KR20180123126A - 면역유도제 - Google Patents

Abstract

본 출원은, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 신규한 면역유도제에 관한 것으로서, 구체적으로는 MCEMP1 유래의 폴리펩티드류 및 그 개변체로부터 선택되고 또한 면역유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 면역유도제, 및 상기 면역유도제를 피험체에 투여하는 것을 포함하는 면역유도 방법을 제공한다.

Description

면역유도제

본 발명은 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규한 면역유도제에 관한 것이다.

암은 전체 사망 원인의 제1위를 차지하는 질환이며, 현재 행해지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 방사선 요법과 화학 요법을 조합시킨 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 불구하고, 일부의 암을 제외하고 암의 치료 성적은 그다지 향상되어 있지 않은 것이 현재의 상태이다. 최근, 분자생물학이나 암면역학의 진보로 암에 반응하는 세포장해성 T세포에 의해 인식되는 암항원, 암항원을 코드하는 유전자 등이 동정되어 있고, 항원 특이성 면역요법에의 기대가 높아지고 있다.

Mast Cell-Expressed Membrane Protein 1(MCEMP1)은 2형의 막관통 단백질이며, 비만세포 특이적으로 세포막에 발현하고 있는 것이 보고되어 있고, 비만세포의 분화, 면역 반응, 알레르기 반응에 관여하는 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 1). 그러나, MCEMP1 단백질이 암세포에 대한 면역유도 활성을 갖고, 그것에 의해서 상기 단백질이 암의 치료나 예방에 유용하다고 하는 보고는 없다.

Kang Li. et al. Genomics, 86:68-75(2005)

본 발명의 목적은, 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규한 폴리펩티드를 찾아내고, 상기 폴리펩티드의 면역유도제에의 사용을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 백혈병환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해, 담암생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코드하는 cDNA를 취득하고, 그 cDNA를 기초로 하여 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 개 Mast Cell-Expressed Membrane Protein 1(이하, MCEMP1로 기재한다)의 폴리펩티드를 제작했다. 또한, 취득한 개 유전자의 인간, 고양이 및 마우스 상동성 유전자를 기초로 하여 서열번호 2, 6, 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 인간, 고양이 및 마우스 MCEMP1 폴리펩티드를 제작했다. 그리고 이들 MCEMP1 폴리펩티드가 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 ,및 항문주위선암에 특이적으로 발현되고 있는 것을 찾아냈다. 또한 이들 MCEMP1을 생체에 투여함으로써 생체 내에 MCEMP1에 대한 면역세포를 유도할 수 있는 것, 및 MCEMP1을 발현하는 생체 내의 종양을 퇴축시킬 수 있는 것을 찾아냈다. 또한, MCEMP1의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 재조합 벡터가, MCEMP1을 발현하는 암에 대하여 생체 내에서 항종양 효과를 유도하는 것을 찾아냈다.

또한, MCEMP1의 폴리펩티드가 항원제시세포에 의해 제시되어서, 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 활성화 및 증식시키는 능력(「면역유도 활성」이라고도 칭한다.)을 갖는 것, 이 때문에, 상기 폴리펩티드가 암의 치료 및/또는 예방에 유용하고, 또한 상기 폴리펩티드와 접촉한 항원제시세포나 상기 항원제시세포와 접촉한 T세포가 암의 치료 및/또는 예방에 유용한 것을 찾아내고, 본 발명을 완성했다.

따라서, 본 발명은 이하의 (1)∼(11)의 특징을 포함한다.

(1) 이하의 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리펩티드로부터 선택되고 또한 면역유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 포함하는 면역유도제.

(a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상으로부터 전체 길이 이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드

(b) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(c) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(d) 상기 (a)∼(c)의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하는 폴리펩티드

(2) 항원제시세포의 처리제인 상기 (1)에 기재된 면역유도제.

(3) 암의 치료 및/또는 예방제의 유효 성분인 상기 (1)에 기재된 면역유도제.

(4) 상기 암이 MCEMP1을 발현하는 암인 상기 (3)에 기재된 면역유도제.

(5) 상기 암이 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 또는 항문주위선암인 상기 (3) 또는 (4)에 기재된 면역유도제.

(6) 면역증강제를 더 포함하는 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 면역유도제.

(7) 상기 면역증강제가 프로인트의 불완전 아쥬반트, 몬타나이드, 폴리IC 및 그 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드, 인터류킨12, 인터류킨18, 인터페론α, 인터페론β, 인터페론ω, 인터페론γ, 및 Flt3 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 상기 (6)에 기재된 면역유도제.

(8) (1)에 정의하는 폴리펩티드와 피험체 유래의 항원제시세포를 생체 외(ex vivo) 또는 인비트로에서 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원제시세포의 제작 방법.

(9) 상기 항원제시세포가 MHC클래스 I분자를 보유하는 수상세포 또는 B세포인 상기 (8)에 기재된 방법.

(10) 상기 (8) 또는 (9)에 기재된 방법에 의해 얻어지는 항원제시세포와 피험체 유래의 T세포를 생체 외 또는 인비트로에서 접촉시켜서 상기 T세포를 활성화하는 것을 포함하는, 상기 (1)에 정의하는 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포의 제작 방법.

(11) 이하의 (a)∼(d)의 폴리펩티드로부터 선택되고 또한 면역유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 피험체에 투여하는 것을 포함하는 면역유도 방법.

(a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상으로부터 전체 길이 이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드

(b) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(c) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(d) 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하는 폴리펩티드

본 발명에 의해 암의 치료 및/또는 예방 등에 유용한 신규한 면역유도제가 제공된다. 후술의 실시예에 있어서 구체적으로 나타내어지는 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 피험체에 투여하면, 생체 내에 있어서 면역세포를 유도할 수 있고, 또한 이미 발생되어 있는 암을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 상기 폴리펩티드는 암의 치료나 예방에 유용하다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원 번호 2016-064034호의 개시 내용을 포함한다.

도 1은 동정한 MCEMP1 유전자의, 개의 종양 조직에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조번호 1; 개 MCEMP1 유전자의, 도시한 개의 각 조양 조직에서의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 동정한 MCEMP1 유전자의, 인간의 각 조직 및 암 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조번호 2; 인간 MCEMP1 유전자의, 도시한 인간의 각정상 조직에서의 발현 패턴을 나타낸다. 참조번호 3; 인간 MCEMP1 유전자의, 도시한 인간의 각 암 세포주에서의 발현 패턴을 나타낸다. 도면 중, PBMC는 말초혈액 단핵구를 가리킨다.
도 3은 동정한 MCEMP1 유전자의, 마우스의 각 암 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조번호 4; 마우스 MCEMP1 유전자의, 도시한 마우스의 각 암 세포주에서의 발현 패턴을 나타낸다.

본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

1. 폴리펩티드

본 발명의 면역유도제에 유효 성분으로서 포함되는 폴리펩티드로서는, 이하의 (a)∼(d)의 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 「폴리펩티드」란 복수의 아미노산이 펩티드 결합함으로써 형성되는 분자를 말하고, 구성하는 아미노산 수가 많은 폴리펩티드 분자 뿐만 아니라, 아미노산 수가 적은 저분자량의 분자(올리고펩티드)나, 전체 길이 단백질도 포함된다.

(a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중의 연속하는 7개 이상으로부터 전체 길이 이하의 아미노산으로 이루어지고, 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드.

(b) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고,또한 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드.

(c) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드

(d) 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하고, 또한 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드.

또한, 본 발명에 있어서 「아미노산 서열을 갖는」이란, 아미노산 잔기가 그러한 순서로 배열되어 있다고 하는 의미이다. 따라서, 예를 들면 「서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」란, 서열번호 8에 나타내어지는 Met, His, Ala, Ser, Ala‥(중략)‥Gln, Pro, Ser, Thr의 아미노산 서열을 갖는, 183 아미노산기 사이즈의 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 예를 들면 「서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」를 「서열번호 8의 폴리펩티드」라고 약기할 경우가 있다. 「염기서열을 갖는다」라고 하는 표현에 대해서도 같다. 이 경우, 「갖는다」라고 하는 용어는 「로 이루어진다」라고 하는 표현으로 치환되어도 좋다.

여기에서, 「면역유도 활성」이란 생체 내에서 인터페론 등의 사이토카인을 분비하는 면역세포를 유도하는 능력을 의미한다.

상기 폴리펩티드가 면역유도 활성을 갖는지의 여부는, 예를 들면 공지의 엘리스팟 어세이 등을 이용하여 확인할 수 있다. 구체적으로는, 면역유도 활성을 평가해야 할 폴리펩티드를 투여한 생체로부터 말초혈액 단핵구 등의 세포를 얻어서 상기 세포를 상기 폴리펩티드와 공존 배양하고, 상기 세포로부터의 사이토카인 산생량을 특이항체를 이용하여 측정함으로써 상기 세포 중의 면역세포 수를 측정할 수 있으므로, 이것에 의해 면역유도 활성을 평가할 수 있다.

또한, 후술의 실시예에 기재되는 바와 같이, 상기 (a)∼(d)의 재조합 폴리펩티드를 담암생체에 투여하면, 그 면역유도 활성에 의해 종양을 퇴축시킬 수도 있다. 따라서, 상기 면역유도 활성은 암세포의 증식을 억제하거나 또는 암조직(종양)을 축소 또는 소멸시키는 능력(이하, 「항종양 활성」이라고 한다)으로서 평가할 수도 있다. 폴리펩티드의 항종양 활성은, 예를 들면 후술의 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 실제로 상기 폴리펩티드를 담암생체에 투여해서 종양이 축소되는지의 여부 등을 조사함으로써 확인할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 담암생체에 투여해서 유도된 세포장해성 T세포가 종양에 대하여 세포장해활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 폴리펩티드의 항종양 활성을 평가할 수도 있다. 생체 내에 있어서의 T세포의 세포장해활성의 측정은, 예를 들면 T세포를 생체 내에서 제거하는 항체를 투여함으로써 종양이 증대되는지의 여부 등을 조사함으로써 확인할 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

또는, 상기 폴리펩티드로 자극한 T세포(즉, 상기 폴리펩티드를 제시하는 항원제시세포와 접촉시킨 T세포)가, 생체 밖에서 종양세포에 대하여 세포장해활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써, 상기 폴리펩티드의 항종양 활성을 평가할 수도 있다. T세포와 항원제시세포의 접촉은, 후술하는 바와 같이 양자를 액체 배지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 세포장해활성의 측정은, 예를 들면 Int. J. Cancer, 58:p317, 1994에 기재된 ⁵¹Cr 릴리스 어세이라고 불리는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 암의 치료 및/또는 예방 용도로 사용할 경우에는, 특별하게 한정되지 않지만, 항종양 활성을 지표로 해서 면역유도 활성을 평가하는 것이 바람직하다.

본 발명이 개시하는 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 각각 나타내어지는 아미노산 서열은, 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 담암 개의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해, 담암 개 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드 및 그 인간, 고양이, 및 마우스 상동인자로서 단리된 MCEMP1의 아미노산 서열이다(실시예 1 참조). 개 MCEMP1의 인간 상동인자인 인간 MCEMP1에서는, 서열 동일성이 염기서열 70%, 아미노산 서열 51%이며, 고양이 상동인자인 고양이 MCEMP1에서는 서열 동일성은 염기서열 83%, 아미노산 서열 64%이며, 마우스 상동인자인 마우스 MCEMP1에서는 서열 동일성은 염기서열 65%, 아미노산 서열 47%이다.

상기 (a)의 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중의 연속하는 7개 이상, 바람직하게는 연속하는 8, 9또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이며, 면역유도 활성을 갖는 것이다. 특히 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 이 분야에서 공지인 바와 같이, 약 7아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 항원성 및 면역원성을 발휘할 수 있다. 따라서, 서열번호 2, 4, 6, 또는 8의 아미노산 서열 중의 연속하는 7아미노산 잔기(7개) 이상으로부터 전체 아미노산 잔기(전체 길이) 이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이면 면역유도 활성을 가질 수 있으므로, 본 발명의 면역유도제의 조제에 사용할 수 있다.

또한, 암항원 폴리펩티드를 투여하는 것에 의한 면역유도의 원리로서, 폴리펩티드가 항원제시세포에 도입되고, 그 후 상기 세포 내에서 펩티다아제에 의한 분해를 받아서 보다 작은 단편으로 되고, 상기 세포의 표면 상에 제시되어, 그것을 세포장해성 T세포 등이 인식하고, 그 항원을 제시하고 있는 세포를 선택적으로 죽여 간다고 하는 것이 알려져 있다. 항원제시세포의 표면 상에 제시되는 폴리펩티드의 사이즈는 비교적 작고, 아미노산 수로 7∼30 정도이다. 따라서, 항원제시세포 상에 제시시킨다고 하는 관점으로부터는, 상기 (a)의 폴리펩티드로서는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7∼30 정도인 것이 바람직한 형태의 하나이며, 보다 바람직하게는 8∼30 또는 9∼30 정도의 아미노산으로 이루어지는 것이면 충분하다. 이들 비교적 작은 사이즈의 폴리펩티드는 항원제시세포 내에 도입되지 않고, 직접 항원제시세포 상의 세포 표면에 제시될 경우도 있다.

또한, 항원제시세포에 도입된 폴리펩티드는 상기 세포 내의 펩티다아제에 의해 랜덤의 위치에서 절단을 받아서 여러 가지의 폴리펩티드 단편이 생기고, 이들 폴리펩티드 단편이 항원제시세포 표면 상에 제시되므로, 서열번호 2, 4, 6, 또는 8의 전체 길이 영역과 같이 큰 사이즈의 폴리펩티드를 투여하면 항원제시세포 내에서의 분해에 의해서 항원제시세포를 개재하는 면역유도에 유효한 폴리펩티드 단편이 필연적으로 생긴다. 따라서, 항원제시세포를 개재하는 면역유도에 있어서도 사이즈가 큰 폴리펩티드를 바람직하게 사용할 수 있고, 아미노산 수를 30 이상, 더 바람직하게는 100 이상, 더 바람직하게는 200 이상, 더 바람직하게는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8의 전체 길이 영역의 폴리펩티드로 해도 된다.

상기 (c)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드 중 소수의(바람직하게는, 1개 또는 수개의) 아미노산 잔기가 치환하고, 결실 및/또는 삽입된 폴리펩티드이며, 원래의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 단백질 항원에 있어서 상기 단백질의 아미노산 서열 중 소수의 아미노산 잔기가 치환되고, 결실되거나 또는 삽입되었을 경우라도, 원래의 단백질과 거의 같은 항원성을 갖고 있을 경우가 있는 것은 당업자에 있어서 널리 알려져 있다. 따라서, 상기 (c)의 폴리펩티드도 면역유도 활성을 발휘할 수 있으므로 본 발명의 면역유도제의 조제에 사용할 수 있다. 또한, 상기 (b)의 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 나타내어지는 아미노산 서열 중, 1개∼수개의 아미노산 잔기가 치환하고, 결실 및/또는 삽입된 폴리펩티드인 것도 바람직하다. 본 명세서 중의 「수개」란 2∼10의 정수, 바람직하게는 2∼6의 정수, 더욱 바람직하게는 2∼4의 정수를 나타낸다.

여기에서, 아미노산 서열 또는 염기서열의 「서열 동일성」이란, 비교해야 할 2개의 아미노산 서열(또는 염기서열)의 아미노산 잔기(또는 염기)가 가능한 한 많이 일치하도록 양 아미노산 서열(또는 염기서열)을 정렬시켜, 일치한 아미노산 잔기 수(또는 일치한 염기 수)를 전체 아미노산 잔기 수(또는 전체 염기 수)로 나눈 것을 백분률로 나타낸 것이다. 상기 정렬시에는 필요에 따라, 비교하는 2개의 서열 중 일방 또는 쌍방에 적당하게 갭을 삽입한다. 이러한 서열의 정렬화는, 예를 들면 BLAST, FASTA, CLUSTALW 등의 주지의 알고리즘을 이용하여 행할 수 있다. 갭이 삽입될 경우, 상기 전체 아미노산 잔기 수는 1개의 갭을 1개의 아미노산 잔기로서 카운트한 잔기 수가 된다. 이와 같이 하여 카운트한 전체 아미노산 잔기 수가, 비교하는 2개의 서열 사이에서 다른 경우에는, 서열 동일성(%)은 긴 쪽의 서열의 전체 아미노산 잔기 수로, 일치한 아미노산 잔기 수를 나누어서 산출된다.

또한, 천연의 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산은 저극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), 친수성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(Arg, Lys, His), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp)과 같이 유사의 성질을 갖는 것으로 그룹 구분할 수 있고, 이것들 사이에서의 치환이면 폴리펩티드의 성질이 변화되지 않는 경우가 많은 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 상기 (a)의 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기를 치환할 경우에는, 이것들의 각 그룹의 사이에서 치환함으로써 면역유도 활성을 유지할 수 있을 가능성이 높아지기 때문에 바람직하다.

상기 (d)의 폴리펩티드는 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하고, 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 즉, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 일단 또는 양단에 다른 아미노산 또는 폴리펩티드가 부가된 것이며, 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드도 본 발명의 면역유도제의 조제에 사용할 수 있다.

상기 폴리펩티드는, 예를 들면 Fmoc법(플루올레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다. 또한, 각종의 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 방법을 이용하여 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 포함시켜 숙주세포에 도입하고, 상기 숙주세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DNA는, 개 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열번호 3에 기재한 염기서열을 증폭할 수 있게 설계한 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA이면, 상기 주형으로서 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 사용함으로써 마찬가지로 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당하게 설정할 수 있고, 예를 들면 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 1분간(신장)으로 이루어지는 반응 공정을 1사이클로 해서, 예를 들면 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열번호 1, 3에 나타내어지는 염기서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 이용하여 인간이나 개 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열번호 2, 4의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로 제작하는 것이 바람직하다. 상기 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면 Molecular cloning 제2판, Current protocols in molecular biology 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 DNA로부터, 상기 (a)의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 또한, 각 아미노산을 코드하는 코돈은 공지이기 때문에, 특정의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 용이하게 특정할 수 있다. 따라서, 상기 (b)∼(d)의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열도 용이하게 특정할 수 있으므로, 그러한 폴리뉴클레오티드도 시판의 핵산 합성기를 이용하여 상법에 의해 용이하게 합성할 수 있다.

상기 숙주세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 세포이면 어떠한 것이여도 좋고, 원핵세포의 예로서는 대장균 등, 진핵세포의 예로서는 원숭이 신장세포 COS1, 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO 등의 포유동물 배양세포, 출아효모, 분열효모, 누에세포, 아프리카발톱개구리 난세포 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.

숙주세포로서 원핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합부위, DNA 클로닝 부위, 터미네이터 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 포함시키고, 상기 벡터에서 원핵 숙주세포를 형질전환한 뒤, 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기 DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주세포로서 진핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가부위 등을 갖는 진핵세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3.1, pSecTag(A, B, C), pMSG, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 포함시키고, 상기 벡터에서 진핵 숙주세포를 형질전환한 뒤, 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기 DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는, His 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주세포에의 도입은 전기천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.

숙주세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는, 공지의 분리 조작을 조합시켜서 행할 수 있다. 예를 들면 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심분리, 한외여과, 겔여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.

이상의 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드에는, 상술한 바와 같이 다른 임의의 단백질과의 융합 단백질의 형태에 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 글루타티온-S-트란스페라제(GST)나 His 태그와의 융합 단백질 등을 예시할 수 있다. 이러한 융합 단백질 형태의 폴리펩티드도, 상기 (d)의 폴리펩티드로서 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 형질전환세포에서 발현된 폴리펩티드는, 번역된 후 세포 내에서 각종 수식을 받을 경우가 있다. 이러한 번역 후 수식된 폴리펩티드도 면역유도 활성을 갖는 한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 번역 수식으로서는 N말단 메티오닌의 탈리, N말단 아세틸화, 당쇄 부가, 세포내 프로테아제에 의한 한정 분해, 미리스토일화, 이소프레닐화, 인산화 등을 예시할 수 있다.

2. 면역유도제

후술의 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 상기 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드를 담암생체에 투여하면 종양을 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역유도제는 암의 치료 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 면역유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 면역유도에 의한 암의 치료 및/또는 예방 방법에 사용할 수 있다.

여기에서, 「종양」 및 「암」이라고 하는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.

이경우, 대상이 되는 암으로서는, MCEMP1을 발현하는 암이면 특별하게 한정되지 않지만, 바람직하게는 정상세포보다 유의하게 많이 MCEMP1을 발현하고 있는 암이며, 구체적으로는 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 또는 항문주위선암이며, 이들 특정의 암에는, 예를 들면 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T세포 백혈병, 무백혈병성 백혈병, 백혈구 혈증성 백혈병(leukocythemic leukemia), 호염기구성 백혈병, 아세포성 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 피부 백혈병, 태생세포성 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병, 리더 세포성 백혈병, 실링 백혈병, 간세포성 백혈병, 아백혈성 백혈병, 미분화 세포성 백혈병, 유모상 세포성 백혈병, 혈구아세포성 백혈병(hemoblastic leukemia), 혈구아세포성 백혈병(hemocytoblastic leukemia), 조직구 백혈병, 간세포성 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 백혈구 감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프아구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프친화 백혈병, 림프모양 백혈병, 림프육종세포성 백혈병, 비만세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 소골수아구성 백혈병, 단구성 백혈병, 골수아구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수과립구성 백혈병, 골수단구성 백혈병, 네겔리 백혈병, 형질세포 백혈병, 형질세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 불응성 빈혈(RA), 철아구를 수반하는 불응성 빈혈(RARS), 아구 증가를 수반하는 불응성 빈혈(RAEB), 이행기 RAEB(RAEB-T), 전백혈병 및 만성 골수단구성 백혈병(CMML), 뼈내 통상형 골육종과 아계 골육종(뼈내 고분화형 골육종, 원형세포 골육종, 표재 골육종, 방골 골육종, 골막 골육종 또는 표재 고악성 골육종), 흉선종, 비만세포종, 항문주위선종, 항문주위선암이 포함되지만, 이것들에 한정되지 않는다.

또한, 대상이 되는 피험체(동물)는 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 영장류, 애완동물, 동물원 등에서 사육되고 있는 동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유동물이며, 특히 바람직하게는 인간, 개 또는 고양이이다.

본 발명의 면역유도제의 생체에의 투여 경로는, 경구 투여라도 비경구 투여라도 좋지만, 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여가 바람직하다. 암의 치료 목적으로 상기 면역유도제를 사용할 경우에는, 항암작용을 향상시키기 위해서 치료 대상이 되는 종양 근방의 소속 림프절에 투여할 수도 있다. 투여량은 면역유도하는데 유효한 양이면 되고, 예를 들면 암의 치료 및/또는 예방에 사용하는 것이라면 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양이면 된다. 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양은, 종양의 크기나 증상 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상, 대상동물에 대하여 1일당의 유효량으로서 0.0001∼1000㎍, 바람직하게는 0.001∼1000㎍이며, 1회 또는 수회로 나누어서 투여할 수 있다. 바람직하게는, 수회로 나누고, 수일 내지 수개월 간격으로 투여한다. 후술의 실시예에 구체적으로 나타내는 바와 같이, 본 발명의 면역유도제는 종양을 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 발생 초기의 소수의 암세포에도 항암작용을 발휘할 수 있으므로, 암의 발병 전이나 암의 치료 후에 사용하면 암의 발병이나 재발을 방지할 수 있다. 즉, 본 발명의 면역유도제는 암의 치료와 예방의 쌍방에 유용하다.

본 발명의 면역유도제는 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 좋고, 각 투여 형태에 적합한, 약리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 등의 첨가제를 적당하게 혼합시켜서 제제할 수도 있다. 제제 방법 및 사용 가능한 첨가제는 의약 제제의 분야에 있어서 주지이며, 어느 방법 및 첨가제나 사용할 수 있다. 첨가제의 구체예로서는, 생리완충액과 같은 희석제; 설탕, 유당, 옥수수 전분, 인산 칼슘, 소르비톨, 글리신 등과 같은 부형제; 시럽, 젤라틴, 아라비아 고무, 소르비톨, 폴리비닐 클로라이드, 트라간트 등과 같은 결합제; 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 탤크, 실리카 등의 활택제 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 제제 형태로서는 정제, 갭슐제, 과립제, 가루약, 시럽제 등의 경구제, 흡입제, 주사제, 좌제, 액제 등의 비경구제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 일반적으로 알려져 있는 제법에 의해 만들 수 있다.

본 발명의 면역유도제는 생체 내에서의 면역학적 응답을 강화할 수 있는 면역증강제와 조합시켜서 사용할 수 있다. 면역증강제는 본 발명의 면역유도제에 포함되어 있어도 되고, 별개의 조성물로서 본 발명의 면역유도제와 병용해서 환자에 투여해도 좋다.

상기 면역증강제로서는, 예를 들면 아쥬반트를 들 수 있다. 아쥬반트는 항원의 저장소(세포 밖 또는 대식세포 내)를 제공하고, 대식세포를 활성화하고, 또한 특정 세트의 림프구를 자극함으로써 면역학적 응답을 강화할 수 있으므로 항암작용을 높일 수 있다. 따라서, 특히 본 발명의 면역유도제를 암의 치료 및/또는 예방에 사용할 경우, 면역유도제는 유효 성분인 상기 폴리펩티드에 추가해서 아쥬반트를 더 포함하는 것이 바람직하다. 다수의 종류의 아쥬반트가 당업계에서 주지이며, 어느 아쥬반트라도 사용할 수 있다. 아쥬반트의 구체예로서는, MPL(SmithKline Beecham), 살모넬라속의 Salmonella minnesota Re 595 리포 다당류의 정제 및 산 가수분해 후에 얻어지는 동류물; QS21(SmithKline Beecham), Quillja saponaria 추출물로부터 정제되는 순QA-21 사포닌; PCT 출원 WO96/33739(SmithKline Beecham)에 기재된 DQS21; QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-L1(소(So), 외 10명, 「몰리큘즈 앤드 셀(Molecules and cells)」, 1997년, 제7권, p.178-186); 프로인트의 불완전 아쥬반트; 프로인트의 완전 아쥬반트; 비타민E; 몬타나이드; 명반; CpG 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 크레이그(Kreig), 외 7명, 「네이쳐(Nature)」, 제374권, p.546-549)을 참조); 폴리IC 및 그 유도체(폴리ICLC 등) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 기름으로 조제되는 여러가지 유중수 에멀젼을 들 수 있다. 그 중에서도, 프로인트의 불완전 아쥬반트, 몬타나이드, 폴리IC 및 그 유도체, 및 CpG 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 상기 아쥬반트와 폴리펩티드의 혼합비는, 전형적으로는 약 1:10∼10:1, 바람직하게는 약 1:5∼5:1, 보다 바람직하게는 약 1:1이다. 단, 아쥬반트는 상기 예시에 한정되지 않고, 당업계에서 공지인 상기 이외의 아쥬반트도 본 발명의 면역유도제를 투여할 때에 사용될 수 있다(예를 들면, 고딩(Goding) 저, 「모노클로날 안티바디스: 프린서플 앤드 프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)」, 제2판, 1986년을 참조). 폴리펩티드 및 아쥬반트의 혼합물 또는 에멀젼의 조제 방법은 예방접종의 당업자에게는 주지이다.

또한, 상기 면역증강제로서는 상기 아쥬반트 이외에도, 대상의 면역응답을 자극하는 인자를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 림프구나 항원제시세포를 자극하는 특성을 갖는 각종 사이토카인을 면역증강제로서 본 발명의 면역유도제와 조합시켜서 사용할 수 있다. 그러한 면역학적 응답을 증강 가능한 다수의 사이토카인이 당업자에게 공지이며, 그 예로서는, 백신의 방어 작용을 강화하는 것이 나타내어져 있는 인터류킨-12(IL-12), GM-CSF, IL-18, 인터페론α, 인터페론β, 인터페론ω, 인터페론γ 및 Flt3 리간드를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 이러한 인자도 상기 면역증강제로서 사용할 수 있고, 본 발명의 면역유도제에 포함시켜서 또는 별개의 조성물로서 본 발명의 면역유도제와 병용해서 환자에게 투여할 수 있다.

3. 항원제시세포 또는 세포장해성 T세포

본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드와 피험체 유래의 항원제시세포를 생체 외 또는 인비트로(in vitro)에서 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원제시세포의 제작 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 이 방법에 의해 얻어지는, 또한 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포를 제공한다.

상기 폴리펩티드와 항원제시세포를 생체 외 또는 인비트로에서 접촉시킴으로써 상기 폴리펩티드를 항원제시세포에 제시시킬 수 있다. 즉, 상기 (a)∼(d)의 폴리펩티드는 항원제시세포의 처리제로서 이용할 수 있다. 본 명세서 중, 항원제시세포로서는 MHC클래스 I분자를 보유하는 수상세포 또는 B세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 여러 가지 MHC클래스 I분자가 동정되어 있고, 주지이다. 인간에 있어서의 MHC 분자는 HLA라고 부른다. HLA클래스 I분자로서는 HLA-A, HLA-B, HLA-C를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 등을 들 수 있다.

MHC클래스 I분자를 보유하는 수상세포 또는 B세포는 주지의 방법에 의해 말초혈로부터 조제할 수 있다. 예를 들면, 골수, 제대혈 또는 환자 말초혈로부터, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)와 IL-3(또는 IL-4)을 사용해서 수상세포를 유도하고, 그 배양계에 종양관련 펩티드를 첨가함으로써 종양 특이적인 수상세포를 유도할 수 있다.

이 수상세포를 유효량 투여함으로써 암의 치료에 바람직한 응답을 유도할 수 있다. 사용하는 세포는 건강인으로부터 제공된 골수나 제대혈, 환자 본인의 골수나 말초혈 등을 사용할 수 있지만, 환자 본래의 자가세포를 사용하는 경우에는 안전성이 높고, 중독한 부작용을 회피하는 것도 기대할 수 있다. 말초혈 또는 골수는 신선 시료, 저온보존 시료 및 동결보존 시료의 어느 것이라도 좋다. 말초혈은 전체 혈액을 배양해도 좋고, 백혈구 성분만을 분리해서 배양해도 좋지만, 후자 쪽이 효율적이여서 바람직하다. 또한 백혈구 성분 중에서도 단핵구를 분리해도 좋다. 또한, 골수나 제대혈을 기원으로 할 경우에는, 골수를 구성하는 세포 전체를 배양해도 좋고, 이것으로부터 단핵구를 분리해서 배양해도 좋다. 말초혈이나 그 백혈구 성분, 골수세포에는 수상세포의 기원이 되는 단핵구, 조혈간세포 또는 미성숙 수상세포나 CD4 양성 세포 등이 포함되어 있다. 사용되는 사이토카인은 안전성과 생리활성이 확인된 특성의 것이라면, 천연형, 또는 유전자 재조합형 등, 그 생산 방법에 대해서는 묻지 않지만, 바람직하게는 의료용으로 사용되는 품질이 확보된 표품이 필요 최저량으로 사용된다. 첨가하는 사이토카인의 농도는 수상세포가 유도되는 농도이면 특별하게 한정되지 않고, 통상 사이토카인의 합계 농도로 10∼1000ng/mL 정도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼500ng/mL 정도이다. 배양은 백혈구의 배양에 통상 사용되고 있는 주지의 배지를 이용하여 행할 수 있다. 배양 온도는 백혈구의 증식이 가능하면 특별하게 한정되지 않지만, 인간의 체온인 37℃ 정도가 가장 바람직하다. 또한, 배양 중의 기체 환경은 백혈구의 증식이 가능하면 특별하게 한정되지 않지만, 5% CO₂를 통기하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 기간은 필요수의 세포가 유도되는 기간이면 특별하게 한정되지 않지만, 통상 3일∼2주간의 사이에서 행하여진다. 세포의 분리나 배양에 제공되는 기기는 적절히 적당한 것을 사용할 수 있지만, 의료용으로 안전성이 확인되고, 또한 조작이 안정되고 간편한 것이 바람직하다. 특히 세포 배양 장치에 대해서는 샤알레, 플라스크, 병 등의 일반적 용기에 관계없이, 적층형 용기나 다단식 용기, 롤러 병, 스피너식 병, 백식 배양기, 중공사 컬럼 등도 사용할 수 있다.

상기 폴리펩티드와 항원제시세포를 생체 외 또는 인비트로에서 접촉시키는 방법 자체는 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 항원제시세포를 상기 폴리펩티드를 포함하는 배양액 중에서 배양함으로써 행할 수 있다. 배지 중의 펩티드 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 1∼100㎍/ml 정도, 바람직하게는 5∼20㎍/ml 정도이다. 배양시의 세포 밀도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 10³∼10⁷세포/ml 정도, 바람직하게는 5×10⁴∼5×10⁶세포/ml 정도이다. 배양은 상법에 따라, 37℃, 5% CO₂ 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 또한, 항원제시세포가 표면 상에 제시할 수 있는 펩티드의 길이는, 통상 최대로 30아미노산 잔기 정도이다. 따라서, 특별하게 한정되지 않지만, 항원제시세포와 폴리펩티드를 생체 외 또는 인비트로에서 접촉시킬 경우, 상기 폴리펩티드를 약 30아미노산 잔기 이하의 길이로 조제해도 좋다.

상기 폴리펩티드의 공존 하에 있어서 항원제시세포를 배양함으로써, 펩티드가 항원제시세포의 MHC 분자에 도입되어 항원제시세포의 표면에 제시된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 이용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는, 단리 항원제시세포를 조제할 수 있다. 이러한 항원제시세포는 생체 내 또는 생체 외 또는 인비트로에 있어서, T세포에 대하여 상기 폴리펩티드를 제시하고, 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도하고, 증식시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 항원제시세포와 피험체 유래의 T세포를 생체 외 또는 인비트로에서 접촉시켜서 상기 T세포를 활성화하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포의 제작 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 이 방법에 의해 얻어지고, 또한 상기 폴리펩티드에 특이적인 것을 특징으로 하는 세포장해성 T세포를 제공한다.

상기와 같이 해서 조제되는 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원제시세포를, T세포와 생체 외 또는 인비트로에서 접촉시킴으로써, 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도하고, 증식시킬 수 있다. 이것은 상기 항원제시세포와 T세포를 액체 배지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 항원제시세포를 액체 배지에 현탁하고, 마이크로 플레이트의 웰 등의 용기에 넣고, 이것에 T세포를 첨가해서 배양함으로써 행할 수 있다. 공존 배양시의 항원제시세포와 T세포의 혼합비율은 특별하게 한정되지 않지만, 통상, 세포수의 비율로 1:1∼1:100 정도, 바람직하게는 1:5∼1:20 정도이다. 또한, 액체 배지 중에 현탁하는 항원제시세포의 밀도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 100∼1000만 세포/ml 정도, 바람직하게는 10000∼100만 세포/ml 정도이다. 공존 배양은 상법에 따라 37℃, 5% CO₂ 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 특별하게 한정되지 않지만, 통상, 2일∼3주간, 바람직하게는 4일∼2주간 정도이다. 또한, 공존 배양은 IL-2, IL-6, IL-7 및 IL-12와 같은 인터류킨의 1종 또는 복수의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 이 경우, IL-2 및 IL-7의 농도는, 통상 5∼20U/ml 정도, IL-6의 농도는 통상 500∼2000U/ml 정도, IL-12의 농도는 통상 5∼20ng/ml 정도이지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 상기 공존 배양은 신선한 항원제시세포를 추가해서 1회 또는 수회 반복해도 좋다. 예를 들면, 공존 배양 후의 배양 상청을 버리고, 신선한 항원제시세포의 현탁액을 첨가해서 더욱 공존 배양을 행한다고 하는 조작을 1회 또는 수회 반복해도 좋다. 각 공존 배양의 조건은 상기와 같아도 좋다.

상기 공존 배양에 의해, 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포가 유도되어 증식된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 이용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체에 선택적으로 결합하는, 단리 T세포를 조제할 수 있다.

후술의 실시예에 기재되는 바와 같이, MCEMP1 유전자는 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 또는 항문주위선암에 특이적으로 발현하고 있다. 따라서, 이들 암종에 있어서는, MCEMP1이 정상세포보다 유의하게 많이 존재하고 있다고 생각된다. 따라서, 암세포 내에 존재하는 MCEMP1의 폴리펩티드의 일부가 암세포 표면 상의 MHC 분자에 제시되도록, 상기와 같이 해서 조제한 세포장해성 T세포가 생체 내에 투여되면, 이것을 마크로 해서 세포장해성 T세포가 암세포를 장해할 수 있다. 또한, MCEMP1의 폴리펩티드의 일부를 제시하는 항원제시세포는, 생체 내에 있어서도 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도하고, 증식시킬 수 있으므로, 상기 항원제시세포를 생체 내에 투여함으로써도 암세포를 장해할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩티드를 이용하여 조제된 상기 세포장해성 T세포나 상기 항원제시세포도 또한 본 발명의 면역유도제와 마찬가지로 암의 치료 및/또는 예방제로서 유용하다.

상기 단리 항원제시세포나 단리 T세포를 생체에 투여할 경우에는, 이들 세포를 이물로서 공격하는 생체 내에서의 면역응답을 회피하기 위해서, 치료를 받는 환자로부터 채취한 항원제시세포 또는 T세포를, 상기와 같이 상기 (a)∼(d)의 폴리펩티드를 이용하여 조제한 것이 바람직하다.

항원제시세포 또는 단리 T세포를 유효 성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방제의 투여 경로는, 정맥내 투여나 동맥내 투여와 같은 비경구 투여가 바람직하다. 또한 투여량은, 증상이나 투여 목적 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상 1개∼10조개, 바람직하게는 100만개∼10억개이며, 이것을 수일 내지 수개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 제제는, 예를 들면 세포를 생리완충식염수에 현탁한 것 등이어도 좋고, 다른 항암제나 사이토카인 등과 병용할 수도 있다. 또한, 제제 분야에 있어서 주지인 1 또는 2 이상의 첨가제를 첨가할 수도 있다.

4. DNA 백신

상기 (a)∼(d)의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 대상동물의 체내에서 발현시킴으로써도, 상기 생체 내에서 항체 생산이나 세포장해성 T세포를 유도할 수 있고, 폴리펩티드를 투여하는 것과 동등한 효과가 얻어진다. 즉, 본 발명의 면역유도제는 상기 (a)∼(d)의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 포함하는 것이라도 된다. 후술의 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 이러한 항원 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터는 DNA 백신이라고도 불린다.

DNA 백신을 제조하기 위해서 사용하는 벡터는, 대상동물 세포 내(바람직하게는 포유동물 세포 내)에서 발현 가능한 벡터이면 특별하게 한정되지 않고, 플라스미드 벡터이어도 바이러스 벡터이어도 좋고, DNA 백신의 분야에서 공지인 어떠한 벡터를 사용해도 좋다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA나 RNA 등의 폴리뉴클레오티드는, 상술한 바와 같이 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 또한, 벡터에의 상기 폴리뉴클레오티드의 포함시킴은 당업자에게 주지의 방법을 이용하여 행할 수 있다.

DNA 백신의 투여경로는 바람직하게는 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여 경로이며, 투여량은 항원의 종류 등에 따라 적당하게 선택할 수 있지만, 통상 체중 1kg당, DNA 백신의 중량으로 0.1㎍∼100㎎ 정도, 바람직하게는 1㎍∼10㎎ 정도이다.

바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 예를 들면 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련(「아데노 수반」이라고도 칭한다.) 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 RNA 바이러스 또는 DNA 바이러스에, 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함시키고, 이것을 대상동물에 감염시키는 방법을 들 수 있다. 이 중에서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.

그 밖의 방법으로서는, 발현 플라스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법(DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는, 유전자를 직접 체내에 도입하는 생체 내(in vivo) 방법, 및 대상동물로부터 어느 종의 세포를 채취해 체외에서 유전자를 상기 세포에 도입하고 그 세포를 체내로 되돌리는 생체 외 방법이 있지만(닛케이 사이언스, 1994년 4월, p20-45, 월간약사, 1994년, 제36권, 제1호, p.23-48, 실험 의학 증간, 1994년, 제12권, 제15호, 및 이것들의 인용문헌 등), 생체 내 방법이 보다 바람직하다.

생체 내 방법에 의해 투여하는 경우에는, 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 근육내 등에 투여할 수 있다. 생체 내 방법에 의해 투여하는 경우에는, 예를 들면 액제 등의 제제 형태를 취할 수 있지만, 일반적으로는 유효 성분인 본 발명의 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 함유하는 주사제 등으로 되고, 필요에 따라서 관용의 담체를 첨가해도 된다. 또한, 상기 DNA를 함유하는 리포솜 또는 막융합 리포솜(센다이바이러스(HVJ)-리포솜 등)에 있어서는, 현탁제, 동결제, 원심분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, 예를 들면 「서열번호 1에 나타내어지는 염기서열」이라고 했을 경우에는, 서열번호 1에 실제로 나타내어져 있는 염기서열 외에, 이것과 상보적인 서열도 포함한다. 따라서, 예를 들면 「서열번호 1에 나타내어지는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드」라고 했을 경우에는, 서열번호 1에 실제로 나타내어져 있는 염기서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 그 상보적인 염기서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 및 이것들로 이루어지는 이중쇄 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 조제할 경우에는, 적당하게 어느 하나의 염기서열을 선택하게 되지만, 당업자라면 용이하게 그 선택을 할 수 있다.

(실시예)

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

[실시예 1] SEREX법에 의한 신규 암항원 단백질의 취득

(1) cDNA 라이브러리의 제작

개의 정소로부터 산-구아니디움-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(다카라 슈조 가부시키가이샤제)를 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리A RNA를 정제했다.

이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis kit, Zap-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE사제)를 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 1×10⁶pfu/ml이었다.

(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝

상기 제작한 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여, 면역스크리닝을 행하였다. 구체적으로는 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트에 약 2500클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜, 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)을 만들게 하고, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Sciece사제)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮음으로써 단백질을 유도·발현시켜 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수해 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7.5)에 담그어 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.

상기 환견 혈청으로서는 백혈병의 환견으로부터 채취한 혈청을 사용했다. 이들 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행하였다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하고 있지 않은 λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO₃ pH8.3의 버퍼를 플레이트에 첨가해, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science사제)에 통액하여 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS에서 500배 희석하고, 이것을 면역스크리닝 재료로 했다.

이러한 처리 혈청과 단백질을 블롯한 상기 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS에서 5000배 희석을 행한 염소항개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+L HRP conjugated: BETHYL Laboratories사제)를, 실온 1시간 반응시켜, NBT/BCIP 반응액(Roche사제)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트 상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO₄, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH7.5) 500μl에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화할 때까지 상기와 마찬가지의 방법으로, 2차, 3차 스크리닝을 반복하여 혈청 중의 IgG와 반응하는 약 10000개의 파지 클론을 스크리닝해서 1개의 양성 클론을 단리했다.

(3) 단리 항원 유전자의 서열 동일성 검색

상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기서열 해석에 제공하기 위해서, 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행하였다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200μl와, 정제한 파지 용액 100μl 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사제) 1μl를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3ml 첨가해 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕에서 20분간 보온한 후, 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행하고, 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200μl와, 정제한 파지 용액 10μl를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜, 50μl를 암피실린(마지막 농도 50㎍/ml) 함유 LB 한천배지에 뿌려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(마지막 농도 50㎍/ml) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(키아겐사제)를 사용해서 목적의 인서트를 가지는 플라스미드 DNA를 정제했다.

정제한 플라스미드는 서열번호 9에 기재된 T3 프라이머와 서열번호 10에 기재된 T7 프라이머를 이용하여, 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체 길이 서열의 해석을 행하였다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열번호 3에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 이용하여 서열 동일성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 서열 동일성 검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 MCEMP1 유전자인 것이 판명되었다. 개 MCEMP1의 인간 상동인자인 인간 MCEMP1에서는, 서열 동일성이 염기서열 70%, 아미노산 서열 51%이며, 고양이 MCEMP1에서는, 서열 동일성이 염기서열 83%, 아미노산 서열 64%이며, 마우스 상동인자인 마우스 MCEMP1에서는, 서열 동일성이 염기서열 65%, 아미노산 서열 47%이었다. 인간 MCEMP1의 염기서열을 서열번호 1, 아미노산 서열을 서열번호 2에, 고양이 MCEMP1의 염기서열을 서열번호 5, 아미노산 서열을 서열번호 6에, 마우스 MCEMP1의 염기서열을 서열번호 7, 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타낸다.

(4) 각 조직에서의 유전자 발현 해석

상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개, 인간 및 마우스의 각종 정상 조직, 각종 조양 조직 및 각종 암 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행하였다. 즉, 각 조직 50∼100㎎ 및 각 세포주 5∼10×10⁶개의 세포로부터 TRIZOL 시약(Life technology사제)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA을 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life technology사제)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상 조직(뇌, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는, 유전자풀 cDNA(Life technology사제), QUICK-Clone cDNA(클론테크사제) 및 Large-Insert cDNA Library(클론테크사제)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(개 프라이머는 서열번호 11 및 12, 인간 프라이머는 서열번호 13 및 14, 마우스 프라이머는 서열번호 15 및 16에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행하였다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25μl, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM의 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(다카라 슈조사제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가해 전량을 25μl로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 이용하여, 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복하여 행하였다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이 개 MCEMP1 유전자는, 개 조양 조직에서는 비만세포종, 항문주위선암에서 강한 발현이 보여졌다(도 1). 인간 MCEMP1 유전자 발현에 있어서는, 건강한 인간 조직에서는 대부분의 조직에서 발현이 보여지지 않고, 한편 인간 암세포에서는 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종의 세포주에서 강한 발현이 보여졌다(도 2). 또한, 마우스 MCEMP1 유전자의 발현은, 백혈병, 흉선종의 세포주에서 발현이 검출되었다(도 3).

[실시예 2] MCEMP1의 생체 내에서의 암 항원성의 해석

(1) 생체 내에서 마우스 MCEMP1을 발현하는 재조합 벡터의 제작

서열번호 7의 염기서열을 기초로, 이하의 방법으로 생체 내에서 마우스 MCEMP1을 발현하는 재조합 벡터를 제작했다. PCR은 실시예 1에 있어서 발현이 보여진 마우스 백혈병 세포주 EL4(ATCC로부터 구입)로 조제했다. cDNA를 1μl, EcoRI 및 NotI 제한효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 17 및 18에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(다카라 슈조 가부시키가이샤제)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가해 전량을 50μl로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 이용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복함으로써 행하였다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 8의 아미노산 서열 전체 길이를 코드하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제) 를 이용하여 약 550bp의 DNA 단편을 정제했다.

정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(Life technology사)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 EcoRI 및 NotI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 EcoRI 및 NotI 제한효소로 처리한 포유류 발현 벡터 pcDNA 3.1(Invitrogen사제)에 삽입했다(이하, 마우스 MCEMP1/pcDNA 3.1). 이 벡터의 사용에 의해 포유류의 세포 내에서 마우스 MCEMP1 단백질이 산생된다.

상기에서 제작한 플라스미드 DNA 100㎍에 50㎍의 금입자(Bio Rad사제), 스페르미딘 100μl(SIGMA사제), 1M CaCl₂ 100μl(SIGMA사제)를 첨가하고, 볼텍스에 의해 교반해 10분 실온에서 정치했다(이후 금-DNA입자로 기재한다). 3000rpm으로 1분 원심한 후, 상청을 버리고 100% 에탄올(WAKO사제)에 의해 3회 세정했다. 금-DNA입자에 100% 에탄올 6ml를 첨가해 볼텍스에 의해 충분하게 교반한 후, 금-DNA입자를 Tefzel Tubing(Bio Rad사제)에 흘려 넣고, 벽면에 침전시켰다. 금-DNA입자가 부착된 Tefzel Tubing의 에탄올을 풍건하고, 유전자총에 적합한 길이로 잘랐다(이하, 마우스 MCEMP1/튜브).

(2) DNA 백신법에 의한 마우스 MCEMP1의 항종양 효과-1

5마리의 A/J 마우스(7주령, 수컷, 일본 SLC사에서 구입)에 대하여, 상기에서 제작한 튜브(마우스 MCEMP1/튜브)를 유전자총에 고정하고, 순헬륨 가스를 이용하여 400psi의 압력으로, 체모(剃毛) 한 마우스의 복강에 DNA 백신을 7일마다 합계 3회, 경피 투여한 후에(플라스미드 DNA 접종량은 2㎍/마리로 된다) 실시예 1에 있어서 MCEMP1 유전자의 발현이 보여진 마우스 백혈병 세포주 EL4세포를 이식해서 항종양 효과를 평가했다(예방 모델). 또한, 컨트롤로서 마우스 MCEMP1 유전자가 삽입되어 있지 않은 플라스미드 DNA를 예방 모델에서 5마리 투여했다.

항종양 효과는 종양의 크기(장경×단경²/2) 및 생존 마우스의 비율로 평가했다. 본 검토의 결과, 예방 모델에 있어서 28일 후에는 컨트롤군 및 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군에서, 각각 1153㎣, 480㎣로 되고, 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군에서는 종양의 현저한 퇴축이 관찰되었다. 또한, 생존의 경과를 관찰한 결과, 예방 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여 후 59일에서 전례 사망한 것에 대해, 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군에서는 60%의 마우스가 생존하고 있었다. 이상의 결과로부터, 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군은 컨트롤군에 비해서 유의한 항종양 효과가 확인되었다.

(3) DNA 백신법에 의한 마우스 MCEMP1의 항종양 효과-2

5마리의 A/J 마우스(7주령, 수컷, 일본SLC사에서 구입)에 대하여, 상기에서 제작한 튜브(마우스 MCEMP1/튜브)를 유전자총에 고정하고, 순헬륨 가스를 이용하여 400psi의 압력으로, 체모한 마우스의 복강에 DNA 백신을 7일마다 합계 3회, 경피 투여한 후에(플라스미드 DNA 접종량은 2㎍/마리로 된다) 실시예 1에 있어서 MCEMP1 유전자의 발현이 보여진 마우스 백혈병 세포주 EG7세포를 이식해서 항종양 효과를 평가했다(예방 모델). 또한, 컨트롤로서 마우스 MCEMP1 유전자가 삽입되어 있지 않은 플라스미드 DNA를 예방 모델에서 5마리 투여했다.

항종양 효과는 종양의 크기(장경×단경²/2) 및 생존 마우스의 비율로 평가했다. 본 검토의 결과, 예방 모델에 있어서 28일 후에는 컨트롤군 및 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군에서, 각각 982㎣, 521㎣로 되고, 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군에서는 종양의 현저한 퇴축이 관찰되었다. 또한 생존의 경과를 관찰한 결과, 예방 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여 후 68일에서 전례 사망한 것에 대해, 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군에서는 60%의 마우스가 생존하고 있었다. 이상의 결과로부터, 마우스 MCEMP1 플라스미드 투여군은 컨트롤군에 비해서 유의한 항종양 효과가 확인되었다.

(4) 생체 내에서 인간 MCEMP1을 발현하는 재조합 벡터의 제작

서열번호 1의 염기서열을 기초로, 이하의 방법으로 생체 내에서 인간 MCEMP1을 발현하는 재조합 벡터를 제작했다. PCR은 실시예 1에 있어서 발현이 보여진 인간 백혈병 세포주 U937(ATCC로부터 구입)로 조제했다. cDNA를 1μl, EcoRI 및 NotI 제한효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 19 및 20에 기재)를 각0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(다카라 슈조 가부시키가이샤제)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가해 전량을 50μl로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 이용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복함으로써 행하였다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 2의 아미노산 서열 전체 길이를 코드하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 이용하여 약 550bp의 DNA 단편을 정제했다.

정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(Life technology사)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 EcoRI 및 NotI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 EcoRI 및 NotI 제한효소로 처리한 포유류 발현 벡터 pcDNA 3.1(Invitrogen사제)에 삽입했다(이하, 인간 MCEMP1/pcDNA 3.1). 이 벡터의 사용에 의해 포유류의 세포 내에서 인간 MCEMP1 단백질이 산생된다.

상기에서 제작한 플라스미드 DNA 100㎍에 50㎍의 금입자(Bio Rad사제), 스페르미딘 100μl(SIGMA사제), 1M CaCl₂ 100μl(SIGMA사제)를 첨가하고, 볼텍스에 의해 교반해 10분 실온에서 정치했다(이후 금-DNA입자로 기재한다). 3000rpm으로 1분 원심한 후, 상청을 버리고 100% 에탄올(WAKO사제)에 의해 3회 세정했다. 금-DNA입자에 100% 에탄올 6ml를 첨가해 볼텍스에 의해 충분하게 교반한 후, 금-DNA입자를 Tefzel Tubing(Bio Rad사제)에 흘려 넣고, 벽면에 침전시켰다. 금-DNA입자가 부착된 Tefzel Tubing의 에탄올을 풍건하고, 유전자총에 적합한 길이로 잘랐다(이하, 인간 MCEMP1/튜브).

(5) 전체 길이 인간 MCEMP1 정상 발현세포의 수립

상기에서 제작한 인간 MCEMP1/pcDNA 3.1을 마우스 신경아세포종 세포주 N2a 세포(ATCC사)에 리포펙션법에 의해 도입하고, 500㎍/ml의 G418(나카라이사)에 의한 선발에 의해, 전체 길이 인간 MCEMP1을 정상적으로 발현하는 N2a 세포주를 수립했다(N2a-인간 MCEMP1). 또한, 인간 MCEMP1을 코드하는 cDNA가 삽입되어 있지 않은 발현 벡터(이하, emp/pcDNA 3.1)를 상기와 마찬가지로 도입해서 선발한 세포를 컨트롤 세포라고 했다(이하, N2a-emp).

(6) DNA 백신법에 의한 인간 MCEMP1의 항종양 효과

5마리의 A/J마우스(7주령, 수컷, 일본SLC사에서 구입)에 대하여, 상기에서 제작한 튜브(인간 MCEMP1/튜브)를 유전자총에 고정하고, 순헬륨 가스를 이용하여 400psi의 압력으로, 체모한 마우스의 복강에 DNA 백신을 7일마다 합계 3회, 경피 투여한 후에(플라스미드 DNA 접종량은 2㎍/마리로 된다) 상기에서 제작한 N2a-인간 MCEMP1을, 또한 컨트롤 세포로서 N2a-emp를 각각 이식해서 항종양 효과를 평가했다(예방 모델). 또한, 컨트롤로서 인간 MCEMP1 유전자가 삽입되어 있지 않은 플라스미드 DNA를 예방 모델에서 5마리 투여했다.

항종양 효과는 종양의 크기(장경×단경²/2) 및 생존 마우스의 비율로 평가했다. 본 검토의 결과, N2a-인간 MCEMP1의 예방 모델에 있어서, 28일 후에는 컨트롤군 및 인간 MCEMP1 플라스미드 투여군에서, 각각 1379㎣, 513㎣로 되고, 인간 MCEMP1플라스미드 투여군에서는 종양의 현저한 퇴축이 관찰되었다. 또한, 생존의 경과를 관찰한 결과, 예방 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여 후 61일에서 전례 사망한 것에 대해, 인간 MCEMP1 플라스미드 투여군에서는 60%의 마우스가 생존하고 있었다. 이상의 결과로부터, N2a-인간 MCEMP1의 예방 모델에 있어서 인간 MCEMP1 플라스미드 투여군은 컨트롤군에 비해서 유의한 항종양 효과가 확인되었다. 한편, N2a-emp의 예방 모델에 있어서는, 인간 MCEMP1 플라스미드 투여군은 컨트롤군에 비해서 유의한 항종양 효과는 확인되지 않았다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명은 각종 암에 대하여 항종양 활성을 발휘하는 폴리펩티드를 포함하는 면역유도제를 제공하기 때문에 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Immunity-Inducing Agent <130> PH-6863-PCT <150> JP 2016-064034 <151> 2016-03-28 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1326 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (26)..(589) <400> 1 tggacaaatt tgcgggctgg ggacc atg gaa gtg gag gaa atc tac aag cac 52 Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His 1 5 cag gaa gtc aag atg caa gca cca gcc ttc agg gac aag aaa cag ggg 100 Gln Glu Val Lys Met Gln Ala Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly 10 15 20 25 gtc tca gcc aag aat caa ggt gcc cat gac cca gac tat gag aat atc 148 Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile 30 35 40 acc ttg gcc ttc aaa aat cag gac cat gca aag ggt ggt cat tca cga 196 Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg 45 50 55 ccc acg agc caa gtc cca gcc cag tgc agg ccg ccc tca gac tcc acc 244 Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr 60 65 70 cag gtc ccc tgc tgg ttg tac aga gcc atc ctg agc ctg tac atc ctc 292 Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu 75 80 85 ctg gcc ctg gcc ttt gtc ctc tgc atc atc ctg tca gcc ttc atc atg 340 Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met 90 95 100 105 gtg aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag 388 Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu 110 115 120 ctt tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag 436 Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys 125 130 135 aga ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag 484 Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys 140 145 150 att gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca 532 Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr 155 160 165 aag gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca 580 Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser 170 175 180 185 cct caa taa atgagaggac attgtggcag ccaaagccac aacttggaag 629 Pro Gln atggggctgc acctgccaac gaagacggga aatgaccccc cccccccagc ctagtgtgaa 689 cctgcccctc gtcccacgta tagaaaaacc tcgagtcatg gtgaatgagt gtctcggagt 749 tgctcgtgtg tgtgtacacc tgcgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgcgcgtg tgttcgtgta 809 tgtgcgtgtg tgcgtgcgcg tgtgtgtgca ttttgcaaag ggtggacatt tcagtgtatc 869 tcccagaaag gtgatgaatg aataggactg agagtcacag tgaatgtggc atgcatgcct 929 gtgtcatgtg acatatgtga gtctcggcat gtcacggtgg gtggctgtgt ctgagcacct 989 ccagcagatg tcactctgag tgtgggtgtt ggtgacatgc attgcacggg cctgtctccc 1049 tgtttgtgta aacatactag agtatactgc ggcgtgtttt ctgtctaccc atgtcatggt 1109 gggggagatt tatctccgta catgtgggtg tcgccatgtg tgccctgtca ctatctgtgg 1169 ctgggtgaac ggctgtgtca ttatgagtgt gccgagttat gccaccctgt gtgctcaggg 1229 cacatgcaca cagacattta tctctgcact cacattttgt gacttatgaa gataaataaa 1289 gtcaagggaa aacagcgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa 1326 <210> 2 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His Gln Glu Val Lys Met Gln Ala 1 5 10 15 Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly 20 25 30 Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln 35 40 45 Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala 50 55 60 Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr 65 70 75 80 Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu 85 90 95 Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met Val Lys Asn Ala Glu Met Ser 100 105 110 Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser 115 120 125 Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln 130 135 140 Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr 145 150 155 160 Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu 165 170 175 Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro Gln 180 185 <210> 3 <211> 1124 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (66)..(689) <400> 3 ctcatctgcc atgacacctt ccggtgggtg gggatgtgtg tgggtaaact ggcccactgg 60 gaacc atg gag tct gag gaa atc tac acg aat cag aag gtc gag atg cag 110 Met Glu Ser Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Gln Lys Val Glu Met Gln 1 5 10 15 gca gcc ttc aaa gac aag aaa cag agg gtc cca gct gat aag gaa ggt 158 Ala Ala Phe Lys Asp Lys Lys Gln Arg Val Pro Ala Asp Lys Glu Gly 20 25 30 gca gat aac cct gac tat gag aat atc acc ttg gcc ttc aga aac cag 206 Ala Asp Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Gln 35 40 45 gac cag cca aag ggc agc cat tta cca ccc aag aat cag agc aag cag 254 Asp Gln Pro Lys Gly Ser His Leu Pro Pro Lys Asn Gln Ser Lys Gln 50 55 60 cca cct gcc agg aca cat cac acg gcc ttg gga ggg gcc cac gtc cca 302 Pro Pro Ala Arg Thr His His Thr Ala Leu Gly Gly Ala His Val Pro 65 70 75 acc ctg tct agg ctg ccc tca gac tct ggc cag ctc ccc cgt tgt ctg 350 Thr Leu Ser Arg Leu Pro Ser Asp Ser Gly Gln Leu Pro Arg Cys Leu 80 85 90 95 cac aga gtc atc atg agc ctg tac atg ctc ctc gcc ctg tcc tgc atc 398 His Arg Val Ile Met Ser Leu Tyr Met Leu Leu Ala Leu Ser Cys Ile 100 105 110 att ctc tta gtc ttg gtc ctc atg aag aat ctg gag atg tcc cag gag 446 Ile Leu Leu Val Leu Val Leu Met Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu 115 120 125 ttg ctg gcc ctg aaa agg gag ctc tgg aat gtg tcc gtc tcg gtg caa 494 Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln 130 135 140 gag tgc cag gag cag cag aat cag ggc tgg agc acc gtc cgg cag ctc 542 Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu 145 150 155 ctg gtg gag gcc aag cgt gac att tcc atg gtc ggg aga aat gcc cag 590 Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln 160 165 170 175 ctt gcg agt gag aag gtg aag acg ctg aca gca gac ata agc cat atc 638 Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile 180 185 190 aag agt aag tta cag gaa atc tcc aag atg ctg gag aag cca aag cca 686 Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro 195 200 205 tag acctcaacat acgcgaggac atcgaagccc tggctgcagc ttggcggacg 739 gggctgcgcc tcccagtgaa gatggccacg tgtgtgcacc acgtgtgttg tgagcctaag 799 gcgtgacaca gtgggtggct gtgtcagcag ggaccacgaa agtgtgtcag cgtgttgttg 859 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Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu 130 135 140 Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu 145 150 155 160 Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu 165 170 175 Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys 180 185 190 Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro 195 200 205 <210> 5 <211> 1416 <212> DNA <213> Felis catus <220> <221> CDS <222> (24)..(641) <400> 5 tctgcttgaa tcaggaggtc agg atg caa gca gca gac ttc aaa ggc aag aaa 53 Met Gln Ala Ala Asp Phe Lys Gly Lys Lys 1 5 10 cag agg gcc cca gac cat aag gaa ggt tcg gta cct caa ggt gca gac 101 Gln Arg Ala Pro Asp His Lys Glu Gly Ser Val Pro Gln Gly Ala Asp 15 20 25 cct gac tat gag aat atc acc ttg acc ttc aga aac cag gag caa cca 149 Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Thr Phe Arg Asn Gln Glu Gln Pro 30 35 40 agg ggc agc cat tca cca ccc aag aat cga ggc aag cag cca cct gcc 197 Arg Gly Ser His Ser Pro Pro Lys Asn Arg Gly Lys Gln Pro Pro Ala 45 50 55 agc ccg cac ctc aca gcc tcg gga ggg gcc cct gtc cca gcc tgg tcg 245 Ser Pro His Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Ala Trp Ser 60 65 70 aag cag gcc cca gac tct gcc cag gtc cct cgt tgg ctg cac aga gtc 293 Lys Gln Ala Pro Asp Ser Ala Gln Val Pro Arg Trp Leu His Arg Val 75 80 85 90 acc ctg agc ctg tac atc ctc ctt gcc ctg ttc tgc atc gtt ctc ttg 341 Thr Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Phe Cys Ile Val Leu Leu 95 100 105 gcc ttg gtc ctg gtg aag aat tct gag gtg tcc cag gag ctg ctg gtc 389 Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val 110 115 120 gtg aaa agg gag ctc cag aat gtc tcc atc tcg gga caa cag tgt cag 437 Val Lys Arg Glu Leu Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln 125 130 135 gag gag cag aaa cag ggc tgg agc agc gtc cag cag ctc atc acg gag 485 Glu Glu Gln Lys Gln Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu 140 145 150 gcc agg cag gac att gac atg atc aag aga aat gtc cac atc ggg aac 533 Ala Arg Gln Asp Ile Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn 155 160 165 170 gag aaa gtg aag 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Asp Ile Asp 145 150 155 160 Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr Leu 165 170 175 Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser Lys 180 185 190 Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln 195 200 205 <210> 7 <211> 1132 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (21)..(572) <400> 7 acgtgaatca accaagcaga atg cat gca tca gcc tcc cag gat aag aac cgg 53 Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg 1 5 10 agg aag cca ggt cat gat gaa ggt gct cac aat cct gac tac gag aat 101 Arg Lys Pro Gly His Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn 15 20 25 ata acc ttg gcc ttc aga aac aag gac caa ctc aaa ctc agc caa tca 149 Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser 30 35 40 aca ccc aca aaa caa gcc aag ttc aag aca tcc ctg gac cca gct gag 197 Thr Pro Thr Lys Gln Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu 45 50 55 tcc ccg cct tgg ttg tac aga acc att atg atg ttg tat gtt ctc ctt 245 Ser Pro Pro Trp Leu Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu 60 65 70 75 gct ctc gtc ttt tta tcc tgc atc gtc ctc tct gct ttg gtc ttg gtg 293 Ala Leu Val Phe Leu Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val 80 85 90 aaa aat tct gag atg tcc aag gag ctg tgg acc ttg aaa gca gag ctt 341 Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu 95 100 105 tcg aat gtt tca gac acg gtg tgg aat atc cgg gag ctc cag aat cag 389 Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln 110 115 120 caa acg agg att tgg gaa gct gcc cag ggg gac atc aag gag gtc aag 437 Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys 125 130 135 aag acc ctt ggc aca gtc atg agt agc atc cag act gga aac gac cgg 485 Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg 140 145 150 155 ctg aag act gtg ccg gca gat ata acc caa atc aag aaa act ctt gag 533 Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu 160 165 170 gcg cta gaa aag aag gca cag cct cag ccc agt aca taa gaggacacca 582 Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr 175 180 cagcagtacc tgtgaagact ccgaattgca cctgctagtg aagatggcag atgggggtgg 642 gtactgagct tgagtgtgaa cctgccgtgc atcctcatat aaaaaagatt ctccaccagg 702 gggaatgagt gttgaagagg tgtgtatgca aatgagcatt tggggtttcc atgtattcca 762 ggagaagggt ttatggtgga aagagaacat ggcagtcaca gcaggtgtta ctctttatgg 822 gccacatagg tgtatgccct ggcttatgtg agtataggca tgtcctggtt ggcagctatt 882 cccgagaagt ccccaaagtg taagtgacat gtaggacatg cctccccatt ctcttgctca 942 tgtatgtgca tctggctgtt ctgtatgtgt gtcactgaag tggtgggtga tagacatcac 1002 cctggagatg tgtcatggca tgggtcattc ctagtgtttt tggtcatgtc agcttgtgtg 1062 ttcagggcat gcacacaaat gtagccatcg atttctgcac ttgtatttat gattcaagaa 1122 gataaatgcc 1132 <210> 8 <211> 183 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg Arg Lys Pro Gly His 1 5 10 15 Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe 20 25 30 Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser Thr Pro Thr Lys Gln 35 40 45 Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu Ser Pro Pro Trp Leu 50 55 60 Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu Ala Leu Val Phe Leu 65 70 75 80 Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Met 85 90 95 Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu Ser Asn Val Ser Asp 100 105 110 Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln Gln Thr Arg Ile Trp 115 120 125 Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys Lys Thr Leu Gly Thr 130 135 140 Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg Leu Lys Thr Val Pro 145 150 155 160 Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu Ala Leu Glu Lys Lys 165 170 175 Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr 180 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T3 primer <400> 9 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 primer <400> 10 taatacgact cactatagg 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> canis RT primer sense <400> 11 ccacgtccca accctgtcta 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> canis RT primer antisense <400> 12 gtgctccagc cctgattctg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human RT primer sense <400> 13 tggccttcaa aaatcaggac 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human RT primer antisense <400> 14 aggctcagga tggctctgta c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse RT primer sense <400> 15 tccaaggagc tgtggacctt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse RT primer antisense <400> 16 agtcttcagc cggtcgtttc 20 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse mcemp1 EcoRI primer sense <400> 17 gaattcgccg ccaccatgca tgcatcagcc tcccagg 37 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse mcemp1 NotI primer antisense <400> 18 gcggccgctt atgtactggg ctgaggctg 29 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCEMP1 EcoRI primer sense <400> 19 gaattcgccg ccaccatgga agtggaggaa atctacaag 39 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCEMP1 NotI primer antisense <400> 20 gcggccgctt attgaggtga ggactgtgg 29

Claims (11)

1. 이하의 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리펩티드로부터 선택되고 또한 면역유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 면역유도제.
   (a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상으로부터 전체 길이 이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
   (b) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
   (c) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
   (d) 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하는 폴리펩티드
2. 제 1 항에 있어서,
   항원제시세포의 처리제인 면역유도제.
3. 제 1 항에 있어서,
   암의 치료 및/또는 예방제의 유효 성분인 면역유도제.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 암이 MCEMP1을 발현하는 암인 면역유도제.
5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
   상기 암이 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 또는 항문주위선암인 면역유도제.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   면역증강제를 더 포함하는 면역유도제.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 면역증강제가, 프로인트의 불완전 아쥬반트, 몬타나이드, 폴리IC 및 그 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드, 인터류킨12, 인터류킨18, 인터페론α, 인터페론β, 인터페론ω, 인터페론γ 및 Flt3 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 면역유도제.
8. 제 1 항에 정의하는 폴리펩티드와 피험체 유래의 항원제시세포를 생체 외(ex vivo) 또는 인비트로(in vitro)에서 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원제시세포의 제작 방법.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 항원제시세포가 MHC클래스 I분자를 보유하는 수상세포 또는 B세포인 방법.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 항원제시세포와 피험체 유래의 T세포를 생체 외 또는 인비트로에서 접촉시켜서 상기 T세포를 활성화하는 것을 포함하는, 제 1 항에 정의하는 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포의 제작 방법.
11. 이하의 (a)∼ (d)의 폴리펩티드로부터 선택되고 또한 면역유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 피험체에 투여하는 것을 포함하는 면역유도 방법.
    (a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상으로부터 전체 길이 이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
    (b) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
    (c) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 또는 8에 나타내어지는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
    (d) 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하는 폴리펩티드

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