TITULO
CONSTRUCCIONES GENÉTICAS MULTIFUNCIONALES CON ALTA CAPACIDAD INHIBITORIA DE LA EXPRESIÓN DE CCR5 EN LA SUPERFICIE CELULAR.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención descrita en esta Memoria puede considerarse de aplicación directa en Biología Celular y Terapia Génica del sida y otras patologías relacionadas con los receptores de quimioquinas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La magnitud de la pandemia de sida y la gran dificultad de desarrollar y probar una vacuna efectiva contra su agente causante, el VIH-1, han conducido a la búsqueda de terapias alternativas que puedan ser aplicadas a los pacientes infectados por dicho virus, especialmente en los estadios tempranos. Teniendo en cuenta el enorme número de personas que se espera sean infectadas por el VIH-1 solamente en la presente década, la simplicidad y los beneficios a largo plazo que promete ofrecer la terapia génica contra el sida resultan muy atractivos.
El desarrollo de un método eficaz de terapia génica contra el sida requiere la identificación de productos génicos cuya inactivación funcional permita bloquear la infección y/o la replicación del VTH-1. La práctica totalidad de los protocolos de terapia génica contra el sida propuestos hasta la fecha están dirigidos contra productos génicos virales (revisado en Yu, M., Poeschla, E. y Wong-Staal, F. (1994) Gene Ther. 1:13-26). La elevada tasa de mutación del virus del sida, consustancial a poseer un genoma RNA+, supone una seria limitación para la efectividad de este tipo de estrategias terapéuticas a medio o largo plazo. En 1996 se descubrió que varios receptores de quimioquinas interaccionan con la proteína gpl20 del virus de inmunodeficiencia humana (VTH-1), comportándose como correceptores en el proceso de infección de
dicho virus. Concretamente, la proteína CCR5 (receptor de las quimioquinas RANTES, MlP-la y MlP-lb) es el correceptor preferentemente utilizado por las cepas M-trópicas (capaces de infectar a macrófagos), que son las que se encuentran en los pacientes durante los estadios tempranos de la infección (Cocchi, F. y col. (1995) Science 270:1811-1815; Deng, H. y col. (1996) Nαtwre 381:661-666; Dragic, T. y col. (1996) Nature 381:667-673; Alkhatib, G. y col. (1996) Science 272:1955-1958; Choe, H. y col. (1996) Cell 85:1135-1148; Doranz, BJ. y col. (1996) Cell 85:1149-1158). Los datos experimentales indican que existe una correlación directa entre los niveles de expresión de CCR5 en la superficie celular y la susceptibilidad a la infección por las cepas macrófago-trópicas del NIH-1 (Wu, B.L. y col. (1997) J. Exp. Med. 185:1681-1691).
A partir de este hallazgo se han propuesto diversos procedimientos potencialmente terapéuticos contra la infección por NιH-1 que consisten en la administración de agentes químicos capaces de bloquear específicamente la interacción entre CCR5 y la proteína viral gpl20, tales como: antagonistas de CCR5 (Proudfoot, A.E.I. y col. (1996) J. Biol Chem. 271:2599-2603; Arenzana-Seisdedos, F. y col. (1996) Nature 383:400; Simmons, G. y col. (1997) Science 276:276-279; International Patent Applications WO 97/45543, WO 97/47318, WO 97/47319, y WO 98/00535), complejos solubles estables de gpl20 y CD4 (International Patent Application WO 98/00535), fragmentos solubles de CCR5 (International Patent Applications WO 97/45543, WO 97/47318 y WO 97/47319), fragmentos solubles de gpl20 (International Patent Applications WO 97/47318 y WO 97/47319) y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos contra CCR5 (International Patent Applications WO 97/45543, WO 97/47318 y WO 97/47319). Hasta el momento, en todos los casos se desconoce su eficacia in vivo.
Por otra parte, se ha identificado una mutación genética natural en el gen CCR5 que confiere a sus portadores una gran protección frente a la infección por VIH-1 (Liu, R. y col. (1996) Cell 86:367-377; Sa son, M. y col. (1996) Nature 382:722-725; Dean, M. y col. (1996) Science 273:1856-1862; Smith, M.W. y col. (1997) Science 277:959-965). Dicha mutación, denominada CCR5Δ32, consiste en una deleción interna de 32
nucleótidos del gen CCR5 que, como consecuencia de un cambio en la fase de lectura, tiene como resultado la producción de una proteína que carece del tercio C-terminal y no se exporta a la membrana celular, siendo, por tanto, no funcional. Posteriormente, se ha descubierto la existencia de otra mutación en el gen CCR5, denominada m303, cuyo producto es también una proteína delecionada en el extremo C-terminal (en este caso carece de los dos tercios terminales), y que también confiere resistencia frente a VIH-1, aunque su relevancia estadística es menor (Quillet, C. y col. (1998) Lancet 351:14-18). Los individuos homozigóticos para el alelo muíante CCR5A32, que muestran estadísticamente una protección prácticamente completa frente al virus del sida, no presentan ningún tipo de alteración funcional en su sistema inmune, lo cual parece indicar que la función biológica de CCR5 es redundante y puede ser suplida sin dificultad por otros receptores de quimioquinas. Estos datos sugieren que la inactivación genética específica de CCR5 en linfocitos o progenitores hematopoyéticos es probablemente inocua y podría tener importantes aplicaciones terapéuticas en la prevención y el tratamiento del sida.
Hasta el momento se han propuesto varios sistemas para inactivar genéticamente la proteína CCR5 en células humanas. El primero de ellos consiste en la administración de oligonucleótidos antisentido específicos para el mRNA de CCR5 (Patentes WO 9745543, WO 9834945, WO 9805798). Otros métodos implican la transducción in vitro de linfocitos o células stem humanas con vectores retrovirales que expresan intracelularmente una molécula inhibidora de la expresión/exportación de CCR5 a la superficie celular Entre estos métodos se han incluido variantes destinadas a interferir con la transcripción del gen CCR5 mediante la utilización de ribozimas específicas (WO 9946372, WO 981730, WO 9936518, WO 9805798) o la combinación de ribozimas y enzimas de DNA (Goila y Banerjea (1998) FEBS Lett. 436:233-8.). Otros métodos implican la utilización de formas imitantes de CCR5 (patente WO 9854317, WO 9805798, WO 9732019). Finalmente la expresión intracelular de ligandos específicos (intraquinas) de CCR5 ha sido también planteada como estrategia terapéutica (WO
9824923; Yang, A.-G. y col. (1997) Proc. Nati Acad. Sel USA 94:11567-11572). Ninguno de estos antecedentes ha propuesto el uso combinado de los principios terapéuticos individuales ni los ha validado.
Así, la proteína humana CCR5 no se ve afectada por el problema de la variabilidad del virus, su participación en el proceso infectivo es crítica, y su inactivación genética no parece producir alteraciones funcionales de ningún tipo. Todo ello convierte a CCR5 en una diana ideal para la terapia génica. Sin embargo, aún no existe ningún protocolo de terapia génica dirigido a bloquear la función de CCR5 en el proceso de infección del
VΓH-I.
DESCRIPCIÓN
Breve descripción de la invención
La presente invención describe una serie de construcciones genéticas capaces de mimetizar el fenotipo resistente a VTH-1 de los individuos con mutaciones que inactivan funcionalmente el receptor de quimioquinas CCR5. Así, forman parte de la presente invención:
- construcciones genéticas terapéuticas, que combinan distintos principios de interferencia génica (GSE, genetic supressor elements) capaces de inhibir específicamente la expresión del receptor CCR5 en células humana, en donde dichos principios de interferencia génica se basan en el uso de ribozimas de tipo
"hammerhead" y/o el bloqueo de la presencia de dicho receptor CCR5 en la membrana celular,
- vectores de expresión eucariotas y retrovirales que permiten introducir las mencionadas construcciones génicas terapéuticas en células eucariotas, - células eucariotas transformadas con los vectores retrovirales, entre otras, células eucariotas empaquetadoras y células diana positivas para el antígeno de membrana
- un modelo animal de inmunización intracelular contra VIH-1 desarrollado sobre la cepa de ratones NOD/Scid basado en el uso de los vectores retrovirales anteriormente mencionados y su uso en ensayos de efectividad in vivo de las construcciones genéticas anteriores de la restricción de la infección con cepas macrofago-trópicas de VIH-1
- uso de los vectores retrovirales mencionados en un procedimiento de terapia génica en pacientes humanos seropositivos para NIH-1 constituido por las siguientes etapas: a) aislamiento de las células diana de pacientes seropositivos para NIH-1 en estadios tempranos de la enfermedad, b) transducción, ex vivo, de las células diana con estos retro virus c) reimplantación de las células transducidas en el paciente, y d) seguimiento clínico de los niveles de viremia y contaje de células CD4+,
- uso de dichos vectores retrovirales en procedimientos de terapia génica de procesos patológicos humanos en los que estén involucrados receptores de quimioquinas con gran similitud estructural y funcional a CCR5.
Descripción detallada de la invención.
La presente invención está dirigida hacia la terapia génica de pacientes seropositivos para NIH-1 en estadios tempranos de la infección, mediante la transducción, ex vivo, de sus células progenitoras hematopoyéticas, o de sus células T
+ CD4 de sangre penférica con un vector retroviral que contiene un gen cuyo producto es capaz de inhibir específicamente la expresión del correceptor utilizado preferentemente por las cepas primarias del virus, el receptor de quimioquinas CCR5. Para ello, la presente invención provee de una serie de secuencias de DΝA cuyos productos génicos bloquean la expresión en superficie de dicho receptor, diversos vectores retrovirales que permiten introducir y expresar de forma estable dichas secuencias en células humanas, y los procedimientos necesarios para la utilización de
dichos vectores en modelos animales y en protocolos clínicos de terapia génica contra el sida. Además, la terapia descrita en la presente invención es compatible y complementaria con las terapias farmacológicas antivirales existentes en la actualidad y con aquellas que, previsiblemente, puedan desarrollarse en los próximos años. El receptor de quimioquinas CCR5 es una glicoproteína perteneciente a la familia de receptores con siete dominios transmembrana que se sintetiza en el retículo endoplásmico (RE) y es transportada a la superficie de la célula, donde sirve como correceptor del NIH-1. Concretamente, CCR5 se expresa en macró fagos, en linfocitos T activados y en células T de memoria. CCR5 es utilizado como correceptor por las cepas del virus que se hallan en la fase temprana asintomática de la infección, por lo que su inactivación funcional presenta un potencial óptimo para bloquear la progresión hacia los estadios posteriores, donde tiene lugar el desarrollo del sida.
El hecho de que CCR5 sea una proteína celular de membrana proporciona tres niveles en los cuales un agente inhibidor puede actuar bloqueando su expresión funcional:
- la transcripción del gen a mRΝA;
- la traducción del mR-ΝA a proteína, y
- la exportación de la proteína sintetizada desde el RE a la superficie celular.
Cualquier producto génico que bloquee uno o varios de estos procesos logrará disminuir el número de moléculas de CCR5 en la superficie celular y, consecuentemente, generar una inmunidad intracelular, al menos parcial, frente a la infección por NIH-1. Las construcciones genéticas descritas en la presente invención están dirigidas contra las etapas de traducción y exportación.
La inactivación específica de un mRΝA in vivo puede lograrse mediante la introducción en las células diana de una molécula de RΝA de secuencia complementaria
(antisentido) a la del mRΝA que se pretende inactivar. Si la secuencia del RΝA antisentido es demasiado extensa, existe el riesgo de que alguna región pueda reconocer otros RΝAs celulares además del mRΝA diana. Esta falta de especificidad hace que, en
las aplicaciones clínicas se prefiera la utilización de oligonucleótidos antisentido, cuyo pequeño tamaño permite diseñar secuencias completamente específicas, que, "teóricamente", pueden ser administradas a un paciente como cualquier otro fármaco. Sin embargo, las grandes dosis que suelen ser necesarias para lograr una efectividad significativa son a menudo tóxicas o producen indeseables efectos secundarios, por lo que la aplicación de este tipo de terapia está seriamente limitada.
Para identificar las regiones antisentido más eficaces para inhibir la expresión de CCR5 puede utilizarse la tecnología GSE (Genetic suppressor elements) (Gudkov y col. (1993) Proc Nati. Acad. Sel USA 90:3231-3235; Gudkov y col. (1994) Proc Nati. Acad. Sel USA 91:3744-3748; Roninson y col. (1995) Cáncer Res. 55:4023-4028; Garkavtsev y col. (1998) Nature 391:295-298). Esta técnica está basada en el aislamiento y caracterización de elementos genéticos supresores (GSEs) que se definen como pequeños fragmentos génicos que codifican RNAs antisentido inhibitorios o péptidos con actividad biológica que actúan de forma dominante. Los GSEs se aislan tras un proceso de clonaje y selección aleatorio, y manifiestan su función por la inhibición de una función génica o celular concreta que se utiliza como método de selección.
Una variante de los sistemas antisentido es la utilización de ribozimas. Las ribozimas naturales son secuencias de RNA con actividad auto-catalítica (Cech, T.R. (1987) Science 236:1532-1539; Uhlenbeck, O.C. (1987) Nαtwre 328:596-600) que pueden ser modificadas para actuar en trans sobre cualquier secuencia de RΝA hidrolizándola de forma específica (Haseloff, J. y Gerlach, W.L. (1988) Nature 334:585-591). La ventaja de una ribozima frente a un tratamiento con oligonucleótidos antisentido consiste en que la actividad ribonucleolítica de la primera es aditiva respecto a su propio efecto antisentido. Al igual que las secuencias antisentido, las ribozimas pueden ser administradas extracelularmente o bien ser codificadas por una secuencia de DΝA que se transduce en las células diana. La administración extracelular de ribozimas presenta los mismos inconvenientes que en el caso de los oligonucleótidos antisentido.
Por el contrario, la transducción de las células con el gen de la ribozima permite la expresión estable de la ribozima y posibilita su colocalización con el mRNA diana en el mismo compartimento celular (Hormes, R. y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:769- 775). Las ribozimas de tipo "hammerhead" son los RISíAs catalíticos más pequeños que se conocen. (Forster, A.C. y Symons, R.H. (1987) Cell 49:211-220; Haseloff, J. y Gerlach, W.L. (1988) Nature 334:585-591). Su estructura consiste en tres hélices (I-III) unidas por dos segmentos de hebra simple. Estos últimos, salvo en un residuo, son invariables en su secuencia, y contienen el centro catalítico y el sustrato. Por el contrario, las regiones que se aparean para formar las hélices pueden ser sustituidas en casi toda su longitud sin afectar a la actividad catalítica. En la naturaleza, dos de los brazos helicoidales terminan en lazos cenados, con lo que la ribozima cataliza la rotura intramolecular (in-cis) de un enlace fosfodiéster. Se pueden crear ribozimas que catalicen la hidrólisis de otra molécula de RNA (in-trans) eliminando uno de los lazos que cieña una de las regiones helicoidales. De este modo se crea una hebra sustrato separada del resto de la ribozima, y esta última actúa entonces como hebra catalítica independiente, siendo capaz de unir e hidrolizar sucesivamente muchas hebras sustrato de forma similar a una enzima polipeptídica. Hay tres posibles construcciones que pueden obtenerse mediante este procedimiento, denominadas I/II, II/III y I/III dependiendo de qué hélices se emplean para unir la hebra sustrato. En el caso de la estructura I/III la hebra catalítica contiene casi todos los nucleótidos conservados. Los restantes residuos conservados se localizan en la hebra sustrato y constituyen el triplete hidrolizado, que preferentemente ha de tener la secuencia GUC (Shimayana, T., Nishikawa, S. y Taira, K. (1995) Biochemistry 34:3649-3654). El pequeño tamaño y la simplicidad del diseño de las ribozimas de tipo
"hammerhead" las convierten en candidatos muy adecuados para inhibir la expresión de proteínas celulares específicas. Para diseñar una ribozima "hammerhead" del tipo descrito anteriormente, debe localizarse en la estructura secundaria del RNA sustrato
una región abierta que contenga el triplete GUC. Esto puede llevarse a cabo utilizando alguno de los programas informáticos de análisis de secuencias biológicas, como el Mfold de Zuker y Jaeger (Zuker, M. (1989) Science 244:48-52) (ver Ejemplo 2). Si existe más de una región que cumpla estos requisistos, se preferirá la que se encuentre más próxima al extremo 5' de la molécula sustrato, para asegurarnos de que el fragmento 5' resultante de la degradación no puede traducirse dando lugar a un polipéptido activo. Además, en el caso de CCR5, la región 5' del mRNA contiene la zona de secuencia menos conservada entre los distintos receptores de quimioquinas, lo que favorecerá la especificidad de la ribozima diseñada. Mediante una estrategia de este tipo en la presente invención se ha diseñado una ribozima del tipo "hammerhead" (SEQ ID NO: 4) que reconoce específicamente la secuencia del mRNA de CCR5 comprendida entre los residuos 62-89 e hidroliza el enlace fosfodiéster C76-PC77 (ver
Ejemplo 2) y fonna parte de la presente invención. El efecto de esta actividad es disminuir los niveles celulares del mRNA de CCR5 y, consiguientemente, el número de moléculas de dicho receptor que se expresan en la superficie de la célula.
Pueden realizarse modificaciones en la secuencia de la ribozima SEQ ID NO. 4 que aumenten su efectividad catalítica y forman parte de la presente invención. Por ejemplo, variantes de dicha ribozima con regiones complementarias al sustrato más cortas o más largas pueden ser más eficaces, al optimizar la velocidad de disociación del complejo ribozima: sustrato respecto a la velocidad de corte (Tabler, M. y Tsagris, M. (1991) Gene 108:175-183; Steinecke, P., Herget, T. y Scheirer, P.H. (1992) EMBO J. 11 :1525-1530; Homann, M. y col. (1993) Nucleic Acids Res. 21 :2809-2814; Heinrich, J.-C, Tabler, M. y Louis, C. (1993) Dev. Genet. 14:258-265; Crisell, P.,Thompson, S. y James, W. (1993) Nucleic Acid Res. 21:5251-5255; Tabler, M. y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22:3958-3965). Por otra parte, con el fin de aumentar la relación molar ribozima: sustrato, pueden construirse secuencias de DNA que codifiquen RNAs que contengan varias copias de la secuencia SEQ ID NO. 4 o variaciones de la misma y forman parte de la presente invención. En los Ejemplos se detalla la construcción de una
de estas secuencias (SEQ ID NO: 13), cuyo transcrito contiene 11 unidades funcionales consecutivas de la ribozima (ver Ejemplo 6) yforma parte de la presente invención.
Otra foraia de disminuir los niveles de CCR5 en la superficie celular es impedir su exportación desde el RE. Esta estrategia ha sido empleada con éxito in vitro utilizando formas intracelulares de los ligandos naturales de CCR5, las quimioquinas RANTES y MlP-lα (Yang, A.-G. y col. (1997) Proc. Nati Acad. Sel USA 94:11567- 11572). Sin embargo, dada la redundancia existente en la función biológica de los receptores de quimioquinas, la utilización de quimioquinas intracelulares entraña el riesgo de bloquear la expresión de otros receptores capaces de unir las mismas moléculas. Así, RANTES se une a CCRl, CCR3 y CCR4, mientras que MlP-lα es reconocido por CCRl y CCR4. La presente invención, como se describe más adelante, incluye varios polipéptidos que, al expresarse en las células diana, se unen intracelularmente con gran afinidad y especificidad a las moléculas de CCR5 y las secuestran en el interior del RE. Existen evidencias de que los individuos heterozigóticos CCR5/CCR5Λ32 infectados por el VIH-1 progresan más lentamente hacia el sida que los individuos sin el alelo muíante (Huang, Y.X. y col. (1996) Nal Med. 2:1240-1243; Michael, N.L y col. (1997) Nαt. Med. 3:338-340). También se ha evidenciado que los PBMC con genotipo CCR5/CCR5Δ32 son menos susceptibles in vitro a la infección por las cepas M-trópicas del VIH-1 que las células CCR5/CCR5 (Liu, R. y col. (1996) Cell 86:367-377). Exisíe asimismo un esíudio que demuestra que las células T CCR5/CCR5Δ32 tienen unos niveles de expresión de CCR5 respecío a las células CCR5/CCR5 sensiblemeníe inferiores al 50% que cabría esperar de su dosis génica (Wu, B.L. y col. (1997) J. Exp. Med. 185:1681-1691). Todos estos datos sugieren que el alelo muíante CCR5A32 acíúa como un íransdominaníe negativo respecío al alelo normal. Recieníemeníe, esía hipóíesis ha sido confirmada por un esíudio que demuesíra que los muíaníes de CCR5 delecionados en su exíremo C-terminal se unen intracelularmeníe a la forma nativa de
CCR5 y la secuestran en el interior del RE (Benkirane, M. y col. (1997) J. Biol Chem. 272:30603-30606).
De acuerdo con esíos daíos, se propone que las secuencias polipepíídicas que contienen fragmentos N-íerminales de CCR5 acíúan como inhibidores de la expresión de esía proíeína en la superficie celular y pueden, por íanío, ser usadas para bloquear la entrada del VIH-1 en células humanas. Preferentemeníe, para permitir la iníeracción con la proíeína nativa, dichas secuencias deberían contener los 2, 3, 4 ó 5 primeros dominios transmembrana de CCR5, conespondientes, de forma aproximada, a los residuos 1-90, 1-125, 1-170 y 1-220, respectivamente. Además, para impedir su exportación a la superficie celular, estos polipéptidos deben carecer del extremo C-íerminal de CCR5 (unos 60 residuos, aproximadameníe). La región conespondieníe al dominio exlracelular (N-terminal) del recepíor nativo (unos 30 aminoácidos, aproximadameníe) no es requerida para la interacción, por lo que puede ser sustiíuída por cualquier oíro dominio funcional (p.ej. oíro dominio de unión a CCR5) siempre que el nuevo dominio coníenga una señal que dirija la síníesis del polipépíido al RE (p.ej. un pépíido señal de mamíferos) para permitir la colocalización con la proíeína CCR5 nativa. Ya que el efecío secuestrante de estos polipépíidos depende de su concentración en el lumen del RE, para potenciar dicho efecto puede añadirse en el exíremo C-íerminal una señal de reíención en RE de mamíferos, como por ejemplo el íeírapépíido KDEL (código de aminoácidos de una leíra, SEQ ID NO: 16). La adición de dicho íetrapéptido se íraduce en una actividad inhibidora sensiblemeníe mayor que la de polipépíidos similares que carecen de esía señal de reíención. En los Ejemplos se describe la consírucción de dos polipéptidos de esíe íipo, concreíameníe una secuencia que comprende los aminoácidos 1-184 de CCR5 (SEQ ID NO: 19) (ver Ejemplo 9) y oíra que abarca los residuos 1-100 (SEQ ID NO: 21) (ver Ejemplo 10) y forman parte de la preseníe invención. La secuencia codificante por el íeírapépíido KDEL se incluye en los oligonucleóíidos 3 ' (SEQ ID NO: 18 y 20) empleados en las reacciones de PCR que se utilizan para modificar las construcciones originales (ver Ejemplos 9 y 10). La eventual transducción
de las células de un pacieníe con secuencias de DNA que codifiquen esíe íipo de polipéptidos no debería inducir ningún tipo de respuesía inmune adversa, o ésía sería mínima, ya que dichas moléculas no contienen secuencias que no esíén presentes de forma natural en el organismo, aparte de un corto fragmento en la nueva secuencia C- terminal.
En las secuencias de nucleótidos que codifican los muíanles de CCR5 delecionados en la región C-íerminal resulta convenieníe introducir una modificación respecío a la secuencia que codifica la región equivaleníe del recepíor CCR5. La adenosina conespondieníe al residuo 75 (uridina) del mRNA de CCR5 puede susíiíuirse por guanosma, de forma que el íripleíe GUC reconocido por la ribozima SEQ ID NO. 4 anteriormente descriía se transforme en GCC, y el mRNA no sea degradado por dicha ribozima y forma parte de la preseníe invención. Esíe cambio no alíera la secuencia de aminoácidos respecío al recepíor naíural, y permite combinar, en el mismo íraíamienío, la acción íerapéuíica de la ribozima con la de las formas delecionadas de CCR5 sin que ambas interfieran muíuameníe. Dicha combinación puede realizarse utilizando simulíáneameníe dos vecíores, o bien incluyendo las secuencias en un mismo vecíor y forma parte de la presente invención. En esíe último caso, puede utilizarse un vecíor bi- cislrónico o construirse una secuencia híbrida como las que se describen más adelante.
La acción inhibidora de los polipépíidos capaces de secuesírar a CCR5 en el RE puede ser incremeníada aumeníando la afinidad de los mismos por el recepíor. Esío puede llevarse a cabo mediante muíaciones en su secuencia de aminoácidos, cuyo efeclo sobre la actividad inhibitoria sería cuaníificado en esíudios in vitro del íipo de los descritos en los Ejemplos y forma parte de la preseníe invención (ver Ejemplo 17 y 18). Oíra forma de conseguirlo es aumeníar el número de sitios de unión a CCR5 en el polipépíido inhibidor. Para ello se consíruirían genes que codifiquen varios dominios funcionales de unión a CCR5 en una misma cadena polipepíídica. Dichos dominios pueden ser iguales (p.ej. repeticiones de un fragmento N-íerminal de CCR5) o distintos (p.ej. un fragmento de CCR5 seguido o precedido de un dominio funcional que se una a
CCR5 en una región disíinía) y forman parte de la preseníe invención. En los Ejemplos se deíalla la consírucción de una proíeína recombinaníe de esíe íipo (SEQ ID NO: 27), en la cual el exlremo N-íerminal de una forma delecionada de CCR5 es reemplazado por la secuencia de la quimioquina RANTES (ver Ejemplo 13) y forma parle de la preseníe invención. Además de los difereníes dominios funcionales, una proíeína de esíe íipo debería incluir uno o varios segmentos de aminoácidos que sirvieran de espaciadores eníre dichos dominios. Esíos segmentos conecíarían el exíremo C-íerminal de un dominio con el N-lemiinal del siguieníe, de forma que cada dominio pudiera unir disíinías moléculas de CCR5 sin interferir con la actividad de los resíaníes dominios. Un ejemplo de esíe tipo de segmento espaciador es la secuencia de aminoácidos GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 15) (ver Ejemplo 13).
Dado que la acción de una ribozima se ejerce a nivel de RNA, la secuencia de DNA que la codifica puede incluirse en la región no íraducida de cualquier gen que codifique un polipépíido capaz de inhibir la expresión de CCR5, lo cual aumeníaría el efecío lerapéutico de la construcción. De esta forma, puede añadirse la secuencia SEQ ID NO. 5 ó la SEQ ID NO. 13 al extremo 3' de todas las secuencias que codifican los polipépíidos anteriormente descritos y forma parte de la preseníe invención. También puede uíilizarse la secuencia de DNA que codifica la quimioquina iníracelular RANTES-KDEL (Yang, A.-G. y col. (1997) Proc. Nati Acad. Sel USA 94:11567- 11572) seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 7 (SEQ ID NO: 30), así como la seguida de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 13, tal como se detalla en los Ejemplos (ver Ejemplo 15). Los productos génicos de íodas esías secuencias tienen un efecío inhibidor a dos niveles: el mRNA hidroliza específicamente el mRNA de CCR5, y el polipépíido resulíaníe de su íraducción acíúa bloqueando la producción de CCR5 mediante el mecanismo correspondiente. El efecío adiíivo de una construcción híbrida de esíe íipo ha sido demosírado para una ribozima dirigida contra el RNA genómico de VIH-1 (Paik, S.-Y. y col. (1997) Hum. Gene Ther. 8:1115-1124).
Para realizar esíudios de actividad en cultivos celulares o animales de laboratorio, así como para llevar a cabo ensayos clínicos en humanos, las secuencias genéticas inhibitorias anteriormente descriías deben introducirse en vectores de expresión eucarióíicos. En el caso de los ensayos en cultivos celulares pueden usarse vectores plasmídicos que contengan un promoíor muy activo en las células diana. Además, es conveniente que posean un origen de replicación procariota para permitir su propagación en Escherichia coli, así como un gen eucariótico que sirva como marcador de selección (p.ej. un gen de resisíencia a un antibiótico). Exisíen numerosos plásmidos comerciales de esíe íipo. Uno de los más usados es pcDNA3 (Inviírogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU), que contiene un promotor de ciíomegalovirus y el gen de resisíencia a neomicina. En los Ejemplos se describe la clonación de algunas de las secuencias anteriormente descriías en el vecíor pcDNA3 (ver Ejemplo 3, 7, 11, 13 y 15) y forman parte de la présenle invención. Para maximizar la expresión de dichas secuencias puede añadirse a su exlremo 5' una secuencia consenso que favorece el inicio de la íranscripción (Kozak, M. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8125-8131). Los plásmidos recombinaníes así obtenidos pueden ser utilizados como vectores en esíudios de íransfección en los que se preíenda lograr la expresión de los genes poíencialmeníe íerapéuticos tanto de forma transitoria como estable y fonnan parte de la presente invención. Además de las derivadas de pcDNA3, pueden realizarse otras construcciones de esíe íipo utilizando vectores de expresión que posean un promotor distinío y/o oíro gen marcador y forman parle de la presente invención. En el caso particular de las ribozimas, para aumentar sus niveles de expresión pueden clonarse en el interior de un gen que contenga un promoíor para la RNA polimerasa III y forman parte de la presente invención. Dicha polimerasa transcribe RNAs muy abundantes en la célula, tales como íRNAs y snRNAs (Palmer, J.M. y Folk, W.R. (1990) Trends Biochem. 15:300-304). De esía forma, se han desarrollado una serie de vecíores particulares donde se ha clonado las SEQ ID NOs. 4 y 13 en el gen de mamíferos U6 (Kunkel, G.R. y col. (1986) Proc.
Nati Acad. Sel USA 83:8575-8579) o en el gen adenoviral NA-1 (Railey, J.F. y Wu, G.J. (1988) Mol Cel Biol 8:1147-1159), íal como se deíalla en los Ejemplos (SEQ ID ΝOs. 9 y 11) (ver Ejemplo 4) y forma parte de la presente invención.
En un tratamiento clínico de terapia génica sería posible utilizar como ageníe íerapéutico una o varias de las secuencias genéticas descritas anteriormente y su utilización forma parte de la presente invención. La elección de la secuencia o secuencias más adecuadas para dicho tratamiento se realizaría teniendo en cuenta su efectividad en ensayos realizados previamente in vitro sobre culíivos celulares. En dichos ensayos se puede medir la reducción de los niveles de expresión en superficie de CCR5 (p.ej . medíanle inmunofluorescencia) producida por la transfección con un vector de expresión del tipo de los descritos aníeriormeníe que coníuviera un gen inhibidor específico (ver Ejemplos 21 y 22). También puede medirse la reducción de la capacidad de infección de cepas M-lrópicas de VIH-1 sobre células que expresen CD4 y CCR5, previamente transducidas con dicho vector de expresión (ver Ejemplo 23). Varios ensayos de esíe tipo aparecen descritos en los Ejemplos y forman parte de la presente invención. Otros ensayos similares resultan evidentes para quienes posean formación en la materia y forman parte de la presente invención.
La realización de ciertos experimentos in vitro, así como la utilización ex vivo, particularmente en aplicaciones clínicas, de las secuencias genéticas inhibitorias anteriormente descriías requieren la consírucción de vecíores capaces de introducir dichas secuencias en células humanas de forma eficiente y esíable. Hasía el momenío preseníe, los vecíores genéticos más eficieníes en células de mamífero son los vecíores virales y, entre ellos, los que presentan más ventajas son los reírovirus. Los retrovirus son virus de RΝA+ que se replican a través de un intermedio de DΝA y transfieren su información al genoma de la célula infectada. De esía forma, dicha célula queda, en teoría, permanentemente modificada (Temin, H.M. (1990) Hum. Gene Ther. 1:111-111- 123; Anderson, W.F. (1992) Science 256:808-813; Miller, A.D. (1992) Nature 357:455- 460; Mulligan, R.C. (1993) Science 260:926-932) lo cual es una veníaja en el
tratamiento de una enfermedad como el sida, que posee características de infección crónica (Finzi, D. y col. (1997) Science 278:1295-1300; Chun, T.W. y col. (1997) Proc. Nati. Acad. Sel USA 94:13193-13197).
Los vectores reírovirales pueden construirse con gran facilidad haciendo uso de plásmidos bacterianos que contienen el genoma viral modificado para ser deficiente en replicación. Dicho genoma contiene las regiones terminales del virus (LTRs) y las señales mínimas necesarias para el empaqueíamienío. Esíe íipo de vecíores puede coníener hasía 7 kb de material genético exógeno, lo cual permite acomodar holgadamente cualquiera de las secuencias poíencialmeníe íerapéuíicas aníeriormeníe descriías. La gran mayoría de los vecíores reírovirales uíilizados en la íransducción de líneas celulares y en íerapia génica esíán basados en el virus de la leucemia murina (MLV) (Mann, R., Mulligan, R.C. y Balíimore, D. (1983) Cell 33:153-159; Cone, R.D. y Mulligan, R.C. (1984) Proc. Nati. Acad. Sel USA 81:6349-6353; McLachlin, J.R. y col. (1990) Progress Nucleic Res. Mol. Biol 38:91-135). La utilización de vectores retrovirales para el íralamienlo de pacieníes humanos requiere la consírucción de vectores de alia seguridad biológica cuyas caracíerísíicas minimicen el riesgo de aparición de vecíores compeíeníes en replicación mediante recombinación con otros elementos virales. Dichas características pueden incluir:
- Una deleción en el enhancer de la región U3 del LTR 3', que impide la íranscripción de secuencias virales iras la integración del vecíor en el genoma de la célula huésped,
- Una serie de deleciones a lo largo de la secuencia reíroviral que minimicen la homología del vecíor con la secuencia de un reírovirus natural, y
- Una mutación que convierte el codón de iniciación del gen reíroviral GAG en un codón stop, de forma que se bloquea el inicio de la íraducción (el gen GAG no puede eliminarse íoíalmeníe, pues contiene la secuencia de empaqueíamienío).
Oirás características deseables en un vector reíroviral íerapéuíico con aplicaciones clínicas son:
- Transcripción del gen terapéutico a partir de un promotor constitutivo distinto del LTR, pues ésíe se ve sometido con frecuencia al fenómeno de silenciamiento en las células íransducidas (Scharfmann, R., Axelrod, J.H. y Verma, I.M. (1991) Proc. Nati. Sel USA 88:4626-4630; Rettinger, S.D. y col. (1994) Proc. Nati. Acad. Sel USA 91:1460-1464; Qin, L. y col. (1997) Hum. Gene Ther. 8:2019-2029),
- El gen de selección debería codificar preferiblemeníe un antígeno de superficie que permitiera seleccionar las células íransducidas medianíe un proceso que no afecíase a la viabilidad celular (p.ej. mediante citomeíría de flujo). Esíe antígeno marcador sería preferiblemente una proteína humana que no diera lugar a una reacción inmune en el paciente recepíor y cuya expresión no alierara el fenotipo celular. Un ejemplo de esíe tipo de marcadores es una forma truncada del receptor de baja afinidad del factor de crecimiento nervioso (LNGFR) (Mavilio, F. Y col. (1994) Blood 83:1988-1997;. Ruggieri, L. y col. (1997) Hum. Gene Ther. 8:1611-1623).
En los Ejemplos se describe una serie de construcciones terapéuticas basadas en el vector pCLXSN (Naviaux, R.K. y col. (1996) J. Virol 70:5701-5705) (ver Ejemplos 5, 8, 12, 14 y 16). Este vector contiene el gen de resistencia a neomicina bajo el control del promotor de SV40, que permite una selección rápida y sencilla de las células transducidas. En estas construcciones el gen insertado se halla bajo el conírol de un promoíor híbrido, muy poleníe, formado por la fusión de la región temprana del promoíor de citomegalovirus humano y la LTR del MLV. Cualquiera de las secuencias polenciamienle lerapéuíicas descriías aníeriormeníe e incluidas en la preseníe invención puede ser clonada en un vecíor de este tipo y forman parte de la presente invención.
En el caso concreto de las ribozimas, la posición que ocupa el gen que las codifica dentro del retrovirus íiene un gran efecío sobre sus niveles de expresión (Uves, H. (1996) Gene 171:203-208). Con el fin de minimizar esíe efecío posicional, las secuencias SEQ ID NOs. 4, 9, 11 y 13 pueden clonarse en la LTR 3' de un vector reíroviral. Además, debido al mecanismo de replicacion reíroviral esía región se duplica una vez que el reírovirus se ha integrado en el genoma de la célula huésped, por lo que
todos los insertos en dicha región conducen a la obíención de dobles copias de nuesíro gen de inferes.
Para la producción de los vecíores reírovirales deficientes en replicación descritos más aniba, deben oblenerse líneas celulares capaces de producir viriones infecciosos coníeniendo el genoma viral. Dichas líneas celulares, denominadas células empaqueíadoras, codifican en su genoma iodos los genes requeridos en trans para la replicación viral, de íal manera que, cuando se introduce en estas células un plásmido que coníiene las secuencias de las LTRs retrovirales necesarias para la integración, replicación y encapsidación, se produce un reírovirus quimérico que coníiene en su genoma la secuencia preseníe entre las LTR del plásmido transfectado. De las líneas empaqueíadoras existeníes, sería preferible emplear aquellas que expresen una proíeína de la envuelía viral anfoírópica, pues su receptor se encuentra expresado ampliamente íanío en células de ralón como en células humanas, incluyendo las de estirpe hemaíopoyéíica, que son el objetivo final de la terapia descrita en la preseníe invención. Además, por motivos de seguridad biológica, sería preferible que las células empaqueíadoras utilizadas tuvieran en su genoma las secuencias retrovirales fragmentadas (lo que se denomina líneas empaquetadoras de segunda generación), de forma que se minimizará el riesgo de recombinación que generara un virus competente en replicación. Por último, sería preferible utilizar una línea celular empaquetadora de origen humano, con el fin de que los viriones producidos no coníuvieran en su envuelía determinantes murinos que los hicieran sensibles a la inactivación por el suero humano (Takeuchi, Y. y col. (1994) J. Virol 68:8001-8007). Una línea que posee todas estas características es la FLYA13, que permite la producción de retrovirus con un tííulo muy alio, de hasla 107 cfu/ml (Cosset, F.-L. y col. (1995) J Virol. 69:7430-7436). En los Ejemplos se describe la obtención de líneas celulares empaqueíadoras derivadas de FLYA13 capaces de producir viriones infecciosos coníeniendo genomas reírovirales deficientes en replicación que codifican la consírucciones polencialmenle íerapéuíicas descriías más arriba (ver Ejemplo 19) y forman parte de la preseníe invención.
Antes de utilizar en aplicaciones clínicas las consírucciones genéticas íerapéuíicas descriías en la preseníe invención, debe realizarse un ensayo de la efectividad de dichas consírucciones in vivo, utilizando para ello un modelo animal. La cepa de raíones NOD/LíSz-Scid/Scid es alíameníe inmunodeficieníe y cuando se irradia de forma moderada permite el injerto medular de células CD34 humanas (Vormoor J. y col. (1994) Blood 83:2489-2497; Greiner, D.L. y col. (1995) Am. J. Pathol 146:888-
902; Larochelle, A. y col. (1996) Nat. Med. 2:1329-1337). Cuando esíos raíones se
4 transplantan con un número de precursores hemaíopoyéíicos humanos supenor a 10 , se desanolla una hematopoyesis humana que persisíe durante toda la vida del animal transplantado. Exisle evidencia que al menos parte de la hemopoyesis humana expresa el aníígeno de membrana CD4, que es el recepíor del VJH-1, por lo que esíe animal quimérico podría ser infecíado por esíe virus. Para potenciar la maduración de células
CD4 humanas en los animales trasplantados, puede injertárseles un fragmento de timo o de hueso humanos, los cuales permiten mantener en esíos animales una linfopoyesis a largo plazo (Namikawa, R. y col. (1990) J Exp. Med. 172:1055-1063; Krowka, JF. y col. (1991) J. Immunol 146:3751-3756; Kyoizumi, S. (1992) Blood 79:1704-1711;
McCune, j. y col. (1991) Annu. Rev. Immunol 9:399-429). Aquellos animales que expresen los genes inhibidores de la expresión de CCR5 preseníarán una resíricción compleía para la infección con cepas macrofago-írópicas de VIH-1. Esíe ensayo in vivo constituye el modelo ideal para probar estrategias de lerapia génica en precursores linfo- mieloides aníes de su uíilizacion en ensayos clínicos en humanos. En los Ejemplos se describe un modelo animal de esíe íipo y forma parte de la presente invención (ver
Ejemplo 28).
Alternativamente, como modelo experimental más sencillo, los raíones inmunodeficieníes pueden ser írasplantados por vía iníraperiíoneal con células humanas CD4 + maduras, obtenidas de sangre penférica de donaníes sanos y íransducidas con los retrovirus terapéuíicos. Bajo esías condiciones las células humanas proliferan y se pueden recuperar de los animales íranplaníados mediante lavados peritoneales. Los
animales trasplantados pueden ser infectados con cepas macrófago- y linfociíoírópicas de VIH-1. En las células no íransducidas el virus se replicará acíivameníe, produciendo
-X- altos niveles virales en el lavado periíoneal y depleción de las células CD4 inyecíadas, mientras que las células transducidas con el vecíor íerapéuíico se mosírarán resisíeníes a la infección. Esle tipo de experimentos se describe detalladamente en los Ejemplos y forma parte de la preseníe invención (ver Ejemplo 27).
Si los modelos animales aníeriormeníe descritos demuestran la seguridad y la eficacia de los vectores retrovirales descritos en la preseníe invención, ésíos pueden usarse en un procedimiento de íerapia génica en pacieníes humanos seroposiíivos para VIH-1. Dicho procedimiento se realizaría prefereníemenle ex vivo, es decir, sobre células diana previameníe exíraídas del pacieníe, y constaría de las siguieníes eíapas:
- aislamiento de las células diana de pacieníes seroposiíivos para VIH-1 en esíadios íempranos de la infección,
- íransducción, ex vivo, de las células diana con los retrovirus poíencialmeníe íerapéuíicos,
- reimplaníación de las células íransducidas en el pacieníe, y
- seguimiento clínico de los niveles de viremia y coníaje de células CD4 , y forma parte de la preseníe invención.
Las células diana para el íraíamienío con los retrovirus terapéulicos pueden ser de dos tipos. En primer lugar, pueden íransducirse células positivas para el aníígeno de membrana CD34. Dicho aníigeno define una población celular de la medula ósea capaz de reconsíiíuir la hemopoyesis de individuos letalmeníe inadiados o sometidos a quimioterapia intensiva (Waller, E.K., Huang, S. y Tersíappen, L. (1995) Blood 86:710- 710-718). Esle íipo celular consliíuye la diana ideal para protocolos de íerapia génica, ya que, debido a la naíuraleza jerárquica del sislema inmune, cualquier gen nuevo incorporado en el genoma de unas pocas células progeniíoras esíará preseníe en los millones de células linfoides y mieloides derivados de esíos precursores.
Los vecíores reírovirales derivados del MLV pueden íransducir de forma eficaz únicamente células que se dividen de forma activa (Roe, T. (1993) EMBO J. 12:2099- 2108; Lewis, P.F. (1994) J Virol. 68:510-516), lo cual limiía considerablemente su eficiencia en el caso de los progeniíores hemaíopoyéíicos, que no se dividen activamente in vitro. Para mejorar dicha eficiencia pueden construise vecíores reírovirales derivados de leníivirus, como el propio VIH, que sí son capaces de infectar células que no proliferan (Naldini, L. Y col. (1996) Science 272:263-267; Poeschla, E. (1996) Proc. Nati. Acad. Sel USA 11395-11399; Zufferey, R. y col. (1997) Nal Biotechnol 15:871-875). También se puede aumentar la eficiencia de transducción de los progenitores hematopoyéticos conseguida por los vectores retrovirales derivados del MLV sometiendo a dichas células, de forma previa o simultánea a la infección con el vector terapéutico, a un tralamienío que induzca una división celular de fonna transitoria y forma parte de la presente invención.
La otra posibilidad es tratar directamente las células CD4 , las cuales pueden aislarse de sangre periférica mediante leucoferesis seriadas y ser amplificadas ex vivo hasta obtener un número muy elevado. Una vez transducidas con el vector terapéutico, estas células pueden reimplantarse en el paciente, en donde se espera que, al tener una ventaja competitiva frente a las células sensibles a VIH-1, repoblarán los órganos linfoides secundarios, desplazando a la linfopoyesis sensible al virus. En los Ejemplos se describe detalladamente una aplicación de este tipo y forma parte de la preseníe invención (ver Ejemplo 29 y 30).
Dada la gran similiíud estructural y funcional de CCR5 con otros receptores de quimioqumas, el modelo de íerapia génica descrito en la presente Invención es también aplicable a cualquier proceso patológico en cuyo desarrollo se hallen involucrados dichos receptores. Las quimioquinas actúan estimulando la migración quimiotáctica de diversas poblaciones celulares, entre las que se encuentran neuírófilos, monocitos, linfociíos, eosinófilos y fibroblastos. En la aclualidad se conocen más de 30 quimioquinas humanas, que intervienen en la mayor parte de los procesos implicados en
la respuesta inmune y la defensa contra las agresiones de patógenos, células lumorales o daños físicos, y se han identificado unos 20 difereníes recepíores de quimioquinas (Baggiolini, M., Dewald, B. yMoser, B. (1997) Annu. Rev. Immunol 15:675-705).
Las quimioquinas y sus recepíores esíán involucrados en el desanollo de muy diversas patologías humanas, íales como malaria (Horak, R. y col. (1993) Science 261:1182-1184), procesos inflamatorios crónicos (Raíhanaswami, P. y col. (1993) J Biol. Chem. 268:5834-5839; Wada, T. y col. (1994) J Exp. Med. 180:1135-1140; Grimm, M.C. y col. (1996) J Leukoc Biol. 59:804-812; Kurashima, KJ. y col. (1996) Leukoc. Biol. 59:313-316; Brown, j. y col. (1996) Leukoc Biol. 59:75-80; Gong, J.H. y col (1997) J. Exp. Med. 186:131-137; Narumi, S. y col. (1997) J Immunol 158:5536- 5544; Tang, W.W. y col. (1997) J. Immunol 159:870-876; Lloyd, C.M. y col. (1997) J. Exp. Med. 185:1371-1380), enfennedades degenerativas del sistema nervioso (Godiska, R. y col. (1995) J. Neuroimmunol 58:167-176; Karpus, WJ. y col. (1995) J Immuno 155:5003-5010; Miyagishi, R. (1995) J Neurol. Sel 129:223-227), rechazo crónico de íransplanles (Paííison, 1 y col. (1994) Lancet 343:209-211; Patíison, J.M. y col. (1996) J. Heart Lung Transplant. 15:1194-1199; Fairchild, R.L y col. (1997) Transplantation 63:1807-1812; Grandaliano, G. (1997) Transplantation 63:414-420), alíeraciones cardiovasculares (Wong, M., Silverman, E.D. y Fish, E.N. (1997) J. Rheumatol 24:1179-1185; Maísumori, A. y col. (1997) J. Mol Cell. Cardiol 29:419-423) y crecimiento y diseminación de lumores (Sírieíer, R.M. y col. (1995) J. Leukoc. Biol. 57:752-762; Keane, M.P. y col. (1997) J. Immunol 159: 1437-1443). Todas esías enfermedades son susceptibles de ser íraíadas medianíe un sisíema de lerapia génica que inactive funcionalmente de forma específica el receptor de quimioquinas involucrado en cada caso, de manera similar a los descriíos en la preseníe invención para CCR5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS
Figura 1 es una ilusíración esquemática de la región eucarioía del plásmido p3HCCR5.
PCMV: Promoíor de ciíomegalovirus; CCR5: Gen CCR5 humano; BGH PA: Señal de
poliadenilación de la hormona de crecimienío bovina; SV40: Promoíor del virus SV40;
HYGRO: Gen de resistencia a higromicina; SV40 PA: Señal de poliadenilación del virus SV40.
Figura 2 es una ilusíración esquemática de la esírucíura secundaria de los 100 primeros nucleóíidos del cDNA del gen CCR5. La flecha indica el enlace fosfodiésíer excindido por la ribozima CCR5.
Figura 3 es una ilusíración esquemáíica del complejo formado por el mRNA de CCR5 y la ribozima CR5Rib. I: Hélice I; II: Hélice II; III: Hélice III.
Figura 4 es una ilustración esquemática de la región eucariota del plásmido p3CR5Rib. PCMV: Promoíor de ciíomegalovirus; RIB: Ribozima CR5Rib; BGH PA: Señal de poliadenilación de la hormona de crecimienío bovina; SV40: Promoíor del virus SV40;
Neo: Gen de resisíencia a neomicina; SV40 PA: Señal de poliadenilación del virus
SV40.
Figura 5 es una ilustración esquemática del retrovirus contenido en el plásmido ρCLCR5Rib. LTR: Long terminal repeaí reíroviral; RIB: Ribozima CR5Rib; SV40:
Promoíor del virus SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina.
Figura 6 es una ilustración esquemáíica de la región eucarioía del plásmido p3CR5Ribxl l. PCMV: Promoíor de ciíomegalovirus; RIB x 11: Ribozima mulíicaíalílica CR5Ribxll; BGH PA: Señal de poliadenilación de la hormona de crecimienío bovina; SV40: Promotor del virus SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina. SV40 PA: Señal de poliadenilación del virus SV40.
Figura 7 es una ilusíración esquemáíica del reírovirus coníenido en el plásmido pCLCR5Ribxl l. LTR: Long terminal repeaí reíroviral; RIB x 11: Ribozima mulíicaíalííica CR5Ribxll; SV40: Promotor del virus SV40; Neo: Gen de resistencia a neomicina.
Figura 8 es una ilustración esquemática de la región eucarioía del plásmido p3CCR5/4TM-KDEL; PCMV: Promoíor de ciíomegalovirus; CCR5(1-184): Fragmento codificante para los aminoácidos 1 a 184 de CCR5; SR: Señal de reíención en reíículo
endoplásmico (KDEL); BGH PA: Señal de poliadenilación de la hormona de crecimienío bovina; SV40: Promoíor del viras SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina; SV40 PA: Señal de poliadenilación del virus SV40.
Figura 9 es una ilusíración esquemáíica del reíroviras coníenido en el plásmido pCLCCR5/4TM-KDEL. LTR: Long terminal repeaí reíroviral; CCR5(1-184): Fragmento codificante para los aminoácidos 1 a 184 de CCR5; SR: Señal de reíención en retículo endoplásmico (KDEL); SV40: Promoíor del virus SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina. Figura 10 es una ilusíración esquemática de la región eucariota del plásmido p3RT- CCR5/4TM-KDEL. PCMV: Promoíor de ciíomegalo viras; RT: Secuencia que codifica la quimioquina RANTES; L: Linker (GGGGS); CCR5(25-184): Fragmento codificante para los aminoácidos 25 a 184 de CCR5; SR: señal de retención en retículo endoplásmico (KDEL); BGH PA: Señal de poliadenilación de la hormona de crecimienío bovina; SV40: Promoíor del viras SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina; SV40 PA: Señal de poliadenilación del viras SV40.
Figura 11 es una ilustración esquemática del reíroviras coníenido en el plásmido pCLRT-CCR5/TM-KDEL; LTR: Long terminal repeaí reíroviral; RT: Secuencia que codifica la quimioquina RANTES; L: Linker (GGGS); CCR5(25-184): Fragmento codificaníe para los aminoácidos 25 al 184 de CCR5; SR: señal de reíención en retículo endoplásmico (KDEL); SV40: Promoíor del viras SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina.
Figura 12 es una ilusíración esquemáíica de la región eucarioía del plásmido p3RT- KDEL-CR5Rib. PCMV: Promoíor de ciíomegaloviras; RT: Secuencia que codifica la quimioquina RANTES; SR: señal de reíención en retículo endoplásmico (KDEL); RIB: Ribozima CR5Rib; BGH PA: Señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina; SV40: Promoíor del viras SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina; SV40 PA: Señal de poliadenilación del virus SV40.
Figura 13 es una ilustración esquemática del retrovirus contenido en el plásmido pCLRT-KDEL-CR5Rib. LTR: Long íermmal repeaí retroviral; RT: Secuencia que codifica la quimioquina RANTES; SR: señal de retención en retículo endoplásmico (KDEL); RIB: Ribozima CR5Rib; SV40: Promotor del virus SV40; Neo: Gen de resisíencia a neomicina
Figura 14 es un diagrama de ba as en el que se represenía el resulíado de un experimenío de colransfección de células 293, del íipo descrito en el Ejemplo 25. Se represenía el porcenlaje (%) de células, medido mediante inmuno fluorescencia, que expresan en su superficie el receptor CCR5 24 h después de haber sido transformadas con: pcDNA3: 2 μg de pcDNA3; CCR5 + pcDNA3: 400 ng de p3HCCR5 + 1,2 μg de pcDNA3; CCR5 + CCR5/4TM-KDEL (a): 400 ng de p3HCCR5 + 400 ng de p3CCR5/4TM-KDEL; CCR5 + CCR5/4TM-KDEL (b): 400 ng de p3HCCR5 + 1,6 μg de p3CCR5/4TM-KDEL.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los siguieníes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limiíaíivos del alcance de la misma.
Ejemplo 1.- Construcción de un plásmido de expresión eucariótico que codifica la secuencia de aminoácidos de CCR5
1.1 Aislamiento de RNA total de linfocitos de sangre periférica (PBLs):
Se obtienen 10 mi de sangre de un donante sano y se someíen, en presencia de
(R) heparina 1000 U/ml, a separación en gradiente de densidad 1,077 gr/1 en Ficoll-Paque (Pharmacia Biolech) centrifugando a 800 g durante 45 min. La fracción de menor densidad del gradiente está formada mayoritáriameníe por PBLs. Dicha fracción es recogida, lavada una vez con PBS y congelada a -80°C en un vial esíéril. A partir de estas células se extrae el RNA íoíal usando el reactivo Tri Reagení TM (Sigma), siguiendo las instrucciones del fabricante.
1.2 Amplificación del fragmento codificante del cDNA de CCR5:
1 μg del RNA obíenido se utiliza en una reacción de RT-PCR empleando el kií Tiían TM (Boehringer Mannheim), siguiendo las instrucciones del fabricante. Como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan 50 pmoles de cada uno de los dos oligonucleóíidos complemeníarios a las regiones codificantes del cDNA de CCR5 (Genebank, U54994) 5'-
CTCGAGGCCACCATGGATTATCAAGTGTCAAGTC-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-
TCTAGATCACAAGCCCACAGATATTTCCTGCTC-3' (SEQ ID NO: 2). Cada uno de esíos cebadores codifica en su extremo 5' una diana de restricción, de manera que el producío de la amplificación esíá flanqueado por una diana Xhol en el exíremo 5' y una
Xbal en el 3'. La reacción de PCR se lleva a cabo durante 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s, hibridación a 55°C duraníe 1 min y exíensión a
72°C duraníe 1 min, seguidos de una eíapa de exíensión a 72°C duraníe 5 min.
1.3 Clonación del fragmento codificante del cDNA de CCR5: 7 μl de la mezcla de PCR obíenida son ligados con 25 ng del plásmido linearizado pCR'-Bluní (Inviírogen), usando 0.5 U de T4 DNA ligasa (Boehringer Mannheim) en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7.8, conteniendo MgCl2 10 mM, DTT 10 mM y ATP 0.8 mM, en un volumen tolal de 10 μl de reacción, duraníe 12 h a 16°C. La mezcla de ligación se usa para transformar células E. coli TOP10 (Inviírogen) para obtener colonias resistenles a kanamicina. Dichas colonias son chequeadas para el producío de ligación deseado medianíe el aislamiento de los plásmidos recombinanles con un méíodo de "miniprep" (Sambrook, J., Frilsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboraíory), seguido de digestión con EcoRI y observación de los fragmentos de DNA resulíaníes en un gel de agarosa al 1% (w/v). La secuencia del inserto obtenido (SEQ ID NO: 3) se confima mediante secuenciación automática.
1.4 Clonación del fragmento codificante del cDNA de CCR5 en el vector de expresión pcDNA3.1/Hygro(+):
Uno de los plásmidos obíenidos aníeriormeníe que contienen el fragmento codificante del cDNA de CCR5 (SEQ ID NO: 3) es digerido con Xhol y Xbal. Los fragmentos de DNA resulíaníes se separan en un gel de agarosa al 1% (w/v) y el fragmento coníeniendo la secuencia de nucleóíidos SEQ ID NO. 3 es eluído utilizando el kií QIAEX II (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El fragmento de DNA obíenido (50 ng) es ligado con 50 ng de plásmido pcDNA3.1/Hygro(+) (Inviírogen) previameníe digerido con Xhol y Xbal y desfosforilado con fosfatasa alcalina. La reacción se lleva a cabo en las condiciones descritas anteriormente. La mezcla de ligación se usa para transformar células E. coli XL1 Blue (Stratagene) para obtener colonias resistentes a ampicilina. Dichas colonias son chequeadas para el producto de ligación deseado mediante el método ya descriío y la orieníación del inserto es determinada mediante secuenciación auíomáíica. En la Figura 1 se mueslra un esquema de la consírucción obíenida, denominada p3HCCR5. Ejemplo 2.- Diseño de una ribozima "hammerhead" anti-CCR5 (CR5Rib)
Para la predicción de la estracíura secundaria del mRNA susíraío (CCR5, Genebank U54994) se utiliza el programa de análisis Mfold (Zuker, M. (1989) Science 244:48-52) incluido en el paquele infonnáíico Wisconsin Package (GCG). Medíanle dicho programa se identificó una zona abierta no apareada de baja entalpia entre los nucleótidos 70 a 90 en la secuencia del mRNA sustralo (Figura 2). Eníre los tripletos GUC situados en dicha área se escoge el conespondieníe a los nucleólidos 74-76 como diana de corte de la ribozima. A continuación, se diseñan dos brazos que son el reverso complementario en 14 nucleótidos de las secuencias 5' y 3 ' adyancentes a dicho triplete diana. La secuencia de la región catalítica se obtiene del motivo canónico publicado (Forster, A.C. y Symmons, R.H. (1987) Cell 49:211-220). De esía forma, se obtiene una secuencia de RNA caíalííico a la que se denomina CR5Rib (SEQ ID NO: 4). La esírucíura teórica del complejo ribozima: susíraío se muesíra en la Figura 3.
Ejemplo 3.- Construcción de un plásmido de expresión eucariótico que codifica la ribozima CR5Rib 3.1 Síntesis de un fragmento de DNA que codifica la ribozima CR5Rib:
Se sintetizan dos oligonucleótidos (SEQ ID NOs. 5 y 6) complemeníarios de 55 pb que codifican la secuencia SEQ ID NO. 4 flanqueada por un adapíador para la diana EcoRI en el exíremo 5' y otro para la diana Xhol en el 3'. 100 ng de cada uno de estos oligonucleótidos se hibridan en 20 μl de agua destilada durante 3 min a 65°C, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente con el fin de obíener un DNA de doble hélice que codifica la ribozima CR5Rib. 3.2 Clonación de la ribozima CR5Rib en el vector de expresión pcDNA3:
100 ng del fragmenío de DNA obíenido en la eíapa de hibridación aníerior se usan en una reacción de ligación con 50 ng del plásmido pcDNA3 (Invitrogen) previameníe digerido con EcoRI y Xhol, en las condiciones descriías anteriormente. La mezcla de ligación se usa para íransfonnar células E. coli XL1 Blue (Síraíagene) para obíener colonias resisíeníes a ampicilina. La presencia del inserto en dichas colonias se determina medianíe la ausencia de digestión del plásmido recombinaníe con Noíl, cuya diana resulía destruida por el inserto. La secuencia del inserto obíenido es confirmada medianíe secuenciación auíomáíica. En la Figura 4 se muesíra un esquema de la construcción obtenida, denominada p3CR5Rib. Ejemplo 4.- Construcción de plásmidos de expresión eucarió ticos que codifican la ribozima CR5Rib bajo el control de promotores dependientes de RNA polimerasa III 4.1 Clonación del gen de fusión U6-CR5Rib:
De modo similar al descrito anteriormente, utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NOs. 7 y 8, se obtiene un fragmenío de DNA de doble hélice que codifica la ribozima CR5Rib, en esíe caso flanqueada por dos adapíadores para Xhol. 100 ng de dicho fragmenío se utilizan en una reacción de ligación con 50 ng del plásmido dl- 328/maxiU6 (Kunkel, G.R. y Pederson, T. (1988) Gene Develop. 2:196-204) que
coníiene el gen U6, previamente digerido con Xhol. La reacción se lleva a cabo en las condiciones ya descriías. La mezcla de ligación se usa para transformar células E. coli XLl Blue (Straíagene) para oblener colonias resisíeníes a ampicilma. La presencia del inserto en dichas colonias se deíennina medianíe secuenciación auíomáíica. La secuencia del gen de fusión obíenido se describe en SΕQ ID NO. 9. 4.2 Clonación del gen de fusión VAl-CR5Rib:
De modo similar al descrito aníeriormeníe, utilizando los oligonucleóíidos SΕQ ID NOs. 10 y 6, se obtiene un fragmento de DNA de doble hélice que codifica la ribozima CR5Rib, en esíe caso flanqueada por un adapíador para BamHI en el extremo 5' y otro para Xhol en el 3'. 100 ng de dicho fragmenío se uíilizan en una reacción de ligación con 50 ng del plásmido pSM620/Ad-VAl (Sysíemix) que coníiene el gen adenoviral VA-1, previameníe digerido con Bam HI y Xhol y purificado medianíe electroforesis según proíocolo descrito aníeriormeníe. La reacción se lleva a cabo en las condiciones ya descriías. La mezcla de ligación se usa para transformar células E. coli XLl Blue (Stratagene) para obíener colonias resisíeníes a ampicilina. La presencia del inserto en dichas colonias se determina medianíe secuenciación auíomáíica. La secuencia del gen de fusión obíenido se describe en SΕQ ID NO. 11. Ejemplo 5.- Construcción de un vector retroviral que codifica la ribozima CR5Rib 100 ng del fragmento de DNA obtenido en el Ejemplo 3.1 se utilizan en una reacción de ligación con 50 ng de plásmido pCLXSN (Naviaux, R.K. y col (1996) J. Virol. 70:5701-5705) digerido con EcoRI y Xhol y purificado mediante elecíroforesis según proíocolo descrito aníeriormeníe. La reacción se lleva a cabo en las condiciones ya descriías. La mezcla de ligación se usa para transformar células E. coli XLl Blue (Stratagene) para obtener colonias resisteníes a ampicilina. La presencia del inserto en dichas colonias se determina mediante secuenciación automática. La construcción obtenida, denominada pCLCR5Rib, se esquematiza en la Figura 5.
Ejemplo 6.- Clonación de una ribozima multicatalítica anti-CCR5 (CR5polRibll)
6.1 Síntesis de concatémeros que codifican múltiples unidades funcionales consecutivas de la ribozima CR5Rib:
Se sintetiza un oligonucleóíido con la secuencia 5'- GACATGAATTGATCAAGT-3 ' (SEQ ID NO: 12) cuya miíad 3' híbrida con la región 3' del oligonucleóíido SEQ ID NO. 5. 100 pmoles de cada uno de dichos oligonucleóíidos se uíilizan en 50 μl de una reacción de PCR coníeniendo los reacíivos del kií Expand (Boehringer Mannheim) en las caníidades indicadas por el fabricante. Tras una desnaíuralización inicial a 94°C duraníe 2 min se realizan 30 ciclos de hibridación a 40°C durante 1 min, exíensión a 69°C duraníe 3 min y desnaturalización a 94°C durante 30 s.
6.2 Clonación de los concatémeros:
Los fragmentos resulíaníes de DNA de más de 400 pb se aislan de geles de agarosa medianíe el procedimienío descrito aníeriormeníe. A continuación se hacen romos los extremos de dichos fragmentos, medianíe la incubación a 37°C durante 1 h con 1 U de T4 DNA polimerasa en el tampón de reacción conespondieníe (Sambrook, J., Friísch, E.F. y Maniaíis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboraíory). Esíos fragmentos son clonados en el plásmido pCR'-Bluní (Invilrogen) en las condiciones descritas anteriormente. Las colonias obtenidas son chequeadas para el producto de ligación deseado mediante digesíión de los plásmidos recombinaníes con EcoRI y observación de los fragmentos de DNA resulíaníes en un gel de agarosa al 1% (w/v). Los clones recombinaníes que contienen los fragmentos de mayor íamaño se secuencian. Un fragmenío de DNA de esíe íipo que codifica 11 unidades funcionales de la ribozima CR5Rib, denominado CR5Ribxl 1, se muesíra en la SEQ ID NO: 13.
Ejemplo 7.- Construcción de un plásmido de expresión eucariótico que codifica la ribozima multicatalítica CR5polRibll
El plásmido recombinante descrito en el Ejemplo 6.2 es digerido con EcoRI y el fragmenío de DNA que coníiene la secuencia SEQ ID NO. 13 es aislado medianíe el procedimiento ya descrito. 100 ng de dicho fragmento se uíilizan en una reacción de ligación con 50 ng del plásmido pcDNA3 previameníe digerido con EcoRI y desfosforilado con fosfaíasa alcalina. La reacción se lleva a cabo en las condiciones ya descriías. La mezcla de ligación se usa para transformar células E. coli XLl Blue (Straíagene) para oblener colonias resisíeníes a ampicilma. La presencia del inserto en dichas colonias se deíermina medianíe la digestión de los plásmidos recombinaníes con EcoRI, y su orienlación medianíe secuenciación auíomáíica. La construcción obtenida, denominada p3CR5Ribxl 1, aparece esquematizada en la Figura 6. Ejemplo 8.- Construcción de un vector retroviral que codifica la ribozima multicatalítica CR5polRibll El plásmido recombinante descrito en el Ejemplo 6.2 es digerido con EcoRI y el fragmenío de DNA que coníiene la secuencia SEQ ID NO. 13 es aislado medianíe el procedimiento ya descrito. 100 ng de dicho fragmenío se uíilizan en una reacción de ligación con 50 ng del plásmido pCLXSN previameníe digerido con EcoRI y desfosforilado con fosfaíasa alcalina. La reacción se lleva a cabo en las condiciones ya descriías. La mezcla de ligación se usa para íransformar células E. coli XLl Blue (Síraíagene) para obíener colonias resisíeníes a ampicilma. La presencia del inserto en dichas colonias se determina mediante la digestión de los plásmidos recombinaníes con EcoRI, y su orientación mediante secuenciación automática. La construcción obtenida, denominada pCLCR5Ribxl 1, aparece esquematizada en la Figura 7. Ejemplo 9.- Clonación de un gen que codifica los aminoácidos 1-184 de CCR5 fusionados al tetrapéptido KDEL (CCR5(1-184)-KDEL)
5 ng del plásmido descrito en el Ejemplo 1.4 se usan como molde en una PCR en 50 μl de una mezcla de reacción conteniendo 50 pmoles de los oligonucleóíidos
cebadores 5'-GCCACCATGGATTATCAAGTGTCAAGCCCAATC-3' (SEQ ID NO: 17) y 5'-TTAGAGTTCGTCCTTGTATGGAAAATGAGAGC-3' (SEQ ID NO: 18), 4 μl de mezcla de dNTPs (N = A, C, G, T) 2,5 mM, 5 μl de lampón 10X de Taq DNA polimerasa (Boehringer Mannheim) y 2,5 U de Taq DNA polimerasa (Boheringer Mannheim). Esta última se añade iras una desnaíuralización inicial a 94°C durante 2 min. A continuación se realizan 25 ciclos de hibridación-extensión durante 1 min a 68°C y desnaturalización durante 30 s a 94°C. El fragmento de DNA obtenido (SEQ ID NO: 19) es clonado en el vector pCR'-Blunt (Inviírogen) de la forma descriía en el Ejemplo 1.3 y codifica los aminoácidos 1-184 de CCR5 seguidos del teírapépíido KDEL (SEQ ID NO 16) que funciona como una señal de relención en retículo endoplásmico.
Ejemplo 10.- Clonación de un gen que codifica los aminoácidos 1-100 de CCR5 fusionados al tetrapéptido KDEL (CCR5(1-100)-KDEL)
Se lleva a cabo a partir de forma similar a la descrita en el Ejemplo 9, pero utilizando como cebador 3' en la reacción de PCR el oligonucleótido 5'- TCAGAGTTCGTCCTTCATTGTATTTCCAAAG (SEQ ID NO: 20). La secuencia obtenida se muesíra en SEQ ID NO. 21.
Ejemplo 11.- Construcción de un plásmido de expresión eucariótico que codifica el polipéptido CCR5(1-184)-KDEL Se lleva a cabo mediante un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 7, pero utilizando como inserto el fragmento que codifica la secuencia SEQ ID NO. 19, obtenido por digestión con EcoRI del plásmido recombinaníe descrito en Ejemplo 12. La construcción obtenida, denominada p3CCR5/4TM-KDEL, aparece esquematizada en la Figura 8. Ejemplo 12.- Construcción de un vector retroviral que codifica el polipéptido CCR5(1-184)-KDEL
Se lleva a cabo mediante un procedimienío similar al descrito en el Ejemplo 8, pero utilizando como inserto el fragmento de DNA que codifica la secuencia SEQ ID
NO. 19, obíenido por digestión con EcoRI del plásmido recombinaníe descriío en Ejemplo 9. La construcción obtenida, denominada pCLCCR5/4TM-KDEL, aparece esquematizada en la Figura 9.
Ejemplo 13.- Construcción de un plásmido de expresión eucariótico que codifica el polipéptido RANTES-CCR5(25-184)-KDEL
13.1 Clonación de un fragmento de DNA que codifica la quimioquina RANTES:
5 ng de un plásmido que contiene el cDNA de RANTES (Schall, T.J. y col. (1988) J. Immunol 141:1018-1025) se usan como molde en una PCR en condiciones similares a las descriías en el Ejemplo 9, pero utilizando como cebadores los oligonucleóíidos 5'-GGATCCGCCACCATGAAGGTCTCCGCGGCAGCC (SEQ ID NO: 22), y 5'-GAATTCAGATCCGCCACCTCCGCTCATCTCCAAAGAGTTGAT-3 (SEQ ID NO: 23). Esíe último codifica en su región 3' el pépíido flexible GGGGS (SEQ ID NO: 15). El fragmenío de DNA obíenido (SEQ ID NO: 24) es clonado en el vector pCR'-Blunt (Invitrogen) de la forma descrita en el Ejemplo 1.3. 13.2 Clonación del gen de fusión CCR5(25-184)-KDEL:
5 ng del plásmido descrito en el Ejemplo 1.4 se usan como molde en una PCR en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 9, utilizando como cebadores los oligonucleóíidos 5'-GAATTCGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTG-3' (SEQ ID NO: 25) y 5'-TTAGAGTTCGTCCTTGTATGGAAAATGAGAGC-3' (SEQ ID NO: 18). El fragmenío de DNA obíenido (SEQ ID NO: 26), que codifica los residuos 25 a 184 de CCR5, seguidos del íeírapépíido KDEL, es clonado en el vecíor pCR'- Bluní (Inviírogen) de la forma descriía en el Ejemplo 1.3.
13.3 Construcción del gen de fusión RANTES-GGGGS-CCR5(25-184)-KDEL en pcDNA3 La secuencia SEQ ID NO. 24 es exíraída del plásmido descriío en el Ejemplo
13.1 medianíe digestión con BamHI y EcoRI, y ligada con el plásmido pcDNA3 digerido con las mismas enzimas y desfosforilado. El plásmido de expresión resulíaníe se denomina p3RT.
Por olra parte, la secuencia SEQ ID NO. 26 es exíraída del plásmido descriío en Ejemplo 13.2 medianíe digestión con EcoRI, e insertada en el plásmido p3RT digerido con dicha enzima y desfosforilado. El plásmido de expresión resultaníe codifica la secuencia RANTES-GGGGS-CCR5(25-184)-KDEL (SEQ ID NO: 27). Un esquema de la consírucción obtenida, denominada p3RT-CCR5/4TM-KDEL aparece en la Figura 10.
Ejemplo 14.- Construcción de un vector retroviral que codifica el polipéptido RANTES-CCR5(25-184)-KDEL
La construcción descriía en el Ejemplo 13.3 es digerida con BamHI y Xhol, y el fragmenío de DNA que coníiene la secuencia SEQ ID NO. 27 se purifica en un gel de agarosa según el procedimiento ya descriío. Esíe fragmenío se incuba con T4 DNA polimerasa y se liga al plásmido pCLXSN previameníe digerido con EcoRI, íraíado con T4 DNA polimerasa y fosfaíasa alcalina. Todas las reacciones se llevan a cabo en las condiciones ya descriías aníeriormeníe. La orieníación del inserto obíenido se determina medianíe secuenciación áulomáíica. Un esquema de la consíracción obtenida, denominada pCLRT-CCR5/4TM-KDEL aparece en la Figura 11. Ejemplo 15.- Construcción de un plásmido de expresión eucariótico que contiene el gen de fusión RANTES-KDEL-CR5Rib 15.1 Clonación del gen que codifica la quimioquina intracelular RANTES-KDEL: 5 ng de un plásmido que contiene el cDNA de RANTES (Schall, T.J. y col.
(1988) J. Immunol 141:1018-1025) se usan como molde en una PCR en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 13.1, utilizando como cebadores los oligonucleóíidos 5'-GGATCCGCCACCATGAAGGTCTCCGCGGCAGCC-3' (SEQ ID NO: 22), y GTCGACTTAGAGTTCGTCCTTGCTCATCTCCAAAGAGTTGAT (SEQ ID NO: 28). El fragmenío de DNA obíenido (SEQ ID NO: 29) es clonado en el vecíor pCR'-Bhmí (Invilrogen) de la forma descrita en el Ejemplo 1.3.
15.2 Clonación del gen de fusión RANTES-KDEL-CR5Rib en el plásmido pcDNA3:
El plásmido recombinanle obíenido es digerido con EcoRI, y el fragmenío de DNA que coníiene la secuencia SEQ ID NO. 29 se purifica en un gel de agarosa según el procedimiento ya descriío. Esíe fragmenío se inserta en el plásmido pcDNA3 previameníe digerido con EcoRI y íratado con fosfatasa alcalina. La orieníación del inserto obíenido se deíermina medianíe secuenciación auíomáíica. A continuación, el plásmido obíenido se digiere con Salí y se liga con el fragmenío de DNA obíenido por hibridación de los oligonucleóíidos SEQ ID NO. 7 y 8 (Ejemplo 4.1). Todas las reacciones se llevan a cabo en las condiciones ya descriías aníeriormeníe. Un esquema de la construcción obtenida, denominada p3RT-KDEL-CR5Rib, se muesíra en la Figura. 12 coníiene una secuencia que codifica la proíeina RANTES-KDEL y la ribozima CR5Rib (SEQ ID NO 30). Ejemplo 16.- Construcción de un vector retroviral que contiene el gen de fusión RANTES-KDEL-CR5Rib
Se lleva a cabo mediante un procedimiento similar al descriío en el Ejemplo 15.2, pero utilizando el vecíor pCLXSN en lugar de pcDNA3. Un esquema de la consírucción obíenida, denominada pCLRT-KDEL-CR5Rib, se mueslra en la Figura 13. Ejemplo 17.- Obtención de un anticuerpo policlonal específico contra la proteína humana CCR5
Para obtener un anticuerpo policlonal capaz de reconocer al recepíor CCR5 en la superficie celular, se inmunizan conejos con una pépíido siníéíico que conesponde a los residuos 6-20 de dicha proíeína (SEQ ID NO: 14). 100 μg de dicho pépíido se emulsionan con 0.5 mi de Adyuvante Incompleto de Freund (Sigma) y se inyecían en el muslo de un conejo. Esíe mismo procedimiento se repiíe 14 días después en el oíro muslo. Se sangra al animal 10 días más farde y se comprueba la especifidad del suero comparándolo con suero recogido aníes de la inmunización. Esía comparación se
realiza mediante citomeíría de flujo, como se describe en el Ejemplo 18. Si se encuentra un título de anticuerpo insuficiente se repiíe la inmunización 2-3 meses después mediante inyección seriada en 6-8 sitios difereníes. Ejemplo 18.- Medida de los niveles de CCR5 en la superficie celular: Las células cuyos niveles de expresión de CCR5 en superficie se han valorado se recogen en una placa de 96 pocilios con fondo en uve (Nunc) y se incuban a 4°C duraníe 20 min con 30 μl de la dilución apropiada del suero policlonal, descriío en el Ejemplo 17, en lampón de bloqueo (PBS con albúmina de suero bovino al 0.5%). A coníinuación, la placa se centrifuga y el sedimento celular se lava con tampón de bloqueo. Las células son después resuspendidas e incubadas en las mismas condiciones que las descriías anteriormente con 30 μl de la dilución apropiada de un anticuerpo comercial aníi-IgG de conejo conjugado con fluoresceína (Amersham). Tras lavarse de nuevo con lampón de bloqueo, la inmunofluorescencia de las células es valorada en un ciíómetro de flujo modelo Epics' XL (Coulter). Ejemplo 19.- Producción de líneas celulares empaquetadoras de retrovirus que codifican productos génicos inhibidores de la expresión de CCR5 19.1 Transfección de las células:
Se crecen células FLYA13 (Cosset, F.-L. y col. (1995) J. Virol. 69:7430-7436) en placas de cultivo de 6 cm (Nunc) con medio DMEM (GibcoBRL) conteniendo un 1% de glucosa, 10% de suero fetal bovino, penicilina 100 U/ml, esírepíomicina 100 mg/ml y fungizona 0.25 mg/ml (DMEM completo), a 37°C en incubador de CO2.
Cuando se alcanza una confluencia celular del 50%, el medio es reemplazado por DMEM sin suero ni antibióticos y las células son transfectadas con 2 μg del plásmido que codifica el vecíor reíroviral que se quiere producir (Ejemplos 5, 8, 12, y 16),
TM utilizando el reactivo LIPOFECTAMINE PLUSi (GibcoBRL) según las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, el medio es reemplazado por
DMEM compleío, y las células se crecen duraníe 24 h en las condiciones descriías aníeriormeníe.
19.2 Selección de transfectantes estables:
Las células transfecíadas con vecíores retrovirales son cultivadas en presencia de 800 μg/ml de geneticina (G418, GibcoBRL) en las condiciones anterionneníe descriías. El medio se reemplaza por medio fresco coníeniendo la misma cantidad de antibiótico cada dos días, y la mortalidad celular se observa al microscopio, comparándola con la que se produce en un cultivo conírol de células no transfecíadas. Cuando en el cultivo de las células íransfecíadas y seleccionadas deja de observarse mortalidad celular (7-10 días), las células supervivientes se recogen y se llevan a dilución límiíe (0.5 células/pocilio) en placas de 96 pocilios (Nunc). Cada clon obíenido se siembra por separado en placas de cultivo de 24 pocilios (Nunc) y se crecen, en las condiciones descriías aníeriormeníe y siempre en presencia del antibiótico de selección, hasta una confluencia celular del 70%. Se reemplaza el medio por medio fresco, y tras 48 h de incubación en las condiciones descritas se recogen los sobrenadantes de cultivo y se procede a la tiíulación del viras. 19.3 Titulación del retrovirus en los sobrenadantes de cultivo:
Se siembran 10 células NIH 3T3 en placas de cultivo de 6 pocilios (Nunc) y se crecen durante 24 h en las condiciones aníeriormeníe descriías. A continuación, se reíira el medio y se reemplaza por diversas diluciones (una dilución disíinía en cada pocilio) de los sobrenadaníes de culíivo filtrados de los clones de FLYA13 transfecíados y seleccionados. Las células NIH 3T3 son incubadas durante 24 h, en las condiciones habituales, con las disíinías diluciones de sobrenadaníe viral en presencia de polibreno (Sigma) 4 μg/ml, y a coníinuación se reemplaza el medio por medio fresco coníeniendo el antibiótico de selección. Se continúa el culíivo en las condiciones habiíuales, cambiando el medio cada dos días hasía que deja de observarse mortalidad celular (7-10 días). Eníonces se reíira el medio y se procede a íeñir los clones supervivientes con violeta crisíal 0.5% en PBS coníeniendo un 20% de meíanol, duraníe 15 min a íemperaíura ambienle. Tras lavarse los pocilios se procede a la observación de las
colonias. El título del virus conesponde a la inversa de la máxima dilución tesíada en la que se observen colonias.
Ejemplo 20.- Obtención de una línea celular humana infectable por cepas M- trópicas de VIH-1 20.1 Transfección de las células:
Se crecen células HeLa T+ (Maddon, P.J. y col. (1986) Cell 47:333-348) en placas de cultivo de 6 cm (Nunc) en las condiciones descritas anteriormeníe. Cuando se alcanza una confluencia celular del 50%, el medio es reemplazado por DMEM sin suero ni antibióticos y las células son íransfecíadas con 2 μg del plásmido de expresión de CCR5 descrito en el Ejemplo 1.4, utilizando el reactivo LIPOFECTAMINA PLUS (GibcoBRL) según las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, el medio es reemplazado por DMEM completo, y las células se crecen duraníe 24 h en las condiciones descriías anteriormente. 20.2 Selección de transfectantes estables: La selección de las células transducidas de forma estable se realiza de forma similar a la descrita en el Ejemplo 19.2, utilizando como antibiótico de selección higromicina a 200 μg/ml. Los clones obtenidos se crecen por separado según el procedimienío descrito en el Ejemplo 19.2 y se miden en cada uno de ellos los niveles de expresión de CCR5 en superficie de la forma descriía en el Ejemplo 18. Para los experimentos de inmunización intracelular coníra VEH-l se seleccionarán prefereníemeníe los clones que mueslren unos niveles de CCR5 en superficie similares a los de PBLs humanos.
Ejemplo 21.- Transducción de células infectables por cepas M-trópicas de VIH-1 con retrovirus que codifican productos génicos inhibidores de la expresión de CCR5
Se siembran al 100%) de confluencia las líneas celulares empaquetadoras que producen los vectores retrovirales descriíos aníeriormeníe (Ejemplo 19) y se cultivan durante 24 h a 37°C en incubador de CO2- A continuación se centrifugan los
sobrenadantes a 600 g durante 10 min y se descartan los sedimentos celulares. Se realiza la íransducción reíroviral culíivando 10 células diana por cada mi de sobrenadaníe obíenido, en presencia de 4 μg/ml de polibreno. Tras 24 h de culíivo en esías condiciones, las células se lavan con PBS y se cultivan en medio de íransducción sin polibreno y conteniendo la concenlración adecuada de aníibióíico de selección duraníe 7 días, iras los cuales se analiza el efecío expresión del gen íransducido. Ejemplo 22.- Ensayo de cotransfección de células 293
Se siembran células 293 (Graham, F.L. y col. (1977) J. Gen. Virol 36:59-74) a una densidad de 2 x 10 células/pocilio en placas de 12 pocilios (Nunc) y se incuban en DMEM (GibcoBRL) completo en las condiciones ya descritas. Tras 24 h, el medio es sustiíuido por DMEM sin suero ni antibióticos y las células se transfectan, en difereníes pocilios, por el méíodo ya descriío con un plásmido irrelevaníe, con un vecíor de expresión eucarióíica que codifique CCR5 (Ejemplo 1), o con éste último más un vecíor de expresión que coníenga un gen poíencialmeníe íerapéuíico (Ejemplos 3, 4, 7, 11, 13 y 15 ). Tras la íransfección, el medio se reemplaza por DMEM compleío y las células se crecen duraníe 24 h en las condiciones habiíuales. En ese momento, se miden los niveles de CCR5 en la superficie de las células íransfecíadas, según el méíodo descriío en el Ejemplo 18. El poíencial íerapéuíico de las dislinías construcciones puede considerarse directamente proporcional a la disminución de la expresión de CCR5 medida en las células coíransfectadas respecto a la de las células íransfecíadas sólo con el vecíor de expresión de CCR5. En la Figura 14 se muesíran los resulíados de un ensayo de esíe íipo en el que se mide la inhibición de la expresión de CCR5 producida por la coíransfección con la consíracción p3CCR5/4TM-KDEL (Ejemplo 11). Ejemplo 23.- Ensayo de formación de sincitios En este ensayo se mide la capacidad de formación de sincitios por fusión celular en cocultivos de células que expresan CD4 y CCR5 (células diana) con células que expresan la proíeína de la envuelía de cepas macrofagoírópicas de VIH-1 (células efecíoras). La cuaníificación del número de sincilios formados permite valorar la
susceptibilidad de las células diana a ser infecíadas por dichas cepas. De esta forma, el ensayo de fusión permite evaluar el efecto íerapéuíico de proíección frente a infección por VrH-1 de los vecíores reírovirales descritos anteriormente transfectados sobre las células diana. La forma más precisa de cuaníificar el número de sinciíios formados es medianíe la expresión del gen reportero de luciferasa. Esto se consigue introduciendo en las células diana un vector de expresión de la luciferasa bajo el control de una RNA polimerasa procariola, que es aportada en trans por las células que expresan la envuelía de VIH-1, de forma que la luciferasa sólo se expresa en los sinciíios. Para el ensayo de fusión se uíilizan los siguieníes vecíores de expresión de vaccinia de la proíeina de la envuelía gpl60: vSC60 (IIIB, clon BH8, linfociíotrópico), vCB39 (ADA, macrofagoírópico), vCB28 (JR-FL, macrofagoírópico) y vCB16 (BH8 no fusogénico). Asimismo es necesario vTFl.l, un vecíor de vaccinia que codifica la RNA polimerasa del bacteriófago T7. Los genes de la proíeína de la envuelía de las difereníes cepas de VIH-1, junio con el de la RNA polimerasa de T7, se iníroducen en células efecloras HeLa, mediante infección con los viras de vaccinia recombinantes que codifican cada una de de dichas proteínas.
10 células diana (Ejemplo 20) se transfectan, en placas de 12 pocilios, con el plásmido pGEM-luc (Promega) por el procedimiento ya descriío. En oíra placa similar, 10 HeLa efecíoras se infecían duraníe 4 h con sobrenadanles de cada uno de los vecíores de vaccinia que codifican las envueltas de difereníe íropismo, las envuellas conírol y la RNA polimerasa de T7. A continuación se despegan las células efecíoras y se plaquean 10 de dichas células sobre las células diana para permitir el desanollo de la fusión de membranas. Después de un coculíivo de 12 h se cuaníifica visualmeníe al microscopio el número de sinciíios, se lisan las células en 50 μl de lampón de lisis para luciferasa (Promega) y se ensaya la actividad luciferasa según protocolo del fabricante (Promega).
Ejemplo 24.- Ensayo de infección de células humanas con VIH-1
Las cepas de VIH-1 se inoculan a una multiplicidad de infección de 0.05 en linfocitos estimulados dos días antes con PHA 5 μg/ml e IL-2 humana 50 U/ml y crecidos en medio RPMI (GibcoBRL) suplementado con 10% suero feíal de ternera. A los 7 días se moniíoriza la infección siguiendo el efecío ciíopáíico caracíerísíico del virus y se recogen los sobrenadaníes retrovirales centrifugando a 600 g durante 10 min. El título vírico se estima a partir de los niveles de la proíeína de la capside p24 présenles en el sobrenadante medidos mediante ELISA (Culter) usando la formula 2 μg de p24 = 10 viriones. A continuación se infectan las células diana utilizando 2-10 ng de p24/2xl05 células (multiplicidad de infección de 0.01-0.05).
Ejemplo 25.- Transducción de PBLs humanos con vectores retrovirales
25.1 Cultivo de PBLs humanos:
Se obtiene sangre de un donante sano y se realiza separación en gradiente de
(íδ densidad 1,077 gr/1 en Ficoll-Paque (Pharmacia Bioíech) centrifugando a 800 g duraníe 45 min. La fracción de menor densidad del gradiente (células mononucleadas, mayoritariameníe PBLs) se siembra en un frasco de culíivo íraíado previameníe con anli-CD3 (3 μg/ml en PBS) durante 24 h. Las células se siembran a una conceníración de 5x10 células/ml en medio RPMI (GibcoBRL) con 10% de suero feíal de ternera. Tras 24 h se lavan las células con PBS y se cultivan en el mismo medio al que se ha añadido 50 U/ml de IL-2 humana. En esíe medio, que llamaremos medio de transducción, se realizan iodos los ensayos posíeriores.
25.2 Infección de los PBLs con sobrenadantes virales:
Se siembran al 100% de confluencia en placas de 6 cm las células empaquetadoras que producen los vectores retrovirales descritos aníeriormeníe (Ejemplo 19) y se cultivan durante 24 h a 37°C en incubador de CO2- A continuación se centrifugan los sobrenadaníes a 600 g duraníe 10 min y se descartan los sedimentos celulares. Se realiza la transduccion reíroviral cultivando 10 PBLs estimulados con IL- 2 por cada mi de sobrenadaníe obíenido, en presencia de 4 μg/ml de polibreno. Tras 24
h de culíivo en las condiciones anteriores se lavan las células con PBS y se cultivan en medio de fransducción sin polibreno durante 7 días. En ese momento, las células pueden analizarse para evaluar el efeclo de los genes inhibidores sobre la expresión de CCR5 medianíe la medida de los niveles de expresión de CCR5 por ciíometria de flujo según el procedimienío descriío en el Ejemplo 18, o bien írasplaníarse a ratones NOD/Scid (Ejemplo 27).
Ejemplo 26.- Transducción de progenitores hematopoiéticos humanos con vectores retrovirales
Se parte de cualquiera de las siguientes fuentes de progeniíores hemaíopoyéíicos: sangre de cordón umbilical de recién nacido; médula ósea de adulío o progeniíores movilizados en sangre periférica de adulío iras íratamienío con 10 mg/kg/día de G-CSF durante cinco días. Una vez obtenido el íejido conespondiente, se lleva a cabo la purificación de las células CD34 . Para ello, primero se obtiene una fracción mononuclear medianíe centrifugación en gradiente de densidad como se describe aníeriormeníe. Posteriormente, las células así obíenidas se incuban con bolas magnéticas recubiertas de anticuerpo aníi-CD34 y se obtiene la fracción que expresa dicho aníígeno siguiendo las instrucciones y el separador magnético (Milíenyi Bioíech). 10 células así oblenidas se cultivan en 5 mi de medio IMDM (GibcoBRL) con 10%o de suero feíal de ternera más 10 U/ml de IL-3 humana, 50 U/ml de SCF humano y 10 U/ml de IL-6 humana. En esías condiciones se produce una diferenciación hacia células de estirpe granulo-macrofágica que expresan CCR5. Se obtienen sobrenadantes retrovirales terapéuticos según el proíocolo descriío anteriormente, con la particularidad de que el medio de transducción en esle caso es el mismo que el utilizado para el culíivo de las células CD34 y se realiza la íransducción de dichas células siguiendo el proíocolo ya descrito. Las células transducidas pueden analizarse para el efecto de los genes inhibidores sobre la expresión de CCR5 mediante la medida de los niveles de expresión de CCR5 por citometria de flujo según el procedimienío descriío en el Ejemplo 18, o bien trasplantarse a ratones NOD/Scid (Ejemplo 28).
Ejemplo 27.- Modelo animal de terapia génica en ratones NOD/Scid trasplantados con PBLs humanos transducidos con vectores retrovirales terapéuticos
7 10 linfocitos humanos normales o transducidos con un retroviras íerapéuíico
(Ejemplo 25) se inyecían iníraperiíonealmeníe en un ratón NOD LtSz/Scid-Scid. Se permite que duraníe 2 semanas esíos linfociíos se expandan en el perifoneo del recepíor.
A continuación se inyecía VEH-1 de la cepa macrofagoírópica Ada-M, calculando una multiplicidad de infección de 0.05. Se permite que la infección continúe durante una semana más y se sacrifican los animales. Se realiza lavado periíoneal medianíe inyección y posterior aspiración con 10 mi de PBS. A continuación se calcula el número de copias de VIH-1 présenle en el lavado medianíe PCR cuaníitativa para RNA, según protocolo del fabricante del kit (Quaníiplex HIV RNA, Chiron). Asimismo se valora la proíección ofrecida a los linfocilos transducidos mediante cuantificación de la depleción de células CD4 . Para ello se mide el número absoluto de dichas células medíanle ciíometría de flujo con anti-CD4 marcado con FITC según las instrucciones del fabricante (Beckton -Dikinson).
Ejemplo 28.- Modelo animal de terapia génica en ratones NOD/Scid trasplantados con progenitores hematopoyéticos humanos transducidos con vectores retrovirales terapéuticos
Células humanas CD34 transducidas con retrovirus terapéuticos según el proíocolo descrito aníeriormeníe (Ejemplo 26) son inyecíadas por vía intravenosa a ratones NOD LtSz/ Scid-Scid previamente inadiados con 2.5 Gy en inadiador de Cs 137
(1700 Ci de acíividad) (10 células/raíón). Un mes postrasplante se realiza biopsia de
+ médula osea para cuaníificar el porcentaje de células CD4 humanas presentes y se inyecta por via intravenosa (i.v.) VIH-1 de la cepa Ada-M a una multiplicidad de infección de 0.05. A los 15 días de la inyección del virus se realiza una nueva biopsia de medula ósea para cuantificar la depleción de células humanas CD4 en comparación con los animales control. Asimismo se lleva a cabo la cuantificación de los niveles de
viremia medianíe RT-PCR cuaníiíaíiva en suero oblenido de la medula ósea según el proíocolo descrito por el fabricante del kií (Quaníiplex HIV RNA, Chiron). Ejemplo 29.- Terapia génica en pacientes seropositivos para VIH-1 mediante trasplante de linfocitos transducidos ex vivo con vectores retrovirales terapéuticos Si los modelos animales demuestran la eficacia y seguridad de los vecíores reírovirales íerapeúíicos aníeriormeníe descritos, se procedería a realizar un ensayo clínico en pacieníes. Los pacienles seleccionados serían prefereníemeníe individuos seroposiíivos asiníomáíicos en los esíadios íempranos de la infección, ya que es en esía eíapa en la que predominan las cepas del virus que uíilizan a CCR5 como correcepíor. El objeíivo de la íerapia es que las células CD4 íransducidas con el reíroviras íerapéuíico, resisíeníes a la infección por dichas cepas, proliferen lo suficiente como para susíeníar una respuesía inmune capaz de eliminar al virus del organismo o, cuando menos, reírasar el desanollo del síndrome de inmunodeficiencia.
Se realiza linfociíoféresis del pacieníe seroposiíivo medianíe el procesamienío de su sangre (dos veces su volumen íoíal) en una máquina de ciíoféresis (Haemoneíics 3000) según instrucciones del fabricante. Las aféresis se repiíen hasía obtener una cifra de linfociíos próxima a 10 células, las cuales a coníinuación son esíimuladas siguiendo un proíocolo similar al aníeriormeníe descriío (Ejemplo 25) pero añadiendo al medio de íransducción 5 μM de Delavirdine, para inhibir la replicación del VIH-1. A continuación se realiza la transducción retroviral utilizando los protocolos descritos aníeriormeníe, se lavan los linfociíos en suero salino isoíónico y se infunden en el donaníe por vía iníravenosa (i.v.).
Ejemplo 30.- Terapia génica en pacientes seropositivos para VIH-1 mediante trasplante de progenitores hematopoyéticos transducidos ex vivo con vectores retrovirales terapéuticos
El criterio de selección de pacieníes sería el mismo que en el Ejemplo 29. En esíe caso se espera que los progeniíores hemaíopoyéíicos íransducidos, incluso aunque la eficiencia de dicha íransducción fuera mínima, puedan regenerar una población
compleía de células CD4 resisíeníes a la infección por las cepas M-trópicas del VIH-1 preseníes en esíos pacieníes.
Se obtienen las células CD34 de donaníe seroposiíivo neonaío o adulío, se estimulan y se íransducen según el proíocolo descriío aníeriormeníe (Ejemplo 26). Posteriomeníe, las células íranducidas se lavan en suero salino isolónico y se infunden en el donaníe por vía iníravenosa (i.v.).