WO2004020657A1 - 酸化還元酵素と基質との反応中間体を捕捉する方法 - Google Patents

酸化還元酵素と基質との反応中間体を捕捉する方法 Download PDF

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Takashi Ogura
Shigeki Kuroiwa
Shinya Yoshikawa
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Japan Science And Technology Agent
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase

Definitions

  • the present invention relates to a method for capturing a reaction intermediate between a oxidoreductase such as cytochrome c oxidase and a substrate and a substrate.
  • a oxidoreductase such as cytochrome c oxidase
  • the present invention provides a method for reducing oxidoreductase such as cytochrome c oxidase sufficiently by using a photoexcited reducing agent that emits electrons by light irradiation at such a low temperature that an aqueous solution containing oxidoreductase and a substrate freezes.
  • a photoexcited reducing agent that emits electrons by light irradiation at such a low temperature that an aqueous solution containing oxidoreductase and a substrate freezes.
  • a reaction is performed by reacting an enzyme solution containing a substrate at a low temperature, using a reagent that emits electrons by irradiating light, irradiating it with light, and reducing the enzyme.
  • a reaction is carried out at a low temperature, there is almost no diffusion of the reagent and the efficiency of photoreduction is low.
  • we have found conditions that can be completely reduced by using an amine-based electron donor that supplies electrons to the photochemical reaction reagent. Was. In this way, we successfully succeeded in capturing the reaction intermediate of the oxidoreductase.
  • the reaction between the enzyme and the substrate is carried out without using an inhibitor in order to avoid side reactions due to P and to apply to enzymes in which an appropriate inhibitor is not present. Start at low temperature and capture reaction intermediates at low temperature. In this case, the reaction does not take place at the time of mixing the substrate with the enzyme, so there is no need to mix the substrate rapidly, and the target may be a crystalline protein. Can open.
  • the present invention provides a first step, a first step, in which an oxidoreductase, a photoexcited reducing agent that emits electrons upon irradiation with light, an amine-based electron donor, and a substrate of the oxidoreductase are dissolved and mixed in water
  • a second step in which the mixture produced in step 2 is cooled to 70 to 27 OK and frozen, and a light having a wavelength including the absorption wavelength of the metal complex at 70 to 270 K is added to the frozen mixture produced in the second step.
  • FIG. 1 shows a low-temperature absorption spectrum of cytochrome c oxidase.
  • the components of the oxidoreductase, the photoexcited reducing agent that emits electrons by light irradiation, the amine-based electron donor, and the substrate of the oxidoreductase are dissolved in water.
  • the substrate is a gas
  • the gas may be separately blown later into a solution in which other components are mixed.
  • Oxidoreductase is an enzyme that catalyzes some kind of redox reaction and is one of the EC1 groups, one of the main groups in the enzyme classification set by the Enzyme Committee of the International Union of Biochemistry (IUB).
  • IUB International Union of Biochemistry
  • alcohol dehydrogenase hydrogenase, nitric oxide reductase, denitrifying enzymes (nitrate reductase, nitrite reductase, nitric oxide reductase, nitrous oxide reductase), P450 superfamily (P450nor, P450scc, P450cam, etc.)
  • Quinol oxidase mitochondrial inner membrane electron transfer enzyme (complex I, complex II, cytochrome complex, cytochrome c oxidase, etc.), photosynthetic electron transfer enzyme (cytochrome f complex, Fd-NADP + Reductase, etc.), oxygen-adding enzymes (tryptophan 2,
  • Examples of photo-exciting reducing agents that emit electrons upon irradiation with light include transgene complexes such as luteuium complexes (such as [Ru (bipyridine) 3 ] 2 ⁇ [Ru ( ⁇ 3 ) 6 ] 2+ ), and hydrocarbons. (Perylene and its derivatives, pyrene and its derivatives, etc.), various dyes (Vorphyrin (without Zn, Mg, and metal ions)), pH indicator (Methylene phenol, Ataridine orange, etc.), Methyl viologen, etc. Is mentioned.
  • transgene complexes such as luteuium complexes (such as [Ru (bipyridine) 3 ] 2 ⁇ [Ru ( ⁇ 3 ) 6 ] 2+ ), and hydrocarbons. (Perylene and its derivatives, pyrene and its derivatives, etc.), various dyes (Vorphyrin (without Zn, Mg, and metal ions)), pH indicator (Methylene phenol, Atar
  • [Ru (bipyridine) 3 ] 2+ has absorption peaks at 452 nm and 4226 nm, and is irradiated with light containing these wavelengths to excite it.
  • the amount of the photoexciting reducing agent in the aqueous solution should be 2 to the reduction equivalent of the enzyme; about 0 times the concentration is necessary. At low temperatures, the efficiency of photoreduction is low and extra reagent is required. 1 110 O mM.
  • the substrate is a compound that is catalyzed by the oxidoreductase, and is a substance that is reduced by receiving an electron.
  • an electron acceptor other than the enzyme's original physiological substrate may be used.
  • the concentration of the substrate in the aqueous solution is about 1 ⁇ to 20 mM.
  • the amine electron donor is an amine compound having an amino group, an imino group, a hydrazino group, etc., which regenerates by supplying electrons to an oxidized photochemical reaction reagent after the photoexcited reducing agent releases electrons. .
  • the amine electron donor has the role of preventing the electrons that have gone to the substrate or enzyme from returning to the photochemical reaction reagent, and is relatively stable, but is deprived of the electrons by the photochemical reaction reagent.
  • Examples of the amine-based electron donor include ethylenediaminetetraacetic acid, triethanolamine, L-cystine, aerin, N, N-dimethylfurin and the like. These may be used in combination.
  • the concentration of the amine-based electron donor in the aqueous solution is about 1 mM to 100 mM.
  • the aqueous solution may further contain a pH buffer, a solubilizing agent, and other reagents, if necessary.
  • a phosphate buffer or a Good's buffer may be used, and the pH is maintained within a range where the oxidoreductase can function normally (pH 1 to 14).
  • the concentration of the pH buffer is preferably higher than the concentration of the photoexciting reducing agent in order to suppress the pH change accompanying the reaction of the photoexciting reducing agent, and is about 1 to 20 mM.
  • oxidoreductase When the oxidoreductase is not a water-soluble protein, a surfactant (n-decyl- ⁇ -D-maltopyranoside ⁇ n-dodecyl- ⁇ -D-maltopyranoside cornoleic acid, Triton X-100 etc.) / ⁇ . Its concentration is about 0-1% (W / V).
  • the mixture produced in the first stage is cooled and frozen.
  • This temperature is 70 K to 270, that is, the temperature at which the aqueous solution is frozen and at which photoreduction is possible.
  • This temperature is preferably lower than the temperature at which the substrate starts to diffuse in the mixture (referred to as the “diffusion start temperature”), but it is convenient to use the liquid nitrogen temperature (77 K).
  • the diffusion initiation temperature is a temperature specific to the substrate and is substantially constant under the conditions as in the present invention.
  • the diffusion start temperature can be known from the data of this example, for example, and is between 170: in the case of oxygen and 140 to 170 in the case of carbon monoxide.
  • the frozen mixture is irradiated with light.
  • the photoexcited photoexcited reducing agent emits electrons, and the oxidoreductase receives the electrons and is reduced.
  • the temperature in this step may be the same as that in the second step, but from the viewpoint that the reaction with the substrate does not proceed, it is preferable that the temperature be lower than the diffusion start temperature. Is preferred. Therefore, the temperature at this stage is preferably a temperature lower than the diffusion start temperature, more preferably a temperature 5 to 20 K lower than the diffusion start temperature.
  • the temperature is raised from the previous step, and the reduced redox enzyme reacts with the substrate to form a reaction intermediate.
  • the temperature in this stage is higher than the temperature in the previous stage, and is preferably a temperature equal to or higher than the diffusion start temperature, but is equal to or lower than 270 K, more preferably, a diffusion start temperature to a diffusion start temperature + 5.
  • the temperature is in the range of 0 K, more preferably the temperature in the range from the diffusion start temperature to the diffusion start temperature + 30 K, most preferably the diffusion start temperature.
  • a fifth step of cooling the frozen mixture produced at this step to a temperature lower than the diffusion start temperature may be added. This is for retaining the reaction intermediate. It is usually convenient to set this temperature to the liquid nitrogen temperature (77 K).
  • the method of the present invention can be applied to protein engineering as follows. The same applies to existing enzyme proteins, but in the future, if an enzyme is designed to function artificially with a redox reaction, technology to capture reaction intermediates at low temperatures will be important. this This makes it easier to determine the structure of the enzyme during the reaction by performing X-ray crystal structure analysis when testing and evaluating the function of the enzyme.
  • the present invention is a reaction intermediate fixing method that does not require modification of an inhibitor or an enzyme, and the range of usable enzymes has been widened.
  • photochemical reaction reagents with higher photosensitivity, reagents that combine photochemical reaction reagents and electron donors, etc. It can also be expected that only one electron is given to the enzyme using the luminescent light, and a reaction is generated for each electron, thereby making it possible to detect the enzyme reaction step by step.
  • the method of the present invention can be used for a low-temperature oxygen detector.
  • Nitric oxide produced in the body is unstable, but raw materials and nitric oxide reductase
  • a reaction intermediate in which cytochrome c oxidase reduces a substrate (oxygen) was captured by the following procedure.
  • Cytochrome c oxidase was added to 50 mM phosphate buffer (pH 6.8) containing 0.2% n-decyl- -D-maltopyranoside (purchased from Anatrace) (reported by Yoshikawa et al. (1977) Journal of Biological Chemistry , 252, 5498-5508).) Solvent 20 ⁇ ⁇ .
  • Tris (2,2, -bipyridine) dichlororuthenium (II) (purchased from Sigma) is added to the solution of (3) in a dark place. After adding 100 M, the mixture is frozen in liquid nitrogen.
  • FIG. 1 shows the absorption spectrum at this time.
  • an absorption peak is observed around 603 nm, but there is no absorption derived from the reagent used in this vicinity, which coincides with the absorption peak of the reduced form of cytochrome c oxidase.
  • the light irradiation excites the inium complex by photoexcitation and emits electrons, which pass electrons to cytochrome c oxidase, which is reduced.
  • the ruthenium complex that has released electrons is a strong oxidizing agent, and if it is left as it is, a reverse reaction occurs in which electrons are removed from reduced cytochrome C oxidase, and the reaction does not proceed.
  • an oxide-type ruthenium complex was reduced again by appropriately adding a substance serving as an electron donor.However, when the solution was frozen at a low temperature and the diffusion of molecules was small, although it was difficult to transfer electrons to the oxidized ruthenium complex, this problem was solved in the present invention by using an ammine-based electron donor (a mixture of ethylenediaminetetraacetic acid and furin). As a result, 100% photoreduction of cytochrome c oxidase was completed.

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Abstract

チトクロムｃ酸化酵素等の酸化還元酵素の反応中間体を確実に捕捉する。　酸化還元酵素、光照射により電子を放出する光励起還元剤、アミン系電子供与体、及び該酸化還元酵素の基質を水に溶解させ混合する第１段階、第１段階で生成した混合物を７０～２７０Ｋに冷却して凍結する第２段階、第２段階で生成した凍結混合物に７０～２７０Ｋで前記金属錯体の吸収波長を含む波長の光を照射する第３段階、及び第３段階で生成した凍結混合物を８０～２７０Ｋであって第３段階の温度より高い温度へ昇温する第４段階から成る酸化還元酵素の反応中間体を捕捉する方法である。

Description

明 細 書 酸化還元酵素と基質との反応中間体を捕捉する方法 技術分野
この発明は、 チトクロム c酸化酵素等の酸化還元酵素と基質との反応中間体を 捕捉する方法に関する。 従来技術
チトクロム c酸化酵素等の何らかの酸化還元反応を触媒する酵素の、 酸化還元 過程の中間体を捕捉することは、 その反応機構を解明する上で極めて重要である ため、 従来様々な試みがなされている。
例えば、還元型チトクロム c酸化酵素に阻害剤として一酸化炭素を作用させて 不活性化した後、 一 2 5 °cmsの低温で酸素を加え、 さらに低温にして凍結し、 これに光を照射することにより阻害剤である一酸化炭素を解離させて、 酸素との 反応中間体を捉えることが報告されている （Chance, B . , Saronio, C , Leigh, Jr . , J. S . , Ingledew, W. J. , and King, T . E . (1978 ) Bioc em.
J. , 171, 787-798)。 この場合、 阻害剤が副反応を起こす可能性を否定できず、 また適切な阻害剤が存在しない酵素には適用できない。 また、 対象が結晶タンパ ク質の場合、 基質を迅速に混合することは困難である等の問題があった。
また、 室温で光照射により電子を放出する試薬であるルテニウム錯体を用いて チトクロム c酸化酵素を光還元することが報告されている （Scoは R . A. and Gray, H . B. (1980 ) J. Am. Chem. Soc . , 102 , 3219 - 3224) 。し力 し、 このような試薬を用いて上記文献のように低温で凍結して反応中間体を捕捉しよ うとしても、 室温と違って試薬の拡散がないため光還元の効率が非常に悪いとい う問題がある。
また従来は、 主として時間^の分光学的測定を行って酵素と基質の反応中間 体について議論していた。 また、 反応開始前や反応終了後などの結晶タンパク質 を用いた X線結晶構^ 祈の結果から反応中間体のタンパク質の構造に関して推 論を行っていた。 発明が解決しようとする課題
本発明は、 酸化還元酵素と基質を含む水溶液が凍結するような低温において、 光照射により電子を放出する光励起還元剤によりチトクロム c酸化酵素等の酸化 還元酵素を十分に還元し、 酸化還元酵素の反応中間体を確実に捕捉する方法であ つて、 従来のように酵素の阻害剤を用いることなく、 結晶状態の酵素の反応中間 体も低温捕捉の対象とすることができる方法を徹する。 課題を解決するための手段
上記の課題を解決するために、 基質を含む酵素溶液を低温で反応させ、 そのた めに光照射により電子を放出する試薬を用い、 これに光を照射して、 酵素を還元 することにより反応を開始させる。 この反応を低温で行うため、 試薬の拡散がほ とんどなく光還元の効率は悪いが、 光化学反応試薬に電子を供給するアミン系電 子供与体を用いることで完全に還元できる条件を見出した。 このようにして酸化 還元酵素の反応中間体を確実に捕捉することに成功した。
本発明の方法においては、 P且害剤による副反応を避け、 また適切な阻害剤が存 在しな ヽ酵素にも適用するために、 阻害剤を使用せずに酵素と基質との反応を低 温で開始させ、 反応中間体を低温で捕捉する。 この場合、 基質を酵素と混合する 時点では反応は起こらないので迅速に混合する必要がなくなり、 対象が結晶タン パク質でも良く、 将来反応中間体の X線結晶構 i ^祈を行うための道が開ける。 即ち、 本発明は、 酸化還元酵素、 光照射により電子を放出する光励起還元剤、 了ミン系電子供与体、 及び該酸化還元酵素の基質を水に溶解させ混合する第 1段 階、 第 1段階で生成した混合物を 7 0〜 2 7 O Kに冷却して凍結する第 2段階、 第 2段階で生成した凍結混合物に 7 0〜 2 7 0 Kで前記金属錯体の吸収波長を含 む波長の光を照射する第 3段階、 及ぴ第 3段階で生成した凍結混合物を 8 0〜 2 7 O Kであって第 3段階の より高い温度へ昇温する第 4段階から成る酸化還 元酵素の反応中間体を捕捉する方法である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 チトクロム c酸化酵素の低温吸収スぺクトルを示す。 発明の実施の形態
第 1段階では、 酸化還元酵素、 光照射により電子を放出する光励起還元剤、 了 ミン系電子供与体、 及ぴ該酸化還元酵素の基質の各成分を水に溶解させる。 この うち基質が気体の場合には他の成分を混合した溶液に、 後で別途この気体を吹き 込んでもよい。
酸化還元酵素は、 何らかの酸化還元反応を触媒する酵素であり、 国際生化学連 合 （I U B ) の酵素委員会によって定められた酵素分類の主群の 1つ E C 1群で ある。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、 ヒドロゲナーゼ、一酸化窒素還元酵 素、 脱窒素酵素群 （硝酸レダクターゼ、 亜硝酸レダクターゼ、 酸化窒素レダクタ ーゼ、亜酸化窒素レダクタ一ゼ）、 P450スーパーフアミリー（P450nor, P450scc, P450camなど）、 キノール酸化酵素、 ミトコンドリァ内膜電子伝達系酵素 （複合 体 I, 複合体 II , チトクロム 複合体， チトクロム c酸化酵素など)、 光合 成電子伝達系酵素（チトクロム f複合体、 Fd-NADP+レダクターゼなど）、 酸素 添加酵素 (トリプトファン 2 , 3-ジォキシゲナーゼ， フェエルァラユン 4 モノォ キシゲナ一ゼなど）、 ヒドロぺ /レオキシダーゼ (カタラーゼ、 ペルォキシダ一ゼ) などが挙げられ、 上記酵素及びそれらのアミノ酸の点変異体も含まれる。 水溶液 中の酸化還元酵素の濃度は約 1 M〜 1 0 mMである。
光照射により電子を放出する光励起還元剤として、 例えば、 ルテユウム錯体 ( [Ru (bipyridine) 3 ] 2\ [Ru (ΝΉ3) 6] 2+など） のような遷 ^属錯体、炭化水 素類（ペリレン及びその誘導体、 ピレン及びその誘導体など)、各種色素（ボルフ ィリン （Z n、 M g及び金属イオンを持たないもの）、 p H指示薬（メチレンプノレ 一、 アタリジンオレンジなど）、 メチルビオローゲンなど) が挙げられる。
例えば、 [Ru (bipyridine) 3] 2+には 4 5 2 n m及ぴ 4 2 6 n mに吸収ピーク があるので、 これらの波長が含まれる光を照射し、 これを励起する。 水溶液中の 光励起還元剤の量は酵素の還元当量の 2〜； L 0倍ほどの濃度が必要であり、 低温 では光還元の効率が悪いため余分に試薬が必要となるため、 その濃度は約 1 〜1 0 O mMである。
基質は、 上記酸化還元酵素によって触媒作用を受ける化合物であり、 電子を受 け取ることによつて還元される物質である。 キノール酸化酵素及ぴチトクロム c 酸化酵素の場合は酸素、 一酸化窒素還元酵素の場合は一酸化窒素、 P 4 5 0スー パーファミリーの場合は酸素と一酸化炭素や有機化合物 （例えば、 コレステロ一 ル、 ショウノウなど） である。 また、 酵素本来の生理的基質以外の電子受容体を 用いてもよい。 水溶液中の基質の濃度は約 1 μ Μ〜2 O mMである。
ァミン系電子供与体は、 光励起還元剤が電子を放出した後に酸化型となった光 化学反応試薬へ電子を供給して再生する、 アミノ基、 イミノ基、 ヒドラジノ基等 を有するアミン系化合物である。 このアミン系電子供与体は、 基質や酵素へ行つ た電子が再び光化学反応試薬に戻る反応を防ぐ役割を持ち、 比較的安定だが光化 学反応試薬によって電子を奪われる。 アミン系電子供与体として、 例えば、 ェチ レンジアミン四酢酸、 トリエタノールァミン、 L一システィン、 ァエリン、 N, N—ジメチルァュリン等が挙げられる。これらを複数組み合わせて用いてもよい。 水溶液中のァミン系電子供与体の濃度は約 1 mM〜 1 0 0 mMである。
この水溶液は、 必要に応じて、 更に、 p H緩衝剤、 可溶化剤、 その他の試薬を 含んでもよい。
p H緩衝剤としては、 リン酸緩衝液や G o o dの緩衝液などを用いてもよく、 上記酸化還元酵素が正常に機能できる範囲内に P Hを保つ （ p H 1〜 1 4 ) 役割 をする。 p H緩衝剤の濃度は光励起還元剤の反応に伴う p H変化を抑えるために 光励起還元剤の濃度よりも高いほうがよく、 1〜2 0 O mM程度である。
可溶化剤としては、 上記酸化還元酵素が水溶性タンパク質ではない場合、 可溶 化剤として界面活性剤 (n-decyl- β -D-maltopyranoside^ n-dodecyl- β - D-maltopyranoside コーノレ酸、 Triton X— 100 など） を用 ヽてもよ！/ヽ。 そ の濃度は 0〜1 % (W/V) 程度である。
なお、 各成分の濃度は目的の酵素が正常に機能できる範囲内の濃度に適宜調整 することが望ましい。
第 2段階では、 第 1段階で生成した混合液を冷却し凍結させる。 この温度は 7 0 K〜 2 7 0 、 つまり水溶液が凍っている温度で光還元が可能な温度である。 この温度は、 基質が混合物中で拡散を開始する温度 （「拡散開始温度」 という。） より低い温度にすることが好ましいが、 液体窒素温度 ( 7 7 K) とすることが簡 便である。 拡散開始温度は、 基質固有の温度であり、 本発明のような条件下では ほぼ一定である。 拡散開始温度は、 例えば、 本実施例等のデータより知るこ が できるが、 酸素の場合には 1 7 0 ：、 一酸化炭素の場合には 1 4 0〜 1 7 0 の 間である。
第3段階では、 凍結混合物に光を照射する。 光励起された光励起還元剤は電子 を放出し、 酸化還元酵素は電子を受け取り、 還元される。 この段階の温度は、 第 2段階と同じでもよいが、 基質との反応が進行しないという観点から ¾拡散開 始温度より低い温度が好ましく、 更に、 この範囲内でできるだけ高いほう力 還 元反応促進から好ましい。 従って、 この段階の温度は、 好ましくは拡散開始温度 より低い温度、 より好ましくは拡散開始温度から 5〜 2 0 K低い温度である。 第 4段階では、 前段階よりも昇温して、 還元型の酸化還元型酵素と基質とを反 応させて、 反応中間体を形成させる。 但し、 余り温度を高くすると反応が進行し て、 反応中間体の状態に留まることが出来ないため、 拡散開始温度以上のできる だけ低い温度が好ましい。 従って、 この段階の温度は、 前段階の温度よりも高い 温度であつて、 好ましくは拡散開始温度以上、 但し 2 7 0 K以下の温度、 より好 ましくは拡散開始温度〜拡散開始温度 + 5 0 Kの範囲の温度、 更に好ましくは拡 散開始温度〜拡散開始温度 + 3 0 Kの範囲の温度、 最も好ましくは拡散開始温度 にする。
本発明の方法においては、 第 4段階の後に、 この段階で生成した凍結混合物を 拡散開始温度より低い温度に冷却する第 5段階を付加してもよい。 反応中間体を 保持するためである。 この温度は通常液体窒素温度 ( 7 7 K) とすることが簡便 である。 発明の効果
( 1 ) 本発明の方法は、 以下のようにタンパク質工学へ応用することができる。 既存の酵素タンパク質でも同様であるが、 将来人工的に酸化還元反応を伴って 機能する酵素を設計した場合、低温で反応中間体を捉える技術は重要となる。これ によって酵素の機能を検定■評価する場合に X線結晶構造解析を行って反応途中 の酵素の構造を決定することが容易になる。
従来技術では反応中間体を固定できる酵素は、 酵素自身で低温で光化学反応を 開始できるものを除けば、 P且害剤又は改変した基質がうまく利用できるものに限 られていた。 それ以外には、 反応中間状態で反応が停止してしまうように酵素本 体を改変してしまうしかなかった。しかし、タンパク質自体に手を加えた場合構造 が変わってしまう可能性も否定できず、 都合の良い改変方法もあるとは限らなか つた。 この場合、 分光学的手法を用いて議論するしかないが、 分光学的手法をも つてしても反応中のタンパク質のあらゆる部分の構造変化までは情報を得られる わけではない。
本発明は、 阻害剤や酵素の改変等を必要としない反応中間体固定法であり、 利 用可能な酵素の範囲が広がった。 また、 光感受性のより高い光化学反応試薬、 光 化学反応試薬と電子供与体を結合させた試薬等を開発することによって、 低温で ノ、。ルス光を用いて 1電子だけを酵素に与え、 1電子分ごとの反応を起こさせて酵 素反応を段階ごとに検查することが可能になることも期待できる。
( 2 ) また本発明の方法は、 低温酸素検出装置に利用することができる。
酸素を基質とする酵素を用いて、 酸素電極が利用できない、 溶液が凍っている 状態で微量の酸素の濃度を検出する装置を作ることができる。
( 3 )更に、本発明の方法は、微量一酸化窒素検出装置に応用することができる。 生体内で生じる一酸化窒素は不安定であるが、 生 料と一酸化窒素還元酵素
(酸化型） と光化学反応試薬等をすばやく混合した後、 凍結して光還元を行い、 温度を上げて一酸化窒素と反応させることによって、 分光学的に微量の一酸化窒 素を検出することができる。 以下、 実施例にて本発明を例証するが、 本発明を限定することを意図するもの ではない。
実施例 1
本実施例では、 以下の手順で、 チトクロム c酸化酵素が基質 （酸素） を還元す る反応中間体を捕捉した。 (1) 0.2 % n-decyl- -D-maltopyranoside (Anatraceより購入) を含む 50 mMリン酸緩衝液 (pH6. 8)にチトクロム c酸化酵素（既報（Yoshikawa et al. (1977) Journal of Biological Chemistry, 252, 5498-5508) に記載の方法に従って調製した。） 20 ^Μを溶力す。
(2) (1) の溶液に酸素を吹き込んで飽和させる。
(3) (2) の溶液にエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（和光純薬製） とァュ リン （関東化学製） をそれぞれ 20 mMと 5 mMになるように添加する。
(4) (3)の溶液に暗所で tris (2,2， - bipyridine)dichlororuthenium(I I) (Sigmaより購入） 1 00 Mを添カロした後、 液体窒素中で凍結する。
(5) (4)の溶液の温度を 140Kに上げて 1 50Wハロゲンランプで 4時間光 照射を行う （波長範囲： 400〜800 nm、 積算光エネルギー： 1X102〜5X106 J)。
このときの吸収スペクトルを第 1図に示す。 （A)に示すように、 60 3 nm付 近に吸収のピークが見られるが、 この近辺には用いた試薬由来の吸収はなく、 チ トクロム c酸化酵素の還元型の吸収のピークに一致している。 光照射によってノレ テユウム錯体は光励起されて電子を放出し、チトクロム c酸化酵素に電子を渡し、 チトクロム c酸化酵素は還元型となっている。
なお、 電子を放出したルテニウム錯体は強力な酸化剤であり、 このままでは還 元型チトクロム C酸化酵素から電子を奪う逆反応が起きて反応が前に進まない。 室温の溶液中での反応では、 適当に電子供与体となる物質を入れておくことで酸 化型ルテニウム錯体を再還元していたが、 低温で凍結していて分子の拡散が少な い状態では電子を酸化型ルテユウム錯体に渡すこと力 S難しかったが、 本発明にお いてはァミン系の電子供与体 （エチレンジァミン四酢酸とァュリンとの混合物） を使うことでこの問題を解決した。 この結果、 チトクロム c酸化酵素の 1 00 % 光還元が完了した。
(6) (5)で得たチトクロム c酸化酵素の還元型を 1 80 Kで 5時間置いて酸素 と反応させる。第 1図（B)に示すように吸収極大の移動が見られる。第 1図（C) は （B) — (A) を計算したものである。
1 80Kまで温度を上げると酸素分子が少しずつ拡散し始めて、 還元型になつ たチトクロム c酸化酵素の活性中心であるヘム a 3のヘム鉄に酸素分子が結合す る。 その結果、 酸素化型反応中間体である F e 3 +— O2一 (F e 3 +はヘム a 3の ヘム鉄） が生じる。 第 1図 （C) に示す酸素と反応後一反応前の差スペク トルの 形状は酸素化型反応中間体として過去報告されてきたのものと一致する (Biochem. J., 171, 787-798 (1978)、 T. Ogura et al . (1990) J. Am. Chem. Soc, 112, 5630-5631.)
第 1図において、 反応中間体 （B) と還元型酵素 (A) の差スペク トルを計算 したところ、 595 nmの付近に吸収の増加 （山） が見られ、 606 nm付近に 吸収の減少（谷） が見られた （C)。 これは酸素を除いた嫌気的条件下では現れな い。 これは酸素との反応によって、 反応前に 606 nm付近に吸収があったもの が反応後に 59.5 nmの付近に吸収が移動したことを示す。 このことは還元型へ ム a _3が酸素によって何かに変化したことを意味する。
Chance らの報告 (Biochem. J., 171, 787-798 (1978)) にあるように 酸素化型反応中間体 （文献では compound A) が生じたときは 59 1 nmの付近 に吸収の増加が見られ、 6 1 1 nm付近に吸収の減少が見られる。 実験条件の違 い （酵素標品の違い、 可溶化剤の有無、 測定温度の違い、 生じた反応中間体の量 の違い） を考慮に入れれば、 酸素化型反応中間体が生じたと考えられる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 酸化還元酵素、 光照射により電子を放出する光励起還元剤、 アミン系電子 供与体、 及ぴ該酸化還元酵素の基質を水に溶解させ混合する第 1段階、 第 1段階 で生成した混合物を 7 0〜 2 7 0 Kに冷却して凍結する第 2段階、 第 2段階で生 成した凍結混合物に 7 0〜 2 7 0 Kで前記金属錯体の吸収波長を含む波長の光を 照射する第 3段階、 及び第 3段階で生成した凍結混合物を 8 0〜 2 7 O Kであつ て第 3段階の温度より高い温度へ昇温する第 4段階から成る酸化還元酵素の反応 中間体を捕捉する方法。
2 . 第 2段階において第 1段階で生成した混合物を、 前記基質が該混合物中で 拡散を開始する温度 （以下「拡散開始温度」 という。） より低い温度に冷却し、第 3段階において第 2段階で生成した凍結混合物に拡散開始温度より低い温度で光 を照射し、 第 4段階において第 3段階で生成した凍結混合物を、 拡散開始 以 上、 伹し 2 7 0 K以下の温度へ昇温する、 請求項 1に記載の方法。
3 . 第 3段階において第 2段階で生成した凍結混合物に拡散開始温度より 5〜 2 O K低い温度で光を照射し、 第 4段階において第 3段階で生成した凍結混合物 を、 拡散開始温度〜拡散開始温度 + 5 0 Kの範囲の温度、 但し 2 7 0 K以下の温 度へ昇温する、 請求項 2に記載の方法。
4 . 更に、 第 4段階で生成した凍結混合物を拡散開始温度より低い温度に冷却 する第 5段階を含む請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の方法。
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