WO2004009620A1 - NUEVO PEPTIDO INHIBIDOR DEL INTERCAMBIADOR Na+/H+ (PINHE), Y SUS APLICACIONES - Google Patents

NUEVO PEPTIDO INHIBIDOR DEL INTERCAMBIADOR Na+/H+ (PINHE), Y SUS APLICACIONES Download PDF

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WO2004009620A1
WO2004009620A1 PCT/ES2003/000364 ES0300364W WO2004009620A1 WO 2004009620 A1 WO2004009620 A1 WO 2004009620A1 ES 0300364 W ES0300364 W ES 0300364W WO 2004009620 A1 WO2004009620 A1 WO 2004009620A1
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pinhe
diseases
nhe
peptide
pharmaceutical composition
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PCT/ES2003/000364
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French (fr)
Inventor
Marina Torreblanca Calvo
Juan Luis Lequerica Llopis
Enrique O'connor Blasco
Inmaculada Meseguer Soria
María del Carmen DOLZ IZQUIERDO
Luis Such Belenguer
Manuel Sanchez Angulo
Antonio Alberola Aguilar
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Universidad De Valencia
Universidad Miguel Hernández
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/215—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Halobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention is framed in several sectors, the most important being the Pharmacist where it would have applications as protective treatment of various pathological processes of great importance such as ischemic and reperfusion pathology (regardless of the mechanism of production), arrhythmias, hypertension, etc. It could also be applied as a contraceptive (in male mammals), as an antibiotic and as immunoregulatory agent.
  • ischemic and reperfusion pathology regardless of the mechanism of production
  • arrhythmias in hypertension
  • it could also be applied as a contraceptive (in male mammals), as an antibiotic and as immunoregulatory agent.
  • the Chemical sector as a regulating reagent of the activity of the Na + / H + exchanger.
  • agriculture as a modulator against salt stress.
  • the sodium-proton exchanger (Na + / H + ) (sodium-proton exchanger or NHE), is a mechanism that is present in the membranes of all cell types, both prokaryotic and eukaryotic, and catalyzes an electrocell exchange of intracellular H + by Na + extracellular (Putney et al. 2002, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 527-552; Counillon and Pouyssegur, 2000, J Biol. Chem. 275: 1-4, Orlowsky and Grinstein, 1997, J Biol Chem. 272: 22373-76; Grinstein et al., 1989, Biochim. Biophys. Acta, 988: 73-97,).
  • the NHE exchangers family includes six isoforms (NHE1-NHE6).
  • the NHE1 isoform which is located in the cytoplasmic membrane, is ubiquitously expressed and plays a central role in the regulatory processes of intracellular pH, cell volume and homeostasis (Orlowski J, Grinstein S. 1997. J. Biol. Chem. 272: 22373- 76; Counillon L, Pouysségur J. 2000. J Biol. Chem. 275: 1-4).
  • the NHE2, 3, 4 and 5 exchangers show a limited tissue distribution and a more specialized function.
  • NHE2, 3 and 4 are predominantly expressed in kidney and intestinal tract.
  • NHE2 can act in collaboration with NHE4 which has a basolateral location (Orlowski j, Kandasamy RA, Shull GE. 1992. J Biol. Chem. 267: 9331-39; Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu-Alfa AK et al. 1998. Am J. Physiol. 275: F510-17; Bookstein C, Xie Y et al. ⁇ 991 Am J. Physiol.
  • NHE3 exchanger has been identified in the apical membrane of the proximal renal tubule epithelium (Biemesderfer D, Pizzonia j, et al. 1993. Am J. Physiol. 265: F736-42) and in the microvilli of the mature intestinal epithelium (Hoogerwerf WA , Tsa SC et al. 1996. Am J. Physiol.
  • NHE3 is important in the reabsorption of Na + and HCO 3 ", significantly contributing to the maintenance of osmolarity and blood acid-base balance (Moe OW 1999. J Am Soc Nephrol 10:.... 2412- 25) the NHE5 exchanger is predominantly expressed in the brain (Klanke CA, His YR et al 1995. Genomics 25:....
  • NHE6 is the newest member of the family NHE. This molecule has the sequence most divergent showing only 20% identity with the other isoforms. NHE6 is located exclusively in mitochondria, giving the highest expression in tissues and organs that have high metabolism, such as the heart, brain and skeletal muscle (Numata M, Petrecca K, Lake N, Orloski J. 1998. J Biol. Chem. 273: 6951- 59).
  • NHE The NHE family of genes has been evolutionarily conserved. Genes encoding NHEs have been identified in all kinds of living organisms. In prokaryotic organisms from archaea such as Halobacterium salinarum (Ng WV, Kennedy SP, et al. 2000. Proc, Nat. Acad. Sci. USA. 97: 12176-181) to bacteria such as Streptococcus faecalis (Harold FM, Papineau D. 1972 . J Membr Biol. 8:. 45-62), and Escherichia coli (nhaA and nhaB genes. Padan E, Maisler N, Taglicht D, Karpel R, Schuldiner S. 1989. J. Biol. Chem.
  • NHE genes have also been identified in plants, specifically an NHE5 homologue in Arabidopsis thaliana (Apse MP, Aharon GS, Snedden WA, Blumwald E. 1999. Science. 285: 1256-58) and in Schizosaccharomyces pombe yeasts (sod2 gene , Jia ZP, McCullogh N, Martel R, Hemingsen S, Young PG, 1992. EMBO J.
  • NHE family genes have also been identified in Caenorhabditis elegans (Marra MA, Prasad SS, Baillie DL. 1993. Mol Gen. Genet. 236: 289-98) and in Drosophila melanogaster (Adams MD, Cleniker SE et al. 2000. Science 287: 2185-95), but have not identified the specific isoforms have been characterized and their functions. Finally, NHE genes have been identified in a number of higher organisms such as various vertebrates including humans (Klanke CA, Su YR et al. 1995. Genomics 25: 615-22; and 24), rat (Orlowski j, Kandasamy RA Shull GE 1992.
  • NHE is involved in various physiological and pathological processes of vital importance such as ischemia and reperfusion, diuresis, arterial hypertension, the division of tumor cells, gastric acidity, epithelial transport, activation of macrophages, etc.
  • NHE Newcastle disease virus
  • synthetic compounds such as amiloride (Cragoe EJ Jr, Woltersdorf OW Jr, Bicking JB, Kwong SF, Jones JH. 1967 J Med Chem. Jan; 10 (l): 66-75) and their analogues such as EIPA (Vigne P, Frelin C, Cragoe EJ Jr, Lazdunski M. 1983 Biochem Biophys Res Commun.
  • amiloride inhibits the NHE exchanger but do not do so specifically, while inhibiting other exchangers, such as Na + / Ca ++ and non-specific Na + channels.
  • other exchangers such as Na + / Ca ++ and non-specific Na + channels.
  • amiloride is being used in therapeutics as a diuretic.
  • the number of its side effects is large.
  • amiloride derivatives that have shown a more specific effect on the NHE exchanger, with some exceptions, have the serious drawback of being difficult to reverse. Higher specificity has shown the cariporide and the zoniporide, the latter being in addition to greater power.
  • the apparent affinities of the plasma membrane isoforms for an inhibitor can vary in a range of four orders of magnitude, generally following the order: NHEl> NHE 2 »NHE 3> NHE 4 (Putney et al, 2002, Annu. Rev. Pharmacol Toxicol 42:.. 527-552).
  • mitochondrial NHE is relatively insensitive to amiloride, but is very effectively inhibited by its benzamil analogue (Sastrasinh et al, 1995, Am. J. Phisiol. 268: C1227-34; Brierley et al, Biochemistry, 28: 4347- 54; Kapus et to the, 1988, Biochim Biophys Acta, 944: 383-90).
  • NHE inhibitors have been shown to be effective in decreasing the size of the necrosis zone in experimental myocardial infarction (Gumina et al. 1998 J Pharm. Experim. Therapeutics, 286: 175-183; Miura et al. 1997 .
  • halocin H7 (formerly H6), is the only known substance of biological origin that shows an inhibitory effect specific NHE.
  • Halocin H7 is a protein substance that has been the subject of two previous patents (inventors: I Meseguer Soria, M Torreblanca Calvo, B Soria Escoms, F Colom Valiente and I Alba Carballo. No. of patents: ES 2 094 695 and ES 2 094 696 published both on January 16, 1997, headline: University of Alicante).
  • halocin has a molecular weight of 30,500 + 500 D and is obtained from the culture of the strain CECT 4547 ⁇ protected in the patent: GB 2094695) and extracted using methods of protein purification such as column chromatography concanavalin a chromatography and high pressure ion exchange column.
  • the complete purification process is long, expensive and complex.
  • the most outstanding advantages of halogen H7 over the rest of NHE inhibitors are (as described in patent ES 2 094 696):
  • the PINHE object of this patent, in addition to having all the advantages mentioned above for halogen H7 over the rest of known NHE inhibitors, presents new advantages that allow us to ensure that we are faced with a substance of choice and with greater potential from the point of sight applied.
  • the present invention describes a peptide (PLNHE), derived from halogen H7, of small molecular weight and defined by its amino acid or other analog sequence that acts as a natural physiological inhibitor of the Na + / H + exchanger (NHE) in eukaryotes.
  • PINHE is obtained by fractionation (which includes a precipitation with cold acetone) and purification of the culture supernatant of Haloferax gibbonsii alicante SPH7, which produces it naturally or, on the basis of its amino acid sequence, can be synthesized or be modified and expressed by molecular or genetic engineering techniques.
  • PLNHE is stable and active in wide ranges of saline concentrations, temperature and pH, trypsin resistant and pronase sensitive and can also be lyophilized and reconstituted without loss of activity.
  • the use of said NHE inhibitor peptide, or pharmaceutically acceptable salts thereof, in the manufacture of a pharmaceutical composition constitutes a further object of this invention.
  • the invention provides a peptide small inhibitor size of the Na + / H +, hereinafter peptide NHE inhibitor or PINHE, comprising an amino acid sequence selected from: a) the sequence identified amino acids as SEQ ID NO 1 (PINHE) or a fragment thereof; b) an amino acid sequence analogous to the sequence defined in a)
  • NHE refers to the different forms of NHE present in different prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • analogous is intended to include any amino acid sequence (aás.) That can be isolated or constructed based on aas sequence. shown in SEQ ID NO 1, for example, by introducing aás substitutions., including the insertion of one or more aás., the addition of one or more aás. at either end of the molecule or the deletion of one or more ASA. at either end or inside the sequence. In general, a sequence of years. Analogous is substantially homologous to the aás sequence. I identified as SEQ ID NO 1. In the sense used in this description, the expression “substantially homologous" means that the sequences of ASA.
  • the PINHE peptide of the present invention is synthesized by an extreme halophilic microorganism belonging to the Archaea Domain also known as haloarchaea. Specifically, the PINHE is produced by the "Alicante SPH7" strain of the Haloferax gibbonsii haloarquea, which was deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Research Building, Burjasot Campus, 46100 Burjasot, Valencia , Spain, corresponding to the deposit number CECT 4547.
  • CECT Type Culture Collection
  • haloarchaea produce substances with antagonistic peptide activity against other members of the group. These substances are generically called as halocinas (Rodriguez-V alera F, G Judge, Kushner DJ, 1982, Can J. Microbiol. 28:. 151-154) and so far only been studied a limited number of them (O ' Connor EM, Ind Microbiol Biotechnol Shand RF.J 2002. 28: 23-31). Only the complete sequence of halogen H4 (Cheung j, Danna KJ, O'Connor EM, Price LB, Shand RF.
  • the aás molecule. of the invention is a molecule of aás. strain "Alicante SPH7" of Haloferax gibbonsii of SEQ LD NO 1 (peptide PINHE).
  • the PINHE is a peptide derivative having the halocin H7 all its activity, therefore an important aspect of the invention is the relationship existing between the halocin H7 and PINHE, and how to obtain it reaches starting from the halocin.
  • halocin H7 or PINHE that performed by the inventors and by the time the peptide sequence halocin H7, of which only the amino-terminus is known is unknown.
  • halocin H7 is a monomer with a unique peptide sequence including the sequence of the PINHE or if really a formed dimer of two peptides , one small and hydrophobic responsible for the inhibitory activity of NHE, and another larger and hydrophilic that would act as a means of transport for the PINHE.
  • This second option would be the most logical considering that the treatment to separate the PINHE, with cold acetone, is not too aggressive to break peptide bonds.
  • the way of obtaining the halocin or PINHE has a number of steps in common (production, obtaining the solution without cells, clarification and concentration) to obtain a protein concentrate containing the halocin H7 and then function purification method employed, the halocin or PINHE is obtained.
  • the key step in obtaining one or the other, as already mentioned, is precipitation with acetone.
  • the separation of PLNHE from the rest of the halocin molecule requires that the precipitation with acetone be done cold and for a more or less prolonged time, preferably several hours. Without the treatment of acetone or other to allow separation of the PLNHE, can reach purify halocin H7 using the methods already described (Torreblanca M, Meseguer I, F.
  • PINHE is a peptide derived from halogen H7 that has all its activity, so it follows that PINHE corresponds to the peptide fraction where the activity of halogen H7 resides.
  • the PINHE peptide of the invention derived from the strain "Alicante SPH7" of Haloferax gibbonsii and can be found in similar forms in other species of microorganisms, which may be naturally or otherwise, could also be the result of a transformation process gene by which the transformed organism expresses said NHE inhibitor peptides.
  • the amino acid molecule of the present invention can be isolated, among others, by conventional techniques from protein extracts from microorganisms containing it, or by using monoclonal or polyclonal antibodies prepared by the sequence information aas . provided in this invention.
  • the NHE inhibitor peptide of the invention includes fragments thereof that exhibit said Na + / H + exchanger inhibitory activity and that can be easily identified from the knowledge in the art.
  • Aás molecule. of the present invention it can be expressed generally by genetic engineering techniques that allow recombinant expression of the inhibitory peptide of the present invention using an expression vector, containing a nucleotide sequence coding for SEQ ID NO 1, in a wide range of host cells.
  • said vector comprising expression, the least one DNA sequence coding for the inhibitory peptide of the present invention and the least, a promoter that directs transcription of said nucleotide sequence of interest, which is operably linked, and other sequences necessary or appropriate for transcription and its appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, cutoff sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers), transcriptional silencers (silencers), etc.
  • Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case among plasmids, artificial yeast chromosomes (YACs), artificial bacterial chromosomes (BACs), artificial chromosomes based on bacteriophage Pl (PACs), cosmids or viruses, which may also contain an origin Bacterial or yeast replication so that it can be amplified in bacteria or yeast, as well as a usable marker to select transfected cells different from the gene or genes of interest.
  • This vector can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook, J., Russell DW 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY.).
  • the "artificial synthesis” means the use of physical and chemical synthesis techniques not involving the use of microorganisms or other living creatures to obtain a compound comprised or sequence of the inhibitory peptide of the present invention and having activity inhibitory on NHE.
  • mixed processes means the joint use of methods of biological manipulation and artificial synthesis to obtain a compound that totally or partially contains the sequence of the NHE inhibitor peptide of the present invention and that have inhibitory activity on NHE.
  • pharmaceutically acceptable salts of the NHE inhibitor peptide provided by this invention.
  • pharmaceutically acceptable salts includes the salts usually used to form metal salts or acid addition salts. The nature of the salt is not critical, provided that it is pharmaceutically acceptable. Said salts can be obtained by conventional methods well known to those skilled in the art by reacting the appropriate acid or base with the NHE inhibitor peptide.
  • the NHE inhibitor peptide of the present invention can be part of various types of compositions for application in the body of a mammal, preferably humans.
  • said composition is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention comprises a therapeutically effective amount of an NHE inhibitor peptide together with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the use of said NHE inhibitor peptide, as well as its pharmaceutically acceptable salts, in the preparation of said pharmaceutical composition constitutes another additional object of this invention.
  • compositions containing the inhibitor peptide NHE may be in any form of administration, e.g., solid or liquid, and can be administered by any appropriate route, for example orally, parenterally, rectally or topically, for which they will include the pharmaceutically acceptable excipients necessary for the formulation of the desired administration form.
  • a further object of the present invention is the use of such pharmaceutical compositions in the manufacture of a medicament for the treatment or prophylaxis of mammalian disease, preferably human, caused by hyperactivity or an undesired activity of NHE, such as, among others , cardiovascular diseases (eg hypertension, myocardial infarction, arrhythmias, angina pectoris, etc.), brain diseases (eg cerebral infarction, cerebral edema, embolisms, etc.), kidney diseases (eg renal failure, diabetic nephropathy, etc.), diseases metabolic (diabetes mellitus, hyperlipidemias, etc.), diseases with hypersecretion of hydrochloric acid in the intestinal mucosa, diseases with alterations in epithelial transport, diseases with alterations of cell volume, pathological proliferative processes (eg cancer, tumors, fibrosis, etc. ), and alterations associated with excessive cell activity system i immune (e.g. inflammation, hypersensitivity).
  • cardiovascular diseases eg hypertension,
  • a particular object of the present invention is the use of said pharmaceutical compositions in the preparation of medicaments for the treatment or prophylaxis of pathological processes of mammals, preferably human, that present with ischemia and post-ischemic reperfusion injury due to NHE hyperactivity. .
  • ischemic lesions produced by vascular alterations (both primary and secondary) in tissues belonging to the cardiocirculatory systems (heart and blood and lymphatic vessels), respiratory, digestive, genito-urinary, nervous (central and peripheral) ), musculoskeletal, haematic, endocrine and skin, and in general all the organs attached to the aforementioned systems, ischemic processes by post-infarction reperfusion, ischemic processes after organ and / or tissue transplantation and ischemic processes in physiological situations such as physical exercise, pregnancy, childbirth, menstruation, etc.
  • these pharmaceutical compositions may be administered as prophylaxis of ischemia or hypoxia which occurs during surgery cardiac and vascular (during and after these surgeries) and also as a result of trauma including crushing and destruction of limbs, as well as in any pathology that involves tissue hypoperfusion (hemorrhagic, cardiac, thermal, neurogenic, anaphylactic shock, etc.)
  • Other Particular and additional object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the present invention in the contraception.
  • the estrogen receptor alpha is essential for proper function in individuals of fertile males since its activity is required for maintenance of cytoarchitecture in the efferent ducts and the concentration of sperm in the epididymis head. Zhou et to the.
  • Another particular object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the present invention for their antibiotic activity in the preparation of an antibiotic for the treatment of infectious diseases, among others, infectious diseases caused by microorganisms (eg Helicobacter pylori).
  • Another particular object of the present invention is the use of effective amounts of the compound of the present invention as a modulator of the expression of the Na + / H + in plants had increased overexpression (constitutively or otherwise) of the Na + / H + or the like.
  • vacuolar Na + / H + plants such as patented by Eduardo Blumwald (Overexpression of a Vacuolar Na + / H + antiport in Arabidopsis Apse MP, Aharon GS, Snedden WA, Blumwald E. Science, 1999 Aug 20; 285 (5431): 1256-8.), Or any other, performing the same function, was inhibited by the peptide object of the present invention.
  • the application or not of this inhibitor of the Na + / H + exchanger could modulate the expression of said gene allowing a greater or lesser enzymatic activity of the protein encoded by it.
  • Figure 1 A - SDS polyacrylamide electrophoresis (12%) of a sample containing the
  • Lane 1 standard proteins. Lane 2: Sample containing H7. Staining with silver nitrate.
  • FIG. 3A Optical photomicrograph of untreated Halobacterium salinarum cells (X
  • Figure 3B Optical photomicrograph of Halobacterium salinarum cells treated with
  • FIG. 4 Relationship between the cytometric measurement of the cytoplasmic acidity of 293HEK cells (Ratio) and their intracellular pH.
  • the ratio is the measure of BCECF fluorescence in the cytoplasm expressed as a ratio between orange (FL3) and green (LF1) fluorescence detected by the cytometer.
  • the intracellular pH is the pH of the medium where the permeabilized cells are suspended with nigericin. For this cells (lxlO 5 cells per ml) were incubated at 37 ° C for 15 minutes with DMEM with glucose and without bicarbonate containing in turn 10% FBS, 25 mM HEPES and BCECF 2 ug / ml and whose pH he adjusted with HC1. Intracellular pH was equilibrated with the external by the presence in the middle of 2 ug / ml nigericin. After incubation fluorescence was measured in the cytometer.
  • Figure 5 Recovery of the intracellular pH of cells 293HEK after acidification with sodium propionate.
  • the assay was performed in the presence (right) and absence (left) of 1000 U / ml of the NHE inhibitor peptide as described in Figure 4 but without the presence of nigericin.
  • the ratio is represented and in ordinates the time elapsed in the test (the maximum time outlined in the figure, (1023, is equivalent to 300 seconds).
  • Example 1 Method for obtaining and purifying the PINHE. Compared to the production and purification of halocin H7.
  • the PINHE to the like halocin H7 is obtained from the strain CECT 4547 and following the same culture conditions described in ES 2 Patent 094 695.
  • the cells are removed, concentrated supernatant and dialyzed with distilled water by filtration and tangential ultrafiltration techniques also following the protocol indicated there.
  • halogen H7 showed, which was the purification process, which consisted of several stages in which slow and expensive protein purification techniques were required.
  • A) Preparation of the PLNH ⁇ a culture of the strain producing SPH7 (C ⁇ CT 4547) in a medium containing 2.66 M NaCl, 0.13 M Mg Cl 2 x 6H 2 O, 0.16 M Mg SO 4 is prepared x 7H 2 O, 6.64 mM Cl 2 Ca, 53.3 mM C1K, 1.6 mM CO 3 HNa, 4.48 mM BrNa, supplemented with 0.5% of yeast extract and pH 7.2. Incubate at 37 ° C with aeration until reaching an optical density between 0.9 and 1 at 600 nm. The cells are separated using a tangential flow filtration system with a filter pore size of 0.45 m.
  • halocin H7 From the dialysate concentrate can obtain halocin H7 following procedure other include acetone precipitation.
  • a sample of the concentrate was applied to a hydroxyapatite column in buffer containing 10 mM potassium phosphate, 2.5 M NaCl, pH 7.2 and eluted using a linear gradient of potassium phosphate buffer 10-400 mM, 2.5 M NaCl , pH 7.2.
  • Fractions of 10 ml were collected and a test was performed on each to determine its inhibitory activity. The fractions containing the highest inhibitory activity were concentrated to a final volume of 3 ml.
  • PINHE is a hydrophobic peptide. This is in accordance with the difficulty it has shown to dissolve in water after being lyophilized.
  • the PINHE maintains all its activity in a wide range of saline solutions ranging from distilled water to saturated salt solutions. It also maintains its activity in a wide variety of aqueous solutions, so far no loss of activity has been found for these reasons.
  • PINHE supports a wide pH range of the solvent, being active at least, at pH values between 5 and 9.
  • Proteases such as trypsin do not affect you, however it is sensitive to other enzymes such as pronase.
  • Example 2 Determination of PINHE activity.
  • the activity of PINHE is determined in the same way as that of halogen H7, using the so-called double-layer system containing the indicator strain.
  • solid culture medium such containing the same components is prepared the liquid medium described in Example 1 by adding 2% agar. It is distributed in Petri dishes at 10 ml per plate and allowed to solidify. Tubes are prepared with 5 ml of the same medium that are maintained at 50 ° C to avoid solidification. These tubes are added a microbial suspension containing about 10 6 cells of the strain of Halobacterium salinarum indicator and quickly poured onto the plates prepared above and allowed to solidify also, generating double layer. Serial dilutions are prepared in the sample to be tested PINHE. 10 1 of these dilutions are deposited on the double layer and left at room temperature until completely absorbed. The plates are then incubated at 37 ° C for four days. The maximum dilution of the PINHE showing a detectable inhibition halo is considered to contain 1 arbitrary unit, that is, 100 arbitrary units (AU) per milliliter ( Figure 2).
  • Example 3 Effect on Halobacterium salinarum antibiotic.
  • Example 4 Diuretic and natriuretic effect of PINHE in rats.
  • a group of six Wistar rats was divided into two, three for the control group and three to be treated. This group would be given intraperitoneally a single injection of purified PINHE at a concentration of 125 AU per gram of animal weight.
  • the control group was treated with saline.
  • the animals were placed in individual metabolic cages. After administration of the PINHE, the weight of the animal and the intake of food and water were monitored at 24, 48 and 72 hours after administration. Also it was collected and measured the amount of urine. To monitor the effect of the PINHE upon natriuresis sodium concentration it was determined in the urine of rats.
  • Example 5 Inhibition of the NHE 293HEK cells (primary cell line of human embryonic kidney). 293HEK cells were cultured in DMEM culture medium containing 4 g / 1 glucose and 3.7 g / 1 sodium bicarbonate and supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 1000 U / ml penicillin, streptomycin 1000 ⁇ g / ml, amphotericin 2.5 ⁇ g / ml and gentamicin 50 ⁇ g / ml. Culturing was carried out at 37 ° C and in atmosphere of 5% CO 2.
  • the cells were cultured to 80% confluence, then collected by incubation with 0.25-0.12% trypsin) and 0.01-0.03% EDTA and centrifugation at 300g for 10 minutes and the precipitate was resuspended in DMEM medium without bicarbonate, containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 25 mM Hepes. count was performed the number of live cells using a hemocytometer and a vital dye (trypan blue dye). The cell suspension was kept on ice until assay.
  • FBS fetal bovine serum
  • the inhibitory effect of the PLNHE on NHE of 293HEK cells was performed by assaying with a flow cytometer, measuring the recovery of the intracellular pH after acidification with propionic acid 1M (pH 7-7.5) in the presence or absence (control) of PINHE.
  • the assay contained: lxlO 5 cells / ml, 10% FBS, 2 ug / ml BCECF (2 *, 7-bis (carboxyethyl) -5,6 carboxyfluoresceina) and 1-2 ml of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) with glucose and without bicarbonate, 10% FBS and 25mM Hepes.
  • PINHE was incubated at 37 ° C for 10 minutes and the corresponding tubes were added at the desired concentrations between 0 and 3000 U / ml and incubated until intracellular pH stabilization (5-30 minutes).
  • the BCECF fluorescence - measured as a ratio between green (FL1) and orange (FL3) fluorescence emissions was measured in a cytometer (EPICS XL-MCL) - and then acidified by adding NaOH neutralized propionic acid to pH 7 - 7.5 of a stock solution until a desired intracellular acidification is achieved from 7.2 to 6.4, then the fluorescence measurement of BCECF is continued.
  • the ratio of fluorescence of BCECF and internal pH of 293HEK cells was performed in parallel experiments balancing the external pH (different using pH in solution assay) with internal pH, to which was added to the test solution 2 mg / ml of nigericin to permeabilize cells to protons in the extracellular medium.

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Abstract

La presente invención describe un péptido (PINHE) constituido por 28 aminoácidos obtenido por fraccionamiento y purificación del sobrenadante del cultivo de Haloferax gibbonsii alicante SPH7. El PINHE actúa como inhibidor fisiológico natural del intercambiador Na+/H+ en eucariotas. Es activo en rangos amplios de concentraciones salinas, temperatura y pH, resistente a tripsina y sensible a pronasa. De su acción reversible sobre el intercambiador Na+/H+ se deriva: (1) su uso para el tratamiento o profilaxis de patologías como enfermedades cardiovasculares, renales, cerebrales, metabólicas, procesos proliferativos patológicos, hiperproducción de ácido clorhídrico, etc., (2) en otras enfermedades o patologías que cursen con isquemia y lesión por reperfusión post-isquémica debida a la hiperactividad del NHE como isquemias por alteraciones vasculares primarias o secundarias en diversos tejidos, por reperfusión post-infarto, por transplante de órganos o tejidos, etc. También como contraceptivo (en mamíferos macho), antibiótico o agente inmunorregulador, y en plantas como modulador del estrés salino.

Description

TITULO
NUEVO PEPTIDO INHIBIDOR DEL INTERCAMBIADO!* Na+Η* (PINHE), Y SUS
APLICACIONES
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuadra en varios sectores, siendo el más importante el Farmacéutico donde tendría aplicaciones como tratamiento protector de diversos procesos patológicos de gran trascendencia tales como la patología isquémica y por reperfusión (independientemente del mecanismo de producción), arritmias, hipertensión, etc. También podría aplicarse como contraceptivo (en mamíferos macho), como antibiótico y como agente inmunorregulador. En el sector Químico, como reactivo regulador de la actividad del intercambiador de Na+/H+ . Y potencialmente en el Agrícola, como modulador frente al estrés salino.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El intercambiador sodio-protón (Na+/H+) (sodium-proton exchanger ó NHE), es un mecanismo que está presente en las membranas de todos los tipos celulares, tanto procariotas como eucariotas, y cataliza un intercambio electroneutro de H+ intracelular por Na+ extracelular (Putney et al. 2002, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 527-552; Counillon and Pouyssegur, 2000, J Biol. Chem. 275: 1-4, Orlowsky and Grinstein, 1997, J Biol. Chem. 272: 22373-76; Grinstein et al, 1989, Biochim. Biophys. Acta, 988: 73-97,). Se sabe desde hace años que participa a nivel celular en procesos vitales que dependen del intercambio iónico transmembranal tales como homeostasis, pH intracelular, volumen celular, adhesión, determinación de la forma, migración y proliferación (Motáis et al. 1991. Biochim Biophys Acta, 1075 (2) : 169-180; Maidurna et al, 1993, Br J Cáncer, 61 (2): 297-303; Harguindey y Craoge 1992. Med Hypotheses, 39 (3): 229-237; Putney et al. 2002, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 527-552).
La familia de los intercambiadores NHE incluye seis isoformas (NHE1-NHE6). La isoforma NHE1, que se localiza en la membrana citoplasmática se expresa ubicuamente y juega un papel central en los procesos reguladores del pH intracelular, volumen celular y homeostasis (Orlowski J, Grinstein S. 1997. J. Biol. Chem. 272: 22373-76; Counillon L, Pouysségur j. 2000. J Biol. Chem. 275: 1-4). En contraste, los intercambiadores NHE2, 3, 4 y 5 muestran una distribución tisular limitada y una función más especializada. Así NHE2, 3 y 4 se expresan predominantemente en el riñon y en el tracto intestinal. En esos lugares, la localización celular de NHE2 es apical, e interviene principalmente en la reabsorción de iones Na+ (Tse CM, Levine SA et al. 1993. J Biol. Chem. 268: 11917-24). NHE2 puede actuar en colaboración con NHE4 que tiene una localización basolateral (Orlowski j, Kandasamy RA, Shull GE. 1992. J Biol. Chem. 267: 9331-39; Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu-Alfa AK et al. 1998. Am J. Physiol. 275: F510-17; Bookstein C, Xie Y et al. \991Am J. Physiol. 273: C1496- 505; Bai L, Collins JF, Muller YL, Xu H, Kiela PR, Ghishan FK, . 1999. Am J. Physiollll: Rl 112-19) para promover la osmoregulación de las células medulares internas renales. El intercambiador NHE3 se ha identificado en la membrana apical del epitelio del túbulo renal proximal (Biemesderfer D, Pizzonia j, et al. 1993. Am J. Physiol. 265: F736-42 ) y en las microvellosidades del epitelio intestinal maduro (Hoogerwerf WA, Tsa SC et al. 1996. Am J. Physiol. 270: G29-41; Bookstein C, DePaoli AM, et al. 1994. J. Clin. Investig. 93: 106-13). En el riñon, el NHE3 es importante en la reabsorción de Na+ y HCO3 ", contribuyendo significativamente al mantenimiento de la osmolaridad sanguínea y el balance ácido-base (Moe OW. 1999. J Am. Soc. Nephrol. 10: 2412-25). El intercambiador NHE5 se expresa predominantemente en el cerebro (Klanke CA, Su YR et al. 1995. Genomics 25: 615- 22; Baird NR, Orlowski j et al. 1999. J Biol: Chem. 21 A: 4377-82) y se piensa que regula el pH intracelular en neuronas (Raley-Susman KM, Cragoe EJ, Saplosky RM, Kopito RR. 1991. J Biol. Chem. 266: 2739-45). NHE6 es el miembro más reciente de la familia NHE. Esta molécula presenta la secuencia más divergente mostrando únicamente un 20 % de identidad con las otras isoformas. NHE6 se localiza exclusivamente en las mitocondrias, dándose la mayor expresión en los tejidos y órganos que presentan un metabolismo elevado, como son el corazón, cerebro y el músculo esquelético (Numata M, Petrecca K, Lake N, Orloski J. 1998. J Biol. Chem. 273: 6951-59).
La familia de genes NHE se ha conservado evolutivamente. Se han identificado genes que codifican para NHEs en toda clase de organismos vivos. En organismos procariotas desde arqueas como Halobacterium salinarum (Ng WV, Kennedy SP, et al. 2000. Proc, Nat. Acad. Sci. USA. 97: 12176-181) a las bacterias como Streptococcus faecalis (Harold FM, Papineau D. 1972. J Membr. Biol. 8: 45-62) y Escherichia coli (genes nhaA y nhaB. Padan E, Maisler N, Taglicht D, Karpel R, Schuldiner S. 1989. J. Biol. Chem. 264: 20297-302), donde estos intercambiadores son electrogénicos y muestran muy poca homología con los NHE de organismos superiores. También se han identificado genes NHE en plantas, en concreto un homólogo de NHE5 en Arabidopsis thaliana (Apse MP, Aharon GS, Snedden WA, Blumwald E. 1999. Science. 285: 1256- 58) y en las levaduras Schizosaccharomyces pombe (gen sod2, Jia ZP, McCullogh N, Martel R, Hemingsen S, Young PG, 1992. EMBO J. 11: 1631-40) y Saccharomyces cerevisae (genes nhxl, nha2, Nass R, Cunningham KW, Rao R. 1997. J Biol. Chem. 272: 26145-52; Numata M, Petrecca K, Lake N, Orloski j. 1998. J Biol. Chem. 273: 6951-59). El producto del gen nhxl, la proteína Nhxlp, se localiza predominantemente en un compartimento prevacuolar y es importante en el proceso de tráfico endocítico (Bowers K, Levi BP, Patel FI, Stevens TH. 2000. Mol. Biol. Cell. 11 : 4277-94). También se han identificado genes de la familia NHE en Caenorhabditis elegans (Marra MA, Prasad SS, Baillie DL. 1993. Mol Gen. Genet. 236: 289-98) y en Drosophila melanogaster (Adams MD, Cleniker SE et al. 2000. Science 287: 2185-95), aunque no se han identificado las isoformas específicas ni se han caracterizado sus funciones. Finalmente, se han identificado genes NHE en un número de organismos superiores tales como diversos vertebrados incluyendo a los humanos (Klanke CA, Su YR et al. 1995. Genomics 25: 615-22; y 24), rata (Orlowski j, Kandasamy RA, Shull GE. 1992. J Biol. Chem. 267: 9331-39; Collins JF, Honda T, et al. 1993. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 3938-42), ratón (Praetorius j. Andreasen D, Jensen BL, Ainsworth MA, Friis UG, johansen T. 2000. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278: G197-206), cerdo (Reilly RF, Hildebrandt F, et al. 1991. Am J. Physiol. 261: F1088- 94), Xenopus laevis (Busch S, Rosskopf D, Lang H-J, Weichert A, Siffert W. 1998. Pflugers Arch-Eur: J. Physiol. 436: 828-33), y en trucha (Borgese F, Sardet C,
Cappadoro M, Pouyséegur J., Motays R. 1992. Proc Nat. Acad. Sci. USA 89: 6765-69).
Recientemente, se ha determinado que el NHE también funciona como un anclaje de membrana para el citoesqueleto a través de actina y que esta función es independiente de la translocación de iones (Putney et al. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 527-552, 2002). Este carácter del NHE junto con los efectos sobre la regulación del pH intracelular, la homeostasis y el volumen celular, indican que el NHE regula un gran número de actividades celulares que incluyen adhesión, determinación de la forma, migración y proliferación. La actividad normal del NHE es por tanto de importancia vital para la célula (Pouyssegur et al. 1984. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 4833-37; Kapus et al, 1994 J Biol. Chem. 269: 23544-52; Delvaux et al 1990, Am. J. Physiol. 259: G842-49. Horvat et al. 1992, Eur. J Cáncer 29a: 132-37; Ritter et al, 1998. Br. J. Pharmacol. 124: 627-38).
Sin embargo, hay situaciones en las que existe un proceso anormal de hiperactividad del NHE que conducen a un proceso patológico. Desde el punto de vista tisular el NHE está implicado en diversos procesos fisiológicos y patológicos de vital importancia como la isquemia y por reperfusión, la diuresis, la hipertensión arterial, la división de las células tumorales, la acidez gástrica, el transporte epitelial, la activación de los macrófagos, etc (Rodríguez-Soriano 2000, Pediatr. Nephrol., 14: 1121-36; Sastrasinh et al 1995, Am. J. Phisiol. 268: C1227-34; Szabó et al, 2000 J. Biol. Chem. 275: 6302-7; Cournillon et al, 1993, Mol. Pharmacol. 44: 1041-45; Scholz et al, 1995, Cardiovasc. Res. 29: 260-68; Scholz et al. 1999, J Thromb. Thrombolysis, 8: 61-70,. Rolfe et al. 1992. Am J Respir. Cell. Mol. Biol. 6 (6): 576-582) han señalado que el NHE participa en la liberación de citokinas por parte de los macrófagos que tiene lugar en los procesos de activación inmunitaria. Asimismo, la actividad del NHE está aumentada en la hipertensión esencial en el humano y en los modelos animales de hipertensión (Canessa et al, 1991, Hypertension. 17 (3): 340-348; Rosskopf et al. 1993. Hypertension, 21 (5): 607-617). En patologías asociadas a la colesterolemia se describe un incremento de actividad del intercambiador NHE o un aumento del número de ellos en las células (Scholz W.; Albus U.; Linz W.; Schólkens BA. 1991. Effect of Na*/H* exchance inhibition in cardiac ischaemia. Ewr Herat J. 12 (Suppl.), 124 (Abstr.)). La asociación frecuente diabetes-hipertensión tendría como mecanismo común el aumento de la actividad de dicho intercambiador. La inhibición del intercambiador puede mejorar la resistencia a la insulina (Dudeya et al. 1992 Kidney Int. 42 (5): 1184-1190; Dudeja PK et al. 1991 J. Clin. Invest. 87 (5): 1755-1762; Dusing et al. 1993 Clin. Invest. 71 (2): 119-125). Por último, el NHΕ participaría en los procesos de reperfusión tras un periodo de isquemia. Durante la reperfusión del miocardio se produce un gradiente de H+ debido al aumento de pH extracelular frente al intracelular por efecto de lavado. Como consecuencia, se produce una acumulación de Na+ intracelular, que fuerza al intercambiador Na'VCa"1"1" a operar en sentido inverso, y se produce un aumento del Ca** citosólico hasta niveles tóxicos que conducen a la muerte celular. La utilización de un buen bloqueador del intercambiador Na+/H+ puede mejorar dicho cuadro.
El tratamiento de todos estos procesos patológicos mencionados anteriormente podría verse mejorado en caso de disponer de un buen inhibidor del NHE. En la actualidad no se dispone de inhibidores fisiológicos de origen natural específicos del intercambiador NHE. Los NHE son inhibidos por compuestos sintéticos como el amiloride (Cragoe EJ Jr, Woltersdorf OW Jr, Bicking JB, Kwong SF, Jones JH. 1967 J Med Chem. Jan;10 (l):66-75) y sus análogos como el EIPA (Vigne P, Frelin C, Cragoe EJ Jr, Lazdunski M. 1983 Biochem Biophys Res Commun. 14;116(l):86-90) y los derivados de la benzoil guanidina como el cariporide (HOE 642) (Scholz, W., Albus, U., Counillon, L., Gógelein, H., Lang, H.J., Linz, W., Weichert, A. y Schδlkens 1995 B.A. Cardiovas. Res.; 29: 260-268; Hoechst AG, Cardiovascular Research H 821, 65926 Frankfurt/Main, Germany: Scholz, W., Albus, U., Gógelein, H., Lang, H.J., Linz, W., Weichert, A. y Schδlkens, B.A.; Centre de Biochimie, Université de Nice - Sophia Antipolis, Pare Valrose, Nice, France: L Counillon), el HOE 694 (Counillon, L., Scholz, W., Lang, H.J., Pouyssegur, 1993. J. Mol Pharmacol. Nov; 44(5):1041-5; Scholz, W., Albus, U., Lang, H.J., Linz, W., Martorana, P.A., Englert, H.C. y Schólkens, B.A. 1.993. Br. J. Pharmacol. 109(2): 562-568; Hoechst AG, Cardiovasc Research H 821, 65926 Frankfurt/Main, Germany: Scholz, W., Albus, U., Gógelein, H., Lang, H.J., Linz, W., Weichert, A. y Schδlkens, B.A), EMD 85131 (Baumgarth, M., Beier, N. y Gericke, R. 1.997.J Med. Chem. 40: 2017-2034) y otros como el zoniporide (Guzman-Perez, A., Wester, R.T., Alien, M.C., Brown, JA., Buchholz, A.R., Cook, E.R., Day, W.W., Hamanaka, E.S., Kennedy, S.P., Knight, D.R., Kowalczyk, P.J., Marala, R.B., Mularski, C.J., Novomisle, W.A., Ruggeri, R.B., Tracey, W.R. y Hill, R.J. 2001. Bioorg Med Chem Lett. Mar 26;ll(6):803-7).
Algunas de estas sustancias como el amiloride, inhiben el intercambiador NHE pero no lo hacen de forma específica, inhibiendo a la vez otros intercambiadores, como el Na+/Ca++ y los canales inespecíficos de Na+. A pesar de estas limitaciones el amiloride se está utilizando en terapéutica como diurético. No obstante, es grande el número de sus efectos secundarios. Por otra parte, algunos derivados de amiloride que han mostrado un efecto más específico sobre el intercambiador NHE, salvo alguna excepción, tienen el grave inconveniente de ser difíciles de revertir. Mayor especificidad han mostrado el cariporide y el zoniporide, siendo éste ultimo además de mayor potencia.
La sensibilidad a todos estos fármacos varía enormemente entre las isoformas del NHE (Yu et al, 1993. J Biol. Chem., 268: 25536-41; Cournillon et al, 1993, Mol. Pharmacol. 44: 1041-45; Cournillon et al, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 4508- 12; Scholz et al, 1995, Cardiovasc. Res. 29: 260-68; Scholz et al, 1999, J. Thromb. Thrombolysis, 8: 61-70; Baumgarth et al, 1997, J. Medicinal Chem. 40: 2017-34). Las afinidades aparentes de las isoformas de la membrana plasmática por un inhibidor puede variar en un rango de cuatro ordenes de magnitud, generalmente siguiendo el orden: NHEl > NHE 2 » NHE 3 > NHE 4 (Putney et al, 2002, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 527-552). En contraste, el NHE mitocondrial es relativamente insensible al amiloride, pero es inhibido muy efectivamente por su análogo benzamil (Sastrasinh et al, 1995, Am. J. Phisiol. 268: C1227-34; Brierley et al, Biochemistry, 28: 4347-54; Kapus et al, 1988, Biochim Biophys Acta, 944: 383-90). Otros agentes farmacológicos como la cimetidina, clonidina, y harmalina también exhiben diferentes afinidades por las isoformas del NHE. Sin embargo, estos compuestos, que no están relacionados químicamente con el amiloride o el cariporide, poseen una parte imidazólica o guanidínica que puede explicar alguna similitud estructural (Orlowski and Grinstein. 1997. J Biol. Chem. 272: 22373-22376,). Algunos de los inhibidores del NHE han mostrado ser efectivos en la disminución del tamaño de la zona de necrosis en el infarto de miocardio experimental (Gumina et al. 1998 J Pharm. Experim. Therapeutics , 286: 175-183; Miura et al. 1997. J Am. Coll. Cardiol. 29: 693-701; Munch-Ellingsen et al. 1998. Mol. Cell Biochem.186: 13-18; Otani et al. 2000. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27: 387-393). Algunos de ellos son objeto de patentes internacionales (p.e. WO0183470
"Sodium-hydrogen exchanger type 1 inhibitor", publicada el 8 de Noviembre de 2001, titulares: Chen Weichao George, Cox Eric David, PFIZER PROD LNC, Guzmán Pérez Ángel; Patente US6348476 "Pharmaceutical combination preparation of an inhibitor of the sodium/hydrogen exchanger and a medicament for the treatment of cardiovascular diseases").
Frente a estas sustancias de origen sintético, hasta la fecha, halocina H7 (antes H6), es la única sustancia conocida de origen biológico que muestra un efecto inhibidor específico del NHE. La halocina H7 es una sustancia proteica que ha sido objeto de dos patentes previas (inventores: I Meseguer Soria, M Torreblanca Calvo, B Soria Escoms, F Colom Valiente e I Alba Carballo . N° de patentes: ES 2 094 695 y ES 2 094 696 publicadas ambas el 16 de enero de 1997, titular: Universidad de Alicante). Dicha halocina tiene un peso molecular de 30.500 + 500 D y se obtiene a partir del cultivo de la cepa CECT 4547 {protegida en la patente: ES 2 094 695) y se extrae utilizando procedimientos de purificación de proteínas tales como la cromatografía en columna con concanavalina A y la cromatografía de alta presión con columna de intercambio iónico. El proceso completo de purificación es largo, costoso y complejo. Las ventajas más destacables de la halocina H7 frente al resto de inhibidores del NHE son (como se describen en la patente ES 2 094 696):
Al ser un producto de naturaleza peptídica tiene reversibilidad de acción terapéutica y la facilidad para metabolizarse propia de las sustancias proteicas. - Es una sustancia natural de tipo antibiótico, su poder microbicida está basado en su acción inhibidora del intercambiador sodio-protón. Es un inhibidor específico, activo a concentraciones muy bajas lo que disminuye los efectos secundarios.
Puede operar en un gran rango de concentraciones de sales, temperatura y pH, lo que le convierte en el fármaco de elección en determinados procesos. - Es resistente a la acción de la tripsina, lo que permite su utilización en el tracto intestinal.
Al tratarse de un péptido sensible a pronasa su efecto puede terminarse cuando se desee.
La importancia de disponer de inhibidores del intercambiador sodio-protón (NHE), reside en las consecuencias que se derivan de la actividad de este mecanismo en diversos procesos patológicos. A excepción de la halocina H7, no se conoce ningún producto natural y/o de naturaleza peptídica capaz de inhibir el NHE. A pesar de que la halocina H7 ya presentaba una serie de ventajas respecto a los inhibidores de tipo sintético, la gran desventaja que podríamos destacar frente a ellos es que el proceso de obtención y purificación es demasiado largo, complejo y caro, y, además, que al tratarse de una proteína de 30.5 kD, podría inducir respuesta inmunitaria.
El PINHE, objeto de esta patente, además de poseer todas las ventajas mencionadas anteriormente para la halocina H7 respecto al resto de inhibidores del NHE conocidos, presenta nuevas ventajas que permiten asegurar que nos encontramos ante una sustancia de elección y con mayor potencial desde el punto de vista aplicado.
Las principales ventajas que ofrece el PLNHE respecto a la halocina H7 son:
- Es un péptido de pequeño tamaño, con un peso molecular 11 veces menor que el de la Halocina H7, lo que podría implicar un menor riesgo de capacidad antigénica.
- Mayor facilidad de manipulación.
Aunque se obtiene a partir del cultivo del mismo microorganismo, tiene un proceso de purificación mucho más rápido, fácil y económico. Por lo que respecta a la actividad del PINHE, al igual que la halocina H7, inhibe de forma específica el NHE.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve
La presente invención describe un péptido (PLNHE), derivado de la halocina H7, de pequeño peso molecular y definido por su secuencia de aminoácidos u otra análoga que actúa como inhibidor fisiológico natural del intercambiador Na+/H+ (NHE) en eucariotas. El PINHE se obtiene por fraccionamiento (que incluye una precipitación con acetona en frío) y purificación del sobrenadante del cultivo de la haloarquea Haloferax gibbonsii alicante SPH7 que lo produce de forma natural o bien, sobre la base de su secuencia de aminoácidos, puede sintetizarse o modificarse y expresarse por técnicas moleculares o de ingeniería genética. El PLNHE es estable y activo en rangos amplios de concentraciones salinas, temperatura y pH, resistente a tripsina y sensible a pronasa y también puede ser liofilizado y reconstituido sin pérdida de actividad. El empleo de dicho péptido inhibidor de NHE, o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la elaboración de una composición farmacéutica constituye otro objeto adicional de esta invención. De su acción reversible como inhibidor del intercambiador Na+/H+ de eucariotas tanto del péptido como de sus sales se deriva sus usos: (1) para el tratamiento o profilaxis de patologías en mamíferos, preferente humanos, ocasionados por una hiperactividad o una actividad indeseada del NHE, tales como enfermedades cardiovasculares (p.e. hipertensión, infarto de miocardio, arritmias, angina de pecho, etc.), enfermedades cerebrales (p.e. infarto cerebral, edema cerebral, embolias, etc.), enfermedades renales (p.e. fallo renal), enfermedades metabólicas (p.e. diabetes mellitus, hiperlipidemias, etc.), enfermedades con hiperproducción de ácido clorhídrico de la mucosa gástrica, enfermedades con alteraciones en el transporte epitelial, enfermedades con alteraciones del volumen celular, procesos proliferativos patológicos (p.e. cáncer, tumores, fibrosis, etc.), y alteraciones asociadas a una actividad excesiva de células del sistema inmunitario (p.e. inflamación, hipersensibilidad) y también su uso en (2) otras enfermedades o patologías que cursen con isquemia y lesión por reperfusión post-isquémica debida a la hiperactividad del NHE, entre otros: isquemias por alteraciones vasculares primarias o secundarias en diversos tejidos y órganos anexos, por reperfusión post-infarto, por transplante de órganos o tejidos, por cirugía cardíaca y vascular, por isquemia en situaciones fisiológicas tales como ejercicio físico, embarazo, parto, menstruación, etc., por traumatismos, o cualquier patología que implique hipoperfusión tisular (choque hemorrágico, térmico, neurogénico, etc.) y en cualquier proceso quirúrgico en general. Otros usos, derivados de su actividad, son como contraceptivo (en mamíferos macho), antibiótico o agente inmunorregulador y en otro campo como modulador del estrés salino en plantas.
Descripción detallada
La invención proporciona un péptido de pequeño tamaño inhibidor del intercambiador Na+/H+, en adelante péptido inhibidor de NHE o PINHE, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: a) la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO 1 (PINHE) o un fragmento de la misma; y b) una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia definida en a)
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "NHE" se refiere a las distintas formas de NHE presentes en distintos organismos procariotas o eucariotas.
En el sentido utilizado en esta invención, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de aminoácidos (aás.) que pueda ser aislada o construida en base a la secuencia de aás. mostrada en la SEQ ID NO 1, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de aás., incluyendo la inserción de uno o más aás., la adición de uno o más aás. en cualquiera de los extremos de la molécula o la delección de uno o más aás. en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia de aás. análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de aás. identificada como la SEQ ID NO 1. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de aás. en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de aá., de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. El péptido PINHE de la presente invención es sintetizado por un microorganismo halófilo extremo perteneciente al Dominio Archaea también conocidos como haloarqueas. En concreto, el PINHE es producido por la cepa "alicante SPH7" de la haloarquea Haloferax gibbonsii, que fue depositad en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot, Valencia, España, correspondiéndole el número de depósito CECT 4547.
. La práctica totalidad de las haloarqueas producen sustancias peptídicas con actividad antagónica frente a otros miembros del grupo. Estas sustancias son denominadas genéricamente como halocinas (Rodriguez-V alera F, Juez G, Kushner DJ, 1982, Can. J. Microbiol. 28: 151-154) y hasta el momento solo se han estudiado un reducido número de ellas (O'Connor EM, Shand RF.J Ind Microbiol Biotechnol. 2002 28:23-31). Sólo se conoce la secuencia completa de la halocina H4 (Cheung j, Danna KJ, O'Connor EM, Price LB, Shand RF. 1997 J Bacteriol.il 9: 548-51 ) y de la halocina S8 (Price LB, Shand RF. 2000. J. Bacteriol. 182: 4951-8). Con relación al mecanismo de acción, únicamente se conoce el de la halocina H7 (antes H6, Meseguer I, Torreblanca M, Konishi T. 1995. J. Biol. Chem. 270: 6450-5) de la que deriva el PINHE objeto de esta invención.
Dada la amplia actividad antagónica de las haloarqueas y la fragilidad de estos microorganismos ante una inhibición de su intercambiador NHE, este constituye una diana perfecta para un mecanismo de competencia o antagonismo en la lucha por la supervivencia poblacional. Es por tanto más que probable que, entre la amplia gama de halocinas, puedan encontrarse péptidos homólogos al PINHE que pueden estar o no, de forma natural.
En una realización particular, la molécula de aás. de la invención es una molécula de aás. de la cepa "alicante SPH7" de Haloferax gibbonsii de SEQ LD NO 1 (péptido PINHE). El PINHE es un péptido derivado de la halocina H7 que posee toda su actividad, por ello un aspecto importante de la invención es la relación existente entre la halocina H7 y el PINHE, y cómo se llega a obtener éste partiendo de la halocina. En la actualidad no existen más estudios sobre la halocina H7 o el PINHE que los realizados por los inventores y por el momento se desconoce la secuencia peptídica de la halocina H7, de la que únicamente se conoce el extremo amino terminal. También sabemos que las células excretan al medio una sustancia inhibidora del NHE en forma de halocina H7 y que el PINHE, como tal, no se detecta en el medio. Se sabe que el PLNHE de algún modo forma parte de la halocina H7, sin embargo, se desconoce si la halocina H7 es un monómero con una secuencia peptídica única que incluye la secuencia del PINHE o si se trata realmente de un dímero formado por dos péptidos, uno pequeño e hidrofóbico responsable de la actividad inhibidora del NHE, y otro de mayor tamaño e hidrofílico que actuaría como medio de transporte para el PINHE. Esta segunda opción sería la mas lógica teniendo en cuenta que el tratamiento para separar el PINHE, con acetona en frío, no es demasiado agresivo como para romper enlaces peptídicos. Cualquiera que sea el caso, la forma de obtención de la halocina o el PINHE tiene una serie de pasos en común (producción, obtención de la solución sin células, clarificación y concentración) hasta obtener un concentrado proteico que contiene la halocina H7 y luego en función del procedimiento de purificación empleado, se obtiene la halocina o el PINHE. El paso clave para la obtención de una u otro, como ya se ha mencionado, es la precipitación con acetona. La separación del PLNHE del resto de la molécula de halocina, requiere que la precipitación con acetona se haga en frío y durante un tiempo más o menos prolongado, preferiblemente varias horas. Sin el tratamiento de la acetona, u otro que permita la separación del PLNHE, se puede llegar a purificar la halocina H7 utilizando los procedimientos ya descritos (Torreblanca M, Meseguer I, Rodriguez-V alera F. 1989, J. Gen. Microbiol. 135: 2655-2661). El PINHE es un péptido derivado de la halocina H7 que posee toda su actividad, por lo que se deduce que el PINHE se corresponde con la fracción peptídica en donde reside la actividad de la halocina H7.
El péptido PINHE de la invención procede de la cepa "alicante SPH7" de Haloferax gibbonsii y puede encontrarse en formas parecidas en otras especies de microorganismos, donde pueden estar de forma natural o en otro caso, también podrían estar como resultado de un proceso de transformación génica por el que el organismo transformado exprese dichos péptidos inhibidores de NHE. La molécula aminoacídica de la presente invención puede ser aislada, entre otros, mediante técnicas convencionales, a partir de extractos proteicos de microorganismos que la contengan, o mediante el empleo de anticuerpos mono- o policlonales, preparados gracias a la información de la secuencia de aás. proporcionada en esta invención.
El péptido inhibidor del NHE de la invención incluye los fragmentos del mismo que presentan dicha actividad inhibidora del intercambiador Na+/H+ y que pueden ser fácilmente identificados a partir de los conocimientos existentes en el sector de la técnica.
La molécula de aás. de la presente invención puede ser expresada, en general, mediante técnicas de ingeniería genética que permitan la expresión recombinante del péptido inhibidor de la presente invención mediante la utilización de un vector de expresión, que contenga una secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEQ ID NO 1, en una amplia gama de células huésped. En general, dicho vector de expresión comprende, al menos, una secuencia de ADN codificante del péptido inhibidor de la presente invención y, al menos, un promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs), cromosomas artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en el bacteriófago Pl (PACs), cósmidos o virus, que pueden contener, además, un origen bacteriano o de levadura de replicación para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de interés. Este vector puede ser obtenido por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambroook, J., Russell DW 2001 Molecular Cloning: A laboratory manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor NY.).
La "síntesis artificial" significa la utilización de técnicas físico-químicas de síntesis que no impliquen la utilización de microorganismos u otros seres vivos para la obtención de un compuesto que contenga total o parcialmente la secuencia del péptido inhibidor de la presente invención y que tenga actividad inhibitoria sobre el NHE.
El término "procedimientos mixtos" tal como se utiliza en la presente invención significa la utilización conjunta de procedimientos de manipulación biológica y síntesis artificial para la obtención de un compuesto que contenga total o parcialmente la secuencia del péptido inhibidor de NHE de la presente invención y que tenga actividad inhibitoria sobre el NHE.
Dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido inhibidor de NHE proporcionado por esta invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables" incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es crítica, siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el ácido o la base apropiados con el péptido inhibidor de NHE.
El péptido inhibidor de NHE de la presente invención, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden formar parte de diversos tipos de composiciones para su aplicación en el cuerpo de un mamífero, preferiblemente el ser humano. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido inhibidor de NHE junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. El empleo de dicho péptido inhibidor de NHE, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, en la elaboración de dicha composición farmacéutica constituye otro objeto adicional de esta invención. Las composiciones farmacéuticas que contienen el péptido inhibidor de NHE pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada.
Un objeto adicional de la presente invención es el empleo de dichas composiciones farmacéuticas en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de procesos patológicos de mamíferos, preferiblemente humanos, ocasionados por una hiperactividad o una actividad indeseada del NHE, tales como, entre otros, enfermedades cardiovasculares (p.e. hipertensión, infarto de miocardio, arritmias, angina de pecho, etc.), enfermedades cerebrales (p.e. infarto cerebral, edema cerebral, embolias, etc), enfermedades renales (p.e. fallo renal, nefropatía diabética, etc), enfermedades metabólicas (diabetes mellitus, hiperlipidemias, etc), enfermedades con hipersecreción de ácido clorhídrico en la mucosa intestinal, enfermedades con alteraciones en el transporte epitelial, enfermedades con alteraciones del volumen celular, procesos proliferativos patológicos .(p.e. cáncer, tumores, fíbrosis, etc.), y alteraciones asociadas a una actividad excesiva de células del sistema inmunitario (p.e. inflamación, hipersensibilidad).
Un objeto particular de la presente invención es el empleo de dichas composiciones farmacéuticas en la elaboración de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de procesos patológicos de mamíferos, preferiblemente humanos, que cursen con isquemia y lesión por reperfusión post-isquémica debida a la hiperactividad del NHE. Entre estos procesos patológicos se incluyen como destacables las lesiones isquémicas producidas por alteraciones vasculares (tanto primarias como secundarias) en tejidos pertenecientes a los sistemas cardiocirculatorio (corazón y vasos sanguíneos y linfáticos), respiratorio, digestivo, genito-urinario, nervioso (central y periférico), musculoesquelético, hemático, endocrino y piel, y en general todos los órganos anexos a los sistemas anteriormente mencionados, procesos isquémicos por reperfusión postinfarto, procesos isquémicos tras trasplante de órganos y/o tejidos y procesos isquémicos en situaciones fisiológicas tales como ejercicio físico, embarazo, parto, menstruación, etc. Por otro lado, estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse como profilaxis de la isquemia o hipoxia que tiene lugar durante la cirugía cardiaca y vascular (durante y posteriormente a dichas cirugías) y también como consecuencia de traumatismos incluyendo síndrome de aplastamiento y destrucción de miembros, así como en cualquier patología que implique hipoperfusión tisular (choque hemorrágico, cardiaco, térmico, neurogénico, anafiláctico, etc) Otro objeto particular y adicional de la presente invención es el empleo de la composición farmacéutica de la presente invención en la contracepció. El receptor alpha estrogénico es esencial para una adecuada función fértil en individuos del sexo masculino ya que su actividad es necesaria para el mantenimiento de la citoarquitectura en los conductos eferentes y para la concentración de esperma en la cabeza del epidídimo. Zhou et al. (PNAS 2001;98(24):14132-14137) han mostrado que el receptor alpha estrogénico es responsable de la expresión de una isoforma del intercambiador sodio-protón (Na+/H+) en los túbulos eferentes del sistema reproductor en ratones machos, y por tanto, influye en la reabsorción de sodio y transporte pasivo de agua, efectos éstos, necesarios para la concentración de esperma. Asimismo, estos autores sugieren que la interferencia en la función de este sistema intercambiador sodio-protón (Na+/H+), sería capaz de producir infertilidad en los machos, sin alterar la síntesis de testoterona y por tanto los efectos fisiológicos de ésta, tales como el mantenimiento de la libido. Así pues, la aplicación a la contracepción resultaría de excepcional importancia, entre otras situaciones, por la reversibilidad de efectos del citado compuesto.
Otro objeto particular de la presente invención es el empleo de la composición farmacéutica de la presente invención por su actividad antibiótica en la elaboración de un antibiótico para el tratamiento de enfermedades infecciosas, entre otras, las enfermedades infecciosas provocadas por microorganismos (p.e. Helicobacter pylori). Otro objeto particular de la presente invención es el empleo de cantidades efectivas del compuesto de la presente invención como modulador de la expresión del intercambiador Na+/H+ en plantas que tuvieran una sobreexpresión incrementada (constitutiva o no) del intercambiador Na+/H+ u otros similares. En los esfuerzos que se realizan para disponer de plantas tolerantes a la sal, podría servir para modular la expresión del intercambiador vacuolar Na+/H+ de plantas como el patentado por Eduardo Blumwald (Overexpression of a Vacuolar Na+/H+ Antiport in Arabidopsis. Apse MP, Aharon GS, Snedden WA, Blumwald E. Science. 1999 Aug 20;285(5431): 1256-8.), o cualquier otro, que realizando la misma función, fuera inhibido por el péptido objeto de la presente invención. En este sentido, la aplicación o no de este inhibidor del intercambiador Na+/H+ podría modular la expresión de dicho gen permitiendo una mayor o menor actividad enzimática de la proteína codificada por el mismo. Ello significaría que en condiciones en las que no existiera un exceso de CINa, la planta que sobreexpresara el transportador podría tener menores efectos indeseables (o carecer de ellos). Tales efectos indeseables se podrían producir, por ejemplo, por una excesiva acidificación del citoplasma. Aunque el intercambiador Na+/H+ utiliza Na+, no se puede descartar que una presencia elevada de este enzima pueda utilizar otros cationes, extruyendo protones al citoplasma. La utilización comercial podría residir en la adición de este inhibidor en cantidades controladas a plantas que tuvieran una expresión incrementada (constitutiva o no) del intercambiador de Na+ H+ vacuolar arriba mencionado o enzimas similares.
DESCRIPCIONES DE LAS FIGURAS
Figura 1 A - Electroforésis en SDS poliacrilamida (12%) de una muestra conteniendo el
PLNHE tras su purificación con acetona. Calle 1 y 2: Proteínas patrón. Calle 3: Muestra conteniendo el PINHE. Tinción con nitrato de plata.
Figura IB - Electroforésis en SDS-poliacrilamida (12%) de una muestra conteniendo H7 semipurificada en primer lugar por Hidroxiapatito y en segundo lugar por Sephadex
G50. Calle 1: proteínas patrón. Calle 2: Muestra conteniendo H7. Tinción con nitrato de plata.
Figura 1C - Purificación de H7 (antes H6) (figura publicada en Torreblanca M,
Meseguer I, Rodríguez- Valera F. 1989, J. Gen. Microbiol. 135: 2655-2661) Tinción con azul Comassie.
Figura 2. Halos de inhibición mostrando la actividad inhibitoria del PINHE sobre la cepa indicadora en doble capa.
Figura 3A. Microfotografía óptica de células de Halobacterium salinarum sin tratar (X
2000). Figura 3B. Microfotografía óptica de células de Halobacterium salinarum tratadas con
PLNHE (X 2000). Figura 4.- Relación entre la medida citométrica de la acidez citoplasmática de células 293HEK (Ratio) y su pH intracelular. El ratio es la medida de la fluorescencia de BCECF en el citoplasma expresada como cociente entre la fluorescencia naranja (FL3) y verde (LF1) detectadas por el citómetro. El pH intracelular es el pH del medio donde se suspenden las células permeabilizadas con nigericina. Para ello las células (lxlO5 células por mi) se incubaron a 37 °C durante 15 minutos con medio DMEM con glucosa y sin bicarbonato que contenía a su vez FBS 10%, HEPES 25 mM y BCECF 2 μg/ml y cuyo pH se ajustó con HC1. El pH intracelular se equilibró con el externo mediante la presencia en el medio de 2 μg/ml de nigericina. Después de la incubación la fluorescencia se midió en el citómetro.
Figura 5.- Recuperación del pH intracelular de células 293HEK después de una acidificación con propionato sódico. El ensayo se realizó en presencia (derecha) y ausencia (izquierda) de 1000 U/ml del péptido inhibidor de NHE como se ha descrito en la Figura 4 pero sin la presencia de nigericina. En el eje de abscisas se representa el ratio y en ordenadas el tiempo transcurrido en el ensayo (el tiempo máximo reseñado en la figura,( 1023, equivale a 300 segundos).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1: Procedimiento de obtención y purificación del PINHE. Comparación con la obtención y purificación de la halocina H7.
El PINHE al igual que la halocina H7 se obtiene a partir de la cepa CECT 4547 y siguiendo las mismas condiciones de cultivo que se describen en la patente ES 2 094 695. A continuación se eliminan las células, se concentra el sobrenadante y se dializa con agua destilada mediante técnicas de filtración y ultrafiltración tangencial siguiendo también el protocolo que allí se indica. Llegados a este punto, se tropezaba con el principal inconveniente que mostraba la halocina H7 que era el proceso de purificación, que constaba de varias etapas en las que se requerían técnicas lentas y costosas de purificación de proteínas.
A) Obtención del PLNHΕ: Se prepara un cultivo de la cepa productora SPH7 (CΕCT 4547) en un medio que contenga 2,66 M CINa, 0,13 M Cl2Mg x 6H2O, 0,16 M SO4Mg x 7H2O, 6,64 mM Cl2Ca, 53,3 mM C1K, 1,6 mM CO3HNa, 4,48 mM BrNa, suplementado con 0.5% de extracto de levadura y pH de 7,2. Se incuba a 37°C con aireación hasta alcanzar una densidad óptica entre 0,9 y 1 a 600 nm. A continuación se separan las células mediante la utilización de un sistema de filtración tangencial con filtros de tamaño de poro de 0,45 m. Posteriormente se eliminan grandes macromoléculas mediante ultrafiltros de 100.000 Daltons. A continuación, el filtrado se concentra utilizando ultrafiltros de 1000 Daltons. El concentrado se dializa frente a agua destilada y se procede como sigue: Precipitación con tres o más volúmenes de acetona en frío durante 18-24 horas. El PINHE queda en el sobrenadante y se elimina el precipitado que contiene las impurezas por centrifugación. Se toma el sobrenadante y se elimina la acetona (p.e. mediante un rotavapor). Se comprueba el grado de pureza del PLNHE.
Si no se ha alcanzado un grado de pureza satisfactorio (aproximadamente del 90%) se repite de nuevo el proceso.
La determinación del grado de pureza de las muestras que contienen PINHE se realizó mediante análisis en geles de poliacrilamida en SDS (figura 1 A) siguiendo el protocolo descrito por Laemmli (Laemmli UK, 1973. J. Mol. Biol. 80: 575-599). El PINHE así obtenido es susceptible de ser tratado para obtener su secuencia peptídica que se indica en la SEQ ID NO 1. B) Obtención de la halocina H7:
A partir del concentrado dializado, podemos obtener halocina H7 siguiendo otro procedimiento que no incluya la precipitación con acetona. Así una muestra del concentrado se aplicó en una columna de hidroxiapatito en tampón conteniendo fosfato potásico 10 mM, 2'5 M NaCl, pH 7'2 y eluido utilizando un gradiente lineal de tampón fosfato potásico 10 - 400 mM, 2'5 M NaCl, pH 7'2. Se colectaron fracciones de 10 mi y de cada una se realizó un test para determinar su actividad inhibitoria. Las fracciones que contenían la mayor actividad inhibitoria fueron concentradas hasta un volumen final de 3 mi. Posteriormente se dializaron frente a agua destilada y se filtraron utilizando una columna de Sephadex G-50 previamente equilibrada en tampón 0'05 M TRIS / HCl, pH 6'7. Las fracciones de 1 mi se eluyeron en el mismo tampón. Aquellas que contenían la máxima actividad se juntaron y concentraron hasta un volumen de 1 '5 mi. En este punto el grado de la pureza de la muestra se determinó mediante una electro foresis en gel de poliacrilamida en SDS (figura IB) siguiendo el protocolo descrito por Laemmli (Laemmli UK, 1973. J. Mol. Biol. 80: 575-599). Si se desea mayor grado de pureza hay que continuar el proceso utilizando otros métodos adicionales de purificación de proteínas. Utilizando cromatografía de alta presión, como se describe por ejemplo en Torreblanca y colaboradores (Torreblanca et al 1989, J Gen. Microbiol. 135: 2655-2661), se puede alcanzar un buen grado de pureza, si bien el rendimiento del proceso es bajo (la figura 1C se muestra el resultado de este procedimiento de purificación).
Características físico-químicas del PINHE:
Tiene un peso molecular de 2733.8 Daltons calculado por espectrometría de masas que se corresponde con el peso calculado como la suma de los pesos de los aminoácidos que lo componen.
A partir de su secuencia, se deduce que el PINHE es un péptido con carácter hidrofóbico. Esto está en concordancia con la dificultad que ha mostrado para disolverse en agua después de haber sido liofilizado.
Para estudiar otras propiedades físico-químicas, se tomaron muestras de PINHE, se determinó su actividad y se sometió a diversos tratamientos tras los cuales se determinó nuevamente la actividad remanente. Como resultado de ello se determinó lo siguiente: El PINHE es resistente a la desnaturalización térmica, siendo capaz de soportar 100°C durante varios minutos y es necesario un tratamiento de 10 min. a 121°C para destruir totalmente su actividad por calor.
El PINHE mantiene toda su actividad en un amplio rango de soluciones salinas que va desde el agua destilada hasta soluciones saturadas de sales. Asimismo mantiene su actividad en una gran diversidad de soluciones acuosas, no habiéndose encontrado hasta el momento pérdida de actividad por estos motivos en ningún caso.
El PINHE soporta un amplio rango de pH del disolvente, siendo activa al menos, a valores de pH comprendidos entre 5 y 9.
Proteasas como la tripsina no le afectan, sin embargo es sensible a otras enzimas tales como la pronasa.
Es susceptible de liofilización sin pérdida de actividad aunque para la rehidratación posterior requiere previamente disolución en un solvente como el DMSO. Se trata además de una sustancia muy estable, capaz de conservar toda su actividad en soluciones acuosas estériles durante largos períodos de tiempo. De igual modo soporta bien las bajas temperaturas, incluso la congelación, aunque se ha observado una disminución parcial de su actividad tras sucesivas congelaciones y descongelaciones.
Ejemplo 2: Determinación de la actividad del PINHE.
La actividad del PINHE se determina del mismo modo que la de la halocina H7, utilizando el sistema denominado de dobles capas conteniendo la cepa indicadora.
Se prepara un medio de cultivo sólido tal que contiene los mismos componentes que el medio líquido indicado en el ejemplo 1 añadiendo un 2% de agar-agar. Se distribuye en placas Petri a razón de 10 mi por placa y se deja solidificar. Se preparan tubos con 5 mi del mismo medio que se mantienen a 50°C para evitar la solidificación. A estos tubos se les añade una suspensión microbiana conteniendo aproximadamente 106 células de la cepa indicadora de Halobacterium salinarum y rápidamente se vierte sobre las placas antes preparadas y se deja también solidificar, generando así la doble capa. Se preparan diluciones seriadas de la muestra de PINHE a ensayar. De estas diluciones se depositan 10 1 sobre la doble capa y se deja a temperatura ambiente hasta su completa absorción. Posteriormente se incuban las placas a 37°C durante cuatro días. La máxima dilución del PINHE que muestra un halo de inhibición detectable se considera que contiene 1 unidad arbitraria, es decir 100 unidades arbitrarias (UA) por mililitro (Figura 2).
Ejemplo 3: Efecto antibiótico sobre Halobacterium salinarum.
Se ha comprobado que el PINHE al igual que la halocina H7, tiene actividad antibiótica frente a microorganismos del grupo de las haloarchaeas. Estos microorganismos que habitan en ambientes hipersalinos (aprox. 4 M de Na+ en el medio externo frente a 2 M de Na+ intracelular), poseen un NHE unidireccional muy eficiente para sacar este ion del medio intracelular aprovechando la fuerza protón motriz. La inhibición del NHE es letal para estos microorganismos, ya que en un medio donde la concentración de Na+ es tan elevada, si no funciona el NHE, este ion se acumula intracelularmente provocando un desequilibrio osmótico. El agua entra al interior celular, la célula se hincha y finalmente se lisa y muere. Una forma de detectar este efecto letal es por observación al microscopio de las células antes y después del tratamiento.
Para ello se prepara un cultivo de la cepa indicadora de Halobacterium salinarum, se centrifuga y se resuspende en una solución conteniendo la misma concentración de sales del ejemplo 1. Se cuantifican las proteínas y se ajusta hasta alcanzar la concentración de 1 mg de proteínas por mililitro. Se toman fotos de las células utilizando un microscopio de contraste de fases (figura 3A). Se añade PINHE purificado a una concentración final de 640 UA por miligramo de proteina. A distintos intervalos de tiempo se toman muestras para ser fotografiadas al microscopio. A partir de los diez minutos se observa una deformación e hinchazón de las células que aumenta progresivamente con el tiempo hasta producirse la lisis celular. Al cabo de 24 horas solo pueden observarse restos de envolturas celulares, denominados fantasmas (figura 3B).
Ejemplo 4: Efecto diurético y natriurético del PINHE en ratas. Un grupo de 6 ratas wistar se dividió en dos, tres para el grupo control y otras tres para ser tratadas. A este grupo le sería administrada intraperitonealmente una inyección única de PINHE purificado a una concentración de 125 UA por gramo de peso del animal. El grupo control fue tratado con suero salino. Los animales se introdujeron en jaulas metabólicas individuales. Tras la administración del PINHE se controló el peso del animal y la ingesta de alimento y de agua a las 24, 48 y 72 horas de la administración. Asimismo se recogía y medía el volumen de orina. Para controlar el efecto del PINHE sobre la natriuresis se determinó la concentración de sodio en la orina de las ratas. A las 24 horas se observó un incremento del volumen de la orina del orden del 89-98%o y un aumento de la concentración de sodio en la orina del orden del 39-43%) de las ratas tratadas con PINHE respecto a las ratas control, lo cual indica un efecto claramente diurético y natriurético del PINHE. Estos efectos son compatibles con una actividad inhibidora del PINHE sobre el NHE. El mecanismo podría ser una disminución de la tasa de reabsorción tubular. Los efectos indicados revierten de forma espontánea a las 48-72 horas del tratamiento.
Ejemplo 5.- Inhibición del NHE de células 293HEK (línea primaría de células de riñon de embriones humanos). Las células 293HEK se cultivaron en medio de cultivo constituido por DMEM conteniendo 4 g/1 de glucosa y 3.7 g/1 de bicarbonato sódico y suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, penicilina 1000 U/ml, estreptomicina 1000 μg/ml, anfotericina 2.5 μg/ml y gentamicina 50μg/ml. El cultivo se realizó a 37°C y en atmósfera de 5% de CO2. Las células se cultivaron hasta EL 80% de confluencia, entonces se recolectaron mediante incubación con tripsina 0.25-0.12%) y EDTA 0.01- 0.03% y centrifugación a 300g durante 10 minutos y el precipitado se resuspendió en medio DMEM sin bicarbonato, conteniendo 10% de suero fetal bovino (FBS) y 25 mM de Hepes. Se realizó un recuento del número de células vivas utilizando un hemocitómetro y un colorante vital (trypan blue dye). La suspensión celular se conservó en hielo hasta el ensayo. El efecto inhibidor del PLNHE sobre NHE de las células 293HEK se realizó mediante un ensayo con un citómetro de flujo, midiendo la recuperación del pH intracelular después de una acidificación con ácido propiónico 1M (pH 7-7.5) en presencia o ausencia (control) de PINHE. El ensayo contenía: lxlO5 células/ml, 10% de FBS, 2 μg/ml de BCECF (2*,7-bis(carboxyethyl)-5,6- carboxyfluoresceina) y hasta 1-2 mi de medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) con glucosa y sin bicarbonato, 10% FBS y 25mM de Hepes. Se incubó a 37°C durante 10 minutos y a los tubos correspondientes se les añadió PINHE a las concentraciones deseadas entre 0 y 3000 U/ml y se incubó hasta la estabilización del pH intracelular (5 - 30 minutos).
Se midió en un citómetro (EPICS XL-MCL de Beckman-Coulter) la fluorescencia de BCECF - medida como cociente entre las emisiones de fluorescencia verde (FL1) y naranja (FL3) - y a continuación se acidificó añadiendo ácido propiónico neutralizado con NaOH hasta pH 7 - 7.5 de una solución stock hasta conseguir una acidificación intracelular deseada desde 7.2 hasta 6.4, continuándose entonces la medida de fluorescencia de BCECF. La relación entre la fluorescencia de BCECF y pH interno de las células 293HEK se realizó en experimentos paralelos equilibrando el pH externo (utilizando distintos pH en la solución del ensayo) con el pH interno, para lo que se añadió a la solución de ensayo 2 μg/ml de nigericina para permeabilizar las células a los protones del medio extracelular. Un ejemplo de la relación entre la fluorescencia de BCECF - cociente FL3/FL1 - de las células y su pH interno se muestra en la Figura 4. Al producirse la acidificación con propiónico tiene lugar un descenso brusco del pH interno de las células desde valores de equilibrio 7.3-7.6 hasta 7.1-6.4. En este momento la célula pone en marcha sus mecanismos de regulación de pH intracelular para restaurar el pH de equilibrio. Sin embargo, la ausencia de bicarbonato en el medio de ensayo inhabilita al intercambiador bicarbonato/cloruro (CO3H7C1") y además la presencia de Hepes en el medio inhibe el cotransportador NBS por lo que la recuperación del pH intracelular que tiene lugar después de la acidificación se debería casi exclusivamente al intercambiador NHE. En la Figura 5 se muestra un ejemplo de acidificación de células 293HEK en ausencia (control) y en presencia de PINHE (1000 U/ml). La acidificación con propionato sódico produjo una acidificación del citosol de las células desde un pH en el equilibrio de 7.4 hasta un valor de 7.04. Inmediatamente la célula comienza a restablecer el pH intracelular como se pone de manifiesto en la Figura 5, tanto en el caso control como en presencia de PINHE. A partir de los valores experimentales se realizó una estimación de la velocidad inicial de recuperación del pH intracelular sobre la base de un ajuste matemático de los datos experimentales a una curva y la obtención de su derivada a tiempo cero, lo que permite estimar valores iniciales de velocidades de recuperación del pH intracelular de 0.37exp(-2) ΔpH/s para el control y de 0.11exp(-2) ΔpH/s en el caso de la presencia de PINHE. Los resultados demuestran que el PINHE, tras la acidificación del citosol, inhibe la recuperación del pH intracelular debida al intercambiador de Na+/H+.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un péptido inhibidor del intercambiador Na+/H+ caracterizado por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo: la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO 1 o un fragmento de la misma; y una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia definida en a) 2.- Un péptido según la reivindicación 1 caracterizado porque se obtiene, entre otros microorganismos, a partir de la cepa "alicante SPH7" de la haloarquea Haloferax gibbonsii (CECT 4547).
3.- Un péptido según la reivindicación 1 caracterizado porque se obtiene por procedimientos de ingeniería genética que permiten la expresión de dicho péptido, por síntesis artificial o por procedimientos mixtos. A.- Una composición caracterizada porque comprende un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3.
5.- Una composición según la reivindicación 4, caracterizada porque es una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 y, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. 6.- Empleo de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 4 a la 5 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de enfermedades y alteraciones patológicas en mamíferos, preferentemente humanos, ocasionados por una hiperactividad o una actividad indeseada del NHE, tales como, entre otros, enfermedades cardiovasculares (p.e. hipertensión, infarto de miocardio, arritmias, angina de pecho, etc.), enfermedades cerebrales (p.e. infarto cerebral, edema cerebral, embolias, etc), enfermedades renales (p.e. fallo renal), enfermedades metabólicas (diabetes mellitus, hiperlipidemias, etc), enfermedades con hiperproducción de ácido clorhídrico de la mucosa gástrica, enfermedades con alteraciones en el transporte epitelial, enfermedades con alteraciones del volumen celular, procesos proliferativos patológicos (p.e. cáncer, tumores, fibrosis, etc.), y alteraciones asociadas a una actividad excesiva de células del sistema inmunitario (p.e. inflamación, hipersensibilidad).
7.- Empleo de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 4 a la 5 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de enfermedades y alteraciones patológicas en mamíferos, preferentemente humanos, que cursen con isquemia y lesión por reperfusión post-isquémica debida a la hiperactividad del NHE, entre otros, lesiones isquémicas producidas por alteraciones vasculares (tanto primarias como secundarias) en tejidos pertenecientes a los sistemas cardiocirculatorio (corazón y vasos sanguíneos y linfáticos), respiratorio, digestivo, genito-urinario, nervioso (central y periférico), musculoesquelético, hemático, endocrino y piel; así como en general todos los órganos anexos a los sistemas anteriormente mencionados, procesos isquémicos por reperfusión post-infarto, procesos isquémicos tras trasplante de órganos y/o tejidos, isquemia o hipoxia que tiene lugar durante la cirugía cardiaca y vascular, lesiones de tejidos causadas por isquemia en situaciones fisiológicas tales como ejercicio físico, embarazo, parto, menstruación, etc. isquemia o hipoxia como consecuencia de traumatismos incluyendo síndrome de aplastamiento y destrucción de miembros.
Cualquier patología que implique hipo-perfusión tisular (choque hemorrágico, cardiaco, térmico, neurogénico, anafíláctico, etc) 8.- Empleo de una composición farmacéutica según la reivindicación 7 caracterizado porque la composición farmacéutica se administra previamente, durante y posteriormente a cualquier proceso quirúrgico.
9. - Empleo de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 4 a la 5 en la elaboración de un medicamento que pueda ser utilizado como contraceptivo en mamíferos machos, incluyendo humanos.
10.- Empleo de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 4 a la 5 en la elaboración de un antibiótico para el tratamiento de infecciones en mamíferos, preferentemente humanos, entre otras, provocadas por microorganismos como Helicobacter pylori. 11.- Empleo de cantidades efectivas del péptido inhibidor según una de las reivindicaciones 1 a la 3 para modular la expresión del intercambiador Na+/H+ en plantas que tuvieran una sobreexpresión incrementada (constitutiva o no) del intercambiador Na+/H+ u otros similares.
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