WO2004016730A2 - Bacterias con capacidad para la sobreproducción y secreción de proteínas. - Google Patents

Bacterias con capacidad para la sobreproducción y secreción de proteínas. Download PDF

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Victorino PARRO GARCÍA
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea

Definitions

  • the invention falls within the area of biotechnology, more specifically in the field of genetic engineering of microorganisms, cell factories and production of extracellular enzymes.
  • This invention relates to a bacterium with a decreased extracellular protease activity that confers greater stability to the proteins in the extracellular environment over time. This bacterium is useful for the overproduction and secretion of homologous and / or heterologous proteins.
  • Streptomyces lividans is a Gram positive, filamentous and aerobic bacterium, whose natural habitat is the soil, where it decomposes a large amount of organic material [Korn-Wendisch and Kutzner (1992). The family Streptomycetaceae. The Prokaryotes, Nol. 1, Springer Nerlarg, Yorkew York, 921]. Its ability to degrade biopolymers is linked to the production of a wide variety of extracellular enzymes [Gilbert, M. et al. (nineteen ninety five). Cloning of a secA homolog of Streptomyces lividans 1326 and overexpression in both S. lividans and E.coli.
  • Biochem Biophys Minutes 1296: 9-12] which makes it an ideal microorganism for the secretion of proteins of commercial interest.
  • metabolic engineering methodologies and large-scale production optimization are used, which is always dependent on the genetic and biochemical characteristics of the microorganism used as a cellular factory.
  • S. lividans is a non-pathogenic bacterium that secretes proteins directly into the environment and whose culture on an industrial scale is well established, it has been used for the overproduction and secretion of homologous and heterologous proteins.
  • S.lividans has been employed in the production of interleukin L. beta. human E. coli .beta.-galactosidase, E. coli alkaline phosphatase, human tumor necrosis factor, and human alpha-1 interferon [Bender et al., (1990) Gene, vol. 86, pp: 227-232; Lichenstein et al., (1988) J.
  • SPase signal peptidase type I
  • Type I signal peptidases are membrane endopeptidases that remove the signal peptide from exported proteins, during or after translocation through the membrane. Enzymes of this type have been identified in archaea, Gram positive and Gram negative bacteria, in the inner membrane of the yeast mitochondria, in the inner membrane of the chloroplast thylakoids and in the endoplasmic reticulum membrane of yeasts and upper eukaryotes. After removal of the signal peptide by the SPases, the mature protein can be released from the membrane and folds to be a functional protein.
  • the present invention describes bacteria modified in a type I signal peptidase for the overproduction of proteins with extracellular stability.
  • this invention describes a strain of S. lividans capable of growing in both defined and complex growth media. This lineage is a mutant in a signal peptidase type I, SipY (the majority), which considerably reduces extracellular prothetic activity, because the signal peptide of proteases cannot be removed and therefore cannot be exported to the medium, while allowing the synthesis and secretion of overproduced extracellular proteins.
  • the present invention also describes a method for the overproduction and secretion of proteins by the use of bacteria with a decreased proteolytic activity due to a modification in a signal peptidase type I. DESCRIPTION Brief description
  • the present invention faces the problem of extracellular degradation of proteins produced by bacteria due to extracellular proteases.
  • the solution provided by this invention is based on the overproduction of proteins by modified bacteria in any of the genes that code for signal I peptidases to achieve a deficiency of cellular protease activity.
  • This invention describes a new bacterial strain for protein overproduction, in which the deficiency of extracellular protease activity allows secreted proteins to remain extracellularly stable, ensuring better performance on an industrial scale in protein production, without using strains. Bacterial difficult growth.
  • plasmid pSN425 ( Figure 1) has been used, which contains a DNA fragment that contains the genes encoding the four signal I peptidases of S.lividans TK21 [Parro et al. (1999). Four genes encoding different type I signal peptidases are organized in a cluster in Streptomyces lividans TK21. Microbiology 145: 2255-63]. This DNA fragment has been claimed in the present invention (SEQ ID NO: 1).
  • the plasmid pSN425 after being digested to deletion of the sipY gene, the thioestrepton (tsr) resistance gene was cloned, giving rise to the plasmid pSNY ( Figure 2), which was used for the generation of the sipY mutant in S. lividans.
  • the mutant strain S. lividans Y '62 has been claimed in the present invention.
  • plasmids pSN425 and pSNY have been claimed in the present invention.
  • the amino acid sequences of Sip W, Sip X, Sip Y and Sip Z show great similarity with the signal type peptidases of Gram-negative and Gram-positive bacteria, as well as of eukaryotic origin. [Parro et al. (1999). Four genes encoding different type I signal peptidases are organized in a cluster in Streptomyces lividans TK21. Microbiology 145: 2255-63].
  • the present invention also claims other modified bacteria in some of its genes that code for peptidases for use in the overproduction of extracellular proteins.
  • a further object of the present invention is a process for producing extracellular proteins by mutant strain in a peptidase gene.
  • signal type I The utility of S. lividans strain Y '62 is exemplified for the overproduction of extracellular agarase. Plasmid pAGAs5 constructed for the overproduction of agarase has also been claimed in the present invention.
  • Type I signal peptidases are integral membrane proteins. Type I signal peptidases are specifically responsible for processing "tagged" preproteins with type I signal peptides, eliminating these during or immediately after translocation through the membrane. [Pugsley, A.P. (1993) The complete general secretory pathaway in Gram-negative bacteria. Microbiol Rev. 57: 50-108 .; Driessen, AJ.M. (1994). How proteins cross the bacterial cytoplasmic membrane. J. Membr. Biol. 142: 145-159; Dalbey et al, (1997) The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases. Protein Science 6: 1129-1138]. In S.
  • a vector, pSN425 ( Figure 1), containing a 3.45 kb fragment, which encompasses from the sn30 oligonucleotide [Parro et al. (1999).
  • Four genes encoding different type I signal peptidases are organized in a cluster in Streptomyces lividans TK21. Microbiology 145: 2255-63] to the Sphl restriction site, and which contains the four genes for Type I signal peptidase existing in S. lividans, the ampicillin resistance gene and origin of replication for E.coli.
  • the vector was digested with Pstl, removing a 399 bp fragment that was replaced by the thiostrepton resistance gene.
  • Plasmid (pSN425) and insert (sr) were ligated and transformed into E.coli ET12567 cells and the transformants were selected by the filter hybridization technique. The resulting plasmid is shown in Figure 2 and was named pSNY.
  • the sipY mutant which encodes the majority peptidase, has been constructed by transformation of S.lividans TK21 protoplasts with the plasmid pSNY conveniently linearized and purified.
  • the relevant region of the line chromosome object of this invention (Y62) is shown in Figure 3.
  • Figure 1 Scheme of plasmid pSN425.
  • the size of the plasmid and the relative orientation of the various genes are indicated; Amp R , ampicillin resistance gene; sipW, sipX, sipY and sipZ, the four genes that code for peptidases signal type I in S. lividans.
  • Figure 2. Scheme of plasmid pSNY. The size of the plasmid and the relative orientation of the various genes are indicated; Amp R , ampicillin resistance gene; sip, sipX, sipY and sipZ.
  • Figure 3. Scheme of the relevant region of the chromosome of the Y62 object line. The boxes that are kept in the line are indicated; AI, B, C and AII. As well as the restriction endonucleases used for its construction; Pstl (P 2 -P 3 ), the anterior and posterior genes; sipXy sipY and the thiostrepton resistance gene; tst ⁇ .
  • Figure 4. Scheme of plasmid pAGAs5. The size of the plasmid and the relative orientation of the various genes are indicated; neo R , kanamycin resistance gene; dagA, S. coelicolor agarase gene.
  • Figure 5. Growth curves of the S.lividans Y62 line compared to the S.lividans TK21 line.
  • Figure 6. Extracellular protease activity. The percentage of extracellular protease activity along the growth in Y62 line in relation to S.lividans TK21 is represented.
  • Figure 7 Agarase secretion under conditions of overproduction. Both agarase associated with the cell, in its precursor and mature form, and the secretion of mature agarase have been analyzed. 1, 2, 3 and 4 represent the different phases of growth; 12h, 22h, 36h and 45h respectively.
  • Example 1 Construction of the S.lividans Y62 line.
  • the methods used for the growth and manipulation of the strains have been performed according to Hopwood et al. [Hopwood, Bibb, Chater, Kieser, Lydiate, Smith, Ward and Schrempf.l985.Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. Norwich, John Innes Foundation].
  • the lineage was constructed by constructing a vector, pSN425, containing a 3.45 kb fragment (SEQ ID NO: 1) with the four genes for S. lividans type I signal peptidase, from nucleotide sn30 to the Sphl restriction site, the resistance gene for ampicillin and the origin of replication for E.coli.
  • a 399 bp fragment (SEQ ID NO: 2) was removed by digestion with Pst ⁇ and was replaced by the thiostrepton resistance gene to which the terminator had been removed to avoid possible polar effects.
  • the plasmid (pSN425) and the insert (tsr) were ligated and transformed into E.coli ET12567 cells and the transformants obtained in LB with 100 mg / ml ampicillin were selected by the filter hybridization technique.
  • the DNA was denatured and immobilized on a nylon membrane (Amersham's Hybond-N +) and hybridized in a 2X SSC solution, 0.1% SDS, 6mg ml of Salmon sperm, with the tsr gene labeled with the klenow fragment of DNA polymerase at its 5'OH ends with dCTP (P 32 ). After hybridization the nonspecific adsorption was washed and the filter was autoradiographed to identify positive clones. The correct orientation was checked by analyzing the DNA fragments resulting from digestion patterns with different restriction endonucleases. The resulting plasmid was called pSNY, see figure 2.
  • the mutant in sipY has been constructed by transformation of protoplasts [Kieser, Bibb, Buttner, Keith, Chater and Hopwood. (2000) Practical Streptomyces Genetics. John Innes Center, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, England] of S.lividans TK21 with the plasmid pSNY conveniently linearized and purified. The correct integration into the genome has been verified by Southern blot.
  • the strain of the present invention is not affected by its growth when grown in NMMP defined medium supplemented with 0.5% mannitol and with 5 ⁇ g / ml thiostrepton, nor when it is made in YEME nutrient medium with 10 ⁇ g / ml thiostrepton. ( Figure 5a and 5b respectively).
  • Example 2. Effect of the S.lividans Y62 line on the secretion of extracellular proteases.
  • the defined NMMP medium has been selected where the secretion of proteases is greatest, and where the effect of the mutation should be more apparent than in other media.
  • the supernatants from 20 ml of culture in NMMP medium in the different growth phases were concentrated with 80% saturation ammonium sulfate.
  • the precipitated proteins were collected by centrifugation at 13000 xg for 30 minutes and dissolved in 0.1 M Tris-HCl pH 8.
  • Example 3 Effect of S.lividans Y62 line on agarase secretion under conditions of overproduction.
  • the recombinant plasmid pAGAs5 ( Figure 4) containing S. coelicolor agarase (DagA) has been constructed and has inactivated the Thiostrepton resistance gene through a change in its reading phase, to be propagated in S.lividans Y62.

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Abstract

La presente invención describe unas bacterias con capacidad para la sobreproducción y secreción de proteínas. En una realización particular de esta invención, la actividad proteasa extracelular de la estirpe de Streptomyces lividans se encuentra seriamente disminuida con lo que la estabilidad de las proteínas en el medio extracelular es mayor a lo largo del tiempo.

Description

TITULO
BACTERIAS CON CAPACIDAD PARA LA SOBREPRODUCCIÓN Y
SECRECIÓN DE PROTEÍNAS
SECTORDE LATÉCNICA
La invención se encuadra dentro del área de biotecnología, más concretamente en el sector de ingeniería genética de microorganismos, factorías celulares y producción de enzimas extracelulares. Esta invención se refiere a una bacteria con una actividad proteasa extracelular disminuida que confiere mayor estabilidad a las proteínas en el medio extracelular a lo largo del tiempo. Esta bacteria es útil para la sobreproducción y secreción de proteínas homologas y/o heterólogas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Streptomyces lividans es una bacteria Gram positiva, filamentosa y aerobia, cuyo habitat natural es el suelo, donde descompone gran cantidad de material orgánico [Korn- Wendisch y Kutzner (1992). The family Streptomycetaceae. The Prokaryotes, Nol. 1, Springer Nerlarg, Νew York, 921]. Su capacidad de degradar biopolímeros está ligada a la producción de gran variedad de enzimas extracelulares [Gilbert, M. y col. (1995). Cloning of a secA homolog of Streptomyces lividans 1326 and overexpression in both S.lividans and E.coli. Biochem. Biophys. Acta 1296:9-12], lo que hace que sea un microorganismo idóneo para la secreción de proteínas de interés comercial. Para producir proteínas extracelulares e intracelulares se recurre a metodologías de ingeniería metabólica y optimización de producción a gran escala que es siempre dependiente de las características genéticas y bioquímicas del microorganismo usado como factoría celular.
Debido a que S.lividans es una bacteria no patógena que secreta directamente proteínas al medio y cuyo cultivo a escala industrial está bien establecido, se ha utilizado para la sobreproducción y secreción de proteínas homologas y heterólogas. S.lividans ha sido empleado en la producción de interleucina l.beta. humana,.beta.-galactosidasa de E. coli, fosfatasa alcalina de E. coli, factor de necrosis tumoral humano, e interferón alfa-1 humano [Bender et al., (1990) Gene, vol. 86, pp: 227-232; Lichenstein et al., (1988) J. Bact, vol 170, pp: 3924-3929; Νoack et al., (1988) Gene, vol. 68, pp: 53-62; Chang et al. in T. Okami et al., (1988) Biology of Actinomycetes, Japan Soc. Press, Tokyo, pp: 103-107].
Algunas patentes relacionadas con la producción de proteínas mediante S.lividans son: [ES2117591, 1-8-1998, Consejo Superior Investigación (ES), Process for the overproduction, purification and use of Streptomyces coelicor agarase; IE912623, 29-1- 1992, American Cyanamid Co (USA), Cloning of the biosynthetic pathway genes for the chlortetracycline production from streptomyces aureofaciens and their expression in Streptomyces lividans; US2001034046, 25-10-2001, Kosan Biosciences hic (USA), Production of 8,8a-dihydroxy-6-deoxyerythronolide B;US5268290, 7-2-1990, Kyowa Hakko Kogyo KK (JP), Process for producing neuraminidase; US4717666, 5-1-1998, Smithkline Beckman Corp (US) Cloned streptomycete lividans excretable .beta- galactosidase gene; US20020090687, 11-7-2002, Council of Scientific & Industrial Research (IN)]. Uno de los objetivos del entorno industrial es el establecimiento de nuevos procedimientos que incrementen la rentabilidad en la producción de enzimas extracelulares. Con el fin de conseguir una mejora en el rendimiento de proteínas heterólogas producidas por S.lividans en algunos casos ha sido añadido ácido casamino al medio de cultivo [US5223418, 29-6-1993, Smithkline Beecham Corp (US), Method of improving the yield of heterologous proteins produced by Streptomyces lividans]. Sin embargo, uno de los grandes problemas es la degradación extracelular de estas proteínas, debido al gran número de genes que codifican para proteasas extracelulares en estas bacterias. Una posible estrategia para solucionar este problema es la generación de imitantes de S.lividans con deficiencia en actividad proteolítica mediante la deleción en el gen que codifica la Proteasa X [US5516685, 14-5-1996, Amgen, Isolation and characterization of a novel protease from Streptomyces lividans]. Sin embargo, la acumulación de mutaciones en genes codificantes de proteasas intra y extracelulares siempre produce estirpes más débiles y con mayores dificultades en su crecimiento. Las proteínas que van a ser secretadas, son sintetizadas con una extensión de aminoácidos en su extremo amino terminal, el péptido señal o péptido lider, que las distingue de las proteínas citoplásmicas y permite su entrada en la ruta. Una vez que el péptido señal ha sido reconocido la proteína se transloca a través de la membrana citoplasmática.
Uno de los componentes necesarios durante las últimas etapas del transporte de proteínas es una enzima de membrana; la peptidasa señal tipo I (SPasa). Las peptidasas señal tipo I son endopeptidasas de membrana que eliminan el péptido señal de las proteínas exportadas, durante o después de la translocación a través de la membrana. Enzimas de este tipo han sido identificadas en arqueas, bacterias Gram positivas y Gram negativas, en la membrana interna de las mitocondrias de levadura, en la membrana interna de los tilacoides de los cloroplastos y en la membrana del retículo endoplasmático de levaduras y eucariotas superiores. Después de la eliminación del péptido señal por las SPasas, la proteína madura puede ser liberada de la membrana y se pliega para ser una proteína funcional. La presente invención describe unas bacterias modificadas en una peptidasa señal tipo I para la sobreproducción de proteínas con estabilidad extracelular. En una realización concreta, esta invención se describe una estirpe de S.lividans capaz de crecer en medios de crecimiento tanto definidos como complejos. Esta estirpe es un mutante en una peptidasa señal tipo I, SipY (la mayoritaria), que reduce considerablemente la actividad protelítica extracelular, porque el péptido señal de las proteasas no puede ser eliminado y por ello no pueden ser exportadas al medio, mientras que permite la síntesis y secreción de proteínas extracelulares sobreproducidas. Aunque la mutación en una peptidasa señal tipo I puede afectar la secreción de otras proteínas distintas de la proteasas, las proteínas que han sido secretadas son más estables en el medio debido a la disminución de la actividad proteolítica, por ello el balance final es la sobreproducción de la proteína de interés. La presente invención también describe un procedimiento para la sobreproducción y secreción de proteínas mediante el empleo de bacterias con una actividad proteolítica disminuida debido a una modificación en una peptidasa señal tipo I. DESCRIPCIÓN Breve descripción
La presente invención se enfrenta con el problema de la degradación extracelular de las proteínas producidas por bacterias debido a las proteasas extracelulares. La solución proporcionada por esta invención se basa en la sobreproducción de proteínas mediante bacterias modificadas en alguno de los genes que codifican para las peptidasas señal tipo I para lograr una deficiencia de actividad proteasa celular.
Esta invención describe una nueva estirpe bacteriana para la sobreproducción de proteínas, en la cual la deficiencia de actividad proteasa extracelular permite que las proteínas secretadas se mantengan estables extracelularmente, asegurando un mejor rendimiento a escala industrial en la producción de proteínas, sin necesidad de utilizar estirpes bacterianas de difícil crecimiento.
Para la construcción de esta nueva estirpe se ha utilizado el plásmido pSN425 (Figura 1) que contiene un fragmento de ADN que contiene los genes que codifican las cuatro peptidasas señal tipo I de S.lividans TK21 [Parro y col. (1999). Four genes encoding different type I signal peptidases are organized in a cluster in Streptomyces lividans TK21. Microbiology. 145: 2255-63]. Este fragmento de ADN ha sido reivindicado en la presente invención (SEQ ID NO:l). El plásmido pSN425 tras ser digerido para deleccionar el gen sipY se le clonó el gen de resistencia a thioestrepton (tsr), dando lugar al plásmido pSNY (Figura 2), que se usó para la generación del mutante en sipY en S.lividans.
La estirpe mutante S.lividans Y '62 ha sido reivindicada en la presente invención. Así como los plásmidos pSN425 y pSNY han sido reivindicados en la presente invención. Las secuencias de aminoácidos de Sip W, Sip X, Sip Y y Sip Z presentan una gran similaridad con las peptidasas señal tipo I de bacterias Gram-negativas y Gram- positivas, así como de origen eucariótico. [Parro y col. (1999). Four genes encoding different type I signal peptidases are organized in a cluster in Streptomyces lividans TK21. Microbiology. 145: 2255-63]. La presente invención reivindica también otras bacterias modificadas en alguno de sus genes que codifican para peptidasas para su empleo en la sobreproducción de proteínas extracelulares.
Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento para producir proteínas extracelulares mediante la estirpe mutante en un gen de la peptidasa señal tipo I. La utilidad de la estirpe S.lividans Y '62 se ejemplifica para la sobreproducción de agarasa extracelular. El plásmido pAGAs5 construido para la sobreproducción de la agarasa también ha sido reivindicado en la presente invención.
Descripción detallada
Las pre-proteínas que van a ser secretadas por la GSP ("General Sec Pathway") [Van Mellaert, L. y J. Anné. (1994). Protein secretion in Gram positive bacteria with high GC-content. Recent Res. Dev. Microbiol.3: 324-340] son sintetizadas con una extensión de aminoácidos en su extremo amino terminal, el péptido señal o péptido lider, que las distingue de las proteínas citoplásmicas y permite su entrada en la ruta de secreción y su correcta translocación a través de la membrana plasmática. Las peptidasas señal tipo I se encargan del procesamiento del péptido señal permitiendo que la proteína sea translocada [Dalbey R. E. y W. Wickner. (1985). Leader peptidase catalyses the reléase of exported proteins from the outer surface of the Escherichia coli plasma membrane. J Biol Chem 260: 15925-31].
Las peptidasas señal tipo I (SPasas) son proteínas integrales de membrana. Las peptidasas señal tipo I se encargan de procesar específicamente las preproteínas "etiquetadas" con péptidos señal tipo I, eliminando éstos durante o inmediatamente después de su translocación a través de la membrana. [Pugsley, A.P. (1993) The complete general secretory pathaway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108.; Driessen, AJ.M. (1994). How proteins cross the bacterial cytoplasmic membrane. J. Membr. Biol. 142: 145-159; Dalbey y col, (1997) The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases. Protein Science 6: 1129-1138]. En S.lividans se han localizado cuatro genes (sipW, sipX, sipY y sipZ) que codifican cuatro SPasas tipo I [Parro y col. (1999). Four genes encoding different type I signal peptidases are organized in a cluster in Streptomyces lividans TK21. Microbiology. 145: 2255-63].
Para la construcción de la estirpe de la presente invención se ha construido previamente un vector, pSN425 (Figura 1), que contiene un fragmento de 3,45 kb, que engloba desde el oligonucleótido sn30 [Parro y col. (1999). Four genes encoding different type I signal peptidases are organized in a cluster in Streptomyces lividans TK21. Microbiology. 145: 2255-63] hasta el sitio de restricción Sphl, y que contiene los cuatro genes para peptidasa señal tipo I existentes en S.lividans, el gen de resistencia a ampicilina y origen de replicación para E.coli. El vector fue digerido con Pstl eliminádose un fragmento de 399 pb que fue remplazado por el gen de resistencia a tiostrepton. Plásmido (pSN425) e inserto (¿sr) fueron ligados y transformados en células E.coli ET12567 y los transformantes se seleccionaron por la técnica de hibridación en filtro. El plásmido resultante se muestra en la figura 2 y se denominó pSNY.
El mutante en sipY, que codifica la peptidasa mayoritaria, se ha construido por transformación de protoplastos de S.lividans TK21 con el plásmido pSNY convenientemente linealizado y purificado. La región relevante del cromosoma de la estirpe objeto de esta invención (Y62) se muestra en la figura 3.
El efecto del mutante sipY en el procesamiento de pre-proteínas, y su comprotamiento en condiciones de sobreprodución se ha estudiado mediante la construcción del plásmido recombinate pAGAs5 (Figura 4) el cual deriva de pAGAsl [Parro V. and R. P. Mellado. 1994. Effect of glucose on agarase overproduction by Streptomyces. Gene 145: 49-55] y contiene el gen de la agarasa de S.coelicolor (dagA) para ser propagado en la estirpe de esta invención, S.lividans Y62.
En la estirpe S.lividans Y62 [pAGAs5] la actividad proteasa extracelular se ve seriamente disminuida (Ejemplo 2). Esta nueva estirpe produce agarasa extracelular en mayor cantidad que la estirpe salvaje S.lividans TK21 [pAGAs5] lo que determina que S.lividans Y62 sea de utilidad para la sobreproducción y secreción de proteínas extracelulares (Ejemplo 3).
De acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes, un cultivo de la bacteria derivada de Streptomyces lividans, portadora de la mutación en el gen sipY y denominada Streptomyces lividans Y62 ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, España, el 17 de Julio de 2002, correspondiéndole el número de depósito CECT 3361. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Esquema del plásmido pSN425. Se indica el tamaño del plásmido y la orientación relativa de los diversos genes; AmpR, gen de resistencia a ampicilina; sipW, sipX, sipY y sipZ, los cuatro genes que codifican para peptidasas señal tipo I en S.lividans.
Figura 2.- Esquema del plásmido pSNY. Se indica el tamaño del plásmido y la orientación relativa de los diversos genes; AmpR, gen de resistencia a ampicilina; sip , sipX, sipY y sipZ. Figura 3.- Esquema de la región relevante del cromosoma de la estirpe objeto Y62. Se indican las cajas que se mantienen en la estirpe; AI, B, C y AII. Así como las endonucleasas de restricción usadas para su construcción; Pstl (P2-P3), los genes anterior y posterior; sipXy sipY y el gen de resistencia a tiostrepton; tst^. Figura 4.- Esquema del plásmido pAGAs5. Se indica el tamaño del plásmido y la orientación relativa de los diversos genes; neoR, gen de resistencia a kanamicina; dagA, gen de la agarasa de S.coelicolor.
Figura 5.- Curvas de crecimiento de la estirpe S.lividans Y62 en comparación con la estirpe S.lividans TK21. A) Crecimiento en medio NMMP + manitol 0,5%. B) Crecimiento en medio YEME. Figura 6.- Actividad proteasa extracelular. Se representa el porcentaje de la actividad proteasa extracelular a lo largo del crecimiento en la estirpe Y62 en relación con S.lividans TK21.
Figura 7.- Secreción de agarasa en condiciones de sobreproducción. Se ha analizado tanto agarasa asociada a la célula, en su forma precursora y madura, como la secreción de agarasa madura. 1, 2, 3 y 4 representan las diferentes fases del crecimiento; 12h, 22h, 36h y 45h respectivamente.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo del alcance de la misma.
Ejemplo 1.- Construcción de la estirpe S.lividans Y62. Los métodos empleados para el crecimiento y la manipulación de las cepas se han realizado según Hopwood y colaboradores [Hopwood, Bibb, Chater, Kieser, Lydiate, Smith, Ward y Schrempf.l985.Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. Norwich, John Innes Foundation]. La construcción de la estirpe se realizó mediante la construcción de un vector, pSN425, que contiene un fragmento de 3,45 kb (SEQ ID NO:l) con los cuatro genes para peptidasa señal tipo I de S.lividans, desde el nucleótido sn30 hasta el sitio de restricción Sphl, el gen resistencia para ampicilina y el origen de replicación para E.coli. Un fragmento de 399 pb ( SEQ ID NO:2) fue eliminado mediante la digestión con Pstϊ y fue remplazado por el gen de resistencia a tiostrepton al cual se le había eliminado el terminador para evitar posibles efectos polares. El plásmido (pSN425) y el inserto (tsr) fueron ligados y transformados en células E.coli ET12567 y los transformantes obtenidos en LB con ampicilina 100 mg/ml se seleccionaron por la técnica de hibridación en filtro. El ADN se desnaturalizó e inmovilizó en una membrana de nylon (Hybond-N+ de Amersham) y se híbrido en una solución SSC 2X, SDS 0,1%, 6mg ml de esperma de Salmón, con el gen tsr marcado con el fragmento klenow de la ADN polimerasa en sus extremos 5 'OH con dCTP(P32). Después de la hibridación la adsorción no específica se lavó y se autorradiografió el filtro para identificar los clones positivos. La correcta orientación se comprobó mediante el análisis de los fragmentos de ADN resultantes de los patrones de digestión con distintas endonucleasas de restricción. El plásmido resultante se denominó pSNY, ver figura 2.
El mutante en sipY se ha construido por transformación de protoplastos [Kieser, Bibb, Buttner, Keith, Chater y Hopwood. (2000) Practical Streptomyces Genetics. John innes Center, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, England] de S.lividans TK21 con el plásmido pSNY convenientemente linealizado y purificado. La correcta integración en el genoma se ha verificado por Southern blot.
La estirpe de la presente invención, S.lividans Y62, no ve afectado su crecimiento cuando se cultiva en medio definido NMMP suplementado con manitol 0,5% y con tiostrepton 5 μg/ml, ni cuando se hace en medio nutritivo YEME con tiostrepton 10 μg/ml. (Figura 5a y 5b respectivamente).
Ejemplo 2.- Efecto de la estirpe S.lividans Y62 en la secreción de proteasas extracelulares. Para determinar la actividad proteasa extracelular, se ha seleccionado el medio definido NMMP donde la secreción de proteasas es mayor, y donde el efecto de la mutación debería ser más patente que en otros medios. Los sobrenadantes procedentes de 20 mi de cultivo en medio NMMP en las diferentes fases de crecimiento, fueron concentradas con sulfato amónico al 80% de saturación. Las proteínas precipitadas fueron recogidas por centrifugación a 13000 x g durante 30 minutos y disueltas en 0,1 M Tris-HCl pH 8. Diferentes alícuotas fueron llevadas a un volumen final de 1 mi con 0,lM-imidazol-HCl pH 7,2 en presencia de 7 mg de Hide Powder Azure (Sigma Chemical Co.) e incubadas a 37 °C hasta el viraje a color azul [Parro V. and R. P. Mellado. 1994. Effect of glucose on agarase overproduction by Streptomyces. Gene 145: 49-55]. Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 mg de Hide Powder Azure en 30 minutos de incubación a 37 °C.
La inactivación de SipY provoca una considerable reducción en la actividad proteolítica extracelular, que mayoritariamente ocurre en las fases de transición y estacionaria (Figura 6), lo que podría permitir que las proteínas sobreproducidas se mantengan estables en el medio extracelular sin ser degradadas.
Ejemplo 3.- Efecto de la estirpe S.lividans Y62 en la secreción de agarasa en condiciones de sobreproducción.
Para correlacionar el efecto del mutante sipY en el procesamiento de pre-proteínas, y su comprotamiento en condiciones de sobreprodución, ha sido construido el plásmido recombinate pAGAs5 (Figura 4) conteniendo la agarasa (DagA) de S.coelicolor y se le ha inactivado el gen de resistencia a tiostrepton mediante un cambio en su fase de lectura, para poder ser propagado en S.lividans Y62.
La síntesis y secreción de DagA ha sido monitorizada mediante experimentos de Western-blot. En el caso de la estirpe S.lividans Y62 [pAGAs5] se observa agarasa precursora y madura asociada a la célula. Sin embargo, a pesar de esta acumulación intracelular los niveles relativos de agarasa extracelular sobreproducida son mayores que en la estirpe S.lividans TK21 [pAGAs5] debido a la ausencia de proteasa extracelular, indicando que la estabilidad de las proteínas en el medio extracelular es mayor a lo largo del tiempo. Por lo tanto la estirpe S.lividans Y62 resulta muy apropiada para la sobreproducción de proteínas extracelulares (Figura 7).

Claims

REIVINDICACIONES
I. Una bacteria con capacidad para la sobreproducción y secreción de proteínas, caracterizada porque es una bacteria con una modificación en un gen que codifica una peptidasa.
2. Bacteria según la reivindicación 1, caracterizada porque es una bacteria con una modificación en un gen que codifica una peptidasa señal tipo I.
3. Bacteria según la reivindicación 2, caracterizada porque la modificación en un gen que codifica una peptidasa señal tipo I, es una mutación que incluye deleción, inserción, o substitución de los aminoácidos naturalmente presentes.
4. Bacteria según la reivindicación 3, caracterizada porque es una bacteria Gram- negativa.
5. Bacteria según la reivindicación 3, caracterizada porque es una bacteria Gram- positiva.
6. Bacteria según la reivindicación 4, caracterizada porque es una bacteria del género Escherichia.
7. Bacteria según la reivindicación 5, caracterizada porque es una bacteria del género Streptomyces o Bacillus.
8. Bacteria según la reivindicación 7, caracterizada porque es la bacteria Streptomyces lividans Y62, depositada en la CECT con el número de depósito 3361 y porque presenta una deleción en el gen que codifica la peptidasa señal tipo I, Sip Y.
9. Bacteria según la reivindicación 7, caracterizada porque una bacteria derivada de S. lividans Y 62.
10. Un fragmento purificado y aislado de ADN, caracterizado porque es una secuencia de ácido nucleico de 3450 pb que codifica los los genes para las cuatro peptidasas señal tipo I de S. lividans TK21 (SEQ ID NO:l).
I I. Un plásmido (pSN425), caracterizado porque contiene el fragmento de ADN de la reivindicación 10 para el clonaje y la propagación de peptidasas señal tipo I de S.lividans TK21. 12. Un plásmido (pSNY), caracterizado porque ha sido construido a partir del plásmido pSN425 según la reivindicación 11 al que se ha delecionado un fragmento de 399 pb (SEQ ID NO:2) en el gen sipY que codifica la peptidasa señal tipo I Sip Y y que ha sido remplazado por el gen de resistencia a tiostrepton. 13. Un plásmido para la propagación del gen de la agarasa (DagA) de S.coelicor y la sobreproducción de agarasa. 14. Un procedimiento para la obtención de una bacteria según las reivindicaciones
8 y 9, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) los protoplastos de la bacteria son transformados con el plásmido pSYN de la reivindicación 12, y b) el plásmido pSYN linealizado se integra en el genoma de la bacteria. 15. El uso de las bacterias según las reivindicaciones de la 1 a la 9 para la sobreproducción y secreción de proteínas extracelulares.
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Non-Patent Citations (5)

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