WO2004035085A1

WO2004035085A1 - 遺伝子ワクチン

Info

Publication number: WO2004035085A1
Application number: PCT/JP2003/013279
Authority: WO
Inventors: Kunihiro Himeno; Masutaka Furue; Yoshihiko Maehara
Original assignee: Kyushu Tlo Company, Limited
Priority date: 2002-10-17
Filing date: 2003-10-16
Publication date: 2004-04-29
Also published as: JP2006096663A; AU2003273035A1

Abstract

　プロテアソームへ導くＴａｇ（誘導）分子であるユビキチンをコードする遺伝子を癌抗原遺伝子と結合させ、遺伝子銃で細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより、細胞質内で癌抗原とユビキチンの融合タンパク質を産生させることができ、この操作により癌抗原に特異的なＣＤ８+キラーＴ細胞を主体とした強力な抗癌腫瘍免疫を誘導させることが可能な癌遺伝子ワクチンを提供する。本発明により、ユビキチンをコードする遺伝子と癌抗原遺伝子を結合した遺伝子を含有することを特徴とする癌遺伝子ワクチンが提供される。

Description

明細書遺伝子ワクチン技術分野

本発明は、遺伝子ワクチンに関する。より詳細には、本発明は、ュビキチンプロテアソーム系を応用した遺伝子ワクチンに関する。

背景技術 .

高等動物においては、抗原と称される物質が生体内に入り込んできた場合に抗体と呼ばれる物質を生成する能力が備わっていることが知られている。この目的は、自己に害を及ぼす恐れのある物質、生物などの抗原から生体を保護することにある。抗体は、侵入した抗原を特異的に認識、その抗原を分解、中和、不活性化することによって生体を保護する。

近年、免疫学の著しい進歩により、侵入してきたあらゆる種類の抗原に対していかに巧妙に特異抗体が生成され、種々の免疫担当細胞が動員され、目的を達するのかといういわゆる免疫応答機構が明らかにされてきた。

免疫応答機構の一つで、一度侵入した抗原を記憶し、再度同じ抗原が侵入した場合に極めて迅速、有効に免疫応答を誘起するという性質を利用したものが、ワクチンである。ワクチンの技術は、不活性化した感染性生物または感染性生物の構成物質の少なくとも一部を予めヒトに接種し擬似感染を成立させることによって、感染時に生体内に記憶された免疫応答を有効に引き出し感染^に対する耐性を発揮させる。

難治性感染症に対応するのに最も適切な戦略はワクチンであることは紛れもない事実であり、現実的に臨床サイドからも早急な開発が期待されている。しかしながら、世界的に蔓延し大きな社会問題となっているマラリア、結核、トキソプラズマ等の免疫回避エスケープ機構が複雑な細胞内寄生病原体に対するワクチンに関しては、これまで幾度となく開発が試みられてきたもののことごとく失敗に帰してきた（D e v B i o l (B a s e l ). 2000； 1 04 ： 1 2 1— 3 2.、 I n t J P a r a s i t o l . 2003 Ma y； 33 (5 一 6) ： 54 7— 54等を参照）。これは、これらの病原体の感染おょぴ寄生適応機構の解明が十分進まず、さらにそれらの病原体排除に要求される宿主防御機構も特定されていないことに起因する。エスケープ機構が複雑な病原体に対し十二分な予防効果を発揮するワクチン法を確立するためには、これまでのヮクチン戦略を抜本的に見直し、感染免疫の分子論的基盤に立脚した総合的な研究を展開していく必要がある。

従来のワクチンで有効な効果が認められなかった原因としては、ワクチンが必ずしも防御に必須な免疫応答の誘導に至らなかったこと、さらに Th 1ZT h 2をはじめとする免疫応答が防御免疫としての適切な方向へと結びついていないことが挙げ.られる。

さらに、免疫応答機構は、生体內に生ずる各種新生物生成疾患、即ち癌の発症に於いても重要な役割を担っているのではないかと考えられるようになってきた。即ちある種の免疫担当細胞は常に生体の全ての細胞と物体とを監視し非自己と判断された細胞を排除する機能を担っており、形質転換を起こした細胞即ち腫瘍細胞の発生もこれら監視機構によって常時チェックされており、発生した腫瘍細胞の多くは悪性な癌となる以前に排除されているのではないかという考えがあり、この機構は癌細胞を傷害するキラー T細胞をはじめ単核食細胞マクロファージ、好中球、 NK細胞などが司る主に細胞性免疫と呼ばれる仕糸且みによって成り立つていることが明らかとなってきた。

これらの知見からさらに一歩進めて癌免疫を積極的に治療に応用しようという癌免疫療法という考えが提唱されるに至った。その中身としては、上に述べた感染症に対するワクチンと原理的に共通な能動免疫療法、即ち不活化させた癌細胞やその成分を接種することによつて抗癌効果を引き出そうというものや、免疫賦活療法、即ち免疫応答機構そのものを非特異的に活性化させて抗癌免疫効果を高めるものがある。

一方、ほとんどの癌の免疫学的排除に対して C D 8 +T細胞（キラー T細胞）が必須の関わりを持つことが知られている。また、キラー細胞の認識の対象となる癌抗原のェピトープも多数同定されている。

しかしながら、それらのェピトープペプチドを用いた癌免疫治療の成功例は皆無に近い。これは癌患者の生体内ではそれらのェピトープ対応する C D 4 ⁺ T細胞は誘導できるが、 C D 8 +キラー T細胞が誘導されないことにある。

例えば、メラノーマ抗原に対して特異的にキラー細胞を活性化させるためにはその抗原ぺプチドを抗原提示細胞の MH Cクラス I分子に提示させることが必須である。そのためには、メラノーマ抗原を細胞質內酵素であるプロテアソームで処理させることが前提となる。しかし、そのような前提を解決する手段はいまだに提供されていない。

一般的に、病原体（例えば、マラリア、結核、 H I V等のような細胞内寄生病原体、癌などの新生物）に対する防御免疫には C D 8 + T細胞（キラー T細胞）を中心とした細胞性免疫の誘導が有用である。しかし、それらの病原体のぺプチド抗原を用いた従来の免疫方法では体液性免疫は誘導されるが、上記のような細胞性免疫の誘導はきわめて困難である。また、これらの病原体には化学療法が困難で、また薬剤耐性の場合が多く、ワクチンの開発が急務である。抗原特異的 C D 8 + T細胞が誘導されるためには抗原が細胞質内酵素であるプロテァソームでプロセッシングを受けた後に、 MH Cクラス I分子に提示されることが通常必要とされる。近年、田中等により細菌抗原等のペプチド抗原をュビキチン化することによりその抗原が必然的にプロテアソームに誘導され、その酵素でプロセッシングを受けることが証明された。この抗原処理経由はュビキチンプロテアソームシステムと呼称されている（例えば、： Tanaka K, Kasahara M.， I匪 unol. Rev.163 :161- 76,1998 参照）。この報告は、単に天然の現象を報告したものに過ぎず、実際の治療への応用は示されていない。抗原を含む構築物としてどのようなものが好ましいかも分かっていなレ、。また、どのような形態でこれを利用すべきかについても報告されていない。抗原遺伝子の 1つの例として、従来、メラノーマ抗原に関する研究が進んでいる。未変異の自己メラノサイト /メラノーマ抗原をコードする従来のプラスミドは、十分な免疫原性を示し得ないようである。さらに、自己マウスのメラノサイト /メラノーマタンパク質（例えば、マウス TRP— 2 (mTRP- 2)) をコードする c DNAを用いた C 57 B L/6 (B 6) マウスの遺伝子による免疫は、自己抗原に対する末梢 T細胞寛容を破壌することはうまくいかないことが示されている。ヒト TRP— 2のような異種メラノサイト抗原をコードする遺伝子、または TRP— 2に融合された緑色蛍光タンパク質（GFP) をコードするキメラ遺伝子を用いて、この寛容を破壌することが試みられたが、それらの系を臨床応用した場合、特定の副作用または危険性が、特にワクチン接種を繰り返した後に起こることが予測され得る。例えば、異種の遺伝子産物またはペプチドに対する抗体の中和化は、ワクチン接種の効果を妨害する。さらに、同種細胞親和抗体により引き起こされるアナフィラキシーショック、または異種の遺伝子産物/ベプチドに特異的な CD 4 +T細胞により媒介される全身性炎症が生じ得る。したがって、これらを克服するために別のストラテジーの提示が求められている。自己反応性の T細胞は、胸腺内で完全には排除されないが、このような T細胞は末梢リンパ,袓織において自己抗原に寛容になっていく。自己寛容は特定の条件において破壊される。 1つの場合は、自己抗原が、専門的な抗原提示細胞 (A P C) または樹状細胞（D C) によって、これらの寛容性 T細胞に効果的に提示されることである。さらに、いくつかのサイト力イン（例えば、インタ一ロイキン 1 2 ( I L - 1 2 ) ) は、自己腫瘍抗原に特異的な C D 8 +T細胞の末梢寛容を、おそらく D Cの活性化により破壌する。しかし、 I L一 1 2は、現在、副作用のため臨床試験に適していないという問題点もある。発明の開示

本発明者らは、ュビキチン系と T細胞ターゲット配列を含む抗原遺伝子とを糸且み合わせることによって、その抗原遺伝子に関連する疾患が予想外に顕著に治癒およびノまたは予防されることを発見したことによって、本発明を完成した。

従って、本発明は、プロテアソームへ導く T a g (誘導）分子であるュビキチンをコードする遺伝子を抗原遺伝子（例えば、癌抗原遺伝子）と結合させ、遺伝子銃などで細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより、細胞質内で癌抗原とュビキチンの融合タンパク質を産生させることができたという効果を達成する。本発明はまた、この操作により、癌抗原のような病原体抗原に特異的な C D 8 +キラー T細胞を主体とした強力な免疫を誘導させることが可能な遺伝子ワクチンを提供する。

1つの具体的な例として、本発明が提供する遣伝子ワクチンによる免疫治療は、メラノーマワクチンを提供する。免疫系の細胞成分により認識される多くの抗原は、メラノーマ患者において分子レベルで同定されていることから、このことは非常に有用であり、本発明をテーラーメイド治療にも応用することができる。これらのメラノーマ抗原、メラニン合成に関与するチロシナーゼ関連タンパク質 2 (T R P - 2 ) のような正常な細胞タンパク質を含み、これらは、メラノサイトおよびメラノーマ細胞において持続的に発現している。 DN Aワクチンとも称される遺伝子ワクチンは、病原体標的遺伝子とュビキチン遺伝子等の免疫応答制御遺伝子との融合遺伝子を用いた融合 D N Aヮクチン、それらの DNAワクチンにインターロイキン 1 2 (以下、 Γ I L - 1 2J と略記する）、インターロイキン 1 5 (以下、「I L一 1 5」と略記する）、インタ一ロイキン 1 8 (以下、「I L— 1 8」と略記する）等のサイト力イン遺伝子治療を併用したコンビネーション D N Aワクチン法を導入することにより、任意の免疫応答を誘導できることが最大の利点であり従来のヮクチンの問題点を克服できる有用な手法である。 .. .

別の局面において、本発明者らは、病原体の侵入（例えば、癌などの新生物の発生おょぴ Zまたは転移、ウィルス、細菌、細胞内寄生原虫等の感染など）において、初期および後期感染防御に関わる免疫細胞集団が異なることを見出し、従来のワクチン法ではなし得なかった任意の免疫応答の特異的防御および誘導を融合 DNAワクチンおよび I L一 1 2、 I L一 1 5等のサイトカイン遺伝子とのコンビネーション DNAワクチンを用いることにより、病原体のエスケープ機構の相違に対応した予防 ·治療法の確立を目的とし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の項目 1. 〜36. に記載した事項を提供する。

1. ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、遺伝子ワクチン。

2. 上記 T細胞ターゲット配列をコードする核酸配列は、上記核酸配列がコードするアミノ酸配列を有するぺプチドが C T Lの反応性を有することで特徴付けられる、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

3. 上記 T細胞ターゲット配列をコードする核酸配列は、少なくとも 8個のアミノ酸からなるペプチドをコードする、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

4. 前記 T細胞ターゲット配列は、少なくとも 8個のアミノ酸を含み、 1番目、 2番目または 3番目のアミノ酸配列は、 Va l、 Le u、 I l e、 Ty r または Ph eから選ばれた 1種であり、 8番目、 9番目または 10番目は、 V a 1、 L e u、 P h eまたは I 1 eから選ばれた 1種であることを特徴とする、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

5. 2番目のアミン酸配列が V a し L e u、 I 1 e、 T y rまたは P h e から選ばれた 1種であり、 9番目のアミノ酸配列が V a 1、 L e u、 Ph eまたは I 1 eから選ばれた 1種である項目 4に記載の遺伝子ワクチン。

6. 前記 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質は、病原体タンパク質および癌抗原タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を含む、項目 1 に記載の遺伝子ワクチン。

7. 前記抗原タンパク質は、自己腫瘍抗原である、項目 1に記載の遺伝子ヮクチン。

8. 前記抗原タンパク質は、メラノソームタンパク質、腫瘍特異的変異ぺプチド、癌関連抗原、癌特異移植抗原おょぴ癌ウィルス由来抗原からなる群より選択される抗原タンパク質である、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

9. 前記抗原タンパク質は、 TRP 2、 MUT1、および MUT2からなる群より選択されるペプチドを含む、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

10. 前記ュビキチンをコードする核酸配列は、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18または 20に示すアミノ酸配列もしくはその改変体をコードする核酸配列を含む、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

11. 前記ュビキチンは、プロテアーゼによる切断を抵抗性になるように改変されている、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

12. 前記ュビキチンは、 C末端の G 1 yが G 1 y以外のアミノ酸に置換されている、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

13. 前記ュビキチンは、 C末端の G l yが Al aに置換されている、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。 1 4. 前記ュビキチンは、配列番号 2 2に示される配列を有する、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

1 5. 前記ュビキチンをコードする核酸配列と、前記抗原タンパク質をコードする核酸配列とは、介在配列なしに連結される、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

1 6. 前記ュビキチンをコードする核酸配列と、前記抗原タンパク質をコードする核酸配列とは、介在配列なしに連結され、かつ、ュビキチンの C末端の G 1 yが G 1 y以外のアミノ酸に置換される、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

1 7. 前記ュビキチンをコードする配列は、前記ュビキチンの N末端に、前記抗原タンパク質が融合されるように配置される、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

1 8. 前記ュビキチンをコードする配列は、前記ュビキチンの N末端に、前記抗原タンパク質が融合されるように配置され、かつ、ュビキチンの C末端の G 1 yが G l y以外のアミノ酸に置換される、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

1 9. 前記ュビキチンをコードする核酸配列は、前記ュビキチンが除去されない様式で融合されるように配置される、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

20. 前記遺伝子ワクチンは、 n a k e d DNAである、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

2 1. 前記遺伝子ワクチンは、癌を処置または予防するためのものである、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

22. 前記遺伝子ワクチンは、メラノーマ、肺癌、胃癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、勝臓癌、大腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、子宮頸部癌、皮膚癌、乳癌、食道癌、腎腫、脳腫瘍からなる群より選択される腫瘍を処置するためのものである、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。 2 3 . 前記遺伝子ワクチンは、 C D 8 + T細胞を誘導する、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

2 4 . 前記遺伝子ワクチンは、針なし注射または遺伝子銃（g e n e g n ) によって投与される、項目 1に記載の遺伝子ワクチン。

2 5 . ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、核酸構築物。

2 6 . ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、遺伝子ワクチンを製造するための方法であって、該ュビキチンをコードする核酸配列と、該 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを作動可能に連結する工程を包含する、方法。

2 7 . T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質に起因する疾患を予防または処置するための方法であって、

A) ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、遺伝子ワクチンを患者に投与する工程、

を包含する、方法。

2 8 . 前記遺伝子ワクチンは、針なし注射または遺伝子銃によって投与される、項目 2 7に記載の方法。

2 9 . 前記疾患は、メラノーマ、肺癌、胃癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、勝臓癌、大腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、子宮頸部癌、皮膚癌、乳癌、食道癌、腎腫、脳腫瘍からなる群より選択される、項目 2 7に記載の方法。

3 0 . ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の、遺伝子ワクチンとしての使用。

3 1 . 遺伝子ワクチンを製造するための、ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の使用。

3 2 . T細胞ターゲット配列をコードする配列を含む抗原遺伝子と、サイト力インをコードする配列とを含む、遺伝子ワクチン。

3 3 . 前記 T細胞ターゲット配列は、癌抗原遺伝子を含む、項目 3 2に記載の遺伝子ワクチン。

3 4 . 前記サイト力インは、 I L一 1 2、 I L一 1 5および I L— 1 8から選択される少なくとも 1種のサイト力インを含有する、項目 3 2に記載の遺伝子ワクチン。

3 5 . T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質に起因する疾患を予防または処置するための方法であって、

A) T細胞ターゲット配列をコードする配列を含む抗原遺伝子と、サイト力インをコードする配列とを含む、遺伝子ワクチンを患者に投与する工程、を包含する、方法。

3 6 . サイト力インをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の、遺伝子ワクチンとしての使用。

3 7 . 遺伝子ワクチンを製造するための、サイト力インをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の使用。本発明によれば、プロテアソームへ導く T a g分子であるュビキチンをコードする遺伝子と、癌抗原遺伝子と結合させ、遺伝子銃などで細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより、細胞質内でその抗原とュビキチンの融合タンパク質を産生させることができ、この操作により抗原に特異的な C D 8 ⁺キラー T細胞を主体とした癌に対する強力な免疫を誘導させることが可能な遺伝子ワクチンを得ることができる。

本発明はまた、効率よくプロテアソームに抗原遺伝子を運搬することができる系を提供することに留意すべきである。このような効果は、好ましくは、ュビキチンの N末端の G l yをそれ以外の残基に置換することによって生じるような、ュビキチン構築物のプロテアーゼによる分解を抑制することによって達成される。

本発明に係る遺伝子ヮクチンの導入は無害であることに留意すベきである。しかも、本発明の遺伝子ワクチンが罹患（例えば、発癌）部位および正常組織部位のどちらにも効果的である。しかも抗癌処置の場合、本発明における遺伝子ヮクチン治療法が転移癌に対しても効果的であり、安全性に優れるという効果が奏される。

本発明により発現されるタンパク質は大腸菌で合成される組換えタンパク質と異なり、遺伝子ワクチンの形態をとることから、発現タンパク質への糖鎖の付加が起こり、本来のタンパク質構造が保たれ、目的とするタンパク質が少量かつ持続的に一定期間供給されるため安全性が高く、連日投与の必要がなく、かつ効果的である。

別の局面において、本発明が提供する I L一 1 2等のサイトカイン遺伝子との共導入（コンビネーション D NAワクチン）、あるいはワクチンベクターをェ夫することで（融合 D N Aワクチン） MH Cクラス IIあるいは MH Cクラス I 依存型免疫応答の選択的誘導が容易である。

本発明におけるワクチンは、糸且換えタンパク質ワクチン、病原体タンパク質自体を用いたワクチンと異なり、頻回投与によってもアナフィラキシーショックを引き起こす可能性は少なく、安全性に優れる。また、組換えタンパク質ヮクチン/サイトカインに比べ精製 ·調製が簡便かつ経済的である。本遺伝子ワクチンに用いる遺伝子は、好ましくは n a k e d DNAであり、ウィルスベクターを用いる必要がないため、遺伝子銃などを用いた遺伝子治療、遺伝子ワクチンでは、生体への反復投与が容易かつ安全に行うことができる。しかも、遺伝子の構築が容易で、しかもウィルスベクターの強毒化による感染の危険性が極めて少ない。また、 g e n om i c DNA内にインテグレーションされる可能性が非常に低い。従って、本発明のこれらおょぴ他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。図面の簡単な説明

図 1は、 DNAワクチンによる癌免疫治療効果を示すグラフである。

図 2は、 DNAワクチンによるキラー T細胞の活†生ィ匕を示すグラフである。図 3は、プラスミド構築物おょぴインビポでの TRP— 2の発現を示す。 A は、 p cDNA— TRP— 2および p c DNAUB— TRP— 2の模式図である。 Bの左側は、 p c DNA (モッタ）、 p TRP— 2または pUB— TRP— 2でトランスフエクトした COS 7細胞を、抗 HA抗体おょぴ抗 HS P抗体を用いて免疫プロットした結果の写真である。右側は、各細胞において発現した H Aのバンド強度を比較したグラフである。

図 4は、 pUB— TRP— 2ワクチン接種による抗原特異的抗腫瘍免疫の誘導を示すグラフである。 p c DNA (〇）、 pUB-TRP-2 (秦）または！) TRP- 2 (□) を用いて免疫化した C 5 7 B LZ6マウスを使用した。 A， Bは B 1 6 F 1メラノーマ細胞、 C〜Eは B 1 6 F 1 0メラノーマ細胞、そして Fは無関係な 3 L L肺癌腫細胞でチヤレンジした結果を示す。抗腫瘍効果を、腫瘍サイズ（A， C, F)、生存率（B， D) および肺転移の頻度（E) によつて評価した。データは、各群 6匹のマウスの平均土 SDを示す。 #は、対応のないスチューデント t検定によって他の 2群と比較した場合、 P< 0. 0 1の有意性を示す。

図 5は、 p UB— TRP— 2ワクチン接種により誘導される抗腫瘍免疫に対する CD 8 +T細胞の必要性を示すグラフである。 pUB— TRP— 2でヮクチン接種した C 57 B LZ6マウスを、コントローノレ I g G (秦）、抗 CD 4抗体 (口）、そして抗 CD 8抗体（画）を用いて処理した結果である。データは、各群 6匹のマウスの平均土 SDを示す。 *は、対応のないスチューデント t検定によって他の 2群と比較した場合、 P< 0. 0 5の有意性を示す。

図 6は、 PA 2 8 a j3— ^κ—マウスにおける p UB— TR Ρ— 2ワクチン接種の抗腫瘍免疫を示すグラフである。〇は p c DNA +野生型マウス、 ·は pUB 一 TRP— 2+野生型マウス、そして口は pUB—TRP— 2 + PA 28 α β一 /一マウスを示す。 Αは、 B 1 6 F 1 0細胞を用いたチャレンジ後の腫瘍増殖の経過を示すグラフである。 Bは、ワクチン接種によるキラー T細胞の活性化を示すグラフである。データは、平均土 S Dを示す。 *は、対応のないスチューデント t検定によって他の 2群と比較した場合、 P< 0. 0 5の有意性を示す。図 7は、 p UB— TRP— 2ワクチン接種の治療効果を示すグラフである。 B 1 6 F 1細胞を移植した野生型マウスを、 p c DNA ( ）、 p TRP— 2 (口）または p UB— TRP— 2 (園）を用いて処理した。腫瘍増殖を、図 4の記載と同様にモニターした。データは、平均土 SDを示す。 *は、対応のないスチユーデント t検定によって他の 2群と比較した場合、 Pく 0. 0 5の有意性を示す。

図 8は、 UM1 +UM2 I mmのプラスミド構築物を示す模式図である。 CMVはサイトメガロウィルスのリーダー配列であり、 UBはュビキチン配列であり、 MUT 1および MUT 2は腫瘍関連抗原である。

図 9は、 3 L L腫瘍細胞でチャレンジしたマウスの f o o t p a d膨張を示す。 UB配列のみ（酾）および UM1 +UM2 I mm (▲) を用いて免疫したマウスを、 3 L L細胞でチャンレンジした場合の結果である。

図 1 0は、 3 L L腫瘍細胞でチャレンジしたマウスの f o o t p a d膨張を示す。コントロールマウス（令）、 UM 1 + UM 2 I mmで免疫した P A 2 8 一 z一マウス（画）、 UM 1 + UM 2 I mmで免疫した正常マウス（▲) を、 3 L L細胞でチャレンジした場合の結果である。

配列表の説明配列番号 1は、ヒトのュビキチンの代表的な核酸配列である。

配列番号 2は、ヒトのュビキチンのアミノ酸配列である。ゥシ、ニヮトリ、マウス、ゥサギ、ショウジヨウバエもまた、この配列と同じアミノ酸配列を有する。

配列番号 3は、 Caenorhabditis elegans (線虫）のュビキチンの核酸配列である。配列番号 4は、 Caenorhabditis elegans (線虫）のュビキチンのァミノ酸配列である。

配列番号 5は、植物（大豆）由来であるュビキチンの核酸配列の例である。配列番号 6は、植物（大豆）由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。 garden pea、 common sunflower^ potato^ トゥモロコシ、オーツ ¾：、 Arabidopsis thai l ana もまた、この配列と同じアミノ酸配列を有する。

配列番号 7は、 TiTpanosoma brucei由来であるュビキチンの核酸配列の例である。

配列番号 8は、 Tryp細讓 a brucei由来であるュビキチンのァミノ酸配列である。

配列番号 9は、 Leishmania tarentolae由来であるュビキチンの核酸配列の例である。配列番号 1 0は、 Leishmania taren tolae由来であるュビキチンのァミノ酸配列の例である。

配列番号 1 1は、

crsssa由来であるュビキチンの核酸配列の例である。

配列番号 1 2は、 ei/rc s^ora crss^由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 1 3は、 Saccharomyces cerevisiae (酵母）由来であるュビキチンの核酸配列の例である。 '

酉己歹 !J番号 1 4は、 Ssccharomyces cerevisiae (酵母）由来であるュビキチンのァミノ酸配列である。

酉 3列番号 1 5は、 Phytophthora fn es aas由来であるュビキチンの核酸酉己列の例である。

配列番号 1 6は、 Phytophthora _z' 2i¾sia 2s由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 1 7は、 / ^oz^s eizrj^io /s由来であるュビキチンの核酸配列の例である。

配列番号 1 8は、 Euplotes eurystomus由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

歹 [J番号 1 9は、 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus由来であるュビキチンの核酸配列の例である。

酉 3歹 (J番号 2 0 ίま、 Autographa californica nuclear polyhedrosis virusのュビキチンのァミノ酸配列である。

配列番号 2 1は、 G 7 6 A改変型ュビキチンの核酸配列を示す。

配列番号 2 2は、 G 7 6 A改変型ュビキチンのァミノ酸配列を示す。

配列番号 2 3は、実施例 6において使用したセンスプライマーを示す。

配列番号 2 4は、実施例 6において使用したアンチセンスプライマーを示す。配列番号 2 5は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 2 6は、ヒト由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 2 7は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 2 8は、ヒト由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 2 9は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 3 0は、ヒト由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 3 1は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 3 2は、ヒト由来であるュビキチンのァミノ酸酉己列である。

配列番号 3 3は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 3 4は、ヒト由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 3 5は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 3 6は、ヒト由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 3 7は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 3 8は、ヒト由来であるュビキチンのアミノ酸酉己列である。

配列番号 3 9は、ヒト由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である。

配列番号 4 0は、ヒト由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 4 1は、ゥシ由来であるュビキチンの核酸配列である。

配列番号 4 2は、ゥシ由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 4 3は、二ヮトリ由来であるュビキチンの核酸配列である。

配列番号 4 4は、二ヮトリ由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 4 5は、マウス由来であるュビキチンの核酸配列である。

配列番号 4 6は、マウス由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 4 7は、ショウジョゥパェ由来であるュビキチンの核酸配列である。配列番号 4 8は、ショウジョゥバエ由来であるュビキチンのアミノ酸配列である。

配列番号 4 9は、植物由来であるュビキチンの核酸配列の別の例（garden pea) である。

配列番号 5 0は、植物由来であるュビキチンのアミノ酸配列（garden pea) である。

配列番号 5 1は、植物由来であるュビキチンの核酸配列の別の例（co腕 on sum lower) である。

配列番号 5 2は、植物由来であるュビキチンのァミノ酸配列（common sunflower) である。

配列番号 5 3は、植物由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である (potatoノ ₀

配列番号 5 4は、植物由来であるュビキチンのアミノ酸配列である（potato)。配列番号 5 5は、植物由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である（maize；)。配列番号 5 6は、植物由来であるュビキチンのアミノ酸配列である（maize；)。配列番号 5 7は、植物由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である（oat)。配列番号 5 8は、植物由来であるュビキチンのアミノ酸配列である（oat) 配列番号 5 9は、植物由来であるュビキチンの核酸配列の別の例である (Arabidopsis tha丄 ianaノ。

配列番号 6 0は、植物由来であるュビキチンのァミノ酸配列である

(Arabidopsis tha丄 iana 。

配列番号 6 1〜配列番号 2 0 5は、 T細胞ターゲット配列である。

配列番号 2 0 6は、 MU T _ 1の N末端にュビキチンを連結させた融合タンパク質をコードするキメラ D N Aの核酸配列である。

配列番号 2 0 7は、 MU T— 1の N末端にュビキチンを連結させた融合タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号 2 0 8は、 MU T— 2の N末端にュビキチンを連結させた融合タンパク質をコードするキメラ D N Aの核酸配列である。

配列番号 2 0 9は、 MU T— 2の N末端にュビキチンを連結させた融合タンパク質のアミノ酸配列である上記配列は、例示であって、その配列は、同じ機能を有する限り、 1以上の改変（例えば、置換、欠失および/または付加）を有し得ることが理解される。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明を、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「a n」、「 t h e」など、独語の場合の「e i n」、「d e r」、「d a s」、「d i e」などおょぴその格変化形、仏語の場合の「u n」、「u n e」、「1 e」、「 1 a」など、スペイン語における「u n」、「u n a」、「e 1」、「1 a」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。 (—般技術）

本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Sambrook J. et al. (1989) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor およびその 3rd Ed. (2001) ; Ausubel, F. M. (1987) . Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley— Interscience ; Ausubel, F. M. (1989) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience ; Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press ; Ausubel, F. M. (1992) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates ; Ausubel, F. M. (1995) . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates ; Innis, M. A. et al. (1995) . PCR Strategies, Academic Press ; Ausubel, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates ; Sninsky, J. J. et al. (1999) . PCR Applications : Protocols for Functional Genomics, Academic Press, 別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1 9 9 7などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

人工的に合成した遺伝子を作製するための D N A合成技術および核酸化学については、例えば、 Gait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, IRL Press ; Adams, R. L. et al. (1992) . The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall ; Shabarova, Z. et al. (1994)， Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press ; Hermanson, G. T. (1996) . Biocon jugate Techniques, Academic Press などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。以下に本発明において使用される定義、基本的技術などを説明する。

(ュビキチン）

本明細書において「ュビキチン」とは、当該分野において通常用いられる最広義の意味を有し、すべての真核細胞に共通して広く存在するタンパク質であり、細胞内で正しい構造を形成していないタンパク質、異常に発現したタンパク質などを標的として結合し、ュビキチン化することが知られる。ュビキチン化されると、細胞の正常な機能を阻害するタンパク質を分解するプロテアソームによって認識される。本発明におけるュビキチンは、タンパク質の分 ^提示シグナルの機能等を有することが特に重要である。ュビキチンをコードる遣伝子をュビキチン遺伝子という。本明細書においては、ュビキチンをコードする遺伝子のプロモーター、ュビキチンをコードする構造遺伝子、およびこれら両者を含む D NA配列を、併せて「ュビキチン遺伝子」ということがある。ュビキチンは、アミノ酸約 76個を有するタンパク質であり、その 1次構造はほとんどの生物で保存されている。遺伝子には、少なくとも 2種類存在し、そのいずれもが本発明において用いられ得る。そのうち 1つは数個から 100個程度のュビキチンが連結したポリュビキチンであり、熱誘導プロモーターを有し、熱ショックなどのストレスによって発現誘導される。他方の遺伝子は、特定のリボソームタンパク質の C末端に連結されて発現され。通常は、このリポソ一ム連結型が発現される。いずれの場合も，発現後にプロセシングを受けモノュビキチンとなることが知られている。ュビキチンの C末端のグリシンが活性化され、標的タンパク質のリジンの ε—ァミノ基と結合することが知られている。ュビキチンの代表的な配列としては、例えば、

( a ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 1 7、 19、 21、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 47、 49、 51、 53、 55、 57および 59からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；

( b ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 2 2、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 50、 52、 54、 56、 58および 60からなる群より選択される配列番号に示されるァミノ配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；

( c ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 2 2、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、

48、 50、 52、 54、 56、 58および 60からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

( d ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 47、

49、 51、 53、 55、 57および 59からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列からなる D N Aの対立遺伝子変異体またはスプライス変異体である、ポリヌクレオチド；

( e ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 2 2、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、

48、 50、 52、 54、 56、 58および 60からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列からなるポリべプチドの種相同体またはオルソログをコードする、ポリヌクレオチド；

(f ) (a) 〜 (e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド；または

(g) (a) 〜（e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有するポリべプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む。ュビキチンをコードする核酸は、「サイレント改変」し得る。そのようなサイレント変換の例としては、例えば、ヒトにおいて、以下のようなものが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、そのような配列もまた使用することができることが理解される。

配列番号 1の核酸配列における、第 4位〜第 6位のコドンは、例えば、 CA Gから CAAにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 n (グノレタミン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 9位〜第 21位のコドンは、 ACTから ACC、 AC Aにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 Th r (スレオニン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 22位〜第 24位のコドンは、 CTGから CTCにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 L e u (ロイシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 28位〜第 30位のコドンは、 GGTから GGCにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 y (グリシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 37位〜第 39位のコドンは、 ATCから ATTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 I l e (イソロイシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 40位〜第 42位のコドンは、 ACCから ACTにサイント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 Th r (スレォニン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 43位〜第 45位のコドンは、 CTCから CTTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 L e u (ロイシン）をコードする。 .

また、この核酸配列における、第 46位〜第 48位のコドンは、 GAGから GAAにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 u (グルタミン酸）をコードする。

また、この核酸配列における、第 49位〜第 51位のコドンは、 GTGから GTC、 GTTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 V a 1 (パリン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 55位〜第 57位のコドンは、 CCCから CCGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 P r o (プロリン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 64位〜第 66位のコドンは、 ACCから ACAにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 Th r (スレォニン) をコードする。

また、この核酸配列における、第 67位〜第 69位のコドンは、 ATCから ATTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 I 1 e (イソロイシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 73位〜第 75位のコドンは、 AATから AACにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 A s n (ァスパラギン）をコードする。また、この核酸配列における、第 9 1位〜第 9 3位のコドンは、 CAAから C AGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 n (ダルタミン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 94位〜第 9 6位のコドンは、 GATから GACにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 A s p (ァスパラギン酸）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 0 6位〜第 1 08位のコドンは、 ATT から ATCにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 I 1 e (ィソロイシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 1 5位〜第 1 1 7位のコドンは、 GAT から GACにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 A s p (ァスパラギン酸）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 3 6位〜第 1 38位のコドンは、 GCC から GCTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 A 1 a (ァラニン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 3 9位〜第 1 4 1位のコドンは、 GGA から GGGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 y (グリシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 14 2位〜第 1 44位のコドンは、 AAA から AAGfcサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 Ly s (リジン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 5 7位〜第 1 5 9位のコドンは、 GGT から GGG、 GGAにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 y (グリシン) をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 60位〜第 1 6 2位のコドンは、 CGT から CGC、 CGGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 A r g (アルギニン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 8 1位〜第 1 8 3位のコドンは、 ATC から ATTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 I l e (ィソロイシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 9 3位〜第 1 9 5位のコドンは、 TCC から TCTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 S e r (セリン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 9 6位〜第 1 9 8位のコドンは、 ACC から ACTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 Th r (スレオニン) をコードする。

また、この核酸配列における、第 1 9 9位〜第 20 1位のコドンは、 TTG から CTGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 L e u (口イシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 20 5位〜第 20 7位のコドンは、 CTG から TTGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 L e u (口イシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 208位〜第 2 1 0位のコドンは、 GTA から GTG、 GTT、 GTCにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 Va l (バリン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 2 1 1位〜第 2 1 3位のコドンは、 CTC から CTGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 L e u (口イシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 2 1 4位〜第 2 1 6位のコドンは、 CGT から CGCにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 Ar g (ァルギニン) をコードする。

また、この核酸配列における、第 2 1 7位〜第 2 1 9位のコドンは、 CTC から TTG、 CTTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 L e u (ロイシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 220位〜第 222位のコドンは、 AGA から AGGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 A r g (ァルギニン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 223位〜第 225位のコドンは、 GGT から GGGにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 y (グリシン）をコードする。

また、この核酸配列における、第 226位〜第 228位のコドンは、 GGG から GGTにサイレント改変され得、これらのコドンはアミノ酸残基 G 1 y (グリシン）をコードする。

ュビキチン (ubiquitin, Ub) は、以下に示すように種を超えて極めて保存性の高いタンパク質である。

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 フ 5

1

2

3

4

6

7

8

9 各種生物のュビキチンのアミノ酸配列

1 : 動物 [ヒト、ゥシ、ゥサギ、ニヮトリ、マウス、 Drosophila melanogaster シヨウジョゥバエ) ] (配列番号 2 )

2： Caenorhabditis elegans (線虫）（配列番号 4 )

3：物 [soybean, garden pea, common sunflower, potato, maize, oat, Arabidopsis thaliana (酉己列番号 6 )

4： Trypanosoma brucei (酉己歹 [J番号 8 )

5 : Leishmania tarentolae (酉 S歹幡号 1 0 )

6： Neurospora crassa (酉己歹 tl番号 1 2 )

7： Saccharomyces cerevisiae (酵母) (目 C歹 (I番号 1 4 )

8： Phytophthora infestans (配歹 U番号 1 6 )

9 : Euplotes eurystomus (酉 G歹幡^■ 1 8 )

10： Autographs californica nuclear polyhedrosis virus (酉己歹 !j番号 2 0 ) 本明細書において「ュビキチンが除去されない様式」とは、ュビキチンを含む本発明の遺伝子の発現産物がプロテアーゼによってモノュビキチンと抗原とへの切断に抵抗性を有する様式をいう。そのような様式としては、例えば、ュビキチンのアミノ酸配列の C末端の G 1 yを G 1 y以外の配列（例えば、 A 1 a ) に置換することなどが挙げられるがそれらに限定されない。このような様式のュビキチン含有産物は、効率よくポリュビキチン化し、プロテアソームによるプロセシングが効率よく誘導される。このような効果は従来の技術では行われていない。抗原とモノュビキチンとが融合される場合、 C末端の配列が G 1 yのままでは、ュビキチンと抗原とは、ュビキチンがポリュビキチン化してプロテアソームに運搬される前に、切断されやすいことから、 C末端の配列は G 1 yでない配列が好ましい。

本明細書において、あるポリヌクレオチドがュビキチンをコードしているか

2フどうかを判定するには、そのポリヌクレオチドを発現させ得られた発現産物が、ュビキチンの生物学的活性を有するか否かを確認することによつて確かめることができる。そのようなュビキチンの生物学的活性としては、例えば、（A) プ口テアソームへの標的化、（B ) C末端のグリシン化により標的タンパク質のリジンの ε—アミノ基と結合すること、（C ) 熱ショックなどのストレスによる誘導、（D) リボソームタンパク質の C末端に連結されて発現されることなどが挙げられるがそれらに限定されない。特に好ましいのは、プロテアソームによる標的化である。プロテアソームによる標的化に関するアツセィは、当該分野において公知の実験により確認することができ、例えば、実施例に記載されるようなアツセィが挙げられる。

(プロテアソーム）

本明細書において「プロテアソーム」とは、真核生物に普遍的に存在する巨大プロテアーゼの一種であり、細胞内には ΑΤΡ非依存性型の 20Sと ΑΤΡ依存性型の 26S と、フットボール型の少なくとも 3種類のプロテアソームがあるとされている。プロテアソーム系では、標的タンパク質のリジン側鎖の ε—アミノ基において、ュビキチン化酵素によりュビキチン分子が付加され、ュビキチンが認識されプロテアソームに送られ分解を受ける。プロテアソームはプロテアーゼの集合体ともいえるからである。この系で選別されたタンパク質は速やかに代謝される。不要なタンパク質の分解のみならず、免疫系における抗原提示細胞内の抗原タンパク質のプロセシング、細胞周期の制御などにも重要な役割を果しているとされている。 20Sプロテアソームは 7つの αサブュニットから成る αリング、 7つの 3サブユニットから成る 3リングが、 α、 β、 ]3、 αの順に筒状に積み重なった中空の構造をとる。 ΑΤΡ依存的に 20Sプロテアソームの上下に ΡΑ700が結合すると， 26Sプロテアソ^ "ムになる。フットポール型は、 ΡΑ700 の代わりに ΡΑ28を有する。本発明では、抗原は、どのプロテアソームにおいて分解を受けてもよい。

(T細胞ターゲット配列）

本明細書において「τ細胞ターゲット配列」とは、 Τ細胞による特異的認識を惹起することができるアミノ酸配列（例えば、ェピトープ）をいい、通常、少なくとも約 5アミノ酸、好ましくは少なくとも約 8ァミノ酸長を有するぺプチドをいう。このような配列は、 Τ細胞レセプターによって認識されるものであり、近年研究が進展しており、 C D 8陽性細胞傷害性 Τ細胞（ C T L = c y t o t o x i c T- l ymp h o c y t e s) による認識によって同定され得る。 CTLには、 CD 8陽性おょぴ CD 4陽性の少なくとも 2種類が知られており、 CD8陽性 CTLは、クラス I拘束性に、 CD4陽性 CTLはクラス II拘束性に抗原ペプチド（例えば、癌抗原としては MAGE、 g p 100、 T y r o s i n a s e、 NY— ES 0—1が挙げられる）を認識するといわれている。

T細胞ターゲット配列は、癌細胞に取り込まれる場合、小胞体（ER) に運ばれ、そこで HL Aクラス I分子に結合性を示すペプチドはクラス I分子と複合体を形成する。この複合体は、細胞表面に表出するといわれている。クラス I分子との結合において、重要であるとされる部位は、このペプチド中の 2番目のアミノ酸と、 9番目（場合により 8番目または 10番目であり得る）のァミノ酸である。ここで、 2番目のアミノ酸は、 HL Aの型に依存する。例えば、 11しー 24の場合は、 2番目のアミノ酸は、チロシン（Y) またはフエ- ルァラニン（F) であることが多く、 HLA— A2の場合はロイシン（L) である。この特徴的な配列は、 HL Aの型に応じて適宜決定することができる。また、 9番目（または 8番目もしくは 10番目）のアミノ酸は、 HLA— A2 4の場合は、ロイシン（L)、イソロイシン（I) またはフエ二ルァラニン（F) であることが多く、 HLA— A24の場合は、ロイシン（L)またはバリン（V) である。このように T細胞ターゲット配列は、目的とする患者の HLA型に依存して変動し得る。このような Τ細胞ターゲット配列は、いったん複合体を形成すると、 CTLの Τ細胞レセプターにより認識され、 Τ細胞による分解の発端となる。

このような Τ細胞ターゲット配列は、当該分野において公知の方法を用いて同定することができる。そのような方法としては、例えば、 c DNA発現クロ一ユング法、 S EREX法などが挙げられるがそれらに限定されない。癌細胞の T細胞ターゲット配列を同定する場合は、例えば、癌細胞から調製してきた cDNAライブラリー由来のサンプルを COS— 7細胞に HLA cDNAとともに一過的に発現させ、その発現が最大となる 2日目に癌特異的 CTLと混合培養をー晚行い、上清中のインターフェロン γ量を例えば EL I SAなどの測定法によって測定することによって同定することができる。ここで陽性ブールをスクリーニングすることによって Τ細胞ターゲット配列を有するクローンを同定し、それによりそのコード配列をも同定することができる。

SEREX法では、患者の血清中に存在する I gG抗体を利用して c DNA ライブラリーをスクリーニングする。この方法では、標的細胞（例えば、癌細胞）由来のファージライブラリーを大腸菌に発現させ、大腸菌の産生するタンパク質をフィルターに転写し、患者血清とハイブリダィズさせ、抗 I g G抗体で検出して抗体と反応したプラークから目的の遺伝子をクローニングすることができる。

上記のように、メラノーマ、や肺癌等に関する細胞上の T細胞ターゲット配列の同定については、（1) 病原体（腫瘍を含む）を認識する T細胞（腫瘍反応性 T細胞）を用いる方法と、（2) (腫瘍を含む）抗原の候補となる分子に対する T細胞を誘導する方法に大別される。し力し、現在のところ、このように同定されたキラー T細胞認識ェピトープで免疫しても生体内では有効にキラー T 細胞を誘導するには至っていない。その原因として、これらのェピトープで免疫しても、キラー T細胞を誘導するための必須の課程である、細胞内酵素であるプロテアーゼによるそれらのェピトープ抗原の処理が起こらないからである。そこで、本発明においては、既知の Τ細胞ターゲット配列の遺伝子を用いてプ口テアソームへの Ta g (誘導）分子のュビキチン遺伝子と融合化することにより、プロテアソームでの抗原処理（Processing) に導き、必然的に腫瘍抗原特異的キラー T細胞を誘導し活性化する。すなわち、既知のキラー T細胞認識ェピトープを使用し、文献上のキラー T細胞認識ェピトープの検索を行い、そのェピトープにつレ、て遺伝子パンク上で配列を確認する。

本発明においては、キラー T細胞を効率的に誘導するェピトープの検索は、既知の癌抗原遺伝子をプロテアソームへの T a g分子であるュビキチン遺伝子と融合化させることで、腫瘍抗原特異的キラー T細胞を主体とした強力な抗腫瘍免疫を誘導させるものである。なお、 T a g分子であるュビキチン等は抗原提示細胞内に恒常的に存在しており、細胞内で産出された異物抗原や細胞内に注入された癌抗原遺伝子産物と非選択的に結合しプロテアソームへ移送される。本発明における T細胞ターゲット配列の遺伝子の構築については、 T細胞ターゲット配列既知配列をデータベースより検索し、その配列両端についてプライマーを合成し、腫瘍細胞よりフエノール ·クロロフオルム法により RNAを抽出し、その RNAをテンプレートとして、 RT—PCR法を用いて逆転写し、遺伝子を構築する。ここで、 P CR法（ρ o 1 y me r a s e c h a i n r e a c t i o n) とは、 D N A鎖の特定部位のみ繰り返し複製する反応で、微量の DNAを 1， 000， 000倍程度まで増幅できる。複製反応のプライマーとしては、増幅部両端の塩基配列を含む合成オリゴヌクレオチォを用いて、耐熱性 DNAポリメラーゼにより行う。また、 RT— PCR法（r e v e r s e — t r a n s c r i p t p o l yme r a s e c h a i n r e a c t i o n) とは、第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、 RNAから D NAを合成し、その後は通常用いられる PCR法によって、特定の DNA部位を増幅する方法である。そのような T細胞ターゲット配列としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない。以下の表では、 1文字表示を採用する。

【表 A】

A. T細胞が認識するヒトメラノ一マ抗原（メラノソームタンパク質)

ェピ卜一プ抗原抗原提示 MHC ペプチド名

KTWGQYWQV gplOO HLA-A2

AMLGTHTMEV gplOO HLA-A2

Mし GTHTMEV gplOO HLA-A2

ITDQVPFSV gplOO HLA-A2

YLEPGPVTA gplOO HLA-A2

LLDGTATLRL gplOO H厂LA-A2

>

VLYRYGSFSV gplOO HLA- >A CO2

SLADTNSLAV gplOO HLA-A2

ALLAVGATK gplOO HLA-A3

VYFFLPDHL gplOO - HLA-A24

MART-1/

AAGIGILTV HLA-A2

Melan— A

MART-1/

EAAGIGILTV HLA-A2

Melan— A

MART-1/

ILTVILGVL HLA-A2

Melan— A

MART- 1 /

AEEAAGIGIL HLA-B45

Melan— A

MART-1/

AEEAAGIGILT HLA-B45

Melan— A

MSLQRQFLR TRP1 HLA-A31

LLPGGRPYR TRP2 LLPGGRPYR TRP2 HLA-A33

DAEKCDICTDEY チロシナーゼ

Mし L WCYししチロシナ一ゼ HLA-A2

YMNGTMSQV チロシナ一ゼ HLA-A2

AFLPWHRLF チロシナ一ゼ HLA-A24

SEIWRDIDF チロシナーゼ HLA-B44

QNILLSNAPLGPQFP チロシナーゼ HLA-DR4

SYLQDSDPDSFQD チロシナ一ゼ HLA-DR4

ェ

B.腫瘍特異的変異ペプチド >

>

C.各種癌細胞と精巣に発現されるタンパク質 (cancertestis抗原) ェピトープ抗原抗原提示 MHC ペプチド名

EADPTGHSY MAGE— 1 HLA-A1

SAYGEPRKL MAGE- 1 HLA-Cw1 6

EVDPIGHLY MAGE -3 HLA-A1

FLWGPRALV MAGE- 3 HLA-A2

MEVDPIGHLY MAGE— 3 HLA-B44

AARAVFLAL BAGE HLA-Cw1 6

YRPRPRRY GAGE - 1 ,2 HLA-Cw6

QLSLL WIT NY-ESO- 1 HLA-A2

SLLMWITQC NY-ESO- 1 HLA-A2

SLLMWITQCFL NY-ESO- 1 HLA-A2 LSL-BLL L-l lVS SlAIAdl>1DV -UL L-iyVS IAdl>iDV>ID i

IU-ZLL L-ldVS 丄 <DV D>13D

SLL-6U L-l¾dVS V>ID>13DniVA

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ZLL-S8L L-iyVS "HVAlETld丄 α

69L-09L L- dVS AlEHd丄 JSSS

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89i-frSi L-ldVS asssiAi»>nnv

09£-L9i L-lidVS siAi>i imv33a

LSL-SUレー »ΊΊν33αΊ>1 Ι ms L L-iyVS V33an l llAiyid

IU-ZU L-lidVS a~l f IIAIidy3丄

8W - 6ε ー丄 yvs lAiyd31»lAI)HE) sw - 9S L-iyvs y31>ilAI IOS9 l

ZH-S L L-lidVS >!IAl>l9SQ>i!DHd

6ZL-0SL L-ldVS DSO>19HddHS

ΟΗ1ΛΙ^¾Κΐϊ ェ翬 ^TT^璽 =l -3

LZ£l0/£00ZdT/13d S80S£0請 OAV TPYIVLSGSG SART-1 781-790

IVLSGSGKSM SART-1 784-793

SGSGKSMNAN SART-1787-796

GKSMNANTIT SART-1790-799

KSMNANTITK SART-1 791-800

F. HLA— A24患者用ワクチンペプチド

ェピト一プ抗原抗原提示 MHC ペプチド名

EYRGFTQDF HLA-A24 SART1 690

DYSARWNEI HLA-A24 SART293

AYDFLYNYL HLA-A24 SART2161

SYTRLFLIL HLA-A24 SART2899

VYDYNCHVDL HLA-A24 SART3109

AYIDFEMKI HLA-A24 SART3315

KFHRVIKDF HLA-A24 CypB84

DFMIQGGDF HLA-A24 CypB9i

HYTNASDGL HLA-A24 Lck208

TFDYLRSVL HLA-A24 Lck486

DYし RSVし EDF HLA-A24 Lck488

EYCLKFTKL HLA-A24 ART1 ₁₇₀

AFし I HAAし HLA-A24 ART413

DYPSし SATDI HLA-A24 ART475

LLQAEAPRL HLA-A2 SART3302

RLAEYQAYI HLA-A2 SART3309

KLKHYGPGWV HLA-A2 CypBi 29 3V-V1H Ί人」ョ ΥνθΟΊ

3 - nH "raavョ

3V-V1H ΛΛΜαθνθΛΊ

3V-V1H A»aOVOAlS

3V-V1H

ZV-ΥΊΗ AASSISOlMd

3V-VHH ASSnSDlAIJWI

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.ZCT0/f00Zdf/X3d S80S£0請 OAV dVSlADHVd

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S丄 ASHVddV lAOHVddVJ.

AOHVddVlS

0Η1ΛΙ ifii¾ 一ェ

3ェ鶴鑼ベ ¾ 髒¾|職 +saoi¾¾¾ Lon^i Ό

LZ l0/£00Zd£/lDd S80S請 00Z OAV 2—丄 ηΐΛΐ VDVlND3d

L—丄 niAi dDVlND3d ζ.ε^υ°ο dDVlN03J

ΟΗΙΛΙ 一ェ

LZ£l0/£00ZdT/13d S80S£0請 OAV 上記例示的配列からも明らかなように、本発明において使用される T細胞タ一ゲット配列は、 HLA— A2または HLA— A24の場合、代表的には、 2 番目（または 1番目もしくは 3番目）のアミノ酸が Va 1、 Le , I 1 e、 T.y rまたは Ph eから選ばれた 1種であり、 9番目（または 8番目もしくは 10番目）のアミノ酸が V a 1、 Le u, P h eまたは I 1 eから選ばれた 1 種であることが特徴であるが、それに限定されない。より好ましくは、 2番目のァミン酸配列が Va l、 Le u, I l e、 T y rまたは P h eから選ばれた 1種であり、 9番目のアミノ酸配列が V a 1、 L e u、 P h eまたは l i eから選ばれた 1種であり得る。

防御免疫には、 CD 8 +T細胞を中心とした細胞性免疫の誘導が必須である。細胞性免疫の誘導は、 CD8+T細胞を誘導し、活性化するためにはワクチン抗原タンパク質を抗原提示細胞（マクロファージゃ樹状細胞）上の MHCクラス I分子に接着させることが必須の課程である。そのためには、 CD 8 +T細胞レセプター（T c e l l r e c e p t o r) が認識しうる、約 8個のアミノ酸からなるペプチド（T細胞ターゲット配列）をワクチン抗原タンパク質から切り出すことが必要である。この切り出し作業が細胞質内酵素であるプロテアソームで行われる。しかし、その前提として、ワクチン抗原タンパク質が細胞内でュビキチンと結合（ュビキチン化）されなければならない。そこで、ワクチン抗原タンパク質をコードする遺伝子と、ュビキチンをコードする遺伝子を結合した遺伝子を遺伝子銃等で抗原提示細胞内に直接注入することにより、その細胞内で結合遺伝子がコードする癒合タンパク質が合成される。そして、癒合タンパク質の一部であるュビキチンが癒合タンパク質をプロテアソームに導くことにより、プロテアソームにより癒合タンパク質内のワクチン抗原タンパク質から T細胞ターゲット配列が切り出され、 CD 8 ⁺T細胞レセプターに認識される。

抗原特異的 CD 8 +Τ細胞が誘導されるためには、抗原が細胞質内酵素であるプロテアソームでプロセッシングを受けた後に、 MHCクラス I分子に提示されることが必須である。このことは、抗原提示細胞の培養中にプロテアソーム特異的阻害剤である 1 a c t a c y s t i nや MG— 132を加えると、 MH Cクラス I分子に抗原が提示されず、 CD 8 +T細胞が活性化されないことが証明され、またプロテアソームノックアウトマウスを用いた実験でも同様の現象が確認されていることからも明らかである（ェ匪 unol. Rev. 163: 161—フ 6, 1998)₀

キラー T細胞レセプターが認識する T細胞ターゲット配列は、上述のように多くの場合 8個（通常 7〜10個）のアミノ酸により構成されるが、感染宿主の組織抗原（MHC、ヒトでは HLA) の相違により、その個体のキラー T細胞レセプターが認識するェピトープが異なる場合が多い。しかし、好ましい実施形態では、本努明に使用される DNAがコードするぺプチドは多種の MHC のキラー T細胞が認識しうるもの、あるいは複数のェピトープをコードする D N Aを用いることが好ましいので、そのような好ましい実施形態では、臨床応用に当たっても、オーダーメイド/ティラーメイド的な配慮の必要性は少なく、オーダーメイド的に多種の MHCを持つ集団がこのワクチンの対象となりうる。これは技術的のみならず経済的にも大きなメリットであり、経済基盤の弱い発展途上国にも応用が可能となる。

本発明における T細胞ターゲット配列の遺伝子の構築については、 T細胞タ一ゲット配列既知配列をデータベースより検索し、その配列両端についてプライマ一を合成し、腫瘍細胞よりフエノール .クロロフオルム法により RNAを抽出し、その RNAをテンプレートとして、 RT— PCR法を用いて逆転写し、遺伝子を構築する。ここで、 PCR法（p o 1 yme r a s e c h a i n r e a c t i o n) とは、 DN A鎖の特定部位のみ繰り返し複製する反応で、微量の DNAを 1， 000， 000倍程度まで増幅できる。複製反応のプライマ一としては、増幅部両端の塩基配列を含む合成オリゴヌクレオチォを用いて、耐熱性 DNAポリメラーゼにより行う。また、 RT— PCR法（r e v e r s e— t r an s c r i p t p o l yme r a s e c h a i n r e a c t i o n) とは、第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、 RNAから DNAを合成し、その後は通常用いられる PCR法によって、特定の DNA部位を増幅する方法である。

本発明の目的のために、 T細胞ターゲット配列は、特異的 CTLによって認識される標的細胞の MHCクラス I分子上に提示されるべきである。プロテアソームは、細胞內タンパク質（MHCクラス Iリガンドを生成する腫瘍抗原を含む）のタンパク質分解を担っている。プロテアソームによる分解の前に、ポリュビキチン鎖は、多酵素系により基質に共有結合されるべきである。（細胞基質のュビキチン C末端の加水分解酵素によって切断されず、かつ除去されないように、 C末端のグリシン残基を別のアミノ酸で置換した）ュビキチンと融合されたタンパク質は、ュビキチン一プロテアソーム系に依存する様式で融合されていないタンパク質よりも迅速に分解されることは注目に値する。この系は特に UFD経路と呼ばれる。従って、本発明が提供する、プロテアソームによる分解を必要とするタンパク質へのュビキチンの融合は、 CTLェピトープを効果的に作製するために有用なストラテジ一である。本明細書において「癌抗原」とは、正常細胞が癌化するに伴って新たに発現するようになる抗原分子をいう。そのような癌抗原としては、例えば、以下のようなものが挙げられるがそれらに限定されない：

(1)癌ウィルス由来抗原 (例えば、アデノウィルス、ポリオ一マウィルス、 SM0などの DNA型腫瘍ウィルスに由来する T抗原など）。ヒト、マウスの R A型腫瘍ウィルスでは、ウィルスのエンベロープタンパク質が細胞表面に発現される。

(2) 癌特異移植抗原 (tumor specific transplantation antigen, TSTA)；この抗原は、同系の癌細胞に対して特異的免疫応答が成立する結果、その癌細胞が拒絶される場合、その標的抗原となるものが該当する。遺伝子変異により、癌細胞内に変異タンパク質が作られると、他の細胞内正常タンパク質と同様に、ぺプチド断片として細胞内で、主要組織適合抗原遺伝子複合体 (MHC)の分子と会合し癌細胞表面に発現されるようになる。；

( 3 ) 癌関連抗原（tumor associated antigen, TM)。癌細胞に必ずしも特異的でないが，癌化に伴って特徴的な発現を示す抗原。例えば、肝癌における α - フェトプロティン、腸癌などにおける胎児性癌抗原 (carcinoembryonic antigen, CEA)などが該当する。これらは、元来は正常の胎児だけに存在するタンパク質であり、成人の組織には認められない。し力し、これらのタンパク質は、癌化に伴って再発現を示すので癌胎児抗原 (oncofetal antigen)と呼ばれる。

本明細書において使用される場合、癌抗原としては、どのような形態のものであっても用いることができるが、特に、癌関連抗原と呼ばれる形態のものが好ましく用いられる。 MH Cとの会合によって、癌細胞の表面に発現されるようになるからである。

本明細書において「自己腫瘍抗原」とは、癌抗原のうち、自己由来の抗原をさす。本発明では、自己腫瘍抗原を用いることは、プロテアソームによって適切な分解を受けるために好ましレ、。抗原において、患者により適正が異なることが判明したからである。

腫瘍細胞において高レベルに発現された「自己」抗原を標的にする遺伝子ヮクチンは、免疫療法に有用である可能性が高いが、免疫寛容は、しばしばこのストラテジーを無効にする。本発明者らは、自己腫瘍抗原（例えば、 n a k e d D NAワクチンであるチロシナーゼ関連タンパク質 2 (N末端ュビキチン力 S 「除去されない」様式で融合される））を使用するとよいことを見出した。従来のワクチンと異なり、本発明のワクチンは、例えば、腫瘍増殖、生存率およぴ肺転移によって評価されるように C 5 7 B L / 6マウスにおけるメラノーマに対する寛容を破壊し、そして保護免疫を誘導した。この保護免疫は、プロテァソームァクチベータ一 P A 2 8 α / ノックァゥトマウスにおいてキャンセルされた。さらに、このワクチン接種は、ワクチン接種前に移植されたメラノ一マに対して治療的効果を呈した。本発明によって、ュビキチン融合型自己抗原をコードする n a k e d D N Aワクチンが、ュビキチンプロテオソーム経路によって媒介される効率的なタンパク質分解により、主要なエフェクター C D 8 + T細胞を優先的に誘導し、そして腫瘍により発現される組織分化抗原を標的化することを目指すストラテジーを導くことが示された。 (サイトカイン、増殖因子、細胞生理活性物質類）

本明細書において「細胞生理活性物質」または「生理活性物質」

(physiologically active substance) とは、細胞または組織に作用する物質をいう。そのような作用としては、例えば、その細胞または組織の制御、変化などが挙げられるがそれに限定されない。生理活性物質には、サイト力インおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものであるが改変された作用を持つものであつてもよい。本明細書では、生理活性物質はタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイト力インは通常はタンパク質形態を意味する。

本明細書において使用される「サイト力イン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイト力インは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウィルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイト力インはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイト力インは通常はタンパク質形態を意味する。

本明細書において用いられる「增殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の增殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。

サイト力インには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（PDGF)、上皮增殖因子（EGF)、線維芽細胞増殖因子（FGF)、肝実質細胞増殖因子（HG F)、血管内皮増殖因子（VEGF) のような増殖活性を有するものが挙げられる。本発明において特に好ましく使用されるものには、インターロイキンが挙げられるがそれに限定されない。

本発明における好ましい例示的サイト力インとしては、限定されないが、特に、免疫細胞の分化、増殖および活性化を誘導することができるものが使用され、例えば、インターロイキン 1、インターロイキン 2、ィンターロイキン 4、インターロイキン 6、インターロイキン 7、 I L_12、 I L一 15、 I L一 18、インターフェロンお、インターフェロン、インターフェロン γ、顆粒球マクロファージ ·コロニー刺激因子（GM— CSF)、 HGF、 VEGF, F GF等の成長因子（GF)、腫瘍壊死因子（TNF)、腫瘍壌死因子 a (TNF -α), 腫瘍壊死因子 ]3 (TNF-/3) 等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、サイト力インは、 I L一 12、 I L一 15、 I L一 18である。

サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象 ( r e d u n d a n c y ) があることから、他の名称おょぴ機能（例えば、細胞殺傷能力、シグナル伝達能力など）で知られるサイト力インまたは増殖因子であつても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイト力インまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性（例えば、所望の病原体を殺傷する能力）を有してさえいれば、本発明のワクチンまたは医薬の好ましい実施形態において使用することができる。

(一般生化学）

本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。本明細書において用いられる場合、この用語は、好ましくは、核酸分子によって翻訳された形態であることから、通常、直鎖であり、天然のアミノ酸のみから構成されるがそれに限定されない。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸ィ匕または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上の'アナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。 F I R、 C E N P -A などの遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。本明細書では、本発明のポリペプチドは、通常、特定の配列（配列番号 2、 4などまたはそれらの改変体）を有する。ュビキチン、抗原（例えば、癌抗原）などの遺伝子の遺伝子産物は、通常、このような配列を有するポリペプチド形態をとる。ここで、改変を有する配列は、本凳明において、予防、治療目的に使用され得る。

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体ォリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレォチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、 2，一 O—メチル一リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘導体ォリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3， - P 5 ' ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリポースとリン酸ジエステル結合とがぺプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C 一 5プロピニルゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5チアゾールゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、才リゴヌクレオチド中のシトシンが C一 5プロピエルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン（phenoxazine - modified cytosine) で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 D N A中のリボースが 2，一 O—プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキシエトキシリポースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相捕配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基およびまたはデォキシィノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer et al. , ucleic Acid Res. 19 : 5081 (1991) ; Ohtsuka et al.、 J. Biol. Chem. 260： 2605—2608 (1985)； Rossolini et al.、Mol. Cell. Probes 8： 91-98 (1994) )。本発明の遣伝子ワクチンは、通常、このポリヌクレオチド形態をとり、通常、アミノ酸形態に翻訳されることが必要であることから、インビボで転写およぴ翻訳される形態（例えば、天然のヌクレオチドからなる）をとることが好ましいがそれに限定されない。

· 本明細書において使用される用語「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およぴポリヌクレオチドと互換可能に使用され、 c D NA、 mRNA、ゲノム D N Aなどを含む。本明細書では、核酸おょぴ核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（バリアント、改変体)」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、ェキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本発明の遺伝子には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。このような変異体は、本発明の診断および治療において有用である。

本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、ュビキチンなどの遺伝子というときは、通常、ュビキチンなどの構造遺伝子およびュビキチンなどのプロモーターなどの転写または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、これらの調節配列もまた、診断に使用することができる。本明細書では、「遺伝子」は、通常「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさす。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに/または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。

本明細書において遺伝子 (例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間で D N A配列が、代表的には少なくとも 5 0 %同一である場合、好ましくは少なくとも 7 0 %同一である場合、より好ましくは少なくとも 8 0 %、 9 0 °/₀、 9 5 %、 9 6 %、 9 7 %、 9 8 %または 9 9 %同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。本発明では、ュビキチン、癌抗原など、使用されるエレメントに対して類似性または相同性の高い配列もまた、利用されることができる。

本明細書において「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。

本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L一異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニン、フエニノレアラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、 γ—力ルポキシグルタミン酸、アルギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。

本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ一ニトロフエ-ルァラニン、ホモフエニノレアラニン、パラーフルオロフェニノレアラニン、 3—ァミノ一 2—ベンジノレプロピオン酸、ホモアノレギニンの D 体または L体おょぴ D—フエ二ルァラニンが挙げられる。

本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、ァミノ酸の物性および/または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、カナバニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられるがそれらに限定されない。アミノ酸アナログの例としてのアミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するァミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよレ、。本明細書において「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2—0—メチルリボヌクレオチド、ペプチド一核酸（P NA) が含まれるが、これらに限定されない。本発明では、遺伝子産物が発現される限り、どのようなアナログを使用してもよレ、。好ましくは、天然型のヌクレオチドを含む遺伝子ワクチンが使用される。天然型のものは、ペプチドに翻訳される可能性が高いからである。本明細書において「対応する」アミノ酸および核酸とは、それぞれあるポリぺプチドおよび核酸分子において、比較の基準となるポリべプチドおよび核酸分子における所定のアミノ酸および核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸および核酸をいい、例えば、ュビキチンにおいては、リジンとの連結を担う配列（例えば、 C末端のグリシン）と同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸およびそれをコードする核酸をいう。例えば、核酸配列であれば、その核酸配列またはそれがコードする特定の部分と同様の機能を発揮する部分であり得る。

本明細書において「対応する」遺伝子 (例えば、ポリペプチド、核酸分子など）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有する力 \ または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトのュビキチン、 T細胞ターゲット配列、癌抗原などの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ゥシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ヒトのュビキチン、 T細胞ターゲット配列、癌抗原などの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばマウス、ラット）の配列データベースを検索することによって、またはゥエツトの実験でライブラリーをスクリー二ングすることによって見出すことができる。

本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および/または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、

BLAST (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215： 403-410 (1990) )、FASTA (Pearson

& Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 85 : 2444 - 2448 (1988) )、 Smith and

Waterman法（Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147： 195 - 197 (1981))、お i Χβ Needleman and Wunsch ¾ (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48： 443-453 (1970) )などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジ工ントハイブリダィゼーション、ゲノム D N Aをナイ口ンメンブレン等に貼り付けたマクロァレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ (マイクロアレイアツセィ）、 P C Rおよび i n s i t uハイプリダイゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、ュビキチン、 T細胞ターゲット配列（例えば、癌抗原）などには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。

本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さが n ) に対して、 1〜！ 1 — 1までの配列長さを有するポリべプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリぺプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 5， 20、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 1 1など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 5， 2 0、 25、 30、 40、 50、 75、 100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 11 など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下 10%) のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。し力し、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本発明のュビキチン、 T細胞ターゲット配列についても、その機能を有する限り、このようなフラグメントもまた使用され得ることが理解される。

本明細書において「ストリンジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー ·ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク ·ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コロニーあるいはプラーク由来の DN Aを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの Na C l存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0 · 1〜2倍濃度の330 (saline-sodium citrate) 溶液（ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150m M 塩ィ匕ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65°C 条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ノヽイブリダィゼ一ンヨンは、 Molecular Cloning 2nd ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 - 38、 DNA Cloning 1 '· Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除外される。「ハイプリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるァミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DN Aの塩基配列と少なくとも 6 0 %以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80 %以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または I UP AC— I UB B 1 o c h em i c a 1 Nome n c l a t u r e C o mm l s s ι o n lこより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された 1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールである FASTAを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。

本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 ( t r u n c a t e d)改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、 1または数個の置換、付加および Zまたは欠失、あるいは 1つ以上の置換、付加およびまたは欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（a l l e l e) とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従つて、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活†生を有するともある。「種相同体またはホモログ（h omo 1 ο g)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レべルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60 %以上の相同性、より好ましくは、 80 %以上、 8 5 %以上、 90 %以上、 9 5 %以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（o r t h o 1 o g)」とは、オルソロガス遺子 (o r t h o l o g o u s e n e と !、ヽ、二つの遺 I 子力 ^sある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子フアミリーを例にとると、ヒトおよびマウスの aへモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトの α ヘモグロビン遺伝子および β へモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。

本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列およぴ核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドン G C A、 G C C、 G C G、および G C U はすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。したがって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである A U G、および通常トリプトファンのための唯一のコドンである T G Gを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。サイレント変異もまた、本発明の診断の指標であり得る。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシスティンの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、 D N Aポリメラーゼ、 K 1 e n o wフラグメント、 D N Aリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法 (特定部位指向突然変異法； Mark Zoller and Michael Smith, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983) ) が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。このような核酸は、周知の P C R法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイプリダイゼーシヨン法などを組み合わせてもよい。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換」、「付加」および「欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、および取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、プロテアソームへの運搬など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 2 0 %以内、 1 0 %以内、または 1 0 0個以下、 5 0個以下、 2 5個以下などであり得る。

(抗原および抗体）

本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗ィディオタィプ抗体、ならびにそれらの断片、例えば F ( a b ' ) ₂および F a b断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ヮサビペルォキシダーゼ、 α ガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。

本明細書において「中和抗体」とは、酵素、毒素、細菌、ウィルスなどの生物学的活性を中和する抗体をいう。本発明では特に、 Τ細胞ターゲット配列を含む抗原に関連する生物学的活性を中和する抗体をいう。

本明細書において「抗原」（antigen) とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immunogen) とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性ィ匕を開始し得る抗原をいう。

本明細書において「ェピトープ」とは、抗原を決定する構造を構成する基のことをいう。従って、ェピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、 T細胞の場合は、 T細胞レセプタータンパク質および/もしくは主要組織適合性複合体（MH C ) レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビポまたはインビトロで、ェピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロプリン、 T細胞レセプターまたは H L A分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むェピトープは、ェピトープに独特な空間的コンフオメーシヨン中に 3つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、ェピトープは、少なくとも 5つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも 6 つ、 7つ、 8つ、 9つ、または 1 0のこのようなアミノ酸からなる。ェピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフオメーシヨンを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフオメーシヨンを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、 X線結晶学、および 2次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるェピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、 Geysenら（1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3998 (所定の抗原における免疫原性ェピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第 4， 7 0 8， 8 7 1号（抗原のェピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；および Geysen ら（1986) Molecular Immunology 23： 709 (所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じェピトープを認識する抗体は、単純な免疫アツセィにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むェピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなェピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。

従って、ペプチドを含むェピトープとして使用するためには、少なくとも 3 ァミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも 4 アミノ酸、より好ましくは 5アミノ酸、 6アミノ酸、 7アミノ酸、 8アミノ酸、 9アミノ酸、 1 0アミノ酸、 1 5アミノ酸、 2 0アミノ酸、 2 5アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。本明細書において「単離された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞內）の他の物質（好ましくは、生物学的因子) (例えば、核酸である場合、核酸以外の因子おょぴ目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のァミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸おょぴタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸おょぴタンパク質を包含する。

本明細書において「精製された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された物質におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。

本明細書において「精製された」および「単離された」とは、好ましくは少なくとも 7 5重量。 /₀、より好ましくは少なくとも 8 5重量％、よりさらに好ましくは少なくとも 9 5重量％、そして最も好ましくは少なくとも 9 8重量。 /₀の、同型の物質が存在することを意味する。

本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリぺプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子（通常は、 D NA形態）などがインビポで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレォチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいう力転写されて mRN Aが作製されることもまた発現の一形態であり得る。別の実施形態では、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。

本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（例えば、癌罹患部位などの特異的部位）にの'み発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。そのような特異的発現は、特異的発現を誘導するプロモーターなどを利用することによって実現することができる。

本明細書において遺伝子発現（たとえば、 mRNA発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、 mRN Aの測定おょぴ免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いる EL I S A法、 R I A法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、 EL I SA 法または R I A法などが例示される。アレイ（例えば、 DNAアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、 Nat Genet.2002 Dec! 32 Suppl: 526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、 RT— PCR、 RACE法、 S S CP法、免疫沈降法、 t wo— h y b r i d システム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法 .中村祐輔ラボ ·マニュアル、編集 ·中村祐輔羊土社（2 0 0 2 ) などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。

本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ュビキチン、 T細胞ターゲット配列含有ペプチド (例えば、癌抗原）など)） 1S 生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、プロテアソームへの運搬、抗体惹起能、転写促進活性など）を発揮する活性が包含される。例えば、 2つの因子が相互作用する（例えば、ュビキチンなどとそのパートナーとが結合する）場合、その生物学的活性は、ュビキチンなどとそのパートナーとの間の結合およびそれによつて生じる生物学的変化（例えば、プロテアソームへの運搬など）などを包含する。 '

(ワクチン）

本明細書において「ワクチン」とは、身体中に投与されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子または感染因子のある部分またはそのような因子または部分を生成することができる因子（例えば、遺伝子配列など）を含む,袓成物 (例えば、懸濁液または溶液）をいう。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物（例えば、ウィルスまたは細菌など）または微生物から精製された天然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖または同様な産生物、あるいはそのようなタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であり得る。ワクチンは、中和抗体を生起することによって、その効果を発現する。

本明細書において「遺伝子ワクチン」とは、ワクチンのうち、投与される被検体において発現され、その発現物がワクチンの作用を有するような因子（代表的には、核酸分子）を含む組成物（例えば、懸濁液または溶液など）をいう。代表的な遺伝子ワクチンは、抗原性を有する遺伝子産物をコードする核酸配列を含む核酸分子（例えば、ベクター、プラスミド、 N a k e d D NAなど）であり得る。

本明細書においてワクチンの免疫学的な効果は、当該分野において公知の任意の方法を用いて確認するこ'どができる。そのような方法としては、例えば、

CTL前駆細胞頻度分析、 EL I SPOT法、テトラマー法、リアルタイム P CR法などが挙げられるがそれらに限定されない。例示的な説明として、 CT L前駆細胞頻度分析では、末梢血リンパ球または抗原べプチドおよび I L一 2 存在下で培養したリンパ球を限界希釈し、 I L一 2とフィーダー細胞との共存下で培養し、増殖したゥエルをワクチンまはその候補で刺激しく I FN— γ 産生の有無を EL I S Aなどで測定する。ここで陽性ゥヱルをポアソン分析に従って CTL前駆細胞の頻度を算出し、ワクチンの効力を評価することができる。ここで、陽性の細胞数が抗原特異的 CTL数であり、その数が多いほどヮクチンとして効力が高いといえる。

本明細書において「アジュバント」とは、投与された免疫原と混合するとき、免疫応答を増加するか、あるいはそうでなければ変更する物質である。アジュパントは、例えば、鉱物、細菌、植物、合成または宿主の産生物に場合に応じて分類される。

本明細書において「病原体」とは、宿主に対して疾患または障害を発生し得る生物または因子をいう。ヒトに対する病原体としては、例えば、ウィルス、細菌、原虫、リケッチア、クラミジァ、真菌、新生物（癌など）などが挙げられるがそれらに限定されない。細胞内寄生病原体としては、具体的には、結核菌由来の MPB 51、 MDP 1、 A g 85 A、 Ag 85B、 HSP65、 M t b 72 f遺伝子、マラリア原虫由来の MS P— 1遺伝子、トキソプラズマ原虫由来の SAG— 1遺伝子、クルーズトリバノソーマ原虫由来の TS A遺伝子、 H I V関連遺伝子、サイトメガロウィルス関連遺伝子等から選ばれる。宿主に対して疾患または障害を発生させるという意味においては、癌などの新生物もまた、本明細書において病原体の定義に入ることに留意すべきである。ヮクチンが有効とされるのは、通常、ウィルス、細菌、癌などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「予防」（p r o p h y l a x i sまたは p r e v e n t i o n ) とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。

本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。このような治療活性または予防活性は、本発明のワクチンについて判定されるとき、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで試験される。例えば、本発明の遺伝子ワクチンの、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセィとしては、細胞株または患者組織試料に対するワクチンの特異的結合の効果が挙げられる。そのような試験は、当業者に公知である技術（例えば、 E L I S Aなどの免疫学的アツセィ）を利用して決定され得る。インビボ試験としては、例えば、中和抗体を惹起する能力があるかどうかを試験する方法が挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「癌」または「がん」は、互換可能に用いられ、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壌性に浸潤し得あるいは転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、癌は固形癌および造血器腫瘍を含むがそれらに限定されない。本明細書において「固形癌」は、固形の形状がある癌をいい、白血病などの造血器腫瘍とは対峙する概念である。そのような固形癌としては、例えば、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、骨腫瘍が挙げられるがそれらに限定されない。本発明が特に意図する癌としては、例えば、肺癌、メラノーマ、胃癌などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。

本発明は、被験体への有効量の本発明の遺伝子ワクチンの投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、本発明の遺伝子ヮクチンは実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる)。 (予防のための投与および組成物）

本発明が対象とする動物は、免疫系または類似の系を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メタラウナギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ゥシ、プタ、ゥマ、ニヮトリ、ネコ、ィヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、二ホンザル、ヒト）が対象とされる。最も好ましくはヒトが対象とされる。

本発明のワクチンが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキヤリァなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキヤリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。本発明に係るワクチンは、病気罹患の際に免疫学的により好ましい免疫応答のできる免疫システムが達成されるような、あらゆる組成物をも含むことができる。通常、ワクチンは免疫決定要因と、この免疫決定要因の応答を、迅速強化するような作用を呈する免疫助成剤とを含み、免疫決定要因は免疫助成剤と組み合わせて用いるのが好適である。免疫賦活剤は、通常用いられる、例えば、フロイント（F r e u n d ) 複合体助成剤や、フロインド非複合体助成剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。尚、本発明のワクチンは、免疫助成剤を用いなくとも効能を有する。

本発明の組成物、ワクチンなどで用いられ得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤およぴ /または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、ワクチン、またはその改変体もしくは誘導体を、 1つ以上の生理的に受容可能なキヤリァ、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。

本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、 _a -トコフエロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマ一 (例えば、ポリビュルピロリドン)；アミノ酸（例えば、グリシン、ダルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、 E D T A) ；糖アルコール（例えば、マンュトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに Zあるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、 T w e e n、プル口ニック（p 1 u r o n i c ) またはポリエチレングリコール（P E G) ) などが挙げられるがそれらに限定されない。

例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤およぴ賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH7. 0-8. 5の T r i s緩衝剤または p H 4. 0-5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これら、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。

以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。

本発明のワクチンなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合して非経口的に投与することができる。

本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第 14版またはその最新版、 Re mi n g t ₀ n' s Ph a rma c e u t i c a l S c i e n c e s, 18 t h E d i t i o n, A. R. Ge nn a r o, e d., Ma c k Pub l i s h i n g C o mp a n y, 1990などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。

様々な送達系が公知であり、本発明では任意の投与経路が企図される。本発明のワクチンを投与するために用いられ得る技術としては、例えば、水溶液、リボソーム、微粒子、マイクロカプセルなどが挙げられる。従って、本発明のワクチンは、経口的または非経口的に投与され得る。そのような投与方法としては、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与（鼻腔内、膣内、気道下、口腔内、直腸粘膜および腸粘膜など）、患部への局所投与、皮膚投与など）が挙げられる。全身投与されるとき、本発明において使用されるワクチンは、発熱物質を含まないことが好ましい。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、 P H、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。導入方法としては、経口剤としての投与、吸入（例えば、肺）、シリンジ、カテーテル、チューブを用いた注入、針無し注射、遺伝子銃などが挙げられるがそれらに限定されない。この場合、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。

本発明の予防方法において使用されるワクチンの量は、使用目的、対象疾患

(種類など）、患者の年齢、体重、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、既往歴、および経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日—数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回一 1ヶ月に 1 回）の投与、あるいは毎年流行前に 1回の頻度などが挙げられる。 1週間 _ 1 ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましく、少なくとも約 1週間の間隔をあけて追加免疫をすることが有利である。より好ましくは、追加免疫の間隔は少なくとも約 3週間であり得る。

本努明のワクチンなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されない。本明細書中、「投与する」とは、本発明のワクチンなどまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて処置が意図される宿主に与えることを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または遂次的にかのいずれかで投与され得る。

ら Ί これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の粘膜を通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第

1に与えられ、続いて第 2に与えられる化合物または薬剤のうちの 1つを別々に投与することをさらに含む。

本発明におけるワクチンの投与は、どのような手法を用いて行ってもよいが、好ましくは、針無し注射を用いることが有利である。患者に過度の負担を与えることなく投与を行えるからである。

ここで本発明における針無注射器とは、注射針を用いずに、ガス圧または弾性部材の弹力によりピストンを移動させて薬液を皮膚に噴射し、薬剤成分を皮下、より好ましくは皮下の細胞内に投与する医療機器を意味する。

具体的には例えば、シマジェット™ (島津製作所製)、メディ 'ジェクタ一ビジョン（Medi- Jector Vision)™ (Elitemedical 社製）、ペンジェット (PenJet)™ (PenJet社製）などが市販されている。このような針無し注射については、

http： / /www . shimadzu . co . j p/ ep/other/ shimaj et/ shimaj ettop . htm 1

htt ： / /ww . elitemedical . com/ ehms 1 /medcho i c . html

http： I /www . pen j et . com/pages /pr drymix . html

などを参照することができる。

なお遺伝子銃（パーティクルガン）とは、 DNAを被覆した金やタングステン等の高密度粒子をヘリウム等のガス圧を利用して加速し、 in vivo遺伝子導入が可能な医療/実験機器である。遺伝子銃の利点は、少量の D N Aでも効率良く細胞導入できることと、異なる操作者でも安定した結果が得られることである。具体的には、例えば米国 Bio- Rad社製の Helios Gene Gunなどが巿販されており、利用することができる。（下記、参照） htt ： //www . bio-rad . com/B2B/BioRad/product/br_category . j sp?B

V SessionID=@@@@0473フ 48622.1065491897@@@@ &BV— EngineID=cccda dcj idiidef cf ngcf kmdhkkdf lm .0 & category Pat =も 2 f Catalogs %2f Li f +Gunも 2f &divName=Co;rpo;ra e&sea;rchS1::r=helios+gene+gun&cai:e:Nam e=Ordering+ Information

または

htt ： //www. bio-rad . com/B2B/BioRad/product/br category . j sp?B

V SessionID=@@@@0473748622.1065491897@@@@&BV EngineID=cccda dcj idiidef cf ngcf kmdhkkdf lm.0 &categoryPath=も 2f Catalogs 2f Lif e+Delivery%2f Helios+Gene+Gun 2f

cience+Resear ch&sea chSt;r=helios+gerLe+gun&catel[ame=0;rde;ring+ Information 本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、予防薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA) など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（p a c k a g e i n s e r t) であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。

本発明の方法による予防処置の終了の判断は、市販のアツセィもしくは機器使用によって惹起される抗体を確認することによって行うことができる。本発明はまた、本発明のワクチンを含む容器を備える薬学的パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。発明を実施するための最良の実施形態の説明以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記载を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。

1つの局面において、本発明は、ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、遣伝子ワクチを提供する。このような遺伝子ワクチンは、ュビキチンが有するプ口テアソームへの指向性の性質によって、 T細胞が認識する抗原（例えば、ゥィルス、細菌、癌細胞などの病原体）がプロテアソームに効率よく運搬されることによって特異的に分解され、疾患または障害がほとんど副作用無しに処置または予防することができるという効果が達成される。このような遺伝子ワクチンは、ュビキチンをコードする核酸配列を設計し、構築すること、および T 細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列を設計し構築することによって、必要に応じて違結することで作製することができる。このような構築は、当該分野において周知の分子生物学的または遺伝子工学的手法を用いて行うことができ、そのような手法は、本明細書において記載されている力、、または引用される文献において記載されている。

フ 0 別の局面において、本発明は、ュビキチンをコードする核酸配列と、 τ細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、核酸構築物を提供する。このような核酸構築物は、ュビキチンをコードする核酸配列を設計し、構築すること、および τ細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列を設計し構築することによって、必要に応じて連結することで作製することができる。このような構築は、当該分野において周知の分子生物学的または遺伝子工学的手法を用いて行うことができ、そのような手法は、本明細書において記載されているか、または引用される文献において記載されている。本発明に係るュビキチン遺伝子の含有量は、種々の要因により適宜変更できるが、マウス一匹（20 g) 当たり、 1 g〜20 /Z g、好ましくは、 6 μ g〜9 μ gであるがそれらに限定されない。本発明に係る抗原遺伝子の含有量は、種々の要因により適宜変更できるが、マウス一匹（20 g) 当たり、 1 μ g〜20 g、好ましくは、 6 g〜9 μ gであるがそれらに限定されない。

ュビキチン化した遺伝子、抗原遺伝子は、上述した RT— PC R法で構築されるが、この方法に限定されるものではない。具体的には、第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、 RNAから DNAを合成し、この後、 PCR 法により D N A鎖の特定部位のみ繰り返し複製し、微量の D N Aを増幅した後、大腸菌に形質転換し、 37 °Cの恒温槽にて晚（約 16時間）振盪培養を行う。その後、遠心を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を T r i s -HC 1 /EDTA溶液に溶解する。続いてアルカリ溶液 Na OH/SDS溶液にて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止める為中和溶液酢酸力リゥムにて中和する。その後、核酸精製用陰イオン交換樹脂カラムに溶液を 1 o a dし、 Na C l/ 酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、 Na C lZTr i s— HC 1にて溶出する。なお、その遺伝子が実際に細胞内で発現することは、 COS細胞にトランスフヱクトして確認することができる。

フ 1 1つの実施形態において、本発明において用いられる T細胞ターゲット配列をコードする核酸配列は、通常その核酸配列がコードするアミノ酸配列を有するぺプチドが c T Lの反応性を有することで特徴付けられる。ある因子が C T Lの反応性を有するかどうかは、 T細胞免疫系を有する宿主に候捕因子を投与したときに、 C T Lが活性化されるか否かを確認することによって判定することができる。このような C T Lを活性化する因子は、通常、 8〜1 0アミノ酸長を有する特徴的なアミノ酸配列を有しており、そのような配列は、本明細書において表として例示されているがそれに限定されず、 C T Lを活性化すること限り、どのような因子でも使用することができる。従って、表に例示されて Vヽる具体的な配列の 1または数個のアミノ酸の、置換、付加およぴ欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体もまた本発明において使用することができる。

好ましい実施形態において、本発明において用いられる T細胞ターゲット配列をコードする核酸配列は、通常少なくとも 7個、より通常には少なくとも 8 個のアミノ酸からなるペプチドをコードし、より好ましくは、 7〜1 0個のァミノ酸からなるぺプチドをコ一ドするがそれに限定されない。このようなアミノ酸配列は、本明細書において他の場所に例示されている。このようなァミノ酸配列をコードする核酸配列は、分子生物学の技術常識を用いてコードを設計することによって作製することができる。そのようなコード配列は、宿主において目的のアミノ酸配列に翻訳される限りどのような配列でもよいが、好ましくは、宿主においてよく利用されるコドン頻度などを利用して転写および翻訳がより効率よく行われる配列を用いることが有利である。

1つの好ましい実施形態において、好ましい T細胞ターゲット配列としては、少なくとも 7個、より好ましくは少なくとも 8個のアミノ酸を含み、 2番目、 1番目または 3番目（好ましくは 2番目）のアミノ酸配列は、疎水性アミノ酸 (例えば、 Va l、 L e u, I l e、 Ty rまたは Ph e) であり、 8番目、 9番目または 10番目（好ましくは 9番目）の配列は、疎水性アミノ酸（例えば、 Va l、 L e u, Ph eまたは l i e) であることが有利であるがこれらに限定されない。このような配列が、特定の状況において CTLによって標的化されやすいことが知られているからである。しかし、このような好ましい配列は、状況に応じて変動し得ることが理解される。また、そのような変動を理解し、実際の遺伝子ワクチン作製に応用することによって、副作用の少ない遺伝子ワクチンを作製することができる。なぜなら、上記の好ましい配列について、 HL Aの型によって好ましい配列が異なることが知られているからである。別の実施形態において、本発明において用いられる T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質は、病原体タンパク質（例えば、ウィルス、細菌、真菌、寄生生物、原虫などのタンパク質）および癌抗原タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を含む。好ましい実施形態では、抗原タンパク質は、ェピトープとしての性質が顕著であることが好ましい。しかし、この抗原タンパク質は、必ずしも天然の状態で存在するときにェピトープであることは必要とされない。抗原タンパク質が実際にタンパク質として細胞上に発現されるときに抗原性を有している限り、いずれのタンパク質も使用することができるからである。 1つの好ましい実施形態では、この抗原タンパク質は、自己腫瘍抗原である。自己腫瘍抗原を用いることによって、効率よく癌を治療または予防することができることが判明したからである。自己腫瘍抗原は、公知のものを用いてもよく、新たに自己腫瘍抗原であるか否かを確認することによつて新たなタンパク質を用いてもよい。自己腫瘍抗原であるか否かは、当該分野において公知の手法を用いて確認することができる。

特定の実施形態において、本発明において使用される抗原タンパク質は、メラノソームタンパク質、 S重瘍特異的変異ペプチド、癌関連抗原、癌特異移植抗原、癌ウィルス由来抗原などであり得る。これらの抗原を用いることによって、

フ 3 それらの抗原に関連する疾患（例えば、メラノーマ、肺癌、胃癌など）を予防または治療することができる。

本発明の特定の好ましい実施形態では、本発明において使用される抗原タンパク質は、 TRP2、 MUT1、 MUT2などであり得、具体的には、例えば、表 Aに記載されている。このような配列は、投与する宿主によって変動させることができる。そのような場合、投与を意図する宿主について予め HL Aなどの型を検査しておくことが有利であり得る。特定の配列を選択することが可能となるからである。 1つの好ましい実施形態では、本発明において使用される抗原タンパク質は、メラノ一マ抗原である。現在までに免疫応答を活性化し得るいくつかのメラノ一マ抗原が規定されている。とりわけ、メラノサイト系統分化抗原（MDA) は、免疫応答の誘導において最も重要である。チロシナーゼ関連タンパク質 2 (TRP- 2) は、ヒトおよびマウスにおける正常メラノサイトおょぴ悪性メラノサイトの両方において発現される MDAのうちの 1つである。 CTLは、抗腫瘍免疫において主要な役割を果たしている。ヒト CD 8+T細胞によって認識されるいくつかのェピトープは、 TRP— 2タンパク質に関連する（Noppen C. , et al . , Int. J. Cancer 87. , 241-246 (2000) )₀ B l o omらは、 H— 2K^b MHCクラス I分子上に提示された主要なマウス CTLェピトープ（TRP— 2₁₈₁— ₁₈₈) を同定し、 C57BLZ6 (B 6) マウスへの TR P— 2₁₈₁_₁₈₈に特異的な CTLの受動的な移送が、確立された B 16肺転移に対する治療効果を有することを報告した（BloomMBetal. , J. Exp. Med. , 185,453-459 (1997))。 T R P _ 2は自己抗原であるにもかかわらず、 TR P— 2に対して応答性である可能性がある C T L前駆体の重要なメンバ一は、胸腺内の選択を回避する。しかし、自己マウスメラノサイトタンパク質（例えば、 TRP— 2) に対して特異的な T細胞は、末梢リンパ系において寛容にさ

フ 4 れることが一般的に認められており、メラノサイト抗原単独での免疫（遺伝子による免疫を含む）は、自己抗原に対する末梢 T細胞寛容を破壌せず、 B 16 メラノーマ細胞に対する保護免疫を提供し得ないとされている（例えば、 Weber LW. , et al. , J. Clin. Invest. , 102, 1258-1264 (1998)； Overwijk, W.W. , et al. , J.eExp.Med. ,188, 277-286 (1998)； Bowne, W. B. , et al. , J. Exp. Med. , 190 , 1フ1フー 1722 (1999) ,·およぴ Tuting, T. et al. , Cancer Gene Ther. , 6, 73-80 (1999) )o これらの寛容の制限を克服することは、メラノーマに対する効果的な免疫治療の開発のために重要であり、本発明は、この制限を克服する。

別の好ましい実施形態において、本発明の抗原ペプチドは、全長遺伝子であることが有利である。そのような全長抗原遺伝子（例えば、自己 TRP— 2) で免疫は、ヒト TRP_2₁₈₁_₁₈₈のような 8〜9マーペプチドを用いるワクチンストラテジ一よりも優れた多くの利点を提供する。

第一に、ュビキチン融合型抗原はュビキチン一プロテアソーム経路によって迅速に分解され、 MHCクラス Iの多くの型に対して提示され得る T細胞ターゲット配列（CTLェピトープともいう）を含む多様なペプチドの効果的な産生を生じる。言い換えると、この型のワクチン接種は、多様な型の MCHクラス Iを有する患者によって利用可能である。

第二に、副作用の発症率は、ベクターウィルスまたは異種のペプチド/遣伝子を使用するワクチンと比較して低い。ワクチンの後者の型は、特定の副作用を引き起こす。この副作用は、例えば、抗体の中和、同種細胞親和性抗体によつて媒介されるアナフィラキシー、および外来/異種抗原もしくはベクターゥィルス抗原（ワクチンを含む）を認識する CD 4+T細胞により媒介される全身性炎症疾患である。

第三に、免疫ァクチべ一ター（例えば、完全なフロイントのアジュパントまたは I L—12のようなサイト力イン）は、通常必要とされない。第四に、 n a k e d DNAの構築は容易であり、かつ費用がかからない。最後に、癌の型に依存して DN Aワクチンの設計が可能であり、大部分の型の癌への適用にかかわり得る。

このように、本発明の 1つの好ましい実施形態では、 T細胞ターゲット配列を有する抗原遺伝子は、天然にある抗原遺伝子であって全長配列またはそれに近い配列（例えば、全体の 80 %以上、 90 %以上）のものであることが有利であり得るが、それに限定されない。本発明において用いられるュビキチンは、どのようなュビキチンであってもよい。ュビキチンは、種を超えて広く保存されていることから、種が異なるュビキチンの配列もまた使用することができる。そのような配列の例示としては、例えば、核酸配列で示すと、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 1 6、 18、 20、 2、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 50、 52、 54、 56、 58および 60に示すァミノ酸配列もしくはその改変体をコードする核酸配列を含む。好ましくは、投与を意図する宿主のュビキチン遺伝子の核酸配列を用いることが有利である。宿主におけるュビキチンの発現が確実であるからである。

好ましい実施形態では、本発明において用いられるュビキチンは、プロテアーゼによる切断を抵抗性になるように改変されたものが有利である。プロテアーゼによる切断に対して抵抗性となることによって、プロテアソームへの運搬効率が高まるからである。このような抵抗性になるように改変することは、当該分野において公知の手法を用いて行うことができる。改変は、分子生物学的または遺伝子工学的手法を用いて行うことができ、実際のスクリーニングの際は、プロテアーゼに対する抵抗性を生化学的手法による確認するか、または必要に応じてプロテアソームへの運搬の効率を見ることにより効果を確認することができる。

フ 6 このような抵抗性の改変の例示としては、ュビキチンの C末端の G l yを G 1 y以外のアミノ酸に置換することが挙げられるがそれに限定されない。一般に、 G 1 yを改変することによって、ュビキチン一プロテアソーム系に依存する様式で融合されていないタンパク質よりも迅速に分解されることが判明したからである。より好ましくは、ュビキチンの C末端の G 1 yは、 A l aに置換されていることが有利であるが、それに限定されず、天然のァミノ酸であれば、どのようなアミノ酸でも同様の効果が期待されることが理解されるべきである。従って、 1つの特定の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子ワクチンにおいて使用されるュビキチンは、配列番号 2 2に示される配列を有する。

別の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子ワクチンにおいて、ュビキチンをコードする核酸配列と、抗原タンパク質をコードする核酸配列とは、介在配列なしに連結される。介在配列がないことによって、ポリュビキチン化が促進され、プロテアソームによるプロセシングが効率よくなるという効果が奏されるからである。従来介在配列が存在する方がプロセシングなどの点で優れてレヽるという報告があつたが、 T細胞ターゲット配列を含む抗原遺伝子をコードする配列を直接連結する方が、好ましいことが予想外に判明した。

より好ましくは、ュビキチンをコードする核酸配列と、抗原タンパク質をコードする核酸配列とは、介在配列なしに連結され、かつ、ュビキチンの C末端の G 1 yが G 1 y以外のアミノ酸に置換される。このような様式のュビキチン含有産物は、効率よくポリュビキチン化し、プロテアソームによるプロセシングが効率よく誘導されることが本発明によって明らかにされた。

従って、ュビキチンをコードする配列は、ュビキチンの N末端に、抗原タンパク質が融合されるように配置される。このような配置にすることによって、ポリュビキチン化が促進され、プロテアソームによるプロセシングが効率よくなるからである。従来この間には介在配列を介在させることが好ましいとされてきた（W098 / 45444等）が、本発明では、それとは逆に介在させず、 ffi合させることの方が所望の効果を達成するのに都合がよいことが判明した。

より好ましい実施形態では、本発明の遺伝子ワクチンでは、ュビキチンをコ一ドする配列は、ュビキチンの N末端に抗原タンパク質が融合されるように配置され、かつ、ュビキチンの C末端の G 1 yが G 1 y以外のアミノ酸に置換される。このような様式のュビキチン含有産物は、なおさらに効率よくポリュビキチン化し、プロテアソームによるプロセシングが効率よく誘導されるからである。

別の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子ワクチンにおいて、ュビキチンをコードする核酸配列は、ュビキチンが除去されない様式で融合されるように配置される。このような様式の代表例としては、ュビキ 'チンの C末端の G 1 y を G l y以外の配列に置換することが挙げられるがそれらに限定されない。ュビキチンの C末端の G l yは、標的配列との相互作用に役割を果たしていることから、その相互作用を阻害するように改変することによつても同様の効果を達成することができる。そのような阻害としては、全く異なる性質の配列を付加すること、あるいは、嵩高いアミノ酸配列を付加することなどが挙げられるがそれらに限定されない。

好ましい実施形態において、この遺伝子ワクチンは、 n a k e d D NAである（従って、ウィルスベクターを用いない）ことが有利であるが、それに限定されない。従って、本発明の遺伝子ワクチンは、任意のベクターを用いて運搬され得る。

従来技術では、 T細胞ターゲット配列を含む抗原（例えば、癌抗原）特異的な C D 8 ⁺陽性キラー T細胞を効率的に誘導するには、その前駆細胞が A P C上の MH Cクラス I分子と結合した T細胞ターゲット配列を含む抗原を認識して活性化される必要があるが、通常 A P Cクラス I分子上での腫瘍拒絶抗原提示レベルは低いとされている。本発明は、 A P Cクラス I分子上に T細胞ターゲット配列を含む抗原を効率的に発現させるために D N Aワクチンを導入し、さらに T細胞ターゲット配列を含む抗原遺伝子をュビキチン遺伝子とを含む遺伝子ワクチン（好ましくは、両者は融合化されている）を提供することによって

Τ細胞ターゲット配列を含む抗原をプロテアソーム系に運ぶことが可能である。本発明においては、 Τ細胞ターゲット配列を含む抗原をプロテアソームへの T a g分子であるュビキチン遺伝子とともに使用する（好ましくは、融合）することで、 T細胞ターゲット配列を含む抗原特異的キラー T細胞を主体とした強力な抗病原体（例えば、抗癌）免疫を誘導する。

メラノーマ、肺癌、胃癌等の癌抗原を含む病原体の抗原に対して特異的に C D 8 ⁺キラー T細胞を活性化させるためにはその抗原べプチドを抗原提示細胞の MH Cクラス I分子に提示させることが必須である。そのためには、例えば、メラノ一マ抗原を細胞質内酵素であるプロテアソームで処理させることが前提となる。本発明においては、プロテアソームへ導く T a g分子であるュビキチンをコードする遺伝子を T細胞ターゲット配列を含む抗原遺伝子と結合させ、例えば、遺伝子銃で細胞質内に直接その結合遺伝子を導入することにより細胞質内でメラノーマ抗原のような T細胞タ一ゲット配列を含む抗原とュビキチンとのタンパク質複合体（好ましくは融合体）を産生させるとともに、この操作によりメラノーマ抗原のような T細胞ターゲット配列を含む抗原に特異的な C D 8 +キラー T細胞を主体とした強力な抗病原体免疫を誘導させることが可能でめる

従来の組換えサイト力インタンパク質を用いた方法では、一度に大量投与を必要とするため副作用が強く、臨床応用が困難な場合が多い。しかし、遺伝子銃を用いたサイトカイン遺伝子治療法では、目的とするタンパク質が少量かつ持続的に一定期間供給されるため安全性が高く、連日投与の必要がなく、かつ効果的である。

本発明により、発現されるタンパク質は大腸菌で合成される組換えタンパク質と異なり、投与される宿主における好ましい翻訳後修飾がなされることから、

フ 9 発現タンパク質への糖鎖の付加が起こり、本来のタンパク質構造が保たれる

1つの実施形態において、本発明の遺伝子ワクチンは、 T細胞ターゲット配列に関連する疾患または障害を処置または予防するためのものである。このような疾患または障害としては、例えば、寄生生物に関連する疾患または障害、ウィルス疾患または障害、細菌性疾患または障害、新生物（癌など）などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、本発明は、癌を処置するための遺伝子ワクチンを提供する。癌抗原遺伝子をュビキチンをコードする配列と連結することによって予想外にプロテアソームによる癌細胞の効率よい分解という現象が確認されたからである。

特定の実施形態において、本発明の遺伝子ワクチンは、メラノーマ、肺癌、胃癌、乳癌、肝癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、骨腫瘍、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、卵巣癌、膝臓癌、大腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、皮膚癌、腎腫からなる群より選択される腫瘍を処置するためのものである。理論に束縛されないが、これらの癌は、 T細胞ターゲット配列をおおむね有しており、その配列とュビキチンをコードする配列とを連結することによって本発明の効果が奏されることが示されたからである。

別の好ましい実施形態において、本発明の遺伝子ワクチンは、抗原タンパク質に起因する疾患に対して保護免疫を与える。従って、本発明の遺伝子ワクチンは、そのような疾患に対する予防を提供する。保護免疫を与えるかどうかは、中和抗体の生成などを観察することによって判定することができる。

別の好ましい実施形態において、本発明の遺伝子ワクチンは、抗原タンパク質に起因する疾患に対して治療効果を与える。

1つの実施形態において、本発明の遺伝子ワクチンは、 C D 8 + T細胞を誘導する。理論に束縛されないが、本発明において用いられる T細胞ターゲット配列は、この C D 8 +細胞の刺激を介して、 C T Lによる標的細胞または病原体の分解を行うことができる。

好ましい実施形態において、本発明の遺伝子ワクチンは、針なし注射によつて投与される。針なし注射は、核酸形態の因子を体内に投入する際には、一般的に利用されており、本宪明は、そのような無痛の、従って、投与される患者に苦痛をほとんど与えることなく、効率よい治療効果または予防効果を提供することができるという効果を奏することになる。針なし注射は、当該分野において公知の任意の技術を用いることができる。そのような技術の例示は、本明細書において他の場所において行ったとおりである。

好ましい実施形態において、本発明の遺伝子ワクチンは、粒子をさらに含む。このように粒子を含むことによって、本発明の遺伝子ワクチンは、遺伝子銃により適した形となるからである。より好ましくは、ここで使用される粒子は、金粒子であることが有利であるがそれに限定されない。金粒子は形質転換効率が高いことからよく使用される粒子である。

別の局面において、本発明は、本発明の遺伝子ワクチンまたは遺伝子構築物を製造するための方法であって、ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを作動可能に連結する工程を包含する、方法を提供する。ここで、ュビキチンおよび T細胞タ一ゲット配列については、上述したとおりである。このような 2つの配列を作動可能に連結することもまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。

(治療方法および予防方法）

別の局面において、本発明は、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質に起因する疾患を予防または処置するための方法を提供する。この方法は、 A) ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、遺伝子ワクチンを患者に投与するェ程、を包含する。ここで、本発明の治療方法または予防方法において用いられる遺伝子ワクチンは、上述したような任意の形態を用いることができる。

1つの好ましい実施形態では、本発明の治療方法または予防方法において、遺伝子ワクチンは、遺伝子銃（g e n e g u n ) によって投与される。

遺伝子銃を行う方法は、当該分野において公知であり、市販される任意のデバイスを用いて実施することができる。 . ·

好ましい実施形態ではまた、本発明の遺伝子ワクチンは、針なし注射によつて投与される。針なし注射もまた、当該分野において公知であり、市販される任意のデバイスを用いて実施することができる。

本発明の治療方法および予防方法が対象とする疾患または障害は、 τ細胞ターゲット配列に関連する疾患または障害であれば、どのような疾患または障害でもよいが、例えば、ウィルス、細菌、真菌、寄生生物（原生動物、原虫、リーシュマニア、トキソプラズマなど）、新生物（例えば、癌）などに起因するものが挙げられるがそれらに限定されない。特定の実施形態では、本発明に係る遺伝子ワクチンは、主に、腫瘍疾患、具体的には、肝癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫および肺、結腸、乳房、膀胱、卵巣、精巣、前立腺、睾丸腫瘍、子宫、頸部、膝臓、胃、大腸、小腸、その他の器官の癌を包含する多様なタイプの癌や白血病等の治療あるいは予防に有効に使用できる。

本発明の治療方法および予防方法において、本発明の遺伝子ワクチンは、疾患の発症前またはその間あるいはその後に投与される。発症前に投与される場合、原則として、本発明は、予防目的に使用されることになり、発症後では、治療目的となるがそれに限定されない。本発明では、 1つの疾患または障害が処置対象であってもよいし、複数の疾患または障害が処置対象であってもよい。好ましくは、本発明の遺伝子ワクチンは、レトロウイルスを使用しないで投与される。レトロウイルスを使用しないことによって、レトロウイルスに特有の副作用（ウィルス疾患の発生など）を抑えることができるからである。これは、従来の治療法においてレトロウイルスがほぼ必となっていた状況を考えると、本発明の一つの顕著な効果であるといえる。

従って、本発明は、ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の、遺伝子ワクチンとしての使用を提供する。あるいは、本発明は、遺伝子ワクチンを製造するための、ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲ; ト配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の使用を提供する。ここで、ュビキチン、 τ細胞ターゲット配列、遺伝子ワクチンなどの詳細な説明は、上述したとおりであり、そのような好ましい実施形態は、実際の使用に応じて適宜任意の好ましい実施形態を選択して実施することができる。

(サイトカインと T細胞ターゲット配列との組み合わせ）

別の局面において、本発明は、 T細胞ターゲット配列を含む抗原遺伝子（例えば、癌抗原遺伝子）と、サイト力イン（例えば、 I L— 1 2、 I L— 1 5および I L _ 1 8から選ばれる少なくとも 1種のサイトカイン）をコードする核酸配列を含有する遺伝子ワクチンを提供する。

このような本発明の遺伝子ワクチンは、癌抗原遺伝子のような T細胞ターグット配列を含む抗原遺伝子をコードする配列と、 I L一 1 2、 I L一 1 5、 I L一 1 8から選ばれる少なくとも 1種のサイトカインをコ一ドする配列とを独立して別々にか、またはともに発現されるように核酸構築物中に含有することによって得ることができる。

ここで、 T細胞ターゲット配列は、上述したとおりであり、本明細書において記載される任意の実施形態のものを利用することができる。

また、サイトカインもまた、適宜選択することができ、サイトカインは、本明細書における好ましい活性（例えば、所望の病原体を殺傷する能力）を有してさえいれば、本発明のワクチンまたは医薬の好ましい実施形態において使用することができる。

好ましくは、サイトカインと抗原遣伝子との組み合わせの遺伝子ワクチンには、ュビキチンが追加で含まれていてもよい。そのような場合、抗原遺伝子とは、本明細書において他の場所において詳述されるような好ましい実施形態が利用される。

このような配列を有する遺伝子ワクチンは、当該分野において公知の技術を用いて実施することができる。そのようなワクチンの作製は、本明細書において他の場所において詳述される分子生物学的手法、生化学的手法および遺伝子工学的手法を応用することによって実施することができる。

本発明におけるサイトカイン遺伝子の含有量は、種々の要因により適宜変更できるが、マウス一匹（約 20 g ) 当たり、 2 /X g〜： L 0 μ g、好ましくは、 4 g〜6 μ gである。この範囲外になるにつれ抗癌腫瘍免疫効果が減弱する。抗原遺伝子およびサイト力イン遺伝子は、上述した RT— PC R法で構築されるが、この方法に限定されるものではない。具体的には、第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、 RNAから DNAを合成し、この後、 PCR 法により DNA鎖の特定部位のみ繰り返し複製し、微量の DNAを増幅した後、大腸菌に形質転換し、 37 °Cの恒温槽にて一晩（〜16時間）振盪培養を行う。その後、遠心を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を T r i s -HC 1 /EDT A溶液に溶解する。続いてアル力リ溶液 N aOH/SDS溶液にて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止める為中和溶液酢酸力リゥムにて中和する。その後、核酸精製用陰イオン交換樹脂カラムに溶液を 1 o a dし、 Na C 1/ 酢酸力リゥム溶液にてカラムを洗浄し、 N a C 1 ZT r i s— HC 1にて溶出する。尚、その遺伝子が実際に細胞内で発現することは、 c o s細胞に t r a n s f e c tして確認する。ここで、癌抗原遺伝子と I L— 12、 I L—15、 I L- 18から選ばれる少なくとも 1種のサイトカイン遺伝子は、 1 ： 1で混合させるのが好ましいが、種々の条件により適宜変更できる。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。実施例

以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、これらの例は単なる実例であって本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変更させてもよい。

(実施例 1 )

本実施例において、ュビキチンをコードする遺伝子と癌抗原遺伝子とを結合した遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（UB— TRP— 2) を調製した。

UB— TRP— 2遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌 DH 5 αに形質転換し、 LB培地 50 Om 1中で 37°Cの恒温槽にてー晚（：〜 16時間）振盪培養を行った。

次いで、 4°C、 12000 r pmにて 10分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を 5 OmMT r i s— HC 1 (pH8. 0) /10 mM EDTA溶液 1 Om 1に溶解した。続いて、アルカリ溶液 200 mMN a OH/l%SDS溶液 1 Om 1にて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液 3. 1M酢酸カリウム（pH5. 5) 10mlにて中和した。その後、 60 OmMN a C 1 Z10 OmM酢酸ナトリウム（pH5. 0) 3 Omlにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（MARL I GEN B I OS C I ENCE I NC. 製）に中和溶液を室温にて 1 2000 r p m で 1 0分間、遠心分離を行った上清を 1 o a dし、 800 mM N a C 1 / 10 OmM酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、 1. 2 5M Na C l /1 00m MT r i s -HC 1 (pH8. 5) にて溶出した。

(実施例 2)

本実施例において、癌抗原遺伝子と I L— 1 2遺伝子からなる癌遺伝子ワクチン（TRP— 2+ I L— 1 2) を調製した。

TRP— 2遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌 DH 5 αに形質転換し、 L Β培地 500 m 1中で 3 7 °Cの恒温槽にて一晩（〜 1 6時間）振盪培養を行つた。

次いで、 4°C、 1 2000 r p mにて 1 0分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を 5 OmMT r i s— HC 1 (pH8. 0 ) / 1 0 mM EDTA溶液 1 0m 1に溶解した。続いて、アルカリ溶液 200 mMN a OH/l%SDS溶液 1 Om 1にて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液 3· 1M酢酸カリウム（pH5. 5) 1 0m lにて中和した。その後、 60 OmM Na C 1 I 00 mM酢酸ナトリウム（pH5. 0) 3 Om lにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（MARL I GEN B I OS C I ENCE I NC. 製）に中和溶液を室温にて 1 2000 r p m で 1 0分間、遠心分離を行った上清を 1 o a dし、 800 mMN a C 1 / 1 0 OmM酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、 1. 2 5M Na C l /1 00m MT r i s—HC l (pH8. 5) にて溶出した。

同様の方法にて、 I L_ l 2遺伝子を含有する発現プラスミドを培養、精製を行った。

このようにして得られた癌抗原遺伝子（TRP— 2) と、 I L一 1 2遺伝子を 1 ： 1で混合し、.癌抗原遺伝子と I L一 1 2遺伝子からなる癌遺伝子ヮクチン（TRP— 2+ I L— 12) を調製した

(比較例 1 )

本比較例において、癌抗原遺伝子からなる癌遺伝子ワクチン（TRP— 2) を調製した。

TRP— 2遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌 DH 5ひに形質転換し、 L B培地 500ml中で 37 °Cの恒温槽にて一晩（〜 16時間）振盪培養を行った。

次いで、 4°C、 12000 r p mにて 10分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を 5 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) /10 mMEDTA溶液 1 Om 1に溶解した。続いて、アルカリ溶液 20 OmM Na OH/l%SDS溶液 1 Om 1にて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液 3. 1M酢酸カリウム（pH5. 5) 10mlにて中和した。その後、 60 OmM N a C 1 /100 mM酢酸ナトリウム（pH5. 0) 3 Om 1にて平衡ィ匕した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（MARL I GEN B I OSC I ENCE INC. 製）に中和溶液を室温にて 12000 r p m で 10分間、遠心分離を行った上清を 1 o a dし、 800 mMN a C 1 /10 OmM酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、 1. 25MNa C l/100m MT r i s— HC 1 (pH8. 5) にて溶出した。

(比較例 2)

本比較例において、 I L— 12遺伝子からなる癌遺伝子ワクチン（I L_ 1 2) を調製した。

I L一 12遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌 DH 5 αに形質転換し、 L Β培地 500 m 1中で 37 °Cの恒温槽にて一晚（：〜 16時間）振盪培養を行った。次いで、 4°C、 12000 r pmにて 10分間、遠心分離を行い、上清を捨て、沈殿物である菌体成分を 5 OmMT r i s— HC 1 (pH8. 0) /10 mMEDTA溶液 1 Om 1に溶解した。続いて、アルカリ溶液 200 mMN a OH/l%SDS溶液 1 Om 1にて菌体成分を溶菌し、溶菌後、反応を止めるため、中和溶液 3. 1M酢酸カリウム（pH5. 5) 10mlにて中和した。その後、 60 OmM Na C 1 /100 mM酢酸ナトリウム（pH5. 0) 3 Omlにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（MARL I GEN B I OSC I ENCE INC. 製）に中和溶液を室温にて 12000 r p m で 10分間、遠心分離を行った上清を l o a dし、 800 mMN a C 1 /10 OmM酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、 1. 25MN a C 1ノ10 Om MTr i s -HC 1 (pH8. 5) にて溶出した。

(実施例 3)

実施例 1、実施例 2およぴ比較例 1、比較例 2で調製した癌遺伝子ワクチン (0. 3mg/k g) を、マウスメラノーマ（B 16F 10) を担癌した 10 週齢の C57BL/6 (B 6) 雌マウスに対して、遺伝子銃（g e n e g u n) を用いて、腹部皮下に 1週間ごとに導入し、 3日おきに腫瘍の大きさを観察した。尚、マウスは一群につき 6匹を用い、担癌（c h a l l e n g e) した日を d a y Oとした。 Ch a 1 1 e n g eしたメラノーマ細胞数は、マウス —匹当たり 2X 10⁵個である。遺伝子ワクチンの導入は d a y 2より開始した。これにより、どの癌遺伝子ワクチンが DN Aワクチンによる癌免疫治療に効果的かを調査した。その結果を図 1に示す。図 1は DN Aワクチンによる癌免疫治療効果を示すグラフである。

図 1の（1) は対照群（非処理群）における測定結果を示し、（2) は実施例 1 (UB— TRP— 2遺伝子導入群）における測定結果を示し、（3) は比較例 1 (TRP_ 2遺伝子単独導入群）における測定結果を示し、（4) は比較例 2 (I L一 12単独導入群）における測定結果を示し、（5) は実施例 2 (TRP 一 2遺伝子と I L—12遺伝子の共導入群）における測定結果を示す。ここで、図 1の（1)、 (5) 中、横に並んだ秦は、腫瘍の大きさが同じであることを表してレヽる。

図 1より、（1) の対照群（非処理群）での C 57BL/6 (B 6) マウスのメラノーマは経時的に増大するのに対し、実施例 1および実施例 2の C 57 B L/6 (B 6) マウスのメラノーマは 25日目においてもほとんど生着せず、著しい抗腫瘍効果が認められた。一方、比較例 1および比較例 2での B 6マウスのメラノーマにおいては、遺伝子導入の効果は認められなかった。

また、実施例 1、実施例 2におけるワクチンをマウスへ導入した際、導入局所にわずかに脱毛が見られる程度で、全身状態に全く悪影響を及ぼさず、無害であった。

更に、実施例 1、実施例 2および比較例 1、比較例 2におけるワクチンの導入は、全て正常組織部位への導入であり、必ずしも発癌部位への導入を必要とせず、発癌部位と正常組織部位のどちらにも効果的であつた。次に、 DN Aワクチンによるメラノーマの肺転移効果を調べた。尚、この実験では一群 4匹を用い、担癌 14日目（d a y l 4) に 2X 10⁵のメラノーマを静脈内に移入し、肺での転移数をカウントした。その結果を表 1 (表 1) に示す。【表 1】

表 1より、非処置（c o n t r o l ) マウスでは一匹あたり 204個の転移腫瘍（メラノーマ）が認められたが、 UB— TRP— 2遺伝子導入群ではわずか 3 7個であった。また、 TRP— 2+ I L— 1 2群では非処置群と有意差が認められなかった。すなわち、本発明における DN Aワクチン治療法が転移癌抑制効果が認められた。

このように、本発明の遺伝子ワクチンを用いた場合、 CD 8+T細胞に対する抗原提示は、細胞上に発現される MHCクラス I分子により媒介される。最初に、 CD 8+T細胞は、細胞質に局在する癌遺伝子産物またはウィルス抗原のような内在性抗原に由来する MHCクラス I関違ペプチドを認識する。 MHCクラス I分子による抗原提示の前に、抗原はュビキチン化され、ついでプロテアソームにより抗原性ぺプチドに処理されなければならない。

本発明者らは、全長マウス TRP— 2 (mTRP- 2) の N末端にマウスュビキチン（UB) を連結させた融合タンパク質をコ^ "ドするキメラ DNAを構築し、これを pUB— TRP— 2と命名した。次いで、 B 6マウスから得た B 1 6メラノーマ細胞の接種の前または後に、キメラ n a k e d DNAを含む遺伝子銃（g e n e g u n) を用いて B 6マウスを免疫した。このストラテジ一は、 UFD (UB融合分解）経路（ュビキチン一プロテアソーム系の実質的経路）による細胞タンパク質が迅速に分解されるという知見に基づく。この

DNAワクチン技術を使用することによって、本発明者らは、宿主マウスにおいて、 C D 8 + T細胞によつて媒介される抗腫瘍免疫を誘導することに成功した。興味深いことに、この DNA免疫によって誘導される抗腫瘍免疫は、プロテアソームァクチベータ一 PA2 8 αΖ の欠損したマウスにおいて、ほぼ完全に消失した。したがって、ュビキチン融合型 mTRP— 2が、プロテアソーム依存性分解に mTRP— 2を導入すること、および MHCクラス Iによって提示されるェピトープを構成し、 mTRP— 2特異的 CD 8 +T細胞の優先的な活性を得ることにおいて、重要な役割を担っていることを示す。

(実施例 4)

本実施例において、担癌動物への DNAワクチンがキラー T細胞を効果的に活性化していることを測定した。

C 5 7 B LZ6マウス由来の E L— 4細胞に TRP— 2ぺプタイドを付着させたものを標的細胞とし、クローム遊離法によりキラー T細胞活性を測定した。その結果を図 2に示すが、このアツセィには、図 1の d a y 25のマウス（一群 6匹）を用いその平均値を示す。

図 2は DN Aワクチンによるキラー T細胞の活性ィ匕を示すグラフである。

図 2の（a) は TRP— 2ぺプタイドを付着させていない EL— 4細胞を用いてキラー T細胞活性を測定した結果を示し、 n e g a t t i v e c o n t r o lを表す。（b) は TRP— 2ぺプタイドを付着させた EL— 4細胞を標的細胞として用いた K i l l e r T c e l l a s s a yの測定結果を示す。図 2の（2) より、実施例 1の UB— TRP— 2群では強いキラー T細胞活性が認められた。一方、比較例 1の TRP— 2単独群では、わずかに活性が認められたが、対照群の UB遺伝子単独処置群では全く活性が認められなかった。 (実施例 5)

本実施例において、抗腫瘍効果がュビキチンプロテアソーム系を介してであることをプロテアソーム阻害剤を用いて調べた。

実施例 1で調製された UB—TRP— 2を COS 7細胞にトランスフヱクトし、その後、トランスフエタトした細胞にプロテアソーム阻害剤である MG— 1 3 2を添加した。細胞を 3 7°Cにて 5%C0₂存在下で培養後、細胞を溶解し、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その後、 PVDF膜に転写し、抗体にて抗原を確認した。

プロテアソーム阻害剤 MG— 1 32非存在下では抗原を確認することができないが、阻害剤存在下では量依存的に抗原パンドが強く確認された。この結果より、ュビキチン化した抗原は阻害剤非存在下では、ュビキチン一プロテアソーム経路により抗原は速やかに分解され、 MHCクラス Iを介して CD 8 +T細胞を活性化することが示唆された。

(実施例 6)

本実施例は、ュビキチン一プロテアソーム経路に基づく DNAワクチンによるメラノーマに対する免疫療法を実証する。 . (動物および腫瘍）

本努明者らは、九州大学（F u k u o k a、 J a a n) の施設ガイドラインに従ってマウスの研究を行った。 8週齢の雌性 C 57 B LZ6マウスを、 S LC (Ha ma ma t s u, J a p a n) から購入した。 C 5 7B L/6パックグラウンドの、プロテアソームァクチベータ一 (野生型) マウス、ノックァゥト（PA28 α β '^χ')マウスを、本発明者らのグループによって確立した（Μ u r a t a, S. ら、 EMBO J . 20， 58 98- 5 90 7 (200 1))。マウスメラノーマ細胞株の B 1 6 F 1および B 1 6 F 1 0を、 1 0%ゥシ胎仔血清、 1 0 0 I U/m 1ペニシリン、 1 00 ^ g/m 1ストレプトマイシン、 2 OmM N— 2—ヒドロキシェチノレビペラジン一N，一 2—エタンスノレホン酸、 50mM NaHC0₃および 2mM L—グルタミンを補充した R PM I 1 640培地に維持した。 B 6マウス由来の肺癌腫 3 LL細胞株を、コント口ール腫瘍として使用した。

(プラスミドの構築）

マウス TRP— 2 (mTRP- 2) をコードするプラスミドを以下のとおり構築した：全 RNAを、 B 1 6 F 1細胞から分離し、そして cDNAに逆転写した。次いで、 TRP— 2 cDNAを、センスプライマー 5 ' — GAATC

3，（配列番号 23) およびアンチセンスプライマー 5，一 CCATGGAT

番号 24) を用いた PCRによって増幅した。 TRP— 2 cDNAの PCR 産物を、 p c DNA3. 1 (一）ベタター（I n v i t r o g e n、 S a n D i e g o、 CA、 DNA)の No t I部位おょぴ B a mH I部位内に挿入した。 C末端の G l y残基を A l aに置換（G 76 A) した変異ュビキチンをコードする遺伝子を、 BALB/cマウスの肝臓から得たゲノム DNAにより PCR によって増幅させ、そして p c DNA3. 1 (―) の E c o R I部位おょぴ B a mH I部位内に挿入した。 TRP— 2をコードする遺伝子を、センスプライ

TGGGCCTTG— 3 ' (配列番号 23)およびアンチセンスプライマー（配列番号 24)として同一プライマーを用いる PCRによってさらに増幅させた。次いで、この変異ュビキチン c DNAを、インフレームに TRP— 2をコードする遺伝子の 5，側に連結し、そして p cDNA3. 1 (一）の B amHI部位内に挿入した。

(インビトロでの遺伝子移送おょぴメラノ一マ細胞の移植）

本発明 ¾"らは、以肓 Uに記載した (Nishitani,M.A. ら、 Cancer Gene Ther.9, 156-163 (2002)、Sakai,T. ¾ , Immunol .99 , 615-24 (2000)、およぴ Sakai,T.ら、 Vaccine 21,1432-1444 (2003) ) ように、 H e 1 i o s G e n e Gun (B i oRa d, NY, USA) を使用した。要するに、プラスミド DNAを、 1. 6 gの金粒子上に沈殿させ、そしてチューブローダによってチュービングの内表面上にコートした。最終的なチュービングセグメントは、一回のトランスフエクシヨンあたり、 0. 125m gの金粒子おょぴ 2 μ gのプラスミド DNAの送達を生じた。 pTRP— 2、 pUB-TRP- 2 または p c DNAを、剃毛した異常な皮膚の 3つの異なる部分に、一週間隔で 3回移送した。総量 18 gのプラスミドを各マウスに投与した。最後のワクチン接種の一週間後に、 0. 1mlの PBS中、 2 X 10⁵個のメラノーマ細胞を、 B 6マウスの腹部中央に皮下移植した。 JS瘍サイズは、キヤリパーを用いて一週間に 2回測定し、そして Na n n iらの式： πΖ6 X {(a X b) ^1/2} ³ を用レヽて計算した (Nanni,P.et al . , Cencer Res . 58, 1225 - 1230 (1998))。ここで、 aおよび bは、腫瘍の、直角をなす 2つの主な直径である。肺転移の実験のために、 B6マウスを、 0. 2mlの PBS中、 2 X 10⁵個の B 16F 10細胞で、静脈内チャレンジした。チャレンジの 2週間後、マウスを屠殺し、両方の肺の全葉を切り出し、そして転移性腫瘍を数えた。治療試験のために、 0. 1mlの PBS中、 5 X 10⁴個の B 16 F 1細胞を、 0日目の B 6マウスの腹部領域に皮下移植した。 pTRP— 2、 pUb—TRP 2または p cDNAを、腫瘍移植部位のうちの 1つの、剃毛した異常な皮膚の 3つの異なる部分に 3回移送した。処理を 1日目に開始し、そして 1週間に 2回、 2 週間にわたって適用した（合計 5回)。各群は、 8匹のマウスからなる。

(インビトロトランスフエクションおよびウェスタンプロット）

2. 5 c mティッシュ (Nu n c、 R o s k i 丄 d e、 D e nma r k の 500000個の CO S 7細胞を、 L i p o f e c t am i n e (I n v i t r o g e n) を用いることによって、 2 /x g p T R P— 2でトランスフエタトした。トランスフエクシヨンの 24時間後、細胞溶解物を、 200 μ 1の可溶化緩衝液 ( 5 0 mM T r i s— HC 1、 1% N o n i d e t P— 4 0ノ1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、 1 μΜ ロイぺプチン/ Ι Ο Ο μ Μ フエ二ルメチルスルフォ-ルフルオリド、 1 μΜ ぺプスタチン Α、および Ι Ο Ο μΜ エチレンジアミンテトラ酢酸）の添加によって調製し、そして l O gのタンパク質を、 1次抗体として抗 HA抗体（マウスモノクローナル抗体クローン 1 2 CA5、 R o c h e、 M a n n h e i m、 G e r ma n y) と共にウェスタンプロットのために使用した。ペルォキシダーゼ結合体化抗マウス免疫グロブリン G ( I g G) (H+L) (Z y me d L a b o r a t o r i e s、 S a n F r a n c i s c o、 CA、 USA) を、二次抗体として使用した。結合抗体を、増強化学発光（e n h a n c e d c h e m i 1 urn i n e s c e n c e) C L) g¾薬 {Άΐα e r s h am L i f e S c i e n c e、 B u c k i n g h ams h i r e, UK) を用いて検出した。

(細胞毒性アツセィ）

マウス'を腫瘍チャレンジに際して屠殺し、それらの脾細胞（4 X 1 0⁷個）を、完全 RPM I 1 640培地の入った 6ゥエル培養プレートにおいて、 mTRP — 2₁₈₁_₁₈₈ (4 μ g/m l ) と共培養した。培養の 5日後、 mTRP— 2₁₈ i- sペプチド（4 g/m l ) で、 2時間にわたってパルスした、非常に多数の生存可能なエフェクター細胞おょぴ [³H] チミジンで標識した EL— 4細胞 JP2003/013279

(1 0⁴個）を、丸底の 9 6ゥエルプレート中に入れた。 4. 5時間のインキュベーシヨン後、これらの培地をガラス繊維フィルター上に回収し、そして放射能を /3シンチレーションカウンターを用いてカウントし、先に記載したように特定の殺傷を計算した（Ma t z i n g e r , P. ら、 J . I mmu n o 1. Me t h o d s 1 4 5, 1 8 5— 1 92 (1 9 9 1))。

(ィンビポでの T細胞サブセットの枯渴）

抗 CD4 mAb (クローン GK1. 5) または抗 CD 8 mAb (クローン 53— 6. 7 2) を、腫瘍チャレンジの 3日前、 1日前、 1日目および 3日目に、 0. 5 mg/マウスに腹腔內注射した。腫瘍細胞を、 0日目に接種した。各 T細胞サブセットの枯渴を、フローサイトメトリーによって確認し；適切な細胞サブセットの 98 %以上を枯渴させた。

(結果）

(プロテアソームによるュビキチン融合型 TRP— 2の迅速な分解）

変異抗原およびウィルス抗原のような内在的に合成された大部分のぺプチドを、細胞基質プロテアーゼであるプロテアソーム、引く続くこれらの抗原のュビキチン化、次いで MHCクラス I分子への提示によって処理し、 CD8+T細胞に対応する活性化を生じさせる。従って、人工的にュビキチン化した mTR P— 2は、プロテアソームに指向され、かつ MHCクラス I分子に効率的に提示されるべきである。このシナリオを確認するために、本発明者らは、 C末端を HAェピトープでタグ化した全長 TRP— 2タンパク質をコードする p TR P— 2 (TRP— 2HA)、および細胞のュビキチン C末端加水分解酵素によつて切断されないように TRP— 2—HAのインフレームで改変した（G76A) ュビキチンをコードする pUB— TRP— 2の発現ベクターを調製した（図 3 A)。各タンパク質は、 C末端に HAタグを有する。 p TRP— 2または pUB 一 TRP— 2でトランスフエタトした COS 7細胞を、プロテアソームインヒビターの MG—132の存在下または非存在下で培養した（図 3B)。 MG13 2の非存在下において、 UB— TRP— 2融合タンパク質の発現は、 TRP— 2の発現よりもかなり低かった。しかし、この細胞を MG 132で処理した場合、 UB— TRP— 2のレベルは、 TRP— 2のレベルと同レベルまで回復した。これらの結果は、 UB— TRP—2タンパク質が TRP— 2と比べて不安定であり、そしてプロテアソームによって迅速に分解されることを示唆する。

(B 16メラノ一マに対する抗 JB瘍免疫）

mTRP— 2₁₈₁― ₁₈₈を含む CTLェピトープを、ュビキチン一プロテアソ一ム系路によって生成する（Mu r a t a, Sら、 EMBO J . 20， 58 98-5907 (2001))。それゆえ、本発明者らは、 MHCクラス I関連 TRP— 2ペプチドの、 CD 8 +T細胞に対する抗原提示が、ュビキチン融合型 TRP— 2を用いるヮクチン接種の後に、有意に効果的になることを予測した。 C57BL/6マウスを、 pTRP— 2または pUB— TRP— 2を用いて、遺伝子銃を使用して 1週間隔で 3回、かつマウス 1匹あたり 18 gプラスミドの全用量で免疫した。最後の免疫の 1週間後、マウスを 2 X 10⁵個の B 16 F 1細胞で皮下的にチャレンジした。コントロールマウスおよび p TRP— 2 で免疫したマウスは、迅速な腫瘍増殖を示した。一方、 pUB— TRP— 2で免疫したマウスの 85%は JB瘍を有さないが、残りの 15%のマウスは腫瘍増殖のほぼ完全な抑制を示した（図 4A)。厳密に言えば、他の 2つ群の全てのマウスは 60日以内に死亡したにもかかわらず、 pUB— TRP— 2で免疫した全てのマウスは、腫瘍細胞の移植後 80日以上にわたって生存した（図 4B)。さらに、 pUB— TRP— 2での免疫はまた、より悪性型メラノーマである B 16F10メラノーマ細胞の増殖を抑制するのに効果であった（図 4 C)。 pU B-TRP- 2で免疫したマウスの 43%が、 B 16 F 10腫瘍細胞の移植後 45日以上にわたって生存したが、他の 2つの群の全てのマウスは 3 5日以内に死亡した（図 4D)。 B 1 6 F 1 0細胞の肺転移性腫瘍の数は、コントロールまたは p TRP— 2で免疫したマウスにおいてよりも p UB— TRP— 2で免疫したマウスにおいて有意に低かった（図 4 E)。他方、 B 6マウスにおける p UB— TRP— 2を用いた免疫は、 TRP— 2抗原を発現しない 3 LL肺癌腫細胞の腫瘍形成に影響を与えなかった（図 4F)。このことは、 pUB— TRP 一 2ワクチンにより獲得された抗腫瘍免疫が、メラノーマ細胞に特異的な事象であることを示している。これらの結果は、腫瘍増殖、生存率および肺転移によって評価されるように、ュビキチン融合型 TRP— 2タンパク質のインビボでの強制発現が、ネイティブ TRP— 2タンパク質の強制発現よりも効果的に B 1 6メラノーマに対して抗腫瘍免疫を誘導することを示す。

(pUB— TRP— 2におけるェフエクタ一細胞は抗腫瘍免疫を誘導する）本発明者らは、 pUB— TRP— 2を用いた免疫が、コードタンパク質の、プロテアソームによる効率的な抗原処理によって抗原特異的 CD 8+T細胞を優先的に活性化したことを推測した。観察された保護免疫におけるエフヱクタ一細胞を決定するために、本発明者らは、 pUB— TRP— 2で免疫したマウスを、対応する T細胞サブセットを枯渴させるために抗 CD4および抗 CD 8 抗体を用いて処理し、次いで、これらのマウスに B 1 6 F 1細胞を移植した。予測したように、抗 CD 8抗体での処理は pUB— TRP— 2免疫によって誘導される抗腫瘍免疫を完全に回避した（図 5)。対照的に、コントロール I g G (抗 CD 4抗体）での処理は腫瘍増殖を減少させなかった。このことは、 pU B— TRP— 2免疫により誘発される抗腫瘍免疫が、 MHCクラス I分子に提示された TRP— 2ェピトープを認識すべき腫瘍特異的 CD 8 +T細胞によつて媒介されることを示した。 (PA28 a j3_z一マウスにおける pUB— TRP— 2を用いた免疫による抗腫瘍免疫誘導の欠損）

pUB— TRP— 2により誘導される抗腫瘍免疫におけるプロテアソームの役割を明らかにするために、本発明者らは、 PA28 α 一マウスを使用した。なぜなら、主要な抗原ペプチドの 1つである TRP— 2₁₈₁_₁₈₈は、 ΡΑ28 により活性化されるプロテアソームによって生成されるからである（Mu r a t a , S. ら、 EMBO J . 20， 585 9— 5 9 0 7 (200 1))。 pU B— TRP— 2で免疫した PA 28 a j3^_/—マウスは、同一のプラスミドで免疫した野生型 B 6マウスと比較して、 B 1 6 F 1 0腫瘍チャレンジに対して著しく感受性であった（図 6A)。腫瘍増殖の結果と一致して、 TRP— 2₁₈₁― ₁₈₈ ェピトープに対する CTL活性は、野生型マウスよりも、 pUB— TRP— 2 で免疫した P A 28 a J3— ^/_マウスの方が低かった（図 6 B)。これらの結果は、 PA28により活性化されたプロテアソームが、 111丁1 ?ー2特異的。丁1^ぉよび pUB— TRP— 2を用いた DNAワクチン接種後の抗腫瘍免疫の誘導において重要な役割を果たすことを証明する。

(プラスミド D N Aを用いた免疫によるメラノーマに対する治療効果）臨床適用の観点から、ワクチン接種の前に移植したメラノーマに対する、この DN Aワクチン接種方法の治療効果を試験することはより重要である。この効果を試験するために、ワクチン接種の前（0日目）に、 B 1 6 F 1メラノ一マ細胞を B 6マウスに移植した。 p TRP— 2、 pUB— TRP— 2またはモックプラスミドを用いた処置を 1日目に開始し、次いで、続く 2週間の間、週 2回繰り返した。図 4に示すように、 pUB— TRP— 2を用いたマウスの免疫は、モッタプラスミ.ドまたは p TRP— 2プラスミドで免疫したマウスと比較して腫瘍増殖の著しい抑制を示した。これらの結果は、 DNAプラスミドを用いた免疫は、腫瘍の発症後でさえ効果的であり、従ってメラノーマに対する JP2003/013279

その潜在的な臨床効果を期待させるメラノーマの場合、免疫による治療効果を妨げる最も大きな問題は、腫瘍拒絶抗原が自己抗原であることであるとされていた。本発明者らは、本実施例において、自己抗原に対する寛容が提示されたェピトープ量を增加させることにより破壊されることを示した。本発明者らは、本発明により強化したュビキチン融合物分解（UFD) 経路を適用し、ュビキチンと全長 mTRP— 2との間の「除去されない」融合タンパク質をコードする n a k e d DNAを提供する。ュビキチン融合型 TRP— 2タンパク質は、ュビキチン一プロテアソーム経路に対する優れた基質に変換される（図 3B)。さらに、強力な抗腫瘍免疫は、腫瘍増殖の抑制、生存率おょぴ肺転移によって見積もられるように、低悪性型の B 16 F 1メラノーマ細胞おょぴ高悪性型の B 16 F 10メラノーマ細胞の両方に対して誘発される（図 4)。 CD8+T細胞の枯渴（図 5) およびプロテァソームァクチベータ一 PA28 α ]3の欠損（これは、主要な TRP—2ェピトープ（TRP— 2₁₈₁_₁₉₃) のプロテアソーム依存性の処理にとって前提条件である）（図 6) は、ワクチン接種の効果を妨げることが分かる。従って、この保護免疫は、プロテアソームによるェピトープの処理を促進した後のメラノ一マに特異的な C T Lの誘導に起因することが示される。メラノーマは、最も一般的な癌のうちの 1つであり、かつ最も重篤な型の皮膚癌である。本発明者らは、メラノーマ処置のためのこの DNAワクチンの能力を調べ、そしてこのストラテジ一がマウスにおけるメラノーマ細胞の移植後でさえ有用であることを実証した（図 7)。本発明者らは、ここで、全長ヒト Τ RP— 2およびヒトュビキチンとの間の融合タンパク質をコードする n a k e dキメラ DNAを用いた遺伝子による免疫が、メラノーマ患者において強力な保護免疫を誘導することを目的とした臨床試験について可能なストラテジ一のうちの 1つであることを実証した, 本発明者らは、本実施例により、全長ヒト TRP— 2およぴヒトュビキチンとの間の融合タンパク質をコードする n a k e dキメラ D N Aを用いた遺伝子による免疫が、メラノーマ患者において強力な保護免疫を誘導することを目的とした臨床試験について可能なストラテジ一のうちの 1つであることを提案した。全長自己 TRP— 2で免疫は、ヒト TRP— 2₁₈₁― ₁₈₈のような 8〜9マ一ペプチドを用いる通常のワクチンストラテジ一よりも優れた多くの利点を提供する。

(実施例 7)

本実施例は、ュビキチン一プロテアソーム経路に基づく DNAワクチンによるマウス Lew i s肺癌腫（3LL) に対する免疫療法を記載する。 (UM1+UM2 Immプラスミドの構築）

本発明者らは、 3 LLの抗原である MUT— 1 (P h e -G 1 u-G 1 n- G 1 n— A s n-Th r—A 1 a— G 1 n_P r o (配列番号 204) および MUT- 2 (Ph e— G l u-G 1 n— G l n—As n—Th r— Al a— G I n— A l a (配列番号 205)) の N末端にュビキチン（UB) を連結させた融合タンパク質をコードするキメラ DNA (UMu t 1および UMu t 2) を構築し、これを UM1+UM2 Immと命名した。 GGGATCC (配列番号 206)

(配列番号 208)

MUT 1および MUT 2は、 Kb制限された腫瘍関連抗原（TAA)であり、これは、ギャップ結合タンパク質コネキシン（C o n 3 7) の変異である。 M UT 1は、マウスギャップ結合タンパク質 C o n 3 7において、高度に保存された Cy s 54から G 1 n 54への変異によって誘導される。 MUT 2は、 M UT 1に近い相同体であり、 C o n 37の 5 9位において P r o力ら A 1 a (図 8) への変異を有している。

(UM1 +UM2 I mmを用いたワクチン接種による抗原特異的抗腫瘍免疫の誘導）

C 5 7 B L/6マウスを、発現ベクター p c DNA3. 1にュビキチン配列のみ（抗原遺伝子非融合）（UB*)、 UM1 +UM2 I mmプラスミドら μ g/l回の用量（それぞれ、 3 gの UB— MUT 1および UB— MUT 2)) を組込んだベクターを用いて、一週間隔で 3回にわたって免疫した。最後の免疫から 1 0日後に、 2 X 1 0⁵個の 3 LL腫瘍細胞を、全群のマウスの f o o t p a dに移植した。チャレンジしたマウスの f o o t p a d膨張を、 1週間に 3回測定した。一週間隔で 3回のチャレンジから 28日後にマウスを屠殺し、そしてマウスの肺重量を測定した。 UM1 +UM2 I mmを用いて免疫した C 5 7B LZ6マウスにおける f o o t p a d膨張サイズの増大は、 UB*群のマウスと比較して有意に少なかつた。肺重量の結果も同様の傾向が見られた。このことから、 UM1 +UM2 I mmは、マウス L ew i s肺癌腫（3 LL) に対して腫瘍抑制効果を有することが示唆された。 (P A28 a i3一 —マウスにおける UM1 +UM2 I mmワクチン接種により弱められた抗腫瘍免疫）

PA28 α β一 Z-マウスを、発現ベクター p c DNA3. 1に UM1 +UM2 I mmプラスミド（6μ gZl回の用量（それぞれ、 3 μ gの UB— MUT 1おょぴ UB— MUT 2)) を組込んだベクターを用いて、一週間隔で 3回にわたつて免疫した。最後の免疫から 10日後に、 2 X 1 0⁵個の 3 LL腫瘍細胞を、全群のマウスの f o o t a dに移植した。チヤレンジしたマウスの f o o t p a d膨張を、 1週間に 3回測定した。一週間隔で 3回のチャレンジから 28 日後にマウスを屠殺し、そしてマウスの肺重量を測定した。肺重量の結果も同様の傾向が見られた。コントロール群として、ワクチンに用いている空べクタ一 p c DNA3. 1を用いて、 C 5 7 B LZ6マウスに対して同様の処理を行つた。 UM1 +UM2 I mmで免疫した C 5 7 B L/ 6マウスは、 UM 1 + UM2 I mmで免疫した PA28 a —^/_マウスおょぴコントロール群のマウスよりも、 f o o t p a d膨張が有意に抑えられた（図 1 0)。これらの結果は、 UM1 +UM2 I mmによってもたらされた腫瘍抑制効果が、プロテァソーム依存的であることを示す。以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

. 産業上の利用可能性

本発明は、癌を含む病原体に起因する疾患を処置するための医薬 ·予防および治療法を提供する。したがって、本努明は、そのような医薬、予防、治療のための方法、システム、組成物を提供するために有用である。

Claims

請求の範囲

2. 前記 T細胞ターゲット配列をコードする核酸配列は、前記核酸配列がコードするアミノ酸配列を有するペプチドが C T Lの反応性を有することで特徴付けられる、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

3. 前記 T細胞ターゲット配列をコードする核酸配列は、少なくとも 8個のアミノ酸からなるペプチドをコードする、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

4. 前記 T細胞ターゲット配列は、少なくとも 8個のアミノ酸を含み、 1番目、 2番目または 3番目のアミノ酸配列は、 Va l、 L e u, I l e、 Ty r または Ph eから選ばれた 1種であり、 8番目、 9番目または 1 0番目は、 V a 1、 L e u、 P h eまたは I 1 eから選ばれた 1種であることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

5. 2番目のアミン酸配列が V a 1、 L e u、 I 1 e、 T y rまたは P h e から選ばれた 1種であり、 9番目のアミノ酸配列が Va 1、 L e u, P h eまたは I 1 eから選ばれた 1種であることを特徴とする、請求項 4に記載の遺伝子ワクチン。

6. 前記 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質は、病原体タンパク質および癌抗原タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を含む、請求項

1に記載の遺伝子ワクチン。

7. 前記抗原タンパク質は、自己腫瘍抗原である、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

8. 前記抗原タンパク質は、メラノソームタンパク質、腫瘍特異的変異ぺプチド、癌関連抗原、癌特異移植抗原および癌ウィルス由来抗原からなる群より選択される抗原タンパク質である、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

9. 前記抗原タンパク質は、 TRP 2、 MUT1、および MUT2からなる群より選択されるぺプチドを含む、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

10. 前記ュビキチンをコードする核酸配列は、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18または 20に示すアミノ酸配列もしくはその改変体をコードする核酸配列を含む、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

1 1. 前記ュビキチンは、プロテアーゼによる切断を抵抗性になるように改変されている、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

1 2. 前記ュビキチンは、 C末端の G 1 yが G 1 y以外のアミノ酸に置換されている、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

13. 前記ュビキチンは、 C末端の G 1 yが A 1 aに置換されている、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

14. 前記ュビキチンは、配列番号 22に示される配列を有する、請求項 1 に記載の遺伝子ワクチン。

15. 前記ュビキチンをコードする核酸配列と、前記抗原タンパク質をコードする核酸配列とは、介在配列なしに連結される、請求項 1に記載の遺伝子ヮクチン。

16. 前記ュビキチンをコードする核酸配列と、前記抗原タンパク質をコードする核酸配列とは、介在配列なしに連結され、かつ、ュビキチンの。末端の G 1 yが G 1 y以外のアミノ酸に置換される、請求項 1に記載の遺伝子ヮクチン。

1 7. 前記ュビキチンをコードする配列は、前記ュビキチンの N末端に、前記抗原タンパク質が融合されるように配置される、請求項 1に記載の遺伝子ヮクチン。

18. 前記ュビキチンをコードする配列は、前記ュビキチンの N末端に、前記抗原タンパク質が融合されるように配置され、かつ、ュビキチンの C末端の

G 1 yが G 1 y以外のアミノ酸に置換される、請求項 1に記載の遺伝子ヮクチン。

1 9 . 前記ュビキチンをコードする核酸配列は、前記ュビキチンが除去されない様式で融合されるように配置される、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

2 0 . 前記遺伝子ワクチンは、 n a k e d D NAである、請求項 1に記載 5 の遺伝子ワクチン。

2 1 . 前記遺伝子ワクチンは、癌を処置または予防するためのものである、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

2 2 . 前記遺伝子ワクチンは、メラノーマ、肺癌、胃癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキ0 ンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、腌臓癌、大腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、子宮頸部癌、皮膚癌、乳癌、食道癌、腎腫、脳腫瘍からなる群より選択される腫瘍を処置するためのものである、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

2 3 . 前記遺伝子ワクチンは、 C D 8 + T細胞を誘導する、請求項 1に記載5 の遺伝子ワクチン。

2 4 . 前記遺伝子ワクチンは、針なし注射または遺伝子銃（g e n e g u n ) によって投与される、請求項 1に記載の遺伝子ワクチン。

- 2 5 . ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、核酸構築物。

0 2 6 . ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、遺伝子ワクチンを製造するための方法であって、該ュビキチンをコードする核酸配列と、該 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを作動可能に連結する工程を包含する、方法。 ·

5 2 7 . T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質に起因する疾患を予防または処置するための方法であって、 A) ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、遣伝子ワクチンを患者に投与する工程、

を包含する、方法。

2 8 . 前記遺伝子ワクチンは、針なし注射または遺伝子銃によって投与される、請求項 2 7に記載の方法。

2 9 . 前記疾患は、メラノーマ、肺癌、胃癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌、大腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、子宫頸部癌、皮膚癌、乳癌、食道癌、腎腫、脳腫瘍からなる群より選択される、請求項 2 7に記載の方法。

3 0 . ュビキチンをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の、遺伝子ワクチンと.しての使用。

3 3 . 前記 T細胞ターゲット配歹 Uは、癌抗原遺伝子を含む、請求項 3 2に記載の遺伝子ワクチン。

3 4 . 前記サイト力インは、 I L一 1 2、 I L— 1 5および I L _ 1 8から選択される少なくとも 1種のサイトカインを含有する、請求項 3 2に記載の遺伝子ワクチン。

3 5 . T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質に起因する疾患を予防または処置するための方法であって、 A) T細胞ターゲット配列をコードする配列を含む抗原遺伝子と、サイト力インをコードする配列とを含む、遺伝子ワクチンを患者に投与する工程、を包含する、方法。

3 7 . 遺伝子ワクチンを製造するための、サイト力インをコードする核酸配列と、 T細胞ターゲット配列を含む抗原タンパク質をコードする核酸配列とを含む、組成物の使用。