WO2004011675A2 - Nuevas variantes alelicas en el gen del factor vii - Google Patents

Nuevas variantes alelicas en el gen del factor vii Download PDF

Info

Publication number
WO2004011675A2
WO2004011675A2 PCT/ES2003/000379 ES0300379W WO2004011675A2 WO 2004011675 A2 WO2004011675 A2 WO 2004011675A2 ES 0300379 W ES0300379 W ES 0300379W WO 2004011675 A2 WO2004011675 A2 WO 2004011675A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
allelic
factor vii
allelic variants
Prior art date
Application number
PCT/ES2003/000379
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004011675A3 (es
Inventor
Jordi Fontcuberta Boj
Jose Manuel Soria Fernandez
Original Assignee
Fundacio Privada I Institut De Recerca De L'hospital De La Santa Creu I Sant Pau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundacio Privada I Institut De Recerca De L'hospital De La Santa Creu I Sant Pau filed Critical Fundacio Privada I Institut De Recerca De L'hospital De La Santa Creu I Sant Pau
Priority to EP03771120A priority Critical patent/EP1538220A2/en
Priority to US10/522,070 priority patent/US20060252039A1/en
Priority to AU2003258721A priority patent/AU2003258721A1/en
Publication of WO2004011675A2 publication Critical patent/WO2004011675A2/es
Publication of WO2004011675A3 publication Critical patent/WO2004011675A3/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to the field of cardiovascular diseases.
  • the present invention relates to the identification of new allelic variants in the sequence of the factor VII gene to determine the predisposition to cardiovascular disease.
  • Factor VII is a vitamin K-dependent glycoprotein synthesized in the liver and is secreted in the blood as an inactive oxygen zi at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml 2 (Fair Blood, 1983). After endothelial damage, tissue factor (TF) is exposed and binds to factor VII, activating the coagulation cascade. (Osterud. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1977; Bauer et al., Blood, 1990).
  • the gene that encodes factor VII is located in 13q34-q.ter (Pfeiffer et al., 1982; Gilgen rantz et al, 1986), contains 9 exons and 8 introns of 12.8 Kb and encodes for a protein of 406 amino acids .
  • the complete gene sequence for human factor VII was determined by O'Hara et al (O'Hara PJ et al., "Nucleotide sequence of the gene coding for human factor VII, a vitamin K-dependent protein participating in blood coagulation" ; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5158-5162 (1987)).
  • the mRNA is polyadenylated in multiple positions and has efficient differential splicing.
  • the mature protein has a molecular mass of approximately 50 KDa.
  • the activated form of factor VII consists of a heavy chain and a light chain, both encoded by the same gene, and linked by a disulfide bridge between the cysteine 135 and cysteine 262 (Hagen et al., 1986). It contains two EGF domains (epidermal growth factor domain), a Gla domain ( ⁇ -carboxyglutamic acid domain) and a trypsin-like catalytic domain (Hagen et al., Nati Acad Sci USA, 1986).
  • the heavy chain comprises the catalytic part of the molecule and the heavy chain contains the Gla domain involved in the Ca 2+ binding and the membrane binding, which are essential for the activity of factor VII.
  • Variants of the heavy chain of factor VII involve direct interference in the process of activation or disruption of the catalytic mechanism, while most variants of light chains interrupt interactions with Ca + or membrane components resulting in non-molecule molecules. functional (Zheng et al., Blood Coagul Fibrinol, 1996).
  • Hereditary factor VII deficiency is a rare disorder that shows an autosomal recessive inheritance with high penetrance and variable expressivity (kupfer et al., 1960; Triplet et al., 1985). It has an incidence of 1 per 500,000 in the population (ulf and Herr ann. Hum Mutation 15; 2000) and was recognized, for the first time, by Alexander et al., 1951. Some of the mutations in the gene of the factor VII, affecting all of the protein domains, although approximately 50% of these mutations affect the protease domain (Wulff and Hermann, Hum mutation, 2000), which indicates that loss of protease function is the main cause of deficiency in factor VII.
  • the most common forms of disorder involve the presence of dysfunctional factor VII, which consists of low levels of antigen in the plasma and a prolongation of prothrombin time due to the defective activity of these molecules.
  • dysfunctional factor VII consists of low levels of antigen in the plasma and a prolongation of prothrombin time due to the defective activity of these molecules.
  • the absence of factor VII activity in plasma causes severe bleeding shortly after birth; in fact, there are studies in which mice deficient in FVII, by interrupting the factor VII gene, lethal hemorrhage occurred during the period of peri-parturition (Me Vey et al. Hum mutation et al, 2000).
  • allelic variants have been associated with the different risk of suffering from cardiovascular diseases, although the studies where this association has been described are contradictory and in no case conclusive (Girelli et al New Eng. J. Med, 2000; Iacoviello et al., N Eng. J. Med. 1998). In addition, they all suffer from design errors and lack of statistical power.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a sequence of the gene coding for factor VII characterized by the fact that said molecule comprises at least one allelic variant, said allelic variable affecting the stability and / or functionality of said nucleic acid molecule, of the product obtained from the transcription of said nucleic acid molecule and / or of the product encoded by said nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule means a DNA sequence from the gene encoding protein factor VII.
  • the length of said sequence is not an essential or limiting aspect of the present invention.
  • allelic variant means a genetic variation in the DNA sequence encoding protein factor VII, which implies genetic variation, a pathology, loss or gain of stability and / or functionality.
  • allelic variant can be a deletion, an insertion or a substitution.
  • new allelic variants are provided that have been identified in the gene encoding protein factor VII.
  • allelic variants affect not only the functionality of factor VII, but also the levels at which said protein is found. This is due to the fact that said variants can affect both the nucleic acid molecule (DNA), as well as the transcript of said molecule (RNA) as well as the protein.
  • the allelic variant results in an increase in RNA stability, higher levels of factor VII protein will be obtained in plasma; if the allelic variant affects an exon (that is, a protein coding region) the functionality of factor VII will be affected; if the allelic variant is found in an intron (that is, in a non-coding region), the stability of the DNA and / or RNA can be affected, affecting the levels of FVII in the blood (increasing or decreasing those levels).
  • said variant affecting stability and / or functionality means an allelic variant that results in an increase or decreased stability, either of DNA or RNA, and / or an increase or loss of FVII function.
  • allelic variants identified in the present invention are located in the region of the promoter, intron 1, intron 2, exon 3, intron 3, intron 5, exon 6, intron 7, intron 8, exon
  • Table 1 allelic variants identified in the present invention.
  • allelic variants described in the table is based on the sequence numbering of the human factor VII coding gene published by O'Hara.
  • the first column indicates the position in which the allelic variant was detected, taking as reference the numbering of the sequence published by O'Hara.
  • the uppercase letters (in the second column) indicate the allelic variant in a given position.
  • -3216 C / T means that in the -3216 position (which is in the promoter region) the normal allele is a C (cytosine) and the allelic variant is T (thymidine);
  • 11293 Ins AA means that at position 11293 two adenine nucleotides are inserted;
  • 11622 of the AG means that at position 11622 there is the deletion of two nucleotides, adenine and guanine.
  • the inventors of the present invention have found that the identification of said allelic variants in a nucleic acid molecule are indicative that the patient may develop cardiovascular disease, due to the fact that said allelic variants may be functional ( identified in the exons of the nucleic acid molecule) affecting the total or partial function of the protein encoded by said molecule and, therefore, the coagulation process in which said protein is involved is affected.
  • the protein (factor VII) encoded by a nucleic acid molecule in accordance with the present invention, may see its stability altered, its secretion from the cell to the plasma, the plasma half-life, etc.
  • the nucleic acid molecule itself may also be altered by the presence of at least one of the allelic variants of Table 1, in terms of transcription rate, messenger RNA half-life, ribosome protein translation rate, etc.
  • the present invention relates to proteins encoded by a nucleic acid molecule comprising at least one allelic variant of Table 1, for use as a medicament.
  • an FVII protein of greater stability can be obtained, remaining longer in plasma, and can be used to administer to patients with coagulation problems.
  • Another aspect of the present invention is a method for the analysis of a nucleic acid molecule, characterized in that it comprises obtaining said molecule from a biological sample and determining at least one allelic variant of the Table. 1, said allelic variable affecting the stability and / or functionality of said nucleic acid molecule and / or the product encoded by it.
  • the present invention relates to a device for the determination of a predisposition to a cardiovascular disease comprising at least one of the oligonucleotides identified in Table 3.
  • a device for the determination of a predisposition to a cardiovascular disease comprising at least one of the oligonucleotides identified in Table 3.
  • a specific treatment can be designed for the prevention of cardiovascular disease in patients who have not yet developed it but who present at least one allelic variant; a treatment that is specific to alleviate factor VII dysfunction can be designed; or the product encoded by said nucleic acid molecule can be used for the treatment of a disease associated with the coagulation cascade.
  • the present invention provides new allelic variants identified in the gene encoding factor VII that affect the stability and / or functionality of said nucleic acid molecule and / or the product encoded by it.
  • the detection of said allelic variables not only allows the detection of a predisposition to a cardiovascular disease (associated with thrombosis) but also the proteins that are encoded by the nucleic acid molecules comprising at least one of the Allelic variants of Table 1 can be used as a medication for the treatment of complications associated with thrombosis or coagulation.
  • Example 1 Procedure for the identification of allelic variants of the present invention.
  • the DNA was extracted from white blood cells (leukocytes) from unrelated people with plasma FVII levels much higher or lower than what one skilled in the art considers as normal levels in the population mean. Blood samples were collected from the anticubital vein and immediately anticoagulated with 1/10 volume of 0.129 M sodium citrate.
  • Platelet depleted plasma was obtained by centrifugation at 2000 g for 20 min. and subsequently froze and stored at -40 ° C until analysis.
  • the DNA was purified from the leukocyte nuclei by the procedure described by Miller et al. (Miller et al. Nuc ⁇ Ac Res 16 (3): 1215, 1988).
  • the FVII gene was analyzed in different overlapping fragments that covered the entire gene sequence.
  • the technique used for this analysis was the Polymerase Chain Reaction (PCR). Primers ("primers") used to amplify these fragments are shown in Table 2 and 3.
  • Table 2 primers used to amplify the fragments obtained by PCR.
  • the different FVII gene fragments were numbered consecutively according to the order of analysis.
  • the primers were also numbered consecutively, taking into account that even numbers correspond to direct sequence primers and odd numbers to reverse sequence ones.
  • Even numbers correspond to direct sequence primers and odd numbers to reverse sequence ones.
  • a direct sequence and a reverse sequence primer are always needed (complementary to the DNA chain to be amplified).
  • sequences of the primers used are included (sequences NO: NO: 36).
  • each fragment was amplified using GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems).
  • the PCR products were generated in 50 ⁇ l of reaction mixtures containing 200 ng genomic DNA, 0.5 U of Taq DNA polymerase (Biotaq DNA Polymerase. Bioline), and the primers indicated in Tables 2 and 3, at a concentration of 0.5 ⁇ M each, dNTPs at a concentration of 0.05 mM each, 1.5 mM MgCl 2 (1 M MgCl 2 for fragment 1), and 5% DMSO (non-DMSO in fragment 1 in buffer for PCR IX Bioline).
  • the PCR program was started with 5 min at 94 ° C during the initial denaturation, followed by 30 cycles of amplification consisting of 1 min. at 94 ° C, 1 min. at hybridization temperature (57 ° C for fragments 1, 2, 7, 9 and 11, 59 ° C for fragments 3 and 8, and 61 ° C for fragment 10, from table 1) and 2 min. at 72 ° C. In the last cycle the extension time was increased to 10 min.
  • the amplified fragments were electrophoresed on a 1% agarose gel for control.
  • Said fluorescence marker may be any of those known to a person skilled in the art, such as commercially available BigDyes (Apply- Biosystems.
  • This step is where DNA synthesis is interrupted by incorporating one of the ddNTPs.
  • ddNTPs a large number of fragments of different sizes are obtained which are separated by continuous capillary electrophoresis.
  • Each of these fragments incorporates a fluorescent ddNTP that corresponds to a determined base of the DNA chain.
  • the color of each fragment is determined when the fluorochrome (fluorescent material of the ddNTPs) is excited by a laser, thus producing a signal that is received by a photomultiplier and transmitted to a computer.
  • the analysis of the signals in the computer allows to establish the sequence of the fragment under study. This technique is performed using an automatic DNA sequencer (in our case an ABI-310 model of Apply Biosystems).
  • PCR amplified fragments were purified, dNTPs and unincorporated oligonucleotides were removed, using the Quiagen ⁇ QIAquick PCR Purification Kit columns before being sequenced.
  • the sequencing reaction was performed in a volume of 10 ⁇ l, containing 3 ⁇ l of the purified DNA fragment, 4 ⁇ l of DNA Sequencing Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems), 5% dimethylsulfoxide (DMSO vol / vol) and 0.32 ⁇ M of the oligonucleotide for sequencing (table 3).
  • the sequencing program consists of an initial step of 3 'at 94 ° C, followed by 25 cycles with the routine:

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presencia de por lo menos una de dichas variantes alélicas afecta a la estabilidad y/o funcionalidad de dicha molécula de ácido nucleico y/o del producto codificado por dicha molécula de ácido nucleico.El procedimiento para el análisis de una molécula de áciddo nucleico comprende la obtención de dicha molécula a partir de una muestra biológica y la determinación de por lo menos una variante alélica de la Tabla 1, afectando dicha variable alélica a la estabilidad y/o funcionalidad de dicha molécula de ácido nucleico y/o del producto codificado por ésta. El producto aislado codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una variante alélica se puede utilizar como medicamento.

Description

NUEVAS VARIANTES ALELICAS EN EL GEN DEL FACTOR VII
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de las enfermedades cardiovasculares. En particular, la presente invención se refiere a la identificación de nuevas variantes alélicas en la secuencia del gen del factor VII para determinar la predisposición a una enfermedad cardiovascular.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El factor VII es una glicoproteina dependiente de vitamina K sintetizada en el hígado y se secreta en la sangre como un zi ógeno inactivo a una concentración de 0,5 μg/ml2 (Fair Blood, 1983) . Después de un daño endotelial, se expone el factor tisular (TF) y se une al factor VII, activando la cascada de coagulación. (Osterud. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1977; Bauer et al., Blood, 1990).
El gen que codifica el factor VII está localizado en 13q34-q.ter (Pfeiffer et al., 1982; Gilgen rantz et al, 1986), contiene 9 exones y 8 intrones de 12,8 Kb y codifica para una proteina de 406 aminoácidos. La secuencia del gen completo para el factor VII humano fue determinada por O'Hara et al (O'Hara P.J. et al., "Nucleotide sequence of the gen coding for human factor VII, a vitamin K-dependent protein participating in blood coagulation"; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:5158-5162 (1987)). El mRNA se encuentra poliadenilado en múltiples posiciones y tiene un splicing diferencial eficiente. La proteina madura tiene una masa molecular de aproximadamente 50 KDa.
La forma activada del factor VII consiste en una cadena pesada y una cadena ligera, ambas codificadas por el mismo gen, y unidos por un puente disulfuro entre la cisteina 135 y la cisteina 262 (Hagen et al., 1986). Contiene dos dominios EGF (dominio del factor de crecimiento epidérmico) , un dominio Gla (dominio del ácido γ-carboxiglutámico) y un dominio catalítico similar a tripsina (Hagen et al., Nati Acad Sci USA, 1986).
La cadena pesada comprende la parte catalítica de la molécula y la cadena pesada contiene el dominio Gla implicado en la unión de Ca2+ y la unión de membrana, que son esenciales para la actividad del factor VII. Las variantes de la cadena pesada del factor VII implican la interferencia directa en el proceso de activación o la interrupción del mecanismo catalítico, mientras que la mayoría de variantes de cadenas ligeras interrumpen las interacciones con Ca + o con componentes de membrana que resulta en moléculas no funcionales (Zheng et al., Blood Coagul Fibrinol, 1996).
La deficiencia del factor VII hereditaria es una alteración poco común que muestra una herencia recesiva autosómica con elevada penetrancia y expresividad variable (kupfer et al., 1960; Triplet et al., 1985). Tiene una incidencia de 1 por cada 500.000 en la población ( ulf and Herr ann. Hum Mutation 15; 2000) y fue reconocida, por primer vez, por Alexander et al., 1951. Se han identificado algunas de las mutaciones en el gen del factor VII, afectando éstas a todos los dominios de la proteina, aunque aproximadamente, un 50% de dichas mutaciones afectan al dominio proteasa (Wulff and Hermann, Hum mutation, 2000) , lo cual indica que la pérdida de función proteasa es la causa principal de deficiencia en el factor VII. En general las formas de desorden más comunes implican la presencia de factor VII disfuncional, que consiste en niveles de antigeno bajos en el plasma y una prolongación del tiempo de protrombina debido a la actividad defectiva de éstas moléculas. La ausencia de actividad de factor VII en plasma causa hemorragia severa poco tiempo después del nacimiento; de hecho existen estudios en los que ratones deficientes en FVII, mediante la interrupción del gen del factor VII se producía hemorragia letal en el periodo del peri-parto (Me Vey et al. Hum mutation et al, 2000) .
Por otro lado, alrededor de un 30-40 % de la variación en los niveles de FVIIa en la población general se puede explicar por la existencia de polimorfismos en el gen del factor FVII (Bernardi et al., Blood 1996). Sin embargo, estos polimorfismos o variantes alélicas presentan diferentes frecuencias alélicas en diferentes poblaciones
(Green et al., Arterioscler . Thromb, 1991; Bernardi, marchetti, Pinotti. Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 1996) .
Estas variantes alélicas se han asociado con el diferente riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares, aunque los estudios donde se han descrito esta asociación son contradictorios y en ningún caso concluyentes (Girelli et al New Eng. J. Med, 2000; Iacoviello et al., N. Eng. J. Med. 1998). Además, adolecen todos ellos de errores de diseño y falta de poder estadístico.
Hasta la actualidad el diseño y la metodología empleada para abordar el estudio de la enfermedad cardiovascular se basan en investigar la presencia del factor de riesgo en individuos sanos (controles) y enfermos (casos), no emparentados entre ellos. Cuando el hipotético factor de riesgo se observa más frecuentemente
(en términos estadísticos) en los casos que en los controles, se concluye que la enfermedad se asocia con el factor bajo estudio. En rigor, una relación de asociación no implica necesariamente causalidad. Este tipo de estudio, denominado Estudio de Asociación o Caso/Control, es totalmente inadecuado para investigar causas genéticas en las enfermedades complejas, como la enfermedad cardiovascular (Gámbaro et al., Lancet 2000). Los estudios epidemiológicos convencionales sirven fundamentalmente para identificar causas ambientales de enfermedad (por ejemplo el tabaco y el cáncer de pulmón, anticonceptivos orales y trombosis venosa o una dieta pobre en vitamina C y escorbuto) pero son muy ineficaces para localizar los genes implicados. Sin embargo, y debido a la generalización de las técnicas de PCR en los laboratorios clínicos, existe una avalancha de Estudios de Asociación para relacionar variantes genéticas (polimorfismos) en determinados genes candidatos con todo tipo de enfermedades. Como consecuencia se ha generado mucha confusión porque habitualmente los resultados relativos a un mismo polimorfismo suelen ser contradictorios. El estudio de la enfermedad cardiovascular, tanto en su vertiente venosa como arterial, tampoco ha escapado a esta perversión metodológica ni al consiguiente caos de resultados (Girelli et al New Eng. J. Med, 2000; Iacoviello et al., N. Eng. J. Med. 1998).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia del gen codificante del factor VII caracterizada por el hecho de que dicha molécula comprende por lo menos una variante alélica, afectando dicha variable alélica a la estabilidad y/o funcionalidad de dicha molécula de ácido nucleico, del producto obtenido de la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico y/o del producto codificado por dicha molécula de ácido nucleico.
En la presente invención, por "molécula de ácido nucleico" se entiende una secuencia de ADN procedente del gen que codifica la proteina factor VII. La longitud de dicha secuencia no es un aspecto esencial o limitativo de la presente invención. En la presente invención, por "variante alélica" se entiende una variación genética en la secuencia de ADN que codifica para la proteina factor VII, implicando, dicha variación genética, una patología, pérdida o ganancia de estabilidad y/o funcionalidad. En particular, dicha variante alélica puede ser una deleción, una inserción o una sustitución.
Por tanto, en un primer aspecto de la invención, se proporcionan nuevas variantes alélicas que han sido identificadas en el gen que codifica la proteina factor VII.
Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han encontrado que dichas variantes alélicas afectan no sólo a la funcionalidad del factor VII, sino que, además, a los niveles en los que se encuentra dicha proteina. Esto se debe al hecho de que dichas variantes pueden afectar tanto a la molécula de ácido nucleico (ADN) , como al transcrito de dicha molécula (ARN) asi como a la proteina. Por ejemplo, si la variante alélica da lugar a un aumento de la estabilidad del ARN, se obtendrán unos niveles mayores de la proteina factor VII en plasma; si la variante alélica afecta a un exón (es decir, a una región codificante de la proteina) se verá afectada la funcionalidad del factor VII; si la variante alélica se encuentra en un intrón (es decir, en una región no codificante) se puede ver afectada la estabilidad del ADN y/o ARN, afectando a los niveles de FVII en sangre (aumentando o disminuyendo dichos niveles) .
En la presente invención por "dicha variante afectando a la estabilidad y/o funcionalidad" se entiende una variante alélica que da lugar a un aumento o disminución de la estabilidad, ya sea del ADN o ARN, y/o a un aumento o pérdida de función de FVII.
La secuencia del gen humano codificante de FVII es conocida (secuencia publicada por O'Hara, P. J. ; Grant, F. J. ; Haldeman, B. A.; Gray, C. L.; Insley, M. Y.; Hagen, F. S.; Murray, M. J. : "Nucleotide sequence of the gene coding for human factor VII, a vitamin K-dependent protein participating in blood coagulation" . Proc. Nat . Acad. Sci . 84: 5158-5162, 1987. Número de acceso en PubMed ID: 3037537) .
Las variantes alélicas identificadas en la presente invención se localizan en la región del promotor, del intrón 1, del intrón 2, del exón 3, del intrón 3, del intrón 5, del exón 6, del intrón 7, del intrón 8, del exón
9, en la región 3'-UTR (región 3' no traducible a proteina, pero que contiene secuencias reguladoras) , tal y como se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 1: variantes alélicas identificadas en la presente invención.
SNP {Single Nucleotide polymophísm) variación de una base
(nucleótido) en la secuencia de ADN .
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
La numeración de las variantes alélicas descritas en la tabla se basan en la numeración de la secuencia del gen codificante del factor VII humano publicada por O'Hara.
La primera columna indica la posición en la que se ha detectado la variante alélica, tomando como referencia la numeración de la secuencia publicada por O'Hara. Las letras en mayúsculas (de la segunda columna) indican cuál es la variante alélica en una determinada posición. Por ejemplo, -3216 C/T significa que en la posición -3216 (que se encuentra en la región del promotor) el alelo normal es una C (citosina) y la variante alélica es T (timidina) ; 11293 Ins AA significa que en la posición 11293 se insertan dos nucleótidos adenina; 11622 del AG significa que en la posición 11622 existe la deleción de dos nucleótidos, adenina y guanina.
En un segundo aspecto, los inventores de la presente invención han encontrado que la identificación de dichas variantes alélicas en una molécula de ácido nucleico son indicativas de que el paciente pueda desarrollar una enfermedad cardiovascular, debido al hecho de que dichas variantes alélicas pueden ser funcionales (identificadas en los exones de la molécula de ácido nucleico) afectando a la función total o parcial de la proteina codificada por dicha molécula y, por lo tanto, viéndose afectado el proceso de coagulación en que se encuentra implicada dicha proteina.
De hecho, la proteina (factor VII) codificada por una molécula de ácido nucleico, de acuerdo con la presente invención, puede ver alterada su estabilidad, la secreción de la misma desde la célula al plasma, la vida media en plasma, etc. La propia molécula de ácido nucleico puede también verse alterada por la presencia de por lo menos una de las variantes alélicas de la Tabla 1, en lo referente a tasa de trascripción, vida media del RNA mensajero, tasa de traducción a proteina en los ribosomas, etc.
Por todo ello, la presente invención se refiere a proteínas codificadas por una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una variante alélica de la Tabla 1, para utilizar como medicamento.
Por ejemplo, si la variante alélica se localiza en un intrón de dicha molécula de ácido nucleico, se puede obtener una proteina FVII de mayor estabilidad, permaneciendo durante más tiempo en plasma, pudiéndose utilizar para administrar a pacientes con problemas de coagulación.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para el análisis de una molécula de ácido nucleico, caracterizado por el hecho de que comprende la obtención de dicha molécula a partir de una muestra biológica y la determinación de por lo menos una variante alélica de la Tabla 1, afectando dicha variable alélica a la estabilidad y/o funcionalidad de dicha molécula de ácido nucleico y/o del producto codificado por ésta.
En aún todavía otro aspecto, la presente invención se refiere a un dispositivo para la determinación de una predisposición a una enfermedad cardiovascular que comprende al menos uno de los oligonucleótidos identificados en la Tabla 3. (Ver posteriormente) Ventajosamente, si la muestra de ADN del paciente se hibrida con al menos uno de los oligonucleótidos identificados en la Tabla 3, será indicativo de que presenta por lo menos una variante alélica en el gen del factor VII y, por tanto, se podrá determinar el origen en la función alterada del factor VII.
De esta manera, se puede diseñar un tratamiento especifico para la prevención de una enfermedad cardiovascular en pacientes que aún no la hayan desarrollado pero que presenten al menos una variante alélica; se puede diseñar un tratamiento que sea especifico para apaliar la disfunción del factor VII; o se puede utilizar el producto codificado por dicha molécula de ácido nucleico para el tratamiento de una enfermedad asociada con la cascada de coagulación.
Por tanto, la presente invención proporciona nuevas variantes alélicas identificadas en el gen que codifica para el factor VII que afectan a la estabilidad y/o funcionalidad de dicha molécula de ácido nucleico y/o del producto codificado por ésta.
Venta osamente, la detección de dichas variables alélicas no sólo permiten la detección de una predisposición a una enfermedad cardiovascular (asociada con trombosis) sino que, además, las proteínas que son codificadas por las moléculas de ácido nucleico que comprenden por lo menos una de las variantes alélicas de la Tabla 1 se pueden utilizar como medicamento para el tratamiento de complicaciones asociadas a la trombosis o coagulación.
A continuación, a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo, se incluye el siguiente ejemplo. Ejemplos
Ejemplo 1 : Procedimiento para la identificación de las variantes alélicas de la presente invención .
1. Extracción de sangre:
El DNA se extrajo de células sanguíneas blancas (leucocitos) procedente de personas no emparentadas con unos niveles de FVII en plasma muy superiores o inferiores a los que un experto en la materia considera como niveles normales en la media de la población. Las muestras de sangre se recogieron de la vena anticubital y se anticoaguló, inmediatamente, con 1/10 volumen de citrato sódico 0,129 M.
El plasma empobrecido en plaquetas se obtuvo por centrifugación a 2000 g durante 20 min. y posteriormente se congeló y guardó a -40°C hasta su análisis.
2. Aislamiento y amplificación del DNA.
El DNA se purificó a partir de los núcleos de leucocitos mediante el procedimiento descrito por Miller et al. (Miller et al. Nucí Ac Res 16 (3): 1215, 1988).
El gen del FVII fue analizado en diferentes fragmentos solapados que cubrían la totalidad de la secuencia del gen. La técnica utilizada para este análisis fue la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) . Los cebadores ( "primers") utilizados para amplificar estos fragmentos se muestran en la Tabla 2 y 3.
Tabla 2: cebadores utilizados para amplificar los fragmentos obtenidos por PCR.
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Los diferentes fragmentos del gen del FVII fueron enumerados consecutivamente según el orden de análisis.
Los cebadores también fueron enumerados consecutivamente, teniendo en cuenta que los números pares corresponden a cebadores de secuencia directa y los impares a los de secuencia reversa. Un experto en la materia conoce el hecho de que para amplificar un fragmento de ADN por PCR siempre se necesita un cebador de secuencia directa y otro de secuencia reversa (complementaria a la cadena de ADN que se va a amplificar) .
A modo esquemático, se incluyen las secuencias de los cebadores utilizados (secuencias NO:l a NO: 36).
Tabla 3
Cebador SEC. NO:
F715.1* 1
F72 2
F73 3
F74 4
F77 5
F78 6
F712 7
F713 8
F714 9
F715 10
F716 11
F711.2 12
F712.1 13
F711.1 14
F712.2 15
F710.1 16
F711.3 17
F716.1* 18
F714.1* 19
F73.1* 20
F77.1* 21
F78.1* 22
F713.2* 23
F73.2* 24
F713.3* 25
F714.2* 26
F71.4* 27
F711.5* 28
F711.4* 29
F79A 30
F710A 31
F79B 32
F710B 33
F79C 34
F710C 35
F710G 36
La metodología seguida para la PCR es estándar.
Brevemente, cada fragmento fue amplificado utilizando GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) . Los productos de la PCR se generaron en 50μl de mezclas de reacción que contenían 200 ng DNA genómico, 0,5 U de Taq DNA polimerasa (Biotaq DNA Polymerase. Bioline) , y los cebadores indicados en las tablas 2 y 3, a una concentración de 0,5 μM cada uno, los dNTPs a una concentración de 0,05 mM cada uno, l,5mM MgCl2 (1 M MgCl2 para el fragmento 1) , y 5% DMSO (no DMSO en el fragmento 1 en el tampón para la PCR IX Bioline) .
El programa de la PCR se inició con 5 min a 94°C durante la desnaturalización inicial, seguido de 30 ciclos de amplificación que consiste en 1 min. a 94°C, 1 min. a temperatura de hibridación (57°C para los fragmentos 1, 2, 7, 9 y 11, 59°C para los fragmentos 3 y 8, y 61°C para el fragmento 10, de la tabla 1) y 2 min. a 72 °C. En el último ciclo el tiempo de extensión se incrementó a 10 min.
Los fragmentos amplificados se sometieron a una electroforesis en un gel de agarosa al 1% para el control.
3. Secuenciación del ADN.
Se utilizó un método de secuenciación enzimática o método de los dideoxinucleótidos, que tiene como principio la síntesis de una cadena de ADN utilizando una DNA polimerasa a partir de un molde de ADN (fragmento que se quiere secuenciar) previamente desnaturalizado. En este caso se ha utilizado la técnica de la PCR (mencionada anteriormente) utilizando los 4 tipos de bases que componen el ADN en forma de dideoxinucleótidos (ddNTPs) , cada uno de ellos marcado con una fluorescencia diferente.
Dicho marcador de fluorescencia puede ser cualquiera de los conocidos por un experto en la materia, tales como los BigDyes comercialmente disponible (Apply- Biosystems .
En este paso es donde la síntesis del ADN se interrumpe al incorporar uno de los ddNTPs. De esta forma se obtienen una gran cantidad de fragmentos de distinto tamaño que se separan mediante electroforesis capilar continuada. Cada uno de estos fragmentos lleva incorporado un ddNTP fluorescente que corresponde a una base determina de la cadena de ADN. El color de cada fragmento se determina cuando el fluorocromo (material fluorescente de los ddNTPs) es excitado por un láser, produciendo asi una señal que es recibida por un fotomultiplicador y transmitida a un ordenador.
El análisis de las señales en el ordenador permite establecer la secuencia del fragmento en estudio. Esta técnica se realiza mediante un secuenciador automático de ADN (en nuestro caso un modelo ABI-310 de Apply Biosystems) .
Todos las variantes alélicas han sido identificados por secuenciación directa del gen del FVII.
Los fragmentos amplificados por PCR fueron purificados, se eliminaron los dNTP y los oligonucleótidos no incorporados, mediante las columnas Quiagen λQIAquick PCR Purification Kit antes de ser secuenciados .
La reacción de secuenciación se realizó en un volumen de 10 μl, que contenía 3 μl del fragmento de ADN purificado, 4 μl de DNA Sequencing Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems) , 5% de dimethylsulfoxide (DMSO vol/vol) y 0,32 μM del oligonucleótido para secuenciar (tabla 3) . El programa de secuenciación consta de un paso inicial de 3' a 94°C, seguido de 25 ciclos con la rutina:
10 segundos a 96°C, 5 segundos de hibridación a 50°C y 4 minutos a 60°C. Las secuencias se realizaron en un ABI
PRISM 310 Genetic Analyzer.
De esta manera, se identificaron las variantes alélicas de la Tabla 1.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia del gen codificante del factor VII caracterizada por el hecho de que dicha molécula comprende por lo menos una variante alélica, afectando dicha variable alélica a la estabilidad y/o funcionalidad de dicha molécula de ácido nucleico y/o del producto codificado por dicha molécula de ácido nucleico.
2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que la presencia de por lo menos una de dichas variantes alélicas es indicativa de una predisposición a una enfermedad cardiovascular.
3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 6 2, en donde dicha variante alélica es una de las identificadas en la Tabla 1.
4. Producto aislado codificado por una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para utilizar como medicamento.
5. Oligonucleótido alelo-específico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el nucleótido del sitio polimórfico de dicho oligonucleótido alelo-específico es diferente del nucleótido del sitio polimórfico del alelo de referencia.
6. Oligonucleótido según la reivindicación 5 caracterizado por el hecho de que es una sonda.
7. Oligonucleótido según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que es uno de los identificados en la tabla 3.
8. Procedimiento para el análisis de una molécula de ácido nucleico, caracterizado por el hecho de que comprende la obtención de dicha molécula a partir de una muestra biológica y la determinación de por lo menos una variante alélica de la Tabla 1, afectando dicha variable alélica a la estabilidad y/o funcionalidad de dicha molécula de ácido nucleico y/o del producto codificado por ésta.
9. Dispositivo de diagnóstico para la determinación de una predisposición a una enfermedad cardiovascular caracterizado por el hecho de que comprende un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
PCT/ES2003/000379 2002-07-25 2003-07-23 Nuevas variantes alelicas en el gen del factor vii WO2004011675A2 (es)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03771120A EP1538220A2 (en) 2002-07-25 2003-07-23 Allelic variants in the factor vii gene
US10/522,070 US20060252039A1 (en) 2002-07-25 2003-07-23 Novel allelic variants in the factor vii gene
AU2003258721A AU2003258721A1 (en) 2002-07-25 2003-07-23 Novel allelic variants in the factor vii gene

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP-200201749 2002-07-25
ES200201749A ES2226533B1 (es) 2002-07-25 2002-07-25 Nuevas variantes alelicas en el gen del factor vii.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004011675A2 true WO2004011675A2 (es) 2004-02-05
WO2004011675A3 WO2004011675A3 (es) 2004-04-08

Family

ID=30775943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2003/000379 WO2004011675A2 (es) 2002-07-25 2003-07-23 Nuevas variantes alelicas en el gen del factor vii

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20060252039A1 (es)
EP (1) EP1538220A2 (es)
AU (1) AU2003258721A1 (es)
ES (1) ES2226533B1 (es)
WO (1) WO2004011675A2 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8828939B2 (en) 2004-08-17 2014-09-09 Csl Behring Gmbh Modified vitamin K dependent polypeptides

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102076852A (zh) * 2007-11-09 2011-05-25 Isis药物公司 因子7表达的调节

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DI CASTELNUOVO A ET AL : "The decunucleotide insertion/deletion polymorphism in the promoter region of the coagulation factor VII gene and the risk of familial myocardinal infarction." THROMBOSIS RESEARCH, vol. 98, 2000, páginas 9-17, XP002902984 ISSN: 0049-3848 *
GREEN F ET AL : "A common genetic polymorphism associated with lower coagulation factor VII levels in healthy individuals." ARTERIOSCLEROSIS AND THROMBOSIS, vol. 11, num. 3, Mayo 1991 (1991-05) - Junio 1991 (1991-06), páginas 540-546, XP002902987 *
MARCHETTI G ET AL : "A polymorphism in the 5' region of coagulation factor VII gene (F7) caused by an inserted decanucleotide." HUMAN GENETICS, vol. 90, num. 5, 1993, páginas 575-576, XP002902988 *
VAN 'T HOOFT F M ET AL : "Two common functional polymorphisms in the promotor region of the coagulation factor VII gene determining plasma factor VII activity and mass concentration." BLOOD, vol. 93, num. 10, 1999, páginas 3432-3441, XP002902986 ISSN: 0006-4971 *
WULFF K ET AL: "Twenty two novel mutations of the factor VII gene in factor VII deficiency." HUMAN MUTATION, vol. 15, num. 6, 2000, páginas 489-496, XP002902985 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8828939B2 (en) 2004-08-17 2014-09-09 Csl Behring Gmbh Modified vitamin K dependent polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003258721A1 (en) 2004-02-16
ES2226533B1 (es) 2005-12-16
ES2226533A1 (es) 2005-03-16
US20060252039A1 (en) 2006-11-09
EP1538220A2 (en) 2005-06-08
WO2004011675A3 (es) 2004-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5479663B2 (ja) 心筋梗塞に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用
Calado et al. Constitutional telomerase mutations are genetic risk factors for cirrhosis
van Wijk et al. Five novel mutations in the gene for human blood coagulation factor V associated with type I factor V deficiency
Matsushima et al. Mutation analysis of the BRCA1 gene in 76 Japanese ovarian cancer patients: four germline mutations, but no evidence of somatic mutation
Zhang et al. Mutations of von Willebrand factor gene in families with von Willebrand disease in the Aland Islands.
Beauchamp et al. The prevalence of, and molecular defects underlying, inherited protein S deficiency in the general population
Howard et al. A patient homozygous for a mutation in the prothrombin gene 3′-untranslated region associated with massive thrombosis
JP4031199B2 (ja) ヒト気道トリプシン様酵素遺伝子多型による疾病体質解析
Tsay et al. R147W mutation of PROC gene is common in venous thrombotic patients in Taiwanese Chinese
ES2226533B1 (es) Nuevas variantes alelicas en el gen del factor vii.
Espinosa-Parrilla et al. Absence of linkage between type III protein S deficiency and the PROS1 and C4BP genes in families carrying the protein S Heerlen allele
Corral et al. Factor XIII Val 34 Leu polymorphism in primary intracerebral haemorrhage
ES2313416T3 (es) Mejoras en generadores de heteroduplex inducidos.
Mahajan et al. Molecular characterization of hemophilia B in North Indian families: identification of novel and recurrent molecular events in the factor IX gene
Kostka et al. Frequency of polymorphisms in the B-domain of factor V gene in APC-resistant patients
Yamada et al. Expression of paraoxonase isoform did not confer protection from acute sarin poisoning in the Tokyo subway terrorist attack
Soo et al. Detection of prothrombin gene polymorphism at position 20209 (PT20209C/T): pilot study in a black population in the United Kingdom
Vettriselvi et al. XRCC1 and XPD gene polymorphisms in a South Indian population
Castaman et al. A novel family with recessive von Willebrand disease due to compound heterozygosity for a splice site mutation and a missense mutation in the von Willebrand factor gene
JP2005527218A (ja) 患者結果の指標として有用なプロテインｃ多型
Paramasivam et al. Association of ACE DD genotype with hypertension among the tribal populations of South India
Hirata et al. A method to detect the G894T polymorphism of the NOS3 gene. Clinical validation in familial hypercholesterolemia
US20090053693A1 (en) Identification of polymorphisms in the epcr gene associated with thrombotic risk
CN112322727B (zh) Cda基因snp位点的用途
RU2331671C2 (ru) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА α-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ Thr312Ala

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003771120

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006252039

Country of ref document: US

Ref document number: 10522070

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003771120

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10522070

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003771120

Country of ref document: EP