 1 5、 1 6、 1 7、 及 び 1 8 ) を用いて叮- PCRを行った。 親和性菌処理区、 非親和性菌処理区双方にお いて、 PVS1~4それぞれ 469 bp、 132 bp、 326 bpおよび 469 bpの推定されるサ ィズにバンドが検出された（図 3)。 ぐ実施例 3 > 非親和性レースおよび親和性レースを接種したジャガイモ塊茎組 織における PVSタンパク質のウェスタン解析 PVS mRNA の蓄積動向が実際のタンパク質合成に反映されているのか調べるた め、 抗ジ ガ モ PVS抗体を作製し、 ウエスタン解析を行った。 抗体の作製に用 いる抗原を得るため、 推定アミノ酸配列を基に大腸菌内での発現を行った。 PCR により調製した PVS1 cDNA翻訳領域を発現ベクターに挿入して、 チォレドキシン との融合タンパク質として大腸菌内で発現させた。 発現誘導前後の大腸菌全タン パク質について SDS- PAGEを行い、 ゲルを CBB溶液で染色した。 尿素画分に約 83 kDのバンドが検出できたので、 この画分から尿素を透析除去し、 抗体作製の抗原 として用いた。
作製した抗体を用いて抗体の力価を検討したところ、 〗，000 倍希釈にして用い た場合、 10 ng の抗原を検出することができた。 以後のウエスタン解析を行うの に充分な力価を有した抗体であると判断されたので、 24 時間エイジングした後、 水処理、非親和性レースまたは親和性レースを接種して 24時間後までジャガイモ 塊茎ディスクより可溶性画分を調製し、 抗ジャガイモ PVS抗体を用いてウェス夕 ン解析を行った（図 4)。 非親和性および親和性レースのいずれの接種区において も、 6 時間以降に PVS タンパク質の蓄積が認められた。 一方、 水処理区では PVS タンパク質の蓄積は認められなかった。 これらの結果は、 PVS niRMAの蓄積が、 菌 接種 6-9時間後をピークとする図 2の結果を支持するものであると考えられる。
<実施例 4 > 疫病菌接種したジャガイモ葉組織における PVS1〜4各メンバー特 異的な RT- PCR
ジャガイモ葉組織において、 PVS1〜4 のいずれのメンバーが発現しているのか を調べるために、 親和性、 非親和性レース接種および水処理、 傷害処理後、 12時 間後まで経時的にジャガイモ葉 3枚より全 RNAを抽出して、 PVS1~4各メンバ一 特異的なプライマー （配列番号 1 1 , 1 2、 1 3、 1 4、 1 5、 1 6、 1 9、 及 び 2 0 ) を用いて RT- PCRを行い、 その後 PVS1〜4各メンバ一特異的な cDNAプロ ーブを用いてサザン解析した。親和性菌接種区、非親和性菌接種区双方において、 PVS3においてのみ 326 bpの推定されるサイズに著しい mRNAの蓄積を示すバンド が検出された（図 5)。 また、 ポジティブコントロールとし用いた塊茎組織由来の RNAを用いた場合においては PVS1〜4それぞれ 176 bp、 132 bp、 326 bpおよび 1 31 bpの推定されるサイズにバンドが確認された（図 5)。
<実施例 5 > ジャガイモゲノムライブラリーのスクリ一二ング
ジャガイモのゲノムサイズは 1 倍体当たり 1.6 - 1.8 X 109 bpであり（Arumuga nathan and Earle, 1991)、 ジャガイモゲノムライブラリーのサイズ平均値が 1 プラークあたり 5 X 104 bpであること、またジャガイモが 4倍体であることを 考えると、 ジャガイモの全染色体をスクリ一二ングするためには、 少なくとも 5. 2 X 105個のプラークをスクリーニングする必要がある。 そこで、 PVS1 cDMAの全 長をプローブとして、 6.0 X 105個のプラークをスクリーニングした。 1次スクリ 一二ングの結果、 87 クローンが確認された。 これら、 87 クローンのうち、 PVS1 〜4を区別すると共に、推定プロモータ領域を得るため、 PVS1〜4それぞれのメン バー特異的な部位でプライマーを構築し、 その PCR産物を電気泳動した。 PVS1、 P VS3 および、 PVS4をそれぞれ、 3クローン選択して 2次、 3次スクリーニングを 行った。
スクリ一二ングの結果得られたクローンを EcoRI、 Hindi I I または Xhol により 単独消化し、 スクリーニングの際用いたプライマーによる PCR産物をプローブと してサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。 その結果、 このプローブとハイブ リダィズするバンドが検出された。 目的のクローンが得られたことが確認された ので、 ハイプリダイズした EcoRI および Hindi I I 消化による DMA断片を pBluescr ipt KS+ベクターにサブクローニングし、 塩基配列を決定した。 ぐ実施例 6 > DMA塩基配列の決定とデータベース解析
サブクローニングした PVS1、 PVS3および PVS4の DNA断片の全塩基配列の決定 を行った （図 6、 7、 8、 9)。 尚、 図 6及び図 7には PVS3のプロモータ領域 （配 列番号 1 ) 及びコード領域 （配列番号 2 1 ) が示される。 PVS3 cDNAおよび PVS3 のゲノム構造について調べるため、 既に単離されている PVS3 cDNA (文献 5 3を 参照）と本実施例で得られた PVS3ゲノム DMA配列を比較した。 PVS3 については 3' 非翻訳領域を除いて全ての塩基配列および推定されるァミノ酸配列が一致し、 6 つのイン卜ロンで分断されることが明らかになった （図 8)。 一方、 PVS1、 および PVS4双方とも、 5つのイン卜ロンで分断されており、 PVS3とは異なっていた （図 9 )。 ジャガイモ植物の栽培品種は 4倍体であり、 各ァイソジーンがゲノム中に複 数存在する例が知られている （文献 5 6 )。 本実施例で得られた PVS3ゲノムクロ ーンも 3' 非翻訳領域のみが PVS3 cDNAと異なっていたことから、 PVS3サブファ ミリ一の一つをコードする遺伝子であると思われる。
Back and Chappe I (1996)は、 セスキテルペンシクラーゼにおける機能分化につ いて報告している （文献 4を参照）。 タバコ（TEAS)、 トウガラシ（PEAS)のセスキテ ルペンシクラーゼである 5-ェピ-アリス卜口キンシンターゼと、 ヒヨス（HVS)、 ジ ャガイモ（PVS) のべティスピラディンシン夕ーゼの推定アミノ酸配列を比較した 同じ VSである HVS と、 PVS3または PVS4の間において vet i pi rad i ne specif ic d omainでは、 90%以上の Identi tyが確認された （図 9 )。 一方、 PVS3 と PEASの間 では 80%以下であった。 また、 基質結合部位の存在する aristolochene specifi c domain においては、 PVS と TEAS、または PVSと PEASの間では、 Iden tyが 78% 〜89%であるのに対し、 PVSと HVSの間では、 98%以上という高い Identityが確 認できた。 さらに、 葉組織で発現するセスキテルペンシクラーゼは 6つのイン卜 ロンに分断される 7つのェクソンから成るのに対し、 ジャガイモ塊茎組織で発現 する PVS1 および PVS4は 5つのイントロンに分断される 6つのェクソンから成る ことが明らかになった （図 9)。
<実施例 7 > プロ トプラストを用いたトランジェントアツセィによる PVS3 プ 口モータの HWC応答性
ルシフェラーゼの上流に PVS3推定プロモータ領域を連結して作製した PGL3ベ クタ一をエレク ト口ポレーシヨンでプロ トプラストで導入し、 HWC に対する応答 性を調べた（図 1 0)。 水処理区に比べ、 HWC 処理区では有意に高いルシフェラー ゼ活性が認められ、本実験に用いた翻訳開始コ ドン上流の 2, 648 bpの領域がエリ シターに応答することが明らかになつた。
<実施例 8 > 形質転換植物における PVS3遺伝子の発現動向
詳細に PVS3 の発現動向を調べるために、 GUS遺伝子の上流に PVS3推定プロモ 一夕領域を連結して作製したバイナリーベクター（図 1 1 )をジャガイモ疫病菌に 対する真正抵抗性遺伝子を持たないメークインに導入した形質転換体を作出した £ 傷害に対する PVS3遺伝子の応答を調べる目的で、形質転換ジャガイモ葉組織の一 部を切除して経時的に GUS染色した（図 1 2)。 その結果、 切除部位は 48時間後に おいても GUS染色されなかった。 したがって、 本プロモータは傷害に応答しなこ とが示された。 疫病菌に対する応答を調べる目的で、 疫病菌親和性レースを接種して顕微鏡観 察したところ， 6時間以内に GUS染色が侵入細胞で確認された（図 1 3)。さらに、 接種 48時間後になると接種葉全体に強い発現が認められた。 これらのことは、本 プロモータが疫病菌親和性レースの感染に応答することを示している。 本プロモ一夕が恒常的に発現する器官の存在を調べるために、 形質転換ジャガ ィモ植物全体を GUS で染色した（図 1 4)。 GUS染色のポジティブコン卜ロールと して用いた疫病菌接種葉組織を除いて、 成長点や根などの部位において染色は認 められなかった。 この結果は、 本プロモー夕が病原菌特異的に応答することを示 唆している。 本プロモータがいずれの病害シグナルに応答するかを調べるために、 葉組織を 各種エリシターで処理して GUS染色した （図 1 5、 1 6、 1 7、 1 8)。 ジャガイ モ疫病菌の膜の構成脂肪酸であるァラキドン酸で処理した場合、 24時間以降にな ると GUSでの染色が確認された （図 1 5)。 一方、 活性酸素種の一つである過酸化 水素処理や、 過酸化水素を生成するグルコース ， グルコース酸化酵素処理、 また は、 全身獲得抵抗性に関与しているサリチル酸のいずれで処理しても GUS染色は 認められなかった （図 1 6、 1 7、 1 8)。 卜マ卜葉かび病菌 Cladosporium f u 1 vumの特異的エリシタ一である Av r9 に対 応する 卜マ卜品種の抵抗性遺伝子産物 Cf- 9が応答すると、情報伝達機構が始動し、 過敏感反応が誘導されることがよく知られている （文献 4 1 を参照）。 Cf-9/Avr9 をァグロパクテリゥ厶を介して一過的に葉組織に発現させたところ、 GUS で染色 された（図 1 9)。 さらに、 これら抵抗性遺伝子の下流に存在し、 種々の防御反応 を司ることが知られてしヽる sal icyl ic acid - induced protei n k i nase (S I PK)およ び wound-induced protei n k i nase (W I PK)をリン酸化して活性化する恒常的活性 変異酵素 StMEK°D (配列番号 7、 8 ) を同様に発現させた結果、 GUS活性が認めら れた（図 1 9)。 一方、 コントロールに用いたインサートを持たないバイナリーべ クタ一を含むァグロパクテリゥ厶を接種した葉組織では GUS染色は認められなか つた。 リシチン合成において重要な役割を果たす HMG- CoA r ed u c t as e (HMGR)遺伝子は 多重遺伝子族を形成している（図 1 )。 HMG 1 は傷害に応答してステロイ ドグリコア ルカロイ ド生産に貢献し、 一方、 HMG2 および HMG3 は病害シグナルにより誘導さ れ、 リシチン合成に貢献することが知られている（文献 9を参照）。 ジャガイモ植 物における PVS遺伝子も同様に多重遺伝子族を形成し、 PVS 1〜4 のメンバーが存 在することが報告されている （文献 5 3を参照）。本研究では、 ジャガイモ塊茎組 織および葉組織における PVS 1〜4各メンバーの発現動向を調べるため、 各メンバ 一特異的なプライマーを用いて RT- PCRを行った。疫病菌の親和性および非親和性 レース接種を施したジャガイモ塊茎ディスクより抽出した全 RNAを錶型として RT -PCRを行った（図 3 )。 いずれのレースを接種した場合においても、 PVS 1 ~ 4全て のメンバーのバンドが推定されるサイズに検出された。 これらの結果は、 少なく とも塊茎組織においては PVSのメンバーは刺激に応答した代謝変動に対して異な つた役割を持たない可能性を示すものと思われる。 PVS mRNAの蓄積動向がジャガイモ塊茎組織における PVSタンパク質合成に反映 されているのか調べるため、 抗ジャガイモ PVS抗体を作製し、 ウエスタン解析を 行った（図 4 )。 非親和性レース、 および親和性レース接種により接種後 6時間か ら 24時間において PVSタンパク質の蓄積が認められた。ジャガイモ塊茎組織より 抽出した全 R N Aを用いてノーザン解析した結果、 非親和性レースおよび親和性レ ース接種区では PVS mRNAが接種後 6- 9時間をピークに一過的に蓄積することが報 告されている（図 2、 文献 5 3 )。 PVS mRNAの蓄積動向を考慮すると、 PVSタンパ ク質の半減期は長いものと思われる。 また、 非親和性レースおよび親和性レース 接種を施したジャガイモ塊茎組織より調製した可溶性画分において、 PVS 酵素活 性がいずれの場合においても増加することが報告されている （文献 5 4を参照）。 この報告は、 非親和性レース接種によってのみファイ トァレキシンが蓄積すると した報告と矛盾する （文献 4 0を参照）。ジャガイモにおけるフアイ 卜ァレキシン 生合成においては、 3- Hydroxy- 3-tnethylglutaryl CoA (HMG-CoA) からメバロン酸 を生合成する酵素である HMGR とフアルネシル二リン酸からベティスピラディン を生合成する PVSの二つが重要な役割を果たすと考えられている （文献 2 9、 5 4、 及び 9を参照）（図 1 )。 HMGR 活性が非親和性レース接種区においてのみ著し く増加し、 親和性レース接種区では時間経過とともに減少することが報告されて いる （文献 5 2を参照）。 HMGR の活性動向を考慮すると、 ジャガイモ品種—疫病 菌レース間の特異的なファイ トァレキシン合成制御はメバロン酸の供給が鍵を握 るものと考えられる。 この可能性を確かめるために、 親和性レースを接種した塊 茎組織に PVSの基質であるフアルネシル二リン酸を外部から供与することで、 フ アイ 卜ァレキシンであるルビミンおよびリシチンが蓄積するか否かを調べる必要 があるものと思われる。 ジャガイモ疫病菌の実際の第一感染組織は葉組織である。 本研究では、 疫病菌 接種により PVS1〜4いずれのメンバーが発現しているのかを調べるために、 親和 性、 非親和性レース接種および水処理後経時的に葉組織から抽出した全 RNAを錶 型として RT- PCRを行った （図 5)。親和性、非親和性レース接種区双方において、 PVS3のみが顕著に誘導されることが確認された。 一般に、 ジャガイモ葉組織にお いて、 リシチンは蓄積しないものとして知られている （文献 3 4を参照）。 しかし ながら、 一過的に葉組織においてもリシチンが合成されるとした観察例がある (文献 2 6を参照）。 防御応答における葉組織でのリシチンの役割は現在のところ 明らかではないが、 親和性レース接種により PVS3が誘導されることは、 本プロモ 一夕を利用した病害耐性作物の作出を可能なものとした。 そこで、 PVS3プロモー 夕配列を得るために、ゲノムクローンを単離した。スクリ一ニングの結果、 PVS1、 PVS3 および PVS4が得られた （図 6、 7、 8、 9 )。 今回単離された PVS 3ゲノム クローンおよび既に単離されている PVS3 cDNAとを比較したところ、 全ての推定 されるアミノ酸配列が一致した。 ェクソン領域における制限酵素サイ 卜は一致し ており、 それぞれ対応していた（図 8)。 タバコおよび卜ゥガラシのファイ トァレキシンである力プシジオールとヒヨス およびジャガイモの生産するリシチンは双方とも類似した生合成経路で合成され る （文献 4、 及び 2 9を参照）（図 1 )。前者の合成に関与するセスキテルペンシク ラーゼは 5-ェピ-ァリストロキンシンターゼ（EAS)であり、 タバコ（TEAS)と 卜ゥガ ラシ（PEAS)の EASはアミノ酸レベルで極めて類似している （文献 5 3を参照）。 B ack and Chappel I は、 TEASとヒヨスの HVS cDNAを用いて様々なキメラ遺伝子を 構築し、 大腸菌内でキメラ遺伝子からタンパク質を合成した（文献 4を参照）。 菌 体可溶画分に EASおよび VSの基質であるフアルネシル二リン酸を加え、 5-ェピ- アリス卜口キンまたはべティスピラディンの生産の割合を定量することで、 両酵 素の活性を司る領域を推定した。 彼らの報告に従い、 各ェキソンで規定される活 性ドメインの推定アミノ酸配列を比較したところ、 vet ipi radine speci f ic doma inでは、 ヒヨスの HVS と PVS4または PVS3の間において 90%以上の Ident i tyが 確認された。 また、 基質結合部位の存在する aristol ochene speci f i c domai nに おいては PVS と TEAS または PEASの間では、 I den U tyが 78 %〜89%であるのに 対し、 PVSと HVSの間では、 98%以上の高い Iden tyが認められた（図 9)。 この 結果は、 Back and Chappe I I が提唱した説（文献 4を参照）を支持するものである。 さらに、 PVS1 および PVS4は 5つのイン卜ロンに分断される 6つのェクソンから 成るのに対し、葉組織で発現する PVS3や他のセスキテルペンシクラーゼは 6つの イン卜ロンに分断される 7つのェクソンから成ることが明らかになった（図 9)。 宮田（1984)は、 ミ トコンドリアゲノムにおいて効率よく複製を行うために機能を 持たない場合のイン卜ロンは除去され、 進化の過程で DNAが縮小化すると推定し た。 彼の説に従うと、 塊茎で発現する PVS1 および PVS4の第 5イントロンは、 進 化の過程でイントロンが除去され縮小化したものと考えることもできるであろう。 プロモータを利用した病害耐性植物の作出を考えると、 PVS3プロモータ領域の 解析■同定をすることが必要であると思われる。 本実施例では、 PVS3の推定プロ モータの下流に GUS遺伝子を連結し、 形質転換ジャガイモ植物を作出して本プロ モータの応答性について詳細に調べた。 興味深いことに、 本プロモータは傷害に は応答しなかっただけではなく（図 1 2)、 成長点や根などの部位において染色は 認められなかった（図 1 4)。 タバコ植物のセスクテルペンシクラーゼである TEAS のプロモータの下流に同様に GUSを連結した形質転換タバコ植物が作出され、 そ の発現動向について報告されている （文献 5 1 を参照）。彼らは、低レベルではあ るが、 傷害に応答し、 さらに、 根や茎においても GUS活性が認められたと報告し ている。 この報告に従うと、 ジャガイモ葉組織における PVS3プロモータとタバコ 葉組織における TEASプロモータの応答様式は異なっているものと思われる。夕バ コ葉においては、 病原菌の攻撃ゃェリシ夕一処理に応答してファイ トァレキシン である力プシジオールが高濃度に蓄積する。 一方、 ジャガイモ葉組織におけるリ シチン蓄積は認められず、 PVS3 mRNA蓄積は叮- PCRで検出される程度の低レベル なものであった（図 5)。 この結果を考慮すると、 PVS3プロモータの特異的応答性 は発現レベルの低さに起因するかもしれない。 最近になって、 HMGR遺伝子発現が mi togen- activated p ro te i n (MAP)キナーゼの —種である SIPKにより制御されることが報告された （文献 3 3を参照）。 本研究 においても、 SIPK および WIPKをリン酸化して活性化する恒常的活性変異酵素 S tMEKDD (文献 5 0を参照） を同様に発現させた結果、 GUS活性が認められた（図 1 9 )。 さらに、 卜マト葉かび病菌 Cladospor ium fulvum の特異的ェリシターであ る Avr9および卜マ卜品種の抵抗性遺伝子産物 Cf- 9をァグロパクテリゥ厶を介し て一過的に葉組織に発現させたところ、 GUSが染色された（図 1 9)。 Romeis et a I ·は、 Cf- 9を形質転換したタバコ植物および培養細胞を Avr9で処理すると、 SIP K および WI PK が活性化されることを報告した（文献 3 5を参照）。 これらの結果 より、 PVS3プロモータも HMGR遺伝子同様に S I PKにより制御されるものと思われ る。 この考えは、 HWC やァラキドン酸でジャガイモ塊茎組織を処理すると、 SIPK に相当する MAPキナーゼが活性化されることからも支持されるであろう （文献 2 0を参照）。 これらの想定される情報伝達経路を 図 2 0に示した。 MAPK カスケードは植物のシグナル伝達経路における重要な制御因子の一つで あり、 近年注目を集めている （文献 6 5 )。 その中でも、 SIPKおよび WIPKは、 植 物の病害抵抗性発現に重要な役割を果たすことが明らかになりつつある （文献 5 7 )。 MAPKカスケ一ドの上流に位置する MAPKKKが MAPKKをリン酸化することで活 性化し、さらに MAPKKが MAPKをリン酸化することで種々の防御反応を引き起こす ことが知られている。 最近になって、 タバコの一種であるべンサミアナ葉 （Nico tiana benthamiana) に MAPKKである StMEKI の恒常的活性型変異酵素 StMEK1°Dを 過剰発現させると、 SIPKおよび WIPKが活性化され、 タバコ植物のセスキテルべ ンシクラ一ゼである 5-ェピ-アリス卜口キンシンタ一ゼ （TEAS) が誘導されるこ とが示された （文献 6 4 )。 ジャガイモの PVS遺伝子調節においても、 タバコ植物 同様に MAPKカスケードが関与することは容易に予想される。 以下の実施例では、 ウィルス誘導型遺伝子サイレンシング （vi rus- induced gene s i lencing; VIGS) の手法を用いてこの可能性について探った。 VIGSは、 植物遺伝子の機能を解析す る上で効果的な遺伝子ノックダウン法として近年注目を集めている （文献 5 9 )。 VIGSは、 本来ウィルスに対する生体防御システムであり、 ウィルス内の遺伝子と ホモロジ一の高い宿主遺伝子の転写産物が特異的に分解される現象である。 一般 に、 ウィルス内に導入された植物遺伝子断片と、 80 %以上のホモロジ一を示す mR NAが分解されるため、 1遺伝子のみならず多重遺伝子族を形成する遺伝子をノッ クダウンするのに有効である。 この手法は、 形質転換体や変異体の作製に比べ、 簡便かつ迅速である。 中でも、 ジャガイモ Xウィルス （PVX) とべンサミアナの系 は、 逆行性遺伝学的な機能解析法として多くの研究成果が蓄積されている （文献 6 7、 文献 7 0)。 そこで、 VIGS により SIPKまたは WIPKをノックダウンし、 上 で述べた PVS3:GUS をァグロパクテリゥ厶により一過的に葉組織に導入して PVS3 プロモータ活性を調べた。 以下の実施例 9 ~ 1 2において使用される生物学的材料、 試薬、 実験方法等は 次の通りである。 尚、 特に説明のない材料等については上記実施例で使用したも のと同様である。
1. 供試植物
供試植物として日本たばこ株式会社から分譲されたべンサミアナ （Nicoti ana benthamiana) を用いた。 ベンサミアナ種子を、 クレハソィル （呉羽化学） を入れ たポリエチレンポッ トに播種し、 25 °Cの恒温室において 24時間の明条件下で発 生させた。 ァグロパクテリゥ厶 （Agrobacterim tumef ac i ens) を介した卜ランジ ェン卜アツセィには、 播種後 30から 35 日目の植物体の 6から 8葉を用いた。 2. INF1 の調製
ベンサミアナ葉に処理するインフェスチン （INF1) は、 infl遺伝子を含む FLA G-ATS ベクター （FLAG- INF1) を導入した大腸菌 （Escheruchia col i 株 pBF53) で発現させた融合タンパク質を用いた （文献 6 2 )。 融合タンパク質の調製は以下 のように行った。
それぞれの大腸菌を 50 t g/ml アンピシリンを含む LB液体培地中で 37 °Cで一 晚振とう培養 （140 rpm) した。 大腸菌培養液を 〗 00倍量の 50 pptnアンピシリン を含む LB液体培地に加え、 0D6()„ = 0.6 になるまで 37 °Cでさらに振とう培養 0 40 rpm) した。 最終濃度 1 raMとなるように I PTGを添加してタンパク質の発現を 誘導し、 37 °Cで 3時間振とう培養 （140 rpm) 後、 培養液を遠心分離 （ 5, 000 x g、 10分間） した。 上清をフィルター濾過後、 透析チューブ （排除限界分子量 3， 500) に移し、 滅菌蒸留水に対して 4 °Cで 24時間透析した。 以上の操作で得られ た画分をタンパク質濃度が 10 mg/ml となるように調整し、 FLAG- INF1溶液とした。 植物に処理をする際には、 蒸留水で 3倍に希釈した INF1溶液を用いた。 3. GUS遺伝子を連結した PVS3プロモータを挿入したバイナリーベクターの構築 MUGアツセィに用いる発現ベクターの構築は以下の様に行った。 PVS3ゲノムク ローンを錶型とし、 制限酵素部位 （fcoRI または Cla、 ) を付加したプライマーを 用いて （図 2 4 )、 推定プロモータ領域と PVS3遺伝子コード領域開始部を含む塩 基配列を PCRにより増幅した。 PCRには KOD -Plus- DMA Polymerase (Toyobo) を 用い、 55 °Cのアニーリング温度で、 添付のプロ 卜コールに従って反応を行った。 この PCR産物を £coRI および C/a、で消化して 1 %ァガロースゲル電気泳動により 分画した後、 目的の DNA断片を QIAqui ck Gel Extraction Ki t (Qiagen) を用い て精製し、 インサートとして用いた。 ベクターにはイントロンを含む GUS遺伝子 を含む pGreen 0229 ' (He I I ens et al . 2000) を用い、 インサートと同様に fcoR I および C/al で消化し 1 %ァガロースゲル電気泳動により分画した。 目的の DNA断 片を QIAqui ck Gel Extraction K i tを用いて精製してベクタ一として用いた。 以 上のように調製したベクターおよびインサートを、 ベクター ： インサートのモル 比が 1 :3になるように調整し、 DNA Ligat ion Ki t ver. 2 (Takara) によリライゲ ーシヨンした。 E. col i JM109 Competent Cel l (Takara) を、 ライゲ一シヨンした プラスミ ド DNAで形質転換した後、 LB寒天培地上 [1 % tryptone peptone, 0.5% yeast extract powder, 1 % NaC L 50 g/m I kanamyc i n% 1 % agarose] に接種 し、 37 °Cでー晚培養した。 シングルコロニーを、 カナマイシン溶液 （50 ig/ml) を含む 1 mlの LB液体培地 [1 % tryptone peptone, 0.5% yeast extract powd er、 1% NaCI, 1 % agarose]で 37 °Cで一晚培養し、 プラスミ ド DMAを回収した。 図 2 5に PVS3プロモータを揷入したバイナリーベクターのマップを示した。
4. ベンサミアナ葉における 卜ランジェン卜アツセィに用いるデリ一シヨンクロ ーンの構築
上記 3で作製した GUS発現ベクターを鏵型とし、 目的のデリーシヨンボイン卜 から始まる制限酵素部位（fcoRI または C/al)を付加したプライマーを用いて（図 24)、推定プロモータ領域と PVS3遺伝子コード領域開始部を含む塩基配列を PC Rによリ増幅した。 PCRには K0D -Plus- DNA Polymerase (Toyobo) を用い、 55 °C のアニーリング温度で、 添付のプロ 卜コールに従った。 バイナリーベクターの調 製は上記 3の操作に準じて行い、 6で述べる方法でァグロパクテリゥ厶に導入し た。得られたデリーシヨンクローンの塩基配列が間違っていないことを確認した。
5. StMEK1DD発現ベクターの構築
ベンサミアナ葉における MUGアツセィに用いる発現ベクターの構築は以下の様 に行った。 5' 側非翻訳領域を含む StMEK1DD (文献 64) の塩基配列を、 制限酵素 部位 （zlpalまたは el) を付加したプライマー (5' -TTGGGCCCATGCGACCTCTTCAAC CACC-3' ： 配列番号 3 6， 5' -GACTAGTACAAAAGAGTGTGGAATTAC-3' ： 配列番号 3 7) を用いて、 PCRにより増幅した。 PCR反応には KOD -Plus- DNA Polymerase (Toyo bo) を用い、 55 °Cのアニーリング温度で、 添付のプロ 卜コールに従って反応を行 つた。 この PCR産物を Apa!および Spelで消化して 1 %ァガロースゲル電気泳動 により分画した後、 目的の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) を用いて精製し、 インサートとして用いた。 ベクタ一には; 8—エストラジオール により導入した遺伝子発現が誘導される PER8 (文献 7 4 ) を用い、 インサー卜と 同様に al および el で消化し 1 %ァガロースゲル電気泳動により分画した。 目的の DMA断片を QIAquick Gel Extract ion K i tを用いて精製してベクターとし て用いた。 以後は上記 3のライゲ一シヨンの操作に準じて行った。
6. ァグロパクテリゥ厶の形質転換
導入するベクターを TEで 10 ng/μ I に調整し、ァグロパクテリゥ厶の形質転換 に用いた。バイナリ一ベクターを 80 μ I のァグロバクテリゥ厶 GV3101株の coinp etent ce I I を氷上で融解して、 2 I のベクター溶液を加えてピペッ トで混和し、 30分間氷上で静置した。 この溶液をキュベッ トに移して、 Mi cro Pul ser™ (Bio- Rad) でエレク トロポレート （V = 1.44 kV、 T = 2.5 kV/res i s tance、 C = al l o ut、 R = R5 129) して、 形質転換した。 溶液を 1.5 ml のエツペンドルフチューブ に移して、 1 ml の S0C培地 [2% tryptone peptone, 0.5% yeast extract powd er、 0.05% NaCI、 10 mM MgCI2、 10 m MgS04] に加え室温で 1 時間静置した。 そ の後、 LB寒天培地上 [1 % tryptone peptone, 0.5% yeast extract powder, 1 % NaCI、 50 μ. g/m I kanamyc iru 50 g/m I r i f amp i c i n, 1 % agarose] に接種し、 28 でで 1 日間培養した。 シングルコロニーを回収し、 下記 7の Agroi nf i I trat io n実験に用いた。
7. ベンサミアナ葉を用いた Agroinf M t rat ionによる遺伝子の導入
Thomas ら （ 2000) の方法 （文献 4 1 ) に従い、 Agro i nf i 11 rat i on を以下の方 法で行った。 バイナリ一ベクターを導入したァグロパクテリゥムを所定の抗生物 質を含む LB液体倍地中で 28 °Cで I 日間振とう培養した。 培養液 1 ml を、 抗生 物質を含む 8 ml の LB液体培地に懸濁し、 28 °Cでさらに 3時間振とう培養した。 懸濁液中のァグロパクテリゥ厶の密度は、 紫外可視分光解析システム （DU シリ一 ズ 600、 Beckman) を用いて測定し、 波長 600 nmにおける吸光度で測定した。 懸 濁液を室温で遠心分離 （3, 000 X g、 15分） し、 沈殿を 150 のァセ卜シリン ゴン、 10 mM MgCI2を含む 10 mM MES (pH 5.6) に 0D6。。 = 0.5 となるよう再懸濁 した。
PVS： GUS i n t保持したァグロパクテリゥ厶を単独で Agro ί nf ί 11 ra t ί onする際は、 OD600 = 0.5の懸濁液を葉に注入し、 一日後に 〗0 t g/ml の ΙΝΠ 溶液を注入する ことで PVS3プロモータを誘導した （図 2 6 )。 一方、 pER8ベクターを用いた XVE: StMEKlDDまたは PVS:GUSint保持したァグロバクテリゥ厶を Agroinf i I t rat ionす る際は、 それぞれ 0D6()Q = 0.005および 0D6。Q = 0.25となるように希釈し、 20 μ Μの β一エス卜ラジオールで G10- 90プロモータの下流に連結した XVE (LexA、 VP 16、 estrogen受容体） システムを誘導して StMEK1DDを発現させた （文献 7 4 )。 対照区には、 XVE:StMEKlDDの代わりに pER8ベクターを用いて 20 の /3 —エス トラジオールを注入した （図 2 6 )。
懸濁液を室温 （20 °C) で 1時間静置した後、 針のないシリンジを用いてベンサ ミアナ葉の細胞間隙に注入した。注入後植物体を 25 °C、24時間明条件で静置し、 下記 9の MUG (4- methylumbel H feryl j8 -D-g I ucu ron i de) アツセィに用いた。
8. ベンサミアナにおけるウィルス誘導型遺伝子サイレンシング
植物に感染したウイルス内の塩基配列が植物の遺伝子と相同な配列を含むと、 植物内で遺伝子サイレンシング （vi rus- induced gene s i lencing; VIGS) が起こ ることが知られている （文献 6 7 )。 本実施例では、 遺伝子サイレンシングが安定 して起こる PVX とべンサミアナの系を用いた。 PVX を含むバイナリ一ベクターで ある PGR106 に、 SIPKの翻訳開始コ ドンよリ 230 bpの cDNA断片、 WIPKの翻訳開 始コ ドンよリ 178 bpの cDNA断片、 または S Kと WI PKをタンデムに連結した cD NA 断片を挿入して得られた遺伝子サイレンシング用ベクターをァグロパクテリ ゥ厶に導入した。 上記 7 の方法に準じてァグロパクテリゥ厶を培養し、 播種後 3 週間のベンサミアナ葉に注入して 1 ヶ月生育させた上位葉を実験に用いた （図 2
7)。
9. MUGアツセィ
Gal lagher ( 1992) の方法 （文献 6 0 ) に従い、 GUS発現を定量するために MUG (4 - me thy I umbe I I i f ery I β -D-gl ucuron i de) アツセィを rつた。 ァグロハクテリ ゥ厶を注入した 1 cm平方のベンサミアナ葉 3枚を液体窒素中で磨砕した後に 200 I の抽出緩衝液 [50mM NaHP04 (pH 7.0)、 10 mM β -mercaptoethano K 10 m EDTA、 0.1 % sodium lauroy I sarcos i ne. 0.1% Tr i tonX-100] を加え、 遠心分離 ( 12,000 rpm、 4 °C、 5分） して上清を回収した。 上記 13のタンパク質定量の方 法に従って抽出液のタンパク質濃度を測定し、 10 μ Ι の抽出液を 37 °Cの 90 I 蛍光測定緩衝液 [extraction buffer, 2 mM MUG]に加えて反応液を 100 l とし、 37 °Cで 1 時間静置した。反応液を 900 μ Ι の反応停止液（0.2 M Ma2C03)に加え、 測定に用いた。 蛍光分光光度計 RF- 5300PC (Shimadzu) を用いて、 365 nmの励起 光で、 455 nmの放出スペク トルを測定した。 検量線は 4-MU (7- hydroxy- 4- methy lcoumarin) を用いて作成し、 測定値を 4- MU nM/min · mg proteinに換算した。 内 在の GUS活性を測定値から除外するため、 酵素を熱変性したサンプルを準備し、 換算値の差をとることで発現ベクターに由来する GUS活性を算出した。
10.ベンサミアナ葉からの全 RNA抽出
ベンサミアナ葉からの全 RNAの抽出は、 SDS/フエノール法をもとに以下の方法 で行った。 ベンサミアナ葉 1 gを乳鉢中で液体窒素を加えながら磨砕し、 抽出緩 衝液 （EB) [50 mM Tris-HCI (pH 7.5)、 150 mM塩化ナトリウム、 5 mM EDTA、 5 % SDS] 5 ml、 PCI [フエノール I クロ口ホルム I イソアミルアルコール （50: 4 9:1、 v/v/v) ] 0.4 ml、 メルカプトエタノール 10 I の入った 50 ml 容滅菌遠心 管に加え、 1分間激しく混合し、 PCI 4.8 ml を加え軽く攪拌した。 これを、 ポリ トロン型ホモジェナイザー （HG30、 日立） を用いて 2分間磨砕した後、 遠心分離 した （1， 300 X g、 15分）。 水層 （上層） を新しい 50 ml 容滅菌遠心管に移し、 PC I 6 ml を加えて 2分間攪拌した後、再び常温で遠心分離した（ 1,300 x g、15分）。 水層 （上層） に 1/40量の 4 M塩化ナ卜リウ厶と 2倍量のエタノールを加えて混合 し、 - 20°Cで 2 時間以上静置した後、 遠心分離した （1，300 X g、 15分）。 得られ た沈殿に再懸濁緩衝液 （RB) [50 mM Tris-HCI (pH 7.5)、 5 mM EDTA、 0.5% SDS] 2 ml を加え、 15分間穏やかに振蕩、 懸濁した。 懸濁液に 4 M塩化ナトリウム 0,2 ml とエタノール 4 ml を加え、 -20°Cで 2時間以上静置した後、遠心分離した（1， 300 X g、 15分）。 得られた沈殿を冷 70 ¾ エタノール 1 ml で洗浄した後、 TE緩 衝液 [10 mM Tris-HCI (pH 7.5)、 1 mM EDTA] 1 ml に懸濁後、 エツペンドルチュ ープに移し、 10 M塩化リチウム 250 l を加えて、 氷上で 1時間静置した。 懸濁 液を 4°Cで遠心分離し （22,000 X g、 15分）、 RNAを沈殿として回収した。 この、 J チウ厶沈殿操作を 2回繰り返し、得られた沈殿を TE緩衝液 300 β I に懸濁し、 ク ロロホルム I イソアミルアルコール （24:1、 ν/ν) 100 μ. I を加えて激しく攪拌 した後、 4°Cで遠心分離した （22,000 X g、 15分）。 水層 （上層） に 1/10量の 3 M酢酸ナトリウム （pH 5.2) と 2倍量のエタノールを加え、 - 20°Cで 2 時間以上静 置した後、 遠心分離した （2.2,000 X g、 5分）。 得られた沈殿を冷 70 % エタノー ルで洗浄した後 10分間風乾し、 TE緩衝液 40 β I に懸濁し、 全 RNAとした。 これ を RNA試料として -80°Cで保存した。
11.ノーザン解析
全 RNAをホルムアルデヒドァガロースゲル電気泳動で分画した後 （文献 3 7 )、 アルカリプロッティング法 （文献 6 8) で Hybond- N+ナイロン膜 （Amersham) に 転写 · 固定した。
RNAを吸着させたナイロン膜を、 42 °Cのプレ八イブリダィゼ一シヨン溶液 [50 %ホルムアミ ド、 5 X デンハル卜溶液 （文献 3 7 )、 5 X SSPE (文献 3 7 )、 0· 5 % SDS、 100 μ g/ml熱変性サケ精子 DNA (Pharmacia) ] 中で 1 時間以上放置した 後、 32P標識 DNAプローブを添加し、 42 °C下で 16時間以上ハイプリダイゼ一ショ ンを行った。 この膜を 0.1 % SDS含有 4 X SSPE中で室温下 15分間 （2回）、 0.1 ¾ SDS含有 4 X SSPE中で 60 °C下 15分間、 さらに 0.1 ¾ SDS含有 2 x SSPE中で 6 0 °C下 15分間 （1 回） 順次洗浄した。 オートラジオグラフィ一は、 X線フィル厶 OMAT-AR (Kodak) および増感紙 Lighting Plus (Dupont) を用いて、 -80 °C下で 行った。
12.プローブの作製
タバコの TEAS cDNAを組み込んだプラスミ ド pTEAS (Facchini and Chappel, 1 992) を錶型とし、 プライマー （5' - GTCGACGACACAGCCACGTACGAGGT- 3' ： 配列番号 3 8、 5' - ATCGATAGACTTTCTCCGGATGAGTG-3' ：配列番号 3 9 ) を用いて PCRにより TEAS cDMA断片を増幅した。 反応は、 TaKaRa Taq™ (宝酒造） およびインサ一卜 D NAを組み込んだプラスミ ド 2 ngを用い、 DMAサ一マルサイクラ一 （PJ2000、 Per kin Elmer Cetus) で 94 °C一 1分間 （熱変性）、 53 °C— 45秒間 （アニーリング）、 72 °C— 2分間 （DMA伸長反応）、 25 サイクルという条件下で行った。 0.8 ァガ ロース電気泳動により増幅された DNA断片のサイズを確認した。 QIAquick Gel E xtraction Kit (QIAGEN) を用いてゲルより DMA断片を精製した。 32P標識 DNAプ ローブをランダムプライミング法 （文献 1 7 ) により [a- 32P] dCTP (111 TBq/ram o I、 I CN Biochemicals) およひ Megaprime DNA label l ing system (, Amersham) を 用いて作製した。 <実施例 9 > Agroinf i I trat ion により導入された PVS3 プロモータデリーショ ンクローンの INF1 に対する応答
P. infestans 由来のエリシ夕一タンパク質である INF1 は、 ベンサミアナに対 して有効なェリシターである （文献 6 3 )。 イン卜ロンを含む GUS遺伝子を PVS3 プロモータの下流にインフレームで連結させたバイナリ一ベクターを Agroinf i I trat ionによりべンサミアナ葉に導入し、 I NF1誘導による GUS活性を調べた （図 2 7 )。PVS3プロモータのほぼ全長を挿入したバイナリーベクター PPVS3-1 を導入 した場合、 水処理対照区に比べて著しい GUS活性の増加が観察された （図 2 8)。 INF1 に応答する PVS3 プロモータのシス配列を調べるために、 デリーシヨンクロ ーンを作製してバイナリーベクターを構築して GUS活性を調べた。 その結果、 -1 337 (pPVS3-2： 配列番号 2 2 ) では I NF1応答性を保持していたが、 -1287 (pPVS 3-3) までデリーシヨンすると INF1 よる GUS活性誘導は顕著に減少した。 この結 果は、 PVS3プロモータのシス配列が pPVS3-2と PPVS3- 3間の 50 bp (配列番号 2 3 ) に関与することを示している （図 2 9 )。
<実施例 1 0 > StMEK1°Dによる PVS3プロモータの誘導
StMEK1DDは、 MAPKKのアミノ酸置換による恒常活性型変異体であり、 Agroinf i l trat ionによりべンサミアナ葉に導入すると、 SIPKおよび WIPKが誘導されること が確かめられている （文献 6 4 )。 INF1処理に対する PVS3プロモータ領域の応答 領域が、 StMEK1DD に対しても同様であるか否かを調べるため、 イン卜ロンを含む GUS遺伝子を PVS3プロモータに連結させたバイナリーベクターを Agroinf i I trat ion によりべンサミアナに導入した。 同時に —エストラジオールにより誘導さ れる XVEの下流に StMEK1DD遺伝子を連結したバイナリ一ベクターを形質転換した ァグロパクテリゥ厶を共感染させ、 ；8—エス卜ラジオ一ルを注入した後さらに 1 日静置して StMEK1DDを発現させて GUS活性を調べた （図 2 7 )。 その結果、 -1337 (PPVS3-2：配列番号 2 2 )では対照区に比べて 一エス卜ラジオ一ルを注入する と GUS活性が誘導された （図 3 0)。 一方、 -1287 (pPVS3- 3) まで PVS3プロモー 夕をデリーシヨンすると P —エス卜ラジオール処理による GUS活性誘導は顕著に 減少した。 この結果は、 PPVS3- 2 と pPVS3-3間の 50 bp (配列番号 2 3 ) に StMEK 1DDに応答するシス配列に関与すること、 および INF1 に対するシス配列と同様で あることを示している （図 2 9 )。
<実施例 1 1 > StMEK1D°誘導による PVS3 プロモータ活性に及ぼす SIPKおよび WIPKサイレンシングの影響
SI PK、 WIPK単独または SIPKと ！《Ι ΡΚ双方を遺伝子サイレンシングしたべンサミ アナに Agroinf i I trationにより pPVS3- 1 を導入して GUS活性を調べた。 この際、 XVEの下流に連結した StMEK1DDを Agroi nf i rationにより共感染させた 1 日後に ^—エストラジオールを注入し、 さらに 1 日静置して StMEK1DDを発現させた （図 3 1 )。 PVX接種した対照植物に比べ、 SIPK、 WIPKをそれぞれサイレンシングした 植物体においては顕著な GUS活性の低下は観察されなかった （図 3 2 )。 一方、 S I P Kおよび W I P K双方をサイレンシングした植物体においては顕著な G U S活性の低 下が認められた。 <実施例 1 2 > StMEK1DD誘導による TEAS発現に及ぼす SI PKおよび WIPKサイレ ンシングの影響
タバコのセスキテルペンシクラーゼである TEASの制御機搆を調べる目的で、 S IPKおよび WIPKをサイレンシングしたべンサミアナに、 StMEK1DD遺伝子を 35Sプ ロモ一夕に連結させた発現ベクターを Agroinf i I tration によリベンサミアナに 導入し、 絰時的に全 RMAを抽出した。 TEAS cDI をプローブに用いてノーザン解 祈したところ、 SI PKと W1PK双方をサイレンシングした において顕著に TEAS m RNAの蓄積が抑制されていた （図 3 2' o この結果は、 PVS3プロモータの活性に対 する SIPKおよび WIPKの役割が同様であることを示している。 以上の実施例に示したように、 PVS3遺伝子発現に重要なプロモータ領域を調べ るために、 GUS遺伝子の上流に PVS3プロモータを連結し、 デリ一ションクローン を構築して、 INF1処理を施して GUS活性を測定した （図 2 8)。 デリーシヨン pP VS3-2 (配列番号 2 2 ) では INF1処理による顕著な活性増加が見られたが、 デリ ーシヨン PPVS3-3では活性増加が認められなかった （囡 2 8)。 遺伝子の転写は、 刺激によリ生じた転写因子であるタンパク質がプロモー夕領域中のシス配列に結 合することにより誘導されることが知られている。デリーシヨン PPVS3- 2と pPVS 3-3 の間に転写因子と結合するシス配列が存在するものと考えられる。 現時点で は、 この 50 bpの領域 （配列番号 2 3 ) には既知の制御モチーフを見出すことが 出来なかった （図 2 9 )。
タバコの MAPKである SIPKがセスキテルぺノィ ドフアイ 卜ァレキシン合成にお いて重要な役割を果たす 3- hydroxy- 3- methy Iglutary I CoA reductase (HMGR) の 発現を制御することが示されている （文献 7 3 )。 APK カスケードは、 植物のシ グナル伝達経路における重要な制御を司リ、 その下流に様々な防御反応を活性化 することが知られている （文献 7 1 )。 さらに最近になって、 StMEK1DD遺伝子を 3 5S プロモータの下流に連結させた発現ベクターを Agroinf i I trat ion によりベン サミアナに導入すると、 TEASが転写レベルで誘導されることが示された （文献 6 4 )。 INF1処理に対する PVS3プロモータの応答領域が、 StMEK1DDに対しても同様 であるか否かを調べるため、 デリーシヨンクローンおよび StMEK1DDを Agroinf i I trat ionによりべンサミアナ葉に共発現させて GUS活性を調べた。 ΙΝΠ の場合と 同様に、デリ一シヨン PPVS3- 2では StMEK1°Dによる著しい活性増加が見られたが、 デリーシヨン PPVS3- 3では有意な活性増加が認められなかった （図 3 0 )。 Zhang ら （ 1998) は Phytophthora c ryp togeaの生産する c ryp t oge i nェリシチンまたは P. parasi ticaの生産する pa ras i t i ce i nエリシチンでタバコ培養細胞を処理する と、 SIPKおよび WI PKが活性化することを報告している （文献 7 2 )。 本実験結果 と併せて考えると P. infestansの生産する INF1 ェリシチンのシグナル伝達によ る PVS3 の誘導過程に、 MAPKカスケードが関与する可能性を示している。 この可 能性を調べる目的で、 SIPK、 WI PKまたは SIPKと WIPK双方を遺伝子サイレンシン グしたべンサミアナ葉に PVS3プロモータを含むバイナリ一ベクターを Agroinf i I trat ionにより導入し、 IMF1ェリシターで処理して GUS活性を調べた （図 3 2)。 PVX接種した対照植物に比べ、 WI PKまたは SI PKをサイレンシングした植物体にお いて僅かな GUS 活性の低下が認められるにとどまった。 一方、 SIPK および WIPK 双方をサイレンシングした植物体においては、 顕著な GUS活性の低下が認められ た。 これらの結果は、 内在性のセスキテルペンシクラーゼである TEASも SIPKお よび ΙίΠΡΚにより制御されている可能性を示唆している。 そこで、 SIPKおよび WI PKをサイレンシングしたべンサミアナに、 StMEK1DB遺伝子をべンサミアナに発現 させたところ、 SIPKと WIPK双方をサイレンシングした区においてのみ顕著に TE AS mRNAの蓄積が抑制されていた （図 3 2)。
Samuel と El I is ( 2002) は、 タバコ植物を高濃度のオゾンにさらすと SIPKおよ び WI PKが活性化され、活性酸素生成を伴った細胞死が誘導されることを報告して いる （文献 6 9 )。 彼らは、 RNAi (RNA干渉） により S I PK をサイレンシングした 形質転換植物をオゾンにさらすと、 W I PK活性が顕著に増高して細胞死が誘導され ることを見いだした。 この報告を考慮すると、 SI PKおよび WIPKが互いを相補す る形で下流の PVS3遺伝子の発現を制御するものと思われる。 この発明は、 上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるもので はない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。 産業上の利用の可能性
本発明によって提供される病原菌応答性プロモータは、 植物細胞内において病 原菌の感染時特異的に所望の遺伝子を発現させることに利用できる。 従って、 例 えば防御応答に関与する遺伝子を用いることにより、 病原菌の感染時において迅 速な防御応答が行われる病原菌耐性植物の作出が可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の（a) ~ (c)のいずれかの DNAを含む病原菌応答性プロモータ、
(a) ： 配列番号 1で示される塩基配列からなる DNA、
(b)：配列番号 1で示される塩基配列において 1 若しくは複数の塩基が置換、欠 失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロモ 一夕として機能する DNA、
(c)： (a)又は（b)の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 植物 細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する DNA。
2 . 以下の（A) ~ (C)のいずれかの DNAを含む病原菌応答性プロモータ、
(A) ： 配列番号 2で示される塩基配列からなる DNA、
(B)：配列番号 2で示される塩基配列において 1若しくは複数の塩基が置換、 欠 失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロモ 一夕として機能する DNA、
(C)： (A)又は（B)の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、植物 細胞内で病原菌応答性プロモー夕として機能する DNA。
3 . 以下の（1 ) ~ (3)のいずれかの DNAを含む病原菌応答性プロモータ、
(1 )：配列番号 1 で示される塩基配列内の連続した一部分からなり、植物細胞内 で病原菌応答性プロモータとして機能する DNA、
(2) : (1 )の DNAにおいて 1 若しくは複数の塩基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加 された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する ■、
(3)： ( 1 )又は（2)の DMAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、 植物 細胞内で病原菌応答性プロモー夕として機能する DNA。
4. 以下の（i)〜（i i i)のいずれかの DMAを含む病原菌応答性プロモータ、
(i) ： 配列番号 2 2で示される塩基配列からなる DNA、
(i i) :配列番号 2 2で示される塩基配列において 1 若しくは複数の塩基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなり、 植物細胞内で病原菌応答性プロ モータとして機能する DNA、
(i i i) ： (i)又は（i i)の DNAとス卜リンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 植物細胞内で病原菌応答性プロモータとして機能する DNA。
5. 以下の（l)~(l I I) のいずれかの DNAを含み、 植物細胞内で病原菌応答性プロ モータとして機能する病原菌応答性プロモータ、
(I) ： 配列番号 2 3で示される塩基配列からなる DNA、
(I I):配列番号 2 3で示される塩基配列において 1若しくは複数の塩基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加された塩基配列からなる DNA、
(I I I) ： (I)又は（I I)の DNAとス卜リンジェン卜な条件下でハイプリダイズする
6. 疫病菌の感染に対して特異的に応答する、 ことを特徴とする請求の範囲第 5 項に記載の病原菌応答性プロモータ。
7. 配列番号 2 3で示される塩基配列からなる DNA。
8. 配列番号 2 3で示される塩基配列の中の連続する 1 0個以上の塩基配列から なり、 病原菌応答性プロモータ活性を有する DNA。
9. 請求の範囲第 5項に記載の病原菌応答性プロモータを含むベクター。
1 0. 請求の範囲第 8項に記載の DNAを含むベクタ一。
1 1 . 請求の範囲第 5項に記載のプロモータと、 及び該プロモータの制御下に連 結される遺伝子であって、 植物内で発現して該植物の防御応答を活性化する遺伝 子と、 を含む DNAコンストラク ト。
1 2 . 請求の範囲第 8項に記載の DNAと、 該 DNAと協同して病原菌応答性プロモ 一夕を構成する DMAと、 構築された病原菌応答性プロモータの制御下に連結され る遺伝子であって、 植物内で発現して該植物の防御応答を活性化する遺伝子と、 を含む DNAコンストラク 卜。
1 3. 前記遺伝子はその発現産物が植物の防御応答を制御する情報伝達経路を活 性化する機能を有する、 請求の範囲第 1 1 項に記載の DNAコンストラク ト。
1 4. 前記遺伝子はその発現産物が SIPK又は WIPKを活性化する機能を有する、 請求の範囲第 1 1 項に記載の DMAコンストラク ト。
1 5. 前記遺伝子は、 恒常的活性型 MEKをコードする遺伝子である、 請求の範囲 第 1 1 項に記載の DNAコンストラク ト。
1 6 . 請求の範囲第 1 1項に記載の DNAコンストラク トで宿主植物を形質転換し て得られた形質転換体。
1 7 . 前記宿主植物がナス科に属する植物である、 請求の範囲第 1 6項に記載の 形質転換体。
1 8 . 前記宿主植物がジャガイモ属に属する植物である、 請求の範囲第 1 6項に 記載の形質転換体。
1 9 . 以下のステップを含む、 形質転換植物の作出方法、
請求の範囲第 1 1項に記載の DNAコンス卜ラク 卜で宿主植物を形質転換するス テツプ。
2 0 . 以下のステップを含む、 宿主植物に病原菌耐性を付与する方法、
請求の範囲第 1 1項に記載の DNAコンス卜ラク 卜で宿主植物を形質転換するス テツプ。
2 1 . 請求の範囲第 5項に記載の病原菌応答性プロモー夕が外来的に導入されて いる植物。
2 2 . 請求の範囲第 8項に記載の DNAが外来的に導入されている植物。
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