WO2004005502A1 - Muerte celular programada como sistema de contención biológica - Google Patents

Muerte celular programada como sistema de contención biológica Download PDF

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WO2004005502A1
WO2004005502A1 PCT/ES2003/000326 ES0300326W WO2004005502A1 WO 2004005502 A1 WO2004005502 A1 WO 2004005502A1 ES 0300326 W ES0300326 W ES 0300326W WO 2004005502 A1 WO2004005502 A1 WO 2004005502A1
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
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    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus

Definitions

  • the invention falls within the Biotechnology Area.
  • This invention relates in general to biological containment systems to prevent the spread of genetically modified microorganisms and, in particular, relates to a system of programmed cell death that is activated under certain conditions.
  • GEMs genetic engineered microorganisms
  • the potential risk involved is mainly due to the unidirectional elimination of such GEMs from their original physical environment (for example, laboratories, fermenters and / or production plants) to the environment where they are released.
  • the levels of safety in the management of GEMs can be increased by combining physical containment measures with biological containment measures, in order to reduce the possibility of survival of the GEMs if they escape from their original physical environment.
  • biological containment systems were based on the use of "safe" cloning vectors (for example, vectors lacking transfection functions) and host bacteria (for example, exotropic mutant hosts for certain nutrients) unable to survive environmental conditions.
  • the recombinant vector encodes a cellular function that induces a "viable but not cultivable” state (VPNC) of those cells whose genes are under the control of a promoter that is only able to express these genes under certain environmental conditions.
  • VPNC viable but not cultivable
  • a homogeneous family of genes encoding protein functions that induce a VPNC state in cells This group includes a toxic protein of low molecular weight and high half-life (a polypeptide of 100 to 130 amino acids) that interacts with another antidote protein, even smaller (polypeptide of 70 to 85 amino acids) and that antagonizes the toxic effect of the first .
  • Antitoxin is a more labile protein and is degraded by a specific bacterial protease (reviewed by Engelberg-Kulka and Glaser, 1999; Gerdes, 2000).
  • the first system described was the Ccd system of plasmid F (reviewed in Gerdes, 2000). The natural function of this system is to stabilize the inheritance of plasmids at least 100 times and mediate the exclusion of competing plasmids (Gerdes et al, 2000; Cooper and Heinemann, 2000).
  • An alternative biological containment strategy includes a broad group of genes that encode protein functions such as bacteriocins (Tan and Riley, 1996), antibiotic resistance determinants (Shaw et al, 1993), virulence determinants (Finlay and Falkow, 1997) , or phosphotransferase / anti-phosphotransferase of Gram-positive bacteria (Meinhart et al, 2002).
  • This last group which has a regulation similar to the group of functions that induce the state of VPNC, is constituted by a toxic protein of phosphotransferase function and of long half-life (from 275 to 295 amino acids) that interacts with a labile protein of an anti-natural nature.
  • a phosphotransferase (85 to 95 amino acids) that antagonizes the toxic effect of the former (antitoxin).
  • Labile antitoxin is degraded by a specific bacterial protease.
  • a phosphotransferase encoded from a plasmid stabilizes in more than 10 6 times the inheritance of both theta and sigma-like replicons, of Gram-positive bacteria in which genes are expressed (Ceglowski et al , 1993a).
  • the phosphotransferase cell death function as defined in this section refers to the cytotoxic peptide, which phosphorylates an essential protein in bacterial duplication, induces cell death and anthoxy phosphotransferase activity that blocks the activity of the toxin .
  • a model of the programmed cell death function of phosphotransferase or ⁇ family of active biological containment factors is the ⁇ operon of plasmid pSM19035 from S. pyogenes, which encodes three genes: ⁇ , ⁇ and ⁇ (Ceglowski et al, 1993b ; de la Hoz et al, 2000, Figure 1).
  • Similar systems are encoded by other members of the same incompatibility group [tncl8, including plasmid pAM ⁇ l and pIP501 (Brantl et al, 1990)] and other less characterized plasmids of Gram-positive bacteria and chromosomally encoded systems (for example, in the genome of S. pneumoniae (Meinhart et al, 2002)).
  • the chromosomal gene SP1051 of S. pneumoniae TIGR4 has been sequenced, it has a sequence identity of 45% and a homology of 65% with the ⁇ gene ( Figure 2).
  • SP1051 is encoded from a bicistronic operon, together with the SP1050 gene that encodes a transcriptional regulator that is homologous to the Cro protein and shows no similarity to ⁇ (Tettelin et al, 2001).
  • the proteins encoded by the SP1050 and SP1051 genes form a very stable complex in vitro, behaving in E. coli as a programmed cell death system (PCD) (Meinhart et al, 2002).
  • PCD programmed cell death system
  • the present invention describes the functional activity of the ⁇ and ⁇ proteins of the ran ⁇ operand of the plasmid pSM19035 as cytotoxin and as an antidote, respectively; the shorter half-life of the antidote ⁇ with respect to cytotoxin ⁇ and the ability of cytotoxin ⁇ to drastically reduce the viability of the microorganisms that express it.
  • This invention shows the use of one or two cytotoxins of the ⁇ family that have functions of programmed cell death as a biological containment system (s), as described below.
  • a biological containment system s
  • the use of such systems opens a new alternative, an extremely effective and versatile biological containment system, in which the frequency of mutants that arise spontaneously and give rise to microorganisms resistant to the lethal effect of these two cytotoxins, would be very low. , implying this that such a biological containment system would be very safe.
  • the present invention describes the use of recombinant expression of cytotoxic polypeptides of the ⁇ family (the protein is derived from the ⁇ gene of plasmid pSM19035, isolated originally from Streptococcus pyogenes or related genes isolated from plasmids of lactic bacteria or from the genome of Streptococcus pneumoniae), which would either eliminate highly genetically modified microorganisms (GEMs) and released into the environment, or drastically released it would limit the function of the GEM organisms to a situation in which they were in clear competitive disadvantage, being thus eliminated from the environment by the natural microfiora of the environment in which these microorganisms were released. Therefore, this system can be defined as an active biological containment system.
  • GEMs highly genetically modified microorganisms
  • the use of the cytotoxic polypeptide ⁇ to carry out the selective and controlled death of microorganisms that have an undesired development is also described.
  • This undesired development refers, for example, to the case of fermenting bacteria that contain a lysogenic profago in their genome, which can be induced and pass into a lithic state.
  • the cytotoxic polypeptide ⁇ would induce the selective death of those cells where the lytic cycle was developed.
  • the use of the cytotoxic polypeptide ⁇ to induce the selective death of those microorganisms that have lost their extrachromosomal element is described, referring to the plasmid that carries the genes of commercial interest in genetically modified organisms.
  • This invention relates to the use in a microbial cell population of an extrachromosomal replicon which carries genes encoding a cytotoxin and its antidote.
  • the method consists of (i) introduction into Gram-positive cells of the extrachromosomal replicon to be confined, containing a gene encoding the ⁇ antidote that, by binding with the cytotoxic peptide ⁇ , would act as an antidote for cytotoxin, (ii) by culturing cells in conditions in which the gene encoding the antidote and cytotoxin are expressed, in the case that a daughter cell does not receive a copy of the extrachromosomal replicon, would die due to the cytotoxic action of the toxin polypeptide, which is maintained in the cell in the absence of the antidote.
  • This invention also mentions systems used to carry out conditional control of the survival of GEMs in the cell population.
  • the method comprises i) the introduction into Gram-positive bacteria of genes encoding the two related cytotoxic peptides ⁇ and which are to be expressed in this cell population, which on the one hand are functionally linked to a gene that exerts a negative control over its expression, and a regulatory and regulating sequence of DNA that allows this control of its expression and (ii) the culture of this cell population under conditions in which both genes, are expressed, resulting in the overproduction of cytotoxic peptides to a phenomenon of PCD of bacteria in the cell population.
  • Another aspect of the invention would involve a specialized method of death on a bacterium within a cell population.
  • This method would involve (i) the insertion by recombination of a plasmid that would carry the genes encoding these cytotoxic peptides, whose expression would be regulated by a bacteriophage-inducible DNA sequence; (ii) these populations would be cultured under conditions that allowed the induction of profagos present in the genome of these cells, so that the expression of these cytotoxic polypeptides ⁇ would induce death in those cells where these replicative phages were present.
  • the present invention describes the use of inas related cytotoxins, which produce an effective and controlled cell death of the GEMs released into the environment, or that limit the GEMs released to a situation in which these would present a significant competitive disadvantage, being able to be eliminated by the natural microflora of the environment in which they are released. Therefore this invention can be defined as an active biological containment factor.
  • This invention also relates to the use of the ⁇ polypeptide in the conditional control of the survival of microbial cells and / or the selective and controlled death of microorganisms undergoing undesirable development. It also refers to the use of related ⁇ polypeptides to carry out a selective death of microorganisms that have lost their extrachromosomal element.
  • the system consists of two components, a otó cytotoxic polypeptide and its corresponding antidote, which by binding with the cytotoxin inhibits its lethal action.
  • a general characteristic of these "killer" systems of a protein nature is that the antidote component, unlike the toxic component, is susceptible to degradation by proteases, leading to a decrease in its intracellular levels.
  • cytotoxic refers not only to the loss of the ability of microbial cells, which contain the gene encoding the toxin, to remain viable (this would be determined by comparing the ability of these cells to spread in a medium in which and under identical environmental conditions, the growth of cells that do not carry this gene has been carried out), but also to the reduction of the replicative capacity of the microbial cells where the expression of ⁇ or a related peptide
  • the expression "microbial cell” includes those Gram positive bacteria with low dG + dC content in their DNA.
  • nucleotide sequences of the cytotoxin ⁇ and the antidote ⁇ located in the plasmid pSM19035 have been deposited in the EMBL database, with the accession number X64695 and the protein sequences are deposited in the PIR database with the numbers of Access S45085 and S45083, respectively, and both sequences are shown in Figure 1.
  • the crystalline structures of the transcriptional regulator ⁇ and the toxin-antidote complex encoded both by plasmid pSM19035, have recently been resolved (Murayama et al, 2001; Meinhart et al, 2002).
  • This invention relates to a system that conditionally controls the survival of a population of recombinant microbial cells, these carrying the two genes encoding the related otó cytotoxic polypeptides, which are functionally fused to a gene whose product binds to a DNA sequence. Adjustable and regulatory - promoter - which is conditionally controlling the expression of these cytotoxic polypeptides.
  • the term "conditionally controls” refers to the fact that the construction carried by these microbial cells allows cytotoxic polypeptides to be expressed under certain pre-determined environmental conditions while, under different conditions, The genes would not express themselves. Therefore, the survival of microbial cells can be default to be carried out under certain conditions.
  • the regulating and regulatory DNA sequence is functionally linked to the 5 'region of the genes encoding cytotoxic polypeptides.
  • this regulatory DNA sequence may be a sequence to which one of the genes encoding these cytotoxins is naturally associated (such as the sequence that carries the binding site of ⁇ ), or it may be a sequence to which these genes are not naturally associated.
  • the DNA sequence that functions to be negatively regulated may consist of a DNA sequence that is directly regulating the expression of these genes at the level of transcription. According to this invention, the survival of microbial cells is therefore controlled by the expression in the carrier cells of these cytotoxic polypeptides ⁇ .
  • the factors that regulate the activity of the promoter as defined above can be selected from a wide variety of factors.
  • the promoter would be regulated by advantageous factors for microorganisms, and in this way the expression of cytotoxic polypeptides would be controlled by the physiological state of the cells, the medium in which the cells are found and / or even by an inducible event from an extrachromosomal element present in the cells.
  • the term "physiological state of the cells” denotes the presence or absence of certain environmental chemicals, such as those found in the fermentation medium in which the cells are propagated, and which may not be present. In a second environment in which these organisms are released, it is also possible that a factor that is required for the survival of the cells, ceases to be in the environment where the cells are located, or that this required factor, is depleted in the environment of the cell, producing the desired effect, that is, that the gene be expressed.
  • the invention is shown as a method that conditionally controls the survival of a recombinant cell population that contains the genes encoding the two cytotoxic peptides ⁇ ,.
  • these genes are functionally linked to an adjustable DNA sequence. which is under the control of another inducible event or phenomenon, this being the one that ultimately controls the expression of the toxin.
  • inducible event or phenomenon refers to factors, among others, that produce changes in the lysogenic state of the profagos present in the bacteria used, which are propagated through fermentative processes. Therefore, gene expression would be under the control of a product encoded by the bacteriophage, allowing cytotoxic polypeptides to be expressed upon activation of the lytic state of the phage.
  • the regulatory DNA sequence may be an isolated promoter of bacterial operons involved in the biosynthesis of amino acids, or of bacterial genes whose transcription is activated at late stages. in the growth phase or early stages of the stationary phase, and that are involved in the synthesis of secondary metabolites, cell differentiation and / or development (sporulation and / or induction of natural competition), or inhibitors that act in certain physiological states of the cell.
  • the regulation of the expression of the genes that encode these cytotoxic peptides consists in the excision by recombination of a DNA sequence that is negatively regulating the gene expression, which would occur as an early event in the induction of the prophage or, the expression would be directly controlled by an early bacteriophage promoter, which in turn would be regulated by a product also encoded by the bacteriophage, constituting what we know as an "inducible event".
  • both the genes encoding the cytotoxic peptides and the genes encoding the antidotes are under the control of the same regulatory sequence, in other cases, it would be advantageous if the genes encoding these cytotoxic peptides were functionally linked to different DNA regulatory sequences, thus allowing their expression to be repressed under the desired conditions.
  • the promoter that in Gram-positive bacteria is regulating the expression of these cytotoxic peptides can also be activated in a second environment in which these microorganisms are located by a chemical present in amounts sufficient to activate the promoter and not be present in the first medium in which the bacteria were initially located.
  • the chemical referred to would rarely have to be found in the environment or in such concentrations that the promoter was not activated.
  • the promoter may have been activated by a change in temperature, such as a decrease in temperature from its first environment (for example, a fermenter), to the medium where they are disseminated.
  • the microbial cells referred to in this invention are cells released to the environment in a controlled manner, for example, to a restricted area of land or limiting the survival in the environment of genetically modified microorganisms whose products would act as active pesticides, such as Bacillus thuringiensis or B. sphaericus.
  • the adjustable promoter can be chemically by the presence or absence of this substance in the medium where these microorganisms are found as explained above.
  • genes that regulate the physiological state of cells are usually regulated by chemical substances (for example, carbon or nitrogen sources, metabolites, amino acids). Such substances should be absent or exert their effect at a concentration that is not present in the natural environment. Also, various temperature conditions or metal ions can be used to control gene expression.
  • This invention relates to the use of a method for confining GEMs within an environmental niche. Basically, this method would consist of i) the introduction into the cell of an extrachromosomal replicon containing the ⁇ and ⁇ genes. The cytotoxic effect of the ⁇ polypeptide is antagonized by the ⁇ antidote, and ii) culture of these cells is carried out under conditions in which both genes are expressed.
  • the cells would be viable since the antidote is always blocking the action of the toxin, however, if one of the daughter cells after the cell division does not receive at least one copy of the extrachromosomal replicon, it dies by action of the cytotoxic polypeptide at be the antidote degraded by cellular proteases, since neither of the two genes is going to be expressed again by loss of the extrachromosomal element.
  • Microbial cells where extrachromosomal replicon is confined and according to the invention include two ⁇ toxins, one from broad-range-host plasmids, isolated from Gram-positive bacteria with low dG + dC content in their DNA (plasmids belonging to the incl8 family, called pSM19035, pAM ⁇ l, p ⁇ ° 501, etc.), and the other belonging to related systems and originating from plasmids originally isolated from S. pneumoniae or to other less known plasmids also belonging to bacteria Gram-positive (Meinhart et al., 2002).
  • this cell could be a bacterium selected from a group of various species of lactic bacteria, Bacillacea spp., Listariaceae spp.
  • This invention also relates to the use of a method of post-segregation stabilization of a plasmid in a population of host microbial cells.
  • the method consists of (i) insertion into the plasmid of the genes that encode the two related cytotoxic polypeptides and the genes that encode the two also related ⁇ polypeptides that will be degraded in the host cell at a rate greater than they are both cytotoxins, and (ii), by culturing this cell population under conditions in which the genes encoding both toxin-antidote complexes are expressed, that daughter cell that does not receive at least one copy of the plasmid of interest, will die as result of faster degradation of both antidote polypeptides.
  • the invention also relates to the use of this method of post-segregation stabilization of the plasmid that carries the genes encoding both cytotoxic polypeptides ⁇ , and which are negatively regulated in the host microbial cell population.
  • This method would limit the survival of a cell population to the first environment where it is found, in which the expression of cytotoxic genes is negatively regulated. The population's survival would, however, be restricted as these cells were transferred to a second environment or when a physical or chemical change took place in the first environment, since both cytotoxic genes would be expressed.
  • the method would include (i) the construction of replicons containing both ⁇ genes, fused to a DNA sequence with a regulatory site and a repressor substance and (ii) when the cells were released into the environment it would reach a degree in the which repressor substance would become a non-functional form, and until a new addition of this chemical substance, cytotoxic polypeptides would be expressed and the programmed cell death process would begin.
  • FIG. 1 Nucleotide sequence of the ⁇ operon of plasmid pSM19035 and amino acid sequences of the peptides derived from the above sequences.
  • A the non-coding DNA strand is shown, that is, the strand equivalent to mRNA is shown.
  • the sequence of aas. deduced (one letter code) is indicated under the nucleotide sequence, with the amino acids aligned with the first nucleotide of each codon and with an asterisk showing the termination codon.
  • B the amino acid sequences of the ⁇ and ⁇ polypeptides are shown.
  • Figure 2 Alignment showing the conserved residues between the R6 protein [SP1051] of S pneumoniae, with a length of 253 amino acids and the ⁇ polypeptide of S. pyogenes with a length of 287 residues. Homology is identified within the first 213 residues, of these 92 are identical (43%) and 142 (66%) similar.
  • Figure 3 The inhibition of continuous expression of the ⁇ complex affects the levels of the ⁇ protein. Lanes 3 to 9 correspond to: 0, 10, 20, 30, 50, 70 and 90 min. In lane 2, cells without plasmid are shown and in 10, the levels of ⁇ and ⁇ at 90 min without adding antibiotic to the cells carrying plasmid pBT233-7.
  • Figure 4 The inhibition of continuous expression of the ⁇ complex affects the viability of the cells.
  • B. subtilis cells carrying plasmids pBT233-2, pBT233-7 or plasmid free were grown in LB medium until reaching the exponential phase of growth. At zero time, 50 ⁇ g / ml of Rif were added to the culture, determining the number of CFU at the different times shown after the antibiotic was added.
  • Full circles correspond to cells that contain plasmid pBT233-2, empty circles are cells that contain plasmid pBT233-7 and empty squares are plasmid-free cells. The data shown corresponds to an experience among several that gave similar results.
  • the effect of the antitoxin is dependent on an open pattern of intact reading of ⁇ and the toxic effect of ⁇ is reversible when the antidote is expressed.
  • the cells were grown with (empty circles) and without (full circles) 1 mM IPTG, which allows ⁇ gene expression. If IPTG is added after the culture is 3 hours without expressing the antidote, no cell death is detected.
  • the black arrow shows the time when IPTG was removed from the culture medium, the empty arrows (from bottom to top) show the points at which IPTG was again added to the crops.
  • the low copy number plasmid pBT233-7 containing the ⁇ operon and polyclonal anti-bodies obtained against these proteins purified to homogeneity was used for this purpose (see Figure 3).
  • wild cells of B. subtilis YB886 carrying the plasmid pBT233-7 were grown in rich medium (Luria broth, LB), until reaching a density of 0.2 x 10 8 cels / ml.
  • RNA polymerase Transcription by RNA polymerase was inhibited by adding a concentration of 50 ⁇ g / ml of rifampin (Rif), aliquots were taken at different time intervals, the proteins were separated by electrophoresis on a polyacrylamide gel in the presence of SDS and life was determined average of the proteins visualizing them by westem blot.
  • Rif rifampin
  • the YB886 wild cells of B. subtilis containing pBT233-7 duplicate every 30 min. until reaching 0.5 to 1.0-10 9 cels / ml and it was found that they had a constant amount of complex ⁇ 2 ⁇ 2 with a ratio ⁇ : ⁇ approaching 1 ( Figure 3, lane 3).
  • Example 2. Demonstration that the product of the ⁇ gene located in the plasmid pSM19035 is a cytotoxin.
  • YB886 cells of B. subtilis that carry the plasmid pBT233-7 that contains the per ⁇ operon or that carry the plasmid pBT233-2 that contains the ⁇ genes were grown in rich medium (LB) until reaching an exponential middle phase. Transcription of RNA polymerase was inhibited by adding to the cells a concentration of 50 ⁇ g / ml of Rif, aliquots were taken at different time intervals and the viability of the cells was determined by plating in non-selective medium.
  • IPTG isopropylthiogalactoside-inducible promoter
  • IPTG was removed from the medium after centrifuging and washing the cells with LB-preheated medium, allowing the cells to continue growing. Samples were collected at different times and plated in LB with and without the addition of a final concentration of IPTG of 1 mM (Figure 3).
  • Figure 3 In the case in which the expression of the ⁇ gene is dependent on IPTG and the expression of ⁇ and ⁇ is under the control of a constitutive promoter in E. coli cells, we observe that under the conditions in which ⁇ is not expressing itself (in the absence of IPTG), the growth of the crop stops. Under these experimental conditions a decrease in viability is observed more than 100,000 times (Figure 5).
  • Example 4 Determination of the frequency of spontaneous occurrence of mutants that are resistant to the toxic effect of the polypeptide ⁇ .
  • YB886 cells of B. subtilis carriers of plasmid pBT322-7 with the ⁇ operon, grew to a density of 0.2 x 10 8 cels / ml in rich medium (LB).
  • RNA polymerase Transcription by RNA polymerase was inhibited by addition in the medium of Rif culture at a concentration of 50 ⁇ g / ml and 90 min later, a decrease in the viability of the cells was observed more than 100,000 times.Of these surviving cells, less than 0.1% were real mutants. These results show that resistance to ⁇ toxicity is a rare phenomenon, based on this result, where we obtain an appearance of mutants less than 10 "8 , we can predict that the appearance of mutants using several related ⁇ cytotoxic polypeptides will be even less likely. E.
  • coli XLl-Blue cells carrying a high copy plasmid, pCB298, containing the ⁇ and ⁇ genes under the control of a constitutive promoter, and a low copy plasmid, pCB297, containing the gene ⁇ under the control of a promoter inducible by IPTG were grown in rich medium (LB) until reaching a density of 0.2 x 10 8 cels / ml.
  • the IPTG was removed from the medium by centrifuging the cells and washing them with preheated LB medium and the cells were allowed to continue growing.

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Abstract

La presente invención se refiere a unas construcciones genéticas que portan genes que codifican una citotoxina, péptido citotóxico ζ y su antídoto ϵ. Esta invención también se refiere al uso de las construcciones para la transformación de microorganismos utilizados en procesos biotecnológicos que requieran un sistema activo de contención biológica, para eliminar microorganismos genéticamente modificados liberados para la mejora de cultivos, protección de plantas y cosechas, limpieza medioambiental, etc.

Description

TÍTULO
MUERTE CELULAR PROGRAMADA COMO SISTEMA DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención se encuadra dentro del Área de Biotecnología. Esta invención se relaciona en general con los sistemas de contención biológica para evitar la diseminación de microorganismos genéticamente modificados y, en particular, se refiere a un sistema de muerte celular programada que se activa en determinadas condiciones.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El uso de nuevos GEMs (genetic engineered microorganisms), los cuales son industrialmente y farmacológicamente útiles, han despertado el interés del público en general. El riesgo potencial involucrado es debido fundamentalmente a la eliminación unidireccional de tales GEMs desde su medio físico original (por ejemplo, laboratorios, fermentadores y/o plantas de producción) al medio ambiente donde son liberados. Los niveles de seguridad en el manejo de los GEMs puede ser incrementado por combinación de medidas de contención física con medidas de contención biológica, para de esta manera reducir la posibilidad de supervivencia de los GEMs si escapan de su medio físico original. Inicialmente, los sistemas de contención biológica estaban basados en el uso de vectores "seguros" de clonado (por ejemplo, vectores que carecen de funciones de transfección) y bacterias hospedadoras (por ejemplo, hospedadores mutantes exotrópicos para determinados nutrientes) incapaces de sobrevivir a las condiciones ambientales.
Recientemente, ha sido desarrollada una estrategia alternativa de contención biológica, en la cual el vector recombinante codifica una función celular que induce un estado "viable pero no cultivable" (VPNC) de aquellas células cuyos genes están bajo el control de un promotor que solo es capaz de expresar estos genes bajo ciertas condiciones ambientales. La incoφoración en la célula hospedador primaria y/o en un entorno físico primario de esta función VPNC y la selección de una secuencia de regulación apropiada, genera un factor de contención biológica activo (Gerdes et al., 1999). Si un mecanismo inducido de regulación de la expresión es seleccionado para este sistema de contención biológica, una población de GEMs conteniendo este sistema, podrá, una vez liberado en el entorno, ser sometido a un estado VPNC, favoreciendo la desaparición de estos organismos.
Existe una familia homogénea de genes codificadores de funciones proteicas que inducen un estado VPNC en las células. Este grupo incluye una proteína tóxica de bajo peso molecular y alta vida media (un polipéptido de 100 a 130 aminoácidos) que interacciona con otra proteína antídoto, aún más pequeña (polipéptido de 70 a 85 aminoácidos) y que antagoniza el efecto tóxico de la primera. La antitoxina es una proteína más lábil y es degradada por una proteasa específica de la bacteria (revisado por Engelberg-Kulka y Glaser, 1999; Gerdes, 2000). El primer sistema descrito fue el sistema Ccd del plásmido F (revisado en Gerdes, 2000). La función natural de este sistema es estabilizar la herencia de plásmidos al menos 100 veces y mediar la exclusión de plásmidos competidores (Gerdes et al, 2000; Cooper y Heinemann, 2000).
Una estrategia alternativa de contención biológica incluye un grupo amplio de genes que codifican funciones proteicas como las bacteriocinas (Tan y Riley, 1996), determinantes de resistencia a antibióticos (Shaw et al, 1993), determinantes de virulencia (Finlay y Falkow, 1997), o fosfotransferasa/anti-fosfotransferasa de bacterias Gram- positivas (Meinhart et al, 2002). Este ultimo grupo, que tiene una regulación similar al grupo de funciones que inducen el estado de VPNC, está constituido por una proteína tóxica de función fosfotransferasa y de larga vida media (de 275 a 295 aminoácidos) que interacciona con una proteína lábil de naturaleza anti-fosfotransferasa (de 85 a 95 aminoácidos) que antagoniza el efecto tóxico de la primera (antitoxina). La antitoxina lábil es degradada por una proteasa bacteriana específica. En este sistema de muerte celular programada, una fosfotransferasa codificada a partir de un plásmido, estabiliza en más de 106 veces la herencia de replicones tanto tipo theta como sigma, de bacterias Gram- positivas en las cuales los genes son expresados (Ceglowski et al, 1993a). La función de muerte celular de la fosfotransferasa como se la define en esta sección se refiere al péptido citotóxico, que al fosforilar una proteína esencial en la duplicación bacteriana, induce la muerte celular y la actividad antifosfotransferasa a la antoxina que bloquea la actividad de la toxina. Un modelo de la función de muerte celular programada de la fosfotransferasa o familia ζ de factores de contención biológica activos es el operón ωεζ del plásmido pSM19035 de S. pyogenes, el cual codifica tres genes: ω, ε and ζ (Ceglowski et al, 1993b; de la Hoz et al, 2000, Figura 1). Sistemas similares son codificados por otros miembros del mismo grupo de incompatibilidad [tncl8, incluyendo el plásmido pAMβl y pIP501 (Brantl et al, 1990)] y otros plásmidos menos caracterizados de bacterias Gram-positivas y sistemas codificados cromosomalmente (por ejemplo, en el genoma de S. pneumoniae (Meinhart et al, 2002)). Recientemente, el gen cromosómico SP1051 de S. pneumoniae TIGR4 ha sido secuenciado, éste presenta una identidad de secuencia del 45 % y una homología del 65 % con el gen ζ (Figura. 2). SP1051 es codificado a partir de un operón bicistrónico, junto con el gen SP1050 que codifica un regulador transcripcional que es homólogo a la proteína Cro y no muestra semejanza con ε (Tettelin et al, 2001). En investigaciones preliminares se ha podido ver que las proteínas codificadas por los genes SP1050 y SP1051 forman in vitro un complejo muy estable, comportándose en E. coli como un sistema de muerte celular programada (PCD) (Meinhart et al, 2002).
La presente invención describe la actividad funcional de las proteínas ζ y ε del operan ωεζ del plásmido pSM19035 como citotoxina y como antídoto, respectivamente; la vida media menor del antídoto ε con respecto a la citotoxina ζ y la capacidad de la citotoxina ζ de reducir drásticamente la viabilidad de los microorganismos que la expresan.
Esta invención muestra el uso de una o dos citotoxinas de la familia ζ que presentan funciones de muerte celular programada como sistema(s) de contención biológica, tal como se describe a continuación. El uso de tales sistemas abre una nueva alternativa, un sistema de contención biológica extremadamente efectivo y versátil, en el cual la frecuencia de mutantes que surgieran de forma espontánea y que dieran lugar a microorganismos resistentes al efecto letal de estas dos citotoxinas, sería muy baja, implicando esto que tal sistema de contención biológica sería muy seguro.
La presente invención describe el uso de la expresión recombinante de polipéptidos citotóxicos de la familia ζ (la proteína procede del gen ζ del plásmido pSM19035, aislado originalmente de Streptococcus pyogenes o genes relacionados aislados de plásmidos de bacterias lácticas o procedente del genoma de Streptococcus pneumoniae), que o bien eliminaría de forma altamente efectiva y de manera controlada los microorganismos genéticamente modificados (GEMs) y liberados al medio ambiente, o bien drásticamente limitaría la función de los organismos GEMs a una situación en la cual se encontraran en clara desventaja competitiva, siendo de esta manera eliminados del medio por la microfiora natural del entorno en el cual estos microorganismos fueron liberados. Por lo tanto, este sistema puede ser definido como un sistema activo de contención biológica.
También se describe el uso del polipéptido citotóxico ζ para llevar a cabo la muerte selectiva y de manera controlada de microorganismos que tienen un desarrollo no deseado. Este desarrollo no deseado se refiere por ejemplo al caso de bacterias fermentadoras que contienen un profago lisogénico en su genoma, el cual puede ser inducido y pasar a un estado lítico. El polipéptido citotóxico ζ induciría la muerte selectiva de aquellas células donde estuviese desarrollado el ciclo lítico. Así mismo, se describe el uso del polipéptitido citotóxico ζ para inducir la muerte selectiva de aquellos microorganismos que han perdido su elemento extracromosómico, refiriéndose éste al plásmido que porta los genes de interés comercial en los organismos genéticamente modificados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN - Breve descripción de la invención
Esta invención se refiere al uso en una población celular microbiana de un replicón extracromosómico el cual porta genes que codifican una citotoxina y su antídoto. El método consiste en (i) introducción en células Gram-positivas del replicón extracromosómico para ser confinado, conteniendo un gen que codifica el antídoto ε que, por unión con el péptido citotóxico ζ, actuaría como un antídoto para la citotoxina, (ii) cultivando las células en condiciones en las cuales el gen que codifica el antídoto y la citotoxina son expresados, en el caso de que una célula hija no reciba una copia del replicón extracromosómico, moriría debido a la acción citotóxica del polipéptido toxina, el cual es mantenido en la célula en ausencia del antídoto. Esta invención también hace mención a sistemas utilizados para llevar a cabo un control condicional de la supervivencia de los GEMs en la población celular. El método comprende i) la introducción en bacterias Gram-positivas de genes que codifican los dos péptidos citotóxicos relacionados ζ y que van a expresarse en esta población celular, los cuales por una parte están funcionalmente ligados a un gen que ejerce un control negativo sobre su expresión, y a una secuencia reguladora y regulable de ADN que permite este control de su expresión y (ii) el cultivo de esta población celular bajo condiciones en las cuales ambos genes ζ son expresados, dando lugar la sobreproducción de los péptidos citotóxicos a un fenómeno de PCD de las bacterias en la población celular. Otro aspecto de la invención implicaría un método de muerte especializada sobre una bacteria dentro de una población celular. Este método supondría (i) la inserción por recombinación de un plásmido que portaría los genes que codifican estos péptidos citotóxicos, cuya expresión estaría regulada por una secuencia de ADN inducible por bacteriófagos; (ii) estas poblaciones serían cultivadas bajo condiciones que permitieran la inducción de profagos presentes en el genoma de estas células, de manera que la expresión de estos polipéptidos citotóxicos ζ induciría la muerte en aquellas células donde estos fagos replicativos estuvieran presentes.
- Descripción detallada de la invención La presente invención describe el uso de citotoxinas ζ relacionadas entre si, que producen una muerte celular efectiva y de forma controlada de los GEMs liberados al medio ambiente, o bien que limitan los GEMs liberados a una situación en la cual éstos presentarían una desventaja competitiva significativa, pudiendo ser eliminados por la microflora natural del entorno en el que son liberados. Por lo tanto puede ser definida esta invención como un factor activo de contención biológica.
Esta invención se refiere también al uso del polipéptido ζ en el control condicional de la supervivencia de células microbianas y/o la muerte selectiva y de manera controlada de microorganismos que experimentan un desarrollo no deseable. Además se refiere al uso de los polipéptidos ζ relacionados para llevar a cabo una muerte selectiva de los microorganismos que han perdido su elemento extracromosómico. El sistema consiste en dos componentes, un polipéptido ζ citotóxico y su antídoto correspondiente, que por unión con la citotoxina inhibe su acción letal. Una característica general de estos sistemas "killer" de naturaleza proteica es que el componente antídoto, a diferencia del componente tóxico, es susceptible a la degradación por proteasas, dando lugar a una disminución en sus niveles intracelulares. Tal como aquí se define, el término "citotóxico" se refiere no sólo a la pérdida de la capacidad de las células microbianas, que contienen el gen que codifica la toxina, de mantenerse viables (esto se determinaría comparando la capacidad de estas células de propagarse en un medio en el cual y bajo condiciones ambientales idénticas, se ha llevado a cabo el crecimiento de células que no portan este gen), sino también a la reducción de la capacidad replicativa de las células microbianas donde se produce la expresión de ζ o un péptido relacionado. Tal y como aquí se define, la expresión "célula microbiana" incluye aquellas bacterias Gram positivas con bajo contenido en dG+dC en su ADN.
Las secuencias nucleotídicas de la citotoxina ζ y del antídoto ε localizados en el plásmido pSM19035 han sido depositadas en la base de datos EMBL, con el número de acceso X64695 y las secuencias de las proteínas están depositadas en la base de datos PIR con los números de acceso S45085 y S45083, respectivamente, y ambas secuencias se muestran en la Figura 1. Las estructuras cristalinas del regulador transcripcional ω y del complejo toxina-antídoto codificados ambos por el plásmido pSM19035, han sido recientemente resueltas (Murayama et al, 2001; Meinhart et al, 2002).
Esta invención relata un sistema que controla de forma condicional la supervivencia de una población de células microbianas recombinantes, portando éstas los dos genes que codifican los polipéptidos citotóxicos ζ relacionados, los cuales están funcionalmente fusionados a un gen cuyo producto se une a una secuencia de ADN regulable y reguladora - promotor - que está controlando condicionalmente la expresión de estos polipéptidos citotóxicos. En el contexto presente, la expresión "controla de forma condicional" se refiere al hecho de que la construcción que portan estas células microbianas, permite que los polipéptidos citotóxicos puedan ser expresados bajo ciertas condiciones medioambientales pre-determinadas mientras que, bajo otras condiciones diferentes, los genes no se expresarían. Por lo tanto, la supervivencia de las células microbianas puede ser predeterminada para que se lleve a cabo bajo determinadas condiciones. La secuencia de ADN regulable y reguladora está funcionalmente ligada a la región 5 'de los genes que codifican los polipéptidos citotóxicos. De acuerdo con la invención descrita, esta secuencia de ADN reguladora, puede ser una secuencia a la cual uno de los genes que codifica estas citotoxinas está naturalmente asociado (como la secuencia que porta el sitio de unión de ω), o bien puede ser una secuencia a la cual estos genes no están naturalmente asociados.
Tal como aquí se define, la secuencia de ADN que funciona siendo regulada negativamente, puede consistir en una secuencia de ADN que esté regulando directamente la expresión de estos genes a nivel de la transcripción. De acuerdo con esta invención, la supervivencia de las células microbianas por tanto está controlada por la expresión en las células portadoras de estos polipéptidos citotóxicos ζ.
Los factores que regulen la actividad del promotor tal y como se define anteriormente, pueden ser seleccionados de entre una gran variedad de factores. De acuerdo con esta invención, el promotor sería regulado por factores ventajosos para los microorganismos, y de esta manera se estaría controlando la expresión de los polipéptidos citotóxicos por el estado fisiológico de las células, el medio en el que se encuentran las células y/o incluso mediante un evento inducible a partir de un elemento extracromosómico presente en las células.
En este contexto, el término "estado fisiológico de las células" denota la presencia o ausencia de ciertas sustancias químicas del entorno, tales como las que se encuentran en el medio de fermentación en el cual las células son propagadas, y que pueden no estar presentes en un segundo entorno en el cual estos organismos son liberados, también es posible que un factor que sea requerido para la supervivencia de las células, deje de encontrarse en el entorno donde se localizan las células, o bien que este factor requerido, se agote en el entorno de la célula, produciendo el efecto deseado, es decir, que el gen sea expresado.
Existe otro aspecto mencionado referente a la invención, en el cual se muestra como un método que controla condicionalmente la supervivencia de una población celular recombinante que contiene los genes que codifican los dos péptidos citotóxicos ζ,. En este otro aspecto estos genes están funcionalmente ligados a una secuencia regulable de ADN que está bajo el control de otro evento o fenómeno inducible, siendo éste el que controla en última instancia la expresión de la toxina. En este contexto, la expresión "evento o fenómeno inducible" se refiere a factores, entre otros, que producen cambios en el estado lisogénico de los profagos presentes en las bacterias utilizadas, las cuales se propagan a través de procesos fermentativos. Por lo tanto, la expresión del gen estaría bajo el control de un producto codificado por el bacteriófago, permitiendo que los polipéptidos citotóxicos pudieran ser expresados al activarse el estado lítico del fago.
En el caso de que se diera una transcripción regulada de los genes que codifican estos péptidos citotóxicos, la secuencia de ADN reguladora puede ser un promotor aislado de operones bacterianos involucrados en la biosíntesis de aminoácidos, o de genes bacterianos cuya transcripción se active en estadios tardíos en la fase de crecimiento o estadios tempranos de la fase estacionaria, y que estén involucrados en la síntesis de metabolitos secundarios, diferenciación celular y/o desarrollo (esporulación y/o inducción de la competencia natural), o inhibidores que actúen en determinados estados fisiológicos de la célula. La regulación de la expresión de los genes que codifican estos péptidos citotóxicos consiste en la excisión mediante recombinación de una secuencia de ADN que está regulando negativamente la expresión génica, lo cual ocurriría como un evento temprano en la inducción del profago o bien, la expresión estaría controlada directamente por un promotor temprano del bacteriófago, el cual a su vez estaría regulado por algún producto también codificado por el bacteriófago, constituyendo lo que conocemos como "evento inducible".
Aunque para ciertas aplicaciones del método descrito sería preferible que tanto los genes que codifican los péptidos citotóxicos como los genes que codifican los antídotos estén bajo el control de la misma secuencia reguladora, en otros casos, sería ventajoso que los genes que están codificando estos péptidos citotóxicos estuvieran funcionalmente unidos a diferentes secuencias reguladoras de ADN, permitiendo de esta manera que la expresión de éstos fuese reprimida en las condiciones deseadas.
El promotor que en bacterias Gram-positivas está regulando la expresión de estos péptidos citotóxicos, puede también ser activado en un segundo entorno en el que se localicen estos microorganismos mediante una sustancia química presente en cantidades suficientes para activar al promotor y que no esté presente en el primer medio en el que se localizaban inicialmente las bacterias.
Tal y como se indica, la sustancia química referida tendría que encontrarse raramente en el medio ambiente o en tales concentraciones que el promotor no fuese activado. De manera similar, el promotor puede que fuese activado por un cambio de temperatura, como una disminución de temperatura desde su primer entorno (por ejemplo, un fermentador), al pasar al medio donde son diseminados. Las células microbianas referidas en esta invención son células liberadas al entorno de forma controlada, por ejemplo, a un área de tierra restringida o bien limitando la supervivencia en el entorno de los microorganismos genéticamente modificados cuyos productos actuarían como pesticidas activos, como es el caso de Bacillus thuringiensis o B. sphaericus. El promotor regulable puede serlo químicamente por la presencia o ausencia de esta sustancia en el medio donde se encuentran estos microorganismos como se explicó anteriormente.
En el caso de promotores químicamente regulables, la presencia o ausencia de esta sustancia química determinaría la activación del promotor. Los genes que regulan el estado fisiológico de las células suelen estar regulados por sustancias químicas (por ejemplo, fuentes de carbón o nitrógeno, metabolitos, aminoácidos). Tales sustancias deberían estar ausentes o ejercer su efecto a una concentración que no está presente en el ambiente natural. También, diversas condiciones de temperatura o iones metálicos pueden utilizarse para controlar la expresión génica.
Esta invención se refiere al uso de un método para confinamiento de GEMs dentro de un nicho medioambiental. Básicamente, este método consistiría en i) la introducción dentro de la célula de un replicón extracromosómico que contiene los genes ζ y ε. El efecto citotóxico el polipéptido ζ es antagonizado por el antídoto ε, y ii) se lleva a cabo el cultivo de estas células en condiciones en las cuales ambos genes son expresados. En este caso las células serían viables puesto que el antídoto siempre está bloqueando la acción de la toxina, sin embargo, si una de las células hijas tras la división celular no recibe al menos una copia del replicón extracromosómico, muere por acción del polipéptido citotóxico al ser el antídoto degradado por las proteasas celulares, ya que ninguno de los dos genes va a ser nuevamente expresado por pérdida del elemento extracromosómico. Las células microbianas donde el replicón extracromosómico es confinado y de acuerdo con la invención, incluyen dos toxinas ζ, una procedente de plásmidos de amplio- rango-de-hospedador, aislados de bacterias Gram-positivas con bajo contenido de dG+dC en su ADN (plásmidos que pertenecen a la familia incl8, llamados pSM19035, pAMβl, pπ°501, etc.), y la otra perteneciente a sistemas relacionados y procedentes de plásmidos aislados originalmente de S. pneumoniae o bien a otros plásmidos menos conocidos también pertenecientes a bacterias Gram-positivas (Meinhart et al., 2002). Tal y como se define en esta invención, esta célula podría ser una bacteria seleccionada dentro de un grupo de diversas especies de bacterias lácticas, Bacillacea spp., Listariaceae spp. Esta invención también se refiere al uso de un método de estabilización post- segregacional de un plásmido en una población de células microbianas hospedadoras. El método consiste en (i) inserción dentro del plásmido de los genes que codifican los dos polipéptidos citotóxicos relacionados y los genes que codifican los dos polipéptidos ε también relacionados que van a ser degradados en la célula hospedadora a una velocidad superior a la cual lo son ambas citotoxinas, y (ii), cultivando esta población celular bajo condiciones en las cuales los genes que codifican ambos complejos toxina-antídoto son expresados, aquella célula hija que tras la división celular no reciba al menos una copia del plásmido de interés, morirá como resultado de una más rápida degradación de ambos polipéptidos antídoto. La invención también se refiere al uso de este método de estabilización post- segregacional del plásmido que porta los genes codificantes de ambos polipéptidos citotóxicos ζ, y que son negativamente regulados en la población celular microbiana hospedadora. Este método limitaría la supervivencia de una población celular al primer entorno donde se encuentra, en el cual la expresión de los genes citotóxicos está regulada negativamente. La supervivencia de la población estaría sin embargo restringida al ser estas células transferidas a un segundo entorno o bien cuando tuviera lugar un cambio físico o químico en el primer entorno, ya que ambos genes citotóxicos serían expresados. El método incluiría (i) la construcción de replicones que contuvieran ambos genes ζ, fimcionalmente fusionados a una secuencia de ADN con un sitio de regulación y una sustancia represora y (ii) cuando las células fueran liberadas al medio ambiente se llegaría hasta un grado en el cual la sustancia represora se convertiría en una forma no funcional, y hasta una nueva adición de esta sustancia química, los polipéptidos citotóxicos serían expresados y se iniciaría el proceso de muerte celular programada.
DESCRIPCIÓN DE FIGURAS
Figura 1. Secuencia nucleotídica del operón ωεζ del plásmido pSM19035 y secuencias de aminoácidos de los péptidos deducidos a partir de las secuencias anteriores. En A se muestra la hebra no codificante de ADN, es decir, se muestra la hebra equivalente al ARNm. La secuencia de aas. deducida (código de una letra) se indica bajo la secuencia de nucleótidos, con los aminoácidos alineados con el primer nucleótido de cada codón y con un asterisco mostrando el codón de terminación. En B se muestran las secuencias aminoacídicas de los polipéptidos ζ y ε.
Figura 2. Alineamiento que muestra los residuos conservados entre la proteína R6 [SP1051] de S pneumoniae, con una longitud de 253 aminoácidos y el polipéptido ζ de S. pyogenes con una longitud de 287 residuos. La homología se identifica dentro de los primeros 213 residuos, de estos 92 son idénticos (43%) y 142 (66%) similares. Figura 3. La inhibición de la expresión continua del complejo εζ afecta los niveles de la proteína ε. Carriles de 3 a 9 corresponden a: 0, 10, 20, 30, 50, 70 y 90 min. En el carril 2, se muestra células sin plásmido y en el 10, los niveles de ε y ζ a los 90 min sin adicionar antibiótico a las células portadoras del plásmido pBT233-7.
Figura 4. La inhibición de la expresión continua del complejo εζ afecta a la viabilidad de las células. Células de B. subtilis portando los plásmidos pBT233-2, pBT233-7 o libres de plásmido fueron crecidas en medio LB hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento. A tiempo cero, 50 μg/ml de Rif fueron añadidos al cultivo, determinando el número de UFC en los distintos tiempos mostrados tras adición del antibiótico. Los círculos llenos corresponden con células que contienen el plásmido pBT233-2, los círculos vacíos son las células que contienen el plásmido pBT233-7 y los cuadrados vacíos son las células libres de plásmido. Los datos mostrados corresponde a una experiencia entre varias que dieron similares resultados. Figura 5. El efecto de la antitoxina es dependiente de una pauta abierta de lectura intacta de ε y el efecto tóxico de ζ es reversible al ser expresado el antídoto. Las células fueron crecidas con (círculos vacíos) y sin (círculos llenos) IPTG 1 mM, el cual permite la expresión del gen ε. Si IPTG es añadido después de estar el cultivo 3 horas sin expresarse el antídoto, no se detecta muerte celular. La flecha negra (de arriba hacia a abajo) muestra el momento en el que IPTG fue eliminado del medio de cultivo, las flechas vacías (de abajo hacia a arriba) muestran los puntos en los que IPTG fue nuevamente añadido a los cultivos.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1.- Demostración de que el producto proteico del gen ζ localizado en el plásmido pSM19035 es una proteína de alta vida media de 32.4 kDa y que el antídoto ε es un polipéptido de menor vida media de 10.7 kDa.
Se utilizó para ello el plásmido de bajo número de copias pBT233-7 que contiene el operón ωεζ y anticueφos policlonales obtenidos frente a estas proteínas purificadas a homogeneidad (ver Figura 3). Así, células silvestres de B. subtilis YB886 que portan el plásmido pBT233-7 fueron crecidas en medio rico (Luria broth, LB), hasta alcanzar una densidad de 0.2 x 108 cels/ml. La transcripción por ARN polimerasa fue inhibida adicionando una concentración de 50 μg/ml de rifampicina (Rif), se tomaron alícuotas a distintos intervalos de tiempo, las proteínas se separaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida en presencia de SDS y se determinó la vida media de las proteínas visualizándolas por westem blot. En ausencia de Rif, las células silvestres YB886 de B. subtilis que contienen pBT233-7, se duplican cada 30 min. hasta alcanzar de 0.5 a 1.0-109 cels/ml y se encontró que presentaban una cantidad constante de complejo ε2ζ2 con un cociente ζ:ε que se aproxima a 1 (Figura 3, carril 3). Bajo estas condiciones experimentales hay aproximadamente 700 complejos εζ por célula en fase media de crecimiento logarítmico o una concentración 1 Mm de complejo (considerando 1.2-10" 5 L el volumen celular). Como era de esperar, en células libres del plásmido, los anticueφos policlonales ε y ζ no dieron ninguna señal (Figura 3, carril 2). Cuando se añadió Rif a las células portadoras del plásmido ρBT233-7, los niveles de la proteína ε se convirtieron en aproximadamente la mitad en los primeros 20 min. y la señal no fue detectable transcurridos 40 min. Bajo estas condiciones, los niveles de la proteína ζ en células portadoras del plásmido pBT233-7 se mantuvieron constantes durante al menos 60 min. (ver Figura 3, carril 9). Bajo condiciones similares, los niveles de ambas proteínas no están afectadas en ausencia de Rif (Figura 3, carril 10). La vida media de la proteína ε es aproximadamente de 18 min., mientras ζ es una proteína de larga vida media (> 60 min.). Ejemplo 2.- Demostración de que el producto del gen ζ localizado en el plásmido pSM19035 es una citotoxina.
Las células YB886 de B. subtilis que portan el plásmido pBT233-7 que contiene el operón ωεζ o que portan el plásmido pBT233-2 que contiene los genes ωε fueron crecidos en medio rico (LB) hasta alcanzar una fase media exponencial. La transcripción de la ARN polimerasa fue inhibida añadiendo a las células una concentración 50 μg/ml de Rif, se tomaron alícuotas en distintos intervalos de tiempo y se determinó la viabilidad de las células plaqueando en medio no selectivo. Cuando la viabilidad de las células no portadoras de plásmido o que contenían el plásmido pBT233-2 (conteniendo los genes ω y ε pero no ζ) fue comparada con las células portadoras del plásmido pBT233-7 tras su exposición a Rif (Figura 4), se vio claramente que la muerte celular fue mediada por la presencia de la proteína ζ en las células que portaban el plásmido pBT233-7. Cuando la transcripción por ARN polimerasa fue inhibida por adición de Rif en una concentración de 50 μg/ml, el número de células viables nunca incrementó, no así en el caso de las células sin plásmido o en las células portadoras del plásmido que carece del gen ζ (pBT233-2), que sobrevivieron, como se esperaba, al efecto bacteriostático de la Rif. Durante los primeros 90 min una disminución en la viabilidad de más de 100.000 veces fue observada, lo cual se conelacionaba con una reducción en las cantidades de priteína ε (Figura 4). Ejemplo 3.-Demostración de que el producto del gen ε del plásmido pSM19035 es un antídoto.
Células YB886 de B. subtilis portadoras del plásmido pBT233-7 que contiene el operón ωεζ o células XLl-Blue de E. coli portando el plásmido pCB298 de alto número de copias, que contiene los genes de ω y ζ (-200 copias por célula) bajo el control de un promotor constitutivo y el plásmido pCB297, de bajo número de copias (~7 copias por célula), que contiene el gen ε bajo el control de un promotor inducible por isopropiltiogalactosido (IPTG), fueron crecidas en medio rico (LB) hasta alcanzar una densidad de 0.2 x 108 cels/ml. El IPTG fue eliminado del medio tras centrifugar y lavar las células con medio LB-precalentad, permitiendo a las células seguir creciendo. Las muestras se recogieron a diferentes tiempos y se plaquearon en LB con y sin adición de una concentración final de IPTG de 1 mM (Figura 3). En el caso en el que la expresión del gen ε es dependiente de IPTG y la expresión de ω y de ζ está bajo el control de un promotor constitutivo en las células de E. coli, observamos que en las condiciones en las cuales ε no está expresándose (en ausencia de IPTG), el crecimiento del cultivo se para. Bajo estas condiciones experimentales se observa una disminución de la viabilidad en mas de 100.000 veces (Figura 5). El efecto del antídoto es dependiente de la presencia de un marco de lectura intacto de este gen, debido a que el efeto tóxico es revertido al añadir de nuevo IPTG al medio. Si IPTG es añadido transcurridos 120 min de parar el crecimiento celular, no se detecta muerte celular. El control con el plásmido pBT233-2 que contiene los genes ωε también fue crecido en medio rico (LB) hasta alcanzar un punto intermedio en la fase exponencial de crecimiento.
Ejemplo 4.- Determinación de la frecuencia de aparición espontanea de mutantes que son resistente al efecto tóxico del polipéptido ζ. Células YB886 de B. subtilis (portadoras del plásmido pBT322-7 con el operón ωεζ, crecieron hasta alcanzar una densidad de 0.2 x 108 cels/ml en medio rico (LB). La transcripción por ARN polimerasa fue inhibida por adición en el medio de cultivo de Rif a una concentración de 50 μg/ml y 90 min más tarde, fue observada una disminución en la viabilidad de las células de más de 100.000 veces. De estas células supervivientes, menos del 0.1% fueron mutantes reales. Estos resultados muestran que la resistencia frente a la toxicidad de ζ es un fenómeno raro, basándonos en este resultado, donde obtenemos una aparición de mutantes menor de 10"8, podemos predecir que la aparición de mutantes utilizando varios polipéptidos citotóxicos ζ relacionados será todavía menos probable. Células XLl-Blue de E. coli que portan un plásmido de alto número de copias, pCB298, que contiene los genes ω y ζ bajo el control de un promotor constitutivo, y un plásmido con bajo número de copias, pCB297, que contiene el gen ε bajo el control de un promotor inducible por IPTG, fueron crecidas en medio rico (LB) hasta alcanzar una densidad de 0.2 x 108 cels/ml. Εl IPTG fue eliminado del medio centrifugando las células y lavándolas con medio LB precalentado y se dejaron las células seguir creciendo.
Bajo estas condiciones experimentales se observó una disminución en viabilidad de más de 100.000 veces.
Referencias
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método que condicionalmente controla la supervivencia de una población de células microbianas recombinantes. El método consiste en (i) obtención de células bacterianas Gram-positivas que contengan los genes que codifican los polipéptidos citotóxicos de la familia ζ y los genes que codifican los antídotos de la familia ε, todos ellos derivados de los plásmidos de la familia incl8 (pSM19035, ρIP501, pAMβl y otros). Al mismo tiempo, estos genes deberían ir funcionalmente unidos a (a) un gen cuya expresión esté controlando la expresión del sistema toxina-antitoxina, y (b) una secuencia de ADN regulable y reguladora. Además se requeriría llevar a cabo (ii) el cultivo de esta población celular bajo condiciones en las cuales los genes ζ sean expresados, conduciendo esta expresión a la muerte celular.
2. Un método en el cual y de acuerdo con la reivindicación 1, los genes que codifican los polipéptidos citotóxicos füncionalmente equivalentes deriven de replicones extracromosómicos de bacterias Gram-positivas de bajo contenido de dC+dG en su ADN.
3. Un método en el cual y de acuerdo con la reivindicación 1, los genes que codifican los polipéptidos citotóxicos funcionalmente equivalentes deriven del cromosoma de bacterias Gram-positivas de bajo contenido de dC+dG en su ADN.
4. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el cual sólo la citotoxina de la familia ζ de citotoxinas sea utilizada para controlar la supervivencia de la población celular microbiana recombinante.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual las bacterias Gram-positivas pertenecen al género Bacillus, entre otras, B. subtlis, B. Thuringiensis, o al grupo constituido por diversas especies de las bacterias lácticas.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la secuencia reguladora utilizada, regule la expresión de los genes codificantes del antídoto ε y del polipéptido citotóxico ζ a nivel de la transcripción, y que sea inducida por un promotor regulable. A su vez, la función de este promotor sería regulada por la presencia o ausencia de un compuesto de naturaleza química en el medio de cultivo.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual las células de la población contengan los genes codificantes del antídoto ε capaz de unirse al péptido citotóxico ζ, antagonizando su actividad, y que ambos genes estén funcionalmente unidos a (a) otro gen que esté regulando negativamente su expresión y (b) a una secuencia regulada y reguladora de ADN.
8. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 7, en el cual la expresión de los genes de la familia ζ es regulada.
9. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 8, en el cual un compuesto químico reprime el promotor que controla la expresión de la antitoxina ε, de manera que cuando la antitoxina ε sea eliminada del medio por acción de las proteasas celulares, la toxina ζ podrá ejercer su función suicida.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el gen que codifica el polipéptido que funciona como antídoto ε, u otros funcionalmente equivalentes, esté funcionalmente unido a una secuencia regulable y reguladora permitiendo que estos genes que codifican los antídotos se repriman en determinadas condiciones en las cuales los genes que codifican los polipéptidos citotóxicos sean expresados.
11. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 8, en el cual el promotor utilizado es inducible por un compuesto químico, el estado fisiológico o las condiciones de crecimiento (temperatura, fuerza iónica).
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el promotor es regulable por expresión de un producto codificado por un profago tras activación de su ciclo lítico.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual regulación es efectuada por la unión funcional de los genes de la familia ζ con una secuencia reguladora que contenga un terminador transcripcional. La inducción de un profago residente permitiría la síntesis de una recombinasa específica de sitio codificada por el fago que catalizaría la delección de secuencias presentes entre el promotor y los genes citotóxicos.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual las células contienen un gen que codifica la proteína de interés.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual la proteína de interés es un producto farmacéuticamente activo.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual la proteína de interés es un producto biotecnológicamente activo.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual la proteína de interés es un producto activo como pesticida.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual el gen codificante del producto activo como pesticida deriva de Bacillus thuringiensis.
19. Un método de confinamiento de un replicón extracromosómico en una población celular microbiana, un método que comprende los siguientes pasos: (i) aislamiento de los genes que se encuentran de forma natural en una célula microbiana y que codifican los péptidos citotóxicos que cuando son expresados en una célula conducen a su muerte celular, (ii) introducción dentro de la célula del replicón extracromosómico que va a ser confinado en la población celular microbiana de interés, dicho replicón debe contener los genes pertenecientes a la familia génica de ε que codifican los dos péptidos antídoto y los genes pertenecientes a la familia génica de ζ que codifican los dos polipéptidos citotóxicos y (iii) cultivando las células bajo condiciones en las cuales todos estos genes van a ser expresados, en el momento en el que alguna célula hija en la división celular no recibe una copia del replicón extracelular, muere por la acción de estos polipéptidos citotóxicos puesto que el antídoto deja de expresarse.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual la población celular consiste en células que contienen un gen que codifica la proteína de interés.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual la proteína de interés es seleccionada de entre un grupo de enzimas, productos alimenticios activos, proteínas activas como pesticidas o proteínas activas farmacológicamente.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual el replicón es un plásmido que se encuentra en las células microbianas en bajo número de cuentas, en un rango de 1-15.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual las células microbianas pertenecen a especies bacterianas Gram positivas con bajo contenido de dC+dG en su ADN.
24. Un método de estabilización post-segregacional de un plásmido en una población de hospedadores celulares bacterianos, el cual comprende los siguientes pasos: (i) inserción por recombinación en el plásmido de (a) los genes que pertenecen a la familia ζ que codifica los péptidos citotóxicos o bien otros funcionalmente equivalentes, es decir, otros polipéptidos citotóxicos que son capaces de ejercer un efecto tóxico sobre las células hospedadoras y (b) los genes pertenecientes a la familia ε de polipéptidos antídoto, los cuales actúan como antitoxina y son degradados por la célula hospedadora mas rápidamente que la citotoxina. El segundo paso (ii) es el cultivo de la población celular bajo condiciones en las cuales estos genes son expresados, de manera que si una célula hija no recibe en la división celular una copia del plásmido, muere como resultado de una mas rápida degradación del polipéptido antídoto.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, en el cual los genes que codifican polipéptidos equivalentes derivan de bacterias Gram-positivas con bajo contenido dC+dG en su ADN.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual el plásmido contiene el gen que codifica la proteína de interés.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en el cual la proteína de interés es un producto biotecnológicamente activo.
28. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en el cual la proteína de interés es un producto activo como pesticida.
29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en el cual el gen codificante del producto activo como pesticida deriva de B. thuringiensis.
30. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, en el cual el plásmido se encuentra en las células microbianas en bajo número de cuentas, en un rango de 1-15.
31. Un método que limita la supervivencia de la población celular en un primero y un segundo entorno, así el método comprende (i) la transformación de las células con los genes pertenecientes a la familia génica z que codifican polipéptidos citotóxicos. Los genes son expresados en las células de la población y están funcionalmente unidos a otro gen, una secuencia de ADN reguladora que es regulada a su vez por factores medioambientales y la cual regula la expresión de dichos genes y (ii) el cultivo de esta población celular bajo condiciones en las cuales los péptidos citotóxicos sean expresados, y esta expresión de lugar a al menos la muerte parcial de esta población.
32. Un método de acuerdo con la reivindicación 31, en el cual la supervivencia de la población celular está limitada en un primer entorno en el cual el gen es expresado, dicha población celular de este modo es contenida en dicho primer entorno.
33. Un método de acuerdo con la reivindicación 29, en el cual la supervivencia de la población celular no es limitada debido a que los polipéptidos citotóxicos no son expresados sino que la supervivencia de la población celular es limitada cuando se transfiere a un segundo entorno o cuando se da un cambio físico o químico en el primer entorno donde el gen está expresándose.
34. Un método de contención de un replicón recombinante extracromosómico en un primer tipo de célula, donde dicho replicón se transfiere de forma natural a un segundo tipo de célula que recibe en este replicón recombinante extracelular los genes codificantes de la familia ζ que expresan los polipéptidos citotóxicos. Una secuencia nucleotídica reguladora cuyo producto génico inhibe la expresión de los polipéptidos citotóxicos y por lo tanto protege dicho primer tipo de célula. La expresión del gen regulador no existe en este segundo tipo de célula, por lo tanto si una célula de segundo tipo recibe este replicón recombinante extracromosómico dicho gen es expresado y produce la muerte celular de este segundo tipo de célula.
35. Un método que limita de forma estocástica la supervivencia de una población celular en un entorno. Este método consta de la transformación de las células con el replicón recombinante que contiene un gen de expresión regulada que pertenece a la familia génica z que codifican los polipéptidos citotóxicos. La expresión de estos genes da lugar a la producción de estas citotoxinas hasta un grado en el cual la función de estas células está limitada. La expresión de dicho gen es estocásticamente inducida como resultado de una excisión recombinacional de una secuencia nucleotídica excindible que está regulando negativamente la expresión del gen y la cual, cuando está presente en las células inhibe la expresión del gen que codifica el polipéptido citotóxico. Dicha secuencia puede estar presente en el replicón recombmante o en otro replicón recombinante presente en las células de la población que contienen el replicón original.
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