WO2004010140A1 - マイクロ流路を利用することによる分子分析方法 - Google Patents

マイクロ流路を利用することによる分子分析方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for performing qualitative or quantitative analysis of a specific molecule using a microchannel system.
  • a probe molecule an analyte molecule such as a biological molecule and a molecule that forms a complex with it (hereinafter referred to as a probe molecule).
  • Detection methods In this method, a complex formed by a probe molecule immobilized on a solid support by specific interaction with a biological molecule is detected by a signal emitted from a fluorescent substance or an electrochemically active substance previously labeled. It qualitatively detects the presence of biomolecules and quantifies them.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the method using PCR reaction is, in principle, difficult to perform accurate quantification because the PCR reaction itself is an exponentially amplified reaction.
  • the method using molecular beacon that is, the one where fluorescence site and extinction site are introduced at both ends of probe DNA, is bent to obtain self-complementary sequence before forming a complex with the test molecule. It is a method to analyze using the property of emitting light by the probe molecule after quenching but after complex formation.
  • the present invention overcomes the drawbacks of the conventional method of immobilizing analyte molecules or probe molecules on a solid phase carrier and analyzes them, which is simple in operation and provides higher accuracy.
  • the purpose of the invention is to provide a method for analyzing various analyte molecules such as biological substances.
  • the inventors of the present invention conducted intensive studies on methods for performing qualitative and quantitative analysis of analyte molecules using conjugation of a probe molecule and an analyte molecule, and as a result, a probe molecule-containing solution and an analyte molecule-containing solution When flowing into the microchannel, the two form a laminar flow and have the property that they do not mix with each other, and therefore, by detecting the difference in diffusivity by the strength and weakness of the selective interaction between the two.
  • the inventors have found that analyte molecules such as biomolecules can be analyzed with high accuracy without fixing to a solid phase carrier, and the present invention has been made based on this finding.
  • the sample molecule-containing solution and the molecule for complex formation solution are flowed into the microchannel while forming a laminar flow, and the sample molecule and the molecule for complex formation are formed in the laminar flow.
  • Analysis method characterized in that changes in the diffusivity of the complex to be detected and analyzed; in this method, a molecule having fluorescence is used as a molecule for complex formation, and the molecule is formed by the intensity of fluorescence.
  • the present invention provides a method of detecting a change in the diffusivity of a complex, and a method of quantifying the concentration of an analyte molecule by comparing the diffusivity of the formed complex with a previously formed calibration curve.
  • FIG. 1 is a plan view showing an example of a microphone opening channel used in the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a bar graph showing the results of Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the probe DNA concentration and its fluorescence intensity in Example 2.
  • the probe molecule-containing solution and the analyte molecule-containing solution are simultaneously flowed in the microchannel while forming a laminar flow, and while flowing, each flow of the complex formed by the specific interaction between the two.
  • the degree of diffusivity of the substance changes depending on the strength of the complexation by the signal emitted by the probe molecule, and the analysis of the result is carried out to analyze the sample.
  • the microchannel used in the method of the present invention needs to be provided on a substrate made of an inert material.
  • This and inert material with respect to complexes which solvent and product use probe molecules and analyte molecules or refers to a have a exhibit reactive material, such as glass, quartz, or silica, Si ZSi 0 2, Mention magnesia, zirconia, alumina, oxide, silica, and ceramics such as oxides, carbides, nitrides, borides and azides of metals such as titanium, aluminum, yttrium and tungsten. Can.
  • the shape of the base is usually plate-like, but if desired, arcs, spheres, granules and the like can be used, and these materials can be selected means, types of analytes and probe molecules, It is selected appropriately according to the solvent, but in the case of detection by optical means, it is necessary to use one that exhibits sufficient transparency to the wavelength of light used at the detection site.
  • the microchannel according to the present invention has a width of 10 to 500 ⁇ m, preferably 50 to 400 ⁇ , and a depth of 10 to 500 ⁇ ⁇ , on a substrate made of these inert materials. Preferably, it is engraved with a size of 50 to 40 ⁇ .
  • the length of the microchannel There is no particular limitation on the length of the microchannel, and it depends on the size of the inert material substrate to be used, but is usually selected in the range of 1000 to 300 °.
  • microchannels may be formed on a substrate by mechanical means using a machine tool such as a microdrill, or grooves may be formed by an optical lithography technique used for manufacturing semiconductor integrated circuits and the like. After. It can be manufactured by bonding another substrate.
  • the fluid flowing in such an extremely thin flow path flows with forming a laminar flow without mixing even with soluble solvents.
  • ultra-thin flow channels are characterized in that the diffusion distance of the substance is short.
  • the solute is, if soluble in the solvent, a force that naturally diffuses to the other solution, a special mutual interaction between the probe molecule and the analyte molecule. If they do, they can further accelerate the diffusion of these complexes.
  • the method of the present invention provides an analysis method utilizing this phenomenon, which is a signal emitted from a functional group introduced into a probe molecule or a specific property of the probe molecule itself (such as absorption of light of a specific wavelength, etc. )
  • a signal emitted from a functional group introduced into a probe molecule or a specific property of the probe molecule itself such as absorption of light of a specific wavelength, etc.
  • the method of the present invention can be generally used in the case where a specific interaction occurs between a probe molecule and an analyte molecule.
  • a nucleic acid fragment is used as a probe, it can be used for detection and analysis of nucleic acid fragments having a specific sequence.
  • a protein as a probe
  • a specific antibody can be detected.
  • detection of a specific enzyme or evaluation of its activity can be performed.
  • sugars are used as a probe, a nucleic acid or protein that specifically recognizes it Can be detected and quantified.
  • various cells are used as a probe, it is possible to screen the influence of various natural or artificial drugs, environmental substances and the like on the living body.
  • the method of the present invention is not limited to these, and any combination can be used for detection of any compound by selecting a combination that causes a specific interaction between the probe molecule and the analyte molecule. Also, in the above example, a single molecule in a chemical sense is used, but in addition to this, it can be applied to cells etc. and other substances in general.
  • the complex formation between the probe molecule and the analyte molecule in the method of the present invention does not require the skill of the operator as in the conventional method.
  • the method of the present invention with regard to the complex formation of the probe molecule and the sample molecule, the uncertainty of the analysis result due to the difference in the level of skill of the operator can be eliminated.
  • hybridization of nucleic acid fragment detection The experimental operation for complex formation between the probe molecule and the sample molecule, such as the dilution operation, is required, and the uncertainty of the analysis result caused by the difference in the skill of the operator in this experimental operation is a problem. It had become.
  • the solution is only poured into the flow path with a syringe or the like, the degree of proficiency is irrelevant, and the use of a device such as a syringe pump further eliminates the difference in the degree of proficiency of workers. can do.
  • the method of the present invention even if the number of probe molecules is small, processing is performed in a minute space, so that the concentration can be kept high, and the density of specific signals emitted by probe molecules can be increased. be able to. Therefore, according to the method of the present invention, high sensitivity detection can be performed.
  • the time required for detection in the method of the present invention is the time required for the solution to be sent to flow through the flow path, but the time required for flow through the very thin flow path of several hundred meters or so is Since the volume of the flow channel is at least small, the time required for detection in the method of the present invention is naturally shortened. This time depends on the dimensions of the microchannel used, etc., but usually within a few seconds It is.
  • qualitative or quantitative analysis of analyte molecules is performed based on the change in the diffusivity of the complex formed between the analyte molecules and the probe molecules in a laminar flow. That is, when there is no affinity between the sample molecule and the probe molecule, both of them merely detect the diffusivity between the laminar flows based on the normal mixing behavior, but the affinity between the two is high.
  • the formed complex can be selectively diffusion-promoted, and is detected as the increased degree of diffusion. Therefore, it is possible to qualitatively know the action of the sample molecule on the probe molecule by comparing the difference in the degree of diffusion.
  • the amount of probe molecules diffused to the sample molecule solution side is usually measured directly, or the amount of probe molecules on the probe molecule solution side is measured. It will be.
  • This measurement is performed by detecting a characteristic signal attached to a probe molecule with a sensor, and in particular, using a molecule to which a fluorescent functional group is introduced as a probe molecule to impart fluorescence, It is advantageous to track the intensity to determine the change in diffusivity of the resulting complex.
  • a probe molecule a molecule introduced with an electrochemically active functional group is used to obtain a change in the current, or a method of measuring the absorption intensity to a specific ultraviolet light, visible light or infrared light of the probe molecule. Etc. are also available.
  • analysis of the analyte molecule can be performed without chemical modification to obtain a signal specific to the probe molecule.
  • a calibration curve is prepared for the known amount, and then the detection result can be compared with this to quantify the concentration of the sample molecule.
  • the above is the case of measuring the amount of probe molecules diffused to the dust molecule solution side, but if desired, it is not identical to the analyte molecules diffused to the probe molecule solution side.
  • the amount of analyte molecule can also be detected by measuring the complex with the bimolecular.
  • the detection means in the method of the present invention is not particularly limited, and any means may be used as long as the diffusion state of the complex of the probe molecule and the analyte molecule can be known.
  • a syringe in order to feed the solution to the microchannel, for example, a syringe may be connected and it may be carried out manually, but it is possible to use a mechanical means such as a syringe pump etc. It is advantageous to carry out while controlling the fluid pressure etc.
  • the sample molecule solution and the probe molecule solution are simultaneously fed to the microchannel, and after passing through the channel for a certain distance, the detection operation is performed.
  • the detection operation is performed.
  • the detection site is irradiated with light from a laser or other excitation light source, and the intensity of the fluorescence emitted therefrom is measured. The stronger the fluorescence from the sample solution side, the greater the amount of probe molecule present, which is reflected in the strength of the interaction between the probe molecule and the sample. In this way, the presence or absence of the target sample can be known.
  • the analyte DNA fragment solution and the fluorescent functional group-introduced DNA fragment solution as a probe are sent to the microchannel.
  • the sample solution side is irradiated with excitation light such as laser light. If there is no or weak fluorescence emitted from it, it is judged that there is no sequence complementarity between the probe DNA fragment and the sample DNA fragment. Conversely, if the fluorescence detected there is strong, it is judged that there is sequence complementarity between the probe DNA fragment and the sample DNA fragment.
  • a DNA-binding peptide (a peptide having a structure similar to DNA and having higher sequence recognition ability than DNA) or LNA (ribose ring 2 'and 5 of DNA) Analysis with higher accuracy can be performed by using 'linked position' and high sequence recognition ability).
  • PNA is also soluble in organic solvents, and by using the sample as an aqueous solution and dissolving the probe PNA in the organic solvent, the diffusion of the sample to the probe solution side can be suppressed. It will be possible to conduct more accurate analysis.
  • Example 1 As the microphone opening flow path, a 30 ⁇ m wide and 30 mm long acryl resin plate was cut with a 30 ⁇ m wide channel with 20 ⁇ m wide by a micro drill. The thing was used.
  • Example 1 As the microphone opening flow path, a 30 ⁇ m wide and 30 mm long acryl resin plate was cut with a 30 ⁇ m wide channel with 20 ⁇ m wide by a micro drill. The thing was used.
  • a DNA fragment is prepared by introducing the fluorescent substance fluorescein into the 5 'end represented by the structural formula F-(5')-AGGCTGCTCCCCCGCGTGGGCC-(3 ') (where F is full reactin) did.
  • sample 1 structural formula (5 ')-GGCCACGCGGGGAGCAGCCT-(3') (hereinafter referred to as sample 1) and structural formula (5 ')-(3') (hereinafter referred to as sample 2)
  • sample 2 structural formula (5 ')-(3')
  • a total of four types of solutions were prepared, including solutions of these three types of DNA fragments and solutions containing no DNA fragments (hereinafter referred to as blank solutions).
  • the solution has a solution composition of 1 pmol / ⁇ M DNA, 5 mM phosphate buffer (pH 7.0) and 50 mM sodium chloride.
  • Three combinations of the probe DNA solution and the sample 1 solution, the probe DNA solution and the sample 2 solution, and the probe DNA solution and the blank solution were fed to the microchannel at a flow rate of 2 ⁇ / min.
  • a DNA fragment having a 5 'end introduced with a full-length receptor at the 5' end represented by the structural formula F-(5 ')-AGGCTGCTCCCCCGCGTGGCCC-(3') (where F is full-length receipt), 1 1 ⁇ 1 / ⁇ l, 500 fmol / ⁇ , 300 fmol / ⁇ , 100 fmol / ⁇ , 5 Ofmol / ⁇ 30 fmol / ⁇ , 10 fmol / ⁇ , 5 ⁇ 1 / ⁇ 31 ⁇ 2 ⁇ 1 / ⁇ 1 fmol / ⁇
  • the mixture of 10 kinds of 5 mM phosphate buffer (PH7.0) containing 5 concentration and 5 OmM sodium chloride aqueous solution is adjusted.
  • the fluorescence light is generated by irradiating the light of wavelength 4 88 nm emitted by the argon gas laser to the probe DNA channel side at the location A in FIG.
  • the relationship between the intensity and the probe DNA concentration was determined.
  • the results are shown in Figure 3 as a graph.
  • FIG. 3 shows the relationship between the average value of fluorescence intensities (relative values) measured 10 times and the probe DNA concentration.
  • the absolute amount of the probe D NA was calculated from the actual volume of the solution to which the laser light was emitted and the concentration of the solution, and the results were also listed in the lower row.
  • concentration of the probe DNA ie, the abundance of the probe DNA
  • the lower limit of detection differs depending on the design of the flow path and the like, but was about 10 amol in this example.
  • the probe-containing solution and the analyte-containing solution are simply transported to the microchannel as a laminar flow without immobilizing on the solid phase carrier, and the concentration of the complex of the probe molecule and the analyte molecule at a predetermined position It is possible to perform qualitative and quantitative analysis of the sample with high accuracy, simply by measuring the degree of diffusion detected as Moreover, since the method of the present invention is carried out by a simple operation, it is possible to minimize the error in the analysis result due to the difference in the level of skill of the workers, and there is no restriction on the molecular species of the applicable sample. It has the advantage of being applicable to a range.

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Abstract

　操作が簡単で、より高い精度が得られる新規な検体分子の分析方法として、検体分子含有溶液と複合体形成用分子含有溶液とを層流を形成させながらマイクロ流路に流し、層流中における検体分子と複合体形成用分子との間で形成される複合体の拡散度の変化を検出し、解析する分析方法を提供する。この方法において複合体形成用分子として、蛍光性を有する分子を用い、蛍光の強度分布により形成された複合体の拡散度の変化を検知する。形成された複合体の拡散度はあらかじめ作成された検量線と対比することにより定量される。

Description

明 細 書 マイク口流路を利用することによる分子分析方法 技術分野
本発明は、 マイクロ流路システムを利用して特定分子の定性又は定量 分析を行う方法に関するものである。 背景技術
遺伝子分野の研究においては、 ヒ トゲノムの配列解読がほぼ終了し、 その成果を基に遺伝子発現、 突然変異、 一塩基多型などに係わる遺伝子 の特定やその機能解析、 さらにそれに伴うタンパク質の構造や機能の解 析に研究の中心が移りつつある。
他方において、 これら一連の研究成果を利用して、 医療面、 福祉面に 役立たせるための技術開発も進められている。
ところで、 このような研究に関連して開発された手法の 1 つに、 生体 分子のような検体分子をそれと複合体を形成する分子 （以下プローブ分 子という） との間の相互作用を利用して検出する方法がある。 この方法 は、 固相担体上に固定されたプローブ分子が生体分子と特異的な相互作 用により形成する複合体を、 あらかじめラベルしておいた蛍光物質ゃ電 気化学活性物質の発する信号により検出して生体分子の存在を定性的に 検知したり、 その定量を行うものである。
そして、 この際の生体物質の検出方法としては、 これまでに例えば、 電気化学反応を利用する方法 [「アナリティカル · ケミス ト リ一 （Anal. Chemjj, 第 72巻， 第 1334〜1341ページ （2000)]、 水晶振動子を利用す る方法 [「ジャーナル'才ブ ' ジ ■ アメリカン · ケミカル · ソサエティ (J. Am. Chem. Soc. )j, 第 114巻， 第 8299〜8300ページ （1992)]、 表面 プラズモン共鳴を利用する方法 （シュプリンガ一 · フエアラーク東京株 式会社， 1998年発行， 永田， 半田共著， 「生体物質相互作用のリアル夕 ィム解析実験法」） などが知られている。
これらは、 いずれも金表面に核酸断片やタンパク質などをプローブ分 子として固定し、 それと特異的な相互作用をもつ生体物質又はその関連 物質を結合させ、 その際に生じる電気化学的応答、 水晶振動子の振動数 変化、 表面プラズモンによる屈折率変化を検知し、 分析するものである, しかしながら、 これらの方法において高い精度で定量分析を行うには. 固相担体上に固定するプローブ分子の厳密な制御が必要とされるが、 固 相担体上へのプローブ分子の固定効率の不均一性、 低再現性、 固液界面 での物質拡散挙動の複雑性及び検体分子を作用させる際の作業者の熟練 度の不足などにより、 限界を生じるのを避けられなかった。
その他、 プローブ分子又は検体分子のいずれも固相担体に固定する必 要のない手法もいくつか知られている。 このような方法としては、 例え ばポリメラ—ゼ連鎖反応 （PCR) を利用する方法 [「プロシ一デイ ング ズ ' 才ブ ' ザ ' ナショナル ' ァカデミー ' 才ブ ' サィェンシズ ' 才ブ - ザ - ユナイテッ ド · ステイツ - 才ブ， アメリカ （Proc. Natl . Acad. Sci. USA)」， 第 94巻， 第 10756ページ （ 1997)]、 モレキュラービーコン を利用する方法 [「アナリティカル · ケミス ト リ一 （Ana Chem. )j, 第 72巻， 第 747A〜753Aページ （2000)] などがある。
しかしながら、 P C R反応を利用する方法は、 その P C R反応自体が 指数関数的に増幅される反応であるため、 精度の高い定量を行うことは 原理的にむずかしい。
また、 モレキュラービーコンを利用する方法、 すなわち蛍光部位と消 光部位をプローブ D N Aの両末端に導入したものは、 被検分子との複合 体形成前は、 自己相補配列をとるために折れ曲がって蛍光が消光するが. 複合体形成後はプローブ分子により発光する性質を有することを利用し て分析する方法である。
しかしながら、 この方法を行うには、 プローブ D N Aの配列設計に制 限がある上に、 D N Aやその他の核酸の分析にしか適用できないという 欠点がある。 発明の開示
本発明は、 このような事情のもとで、 従来の固相担体に検体分子又は プローブ分子を固定して分析する方法がもつ欠点を克服し、 操作が簡単 で、 より高い精度が得られる新規な検体分子、 例えば生体物質の分析方 法を提供することを目的としてなされたものである。
本発明者らは、 プローブ分子と検体分子との複合化を利用して、 検体 分子の定性、 定量分析を行う方法について鋭意研究を重ねた結果、 プロ —ブ分子含有溶液と検体分子含有溶液とをマイクロ流路に流した場合、 その両者が層流を形成し、 たがいに混ざり合わない性質を有すること、 したがって、 両者の選択的相互作用の強弱によって、 拡散度の差異を検 出することにより固相担体への固定なしに、 しかも高い精度で生体分子 のような検体分子を分析しうることを見出し、 この知見に基づいて本発 明をなすに至った。
すなわち、 本発明は、 検体分子含有溶液と複合体形成用分子含有溶液 とを層流を形成させながらマイクロ流路に流し、 層流中における検体分 子と複合体形成用分子との間で形成される複合体の拡散度の変化を検出 し、 解析することを特徴とする分析方法、 この方法において複合体形成 用分子として、 蛍光性を有する分子を用い、 蛍光度の強弱により形成さ れた複合体の拡散度の変化を検知する方法、 及び形成された複合体の拡 散度をあらかじめ形成された検量線と対比することにより検体分子の濃 度を定量する方法を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明方法で用いるマイク口流路の 1例を示す平面図である, 図 2は、 実施例 1 の結果を示す棒グラフである。 図 3は、 実施例 2におけるプローブ D N A濃度とその蛍光強度との関 係を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明方法は、 マイクロ流路にプローブ分子含有溶液と検体分子含有 溶液とを層流を形成させながら同時に流し、 流れる間に両者の間の特異 的相互作用により形成される複合体の各層流への拡散度が、 その複合化 の強弱によって変化するのを、 プローブ分子の発する信号により検知し. その結果を解析することにより検体の分析を行うものである。
本発明方法で用いるマイクロ流路は、 不活性材料からなる基板上に設 けられていることが必要である。 この不活性材料とは、 プローブ分子や 検体分子や使用される溶媒及び生成する複合体に対し、 反応性を示さな い材料のことであり、 例えばガラス、 石英、 又はシリカ、 Si ZSi 02、 マ グネシァ、 ジルコニァ、 アルミナ、 ァパタイ ト、 窒化ケィ素、 及びチタ ン、 アルミニウム、 イツ ト リ ウム、 夕ングステンなどの金属の酸化物、 炭化物、 窒化物、 ホウ化物、 ケィ化物などのセラミックスを挙げること ができる。
このほか上記の要件を満たすものである限り、 金属、 プラスチックな ども用いることができる。 このベースの形状としては、 板状体が普通で あるが、 所望ならば弧状体、 球体、 粒体などのものを用いることができ これらの材料は、 選択する手段、 検体及びプローブ分子の種類、 溶媒 に応じて適宜選択されるが、 光学的手段で検出する場合は、 検出部位に おいては使用する光の波長に対し、 十分な透明性を示すものを用いる必 要がある。
本発明におけるマイクロ流路は、 これらの不活性材料からなる基板に, 幅 1 0〜 5 0 0 um、 好ましくは 5 0〜 4 0 0 μιπ、 深さ 1 0〜 5 0 0 μπι, 好ましくは 5 0〜 4 0 Ο μιηのサイズで刻設される。 このマイクロ流路 の長さには特に制限はなく、 使用される不活性材料基板のサイズに依存 するが、 通常 1 0 0〜3 0 0關の範囲で選ばれる。
このようなマイクロ流路は、 例えばマイクロ ドリルのような工作機械 を用いる機械的手段により基板上に刻設するか、 あるいは半導体集積回 路製造などに用いられる光リソグラフィ一技術により溝を形成させた後. 別の基板を接着することにより製造することができる。 このような極細 の流路を流れる流体は、 たがいに可溶な溶媒であっても混ざり合うこと なく、 層流を形成したまま流れていく。 また、 このような極細の流路は. 物質の拡散距離が短いという特徴を有している。
一般にマイクロ流路を流れる 2液の界面では、 溶質は、 溶媒に可溶で あれば、 もう一方の溶液のほうへ自然に拡散していく力 、 プローブ分子 と検体分子との間に特別な相互作用がある場合には、 それらの複合体の 拡散をさらに加速させることができる。
本発明方法は、 この現象を利用した分析方法を提供するものであって. プローブ分子に導入した官能基の発する信号、 もしくはプローブ分子自 体の持つ特異的な特性 （特定波長の光の吸収など）、 もしくは形成され た複合体に選択的に結合する物質の発する信号や特性を検出することで. 自然拡散に上乗せされた余分の拡散量を知ることができ、 その量により , 検体の分析を行うものである。
したがって、 本発明方法は、 プローブ分子と検体分子との間に特異的 な相互作用が生じるような場合において、 一般的に利用することができ る。 例えば、 プローブとして核酸断片を用いれば、 特異的配列を持つ核 酸断片の検出や分析に用いることができる。 例えばプローブとしてタン パク質を用いる場合には、 特定の抗体を検出することができる。 プロテ ァ―ゼ阻害活性を有する各種べプチ ドをプローブと して用いた場合には, 特定の酵素の検出やその活性の評価を行うことができる。 各種糖をプロ —ブとして用いた場合には、 それを特異的に認識する核酸やタンパク質 を検出、 定量することができる。 各種細胞をプローブとして用いた場合 には、 種々の天然又は人工薬剤、 環境物質などの生体への影響をスクリ 一二ングすることができる。
本発明方法では、 これらに限らず、 プローブ分子と検体分子との間に 特異的相互作用を生じるような組合せを選択すれば、 あらゆる化合物の 検出に利用することができる。 また、 上記の例では、 化学的な意味での 単一分子が用いられているが、 これ以外にも細胞などやその他の物質一 般への展開が可能である。
本発明方法におけるプローブ分子と検体分子との間の複合体形成につ いては、 従来の方法のように作業者の熟練を必要とすることはない。 本発明方法では、 プローブ分子と検体分子の複合体形成に関しても、 作業者の熟練度の差による分析結果の不確実性を排除することができる, 従来法では、 例えば核酸断片検出の際のハイブリダィゼーション操作の ような、 プローブ分子と検体分子の複合体形成のための実験操作が必要 となり、 この実験操作における作業者の熟練度の差によってもたらされ る分析結果の不確実性が問題となっていた。
これに対し、 本発明方法では、 注射器などで溶液を流路内に流し込む だけであるため、 熟練度は無関係であり、 シリンジポンプなどの器具を 用いれば、 さらに作業者の熟練度の差を排することができる。
さらに、 本発明方法においては、 プローブ分子の分子数が少なくても. 微小空間内で処理が行われるため、 その濃度を高く保つことができ、 プ ローブ分子の発する特異的な信号の密度を高めることができる。 したが つて、 本発明方法によれば、 高感度の検出を行うことができる。
本発明方法における検出に要する時間は、 送液した溶液が流路を流れ るのに要する時間であるが、 数百 m程度の大きさの極細の流路を流れ るのに要する時間は、 たとえその送液量が少なく とも流路の体積も小さ いため、 本発明方法における検出に要する時間は当然短くなる。 この時 間は、 使用するマイクロ流路の寸法などに左右されるが、 通常数秒以内 である。
本発明方法は、 層流中における検体分子とプロ一ブ分子との間で形成 される複合体の拡散度の変化に基づいて検体分子の定性的又は定量的な 分析を行うものである。 すなわち、 検体分子とプローブ分子との間に親 和性がない場合には、 両者は単に通常の混合挙動に基づく層流間の拡散 度が検出されるだけであるが、 両者の間で親和性を有する場合には、 形 成された複合体を選択的に拡散促進させることができ、 増大された拡散 度として検出される。 したがって、 このような拡散度の違いを対比する ことによって、 プローブ分子に対する検体分子の作用を定性的に知るこ とが可能である。
上記の検出は、 測定しやすいということから、 通常検体分子溶液側へ 拡散するプローブ分子の量を直接測定するか、 あるいはプローブ分子溶 液側のプ口一ブ分子の量を測定することにより行われる。 この測定は、 プローブ分子に付した特徴的な信号をセンサ一で検出することにより行 われるが、 特にプローブ分子として蛍光性官能基を導入して蛍光性を付 与した分子を用い、 その蛍光の強度を追跡して生成する複合体の拡散度 の変化を求めるのが有利である。
そのほか、 プローブ分子として、 電気化学活性官能基を導入した分子 を用い、 その電流の変化を求める方法や、 プローブ分子のもつ特異的な 紫外光、 可視光又は赤外光に対する吸収強度を測定する方法なども利用 可能である。
このようにして、 プローブ分子に特異的な信号を得るための化学修飾 を施すことなく、 検体分子の分析を行うことができる。
また、 複合体の拡散度の測定に先立って、 あらかじめ知られた量につ いて検量線を作成しておき、 次いで検出結果をこれと対比すれば検体分 子の濃度の定量をすることもできる。
以上は、 挨体分子溶液側へ拡散したプローブ分子の量を測定する場合 であるが、 所望ならばプロ一ブ分子溶液側へ拡散した検体分子とプロ一 ブ分子との複合体を測定して、 検体分子の量を検出することもできる。 このように、 本発明方法における検出手段には、 特に制限はなく、 プ ローブ分子と検体分子との複合体の拡散状況が分かる手段であればどの ような手段でもよい。
次に、 本発明方法において、 マイクロ流路に溶液を送液するには、 例 えば注射器を接続し、 手動で行うことも可能であるが、 シリンジポンプ などの機械的手段により送液速度、 送液圧力などを制御しながら行うの が有利である。
例えば、 マイクロ流路に検体分子溶液とプロ—ブ分子溶液を同時に送 液し、 ある一定距離流路を通過した後、 検出操作を行う。 ここでは、 検 体分子溶液とプローブ分子溶液とは少なく とも 1種類ずつ必要であるが. 複数の溶液を同時に流すことにより、 性質の異なる情報を同時に得るこ とも可能である。 この際の検出は、 例えば蛍光法で行う場合、 検出部位 にレーザ一光又はその他の励起光源からの光を照射し、 そこから発せら れる蛍光の強度を測定する。 検体溶液側から出る蛍光が強いほどプロ一 ブ分子の存在量が多いということであり、 すなわちプローブ分子と検体 との相互作用の強さに反映される。 このようにして、 目的の検体の有無 や存在量を知ることができる。
次に、 所定の配列の D N Aの検出を蛍光性官能基を導入したプローブ 分子を用いて行った場合を例として、 具体的に説明する。
すなわち、 検体 D N A断片溶液と、 プローブである蛍光性官能基導入 D N A断片溶液を、 マイクロ流路に送液する。 ある一定距離流路を流れ た後、 サンプル溶液側にレーザ一光などの励起光を照射する。 そこから 発せられる蛍光がないか弱ければ、 プローブ D N A断片と検体 D N A断 片の配列相補性はないものと判断される。 逆にそこで検出される蛍光が 強ければ、 プローブ D N A断片と検体 D N A断片の配列相補性があると 判断される。
この際、 未知試料を検定する前に、 既知試料について蛍光強度と相補 性の度合いを調べておく ことでより正確に分析することができると同時 に、 相補配列を持つ D N A断片の量を定量することができる。
この場合、 プローブ分子としての D N Aに代えて、 D N A結合性ぺプ チド （ D N Aに類似した構造を持つペプチドで、 D N Aよりも配列認識 能が高い） 又は L N A ( D N Aのリボース環 2 '位と 5 '位を連結したも ので配列認識能が高い） を使用することにより、 さらに精度の高い分析 を行うことが可能となる。 また、 P N Aは D N Aとは異なり、 有機溶媒 にも可溶であり、 検体を水溶液とし、 プローブ P N Aを有機溶媒に溶か して使用することにより、 検体のプローブ溶液側への拡散を抑えること ができ、 さらに精度の高い分析を行うことが可能となる。
次に、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれ らの例によりなんら限定されるものではない。
なお、 マイク口流路としては、 図 1 に示すように、 横 7 0關、 縦 3 0 mmのァクリル樹脂板に、 幅 3 6 Ομπκ 深さ 2 0 Ομΐϋのチヤネルをマイ クロ ドリルにより刻設したものを用いた。 実施例 1
プローブ D N Aと して、 構造式 F— (5')— AGGCTGCTCCCCGCGTGGCC— (3') (ただし Fはフル才レセイン） で表わされる 5 '末端に蛍光物質のフ ル才ロセインを導入した D N A断片を調製した。
また、 試料 D N A と して、 構造式（5')— GGCCACGCGGGGAGCAGCCT— (3') (以下、 試料 1 と称する）及び構造式（5')— ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ— (3') (以下、 試料 2と称する） で表わされる 2種類の D Ν Α断片を準備 した。
これら 3種の D N A断片の溶液とともに D N A断片を含まない溶液 (以下、 ブランク溶液と称する） の、 計 4種類の溶液を調製した。 溶液 は、 1 pmol/μΐの D N A、 5 mMリ ン酸緩衝液 （ pH 7 . 0 )、 5 0mM塩化 ナトリゥムの溶液組成である。 これらのプローブ D N A溶液と試料 1 溶液、 プローブ D N A溶液と試 料 2溶液、 プローブ D N A溶液とブランク溶液の、 3つの組合せをマイ クロ流路に送液速度 2 Ομΐ/minで送液した。
次に、 図 1 中の Aの場所における検体流路側にアルゴンガスレーザ— の発する 488nmの光を照射することにより蛍光を発生させ、 その強度 を比較した。 その結果を棒グラフとして図 2に示す。 このグラフは、 1 0回測定した蛍光強度 （任意単位） の平均値であり、 標準偏差の範囲を エラ—パ—にて示した。 プローブ D N A断片と相補的な塩基配列のサン プル 1 の場合のみ、 ほかの 2つの比較対照の場合よりも特に大きな蛍光 応答を得た。 この結果から、 特別な相互作用を持つ分子が、 その相互作 用によって拡散が加速されることを利用して、 分析可能であることが分 る。 その測定結果は、 変動係数にして 3%程度であり、 極めて高い再現 性を示していた。 実施例 2
プローブ D N A溶液として、 構造式 F— (5')— AGGCTGCTCCCCGCGTGGCC -(3') (ただし Fはフル才レセイン） で表わされる 5 '末端にフル才レセ イ ンを導入した D N A断片を、 1 ρπιο1/μ1、 5 0 0 fmol/μΐ . 3 0 0 fmol /μΐ、 1 00 fmol/μΐ , 5 Ofmol/μΚ 3 0 fmol /μΐ、 1 0 fmol /μΐ、 5 ίπιο1/μΚ 3½ο1/μΚ 1 fmol/μΐの濃度を含有する 1 0種類の 5mMリ ン酸緩衝液 （PH7.0 ) と 5 OmM塩化ナ トリ ゥム水溶液との混合液を調
¾ϊした。
別に D Ν Α断片を含まない 5mMリ ン酸緩衝液 （pH7.0 ) と 5 0 mM塩 化ナ卜リゥム水溶液との混合液を調製した。
これらの溶液試料を図 1 に示す形状のマイク口流路にシリンジポンプ により送液速度 2 Ομΐ/minで送液した。
次いで、 図 1 中の Aの場所におけるプローブ D N A流路側にアルゴン ガスレーザ—の発する波長 4 88 nmの光を照射することにより蛍光を生 じさせ、 その強度とプローブ D N A濃度の関係を求めた。 その結果をグ ラフとして図 3に示す。 図 3は、 1 0回測定した蛍光強度 （相対値） の 平均値とプローブ D N A濃度との関係を示したものである。
次に、 レーザ一光の照射される溶液の実体積と溶液の濃度からプロ— ブ D N Aの絶対量を計算し、 下列に併記した。 プローブ D N Aの濃度、 すなわちプローブ D N Aの存在量の増加にしたがって、 得られた蛍光強 度も強くなつており、 両変数の間には高い相関性が認められた。 その検 出下限は、 流路の設計その他により異なるが、 本実施例においては 1 0 amol程度であつた。 産業上の利用可能性
本発明によると、 固相担体に固定することなしに、 単にプローブ含有 溶液と検体含有溶液を層流としてマイクロ流路に送液し、 所定の位置で プローブ分子と検体分子との複合体の濃度として検出される拡散度を測 定するだけで、 高い精度により検体の定性及び定量分析を行うことがで きる。 しかも、 本発明方法は単純な操作で行われるため、 作業者の熟練 度の差による分析結果の誤差を最小限に抑制することができる上、 適用 しうる検体の分子種に制限がなく、 広い範囲に応用することができると いう利点がある。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 検体分子を含有する溶液と、 検体分子との間に複合体を形成し得 るプローブ分子を含有する溶液とを層流が形成されるようにマイクロ流 路に流す工程と、 層流中における、 検体分子とプローブ分子との間に形 成された複合体の拡散度を検出し、 解析する工程を包含する検体分子の 分析方法。
2 . 前記プローブ分子が蛍光を発生し得る分子である請求項 1 に記載 の分析方法。
3 . 前記複合体の拡散度の検出及び解析をあらかじめ作成された検量 線と対比することにより行われる請求項 1 に記載の分析方法。
4 . 特定配列の DMA断片を検体分子として含有する溶液と、 検体分子 との間に複合体を形成し得るプローブ分子を含有する溶液とを層流が形 成されるようにマイクロ流路に流す工程と、 層流中における、 検体分子 とプローブ分子との間に形成された複合体の拡散度を検出し、 解析する 工程を包含する DNA断片の分析方法。
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