WO2004005495A1 - Novel airway epithelial cell line and use thereof - Google Patents

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WO2004005495A1
WO2004005495A1 PCT/JP2003/008486 JP0308486W WO2004005495A1 WO 2004005495 A1 WO2004005495 A1 WO 2004005495A1 JP 0308486 W JP0308486 W JP 0308486W WO 2004005495 A1 WO2004005495 A1 WO 2004005495A1
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protein
calcium
cell line
chloride channel
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Atsushi Nakanishi
Hiroki Iwashita
Shigeru Morita
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a novel airway epithelial cell line. More specifically, the present invention relates to a screening method for a prophylactic and / or therapeutic agent for respiratory diseases and the like. Background art
  • Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the respiratory tract, with airway narrowing and paroxysmal dyspnea, wheezing, and coughing. Many cells are involved in its onset and progression, including airway epithelial cells, mast cells, eosinophils, and T lymphocytes.
  • adhesion molecules such as VCAM-1 and ICAM-1 are found on airway epithelial cells and capillary endothelial cells around the bronchi.
  • adhesion molecules such as VCAM-1 and ICAM-1 are found on airway epithelial cells and capillary endothelial cells around the bronchi.
  • Th2-type helper T cells and Th2-type cytokines such as IL-3, IL-4, IL-5, IL_13, GM-CSF, and chemokines such as eotaxin and RANTES. Production is increased.
  • IL-4 and IL-13 have an effect of inducing IgE production
  • IL-3 and IL-4 have an effect of inducing mast cell proliferation.
  • eosinophils differentiate and proliferate by the action of IL-5, GM-CSF, etc., and infiltrate the respiratory tract by eotaxin and RANTES. And 'azma' Proceeding '(Vol. 20, p. 141, 1999).
  • IL-13 is an important factor in the development of chronic obstructive pulmonary disease and mucus hypersecretion in bronchial asthma, among cytodynamic agents [Journal of Clinical Investigator]. Chillon (J. Cl in. Inves t.), 106, 1081, 2000; Ja J. Clin. Invest., 103, 779, 1999].
  • the epithelial cells that cover the mucosa of the trachea and bronchi have a barrier function that prevents external stimuli from being transmitted directly to the submucosal tissue, excretion of secretions and foreign bodies, and epithelial-derived smooth muscle relaxing factor. It controls the contraction of the trachea by secretion.
  • Chloride channels play an important role in the secretion from airway epithelial cells, and the abnormalities cause various respiratory diseases. Among the chloride channels that function in the respiratory epithelium, dysfunction of CFTR causes cystic fibrosis (Science, 257, 1125, 1992), and CIC chloride channel is associated with myotonia (Nature, 354, 304, 1991).
  • CLCA calcium-dependent chloride channel
  • CLCA has been reported for diseases associated with airway hyperresponsiveness and airway mucus hypersecretion. Therefore, drugs that suppress the expression of CLCA and drugs that inhibit the activity of CLCA can be effective drugs for respiratory diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease.
  • respiratory diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease.
  • CLCA is a gene whose expression is induced with the onset of disease, no cell line expressing CLCA in respiratory cells has been reported, and CLCA is expressed by certain stimuli. No inducible cell lines have been reported.
  • a prophylactic and therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease and bronchial asthma with few side effects there is an urgent need to obtain a cell line that can express or induce the expression of CLCA. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found an airway epithelial cell line that highly expresses CLCA1 by stimulating a primary airway epithelial cell line with IL-13. As a result of further studies based on this finding, the present invention has been completed.
  • Calcium-dependent chloride channel proteins are: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52.
  • An airway epithelial cell line according to the above (1) which is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • Calcium-dependent chloride channel proteins are: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or an airway epithelial cell line according to the above (1), which is a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • the airway epithelial cell line according to (1) which has the ability to secrete mucus
  • a protein or a partial peptide thereof, wherein the calcium-dependent chloride channel protein has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50 Or the salt thereof, the screening method according to the above (12) or (13),
  • a calcium-dependent chloride channel protein comprising an airway epithelial cell line and a cytodynamic cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein or the airway epithelial cell line according to (1).
  • the airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein is a cell line in which primary airway epithelial cells of mammals (human, rat, mouse, etc.) have been established. 18) or the screening method described in (18a) above,
  • the rat respiratory epithelial cell line is a cell designated by NIM-1 (FERM BP-8091) or a SPOC 1 (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 14, 146, 1996) The screening method according to (18c) above,
  • a protein or a partial peptide thereof, wherein the calcium-dependent chloride channel protein has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50 Or the salt thereof, the screening method according to the above (18),
  • a compound which inhibits expression of a calcium-dependent chloride channel protein gene comprising an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a cytokine,
  • a kit for screening the salt
  • a compound that inhibits the production of calcium-dependent oral chloride channel protein which comprises an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a cytokin. Or a salt screening kit,
  • the airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein is a cell indicated by NIM-l (FERM BP-8091) as described in (12), (18) or (22) above. ) Described screening method,
  • (31) a method for screening a respiratory disease or rhinitis prophylactic / therapeutic agent, which comprises using an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein;
  • a method for screening a respiratory disease or rhinitis prevention / treatment agent comprising using the cell and IL-13 according to (11) above.
  • a method for preventing or treating respiratory disease or rhinitis which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound according to (17), (21) or (25) or a salt thereof,
  • FIG. 1 is a diagram showing the expression level of rat CLCA1 gene in Example 3 when IL-13 was added to NIM-1 cells.
  • the mouth indicates the culture group without addition of IL-13
  • the image indicates the culture group with addition of IL-13.
  • FIG. 2 is a diagram showing an increase in membrane potential of NIM-1 cells cultured with addition of IL-13 accompanying an increase in Ca 2+ -dependent C 1 -channel activity in Example 4.
  • ⁇ indicates culture with IL-13 supplementation ⁇ ionomycin stimulation group
  • mouth indicates culture with IL-13 supplementation 'ionomycin non-stimulation group'
  • ⁇ indicates culture without IL-13 'ioniomycin stimulation group
  • ⁇ indicates culture without IL-13 supplementation 'Iionomycin unstimulated group is shown.
  • FIG. 3 is a diagram showing the increase in mucus secretion of NIM-1 cells cultured with the addition of IL-113 by ionomycin stimulation in Example 5.
  • the mouth shows the culture group without IL-113
  • the drawing shows the culture group with IL-113.
  • FIG. 4 is a graph showing the inhibitory effect of wortmannin on the induction of expression of rat CLCA1 gene by IL-13 in SPOC1 cells in Example 9.
  • the vertical axis indicates the emission intensity when wortmannin was added when the emission intensity of the control was 100%.
  • the white bar is the wortmannin concentration of 100 iM
  • the gray bar is the wortmannin concentration of 100 M
  • the black bar is the expression level of the rat CLCA1 gene when the wortmannin concentration of 1 M was added.
  • Examples of the calcium-dependent chloride channel protein used in the present invention include proteins belonging to the calcium-dependent cleft chloride channel protein family and the like.
  • SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: No .: 52 or a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is used.
  • the protein used in the present invention includes cells of human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, pigs, sheep, pigs, monkeys, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, Nerve cells, glial cells, kidney 0 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells , Immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone Cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells, or cancer cells of these cells
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence substantially identical to the sequence
  • proteins having an amino acid sequence substantially identical to the sequence include, for example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, It contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, or a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53. preferable.
  • substantially equivalent activities include, for example, chloride channel-like activity (eg, calcium-dependent chloride channel-like activity), mucus secretion activity, and the like.
  • chloride channel-like activity eg, calcium-dependent chloride channel-like activity
  • mucus secretion activity e.g., mucus secretion activity
  • substantially homogeneous indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, it is preferable that the chloride channel-like activity, the mucus secretion activity, and the like are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). But the extent of these activities, evening Quantitative factors such as the molecular weight of the proteins may be different.
  • the chloride channel-like activity can be measured according to a known method, for example, according to the method described in Genomics, Vol. 54, p. 200 (1998) or a method analogous thereto.
  • the mucus secretion activity can be measured according to a known method. For example, it can be measured according to the method described in Biochemical Journal (Biochem. J), vol. 316, p. 943 (1996) or a method analogous thereto. it can.
  • Examples of the protein used in the present invention include: (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, One or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53 (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 10 5) amino acid sequence deleted amino acid sequence, 2 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5)) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53 ) Amino acid sequence with amino acid added, 3 Sequence ID: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO
  • 4SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or 1 or 2 or more (preferably) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 Is an amino acid sequence in which about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5 amino acids have been substituted with another amino acid, or an amino acid sequence combining them. Includes so-called muteins such as contained proteins .
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (potassium terminus) according to the convention of peptide notation.
  • the C-terminus of the protein may be any of a carboxyl group (-C00H), a carboxylate (-C00-), an amide (-C0N) or an ester (-C00R).
  • R in the ester is, for example, an alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and n-butyl; for example, a C 3 -cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl; for example, phenyl, ⁇ - naphthyl which any C 6 - 12 ⁇ Li Ichiru group, e.g., benzyl, phenylene Lou C such as phenethyl, 2 T alkyl group or a Q, such as single naphthylmethyl -.! naphthyl - C t_ C, such as 2-alkyl group 7 - 14 Ararukiru group, Viva port Iruokishimechiru group is used.
  • an alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and n-butyl
  • a protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified may also be used in the present invention.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the protein used the invention may include amino acid residues (e.g., main Chionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups (e.g., formyl groups, C WINCH 6 Ashiru groups such as C M Arukanoiru such Asechiru group Etc.), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, and glutamine oxidized at the mouth, Substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg-0H, -SH, Amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are protected by a suitable protecting group (eg, C aryl group such as formyl group, acetyl group, etc.). And complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., formyl groups, C WINCH 6 Ashiru groups such as C M Arukanoiru such Asechiru
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42; a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 50 A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51; a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53 A protein containing the represented amino acid sequence, Mouse CLCA 1 (J Biol Chem, 273, 32096, 1998); mouse CLCA 2 (Biochem Biophys Res Com, 264, 933, 1999).
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is the partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. Any one may be used.
  • one or more (preferably about 110, more preferably about (15)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, Or 1 or 2 or more (preferably, about 120, more preferably, about 110, and more preferably, about (15)) amino acids are added to the amino acid sequence, or One or more (preferably about 120, more preferably about 110, and more preferably a number (15)) amino acids are inserted into the sequence, or the amino acid sequence
  • One or two or more (preferably about 110, more preferably several, and still more preferably about 15) amino acids of the above may be substituted with another amino acid.
  • the partial peptide used in the present invention C-terminal carboxyl group (- C00H) carboxylate (-C00 ") may be any of the amide (-C0NH 2) or ester (
  • the partial peptide used in the present invention includes those having a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, N-terminal amino acid residues ( E.g., methionine residue) whose amino group is protected by a protecting group, glutamine residue generated by cleavage of N-terminal in vivo, pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule
  • a suitable protecting group or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • salts with inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, kohic acid
  • Tartaric acid cunic acid, malic acid, oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid.
  • the protein, its partial peptide, or a salt thereof used in the present invention can be produced by a known protein purification method from human or warm-blooded animal cells or tissues as described above, or can encode a protein. It can also be produced by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin , 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,, 4, dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ', 4' dimethoxyphenyl aminomethylethyl ) Phenoxy resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or their amide Get the body.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt), or may be pre-formed as a symmetric anhydride or H ⁇ ⁇ ⁇ Bt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • a racemization inhibitor eg, HOBt, HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpiperidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulfoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof.
  • sulfoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran
  • nitriles such as acetonitrile and propionitrile
  • esters such as
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isoporiloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, Br—Z, and adamantyl.
  • Z Boc, t-pentyloxycarbonyl, isoporiloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, Br—Z, and adamantyl.
  • oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • Carbonyl groups are, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl).
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl.
  • Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as tyl, cyclootatyl, 2-adamantyl, etc., aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester) Benzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester
  • Benzyl ester, benzhydryl esterification benzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyloxycarbonyl hydr
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a group derived from carbonic acid such as a lower (Cw) alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarponyl group is used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of Fueno Ichiru hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - Bz l, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethyl alcohol, p-nitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, and esters with HOB t)].
  • active esters alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol)
  • Cyanomethyl alcohol p-nitrophenol
  • H ⁇ NB N-hydroxysuccinimide
  • N-hydroxyfurimide N-hydroxyfurimide
  • esters with HOB t esters with HOB t
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • Reduction by pum is also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisole, methacresol, paracresol
  • a thione scavenger such as toluene, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is 1,2-ethanedithiol
  • it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution or dilute ammonia.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein or partial peptide for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal, a peptide (protein) chain having a desired chain length is attached to the amino group side.
  • the protein or partial peptide from which only the protecting group for the amino-terminal hamino group of the peptide chain has been removed and the protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal lipoxyl group has been removed And condensing these proteins or peptides in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain the desired protein or peptide amide.
  • the desired protein is prepared in the same manner as the amide of a protein or peptide. It is possible to obtain an ester of quality or a peptide.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used.
  • the partial peptide or amino acid which can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to thereby remove the desired peptide.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto. Can be converted into a free form or another salt by a method according to the above.
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell and tissue-derived cDNA, the above-described cell and tissue-derived cDNA library, and any of synthetic DNAs.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • DNA encoding the protein used in the present invention examples include: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, Sequence No. 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57.
  • a protein used in the present invention which contains a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as those of DNA.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or base represented by SEQ ID NO: 57
  • DNA that can hybridize with the sequence under high stringency conditions include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, Sequence SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57 and about 40% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, preferably about 70% or more, preferably about DNA containing a nucleotide sequence having a homology of .80% or more, preferably about 90% or more, preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Yo More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions refer to, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 4 OmM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° (preferably about 60 to 65 ° C). Particularly, it is most preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented by SEQ ID NO: 22.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26.
  • the DNA encoding the protein containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 is represented by SEQ ID NO: 42.
  • the DNA encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 is represented by SEQ ID NO: 43.
  • the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44. Number: As the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by 50, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 54 contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 As a DNA encoding a protein, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 55 is used. As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56 is used. The DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53. Are used.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention.
  • the DNA encoding the partial peptide used in the present invention includes, for example, a sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57 DNA having a part of the contained DNA, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 Or a portion of DNA encoding a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57 and encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention. And the like containing DNA.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or base represented by SEQ ID NO: 57
  • the DNA that can hybridize with the sequence has the same significance as described above. The same hybridization method and high stringent conditions as described above are used.
  • a DNA or a partial peptide used in the present invention (hereinafter, in the description of cloning and expression of DNAs encoding them, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention).
  • the DNA of the present invention is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector.
  • the DNA can be selected by hybridization with a DNA fragment coding for a part or the entire region of the DNA or a DNA labeled with a synthetic DNA.
  • the method of hybridization is, for example,
  • the DNA base sequence can be converted by PCR or a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo) or Mutan TM -K (Takara Shuzo) using the 0DA-LA PCR method or the like. It can be performed according to a known method such as the Gapped du 1 ex method or the Kunke method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as is, or Can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the protein of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting downstream of
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, PBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, TP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSHl9). , pSHl 5), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Ne, etc. Is used.
  • Escherichia coli eg, pBR322, PBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, TP5, pC194
  • yeast eg, pSHl9
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when an animal cell is used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • the host When the host is Eshierihia genus, when trp promoter one, lac promoter one, re cA promoter one, AP L promoter, l pp promoter, T 7 promoter, the host is Ru der Bacillus, spol
  • yeast such as promoter overnight, SP ⁇ 2 promoter, penP promoter, etc., PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may include, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter, S V40 ori) may be used.
  • selectable markers include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp 1 ) ), the neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance), and the like.
  • dhfr gene as a selectable marker one with dh fr gene deficient Chinese eight Muster cells
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is Escherichia, Pho A signal sequence, OmpA signal sequence, etc.
  • the host is Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc.
  • the host is In the case of yeast, MFMF signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available for each.
  • a transformant can be produced using the thus constructed vector containing the DNA encoding the protein of the present invention.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli.
  • Bacillus bacterium for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris K ⁇ 71, etc. .
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cell a cell line derived from silkworm (Bombyx mori N cell; BmN cell) is used.
  • Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (Vaughn, J.L., et al., In Vipo).
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • -As animal cells for example, monkey cell COS-7, Ve'ro, chick cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient chick cell CHO cell (hereinafter CHO) CHO (dh fr ”) cells), mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). Transformation of animal cells can be performed, for example, by the method described in Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 63-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be done according to law.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is contained therein.
  • Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for culturing a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments in Molecular
  • cultivation is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be applied.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burkholder's minimum medium Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) And SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Cultivation is usually performed at about 20-35 ° C for about 24-72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method described above, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods are mainly methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method utilizing the difference in ion exchange chromatography -A method that uses a difference in charge such as, a method that uses a specific affinity such as affinity chromatography, a method that uses a difference in hydrophobicity such as reverse-phase high-performance liquid chromatography, and an isoelectric point.
  • a method utilizing the difference between isoelectric points such as electrophoresis is used.
  • the protein thus obtained When the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a known method or a method analogous thereto Can be converted into a free form or another salt.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by, for example, enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. A little bit.
  • An antibody against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) uses the protein of the present invention as an antigen, Can be produced according to the method for producing an antibody or antiserum.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody upon administration by itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • the warm-blooded animals used include, for example, monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Mills in [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • a variety of methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • a culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) onto which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then the supernatant is added.
  • Anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is mouse
  • protein A is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
  • a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. And the like.
  • Monoclonal antibodies should be performed according to a known method or a method equivalent thereto. Can be. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as it can grow a hybridoma. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Alternatively, a serum-free culture medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)).
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) Can be.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • an immunogen protein antigen
  • a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and an antibody against the protein of the present invention is obtained from the immunized animal. It can be produced by collecting the contents and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier-1 protein and the mixing ratio of carrier-1 to hapten are determined by antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier.
  • any kind may be cross-linked at any ratio.
  • ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ cysiloglopurine, hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 1 hapten to 1 hapten
  • a method of coupling at a rate of 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents may be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • active ester reagents containing daltaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithioviridyl group and the like can be used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Airway epithelial cell line of the present invention Airway epithelial cell line of the present invention
  • the airway epithelial cell line of the present invention is an airway epithelial cell line derived from a mammal such as human, which expresses the protein used in the present invention.
  • mucus include MU C5 AC protein and MU C 2 protein.
  • the confirmation of whether or not the respiratory epithelial cell line of the present invention is a respiratory epithelial cell line may be performed using a known method, for example, by measuring the expression of cytokeratin.
  • airway epithelial cell line of the present invention those which highly express the protein used in the present invention are preferable.
  • airway epithelial cells that express about 0.01% or more, preferably about 0.1% or more, more preferably about 1% or more of the protein relative to a housekeeping gene (eg, GA PDH gene) A strain or the like is used.
  • the airway epithelial cell line of the present invention includes, as an airway epithelial cell line having the ability to express the protein used in the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as airway epithelial cell line A). It is obtained by contacting the light force.
  • the airway epithelial cell line of the present invention also includes cells expressing the protein used in the present invention, which are obtained by contacting the airway epithelial cell line A with a cytokine.
  • Examples of the above-mentioned airway epithelial cell line A include, for example, a cell line of primary airway epithelial cells of mammals such as humans (eg, rat primary airway epithelial cells), SPOC1 cells [American Journal of Respiratory Cells and Moreukiura]. I. Biology (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.), 14, 146, 1996].
  • cells were isolated from rat trachea, and a basal medium of a medium (eg, a medium for rat respiratory epithelial cells [Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, p. 385, 1995]) was used as DMEMZF.
  • the culture medium is changed to a 12-medium medium and the medium is deprived of CaCl 2 ), and the culture is continued until the appearance of a colony derived from a single cell is observed.
  • a basal medium of a medium eg, a medium for rat respiratory epithelial cells [Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, p. 385, 1995]
  • the culture medium is changed to a 12-medium medium and the medium is deprived of CaCl 2 ), and the culture is continued until the appearance of a colony derived from a single cell is observed.
  • NIM-1 or the like obtained in Examples described later is used. '
  • site force in examples include IL-13, IL-1, IL-4, IL-16, IL-8, IL-9, TNF-HI, TGF-HI, EGF, bFGF and the like.
  • it is IL-13.
  • the amount of cytokin used is about 0.01 ng / ml or more, preferably about 0.1 ng / ml or more, and about 1 ng / ml or more.
  • the method of contacting the airway epithelial cell line A with the cytodynamics is not particularly limited, and examples include a method of adding the cytodynamics to the airway epithelial cell line A seeded on a plate and culturing the cells. .
  • the expression of the protein of the present invention increases prior to inflammation of the lungs and airways, and the antisense oligonucleotide of the protein gene of the present invention suppresses the hypersensitivity of the airways, thus inhibiting the activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof, compounds or salts thereof that inhibit the expression of the protein gene of the present invention, compounds or salts thereof that inhibit the production of the protein of the present invention may be used for lung and chest diseases accompanied by inflammation of the lungs and airways.
  • Or call Inhaler disease eg, chronic obstructive pulmonary disease (eg, chronic bronchitis, emphysema), diffuse panbronchiolitis, bronchial asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia, pulmonary fibrosis, etc.), inflammatory bowel disease, It can be used as a medicine for preventing and treating allergic conjunctivitis.
  • rhinitis eg, allergic rhinitis, hay fever, acute rhinitis, chronic rhinitis, hypertrophic rhinitis, atrophic rhinitis, dry pronasitis, blood vessels It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for motor rhinitis, gangrenous rhinitis, sinusitis, etc.).
  • the respiratory epithelial cell line and the respiratory epithelial cell line A of the present invention are useful as reagents for screening the above compounds or salts thereof.
  • the present invention relates to a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention (eg, chloride channel-like activity, mucus secretion activity, etc.) characterized by using the protein of the present invention (hereinafter referred to as “inhibitor”). Screening method).
  • the protein of the present invention eg, chloride channel-like activity, mucus secretion activity, etc.
  • the chloride channel-like activity can be measured according to a known method. For example, according to the method described in Genomics, Vol. 54, p. 200 (1998) or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the measurement of the mucus secretion activity can be performed according to a known method. It can be measured according to the method described in Chemical Journal (Biochem. J), vol. 316, p. 943 (1996) or a method analogous thereto.
  • calcium activator for example, ionomycin, A23187 (calcimicin) and the like are used.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • the mixture of airway epithelial cell line A, cytoforce, and the test compound can be obtained by (1) contacting the airway epithelial cell line A with cytoforce, mixing with the test compound before activation with a calcium activator, ( 2) Contact cytotoxicity to airway epithelial cell line A, activate with calcium stimulant, and mix with test compound. (3) Contact airway epithelial cell line A with cytokines and test with calcium activator. Before contacting the airway epithelial cell line A with the calcium activator, such as adding a mixture of compounds, any order may be used as long as the site force-in is brought into contact with the airway epithelial cell line A. .
  • the airway epithelial cell line of the present invention may be mixed with a test compound before or after the airway epithelial cell line of the present invention is activated with a calcium activator. A mixture of a test compound and a calcium activator may be added.
  • the airway epithelial cell line A or the airway epithelial cell line of the present invention is prepared by suspending in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the activity of the protein of the present invention, such as 1 to about 4 to 10 (preferably, about 1 to 6 to 8) phosphate buffer and borate buffer. .
  • the chloride channel activity or mucus secretion activity in the above (ii) or (ii ') is about 20% or more, preferably 30%, as compared with the above (i) or ( ⁇ ⁇ ).
  • Test compounds that inhibit the above, more preferably about 50% or more, can be selected as compounds or salts thereof that inhibit the activity of the protein of the present invention.
  • the airway epithelial cell line of the present invention is seeded at 4 ⁇ 10 5 per well on a 96-well black clear potom plate and cultured.
  • the C1-channel activity was evaluated assuming that the C1-channel activity when stimulated with ionomycin was 100% and the channel activity when ionomycin was not stimulated was 0%, and the compound having C1-ion channel inhibitory activity was evaluated.
  • the present invention relates to a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention, characterized by using an airway epithelial cell line A (hereinafter referred to as an inhibitor). Screening method). More specifically, for example,
  • the expression level of the protein gene of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention or mRNA encoding the protein) Measure) and compare.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • the respiratory epithelial cell line A by suspending it in a buffer suitable for screening.
  • a buffer suitable for screening Any buffer may be used as long as it does not inhibit the expression of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8).
  • the amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention to detect the protein present in a cell extract or the like, using a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured in accordance with the corresponding method.
  • the expression level of the protein gene of the present invention can be determined by a known method, for example, Northern blot ink, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR analysis system (manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain reac This can be measured according to a method such as (tion) or a method analogous thereto.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • PCR real-time PCR analysis system
  • ABI TaqMan polymerase chain reac
  • the expression of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii).
  • the test compound to be tested can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
  • IL-13 is added at a final concentration of 10 ng / ml, and the cells are further cultured for one day, and the total RNA in the cells is extracted using RNeasy 96 Kit (manufactured by QIAGEN). Using these total RNAs as starting materials, cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction using TaqMan Gold RT-PCR Kit (manufactured by Applied Biosystems). Using a part thereof, the copy number of the gene of the protein used in the present invention (eg, CLCA1 gene, etc.) is measured by TaqMan PCR using ABI PRISM 7700 Sequence Detector (manufactured by Applied Biosystems). .
  • the expression level of the gene of the present invention eg, CLCA1 gene, etc.
  • the degree of inhibition of the expression of the gene of the protein used in the present invention eg, CLCA1 gene, etc.
  • the gene of the protein used in the present invention eg, CLCA1 gene
  • a compound having an action of inhibiting the expression of the CLCA1 gene is selected.
  • the present invention also provides a method for screening a compound or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as an inhibitor) that inhibits the production of the protein of the present invention, characterized by using the respiratory epithelial cell line A and a cytokine. . More specifically, for example,
  • the production amount of the protein of the present invention in the cases of (V) and (vi) using an antibody against the protein of the present invention or the like for example, the production amount of the protein of the present invention in the cases of (V) and (vi) using an antibody against the protein of the present invention or the like.
  • the amount of the protein of the present invention is measured (eg, the expression of the protein of the present invention is detected, the expression level of the protein of the present invention is quantified, etc.) and compared.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the activity of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8).
  • the amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention to detect the protein present in a cell extract or the like, using a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured in accordance with the corresponding method.
  • the production of the protein of the present invention in the case of the above (vi) is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, as compared with the case of the above (V).
  • the test compound can be selected as a compound that inhibits the production (expression) of the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the screening kit of the present invention contains the airway epithelial cell line or the airway epidermal cell line A of the present invention and a cytokine.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a test compound as described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, and a plant extract.
  • a salt, or a compound that inhibits the production of the protein of the present invention, or a salt thereof is a test compound as described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, and a plant extract.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention, the compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, or the compound or its salt that inhibits the production of the protein of the present invention includes, for example, The lungs ⁇ Lungs with airway inflammation ⁇ Chest disease and respiratory disease [eg, chronic obstructive pulmonary disease (eg, chronic bronchitis, ), Diffuse panbronchiolitis, bronchial asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia, pulmonary fibrosis, etc.), inflammatory bowel disease, and preventive and therapeutic agents for allergic conjunctivitis.
  • chronic obstructive pulmonary disease eg, chronic bronchitis, )
  • Diffuse panbronchiolitis bronchial asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia, pulmonary fibrosis, etc.
  • inflammatory bowel disease e.g, asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia,
  • rhinitis eg, allergic rhinitis, hay fever, acute rhinitis, chronic rhinitis, hypertrophic rhinitis, atrophic rhinitis, dry proprietary rhinitis, vasomotor rhinitis, gangrenous rhinitis, sinusitis, etc. It is useful as a medicine for preventive and therapeutic agents.
  • the above compound or a salt thereof when used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. which are sugar-coated as required, orally, or aseptic solution or suspension in water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections.
  • the above compounds or salts thereof can be combined with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in unit dosage forms generally required for the practice of formulations. It can be produced by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agent for example, alcohol (for example, ethanol ), Polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM , HCO-50, etc.).
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, Shiridani benzalkonium, prochlorin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene) Glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, pests, birds, cats, dogs, monkeys). , Chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, pests, birds, cats, dogs, monkeys.
  • Chimpanzees, etc. can be administered orally or parenterally.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention is inhibited for the purpose of treating chronic obstructive pulmonary disease.
  • the compound or its salt is generally administered to an adult (as a body weight of 60 kg) per day. Is administered in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, etc., for example, the activity of the protein of the present invention is inhibited for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease.
  • a compound or a salt thereof is administered to an adult (with a body weight of 6 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 3 Omg per day.
  • 2 Omg, more preferably about 0.1-1 Omg is administered by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • HONB Trihydroxy-5-norpolene-2,3-dicarboximide
  • DCC ⁇ , ⁇ '-Dicyclohexylcarposimide
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence of the rat CLCA1 protein portion having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is shown.
  • the nucleotide sequence of the mouse CLCA4 gene on the 5 'side is shown.
  • the nucleotide sequence of the mouse CLCA4 gene on the 3 'side is shown.
  • T7promoteperprimer promoter primer
  • FIG 3 shows the nucleotide sequence of Ml 3 RV primer (primer) used in Reference Example 2.
  • [SEQ ID NO: 52] 2 shows the amino acid sequence of human CLCA2 protein.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding the human CLCA 2 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 is shown.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding the human CLCA4 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is shown. From June 26, 2002, NIM-1 obtained in Example 1 described below was incorporated by the Industrial Technology Development Corporation of 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, with a central 6th (postal code 305-8566). Deposited at the Institute for Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8091. The transformant Escherichia coli TOPlO / pCR-Blunt II-rCLCAl obtained in Reference Example 1 described below has been used since January 9, 2002, Tsukuba East Higashi 1-1-chome 1 Chuo No.
  • PCR was performed with the combination of primer 1 and primer 4, primer 1 and primer 5, primer 1 and primer 3, and primer 13 and primer 5, and the size expected by agarose gel electrophoresis.
  • the DNA fragment was found to be amplified.
  • the reaction was performed using Takara Ex Taq (manufactured by Takara Shuzo) on a thermal cycler Gene Amp PCR System 9700 (manufactured by PerkinElmer) at 94 for 1 minute, then at 94 ° C for 10 seconds and 65T. 30 seconds, 72 2 minutes 30 seconds 1 The reaction cycle was repeated 35 times, and the reaction was finally performed at 72 for 10 minutes.
  • the obtained DNA fragment was cloned into pT7 Blue-T vector (Novagen).
  • T7 promoter primer SEQ ID NO: 15
  • U19 primer SEQ ID NO: 21
  • two kinds of synthetic primers Primer 6 (SEQ ID NO: 8) and Primer 7 (SEQ ID NO: 9)
  • a cycle sequence reaction was performed, and the nucleotide sequence of the reaction product obtained using Fluorescent MA Sequencer-377 (manufactured by PerkinElmer Inc.) was determined.
  • 1879 nucleotide sequences were determined as a partial nucleotide sequence of rat CLCA1 gene.
  • SEQ ID NO: 2 Based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, a 625 amino acid sequence was determined (SEQ ID NO: 1). The partial amino acid sequence had 75% homology with the corresponding sequence of human CLCA1 and 88% with the corresponding sequence of mouse gob-5.
  • RNA was prepared using an mRNA purification kit (manufactured by amersham Pharmacia biotech). Using this mRNA Ig as a starting material, an Adaptor-ligated cDNA was synthesized using a Marathon cDNA Amplification Kit (clontech). 5. For _RACE, use this cDNA as type I primer 10 (SEQ ID NO: 13) and primer AP I (SEQ ID NO: 19)
  • the reaction solution was nested with a combination of primer — 11 (SEQ ID NO: 14) and primer AP 2 (SEQ ID NO: 20) (clontech).
  • PCR was performed, and the amplified DNA fragment was cloned into a pCRII-TOPO vector (manufactured by Invitrogen).
  • Cycle sequence reaction was performed using T7 promoter primer (SEQ ID NO: 15) and M13RV primer (SEQ ID NO: 16), and the base of the reaction product obtained with Fluorescent DNA Sequencer-1 3100 (Applied Biosystems) was used. The sequence was determined.
  • primer 12 SEQ ID NO: 17
  • Adapter-ligated cDNA was converted into type II primer AP2
  • PCR was performed in combination with the DNA sequencer (manufactured by Clontech), and the nucleotide sequence of the amplified DNA fragment was directly determined using a fluorescent DNA sequencer-1100 (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the nucleotide sequence corresponding to the rat CLCA1 N-terminal amino acid sequence was determined. Also, for 3, -RACE, adaptor-ligated cDNA was used as a type I primer and primer 3. After PCR was performed using the combination of primers API (manufactured by Clontech), the reaction solution was subjected to nested PCR using a combination of primer 13 (SEQ ID NO: 18) and primer AP2 (manufactured by clontech).
  • nucleotide sequence of the amplified DNA fragment was directly determined using a fluorescent DNA sequencer-3100 (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the nucleotide sequence corresponding to the rat CLCA1 C-terminal amino acid sequence was determined.
  • the rat CLCA1 full-length gene had 2730 nucleotide sequences (SEQ ID NO: 23).
  • the 910 amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 is shown in SEQ ID NO: 22.
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 was prepared from rat
  • Rat CLCA1 protein is human at the amino acid level
  • amino acids 268 to 889 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 were identical to the amino acids 4 to 625 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 1st to 3rd Tyr_Gly- in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • Leu is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 from position 265 to position 267
  • the first to tenth sequences of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are substituted with AAAACCAACG in the corresponding nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23.
  • the 17th T, the 224th 1787th ⁇ and the 1868th C are the corresponding SEQ ID NOs:
  • PCR was performed using Polymerase (manufactured by Takara Shuzo), and a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 was cloned into pCR-Bluntll-TOPO vector (manufactured by Invitrogen). This plasmid was introduced into E. coli TO 0 (invitrogen),
  • cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using a Marathon cDNA Amplification kit (manufactured by Clontech). After performing PCR using this cDNA as a type III primer and a combination of primers 1 and 2, and primers 3 and 4, a DNA fragment of the expected size is amplified by agarose gel electrophoresis. Admitted. The reaction was carried out using Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) in a Thermocycler Gene Amp PCR System 9700 (PerkinElmer Co., Ltd.) at 94 ° C for 30 seconds, followed by 94t: for 10 seconds.
  • the reaction cycle was repeated 35 times at 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes and 30 seconds, and the reaction was finally performed at 72 t for 10 minutes.
  • the obtained DNA fragment was cloned into pCR_Blunt II-T0P0 (Invitrogen).
  • T7 promoter primer SEQ ID NO: 40
  • M13RV primer SEQ ID NO: 41
  • six synthetic primers [Primer-1 (SEQ ID NO: 34), Primer-6 (SEQ ID NO: 35), Primer-1 7 (SEQ ID NO: 36), Primer 8 (SEQ ID NO: 37), Primer 9 (SEQ ID NO: 38) and Primer 10 (SEQ ID NO: 39)] to perform a cycle sequence reaction, and the fluorescent DNA sequencer was used.
  • the nucleotide sequence of the reaction product obtained in 1377 (PerkinElmer) was determined.
  • mouse CLCA4 was found to consist of 2772 nucleotide sequences (SEQ ID NO: 27). Based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27, a 924 amino acid sequence was determined (SEQ ID NO: 26) and named as mouse CLCA4 protein.
  • Next Loan ⁇ .7-3 was digested with 11 (1111, and a 1.4Kb mouse CLCA4 DNA fragment containing the C-terminal region was cut out. This was also cloned into Hindlll and cloned! ⁇ 0.3-1 into a mouse (1 ⁇ 8 4).
  • the plasmid pCR-Bluntll-mCLCA4 containing the full-length mouse CLCA4 sequence was ligated to the vector sequence containing the N-terminal region, and the transformant containing this plasmid was used to transform Escherichia coli T0P10 / pCR_BluntII-named as mCLCA4.
  • mouse CLCA4 had 68% homology with human CLCA4 and 51% homology with mouse gob-5.
  • mouse smooth muscle cDNA (Mouse MTC panel II: Clontech) as a type III primer in combination with primer 1 (SEQ ID NO: 30) and primer 11 (SEQ ID NO: 46). It was confirmed that a 2.7 Kb DNA fragment was amplified by electrophoresis.
  • the reaction was performed using a thermal cycler Gene Amp PCR System 9700 (manufactured by Perkin Elmer) using pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) for 30 seconds at 94 first, then 60 seconds at 94 ° C for 10 seconds. The reaction was repeated for 35 cycles, with one reaction cycle consisting of 30 seconds at C and 5 minutes at 72 ° C, followed by a reaction at 72 ° C for 10 minutes. The obtained DNA fragment was cloned into pCR-Bluntll-TOP0 (manufactured by Invitrogen).
  • T7 promoter primer SEQ ID NO: 40
  • M13RV primer SEQ ID NO: 41
  • six synthetic primers [Primer 1 (SEQ ID NO: 34), Primer 6 (SEQ ID NO: 35), Primer 7 (SEQ ID NO: 35) No .: 36), Primer 8 (SEQ ID NO: 37), Primer 9 (SEQ ID NO: 38) and Primer 10 (SEQ ID NO: 39)] to perform a fluorescent sequencer reaction.
  • the base sequence of the reaction product obtained by Elma Corporation was determined.
  • CDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using 1 zg of this mRNA as a starting material and a Marathon cDNA Amplification kit (manufactured by Clontech). After PCR was performed using this cDNA as type I and a combination of primer 12 and primer 13, it was confirmed that a DNA fragment of the expected size was amplified by agarose electrophoresis.
  • the reaction was carried out using pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) on a Thermocycler Gene Amp PCR System 9700 (manufactured by PerkinElmer) first at 94 for 30 seconds, then at 94 for 10 seconds and at 60 The reaction was repeated for 35 cycles with 1 minute as a reaction cycle of 2 minutes at 72 ° C for 30 seconds, and the reaction was finally performed at 72 ° C for 10 minutes.
  • One obtained fragment was cloned into ⁇ 11 ⁇ 11- ⁇ )-0 (manufactured by Invitrogen).
  • T7 promoter primer SEQ ID NO: 40
  • M13RV primer SEQ ID NO: 41
  • three synthetic primers [Primer 12 (SEQ ID NO: 47), Primer 13 (SEQ ID NO: 48), Primer 14 ( [SEQ ID NO: 49)]
  • the nucleotide sequence of the reaction product obtained with a fluorescent DNA sequencer 377 was determined.
  • clone No. a-20 SEQ ID NO: 45
  • a partial amino acid sequence of 373 was determined (SEQ ID NO: 44).
  • the partial amino acid sequence had 66% homology with the corresponding sequence of human CLCA4 and 81% homology with the corresponding sequence of mouse CLCA4 and mouse CLCA4A.
  • Example 1 Isolation of primary rat airway epithelial cells
  • Wistar rats (oss, 7 weeks old) were placed in a sealed container and killed by asphyxiation by injecting carbon dioxide.
  • Tissue culture technology [2nd edition] p. 132 (edited by the Japan Society for Tissue Culture, Asakura Shoten) According to the method, the trachea was excised after inserting a forcenula into the trachea. The inside and outside of the removed trachea is thoroughly washed with DMEM / F12 medium (manufactured by Invitrogen) to remove the attached blood, and then a sufficient amount of 1% protease solution is removed from the force neura using a syringe.
  • DMEM / F12 medium manufactured by Invitrogen
  • DMEM / F12 medium was changed to DMEM / F12 medium and suspended in a medium without CaCl 2 (hereinafter referred to as a modified rat airway epithelial cell medium). It became cloudy and was seeded on a 10 cm 2 (i) Typel collagen coated dish (Iwaki Glass).
  • Culture was continued while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days, and the confluent cells were peeled off with 0.25% trypsin / lmM EDTA solution (manufactured by Invitrogen), and 3x10 4 cells were newly added. Cells were seeded on a lOcin 2 * Typel collagen coated dish. Culture was continued for 40 days while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days. Thereafter, the cells were detached with a 0.25% trypsin / 1 EDTA solution, and 5 ⁇ 10 4 cells were newly seeded on a 10 cm 2 ⁇ Typel collagen coat dish.
  • the culture was continued for 20 days while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days. Thereafter, the cells were detached with 0.25% trypsin 'lmM EDTA solution, and 3 ⁇ 10 4 cells were newly seeded on a 10 cm 2 (i) Typel collagen coat dish. Replace with fresh modified rat airway epithelial cell medium every 2 days. The culture was continued for 15 days. The cells were then detached with 0.25% trypsin ⁇ LMM EDTA solution, freshly seeded 3 X 10 4 cells of the 10 2 Typel collagen coated Disshi Interview. Further, the culture was continued for 12 days while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days.
  • the NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well on an 8-well collagen-coated culture slide (manufactured by Becton Dickinson). On the second day of the culture, the medium was replaced with a fresh medium. On the fourth day of the culture, the cells were washed with PBS, and the cells were fixed with 4% baraformaldehyde (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) for 10 minutes. After washing with a PBS solution containing 0.1% Triton X-100 (manufactured by SIGMA), blocking was performed with 5% BSA for 30 minutes.
  • a primary antibody to recognize epithelial cells was reacted with an anti-cytokeratin antibody derived from egret (ICN) as a primary antibody for 4 hours, and the detection was carried out using anti-peacock IgG fluorescently labeled with FITC (Fluoresce in Isothiocyanate).
  • the antibody (Molecular Probes) was reacted at room temperature for 30 minutes.
  • a mouse-derived anti-MUC5AC antibody or anti-MUC2 antibody both from Neomarkers was reacted at room temperature for 30 minutes as a primary antibody to recognize mucus, and the anti-mouse fluorescently labeled with Texas Red was used for detection.
  • NIM-1 cells are airway epithelial cells that express cytokeratin,
  • Example 3 Expression of rat CLCA1 gene by addition of IL-13 in NIM-1 cells NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells per well on a 96-well collagen-coated plate (manufactured by Becton Dickinson). On day 2 of culture, replace the medium with fresh medium.On day 4 of culture, add mouse IL-13 to a final concentration of 10 ng / ml, and extract total RNA 24 hours after addition using the RNeasy 96 Kit (QIAGEN) did.
  • cDNA was synthesized by reverse transcription in a 1001 reaction mixture using a TaqMan Gold RT-PCR Kit (manufactured by Applied Biosystems).
  • the number of copies of the rat CLCA1 gene was measured by TaqMan PCR using 10 t1 of these, using ABI PRISM 7700 Sequence Detector (manufactured by Applied Biosystems).
  • the primers [Primer 1 (SEQ ID NO: 10), Primer 1 (SEQ ID NO: 11)] and TaqMan probe (SEQ ID NO: 12) used for detecting the gene amount were designed using the Primer Express program. 6-carboxyfluorescein (FAM) was used as the reporter dye of the TaqMan probe.
  • the number of copies of the rat GAPDH gene was determined using TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VIC Probe (manufactured by Applied Biosystems). Samples containing no reverse transcriptase were treated in the same manner to remove non-specific amplification, and the rat CLCA1 gene copy number per GAPDH gene was determined from the following equation.
  • the NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells per well on a 96-well black clear potom plate (Course Yuichisha). Culture was continued while replacing the medium with fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days. Mouse IL-13 was added at a final concentration of l Ong / ml, and the cells were further cultured for 2 days. The C1-channel activity was measured using a FLIPR Membrane Potential Assay Kit (Molecular Devices). A voltage-sensitive dye (Co-immediate onent A) diluted with HBSS buffer (Co-immediate onent B) containing 20 mM HEPES was added at 100 ⁇ 1 per 1 ⁇ l, and reacted at 37 ° C for 30 minutes.
  • Example 2 4 ⁇ 10 4 NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded on a 96-well collagen-coated plate per well. Culture was continued while replacing the medium with fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days, and mouse IL-13 was added to the confluent cells at a final concentration of lOng / ml, followed by culturing for 2 days. After washing with PBS, the medium was replaced with DMEM / F12 medium, and the reaction was performed three times at 37 ° C for 20 minutes. Thereafter, ionomycin having a final concentration of 10 ⁇ ⁇ 1 diluted in 03 ⁇ 4 3 ⁇ 4 12 12 medium was added and reacted at 37 ° C for 30 minutes.
  • the supernatant containing the secreted mucus was transferred to a new 96-well plate and adsorbed at 37 for 2 hours. After the mucus in the supernatant was adsorbed to the plate, the plate was washed with a PBS solution containing 0.3% BSA and 0.05% Tween20 (ICN), and then blocked with 3% BSA at 37 ° C for 2 hours. went. After that, in order to recognize the mucus, a biotinylated Ulex Europaeus Lectin I (UEA-1, manufactured by Wako Pure Chemical) was reacted for 37 hours for 1 hour, and HRP-labeled streptavidin was detected for the detection.
  • UAA-1 biotinylated Ulex Europaeus Lectin I
  • the NIM-1 cells obtained in Example 1 are seeded in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured for 4 days while replacing the medium with fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days.
  • To the plate add 10 1 of fresh medium or a test compound diluted to a certain concentration with fresh medium per well, and incubate at 37 ° C for 10 minutes.
  • mouse IL-13 was added at a final concentration of 10 ng / ml, and the cells were further cultured for 1 day.
  • the total RNA in the cells was analyzed using RNeasy 96 Kit (manufactured by QIAGEN). Extract.
  • cDNA is synthesized by reverse transcription using TaqMan Gold RT-PCR Kit (manufactured by Applied Biosystems). Using a part thereof, the copy number of the CLCA1 gene is measured by the TaqMan PCR method using ABI PRISM 7700 Sequence Detector (manufactured by Applied Biosystems). In the absence of the test compound, the degree of inhibition of CLCA1 expression was evaluated, assuming that the expression level of CLCA1 when IL-13 was added was 100% and the expression level of CLCA1 when IL-13 was not added was 0%. A compound having an action is selected.
  • NIM- 1 cells are seeded 4XL 0 4 per Ueru to 96 black clear Po Tom plates. Culture is continued while changing the medium for fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days, and mouse IL-13 is added to the confluent cells at a final concentration of 10 ng / ml, followed by culturing for 2 days. Add Co Immediate Onent A diluted with Co Immediate Onent B at 75 1 / well, and react at 37 ° C for 20 minutes. To the plate, add Component B or a test compound diluted to a certain concentration with Component B, add 25 I per well, and react at 37 ° C for 10 minutes.
  • the NIM-1 cells obtained in Example 1 are seeded on a 96-well collagen-coated plate at 4 ⁇ 10 4 per well. Culture is continued while replacing the medium for fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days, and mouse IL-13 is added to the confluent cells at a final concentration of 1 Ong / m1 and cultured for 2 days. I do. After washing with PBS, replace the medium with DMEM / F12 medium and perform the reaction 3 times at 37 ° (:, 20 minutes. After removing the medium, dilute the test compound diluted to a certain concentration with fresh DMEM / F12 medium or DMEM / F12 medium. Add 100 1 per well and incubate for 10 minutes at 37 ° C.
  • Example 9 Screening using expression of rat CLCA1 gene as an index
  • a rat airway epithelial cell line (SP0C1) (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, vol. 14, p. 146, 1996) was seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / well on a 96-well collagen plate (manufactured by Becton Dickinson). Cultured for days. On day 4 of the culture, recombinant mouse IL-13 (R & D) and various concentrations (1, 10, and 100 / zM) of wort mannin (CALBI0CHEM) were added, followed by 24 additional days. Cultured for hours. The cells to which no mannin was added were used as controls.
  • the cells were washed with PBS, 50 l / well of Lysis Buffer (QuantiGene High Volume Kit, manufactured by Bayer) was added, and the mixture was left standing at 37 for 30 minutes to lyse the cells. After mixing 100 ⁇ l of Probe Reagent (QuantiGene High Volume Kit, Bayer) into each hole and stirring by pipetting, sample 100 l and bDNA Capture Plate
  • the plate was washed twice with Wash Buffer, and then Substrate Working Reagent (QuantiGene High Volume Kit, manufactured by Bayer) was added at 100 M 1 / wel 1 and reacted at 46 for 1 hour. After returning the plate to room temperature, the luminescence intensity was measured with a plate reader. Since the luminescence intensity increases in proportion to the expression level of rat CLCA1, the mRNA of rat CLCA1 can be quantified by measuring the luminescence intensity. In control cells to which no wortmannin is added, expression of rat CLCA1 is induced by IL-13, and luminescence intensity is increased.
  • Substrate Working Reagent QuantiGene High Volume Kit, manufactured by Bayer
  • Fig. 4 shows the results.
  • the epithelial airway cell line of the present invention stably expresses the protein used in the present invention for a long period of time. Therefore, by using the epithelial airway cell line of the present invention, the epithelial airway cell line A and the cytokine, the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention, and the gene expression of the protein of the present invention are inhibited. A compound or a salt thereof, a compound or a salt thereof that inhibits the production of the protein of the present invention, can be efficiently screened.
  • Chronic obstructive pulmonary disease eg, chronic bronchitis, emphysema
  • diffuse panbronchiolitis bronchial asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia, pulmonary fibrosis, etc.
  • inflammatory bowel disease Allergic conjunctivitis, rhinitis (eg, allergic rhinitis, hay fever, acute rhinitis, chronic rhinitis, hypertrophic rhinitis, atrophic rhinitis, dry pronasitis, vasomotor rhinitis, gangrene It is useful as an agent for preventing and treating rhinitis, sinusitis, etc.

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Abstract

A method of screening a preventive/remedy for respiratory diseases or nephritis by using an airway epithelial cell line expressing CLCA or an airway epithelial cell line capable of expressing CLCA and a cytokine.

Description

明細書 新規気道上皮細胞株およびその用途 技術分野  Description New airway epithelial cell line and its use
本発明は、 新規気道上皮細胞株の用途に関する。 さらに詳しくは、 呼吸器疾患 などの予防 ·治療剤のスクリーニング方法などに関する。 背景技術  The present invention relates to the use of a novel airway epithelial cell line. More specifically, the present invention relates to a screening method for a prophylactic and / or therapeutic agent for respiratory diseases and the like. Background art
慢性閉塞性肺疾患、 慢性気管支炎、 肺気腫、 びまん性汎細気管支炎、 内因性喘 息などは、 喫煙世代の高齢化、 平均寿命の延長等にともなって、 今後、 呼吸器疾 患の中心的な病気になると考えられている。 また、 気管支喘息は気道の慢性炎症 性疾患であり、 気道狭窄を示し、 発作性の呼吸困難、 喘鳴、 咳などの症状が見ら れる。 その発症と進展には気道上皮細胞、 肥満細胞、 好酸球、 Tリンパ球などの 多くの細胞が関与している。  Chronic obstructive pulmonary disease, chronic bronchitis, emphysema, diffuse panbronchiolitis, endogenous asthma, etc. will become the central respiratory diseases in the future due to aging of the smoking generation and prolonged life expectancy Is thought to be a serious disease. Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the respiratory tract, with airway narrowing and paroxysmal dyspnea, wheezing, and coughing. Many cells are involved in its onset and progression, including airway epithelial cells, mast cells, eosinophils, and T lymphocytes.
外界からの刺激 （アレルゲン、 排気物） やウィルス感染により気道の炎症反応 の引き金が引かれると、 気道上皮細胞や気管支周辺の毛細血管内皮細胞上に VCAM-1や ICAM- 1などの接着分子が発現し 〔ジャーナル ·ォブ ·ァラジ一 ·アン ド ·クリニカル ·ィムノロジー （J. Al lergy Cl in. I匪 unol . ) 、 96巻、 941頁、 1995年〕 、 サイト力インや化学遊走物質が産生される。 気管支喘息の患者は Th2 型のヘルパー T細胞の機能が亢進しており、 IL- 3、 IL- 4、 IL-5、 IL_13、 GM- CSFな どの Th2型のサイトカインゃ eotaxin、 RANTESなどのケモカインの産生が増加する。 IL-4や IL-13は IgEの産生誘導作用があり、 IL- 3や IL-4は肥満細胞の増殖誘導作用 がある。 さらに、 IL-5、 GM-CSFなどの作用により好酸球が分化増殖し、 eotaxin、 RANTESにより気道に浸潤してくる 〔ァラジー。アンド 'ァズマ 'プロシーディン' グ （Al lergy As thma Proc. ) 、 20巻、 141頁、 1999年〕 。 また、 サイト力インの 中でも、 IL- 13が慢性閉塞性肺疾患の発症や気管支喘息における粘液過分泌の重 要な因子であることが報告されてきている 〔ジャーナル ォブ クリニカル ィ ンヴエスティゲーシヨン （J. Cl in. Inves t. ) 、 106巻、 1081頁、 2000年；ジャ ーナル ォブ クリニカル インヴエスティゲ一シヨン （J. Cl in. Inves t. ) 、 103巻、 779頁、 1999年〕 。 When an inflammatory reaction in the airways is triggered by external stimuli (allergens, exhausts) or viral infection, adhesion molecules such as VCAM-1 and ICAM-1 are found on airway epithelial cells and capillary endothelial cells around the bronchi. [J. Allergy Clin. I Maraudal Unol., 96, 941, 1995], producing cytokins and chemoattractants Is done. Patients with bronchial asthma have enhanced function of Th2-type helper T cells, and Th2-type cytokines such as IL-3, IL-4, IL-5, IL_13, GM-CSF, and chemokines such as eotaxin and RANTES. Production is increased. IL-4 and IL-13 have an effect of inducing IgE production, and IL-3 and IL-4 have an effect of inducing mast cell proliferation. Furthermore, eosinophils differentiate and proliferate by the action of IL-5, GM-CSF, etc., and infiltrate the respiratory tract by eotaxin and RANTES. And 'azma' Proceeding '(Vol. 20, p. 141, 1999). It has also been reported that IL-13 is an important factor in the development of chronic obstructive pulmonary disease and mucus hypersecretion in bronchial asthma, among cytodynamic agents [Journal of Clinical Investigator]. Chillon (J. Cl in. Inves t.), 106, 1081, 2000; Ja J. Clin. Invest., 103, 779, 1999].
気管 ·気管支の粘膜を覆っている上皮細胞は外界からの刺激が直接粘膜下組織 に伝わるのを防ぐバリヤ一の機能、 分泌物や異物の排泄機能を持つだけでなく、 上皮由来平滑筋弛緩因子の分泌などによって気管の収縮を制御している。 この気 道上皮細胞からの分泌にはクロライドチャネルが重要な働きを持ち、 その異常は 様々な呼吸器疾患を引き起こす。 気道上皮で機能するクロライドチャネルのうち CFTRの機能不全が嚢胞性繊維症を引き起こすことや （Science, 257巻、 1125頁、 1992年） 、 CICクロライドチャネルが筋緊張症と関係している （Nature、 354巻、 304頁、 1991年） ことが報告されている。 特に喘息や慢性閉塞性肺疾患など気道 粘液の過分泌を伴う疾患についてはカルシウム依存性クロライドチャネル （以下、 CLCAと略称することもある） の関与が報告されている 〔アメリカン ジャーナル ォブ レスピラトリー アンド クリティカル ケア ォブ メデイシン （Am. J. Respir. Cri t. Care Med. ) 1-65卷、 11'32頁、 2002年〕 。 また、 CLCA1などの 活性を阻害することと喘息などの治療との関連や、 Gob- 5遺伝子に対するアンチ センスオリゴヌクレオチドの投与による気道過敏性亢進の抑制などが報告されて いる （TO 01/38530号公報） 。  The epithelial cells that cover the mucosa of the trachea and bronchi have a barrier function that prevents external stimuli from being transmitted directly to the submucosal tissue, excretion of secretions and foreign bodies, and epithelial-derived smooth muscle relaxing factor. It controls the contraction of the trachea by secretion. Chloride channels play an important role in the secretion from airway epithelial cells, and the abnormalities cause various respiratory diseases. Among the chloride channels that function in the respiratory epithelium, dysfunction of CFTR causes cystic fibrosis (Science, 257, 1125, 1992), and CIC chloride channel is associated with myotonia (Nature, 354, 304, 1991). In particular, it has been reported that calcium-dependent chloride channel (hereinafter sometimes abbreviated as CLCA) is involved in diseases involving airway mucus hypersecretion, such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease [American Journal of Respiratory and Critical Studies]. Care Med Medin (Am. J. Respir. Crit. Care Med.) 1-65, 11'32, 2002]. In addition, it has been reported that inhibition of activities such as CLCA1 is associated with the treatment of asthma and the like, and that the administration of antisense oligonucleotides to the Gob-5 gene suppresses airway hyperreactivity (TO 01/38530) Gazette).
CLCAを発現する細胞株としてはヒト CLCA2を発現している MCF10A細胞 （Cancer Research, 59巻、 5488頁、 1999年) 、 マウス CLCA1を発現している HC11細胞 (J. Biol. Chem.、 276巻、 40510頁、 2001年） などが報告されているが、 これらはい ずれも胸部上皮細胞株で、 機能的にもガンやアポトーシスとの関連が示唆されて おり、 粘液の過分泌との関連についての報告はない。 また粘液を分泌する気道上 皮細胞株としては、 正常ヒト気道上皮細胞株の NHTBE細胞 〔アメリカン ジャー ナル ォブ フイジォロジカル ラング セル モレキュラー フィジオロジー (Am. J. Phys iol. Lung. Cel l Mol . Phys iol) 、 278巻、 L1118頁、 2000年〕 、 ハムスター初代気道上皮細胞の HTE細胞 〔ジャーナル ォブ セルラー フイジ ォロジ一 (J. Cel lular Phys i ology) 、 125巻、 167頁、 1985年〕 などが報告され ている。  As cell lines expressing CLCA, MCF10A cells expressing human CLCA2 (Cancer Research, vol. 59, p. 5488, 1999), and HC11 cells expressing mouse CLCA1 (J. Biol. Chem., 276) , P. 40510, 2001), all of which have been reported to be thoracic epithelial cell lines and have been implicated functionally in cancer and apoptosis. No reports. In addition, as an airway epithelial cell line that secretes mucus, NHTBE cells of a normal human airway epithelial cell line [Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. ), 278, L1118, 2000), and HTE cells of hamster primary airway epithelial cells (J. Cellular Physiology, 125, 167, 1985). It has been.
気道過敏性や気道粘液の過分泌を伴う疾患については、 CLCAの関与が報告され ており、 CLCAの発現を抑制する薬剤、 CLCAの活性を阻害する薬剤は、 喘息や慢性 閉塞性肺疾患などの呼吸器疾患の有効な治療薬となりうる。 しかしながら、 CLCA は、 疾患の発症に伴って発現が誘導される遺伝子であるため、 呼吸器由来の細胞 で CLCAを発現する細胞株は報告されておらず、 また、 ある種の刺激で CLCAを発現 誘導しうる細胞株についても報告されていない。 副作用の少ない優れた慢性閉塞 性肺疾患や気管支喘息の予防 ·治療剤を開発するために、 CLCAを発現または発現 誘導しうる細胞株の取得が切望されている。 発明の開示 CLCA has been reported for diseases associated with airway hyperresponsiveness and airway mucus hypersecretion. Therefore, drugs that suppress the expression of CLCA and drugs that inhibit the activity of CLCA can be effective drugs for respiratory diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease. However, since CLCA is a gene whose expression is induced with the onset of disease, no cell line expressing CLCA in respiratory cells has been reported, and CLCA is expressed by certain stimuli. No inducible cell lines have been reported. In order to develop a prophylactic and therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease and bronchial asthma with few side effects, there is an urgent need to obtain a cell line that can express or induce the expression of CLCA. Disclosure of the invention
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 初代気道 上皮細胞株を IL- 13で刺激することにより、 CLCA1を高発現する気道上皮細胞株を 見出した。 この知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに 至った。  The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found an airway epithelial cell line that highly expresses CLCA1 by stimulating a primary airway epithelial cell line with IL-13. As a result of further studies based on this finding, the present invention has been completed.
すなわち、 本発明は、  That is, the present invention
(1) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する気道上皮細 胞株、  (1) an airway epithelial cell line that expresses a calcium-dependent chloride channel protein,
(2) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配 列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるアミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ペプチドまたはその塩である上記 （1) 記載の気道上皮細胞株、 (2) Calcium-dependent chloride channel proteins are: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52. An airway epithelial cell line according to the above (1), which is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, or a partial peptide thereof or a salt thereof.
(3) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配 列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記 (1) 記載の気道上皮細胞株、 (3) Calcium-dependent chloride channel proteins are: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or an airway epithelial cell line according to the above (1), which is a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
(4) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配 列番号： 22または配列番号： 50で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記 （1) 記載の気道上皮細胞株、 (4 a) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 22 で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩である上記 （1) 記載の気道上皮細胞株、 (4) The above-mentioned (1), wherein the calcium-dependent chloride channel protein is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50, a partial peptide thereof, or a salt thereof. Airway epithelial cell line, (4a) The airway epithelial cell line according to (1), wherein the calcium-dependent chloride channel protein is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
(5) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を高発現する上記 (1) 記載の気道上皮細胞株、  (5) The airway epithelial cell line according to the above (1), which highly expresses a calcium-dependent chloride channel protein,
(5 a) ハウスキーピング遺伝子に対して約 0. 01%以上のカルシウム依存 性クロライドチャネルタンパク質遺伝子を発現する上記 （1) 記載の気道上皮細 胞株、  (5a) the airway epithelial cell line according to (1), which expresses about 0.01% or more of a calcium-dependent chloride channel protein gene with respect to the housekeeping gene;
(6) 粘液を分泌する能力を有する上記 （1) 記載の気道上皮細胞株、 (7) 粘液が MUC 2タンパク質および （または） MUC 5 ACタンパク質で ある上記 （6) 記載の気道上皮細胞株、  (6) The airway epithelial cell line according to (1), which has the ability to secrete mucus, (7) the airway epithelial cell line according to (6), wherein the mucus is a MUC2 protein and / or a MUC5 AC protein.
(8) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株に、 サイト力インを接触させることを特徴とする、 上記 （1) 記載の気道上皮細胞株の製造法、  (8) The method for producing an airway epithelial cell line according to the above (1), wherein a site force-in is brought into contact with an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein.
(9) サイト力インが I L一 13である上記 （8) 記載の製造法、  (9) The production method according to the above (8), wherein the site force in is IL-13.
(9 a) サイト力インを約 0. 01 ng/ml以上用いる上記 （8) 記載の製 造法、  (9a) The production method according to (8), wherein the site force in is about 0.01 ng / ml or more,
(10) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株が、 N IM— l (FERM B.P— 8091) で標示される 細胞である上記 （8) 記載の製造法、  (10) The method according to the above (8), wherein the airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein is a cell designated by NIM-I (FERM B.P-8091),
(11) N IM—l (FERM B P— 8091 ) で標示される細胞、 (11) N IM-l (FERM B P- 8091) labeled cells,
(12) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、 カルシウム 依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のス クリ一ニング方法、 (12) Screening of a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a calcium-dependent chloride channel protein, characterized by using an airway epithelial cell line and a cytokine capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein. Method,
(12 a) (i) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能 力を有する気道上皮細胞株およびサイトカインを、 カルシウム J!武活剤で活性化レ た場合と （ii) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力 を有する気道上皮細胞株、 サイトカインおよび試験化合物の混合物をカルシウム 賦活剤で活性化した場合における、 カルシウム依存性クロライドチャネルタンパ ク質の活性をそれぞれ測定し、 比較を行う上記 （12) 記載のスクリーニング方 法、 (12a) (i) Calcium-dependent chloride channel protein and the ability to express respiratory epithelial cell lines and cytokines with calcium J! An airway epithelial cell line capable of expressing a mixture of cytokines and test compounds with calcium The screening method according to (12), wherein the activity of the calcium-dependent chloride channel protein when activated by an activator is measured and compared.
(13) 上記 （1) 記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする、 カルシ ゥム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩 のスクリーニング方法、  (13) A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a calcium-dependent chloride channel protein, comprising using the airway epithelial cell line according to (1) above,
(13 a) (i) 上記 （1) 記載の気道上皮細胞株をカルシウム賦活剤で活性 化した場合と （ii) 上記 （1) 記載の気道上皮細胞株および試験化合物の混合物 をカルシウム賦活剤で活性化した場合におけるカルシウム依存性クロライドチヤ ネルタンパク質の活性をそれぞれ測定し、 比較を行うことにより、 カルシウム依 存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を選択 する上記 （13) 記載のスクリーニング方法、  (13a) (i) When the airway epithelial cell line described in (1) above is activated with a calcium activator, and (ii) A mixture of the airway epithelial cell line described in (1) and a test compound is activated with a calcium activator. (13) The method according to (13) above, wherein the activity of the calcium-dependent chloride channel protein when activated is measured, and a compound or salt thereof that inhibits the activity of the calcium-dependent chloride channel protein is selected by comparing the activities. Screening method,
(14) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配列番号： 22または配列番号： 50で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩である上記 （12) または （13) 記載のスクリーニング方法、  (14) A protein or a partial peptide thereof, wherein the calcium-dependent chloride channel protein has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50 Or the salt thereof, the screening method according to the above (12) or (13),
(15) カル ウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性が、 クロライ ドチャネル様活性または粘液分泌活性である上記 （12) または （13) 記載の スクリーニング方法、  (15) The screening method according to the above (12) or (13), wherein the activity of the calcium-dependent chloride channel protein is a chloride channel-like activity or a mucus secretion activity.
(15 a) カルシゥム依存性クロライドチャネルタンパク質の活性が、 クロラ ィドチャネル様活性または粘液分泌活性である上記 （12 a) または （13 a) 記載のスクリーニング方法、  (15a) The screening method according to (12a) or (13a) above, wherein the activity of the calcium-dependent chloride channel protein is a chloride channel-like activity or a mucus secretion activity.
(16) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株およびサイト力インまたは上記 （1) 記載の気道上皮細胞株 を含有することを特徴とする、 カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質 の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、  (16) A calcium-dependent chloride channel protein comprising an airway epithelial cell line and a cytodynamic cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein or the airway epithelial cell line according to (1). A kit for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of
(17) 上記 （12) もしくは （13) 記載のスクリーニング方法または上記 (16) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、 (17) a compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to (12) or (13) or the screening kit according to (16);
(18) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、 カルシウム 依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、 (18) Capable of expressing calcium-dependent chloride channel protein A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of a calcium-dependent chloride channel protein gene, characterized by using a respiratory epithelial cell line and a cytokine,
(18 a) (i) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する 能力を有する気道上皮細胞株およびサイト力インを培養した場合と （ii) カルシ ゥム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞 株、 サイト力インおよび試験化合物の混合物を培養した場合における、 カルシゥ ム依存性クロライドチャネルタンパク質遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、 比較 することにより、 カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発 現を阻害する化合物またはその塩を選択する上記 （18) 記載のスクリーニング 方法、  (18a) (i) an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a culture of a cytodynamic cell line; and (ii) an airway capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein. The expression of calcium-dependent chloride channel protein gene was determined by measuring and comparing the expression levels of calcium-dependent chloride channel protein genes when culturing a mixture of epithelial cell lines, cytodynamic cells, and test compounds. The screening method according to the above (18), wherein a compound or a salt thereof that inhibits
(18 b) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を 有する気道上皮細胞株が、 哺乳動物 （ヒ卜、 ラット、 マウスなど） の初代気道上 皮細胞が株化された細胞株である上記 （18) または上記 （18 a) 記載のスク リ一ニング方法、  (18b) The airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein is a cell line in which primary airway epithelial cells of mammals (human, rat, mouse, etc.) have been established. 18) or the screening method described in (18a) above,
(18 c) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を 有する気道上皮細胞株がラット気道上皮細胞株である上記 （18) または （18 a) 記載のスクリーニング方法、  (18c) the screening method according to (18) or (18a), wherein the airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein is a rat airway epithelial cell line;
(18 d) ラット気道上皮細胞株が、 N I M— 1 (FERM BP— 809 1) で標示される細胞または S POC 1 (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 14巻、 146頁、 1996年） 細胞である上記 （18 c) 記載のスクリーニング方法、  (18 d) The rat respiratory epithelial cell line is a cell designated by NIM-1 (FERM BP-8091) or a SPOC 1 (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 14, 146, 1996) The screening method according to (18c) above,
(19) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配列番号： 22または配列番号： 50で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩である上記 （18) 記載のスクリーニング方法、  (19) A protein or a partial peptide thereof, wherein the calcium-dependent chloride channel protein has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50 Or the salt thereof, the screening method according to the above (18),
(20) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株およびサイトカインを含有することを特徴とする、 カルシゥ ム依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物または その塩のスクリーニング用キット、 (20) a compound which inhibits expression of a calcium-dependent chloride channel protein gene, comprising an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a cytokine, A kit for screening the salt,
(21) 上記 （18) 記載のスクリーニング方法または上記 （20) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる化 物またはその塩、  (21) A compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to (18) or the screening kit according to (20).
(22) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株およびサイト力インを用いることを特徴とする、 カルシウム 依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のス クリーニング方法、  (22) Screening of a compound or a salt thereof that inhibits the production of a calcium-dependent chloride channel protein, which comprises using an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a cytokin. Method,
(22 a) (i) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する 能力を有する気道上皮細胞株およびサイト力インを培養した場合と （ii) カルシ ゥム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する気道上皮細胞 株、 サイト力インおよび試験化合物の混合物を培養した場合における、 カルシゥ ム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生量を、 それぞれ測定し、 比較する ことにより、 カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する 化合物またはその塩を選択する上記 （22) 記載のスクリーニング方法、  (22a) (i) respiratory tract epithelial cell line capable of expressing calcium-dependent chloride channel protein and when cultured with cytodynamics; and (ii) respiratory tract capable of expressing calcium-dependent chloride channel protein Inhibition of calcium-dependent chloride channel protein production by measuring and comparing the amount of calcium-dependent chloride channel protein produced by culturing a mixture of epithelial cell lines, cytodynamics and test compounds The screening method according to the above (22), wherein the compound or a salt thereof is selected,
(23) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配列番号： 22または配列番号： 50で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩である上記 （22) 記載のスクリーニング方法、  (23) a protein or a partial peptide thereof, wherein the calcium-dependent chloride channel protein has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50 Or a salt thereof, the screening method according to the above (22),
(24) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株およびサイト力インを含有することを特徴とする、 カルシゥ ム依存性ク口ライドチャネル夕ンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング用キッ卜、  (24) A compound that inhibits the production of calcium-dependent oral chloride channel protein, which comprises an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a cytokin. Or a salt screening kit,
(25) 上記 （22) 記載のスクリーニング方法または上記 （24) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、  (25) a compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to (22) or the screening kit according to (24);
(26) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株が、 N IM—l (FERM BP— 8091) で標示される 細胞である上記 （12) 、 （18) または （22) 記載のスクリーニング方法、 (26) The airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein is a cell indicated by NIM-l (FERM BP-8091) as described in (12), (18) or (22) above. ) Described screening method,
(27) 上記 （17) 、 （21) または （25) 記載の化合物またはその塩を 含有してなる医薬、 (28) 呼吸器疾患の予防 ·治療剤である上記 （27) 記載の医薬、 (27) a medicament comprising the compound according to (17), (21) or (25) or a salt thereof, (28) The medicament according to the above (27), which is a prophylactic or therapeutic agent for a respiratory disease.
(29) 呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患または気管支喘息である上記 （28) 記載の医薬、  (29) The medicament according to the above (28), wherein the respiratory disease is chronic obstructive pulmonary disease or bronchial asthma.
(30) 鼻炎の予防 ·治療剤である上記 （27) 記載の医薬、  (30) The medicament according to the above (27), which is an agent for preventing or treating rhinitis.
(31) カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有 する気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防 ·治 療剤のスクリーニング方法、  (31) a method for screening a respiratory disease or rhinitis prophylactic / therapeutic agent, which comprises using an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein;
(32) 上記 （1) 記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾 患または鼻炎の予防 ·治療剤のスクリーニング方法、  (32) A method for screening a preventive or therapeutic agent for respiratory disease or rhinitis, characterized by using the airway epithelial cell line according to (1) above,
(33) 上記 （11) 記載の細胞および I L一 13を用いることを特徴とする 呼吸器疾患または鼻炎の予防 ·治療剤のスクリーニング方法、 ' (33) A method for screening a respiratory disease or rhinitis prevention / treatment agent, comprising using the cell and IL-13 according to (11) above.
(34) 哺乳動物に対し、 上記 （17) 、 （21) または （25) 記載の化合 物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予 防 ·治療方法、 (34) A method for preventing or treating respiratory disease or rhinitis, which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound according to (17), (21) or (25) or a salt thereof,
(35) 呼吸器疾患または鼻炎の予防 ·治療剤の製造のための、 上記 （17) 、 (21) または （25) 記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。 図面の簡単な説明  (35) Use of the compound or a salt thereof according to (17), (21) or (25) for the manufacture of a prophylactic or therapeutic agent for respiratory disease or rhinitis. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 実施例 3における、 N IM— 1細胞の I L一 13添加時のラット CL CA1遺伝子の発現量を表す図である。 図中、 口は I L一 13無添加培養群、 画 は I L— 13添加培養群を示す。  FIG. 1 is a diagram showing the expression level of rat CLCA1 gene in Example 3 when IL-13 was added to NIM-1 cells. In the figure, the mouth indicates the culture group without addition of IL-13, and the image indicates the culture group with addition of IL-13.
図 2は、 実施例 4における、 I L— 13を添加して培養した N I M— 1細胞の Ca2+依存性 C 1—チャネル活性の増加に伴う膜電位の上昇を表す図である。 図 中、 騸は I L一 13添加培養 ·ィオノマイシン刺激群、 口は I L一 13添加培 養 'ィオノマイシン無刺激群、 ▲は I L—13無添加培養 'ィオノマイシン刺激 群、 △は I L一 13無添加培養'ィオノマイシン無刺激群を示す。 FIG. 2 is a diagram showing an increase in membrane potential of NIM-1 cells cultured with addition of IL-13 accompanying an increase in Ca 2+ -dependent C 1 -channel activity in Example 4. In the figure, 騸 indicates culture with IL-13 supplementation · ionomycin stimulation group, mouth indicates culture with IL-13 supplementation 'ionomycin non-stimulation group', ▲ indicates culture without IL-13 'ioniomycin stimulation group, △ indicates culture without IL-13 supplementation 'Iionomycin unstimulated group is shown.
図 3は、 実施例 5における、 I L一 13を添加して培養した N I M— 1細胞の、 ィオノマイシン刺激による粘液分泌の増加を表す図である。 図中、 口は I L一 1 3無添加培養群、 画は I L一 13添加培養群を示す。 図 4は、 実施例 9における、 S P O C 1細胞での I L— 1 3によるラット C L C A 1遺伝子の発現誘導に対するワートマンニンの抑制作用を表す図である。 図 中、 縦軸はコントロールの発光強度を 1 0 0 %としたときのワートマンニン添加 時の発光強度を示す。 白いバーはワートマンニン濃度 1 0 0 i M、 灰色のバーは ワートマンニン濃度 1 0 M、 黒いバ一はヮ一トマンニン濃度 1 Mを添加した 場合のラット C L C A 1遺伝子の発現量である。 発明を実施するための最良の形態 FIG. 3 is a diagram showing the increase in mucus secretion of NIM-1 cells cultured with the addition of IL-113 by ionomycin stimulation in Example 5. In the figure, the mouth shows the culture group without IL-113, and the drawing shows the culture group with IL-113. FIG. 4 is a graph showing the inhibitory effect of wortmannin on the induction of expression of rat CLCA1 gene by IL-13 in SPOC1 cells in Example 9. In the figure, the vertical axis indicates the emission intensity when wortmannin was added when the emission intensity of the control was 100%. The white bar is the wortmannin concentration of 100 iM, the gray bar is the wortmannin concentration of 100 M, and the black bar is the expression level of the rat CLCA1 gene when the wortmannin concentration of 1 M was added. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明で用いられるカルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質 （以下、 本発明で用いられるタンパク質または本発明のタンパク質と称することもある） としては、 カルシウム依存性ク口ライドチャネル夕ンパク質ファミリ一に属する タンパク質などが用いられ、 例えば、 配列番号： 1、 配列番号： 2 2、 配列番 号： 2 6、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 5 0、 配列番号： 5 1、 配列番号： 5 2または配列番号： 5 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質などが用いられる。  Examples of the calcium-dependent chloride channel protein used in the present invention (hereinafter, also referred to as the protein used in the present invention or the protein of the present invention) include proteins belonging to the calcium-dependent cleft chloride channel protein family and the like. For example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: No .: 52 or a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is used.
本発明で用いられるタンパク質は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラ ッ卜、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例 えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 0細胞、 骨髄細胞、 メサン ギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平 滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロフ ァージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もし くはガン細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 勝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋な どに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。 配列番号： 1、 配列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番 号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番 号： 1、 配列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表わ されるアミノ酸配列と約 40%以上、 好ましくは約 50%以上、 好ましくは約 6 0%以上、 好ましくは約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 好ましくは約 9 0%以上、 好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げら れる。 The protein used in the present invention includes cells of human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, pigs, sheep, pigs, monkeys, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, Nerve cells, glial cells, kidney 0 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells , Immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone Cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells, or cancer cells of these cells) or any of those cells Tissues, for example, brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, stomach, kidney, liver , Gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testicle, ovary, placenta, It may be a protein derived from the uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or may be a synthetic protein. Amino acid represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53 As the amino acid sequence substantially identical to the sequence, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: : 52 or about 40% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, preferably about 70% or more, preferably about 80% or more, preferably about 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53. Is an amino acid sequence having about 90% or more, preferably about 95% or more homology.
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フ ィル夕リング =0FF) にて計算することができる。  The amino acid sequence homology was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; file ring). = 0FF).
配列番号： 1、 配列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番 号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク 質としては、 例えば、 配列番号： 1、 配列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番 号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52 または配列番号： 53で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含有し、 配列番号： 1、 配列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配 列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番 号： 53で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を 有するタンパク質などが好ましい。  Amino acid represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53 Examples of proteins having an amino acid sequence substantially identical to the sequence include, for example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, It contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, or a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53. preferable.
実質的に同質の活性としては、 例えば、 クロライドチャネル様活性 （例、 カル シゥム依存性クロライドチャネル様活性） 、 粘液分泌活性などが挙げられる。 実 質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的 に） 同質であることを示す。 したがって、 クロライドチャネル様活性、 粘液分泌 活性などが同等 （例、 約 0. 01〜100倍、 好ましくは約 0. 1〜10倍、 よ り好ましくは 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 夕 ンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 Examples of substantially equivalent activities include, for example, chloride channel-like activity (eg, calcium-dependent chloride channel-like activity), mucus secretion activity, and the like. Substantially homogeneous indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, it is preferable that the chloride channel-like activity, the mucus secretion activity, and the like are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). But the extent of these activities, evening Quantitative factors such as the molecular weight of the proteins may be different.
クロライドチャネル様活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例 えば、 ジエノミクス （Genomics) 、 54巻、 200頁 （1998) に記載の方法 またはそれに準じる方法に従って測定することができる。  The chloride channel-like activity can be measured according to a known method, for example, according to the method described in Genomics, Vol. 54, p. 200 (1998) or a method analogous thereto.
粘液分泌活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例えば、 バイオ ケミカル ジャーナル （Biochem. J) 、 316巻、 943頁 （1996) に記載 の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。  The mucus secretion activity can be measured according to a known method. For example, it can be measured according to the method described in Biochemical Journal (Biochem. J), vol. 316, p. 943 (1996) or a method analogous thereto. it can.
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 ①配列番号： 1、 配 列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるァミノ · 酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、 ②配列番号： 1、 配列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列 番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番 号： 53で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個 程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のァミノ 酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列齊号： 1、 配列番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番 号： 52または配列番号： 53で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 (1〜5) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 ④配列番号： 1、 配列番 号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程 度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された アミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク 質などのいわゆるムテインも含まれる。  Examples of the protein used in the present invention include: (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, One or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53 (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 10 5) amino acid sequence deleted amino acid sequence, ② SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5)) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53 ) Amino acid sequence with amino acid added, ③ Sequence ID: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 ( Preferably, an amino acid sequence having about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids inserted therein. ④SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 or 1 or 2 or more (preferably) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 Is an amino acid sequence in which about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5 amino acids have been substituted with another amino acid, or an amino acid sequence combining them. Includes so-called muteins such as contained proteins .
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 本発明で用いられ るタンパク質は、 C末端が、 力ルポキシル基 （- C00H) 、 カルポキシレート（- C00— ) 、 アミド （- C0N ) またはエステル （- C00R) の何れであってもよい。 In the protein in the present specification, the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (potassium terminus) according to the convention of peptide notation. Used in the present invention The C-terminus of the protein may be any of a carboxyl group (-C00H), a carboxylate (-C00-), an amide (-C0N) or an ester (-C00R).
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シ クロへキシルなどの C 3—ンクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルな どの C 6— 12ァリ一ル基、 例えば、 ベンジル、 フェネチルなどのフエ二ルー C ,.2T ルキル基もしくは 一ナフチルメチルなどの Q!—ナフチル— C t_2アルキル基など の C 7— 14ァラルキル基、 ビバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。 Here, R in the ester is, for example, an alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and n-butyl; for example, a C 3 -cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl; for example, phenyl, α - naphthyl which any C 6 - 12 § Li Ichiru group, e.g., benzyl, phenylene Lou C such as phenethyl, 2 T alkyl group or a Q, such as single naphthylmethyl -.! naphthyl - C t_ C, such as 2-alkyl group 7 - 14 Ararukiru group, Viva port Iruokishimechiru group is used.
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （または力ルポ キシレ一卜) を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化さ れているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。  When the protein used in the present invention has a lipoxyl group (or lipoxyl group) at a position other than the C-terminus, a protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified may also be used in the present invention. include. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
さらに、 本発明 用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メ チォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C Mアルカノィルなどの C卜 6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断 されて生成する N末端のグルタミン残基がピ口グルタミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば - 0H、 -SH, アミノ基、 イミダゾ一ル基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの C アル力ノィル基などの C wァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含ま れる。 Furthermore, the protein used the invention may include amino acid residues (e.g., main Chionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups (e.g., formyl groups, C WINCH 6 Ashiru groups such as C M Arukanoiru such Asechiru group Etc.), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, and glutamine oxidized at the mouth, Substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg-0H, -SH, Amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are protected by a suitable protecting group (eg, C aryl group such as formyl group, acetyl group, etc.). And complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 2 2で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を含有する タンパク質、 配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配 列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 5 0で 表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 5 1で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列を含有す るタンパク質、 配列番号： 5 3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 マウス C L C A 1 (J Biol Chem, 273巻、 32096頁、 1998年） 、 マウス C L C A 2 (Bi ochem Biophys Res Com 264巻、 933頁、 1999年) などがあげられる。 本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明で用 いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明で用 いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。 また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1 5 ) 個） のァ ミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1 2 0個程度、 より好ましくは 1 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1 5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1 2 0個程度、 より好ましくは 1 1 0個程度、 さらに好まし くは数 （1 5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （好ましくは、 1 1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好 ましくは 1 5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （- C00H) カルボキシレート (-C00") 、 アミド (-C0NH2) またはエステル (-C00R) の何れ であってもよい。 Specific examples of the protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42; a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 50 A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51; a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53 A protein containing the represented amino acid sequence, Mouse CLCA 1 (J Biol Chem, 273, 32096, 1998); mouse CLCA 2 (Biochem Biophys Res Com, 264, 933, 1999). The partial peptide of the protein used in the present invention is the partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. Any one may be used. In the partial peptide used in the present invention, one or more (preferably about 110, more preferably about (15)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, Or 1 or 2 or more (preferably, about 120, more preferably, about 110, and more preferably, about (15)) amino acids are added to the amino acid sequence, or One or more (preferably about 120, more preferably about 110, and more preferably a number (15)) amino acids are inserted into the sequence, or the amino acid sequence One or two or more (preferably about 110, more preferably several, and still more preferably about 15) amino acids of the above may be substituted with another amino acid. The partial peptide used in the present invention C-terminal carboxyl group (- C00H) carboxylate (-C00 "), may be any of the amide (-C0NH 2) or ester (-C00R).
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられる タンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 (またはカルポキシレート) を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が 保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残 基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な 保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど の複合ペプチドなども含まれる。  Further, similar to the protein used in the present invention, the partial peptide used in the present invention includes those having a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, N-terminal amino acid residues ( E.g., methionine residue) whose amino group is protected by a protecting group, glutamine residue generated by cleavage of N-terminal in vivo, pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule However, it includes those protected by a suitable protecting group, or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いること ができる。  The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に 許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩 が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩と しては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コ八ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。 As the salt of the protein or partial peptide used in the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, an organic acid) or a base (eg, an alkali metal salt) is used. Are preferred. With such salt For example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, kohic acid) , Tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前 述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によつ て製造することもできるし、 夕ンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換 体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合成 法に準じて製造することもできる。  The protein, its partial peptide, or a salt thereof used in the present invention can be produced by a known protein purification method from human or warm-blooded animal cells or tissues as described above, or can encode a protein. It can also be produced by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。  When producing from human or mammalian tissues or cells, the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそ のアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルァ ルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロ キシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4 - ( 2， , 4， ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル) フエノキシ樹脂、 4ー （2 ' ， 4 ' ージメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエノキシ樹 脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—アミノ基と側鎖官能 基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 公知の各 種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質また は部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で 分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部分ぺプ チドまたはそれらのアミド体を取得する。  For the synthesis of the protein or partial peptide or a salt thereof, or an amide thereof used in the present invention, a commercially available resin for protein synthesis can be usually used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin , 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,, 4, dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ', 4' dimethoxyphenyl aminomethylethyl ) Phenoxy resin. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or their amide Get the body.
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ル— N ' - ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H〇 B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性 化を行なった後に樹脂に添加することができる。 Regarding the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. Karposi Examples of the amides include DCC, N, N'-diisopropylcarboimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like. For these activations, the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt), or may be pre-formed as a symmetric anhydride or H ま た は Bt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピ 口リドンなどの酸アミド類、 塩ィ匕メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのェ一テ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約 _ 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な 縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反 応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにす ることができる。  The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpiperidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc. Alcohols, sulfoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof. Are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid may be acetylated with acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction. it can.
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t一ペンチルォキシ カルボニル、 ィソポル二ルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシカル ポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2 _ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエ二ル ホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。  Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isoporiloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, Br—Z, and adamantyl. For example, oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t一ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロオタチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルボニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。 Carbonyl groups are, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl). Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as tyl, cyclootatyl, 2-adamantyl, etc., aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester) Benzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （Cw) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカ ルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロ ビラ二ル基、 t—ブチル基などである。  The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. As a group suitable for the esterification, for example, a group derived from carbonic acid such as a lower (Cw) alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarponyl group is used. . Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, and a t-butyl group.
チロシンのフエノ一ル性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12- Bz l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。 The protecting group of Fueno Ichiru hydroxyl group of tyrosine, for example, B z 1, C 1 2 - Bz l, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキシ -2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum, Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。  As the protecting group for imidazole of histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2， 4, 5—トリクロ口フエノール、 2, 4ージニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフ夕ルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。  Examples of activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethyl alcohol, p-nitrophenol, H〇NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, and esters with HOB t)]. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においてほ、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイド、 1 , 4—ブタンジチオール、 1， 2 —エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基とし て用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 トリブトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2 —エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。 Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc. Reduction by pum is also used. The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisol, phenol, thioanisole, methacresol, paracresol It is effective to add a thione scavenger such as toluene, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. In addition, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is 1,2-ethanedithiol, In addition to deprotection by acid treatment in the presence of 1,4-butanedithiol, etc., it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution or dilute ammonia.
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。  The protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチ ド鎖の Ν末端のひーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分べプチ ドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺプ チドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒 中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得ら れた保護タンパク質またはべプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護 基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗夕 ンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍 結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができ る。  As another method for obtaining an amide form of a protein or partial peptide, for example, first, after amidating and protecting the α-hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal, a peptide (protein) chain having a desired chain length is attached to the amino group side. The protein or partial peptide from which only the protecting group for the amino-terminal hamino group of the peptide chain has been removed and the protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal lipoxyl group has been removed And condensing these proteins or peptides in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein or peptide can be obtained. The crude protein or peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain the desired protein or peptide amide.
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはべプチドのエステル体を得ることができる。 本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 公知のペプチドの合成 法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダ一ゼで切 断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用いられ る部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合 させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチ ドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。 In order to obtain an ester of a protein or peptide, for example, after condensing the α-hydroxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein is prepared in the same manner as the amide of a protein or peptide. It is possible to obtain an ester of quality or a peptide. The partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptide. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid which can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to thereby remove the desired peptide. Can be manufactured. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following ① to ⑤.
ΦΜ. Bodanszkyおよび M. A. Onde t t K ペプチド ·シンセシス (Pept ide  ΦΜ. Bodanszky and M.A. Onde t t K peptide synthesis (Peptide
Synthes i s) , Intersc i ence Publ i shers, New York (1966年) Synthes is), Interscience Publ isers, New York (1966)
② Schroederおよび Luebke、 ザ'ペプチド（The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年）  ② Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年） ' (3) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975) ''
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年） 治 Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店  治 Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs, Volume 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。  After the reaction, the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto. Can be converted into a free form or another salt by a method according to the above.
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述 した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 好ましくは D NAである。 D NAとしては、 ゲ ノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリ一、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞'組織より 全 RN Aまたは mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称す る） によって増幅することもできる。 The polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention. Preferably it is DNA. The DNA may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell and tissue-derived cDNA, the above-described cell and tissue-derived cDNA library, and any of synthetic DNAs. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, from the above-described cell 'tissue It is also possible to directly amplify by direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using the prepared total RNA or mRNA fraction.
本発明で用いられるタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番 号： 2、 配列番号： 23、 配列番号： 27、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 56または配列番号.： 57で表さ れる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2、 配列番号： 23、 配列番 号： 27、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 56または配^番号： 57で表される塩基配列とハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明で用いられるタンパ ク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DN Aであれば何れ のものでもよい。  Examples of the DNA encoding the protein used in the present invention include: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, Sequence No. 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57. A protein used in the present invention which contains a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as those of DNA.
配列番号： 2、 配列番号： 23、 配列番号： 27、 配列番号： 43、 配列番 号： 45、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 56または配列番号： 57で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズでき る DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 23、 配列番号： 27、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番 号： 56または配列番号： 57で表される塩基配列と約 40%以上、 好ましくは 約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 好ましくは 約.80 %以上、 好ましくは約 90 %以上、 好ましくは約 95 %以上の相同性を有 する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。  SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or base represented by SEQ ID NO: 57 Examples of the DNA that can hybridize with the sequence under high stringency conditions include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, Sequence SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57 and about 40% or more, preferably about 50% or more, preferably about 60% or more, preferably about 70% or more, preferably about DNA containing a nucleotide sequence having a homology of .80% or more, preferably about 90% or more, preferably about 95% or more is used.
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用 ( 、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；フィル夕リン'グ =0Ν；マッチスコア =1；ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。  The homology of the nucleotide sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) (with the following conditions (expected value = 10; gap allowed; Match score = 1; mismatch score = -3).
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販のライブラリー を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。 よ り好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。 Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Yo More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜4 Om M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 ° (、 好ましくは約 60 〜 65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65 °Cの 場合が最も好ましい。  High stringency conditions refer to, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 4 OmM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° (preferably about 60 to 65 ° C). Particularly, it is most preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DN Aが、 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 23で表される塩基配列を含有する DN Aが、 配 列番号： 26で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNA としては、 配列番号： 27で表される塩基配列を含有する DN Aが、 配列番号： 42で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 43で表される塩基配列を含有する DN Aが、 配列番号： 44で表さ れるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DN Aとしては、 配列番 号： 45で表される塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 50で表されるァ ミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 54 で表される塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 51で表されるアミノ酸配 列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 55で表され る塩基配列を含有する DNAが、 配列番号： 52で表されるアミノ酸配列を含有 するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 56で表される塩基配 列を含有する DNAが、 配列番号： 53で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 57で表される塩基配列を含有 する DN Aなどが用いられる。  More specifically, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented by SEQ ID NO: 22. The DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26. The DNA encoding the protein containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 is represented by SEQ ID NO: 42. The DNA encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 is represented by SEQ ID NO: 43. The DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44. Number: As the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by 50, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 54 contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 As a DNA encoding a protein, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 55 is used. As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56 is used. The DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 is a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53. Are used.
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DN A) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列 を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲ ノム DNAライブラリ一、 前記した細胞'組織由来の cDNA、 前記した細胞。 組織由来の c DN Aライブラリ一、 合成 DN Aのいずれでもよい。  The polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. Also, a genomic DNA, a genomic DNA library, a cDNA derived from the above-described cell, or a cell as described above. Any of a tissue-derived cDNA library and a synthetic DNA may be used.
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2、 配列番号： 23、 配列番号： 27、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 56または配列番号： 57で表さ れる塩基配列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号： 2、 配列番号： 23、 配列番号： 27、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番 号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 56または配列番号： 57で表される塩 基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DN Aの一部分を含有する DN Aなどが用いられる。 The DNA encoding the partial peptide used in the present invention includes, for example, a sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57 DNA having a part of the contained DNA, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 Or a portion of DNA encoding a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57 and encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention. And the like containing DNA.
配列番号： 2、 配列番号： 23、 配列番号： 27、 配列番号： 43、 配列番 号： 45、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 56または配列番号： 57で表される塩基配列とハイブリダィズできる DN Aは、 前記と同意義を示す。 ハイブリダィゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。  SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or base represented by SEQ ID NO: 57 The DNA that can hybridize with the sequence has the same significance as described above. The same hybridization method and high stringent conditions as described above are used.
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする D N Aのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパ ク質と略記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクローニングの手段と しては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 DNA プライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み 込んだ DNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A断 片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼ一シヨンによつ て選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、  A DNA or a partial peptide used in the present invention (hereinafter, in the description of cloning and expression of DNAs encoding them, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention). As a cloning means, the DNA of the present invention is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector. The DNA can be selected by hybridization with a DNA fragment coding for a part or the entire region of the DNA or a DNA labeled with a synthetic DNA. The method of hybridization is, for example,
Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販のライブラリー を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 MutanTM- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 MutanTM-K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA-LA PCR法や Gapped du 1 ex法や Kunke 1法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法 に従って行うことができる。 The DNA base sequence can be converted by PCR or a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo) or Mutan TM -K (Takara Shuzo) using the 0DA-LA PCR method or the like. It can be performed according to a known method such as the Gapped du 1 ex method or the Kunke method, or a method analogous thereto.
クローン化された夕ンパク質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することが できる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 ま た 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダブターを用いて付加することもできる。 The DNA encoding the cloned protein can be used as is, or Can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
本発明のタンパク質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現べクタ一中のプロモータ一の下流に連結することにより製造すること ができる。  The expression vector of the protein of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting downstream of
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， PBR32 5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10， TP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9, pSHl 5) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 pXTl、 pR c/CMV、 pRc/RSV、 p cDNA I/Ne oなどが用いられる。  Examples of the vector include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, PBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, TP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSHl9). , pSHl 5), bacteriophages such as λ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Ne, etc. Is used.
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモータ一、 SV40プロモー夕一、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモータ一などが挙げられる。 これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモータ一、 SRひプロモ —ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l a cプロモータ一、 r e cAプロモータ一、 APLプロモー ター、 l ppプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SPOlプロモ一夕一、 SP〇2プロモ一ター、 p e nPプロモータ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞であ る場合は、 ポリヘドリンプロモ一ター、 P 10プロモー夕一などが好ましい。 発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズ八ムスター細胞を用いて d h f r遺伝子 を選択マーカ一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。 The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Among them, it is preferable to use CMV (cytomegalovirus) promoter, SR promoter and the like. When the host is Eshierihia genus, when trp promoter one, lac promoter one, re cA promoter one, AP L promoter, l pp promoter, T 7 promoter, the host is Ru der Bacillus, spol When the host is yeast, such as promoter overnight, SP〇2 promoter, penP promoter, etc., PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable. The expression vector may include, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter, S V40 ori) may be used. Examples of selectable markers include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp 1 ) ), the neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance), and the like. in particular, using the dhfr gene as a selectable marker one with dh fr gene deficient Chinese eight Muster cells In this case, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシェリヒア属菌である場合は、 P h o A ·シグナル 配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α— アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MF« ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物 細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インタ一フエロン ·シ グナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。  If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is Escherichia, Pho A signal sequence, OmpA signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., the host is In the case of yeast, MFMF signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available for each.
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Αを含有する ベクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。  A transformant can be produced using the thus constructed vector containing the DNA encoding the protein of the present invention.
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。  As the host, for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ  Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli.
(Escherichia coli) K 12 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 巻， 160(1968)〕 ， JM103 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309(1981)〕 , J A 221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)] , HB 101  (Escherichia coli) K12-DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA 221 [Journal of Molecular] Biology, 120, 517 (1978)], HB 101
[Journal of Molecular Biology, 41巻， 459(1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39 巻， 440(1954)〕 などが用いられる。  [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] and the like are used.
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis) M I 114 〔Gene, 24巻， 255 (1983)〕 ， 207-21 [Journal of Biochemistry, 95卷， 87(1984)] などが用いられる。  As the Bacillus bacterium, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R―， NA87— 11A, DKD- 5D, 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス 'ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NC YC 1913, NCYC 2036、 ピキア ·パストリス （Pichia pastoris) K Μ71などが用いられる。 Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris K Μ71, etc. .
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴィポ （In  As insect cells, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five ™ cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a cell line derived from silkworm (Bombyx mori N cell; BmN cell) is used. Examples of the Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (Vaughn, J.L., et al., In Vipo).
Vivo) ，13， 213-217, (1977)) などが用いられる。 Vivo), 13, 213-217, (1977)).
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature,315 巻， 592 (1985)〕 。 - 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve'r o, チヤィニ一ズハ ムス夕一細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） , dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r") 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3， ヒト FL 細胞などが用いられる。  As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)]. -As animal cells, for example, monkey cell COS-7, Ve'ro, chick cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient chick cell CHO cell (hereinafter CHO) CHO (dh fr ") cells), mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. To transform Escherichia sp., For example, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻, 107 (1982)などに記載の方法に従って行うこと ができる。 USA, 69, 2110 (1972) and Gene, 17, 107 (1982).
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General  To transform Bacillus, for example, use Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行うことができる。 Genetics, Vol. 168, 111 (1979) and the like.
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182- To transform yeast, for example, see Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-
187(1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行うことができる。 Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47- 55 (1988)) などに記載の方法に従って行うことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコ一ル. 63-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載の方 法に従って行うことができる。 Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). Transformation of animal cells can be performed, for example, by the method described in Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 63-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be done according to law.
このようにして、 タンパク質をコードする DN Aを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。  Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成長促進因子などを添 加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。  When culturing a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is contained therein. , Nitrogen sources, inorganic substances and others. Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.Nitrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, potato zein, meat extract, soybean meal, potato extract Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like. Also, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M9培地 [Miller, Journal of Experiments in Molecular  As a medium for culturing a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments in Molecular
Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好まし レ^ ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 β- インドリルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。 Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) is preferred here. In order to make the promoter work more efficiently, if necessary, add a drug such as 3β-indolylacrylic acid. Can be.
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 43 で約 3〜 24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。  When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, cultivation is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be applied.
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 で約 6〜 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。  When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 [Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81巻， 5330 (1984)〕 が挙げられる。 培地の pH は約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20〜35°Cで約 24〜72 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜5日間行 ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) And SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Cultivation is usually performed at about 20-35 ° C for about 24-72 hours, and aeration and agitation are added as necessary. When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, add 10% serum inactivated to Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). What is obtained by appropriately kneading the material is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔8(^61^6，122巻，501(1952)〕 ， DME M培地 [Virology, 8巻， 396(1959)〕 ， RPMI 1640培地 〔The Journal of the American Medical Association 199卷， 519 (1967)〕 ， 199培地  When culturing a transformant whose animal host is an animal cell, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [8 (^ 61 ^ 6, 122, 501 (1952)]) DME M medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium
[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜4 0°Cで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。  [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)]. Preferably, the pH is about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタン パク質を生成せしめることができる。 ，  As described above, the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant. ,
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行うことができる。  The protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの ち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X - 100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタンパク質が 分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分 離し、 上清を集める。 When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method described above, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected.
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行うことができる。 これらの 公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィ —などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特 異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水性の差 を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用い られる。 Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods are mainly methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method utilizing the difference in ion exchange chromatography -A method that uses a difference in charge such as, a method that uses a specific affinity such as affinity chromatography, a method that uses a difference in hydrophobicity such as reverse-phase high-performance liquid chromatography, and an isoelectric point. A method utilizing the difference between isoelectric points such as electrophoresis is used.
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方法あるい はそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合に は公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変換する ことができる。  When the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a known method or a method analogous thereto Can be converted into a free form or another salt.
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当なタンパ ク修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 タンパク修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコ シダーゼなどが用いられる。  The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. As the protein-modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィゃウエスタンプロッティングなどにより測定することができる。 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノク口一ナル抗体の何れであって ちょい。  The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by, for example, enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody. The antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. A little bit.
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗 体の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 公知の抗体または抗血 清の製造法に従って製造することができる。  An antibody against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) uses the protein of the present invention as an antigen, Can be produced according to the method for producing an antibody or antiserum.
〔モノクローナル抗体の作製〕  [Preparation of monoclonal antibody]
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製  (a) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。 The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody upon administration by itself or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. The warm-blooded animals used include, for example, monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
モノク口一ナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクロ一ナル钪体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化タ ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行うことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミル ス夕インの方法 〔Nature、 256、 495 (1975)) に従い実施することができる。 融 合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウイ ルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。  When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Mills in [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0、 AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 37 °C で 1〜 10分間ィンキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） に八イブリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。  Examples of myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%. Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes. A variety of methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) onto which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then the supernatant is added. Anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is mouse) or protein A is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. A monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. And the like.
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行うこ とができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加 した動物細胞用培地で行うことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイ プリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1 - 2 0 % , 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイ プリド一マ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いる ことができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培 養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行うことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記 の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 Selection of monoclonal antibodies should be performed according to a known method or a method equivalent thereto. Can be. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as it can grow a hybridoma. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Alternatively, a serum-free culture medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
( b ) モノクローナル抗体の精製  (b) Purification of monoclonal antibodies
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相 あるいはプロテイン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行うことができる。 〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕  Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)). Adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) Can be. (Preparation of polyclonal antibody)
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製造 することができる。 例えば、 免疫钪原 （タンパク質抗原） 自体、 あるいはそれと キャリアータンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法 と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質に対する 抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一タンパク質との複 合体に関し、 キヤリア一タンパク質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。 The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, an immunogen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and an antibody against the protein of the present invention is obtained from the immunized animal. It can be produced by collecting the contents and separating and purifying the antibody. Regarding the complex of immunizing antigen and carrier-1 protein used for immunizing warm-blooded animals, the type of carrier-1 protein and the mixing ratio of carrier-1 to hapten are determined by antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier. If it can be efficiently performed, any kind may be cross-linked at any ratio.For example, 血清 serum albumin サ イ cysiloglopurine, hemocyanin, etc., in a weight ratio of about 1 hapten to 1 hapten A method of coupling at a rate of 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used. In addition, various condensing agents may be used for force coupling between the hapten and the carrier. However, active ester reagents containing daltaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithioviridyl group and the like can be used. The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。  The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行うことができ る。  The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
( 1 ) 本発明の気道上皮細胞株 (1) Airway epithelial cell line of the present invention
カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する気道上皮細胞株 Airway epithelial cell line expressing calcium-gated chloride channel protein
(以下、 本発明の気道上皮細胞株と略記することもある） としては、 本発明で用 いられるタンパク質を発現する、 ヒトなどの哺乳動物由来の気道上皮細胞株であ る。 (The airway epithelial cell line of the present invention may be abbreviated hereinafter) is an airway epithelial cell line derived from a mammal such as human, which expresses the protein used in the present invention.
本発明の気道上皮細胞株としては、 粘液を分泌する能力を有するものが好まし い。 粘液としては、 例えば、 MU C 5 A Cタンパク質、 MU C 2タンパク質など が挙げられる。  As the airway epithelial cell line of the present invention, those having the ability to secrete mucus are preferred. Examples of the mucus include MU C5 AC protein and MU C 2 protein.
本発明の気道上皮細胞株の気道上皮細胞株であるか否かの確認は、 公知の方法 を用いて、 例えばサイ卜ケラチンの発現の測定によって行えばよい。  The confirmation of whether or not the respiratory epithelial cell line of the present invention is a respiratory epithelial cell line may be performed using a known method, for example, by measuring the expression of cytokeratin.
本発明の気道上皮細胞株としては、 本発明で用いられるタンパク質を高発現す るものが好ましい。 例えば、 ハウスキーピング遺伝子 （例、 GA P D H遺伝子） に対して約 0 . 0 1 %以上、 好ましくは約 0 . 1 %以上、 より好ましくは約 1 % 以上の該タンパク質の遺伝子を発現する気道上皮細胞株などが用いられる。 本発明の気道上皮細胞株は、 本発明で用いられるタンパク質を発現する能力を 有する気道上皮細胞株 （以下、 気道上皮細胞株 Aと略記することもある） に、 サ イト力インを接触させることにより得られる。 As the airway epithelial cell line of the present invention, those which highly express the protein used in the present invention are preferable. For example, airway epithelial cells that express about 0.01% or more, preferably about 0.1% or more, more preferably about 1% or more of the protein relative to a housekeeping gene (eg, GA PDH gene) A strain or the like is used. The airway epithelial cell line of the present invention includes, as an airway epithelial cell line having the ability to express the protein used in the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as airway epithelial cell line A). It is obtained by contacting the light force.
本発明の気道上皮細胞株には、 気道上皮細胞株 Aにサイトカインを接触させる ことにより得られる、 本発明で用いられるタンパク質を発現する細胞も含まれる。 上記気道上皮細胞株 Aとしては、 例えば、 ヒトなどの哺乳動物の初代気道上皮 細胞 （例、 ラット初代気道上皮細胞など） が株化されたもの、 SPOC 1細胞 〔アメリカン ジャーナル ォブ レスピラトリー セル アンド モレキユラ 一 バイオロジー （Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.) 、 14巻、 146頁、 1996 年〕 などが挙げられる。 具体例としては、 ラットの気管から細胞を分離し、 培地 (例、 ラット気道上皮細胞用培地 〔Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12巻、 385 頁、 1995年〕 の基礎培地を DMEMZF 12培地に変更し、 CaC l 2を除いた 培地など） で、 単一細胞に由来するコロニーの出現が認められるまで培養を継続 した細胞などが挙げられる。 好ましくは、 後述の実施例で得られた N IM— 1な どが用いられる。 ' The airway epithelial cell line of the present invention also includes cells expressing the protein used in the present invention, which are obtained by contacting the airway epithelial cell line A with a cytokine. Examples of the above-mentioned airway epithelial cell line A include, for example, a cell line of primary airway epithelial cells of mammals such as humans (eg, rat primary airway epithelial cells), SPOC1 cells [American Journal of Respiratory Cells and Moreukiura]. I. Biology (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.), 14, 146, 1996]. As a specific example, cells were isolated from rat trachea, and a basal medium of a medium (eg, a medium for rat respiratory epithelial cells [Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, p. 385, 1995]) was used as DMEMZF. The culture medium is changed to a 12-medium medium and the medium is deprived of CaCl 2 ), and the culture is continued until the appearance of a colony derived from a single cell is observed. Preferably, NIM-1 or the like obtained in Examples described later is used. '
サイト力インとしては、 例えば、 I L— 13、 I L—1、 I L— 4、 I L一 6、 I L— 8、 I L— 9、 TNF—ひ、 TGF—ひ、 EGF、 bFGFなどが挙げら れる。 好ましくは I L— 13である。  Examples of site force in include IL-13, IL-1, IL-4, IL-16, IL-8, IL-9, TNF-HI, TGF-HI, EGF, bFGF and the like. Preferably, it is IL-13.
サイト力インの使用量としては、 例えば、 約 0. 01 ng/ml以上、 好まし くは約 0. I ngZml以上、 約 1 ng/m 1以上が用いられる。  For example, the amount of cytokin used is about 0.01 ng / ml or more, preferably about 0.1 ng / ml or more, and about 1 ng / ml or more.
気道上皮細胞株 Aに、 サイト力インを接触させる方法は特に限定されず、 例え ば、 プレートに播種された気道上皮細胞株 Aに、 サイト力インを添加し、 培養す る方法などが挙げられる。  The method of contacting the airway epithelial cell line A with the cytodynamics is not particularly limited, and examples include a method of adding the cytodynamics to the airway epithelial cell line A seeded on a plate and culturing the cells. .
( 2 ) 気道上皮細胞株 Aまたは本発明の気道上皮細胞株を用いるスクリーニング 方法 (2) Screening method using airway epithelial cell line A or airway epithelial cell line of the present invention
本発明のタンパク質は、 肺 ·気道の炎症に先立ち発現が増加し、 本発明のタン パク質遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドは気道過敏性亢進を抑制するの で、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパ ク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の産生 を阻害する化合物またはその塩などは、 肺 ·気道の炎症を伴う肺 ·胸部疾患や呼 吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細 気管支炎、 気管支喘息、 嚢胞性線維症、 過敏性肺炎、 肺線維症など〕 、 炎症性腸 疾患、 アレルギー性結膜炎などの予防 ·治療剤などの医薬として使用できる。 さらに、 本発明のタンパク質は、 鼻炎時に発現が増加するので、 本発明のタン パク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発 現を阻害する化合物またはその塩、 本発明の夕ンパク質の産生を阻害する化合物 またはその塩などは、 例えば、 鼻炎 （例、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 急性鼻炎、 慢性鼻炎、 肥厚性鼻炎、 萎縮性鼻炎、 乾燥性前鼻炎、 血管運動性鼻炎、 壊疽性鼻 炎、 副鼻腔炎など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。 The expression of the protein of the present invention increases prior to inflammation of the lungs and airways, and the antisense oligonucleotide of the protein gene of the present invention suppresses the hypersensitivity of the airways, thus inhibiting the activity of the protein of the present invention. Compounds or salts thereof, compounds or salts thereof that inhibit the expression of the protein gene of the present invention, compounds or salts thereof that inhibit the production of the protein of the present invention may be used for lung and chest diseases accompanied by inflammation of the lungs and airways. Or call Inhaler disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease (eg, chronic bronchitis, emphysema), diffuse panbronchiolitis, bronchial asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia, pulmonary fibrosis, etc.), inflammatory bowel disease, It can be used as a medicine for preventing and treating allergic conjunctivitis. Furthermore, since the expression of the protein of the present invention increases during rhinitis, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of a gene of the protein of the present invention, Compounds or salts thereof that inhibit the production of protein of the invention include, for example, rhinitis (eg, allergic rhinitis, hay fever, acute rhinitis, chronic rhinitis, hypertrophic rhinitis, atrophic rhinitis, dry pronasitis, blood vessels It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for motor rhinitis, gangrenous rhinitis, sinusitis, etc.).
したがって、 本発明の気道上皮細胞株および気道上皮細胞株 Aは、 上記化合物 またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。  Therefore, the respiratory epithelial cell line and the respiratory epithelial cell line A of the present invention are useful as reagents for screening the above compounds or salts thereof.
本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質 の活性 （例えば、 クロライドチャネル様活性、 粘液分泌活性など） を阻害する化 合物またはその塩 （以下、 阻害剤と略記する場合がある） のスクリーニング方法 を提供する。  The present invention relates to a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention (eg, chloride channel-like activity, mucus secretion activity, etc.) characterized by using the protein of the present invention (hereinafter referred to as “inhibitor”). Screening method).
具体的には、 例えば、 （a) (i) 気道上皮細胞株 Aおよびサイト力インをカル シゥム賦活剤で活性化した場合と （i i) 気道上皮細胞株 A、 サイト力インおよび 試験ィヒ合物の混合物をカルシウム賦活剤で活性化した場合との比較を行うことを 特徴とする阻害剤のスクリーニング方法、 （b) (Γ ) 本発明の気道上皮細胞株 をカルシウム賦活剤で活性化した場合と （i i' ) 本発明の気道上皮細胞株および 試験化合物の混合物をカルシウム賦活剤で活性化した場合との比較を行うことを 特徴とする阻害剤のスクリーニング方法が挙げられる。  Specifically, for example, (a) (i) when airway epithelial cell line A and cytoforce were activated by a calcium activator; and (ii) when airway epithelial cell line A, cytoforce and test (B) (Γ) a method in which the airway epithelial cell line of the present invention is activated with a calcium activator And (ii ') a screening method for an inhibitor characterized by comparing the mixture of the airway epithelial cell line and the test compound of the present invention with a calcium activator.
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i) と （i i) または （Γ ) と In the above screening method, for example, (i) and (i i) or (Γ)
(i i' ) の場合における、 本発明のタンパク質のクロライドチャネル様活性、 粘 液分泌活性などを測定して、 比較する。 The chloride channel-like activity, mucus secretion activity and the like of the protein of the present invention in the case of (ii ′) are measured and compared.
クロライドチャネル様活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例 えば、 ジエノミクス （Genomics) 、 5 4巻、 2 0 0頁 （1 9 9 8 ) に記載の方法 またはそれに準じる方法に従って測定することができる。  The chloride channel-like activity can be measured according to a known method. For example, according to the method described in Genomics, Vol. 54, p. 200 (1998) or a method analogous thereto. Can be measured.
粘液分泌活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例えば、 バイオ ケミカル ジャーナル (Biochem.J) 、 316巻、 943頁 （1996) に記載の 方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。 The measurement of the mucus secretion activity can be performed according to a known method. It can be measured according to the method described in Chemical Journal (Biochem. J), vol. 316, p. 943 (1996) or a method analogous thereto.
カルシウム賦活剤としては、 例えば、 ィオノマイシン、 A23187 (カルシ マイシン） などが用いられる。  As the calcium activator, for example, ionomycin, A23187 (calcimicin) and the like are used.
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。  Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
気道上皮細胞株 A、 サイト力インおよび試験化合物の混合は、 （1) 気道上皮 細胞株 Aにサイト力インを接触させ、 カルシウム賦活剤で活性化する前に試験化 合物と混合する、 （2) 気道上皮細胞株 Aにサイト力インを接触させ、 カルシゥ ム賦活剤で活性化した後に試験化合物と混合する、 （3) 気道上皮細胞株 Aにサ ィトカインを接触させ、 カルシウム賦活剤と試験化合物の混合物を添加するなど、 気道上皮細胞株 Aにカルシウム賦活剤を接触させる前に、 気道上皮細胞株 Aにサ イト力インを接触される順序であれば、 いずれの順序で行ってもよい。  The mixture of airway epithelial cell line A, cytoforce, and the test compound can be obtained by (1) contacting the airway epithelial cell line A with cytoforce, mixing with the test compound before activation with a calcium activator, ( 2) Contact cytotoxicity to airway epithelial cell line A, activate with calcium stimulant, and mix with test compound. (3) Contact airway epithelial cell line A with cytokines and test with calcium activator. Before contacting the airway epithelial cell line A with the calcium activator, such as adding a mixture of compounds, any order may be used as long as the site force-in is brought into contact with the airway epithelial cell line A. .
本発明の気道上皮細胞株と試験化合物との混合は、 本発明の気道上皮細胞株を カルシウム賦活剤で活性化する前または後の何れであってもよく、 また本発明の 気道上皮細胞株に試験化合物とカルシウム賦活剤の混合物を添加してもよい。 上記のスクリーニング方法を実施するには、 気道上皮細胞株 Aまたは本発明の 気道上皮細胞株をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製す 。 バッ ファーには、 1!約4〜10 (望ましくは、 ^1約6〜8) のリン酸バッファ一、 ほう酸バッファ一などの、 本発明のタンパク質の活性を阻害しないバッファーで あればいずれでもよい。  The airway epithelial cell line of the present invention may be mixed with a test compound before or after the airway epithelial cell line of the present invention is activated with a calcium activator. A mixture of a test compound and a calcium activator may be added. In order to carry out the above screening method, the airway epithelial cell line A or the airway epithelial cell line of the present invention is prepared by suspending in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the activity of the protein of the present invention, such as 1 to about 4 to 10 (preferably, about 1 to 6 to 8) phosphate buffer and borate buffer. .
例えば、 上記 （ii) または （ii') の場合におけるクロライドチャネル活性ま たは粘液分泌活性などを、 上記 （i) または （Γ) の場合に比べて、 約 20%以 上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害する試験化合物を 本発明の夕ンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することが できる。  For example, the chloride channel activity or mucus secretion activity in the above (ii) or (ii ') is about 20% or more, preferably 30%, as compared with the above (i) or (上 記). Test compounds that inhibit the above, more preferably about 50% or more, can be selected as compounds or salts thereof that inhibit the activity of the protein of the present invention.
以下に、 スクリーニングの具体例を記載する。 (A) 気道上皮細胞株 Aを 96穴ブラッククリアポトムプレートにゥエルあたり 4 X 個播種する。 2日ごとに新鮮な培地 〔例、 ラット気道上皮細胞用培地 （ J. Respi r. Ce l l Mo l . Bi o l . , 12卷、 385頁、 1995年) の基礎培地を DMEM/F12培 地に変更し、 CaCl2を除いた培地など〕 に交換しながら培養を継続し、 コンフル ェントになった細胞に IL- 13を終濃度 10ng/mlで添加し、 さらに 2日間培養する。 C1—チャネル活性の測定は FLIPR Membrane Po t ent i a l Ass ay Ki t (モレキュラー デバイス社製） を使用する。 20mMの HEPESを含む HBSSバッファー （Co即 onent B) で希釈した電位感受性色素 （Component A) を 1ゥエルあたり 75 1添加し、 37°C で 20分間反応する。 そのプレートに Co即 onent B、 または Co即 onent Bで一定濃度 に希釈した試験化合物を 1ゥエルあたり 添加し、 37°Cで 10分間反応する。 そ の後、 プレートを FL IPRにセットし、 Component Bまたは終濃度 10 Mのィオノマ イシンを含む Component Bを 1ゥエルあたり 50 1添加する。 添加後の蛍光変化を C1一チャネル活性として観察する。 試験化合物無添加の状態で、 ィオノマイシン 刺激時の C 1—チャネル活性を 100 %、 ィオノマイシン無刺激時の C1—チャネル活性 を 0 %として、 C 1—チャネル活性を評価し、 C1—イオンチャネル阻害作用を有する 化合物を選択する。 Hereinafter, specific examples of the screening will be described. (A) Seed 4 x respiratory epithelial cell line A into a 96-well black clear potom plate per well. Every 2 days, a basal medium of a fresh medium [eg, a medium for rat respiratory epithelial cells (J. Res. Cell. MoI. Biol., Vol. 12, p. 385, 1995)] is added to a DMEM / F12 medium. Change the medium to a medium without CaCl 2 ], continue the culture, add IL-13 to the confluent cells at a final concentration of 10 ng / ml, and culture for another 2 days. The C1-channel activity is measured using a FLIPR Membrane Potential Assy Kit (Molecular Devices). Add 751 of the voltage-sensitive dye (Component A) diluted in HBSS buffer (Co-immediate onent B) containing 20 mM HEPES and react at 37 ° C for 20 minutes. Add the test compound diluted to a constant concentration with Co-immediate onent B or Co-immediate onent B to each plate, and incubate at 37 ° C for 10 minutes. Then, set the plate on the FL IPR, and add Component B or Component B containing 10 M final concentration of ionomycin at a ratio of 50 1 per well. The change in fluorescence after addition is observed as C1 one-channel activity. In the absence of the test compound, the C1-channel activity was evaluated assuming that the C1-channel activity when stimulated with ionomycin was 100% and the C1-channel activity when not stimulated with ionomycin was 0%. Is selected.
( B ) 本発明の気道上皮細胞株を 96穴ブラッククリアポトムプレートにゥエルあ たり 4x105個播種しー晚培養する。 20mMの HEPESを含む HBSSバッファー (B) The airway epithelial cell line of the present invention is seeded at 4 × 10 5 per well on a 96-well black clear potom plate and cultured. HBSS buffer containing 20 mM HEPES
(Co即 onent B) で希釈した電位感受性色素 （Component A) を 1ゥエルあたり 75 ^ 1添加し、 37°Cで 20分間反応する。 そのプレートに Co即 onent B、 または Componen t Bで一定濃度に希釈した試験化合物を 1ゥエルあたり 25 1添加し、 37°Cで 10分間反応する。 その後、 プレートを FLIPRにセットし、 Co即 onent Bまた は終濃度 10 z Mのィオノマイシンを含む Component Bを 1ゥエルあたり 50 1添加す る。 添加後の蛍光変化を C1—チャネル活性として観察する。 試験化合物無添加の 状態で、 ィオノマイシン刺激時の C1—チャネル活性を 100%、 ィオノマイシン無剌 激時の チャネル活性を 0 %として、 C1—チャネル活性を評価し、 C1—イオンチヤ ネル阻害作用を有する化合物を選択する。  Add 75 ^ 1 per well of voltage-sensitive dye (Component A) diluted with (Co immediately onent B) and react at 37 ° C for 20 minutes. To the plate, add a test compound diluted to a constant concentration with Co-immediate onent B or Component B at a concentration of 251 / well, and react at 37 ° C for 10 minutes. Then, set the plate on the FLIPR, and add Co-only onent B or Component B containing ionomycin at a final concentration of 10 zM at 50 1 per well. Observe the change in fluorescence after addition as C1-channel activity. In the absence of the test compound, the C1-channel activity was evaluated assuming that the C1-channel activity when stimulated with ionomycin was 100% and the channel activity when ionomycin was not stimulated was 0%, and the compound having C1-ion channel inhibitory activity was evaluated. Select
さらに、 本発明は、 気道上皮細胞株 Aを用いることを特徴とする本発明のタン パク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩 （以下、 阻害剤と略記する場 合がある） のスクリーニング方法も提供する。 より具体的には、 例えば、Furthermore, the present invention relates to a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention, characterized by using an airway epithelial cell line A (hereinafter referred to as an inhibitor). Screening method). More specifically, for example,
(i i i) 気道上皮細胞株 Aおよびサイト力インを培養した場合と （iv) 気道上 皮細胞株 A、 サイトカインおよび試験化合物の混合物を培養した場合との比較を 行うことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法を提供する。 (iii) comparing the case of culturing airway epithelial cell line A and cytodynamics with the case of (iv) culturing a mixture of airway epithelial cell line A, cytokines and test compounds. A screening method is provided.
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i i i) と （iv) の場合におけ る、 本発明のタンパク質遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明のタンパク質量ま たは前記タンパク質をコードする mR N A量） を測定して、 比較する。  In the above-mentioned screening method, for example, in the cases (iii) and (iv), the expression level of the protein gene of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention or mRNA encoding the protein) Measure) and compare.
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。  Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
上記のスクリーニング方法を実施するには、 気道上皮細胞株 Aをスクリーニン グに適したバッファーに浮遊して調製する。 バッファ一には、 p H約 4〜1 0 (望ましくは、 p H約6〜8 ) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーなどの、 本発明のタンパク質の発現を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 本発明のタンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を 認識する抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェス タン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定すること ができる。  To perform the above screening procedure, prepare the respiratory epithelial cell line A by suspending it in a buffer suitable for screening. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the expression of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8). The amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention to detect the protein present in a cell extract or the like, using a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured in accordance with the corresponding method.
本発明のタンパク質遺伝子の発現量は、 公知の方法、 例えば、 ノーザンブロッ テインクや Reverse transcri t ion-polymer ase chain reac t ion (R T— P C R) 、 リアルタイム P C R解析システム （ABI社製、 TaqMan polymerase chain reac t i on) などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがつて測定することがで さる。  The expression level of the protein gene of the present invention can be determined by a known method, for example, Northern blot ink, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR analysis system (manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain reac This can be measured according to a method such as (tion) or a method analogous thereto.
例えば、 上記 （iv) の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現を、 上記 (i i i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましく は約 5 0 %以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害す る化合物またはその塩として選択することができる。  For example, the expression of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii). The test compound to be tested can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof.
以下に、 スクリーニングの具体例を記載する。 気道上皮細胞株 Aを 96穴プレートにゥエルあたり 2 X 104個播種し、 2日ごとに 新鮮培地 〔例、 ラット気道上皮細胞用培地 (Am. J. Respi r. Ce l l Mol . Bi o l . , 12巻、 385頁、 1995年) の基礎培地を DMEM/F12培地に変更し、 CaCl2を除いた培地 など〕 に交換しながら、 4日間培養する。 そのプレートに新鮮培地、 または新鮮 培地で一定濃度に希釈した試験化合物を 1ゥエルあたり 10 / 1添加し、 37°Cで 10分 間反応する。 その後、 IL- 13を終濃度 10ng/mlで添加し、 さらに 1日間培養し、 細 胞中の全 RNAを RNeasy 96 Ki t (QIAGEN社製） を用いて抽出する。 これらの全 RNA を出発材料として TaqMan Gold RT-PCR Ki t (アプライドバイオシステムズ社製） を用いて逆転写反応により cDNAを合成する。 その一部を用いて ABI PRISM 7700シ ークエンスディテクタ一 （アプライドバイオシステムズ社製） を用いた TaqMan PCR法により、 本発明で用いられるタンパク質の遺伝子 （例、 CLCA1遺伝子など） のコピー数を測定する。 試験化合物無添加の状態で、 IL-13添加時の本発明で用 いられるタンパク質の遺伝子 （例、 CLCA1遺伝子など） の発現量を 100%、 IL-13 無添加時の本発明で用いられるタンパク質の遺伝子 （例、 CLCA1遺伝子など） の 発現量を 0 %として、 本発明で用いられるタンパク質の遺伝子 （例、 CLCA1遺伝子 など） の発現の阻害度を評価し、 本発明で用いられるタンパク質の遺伝子 （例、 CLCA1遺伝子など） の発現を阻害する作用を有する化合物を選択する。 Hereinafter, specific examples of the screening will be described. Seed 2 × 10 4 respiratory epithelial cell lines A per well in a 96-well plate, and renewed every 2 days in fresh medium (eg, rat airway epithelial cell culture medium (Am.J. Respir. Cell Mol. Biol. , Vol. 12, p. 385, 1995), and then change the medium to DMEM / F12 medium and replace it with a medium without CaCl 2 ] for 4 days. To the plate, add 10/1 of fresh medium or a test compound diluted to a certain concentration in fresh medium per well, and incubate at 37 ° C for 10 minutes. Thereafter, IL-13 is added at a final concentration of 10 ng / ml, and the cells are further cultured for one day, and the total RNA in the cells is extracted using RNeasy 96 Kit (manufactured by QIAGEN). Using these total RNAs as starting materials, cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction using TaqMan Gold RT-PCR Kit (manufactured by Applied Biosystems). Using a part thereof, the copy number of the gene of the protein used in the present invention (eg, CLCA1 gene, etc.) is measured by TaqMan PCR using ABI PRISM 7700 Sequence Detector (manufactured by Applied Biosystems). . 100% expression level of the gene (eg, CLCA1 gene) of the protein used in the present invention when IL-13 is added without adding the test compound, and the protein used in the present invention without adding IL-13 Assuming that the expression level of the gene of the present invention (eg, CLCA1 gene, etc.) is 0%, the degree of inhibition of the expression of the gene of the protein used in the present invention (eg, CLCA1 gene, etc.) is evaluated, and the gene of the protein used in the present invention (eg, CLCA1 gene) For example, a compound having an action of inhibiting the expression of the CLCA1 gene is selected.
本発明は、 気道上皮細胞株 Aおよびサイトカインを用いることを特徴とする本 発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩 （以下、 阻害剤と略記す る場合がある） のスクリーニング方法も提供する。 より具体的には、 例えば、 The present invention also provides a method for screening a compound or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as an inhibitor) that inhibits the production of the protein of the present invention, characterized by using the respiratory epithelial cell line A and a cytokine. . More specifically, for example,
(V) 気道上皮細胞株 Aおよびサイト力インを培養した場合と （vi) 気道上皮 細胞株 A、 サイトカインおよび試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行 うことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法を提供する。 (V) a comparison of the culture of airway epithelial cell line A and cytodynamics with the culture of (vi) a mixture of airway epithelial cell line A, cytokines and test compounds. A screening method is provided.
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 本発明のタンパク質に対する抗 体などを用いて （V) と （vi) の場合における、 本発明のタンパク質の産生量 In the above screening method, for example, the production amount of the protein of the present invention in the cases of (V) and (vi) using an antibody against the protein of the present invention or the like.
(本発明のタンパク質量） を測定 （例、 本発明のタンパク質の発現を検出、 本発 明のタンパク質の発現量を定量等） して、 比較する。 (The amount of the protein of the present invention) is measured (eg, the expression of the protein of the present invention is detected, the expression level of the protein of the present invention is quantified, etc.) and compared.
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。 Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds.
上記のスクリーニング方法を実施するには、 気道上皮細胞株 Aをスクリ一ニン グに適したバッファーに浮遊して調製する。 バッファ一には、 p H約 4〜1 0 (望ましくは、 p H約 6〜8 ) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーなどの、 本発明のタンパク質の活性を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 本発明のタンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を 認識する抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェス タン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定すること ができる。  To carry out the above screening method, prepare airway epithelial cell line A by suspending it in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the activity of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8). . The amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention to detect the protein present in a cell extract or the like, using a method such as Western analysis, ELISA, or the like. It can be measured in accordance with the corresponding method.
例えば、 上記 （vi) の場合における本発明のタンパク質の産生を、 上記 （V) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の産生 （発現） を阻害する化 合物またはその塩として選択することができる。  For example, the production of the protein of the present invention in the case of the above (vi) is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, as compared with the case of the above (V). The test compound can be selected as a compound that inhibits the production (expression) of the protein of the present invention or a salt thereof.
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明の気道上皮細胞株、 または気道上 皮細胞株 Aおよびサイトカインを含有するものである。  The screening kit of the present invention contains the airway epithelial cell line or the airway epidermal cell line A of the present invention and a cytokine.
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明のタンパ ク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発 現を阻害する化合物もしくはその塩、 または本発明のタンパク質の産生を阻害す る化合物もしくはその塩である。  The compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a test compound as described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, and a plant extract. A compound selected from animal tissue extract, plasma, or the like, or a salt thereof, a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof, a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, or a compound thereof. A salt, or a compound that inhibits the production of the protein of the present invention, or a salt thereof.
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。  As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパ ク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、 または本発明のタンパク 質の産生を阻害する化合物もしくはその塩は、 例えば、 肺 ·気道の炎症を伴う 肺 ·胸部疾患や呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気 腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 気管支喘息、 嚢胞性線維症、 過敏性肺炎、 肺線維 症など〕 、 炎症性腸疾患、 アレルギー性結膜炎に対する予防 ·治療剤などの医薬 として有用である。 さらには鼻炎 （例、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 急性鼻炎、 慢性鼻炎、 肥厚性鼻炎、 萎縮性鼻炎、 乾燥性前鼻炎、.血管運動性鼻炎、 壊疽性鼻 炎、 副鼻腔炎など） などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。 The compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention, the compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, or the compound or its salt that inhibits the production of the protein of the present invention includes, for example, The lungs · Lungs with airway inflammation · Chest disease and respiratory disease [eg, chronic obstructive pulmonary disease (eg, chronic bronchitis, ), Diffuse panbronchiolitis, bronchial asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia, pulmonary fibrosis, etc.), inflammatory bowel disease, and preventive and therapeutic agents for allergic conjunctivitis. In addition, rhinitis (eg, allergic rhinitis, hay fever, acute rhinitis, chronic rhinitis, hypertrophic rhinitis, atrophic rhinitis, dry proprietary rhinitis, vasomotor rhinitis, gangrenous rhinitis, sinusitis, etc.) It is useful as a medicine for preventive and therapeutic agents.
上記化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段 に従って製剤化することができる。 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル 剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液と の無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 ' 例えば、 上記化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形 剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施 に要求される単位用量形態で混和することによつて製造することができる。 これ ら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにする ものである。  When the above compound or a salt thereof is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., which are sugar-coated as required, orally, or aseptic solution or suspension in water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections. '' For example, the above compounds or salts thereof can be combined with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in unit dosage forms generally required for the practice of formulations. It can be produced by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。  Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェタノ ールなど) 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 80TM、 H CO— 50など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大 豆油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール などと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウ ム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩ィ匕ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インな ど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). Agent, for example, alcohol (for example, ethanol ), Polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 ™ , HCO-50, etc.). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol. Also, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), a soothing agent (eg, Shiridani benzalkonium, prochlorin hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, polyethylene) Glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与 することができる。  The preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, pests, birds, cats, dogs, monkeys). , Chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 慢性閉塞性肺疾患治療の目的で本発明の夕 ンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 または本発明のタンパク質遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 （体 重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物またはその塩を約 0.1〜 10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は 投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 慢性閉塞性肺疾患治療の 目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で 通常成人 （体重 6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはそ の塩を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは 約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該 分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に 関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.For example, the activity of the protein of the present invention is inhibited for the purpose of treating chronic obstructive pulmonary disease. When a compound or its salt that inhibits expression of the protein gene of the present invention or its salt is orally administered, the compound or its salt is generally administered to an adult (as a body weight of 60 kg) per day. Is administered in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, etc., for example, the activity of the protein of the present invention is inhibited for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease. When a compound or a salt thereof is administered to an adult (with a body weight of 6 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 3 Omg per day. Conveniently 2 Omg, more preferably about 0.1-1 Omg, is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg. In the present specification and drawings, when bases or amino acids are indicated by abbreviations, the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or It is based on common abbreviations in the field, examples of which are given below. When an amino acid may have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA デォキシリポ核酸  DNA Deoxylipo nucleic acid
cDNA 相補デォキシリポ核酸  cDNA complementary deoxylipo nucleic acid
A アデニン  A adenine
T チミン  T thymine
G グァニン  G Guanin
C C
RNA リポ核酸 RNA liponucleic acid
mRNA メッセンジャーリポ核酸  mRNA messenger liponucleic acid
dATP デォキシアデノシン三リン酸  dATP Deoxyadenosine triphosphate
dTTP デォキシチミジン三リン酸  dTTP Deoxythymidine triphosphate
dGTP デォキシグアノシン三リン酸  dGTP Deoxyguanosine triphosphate
dCTP デォキシシチジン三リン酸  dCTP Deoxycytidine triphosphate
ATP アデノシン三リン酸  ATP adenosine triphosphate
EDTA エチレンジァミン四酢酸  EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
SDS ドデシル硫酸：  SDS dodecyl sulfate:
G 1 y  G 1 y
A 1 a ァラニン  A 1 a Alanin
V a 1 バリン  V a 1 Valine
Le u ロイシン  Le u leucine
I 1 e イソロイシン  I 1 e isoleucine
S e r セリン  S e r serine
Th r スレオニン  Th r threonine
Cy s  Cy s
Me t メチォニン  Me t Methionin
G 1 u グルタミン酸  G 1 u Glutamic acid
As p ァスパラギン酸  As p Aspartic acid
L y s リジン A r g ：アルギニン Lys lysine A rg: Arginine
H i s ：ヒスチジン  H i s: Histidine
Ph e ：フエ二ルァラニン  Ph e: feniralanin
Ty r ：チロシン  Ty r: Tyrosine
T r p ： トリブトファン  T r p: Tribute fan
P r o ：プロリン  Pro: Proline
A s n ：ァスパラギン  A s n: Asparagine
G 1 n ：ダル夕ミン  G 1 n: Dal Yu Min
p G 1 u ：ピログルタミン酸  pG1u: pyroglutamic acid
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。  The substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Me メチル基  Me methyl group
E t ェチル基  Etethyl group
B u ブチル基  B u butyl group
Ph フエニル基  Ph phenyl group
TC チアゾリジン— 4 (R) '一力ルポキサミド基  TC thiazolidine—4 (R) 'One-pot lipoxamide group
T o s p—トルエンスルフォニル  T os p—toluenesulfonyl
CHO ホルミル  CHO Holmill
B z 1  B z 1
ClrBzl 2， 6—ジクロ口べンジル Cl r Bzl 2, 6-Dicyclo benzene
Bom ベンジルォキシメチル  Bom benzyloxymethyl
Z ベンジルォキシカルポニル  Z benzyloxycarponyl
C 1 -z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル  C 1 -z 2 -chloro benzyloxycarbonyl
B r -Z  B r -Z
B o c t一ブトキシカルポニル  B oc t-butoxycarponyl
DNP ジニトロフエニル  DNP dinitrophenyl
T r t トリチル  T r t Trityl
Bum t一ブトキシメチル  Bum t-butoxymethyl
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル HOB t : 1ーヒドロキシベンズトリアゾ一ル Fmo c N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl HOB t: 1-hydroxybenztriazole
HOOB t ： 3， 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシ一 4一ォキソ一  HOOB t: 3,4-dihydro-3-hydroxy-1 4-oxo-1
1, 2, 3一べンゾトリアジン  1, 2, 3 Benzotriazine
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン -2， 3-ジカルポキシイミド DCC ： Ν,Ν' —ジシクロへキシルカルポジイミド  HONB: Trihydroxy-5-norpolene-2,3-dicarboximide DCC: Ν, Ν'-Dicyclohexylcarposimide
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。  The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
〔配列番号： 1〕  [SEQ ID NO: 1]
ラット CLCA1タンパク質の部分アミノ酸配列を示す。  2 shows a partial amino acid sequence of rat CLCA1 protein.
〔配列番号： 2〕  [SEQ ID NO: 2]
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するラット CLCA1タンパク質部 分ァミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。  The nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence of the rat CLCA1 protein portion having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is shown.
〔配列番号： 3〕  [SEQ ID NO: 3]
参考例 1で用いられたプライマ一 1の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer 11 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 4〕  [SEQ ID NO: 4]
参考例 1で用いられたプライマ一 2の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of Primer 12 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 5〕  [SEQ ID NO: 5]
参考例 1で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer 3 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 6〕  [SEQ ID NO: 6]
参考例 1で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。  3 shows the base sequence of primer 4 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 7〕  [SEQ ID NO: 7]
参考例 1で用いられたプライマ一 5の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer 15 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 8〕  [SEQ ID NO: 8]
参考例 1で用いられたプライマ一 6の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer 16 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 9〕  [SEQ ID NO: 9]
参考例 1で用いられたプライマー 7の塩基配列を示す。  3 shows the base sequence of primer 7 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 10〕  [SEQ ID NO: 10]
実施例 3で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of primer 1 used in Example 3.
〔配列番号： 11〕  [SEQ ID NO: 11]
実施例 3で用いられたプライマ一 2の塩基配列を示す。 ' 〔配列番号： 12〕 3 shows the nucleotide sequence of Primer 12 used in Example 3. ' [SEQ ID NO: 12]
実施例 3で用いられた T a d M a nプローブの塩基配列を示す。 6 shows the nucleotide sequence of the TadMan probe used in Example 3.
〔配列番号： 13〕  [SEQ ID NO: 13]
参考例 1で用いられたプライマー 10の塩基配列を示す。  2 shows the base sequence of primer 10 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 14〕  [SEQ ID NO: 14]
参考例 1で用いられたプライマ一 11の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer 11 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 15〕  [SEQ ID NO: 15]
参考例 1で用いられた T 7 p r omo t e r p r i m e rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 16〕  3 shows the nucleotide sequence of T 7 promoterpirimer used in Reference Example 1. [SEQ ID NO: 16]
参考例 1で用いられた Ml 3 RV p r ime rの塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of Ml 3 RV primer used in Reference Example 1.
〔配列番号： 17〕  [SEQ ID NO: 17]
参考例 1で用いられたプライマー 12の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer 12 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 18〕  [SEQ ID NO: 18]
参考例 1で用いられたプライマー 13の塩基配列を示す。  3 shows the base sequence of primer 13 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 19〕  [SEQ ID NO: 19]
参考例 1で用いられたプライマー A P 1の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer AP1 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 20〕  [SEQ ID NO: 20]
参考例 1で用いられたプライマー A P 2の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer AP2 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 21〕  [SEQ ID NO: 21]
参考例 1で用いられた U 19 r ime rの塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of U 19 rime r used in Reference Example 1.
〔配列番号： 22〕  [SEQ ID NO: 22]
ラット CLCA1タンパク質のアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of rat CLCA1 protein.
〔配列番号： 23〕  [SEQ ID NO: 23]
配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を有するラット CLCA1タンパク質 をコードする DNAの塩基配列を示す。  This shows the nucleotide sequence of DNA encoding rat CLCA1 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22.
〔配列番号： 24〕  [SEQ ID NO: 24]
参考例 1で用いられたプライマー 14の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of primer 14 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 25〕  [SEQ ID NO: 25]
参考例 1で用いられたプライマ一 15の塩基配列を示す。 〔配列番号： 26〕 3 shows the nucleotide sequence of primer 15 used in Reference Example 1. [SEQ ID NO: 26]
マウス CLCA4タンパク質のアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of mouse CLCA4 protein.
〔配列番号： 27〕  [SEQ ID NO: 27]
配列番号： 26で表されるアミノ酸配列を有するマウス CLCA4タンパク質 のアミノ酸配列をコードする DN Aの塩基配列を示す。  This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of mouse CLCA4 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26.
〔配列番号： 28〕  [SEQ ID NO: 28]
マウス CLCA4遺伝子 5' 側の塩基配列を示す。  The nucleotide sequence of the mouse CLCA4 gene on the 5 'side is shown.
〔配列番号： 29〕  [SEQ ID NO: 29]
マウス CLCA4遺伝子 3 ' 側の塩基配列を示す。  The nucleotide sequence of the mouse CLCA4 gene on the 3 'side is shown.
〔配列番号： 30〕  [SEQ ID NO: 30]
参考例 2で用いられたプライマ一 1の塩基配列を示す。  7 shows the nucleotide sequence of primer 11 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 31〕  [SEQ ID NO: 31]
参考例 2で用いられたプライマ一 2の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of Primer 12 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 32〕  [SEQ ID NO: 32]
参考例 2で用いられたプライマ一 3の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of primer 13 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 33〕  [SEQ ID NO: 33]
参考例 2で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。  3 shows the base sequence of primer 4 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 34〕  [SEQ ID NO: 34]
参考例 2で用いられたプライマー 5の塩基配列を示す。  7 shows the base sequence of primer 5 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 35〕  [SEQ ID NO: 35]
参考例 2で用いられたプライマー 6の塩基配列を示す。  7 shows the base sequence of primer 6 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 36〕  [SEQ ID NO: 36]
参考例 2で用いられたプライマー 7の塩基配列を示す。  7 shows the base sequence of primer 7 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 37〕  [SEQ ID NO: 37]
参考例 2で用いられたプライマー 8の塩基配列を示す。  7 shows the base sequence of primer 8 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 38〕  [SEQ ID NO: 38]
参考例 2で用いられたプライマー 9の塩基配列を示す。  7 shows the nucleotide sequence of primer 9 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 39〕  [SEQ ID NO: 39]
参考例 2で用いられたプライマー 10の塩基配列を示す。 〔配列番号： 40〕 7 shows the base sequence of primer 10 used in Reference Example 2. [SEQ ID NO: 40]
参考例 2で用いられた T 7 p r omo t e r p r ime r (プロモーター プライマー） の塩基配列を示す。  7 shows the nucleotide sequence of T7promoteperprimer (promoter primer) used in Reference Example 2.
〔配列番号： 41〕  [SEQ ID NO: 41]
参考例 2で用いられた Ml 3 RV p r ime r (プライマー） の塩基配列を 示す。  3 shows the nucleotide sequence of Ml 3 RV primer (primer) used in Reference Example 2.
〔配列番号： 42]  [SEQ ID NO: 42]
マウス CLCA4 Aタンパク質のアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of mouse CLCA4 A protein.
〔配列番号： 43〕  [SEQ ID NO: 43]
配列番号： 42で表されるアミノ酸配列を有するマウス CLCA4 Aタンパク 質のアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。  This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of mouse CLCA4A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42.
〔配列番号： 44〕  [SEQ ID NO: 44]
ラット CLCA4タンパク質の部分アミノ酸配列を示す。  2 shows a partial amino acid sequence of rat CLCA4 protein.
〔配列番号： 45〕  [SEQ ID NO: 45]
配列番号： 44で表される部分アミノ酸配列を有するラット CLCA4タンパ ク質の部分ァミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。  This shows the base sequence of DNA encoding the partial amino acid sequence of rat CLCA4 protein having the partial amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
〔配列番号： 46〕  [SEQ ID NO: 46]
参考例 2で用いられたプライマー 11の塩基配列を示す。  7 shows the base sequence of primer 11 used in Reference Example 2.
〔配列番号： 47〕  [SEQ ID NO: 47]
参考例 3で用いられたプライマー 12の塩基配列を示す。  7 shows the base sequence of primer 12 used in Reference Example 3.
〔配列番号： 48〕  [SEQ ID NO: 48]
参考例 3で用いられたプライマー 13の塩基配列を示す。  7 shows the base sequence of primer 13 used in Reference Example 3.
〔配列番号： 49〕  [SEQ ID NO: 49]
参考例 3で用いられたプライマ一 14の塩基配列を示す。  7 shows the nucleotide sequence of primer 14 used in Reference Example 3.
〔配列番号： 50〕  [SEQ ID NO: 50]
ヒト C L C A 1夕ンパク質のアミノ酸配列を示す。  1 shows the amino acid sequence of human CLC A1 protein.
〔配列番号： 51〕  [SEQ ID NO: 51]
マウス gob— 5タンパク質のアミノ酸配列を示す。  Shows the amino acid sequence of mouse gob-5 protein.
〔配列番号： 52〕 ヒト CLCA2タンパク質のアミノ酸配列を示す。 [SEQ ID NO: 52] 2 shows the amino acid sequence of human CLCA2 protein.
〔配列番号： 53〕  [SEQ ID NO: 53]
ヒト CLCA4タンパク質のアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of human CLCA4 protein.
〔配列番号： 54〕  [SEQ ID NO: 54]
配列番号： 50で表されるアミノ酸配列を有するヒト CLCA1タンパク質を コードする DNAの塩基配列を示す。  This shows the base sequence of DNA encoding the human CLCA1 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50.
〔配列番号： 55〕  [SEQ ID NO: 55]
配列番号： 51で表されるアミノ酸配列を有するマウス gob— 5タンパク質 をコードする DN Aの塩基配列を示す。  This shows the nucleotide sequence of DNA encoding the mouse gob-5 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
〔配列番号： 56〕  [SEQ ID NO: 56]
配列番号： 52で表されるアミノ酸配列を有するヒト CLCA 2タンパク質を コードする D N Aの塩基配列を示す。  The nucleotide sequence of DNA encoding the human CLCA 2 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 is shown.
〔配列番号： 57〕  [SEQ ID NO: 57]
配列番号： 53で表されるアミノ酸配列を有するヒト CLCA4タンパク質を コードする DN Aの塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られた NIM-1は、 2002年 6月 26日から、 日本国茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP- 8091として寄託されている。 後述の参考例 1で得られた形質転換体 Escherichia coli TOPlO/pCR-Blunt II- rCLCAlは、 2002年 1月 9日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ一に寄託番 号 FERM BP- 7846として、 2001年 12月 18日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2丁目 17番 85号 （郵便番号 532-8686) の財団法人。発酵研究所 （IF0) に寄託番号 IF0 16742として寄託されている。  The nucleotide sequence of DNA encoding the human CLCA4 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is shown. From June 26, 2002, NIM-1 obtained in Example 1 described below was incorporated by the Industrial Technology Development Corporation of 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, with a central 6th (postal code 305-8566). Deposited at the Institute for Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8091. The transformant Escherichia coli TOPlO / pCR-Blunt II-rCLCAl obtained in Reference Example 1 described below has been used since January 9, 2002, Tsukuba East Higashi 1-1-chome 1 Chuo No. 6 (Postal code 305-8566 Deposit No. FERM BP-7846 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) as a deposit number FERM BP-7846 2-18-17 Jusanhoncho 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan from December 18, 2001 (postal code 532-8686). Deposited with the Fermentation Research Institute (IF0) under the deposit number IF0 16742.
後述の参考例 2で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) TOPlO/pCR- Bluntll- mCLCA4は、 2002年 2月 12日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センターに寄託番号 FERM BP-7887として、 2002年 1月 29日から大阪府大 阪市淀川区十三本町 2丁目 17番 85号 （郵便番号 532- 8686) の財団法人発酵研究所The transformant Escherichia coli TOPlO / pCR-Bluntll-mCLCA4 obtained in Reference Example 2 described below has been used since February 12, 2002 at 1-1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref. No. 305-8566) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) as a deposit number FERM BP-7887 from January 29, 2002, Osaka Prefecture University Fermentation Research Institute, 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka City (zip code 532-8686)
(IF0) に受託番号 IF0 16751として寄託されている。 (IF0) as deposit number IF0 16751.
後述の参考例 2で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia col i) TOP10/pCR- Blunt l l- mCLCA4Aは、 2002年 3月 4日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センターに寄託番号 FERM BP- 7934として、 2002年 2月 19日から大阪府大 阪市淀川区十三本町 2丁目 17番 85号 （郵便番号 532- 8686) の財団法人発酵研究所 The transformant Escherichia coli (Escherichia coli) TOP10 / pCR-Blunt l-mCLCA4A obtained in Reference Example 2 described below has been available since March 4, 2002, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 1 Central No. 6 (Postal code 305-8566) Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Depositary Depositary No. FERM BP-7934 No. 2-17, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka, Japan since February 19, 2002 No.85 (Zip code 532-8686) Fermentation Research Institute
(IF0) に受託番号 IF0 16764として寄託されている。 以下に、 実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本 発明はそれに限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 Molecul ar c loningに記載されている方法に従った。 (IF0) and accession number IF0 16764. Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited thereto. The method of genetic manipulation using Escherichia coli followed the method described in Molecular cloning.
( 1 ) ラット C L C A 1遺伝子のクローニング (1) Cloning of rat CLC A1 gene
ヒト CLCA1遺伝子の塩基配列 〔Genomics、 54巻、 200頁 （1998) 〕 、 マウス gob- 5遺伝子の塩基配列 〔Biochem. Biophys. Res. Commun.、 255巻、 347頁  Nucleotide sequence of human CLCA1 gene [Genomics, 54, 200 (1998)], mouse gob-5 gene [Biochem. Biophys. Res. Commun., 255, 347
(1999) 〕 およびブ夕 CLCA1遺伝子の塩基配列 [Phys iol. Genomics, 3巻、 101頁 (1999)] and the nucleotide sequence of CLCA1 gene [Physiol. Genomics, 3, 101
(2000) 〕 の共通配列を参考にして 5種のプライマ一 〔プライマ一 1 (配列番 号： 3 ) 、 プライマ一 2 (配列番号： 4 ) 、 プライマー 3 (配列番号： 5 ) 、 プ ライマー 4 (配列番号： 6 ) およびプライマ一 5 (配列番号： 7 ) ) を設計-合 成した。 次に、 ラット胃粘膜組織から IS0GEN (和光純薬社製） を用いて全 RNAを 調製した。 この全 RNA 200ngを出発材料として TaqMan Gold RT-PCR Ki t (ァプラ ィドバイオシステムズ社製） を用いて 100 1の反応液中で逆転写反応により cDNA を合成した。 この cDNAを铸型としてプライマー 1とプライマー 4、 プライマー 1 とプライマー 5、 プライマ一 2とプライマー 3、 プライマ一 3とプライマー 5の 組み合わせで PCRを行った後、 ァガロース電気泳動により予想される大きさの DNA 断片が増幅されることを認めた。 反応は Takara Ex Taq (宝酒造社製） を用いて サーマルサイクラ一 Gene Amp PCR Sys tem 9700 (パーキンエルマ一社製） にて、 最初 94 で 1分間反応させた後、 94°Cで 10秒、 65Tで 30秒、 72 で 2分 30秒を 1反 応サイクルとして 35サイクル繰り返し、 最後は 72 で 10分間反応させた。 得られ た DNA断片は pT7 Blue-T vector (Novagen社製） にクローニングした。 さらに T7 promoter primer (配列番号： 15) 、 U19 primer (配列番号： 2 1) および 2 種の合成プライマ一 〔プライマー 6 (配列番号： 8) およびプライマ一 7 (配列 番号： 9) 〕 を用いてサイクルシークェンス反応を行い、 蛍光 MAシークェンサ -377 (パーキンエルマ一社製） で得られた反応物の塩基配列を決定した。 その 結果、 ラット CLCA1遺伝子の部分塩基配列として 1879個の塩基配列を決定した (2000)], five primers [primer 1 (SEQ ID NO: 3), primer 2 (SEQ ID NO: 4), primer 3 (SEQ ID NO: 5), primer 4] (SEQ ID NO: 6) and Primer-5 (SEQ ID NO: 7)) were designed and synthesized. Next, total RNA was prepared from rat gastric mucosal tissue using IS0GEN (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Using 200 ng of the total RNA as a starting material, cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction in a 1001 reaction solution using TaqMan Gold RT-PCR Kit (manufactured by Applied Biosystems). Using this cDNA as a 铸, PCR was performed with the combination of primer 1 and primer 4, primer 1 and primer 5, primer 1 and primer 3, and primer 13 and primer 5, and the size expected by agarose gel electrophoresis. The DNA fragment was found to be amplified. The reaction was performed using Takara Ex Taq (manufactured by Takara Shuzo) on a thermal cycler Gene Amp PCR System 9700 (manufactured by PerkinElmer) at 94 for 1 minute, then at 94 ° C for 10 seconds and 65T. 30 seconds, 72 2 minutes 30 seconds 1 The reaction cycle was repeated 35 times, and the reaction was finally performed at 72 for 10 minutes. The obtained DNA fragment was cloned into pT7 Blue-T vector (Novagen). Furthermore, using T7 promoter primer (SEQ ID NO: 15), U19 primer (SEQ ID NO: 21) and two kinds of synthetic primers [Primer 6 (SEQ ID NO: 8) and Primer 7 (SEQ ID NO: 9)] A cycle sequence reaction was performed, and the nucleotide sequence of the reaction product obtained using Fluorescent MA Sequencer-377 (manufactured by PerkinElmer Inc.) was determined. As a result, 1879 nucleotide sequences were determined as a partial nucleotide sequence of rat CLCA1 gene.
(配列番号： 2) 。 配列番号： 2で表される塩基配列を基に、 625個のアミノ酸 配列を決定した （配列番号： 1) 。 該部分アミノ酸配列は、 ヒト CLCA1の対応す る配列とは 75%、 マウス gob- 5の対応する配列とは 88%の相同性を有していた。 (SEQ ID NO: 2). Based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, a 625 amino acid sequence was determined (SEQ ID NO: 1). The partial amino acid sequence had 75% homology with the corresponding sequence of human CLCA1 and 88% with the corresponding sequence of mouse gob-5.
(2) ラット CLCA 1完全長遺伝子のクローニング (2) Cloning of rat CLCA 1 full-length gene
上記参考例 1 (1) で調製したラット胃粘膜全 RNAより mRNA purification kit (amersham Pharmacia biotech社製） を用いて mRNAを調製した。 この mRNA l g を出発材料として Marathon cDNA Amplification Kit (clontech社製） を用いて Adaptor- ligated cDNAを合成した。 5，_RACEのために、 この cDNAを铸型としてプ ライマ一 10 (配列番号： 13) とプライマ一 AP I (配列番号： 19)  From the rat gastric mucosa total RNA prepared in Reference Example 1 (1), mRNA was prepared using an mRNA purification kit (manufactured by amersham Pharmacia biotech). Using this mRNA Ig as a starting material, an Adaptor-ligated cDNA was synthesized using a Marathon cDNA Amplification Kit (clontech). 5. For _RACE, use this cDNA as type I primer 10 (SEQ ID NO: 13) and primer AP I (SEQ ID NO: 19)
(clontech社製） の組み合わせで PCRを行った後、 その反応液を铸型にプライマ —1 1 (配列番号： 14) とプライマー AP 2 (配列番号： 20) (clontech社 製） の組み合わせで nested PCRを行い、 増幅してきた DNA断片を pCRII-TOPO vector (invi trogen社製） にクロ一ニングした。 T7 promoter primer (配列番 号： 1 5) 、 M13RV primer (配列番号： 16) を用いてサイクルシークェンス反 応を行い、 蛍光 DNAシークェンサ一 3100 (アプライドバイオシステムズ社製） で 得られた反応物の塩基配列を決定した。 その結果、 ラット CLCA1 N末端アミノ酸 配列に相当する塩基配列は含まれていなかつたので、 さらにプライマー 12 (配 列番号： 17) を合成し、 Adaptor- ligated cDNAを铸型に、 プライマー AP2  After performing PCR with the combination of (clontech), the reaction solution was nested with a combination of primer — 11 (SEQ ID NO: 14) and primer AP 2 (SEQ ID NO: 20) (clontech). PCR was performed, and the amplified DNA fragment was cloned into a pCRII-TOPO vector (manufactured by Invitrogen). Cycle sequence reaction was performed using T7 promoter primer (SEQ ID NO: 15) and M13RV primer (SEQ ID NO: 16), and the base of the reaction product obtained with Fluorescent DNA Sequencer-1 3100 (Applied Biosystems) was used. The sequence was determined. As a result, since the nucleotide sequence corresponding to the rat CLCA1 N-terminal amino acid sequence was not contained, primer 12 (SEQ ID NO: 17) was further synthesized, and the Adapter-ligated cDNA was converted into type II primer AP2
(clontech社製） との組み合わせで PCRを行い、 増幅してきた DNA断片の塩基配列 を直接、 蛍光 DNAシークェンサ一 3100 (アプライドバイオシステムズ社製） で決 定した。 その結果、 ラツト CLCA1 N末端アミノ酸配列に対応する塩基配列が判明した。 また、 3，- RACEのために、 Adaptor-ligated cDNAを铸型としてプライマー 3と プライマー AP I (clontech社製） の組み合わせで PCRを行った後、 その反応液 を铸型にプライマ一 13 (配列番号： 18) とプライマー AP2 (clontech社製） の組み合わせで nested PCRを行った。 続いて増幅してきた DNA断片の塩基配列を 直接、 蛍光 DNAシークェンサ一 3100 (アプライドバイオシステムズ社製） で決定 した。 その結果、 ラット CLCA1 C末端アミノ酸配列に対応する塩基配列が判明し た。 PCR was performed in combination with the DNA sequencer (manufactured by Clontech), and the nucleotide sequence of the amplified DNA fragment was directly determined using a fluorescent DNA sequencer-1100 (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the nucleotide sequence corresponding to the rat CLCA1 N-terminal amino acid sequence was determined. Also, for 3, -RACE, adaptor-ligated cDNA was used as a type I primer and primer 3. After PCR was performed using the combination of primers API (manufactured by Clontech), the reaction solution was subjected to nested PCR using a combination of primer 13 (SEQ ID NO: 18) and primer AP2 (manufactured by clontech). Subsequently, the nucleotide sequence of the amplified DNA fragment was directly determined using a fluorescent DNA sequencer-3100 (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the nucleotide sequence corresponding to the rat CLCA1 C-terminal amino acid sequence was determined.
以上の結果、 ラット CLCA1完全長遺伝子は 2730個の塩基配列を有していること が判明した （配列番号： 23) 。 配列番号： 23で表される塩基配列がコードす る 910個のアミノ酸配列を、 配列番号： 22に示す。  As a result, it was found that the rat CLCA1 full-length gene had 2730 nucleotide sequences (SEQ ID NO: 23). The 910 amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 is shown in SEQ ID NO: 22.
配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、 ラット A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 was prepared from rat
CLCA1タンパク質と命名した。 ラット CLCA1タンパク質は、 アミノ酸レベルでヒトIt was named CLCA1 protein. Rat CLCA1 protein is human at the amino acid level
CLCA1と 76%、 マウス gob_5と 89%の相同性をそれぞれ示した。 It showed 76% homology with CLCA1 and 89% with mouse gob_5, respectively.
配列番号： 22で表されるアミノ酸配列の第 268番目から第 889番目は、 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の第 4番目から第 625番目のアミノ酸配列と同一であ つた。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の第 1番目から第 3番目の Tyr_Gly- The amino acids 268 to 889 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 were identical to the amino acids 4 to 625 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 1st to 3rd Tyr_Gly- in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
Leuは、 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列の第 265番目から第 267番目ではLeu is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 from position 265 to position 267
Asn-Gl n- Ar gに置換されている。 Substituted for Asn-Gln-Arg.
配列番号： 2で表される塩基配列の第 1番目から第 10番目の配列は、 対応する 配列番号： 23の塩基配列では AAAACCAACGに置換されている。 また、 第 17番目の T、 第 224番目の 第 1787番目の Αおよび第 1868番目の Cは、 対応する配列番号： The first to tenth sequences of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are substituted with AAAACCAACG in the corresponding nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23. In addition, the 17th T, the 224th 1787th Α and the 1868th C are the corresponding SEQ ID NOs:
23の塩基配列では、 それぞれ T、 Cおよび Gに置換されている。 In the 23 base sequences, they are replaced by T, C and G, respectively.
これらの結果をもとに、 ラット胃粘膜 cDNAを铸型としてプライマー 14 (配列 番号： 24) とプライマー 1 5 (配列番号： 25) の組み合わせで Pyrobest DNA Based on these results, Pyrobest DNA was obtained by combining rat gastric mucosa cDNA with type I primer 14 (SEQ ID NO: 24) and primer 15 (SEQ ID NO: 25).
Polymerase (宝酒造社製） を用いて PCRを行い、 配列番号： 23で表される塩基 配列を有する DNA断片を pCR- Bluntll- TOPO vector (invi trogen社製） にクロー二 ングした。 このプラスミドを大腸菌 TO 0 (invi trogen社製） に導入し、 PCR was performed using Polymerase (manufactured by Takara Shuzo), and a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 was cloned into pCR-Bluntll-TOPO vector (manufactured by Invitrogen). This plasmid was introduced into E. coli TO 0 (invitrogen),
Escherichia coli T0P10/pCR- Bluntll- rCLCAlと命名した。 参考例 2 (1) マウス CLCA4遺伝子のクローニング It was named Escherichia coli T0P10 / pCR-Bluntll-rCLCAl. Reference example 2 (1) Cloning of mouse CLCA4 gene
ヒト CLCA4遺伝子の塩基配列 〔FEBS Letters, 455巻、 295頁 （1999) 〕 、 マウ ス gob-5遺伝子の塩基配列 CBiochem. Biophys. Res. Commun.、 255巻、 347頁 (1999) 〕 を参考にして 4種のプライマ一 〔プライマ一 1 (配列番号： 30) 、 プライマ一 2 (配列番号： 31) 、 プライマー 3 (配列番号： 32) およびブラ イマ一 4 (配列番号： 33) 〕 を設計 ·合成した。 次に、 マウス大腸組織から IS0GEN (和光純薬社製） を用いて全 RNAを調製した。 さらに mRNA puri f icat ion kit (アマシャムフアルマシアバイオテク社製） を用いて mRNAを調製した。 この mRNA l gを出発材料として Marathon cDNA Amplification kit (Clontech社製） を用いて逆転写反応により cDNAを合成した。 この cDNAを铸型としてプライマ一 1 とプライマ一 2、 プライマー 3とプライマ一 4の組み合わせで PCRを行った後、 ァガ口一ス電気泳動により予想される大きさの DNA断片が増幅されることを認め た。 反応は pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製） を用いてサ一マルサイクラ 一 Gene Amp PCR System 9700 (パーキンエルマ一社製） にて、 最初 94°Cで 30秒間 反応させた後、 94t:で 10秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 2分 30秒を 1反応サイクルとして 35サイクル繰り返し、 最後は 72tで 10分間反応させた。 得られた DNA断片は pCR_ Blunt II-T0P0 (Invi trogen社製) にクロ一ニングした。 さらに T7 promoter primer (配列番号： 40) 、 M13RV primer (配列番号： 41) および 6種の合成 プライマ一 〔プライマ一 5 (配列番号： 34) 、 プライマ一 6 (配列番号： 3 5) 、 プライマ一 7 (配列番号： 36) 、 プライマ一 8 (配列番号： 37) 、 プ ライマー 9 (配列番号： 38) およびプライマー 1 0 (配列番号： 39) 〕 を用 いてサイクルシークェンス反応を行い、 蛍光 DNAシークェンサ一 377 (パーキンェ ルマ一社製） で得られた反応物の塩基配列を決定した。 その結果、 マウス CLCA4 遺伝子の部分塩基配列としてマウス N末端配列を含有する 2027個の塩基配列を挿 入したクローン No.3-1 (配列番号： 28) とマウス C末端配列を含有する 1869個 の塩基配列を揷入したクローン No.7-3 (配列番号： 4) を取得した。 両者の重複 配列を除き、 マウス CLCA4は 2772個の塩基配列からなることが判明した （配列番 号： 27) 。 配列番号： 27で表される塩基配列を基に、 924個のアミノ酸配列 を決定し （配列番号： 26) 、 マウス CLCA4タンパク質と命名した。 つづいてク ローン ^.7-3を 11(1111で消化し、 1.4Kbのマウス CLCA4 C末端領域を含む DNA断片 を切り出した。 これを同じく Hindlllで消化したクローン !^0.3-1のマゥス(1^八4 N 末端領域を含むベク夕一配列に連結し、 マウス CLCA4完全長配列を含むプラスミ ド pCR- Bluntll- mCLCA4を構築した。 このプラスミドを含む形質転換体をェシエリ ヒア 'コリ （Escherichia col i) T0P10/pCR_BluntII - mCLCA4と命名した。 Refer to the nucleotide sequence of the human CLCA4 gene [FEBS Letters, vol. 455, p. 295 (1999)] and the nucleotide sequence of the mouse gob-5 gene CBiochem. Biophys. Res. Commun., 255, p. 347 (1999)]. Design four primers (primer 1 (SEQ ID NO: 30), primer 2 (SEQ ID NO: 31), primer 3 (SEQ ID NO: 32) and primer 1 (SEQ ID NO: 33)) Synthesized. Next, total RNA was prepared from mouse colon tissue using IS0GEN (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Further, mRNA was prepared using mRNA purification kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Using this mRNA lg as a starting material, cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using a Marathon cDNA Amplification kit (manufactured by Clontech). After performing PCR using this cDNA as a type III primer and a combination of primers 1 and 2, and primers 3 and 4, a DNA fragment of the expected size is amplified by agarose gel electrophoresis. Admitted. The reaction was carried out using Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) in a Thermocycler Gene Amp PCR System 9700 (PerkinElmer Co., Ltd.) at 94 ° C for 30 seconds, followed by 94t: for 10 seconds. The reaction cycle was repeated 35 times at 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes and 30 seconds, and the reaction was finally performed at 72 t for 10 minutes. The obtained DNA fragment was cloned into pCR_Blunt II-T0P0 (Invitrogen). In addition, T7 promoter primer (SEQ ID NO: 40), M13RV primer (SEQ ID NO: 41) and six synthetic primers [Primer-1 (SEQ ID NO: 34), Primer-6 (SEQ ID NO: 35), Primer-1 7 (SEQ ID NO: 36), Primer 8 (SEQ ID NO: 37), Primer 9 (SEQ ID NO: 38) and Primer 10 (SEQ ID NO: 39)] to perform a cycle sequence reaction, and the fluorescent DNA sequencer was used. The nucleotide sequence of the reaction product obtained in 1377 (PerkinElmer) was determined. As a result, clone No.3-1 (SEQ ID NO: 28) into which the 2027 nucleotide sequence containing the mouse N-terminal sequence was inserted as a partial nucleotide sequence of the mouse CLCA4 gene, and 1869 clones containing the mouse C-terminal sequence Clone No. 7-3 (SEQ ID NO: 4) into which the nucleotide sequence was inserted was obtained. Excluding the overlapping sequence of both, mouse CLCA4 was found to consist of 2772 nucleotide sequences (SEQ ID NO: 27). Based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27, a 924 amino acid sequence was determined (SEQ ID NO: 26) and named as mouse CLCA4 protein. Next Loan ^ .7-3 was digested with 11 (1111, and a 1.4Kb mouse CLCA4 DNA fragment containing the C-terminal region was cut out. This was also cloned into Hindlll and cloned! ^ 0.3-1 into a mouse (1 ^ 8 4). The plasmid pCR-Bluntll-mCLCA4 containing the full-length mouse CLCA4 sequence was ligated to the vector sequence containing the N-terminal region, and the transformant containing this plasmid was used to transform Escherichia coli T0P10 / pCR_BluntII-named as mCLCA4.
マウス CLCA4は、 アミノ酸レベルで、 ヒト CLCA4と 68%の相同性を、 マウス gob- 5と 51%の相同性を有していた。  At the amino acid level, mouse CLCA4 had 68% homology with human CLCA4 and 51% homology with mouse gob-5.
(2) マウス CLCA4A遺伝子のクロ一ニング  (2) Cloning of mouse CLCA4A gene
マウス CLCA4遺伝子のクローニングの際、 マウス CLCA4とは異なる塩基配列を有 するクローンの存在が示唆された。 そこで、 マウス平滑筋 cDNA (Mouse MTC panel II :クロンテック社製） を铸型として、 プライマー 1 (配列番号： 30) とプライマ一 11 (配列番号： 46) の組み合わせで PCRを行い、 ァガ口一ス電 気泳動により 2.7Kbの DNA断片が増幅されることを認めた。 反応は pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製） を用いてサーマルサイクラ一 Gene Amp PCR System 9700 (パーキンエルマ一社製） にて、 最初 94 で 30秒間反応させた後、 94°Cで 10 秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 5分を 1反応サイクルとして 35サイクル繰り返し、 最後は 72°Cで 10分間反応させた。 得られた DNA断片は pCR- Bluntll- T0P0 (Invitrogen社 製） にクロ一ニングした。 さらに T7 promoter primer (配列番号： 40) 、 M13RV primer (配列番号： 41) および 6種の合成プライマー 〔プライマ一 5 (配列番号： 34) 、 プライマー 6 (配列番号： 35) 、 プライマー 7 (配列番 号： 36) 、 プライマー 8 (配列番号： 37) 、 プライマー 9 (配列番号： 3 8) およびプライマ一 10 (配列番号： 39) 〕 を用いてサイクルシークェンス 反応を行い、 蛍光 DNAシークェンサ一 377 (パーキンエルマ一社製） で得られた反 応物の塩基配列を決定した。 その結果、 マウス CLCA4とアミノ酸レベルで 94%、 ヒト CLCA4と 68%の相同性を示す 924個のアミノ酸からなるタンパク質 （配列番 号： 42) がコードされていることが判明し （配列番号： 43) 、 マウス CLCA4A タンパク質と命名した。 上記プラスミド pCR_BluntII-mCLCA4を構築した。 このプ ラスミド pCR_BluntII_T0P0を含む形質転換体をェシエリヒア ·コリ  When cloning the mouse CLCA4 gene, the existence of a clone having a nucleotide sequence different from that of mouse CLCA4 was suggested. Therefore, PCR was performed using mouse smooth muscle cDNA (Mouse MTC panel II: Clontech) as a type III primer in combination with primer 1 (SEQ ID NO: 30) and primer 11 (SEQ ID NO: 46). It was confirmed that a 2.7 Kb DNA fragment was amplified by electrophoresis. The reaction was performed using a thermal cycler Gene Amp PCR System 9700 (manufactured by Perkin Elmer) using pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) for 30 seconds at 94 first, then 60 seconds at 94 ° C for 10 seconds. The reaction was repeated for 35 cycles, with one reaction cycle consisting of 30 seconds at C and 5 minutes at 72 ° C, followed by a reaction at 72 ° C for 10 minutes. The obtained DNA fragment was cloned into pCR-Bluntll-TOP0 (manufactured by Invitrogen). In addition, T7 promoter primer (SEQ ID NO: 40), M13RV primer (SEQ ID NO: 41) and six synthetic primers [Primer 1 (SEQ ID NO: 34), Primer 6 (SEQ ID NO: 35), Primer 7 (SEQ ID NO: 35) No .: 36), Primer 8 (SEQ ID NO: 37), Primer 9 (SEQ ID NO: 38) and Primer 10 (SEQ ID NO: 39)] to perform a fluorescent sequencer reaction. The base sequence of the reaction product obtained by Elma Corporation was determined. As a result, it was found that a protein consisting of 924 amino acids (SEQ ID NO: 42) having 94% homology with mouse CLCA4 at the amino acid level and 68% homology with human CLCA4 was encoded (SEQ ID NO: 43). ) And designated as mouse CLCA4A protein. The above plasmid pCR_BluntII-mCLCA4 was constructed. A transformant containing this plasmid pCR_BluntII_T0P0 was transformed into Escherichia coli.
(Escherichia coli) T0P10/pCR- Bluntll- mCLCA4Aと命名した。 参考例 3 (Escherichia coli) T0P10 / pCR-Bluntll-mCLCA4A. Reference example 3
ラット CLCA4遺伝子のクローニング  Cloning of rat CLCA4 gene
ヒト CLCA4遺伝子の塩基配列 〔FEBS Letters, 455卷、 295頁、 1999年〕 、 マウ ス CLCA4遺伝子の塩基配列 （配列番号： 27) およびマウス CLCA4A遺伝子の塩基 配列を参考にして 2種のプライマー 〔プライマー 12 (配列番号： 47) および プライマー 13 (配列番号： 48) 〕 を設計 '合成した。 次に、 ラット腸組織か ら ISOGEN (和光純薬社製） を用いて全 RNAを調製した。 さらに mRNA puri ficat ion kit (アマシャムフアルマシアバイオテク社製） を用いて mRNAを調製した。 この mRNA 1 zgを出発材料として Marathon cDNA Amplification kit (Clontech社製） を用いて逆転写反応により cDNAを合成した。 この cDNAを铸型としてプライマ一 1 2とプライマー 1 3の組み合わせで PCRを行った後、 ァガロース電気泳動により 予想される大きさの DNA断片が増幅されることを認めた。 反応は pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製） を用いてサ一マルサイクラ一 Gene Amp PCR System 9700 (パーキンエルマ一社製） にて、 最初 94 で 30秒間反応させた後、 94 で 10 秒、 60でで 30秒、 72°Cで 2分を 1反応サイクルとして 35サイクル繰り返し、 最後は 72°Cで 10分間反応させた。 得られた1 断片は ^11^11-^)?0 (Invitrogen社 製） にクローニングした。 さらに T7 promoter primer (配列番号： 40) 、 M13RV primer (配列番号： 41) および 3種の合成プライマー 〔プライマー 12 (配列番号： 47) 、 プライマ一 13 (配列番号： 48) 、 プライマ一 14 (配 列番号： 49) 〕 を用いてサイクルシークェンス反応を行い、 蛍光 DNAシークェ ンサ一 377 (パーキンエルマ一社製） で得られた反応物の塩基配列を決定した。 その結果、 ラット CLCA4遺伝子の部分塩基配列として 1119個の塩基配列を挿入し たクローン No.a-20 (配列番号： 45) を取得した。 配列番号： 45で表される 塩基配列を基に、 373個の部分アミノ酸配列を決定した （配列番号： 44) 。 該 部分アミノ酸配列は、 ヒト CLCA4の対応する配列とは 66%、 マウス CLCA4、 マウス CLCA4Aの対応する配列とは 81%の相同性を有していた。 実施例 1 (1) ラット初代気道上皮細胞の分離 Two primers [primer based on the nucleotide sequence of human CLCA4 gene [FEBS Letters, vol. 455, p. 295, 1999], the nucleotide sequence of mouse CLCA4 gene (SEQ ID NO: 27) and the nucleotide sequence of mouse CLCA4A gene 12 (SEQ ID NO: 47) and primer 13 (SEQ ID NO: 48)] were designed and synthesized. Next, total RNA was prepared from rat intestinal tissue using ISOGEN (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Further, mRNA was prepared using mRNA puri ficat ion kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). CDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using 1 zg of this mRNA as a starting material and a Marathon cDNA Amplification kit (manufactured by Clontech). After PCR was performed using this cDNA as type I and a combination of primer 12 and primer 13, it was confirmed that a DNA fragment of the expected size was amplified by agarose electrophoresis. The reaction was carried out using pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) on a Thermocycler Gene Amp PCR System 9700 (manufactured by PerkinElmer) first at 94 for 30 seconds, then at 94 for 10 seconds and at 60 The reaction was repeated for 35 cycles with 1 minute as a reaction cycle of 2 minutes at 72 ° C for 30 seconds, and the reaction was finally performed at 72 ° C for 10 minutes. One obtained fragment was cloned into ^ 11 ^ 11-^)-0 (manufactured by Invitrogen). Furthermore, T7 promoter primer (SEQ ID NO: 40), M13RV primer (SEQ ID NO: 41) and three synthetic primers [Primer 12 (SEQ ID NO: 47), Primer 13 (SEQ ID NO: 48), Primer 14 ( [SEQ ID NO: 49)], and the nucleotide sequence of the reaction product obtained with a fluorescent DNA sequencer 377 (PerkinElmer) was determined. As a result, clone No. a-20 (SEQ ID NO: 45) was obtained in which 1119 nucleotide sequences were inserted as a partial nucleotide sequence of rat CLCA4 gene. Based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 45, a partial amino acid sequence of 373 was determined (SEQ ID NO: 44). The partial amino acid sequence had 66% homology with the corresponding sequence of human CLCA4 and 81% homology with the corresponding sequence of mouse CLCA4 and mouse CLCA4A. Example 1 (1) Isolation of primary rat airway epithelial cells
Wistarラット （ォス、 7週齢） を密封容器に入れ、 炭酸ガス注入により窒息死 させた後、 組織培養の技術 〔第 2版〕 132頁 （日本組織培養学会編、 朝倉書店） 記 載の方法に準じて、 力ニューレを気管に挿入後、 気管を摘出した。 取り出した気 管の内外を DMEM/F12培地 （インビトロジェン社製） で十分に洗浄し、 付着した血 液を除去した後、 注射筒を用いて力ニューレから充分量の 1%プロテアーゼ液  Wistar rats (oss, 7 weeks old) were placed in a sealed container and killed by asphyxiation by injecting carbon dioxide. Tissue culture technology [2nd edition] p. 132 (edited by the Japan Society for Tissue Culture, Asakura Shoten) According to the method, the trachea was excised after inserting a forcenula into the trachea. The inside and outside of the removed trachea is thoroughly washed with DMEM / F12 medium (manufactured by Invitrogen) to remove the attached blood, and then a sufficient amount of 1% protease solution is removed from the force neura using a syringe.
(Protease- Typel4、 シグマ社製） を気管の内部に流した。 その後、 気管下端を 手術糸で結紮し、 1% プロテアーゼ液で気管内腔を満たし、 50ml遠心管内の DMEM/F12培地に浸した。 37T:で 1時間処理後、 DMEM/F12培地 + 5% FBSを入れた注 射筒を力ニューレに連結し、 内筒を数回上下させ、 気管内の細胞を含んだプロテ ァ一ゼ液を気管から出し入れして細胞の分離を十分にした後、 気管の下端をハサ ミで切開してプロテア一ゼ液を押し流し、 細胞を含んだプロテア一ゼ液を遠心管 に集めた。 上記方法で得られた細胞を含んだ液を遠心 （1000Π 、 5分間） 後、 上 清を捨て、 ラット気道上皮細胞用培地 〔アメリカン ジャーナル ォブ レスピ ラトリ一 セル アンド モレキュラー バイオロジー （Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.) 12巻、 385頁 (1995) 〕 の基礎培地を DMEM/F12培地に変更し、 CaCl2 を除いた培地 （以下、 改変ラット気道上皮細胞用培地と称する） に懸濁し、 10cm2(i) Typelコラーゲンコートディッシュ （岩城硝子社製） に播種した。 (Protease-Typel4, manufactured by Sigma) was flowed into the trachea. Thereafter, the lower end of the trachea was ligated with a surgical thread, the tracheal lumen was filled with 1% protease solution, and immersed in DMEM / F12 medium in a 50 ml centrifuge tube. After treatment with 37T: for 1 hour, connect the injection tube containing DMEM / F12 medium + 5% FBS to the force nebulizer, raise and lower the inner tube several times, and remove the protease solution containing tracheal cells. After the cells were removed from the trachea to sufficiently separate the cells, the lower end of the trachea was cut open with scissors, and the protease solution was washed away, and the protease solution containing the cells was collected in a centrifuge tube. After centrifuging the liquid containing the cells obtained by the above method (1000 ° C, 5 minutes), discard the supernatant and discard the medium for rat airway epithelial cells [American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.) Volume 12, p. 385 (1995)] was changed to DMEM / F12 medium and suspended in a medium without CaCl 2 (hereinafter referred to as a modified rat airway epithelial cell medium). It became cloudy and was seeded on a 10 cm 2 (i) Typel collagen coated dish (Iwaki Glass).
(2) ラット気道上皮細胞株、 N IM— 1細胞の樹立  (2) Establishment of rat airway epithelial cell line, NIM-1 cell
2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら培養を継続し、 コンフルェントになった細胞を 0.25% トリプシン · lmM EDTA液 （インビトロジ ェン社製） で剥がし、 新たに 3X104個の細胞を lOcin2* Typelコラーゲンコート ディッシュに播種した。 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換 しながら、 40日間培養を継続した。 その後、 細胞を 0.25%トリプシン · 1 EDTA 液で剥がし、 新たに 5X104個の細胞を 10cm2 φ Typelコラーゲンコ一トディッシ ュに播種した。 さらに 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換し ながら、 20日間培養を継続した。 その後、 細胞を 0.25% トリプシン ' lmM EDTA 液で剥がし、 新たに 3X104個の細胞を 10cm2(i) Typelコラーゲンコ一トディッシ ュに播種した。 さらに 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換し ながら、 15日間培養を継続した。 その後、 細胞を 0. 25 % トリプシン · lmM EDTA 液で剥がし、 新たに 3 X 104個の細胞を 10 2 Typelコラーゲンコートディッシ ュに播種した。 さらに 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換し ながら、 12日間培養を継続した。 その後、 細胞を 0. 25 % トリプシン · lmM EDTA 液で剥がし、 新たに 3 X 103個の細胞を l Ocm Typelコラーゲンコートディッシ ュに播種した。 さらに 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換し ながら培養を行うことにより、 単一細胞に由来するコロニーの出現が認められ、 NIM- 1細胞として樹立した。 実施例 2 Culture was continued while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days, and the confluent cells were peeled off with 0.25% trypsin / lmM EDTA solution (manufactured by Invitrogen), and 3x10 4 cells were newly added. Cells were seeded on a lOcin 2 * Typel collagen coated dish. Culture was continued for 40 days while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days. Thereafter, the cells were detached with a 0.25% trypsin / 1 EDTA solution, and 5 × 10 4 cells were newly seeded on a 10 cm 2 φ Typel collagen coat dish. Further, the culture was continued for 20 days while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days. Thereafter, the cells were detached with 0.25% trypsin 'lmM EDTA solution, and 3 × 10 4 cells were newly seeded on a 10 cm 2 (i) Typel collagen coat dish. Replace with fresh modified rat airway epithelial cell medium every 2 days. The culture was continued for 15 days. The cells were then detached with 0.25% trypsin · LMM EDTA solution, freshly seeded 3 X 10 4 cells of the 10 2 Typel collagen coated Disshi Interview. Further, the culture was continued for 12 days while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days. Thereafter, the cells were detached with a 0.25% trypsin / lmM EDTA solution, and 3 × 10 3 cells were newly seeded on an lOcm Typel collagen-coated dish. Further, by culturing while replacing the medium with fresh modified rat airway epithelial cells every two days, the appearance of colonies derived from single cells was observed, and the cells were established as NIM-1 cells. Example 2
抗サイトケラチン抗体、 抗ムチン抗体を用いた気道上皮細胞の証明  Proof of airway epithelial cells using anti-cytokeratin antibody and anti-mucin antibody
実施例 1で得られた NIM-1細胞を 8穴コラ一ゲンコートカルチヤ一スライド （ベ クトン ·ディッキンソン社製) にゥエルあたり 5 X 104個播種した。 培養 2日目に 新鮮培地に交換し、 培養 4日目に PBSで洗浄後、 4%バラフオルムアルデヒド （和 光純薬社製） で 10分間、 細胞を固定した。 0. 1 %の Tr i ton X-100 (SIGMA社製） を 含む PBS溶液で洗浄後、 5 % BSAで 30分間ブロッキングした。 その後、 上皮細胞を 認識するための一次抗体としてゥサギ由来の抗サイトケラチン抗体 （ICN社製） を 4 でー晚反応させ、 その検出に FITC (Fluoresce in I sothi ocyanate) で蛍光 標識した抗ゥサギ IgG抗体 （モレキュラープロ一ブス社製） を室温で 30分間反応 させた。 さらに粘液を認識するための一次抗体として、 マウス由来の抗 MUC5AC抗 体、 または抗 MUC2抗体 （ともにネオマーカーズ社製） を室温で 30分間反応させ、 その検出に Texas Redで蛍光標識した抗マウス IgG抗体 （モレキュラープローブス 社製） を室温で 30分間反応させた。 反応後、 細胞核検出用の DAP Iを含む封入剤 VECTASHIELD (ベクターラボラトリーズ社製） にて封入し、 蛍光顕微鏡で観察し た。 その結果、 NIM-1細胞はサイトケラチンを発現する気道上皮細胞であり、The NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded at 5 × 10 4 cells / well on an 8-well collagen-coated culture slide (manufactured by Becton Dickinson). On the second day of the culture, the medium was replaced with a fresh medium. On the fourth day of the culture, the cells were washed with PBS, and the cells were fixed with 4% baraformaldehyde (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) for 10 minutes. After washing with a PBS solution containing 0.1% Triton X-100 (manufactured by SIGMA), blocking was performed with 5% BSA for 30 minutes. Then, a primary antibody to recognize epithelial cells was reacted with an anti-cytokeratin antibody derived from egret (ICN) as a primary antibody for 4 hours, and the detection was carried out using anti-peacock IgG fluorescently labeled with FITC (Fluoresce in Isothiocyanate). The antibody (Molecular Probes) was reacted at room temperature for 30 minutes. In addition, a mouse-derived anti-MUC5AC antibody or anti-MUC2 antibody (both from Neomarkers) was reacted at room temperature for 30 minutes as a primary antibody to recognize mucus, and the anti-mouse fluorescently labeled with Texas Red was used for detection. An IgG antibody (Molecular Probes) was reacted at room temperature for 30 minutes. After the reaction, the cells were sealed with VECTASHIELD (manufactured by Vector Laboratories) containing DAPI for cell nucleus detection, and observed with a fluorescence microscope. As a result, NIM-1 cells are airway epithelial cells that express cytokeratin,
MUC5ACタンパク質および UC2タンパク質を含有する粘液を産生していることが確 認された。 実施例 3 N I M— 1細胞における I L— 13添加によるラット CLCA1遺伝子の発現 実施例 1で得られた NIM-1細胞を 96穴コラーゲンコートプレート （べクトン · ディッキンソン社製） にゥエルあたり 2X104個播種した。 培養 2日目に新鮮培地 に交換し、 培養 4日目にマウス IL- 13を終濃度 10ng/mlで添加し、 添加 24時間後の 全 RNAを RNeasy 96 Kit (QIAGEN社製） を用いて抽出した。 これらの全 RNAを出発 材料として TaqMan Gold RT-PCR Kit (アプライドバイオシステムズ社製） を用い て 100 1の反応液中で逆転写反応により cDNAを合成した。 そのうちの 10 t 1を用 いて ABI PRISM 7700シークェンスディテクター (アプライドバイオシステムズ社 製） を用いた TaqMan PCR法により、 ラット CLCA1遺伝子コピ一数を測定した。 遺伝子量検出に用いたプライマ一 〔プライマー 1 (配列番号： 10) 、 プライ マ一 2 (配列番号： 1 1) 〕 および TaqManプローブ （配列番号： 12) は Primer Expressプログラムを用いて設計した。 TaqManプローブのレポ一タ一色素には 6 - carboxyfluorescein (FAM) を使用した。 内部標準としてラット GAPDH遺伝子のコ ピ一数を TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VIC Probe (アプライドバイオ システムズ社製） を用いて求めた。 非特異的な増幅を除去するために逆転写酵素 を含まないサンプルも同様に処理し、 次式より、 GAPDH遺伝子あたりのラット CLCA1遺伝子コピー数を求めた。 It was confirmed that mucus containing MUC5AC protein and UC2 protein was produced. Example 3 Expression of rat CLCA1 gene by addition of IL-13 in NIM-1 cells NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded at 2 × 10 4 cells per well on a 96-well collagen-coated plate (manufactured by Becton Dickinson). On day 2 of culture, replace the medium with fresh medium.On day 4 of culture, add mouse IL-13 to a final concentration of 10 ng / ml, and extract total RNA 24 hours after addition using the RNeasy 96 Kit (QIAGEN) did. Using these total RNAs as starting materials, cDNA was synthesized by reverse transcription in a 1001 reaction mixture using a TaqMan Gold RT-PCR Kit (manufactured by Applied Biosystems). The number of copies of the rat CLCA1 gene was measured by TaqMan PCR using 10 t1 of these, using ABI PRISM 7700 Sequence Detector (manufactured by Applied Biosystems). The primers [Primer 1 (SEQ ID NO: 10), Primer 1 (SEQ ID NO: 11)] and TaqMan probe (SEQ ID NO: 12) used for detecting the gene amount were designed using the Primer Express program. 6-carboxyfluorescein (FAM) was used as the reporter dye of the TaqMan probe. As an internal standard, the number of copies of the rat GAPDH gene was determined using TaqMan Rodent GAPDH Control Reagents VIC Probe (manufactured by Applied Biosystems). Samples containing no reverse transcriptase were treated in the same manner to remove non-specific amplification, and the rat CLCA1 gene copy number per GAPDH gene was determined from the following equation.
(逆転写酵素含有サンプル中の遺伝子コピー数） 一 （逆転写酵素非含有サンプル 中の遺伝子コピー数） = (遺伝子コピー数）  (Number of gene copies in sample containing reverse transcriptase) i (Number of gene copies in sample not containing reverse transcriptase) = (Number of gene copies)
その結果、 NIM- 1細胞では、 ラット CLCA1が IL- 13に依存して発現誘導されるこ とがわかった （図 1) 。 実施例 4  As a result, it was found that in NIM-1 cells, expression of rat CLCA1 was induced depending on IL-13 (Fig. 1). Example 4
N I M— 1細胞における I L一 13添加による C a 2+依存性 C 1—チャネル活 性の増加 Addition of IL-13 in NIM-1 cells increases Ca2 + -dependent C1-channel activity
実施例 1で得られた NIM- 1細胞を 96穴ブラッククリアポトムプレート （コース 夕一社製） にゥエルあたり 4X104個播種した。 2日ごとに新鮮な改変ラット気道 上皮細胞用培地に交換しながら培養を継続し、 コンフルェントになった細胞にマ ウス IL- 13を終濃度 l Ong/mlで添加し、 さらに 2日間培養した。 C1—チャネル活性の 測定は FLIPR Membrane Potent i al Assay Ki t (モレキュラーデバイス社製） を使 用した。 20mMの HEPESを含む HBSSバッファ一 （Co即 onent B) で希釈した電位感受 性色素 （Co即 onent A) を 1ゥエルあたり 100 ^ 1添加し、 37°Cで 30分間反応させた。 その後、 プレートを FLIPR (モレキュラーデバイス社製） にセットし、 終濃度 10 Mのィオノマイシン刺激後の膜電位変化を蛍光強度の変化として観察した。 そ の結果、 IL- 13を添加して培養した NIM- 1細胞において、 Ca2+依存性 C チャネル活 性の増加に伴う膜電位の上昇が観察された （図 2 ) 。 実施例 5 The NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded at 4 × 10 4 cells per well on a 96-well black clear potom plate (Course Yuichisha). Culture was continued while replacing the medium with fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days. Mouse IL-13 was added at a final concentration of l Ong / ml, and the cells were further cultured for 2 days. The C1-channel activity was measured using a FLIPR Membrane Potential Assay Kit (Molecular Devices). A voltage-sensitive dye (Co-immediate onent A) diluted with HBSS buffer (Co-immediate onent B) containing 20 mM HEPES was added at 100 ^ 1 per 1 μl, and reacted at 37 ° C for 30 minutes. Thereafter, the plate was set on a FLIPR (manufactured by Molecular Devices), and the change in membrane potential after stimulation with ionomycin at a final concentration of 10 M was observed as a change in fluorescence intensity. As a result, in NIM-1 cells cultured with the addition of IL-13, an increase in membrane potential was observed with an increase in Ca 2+ -dependent C channel activity (FIG. 2). Example 5
ラッ卜気道上皮細胞株における I L一 1 3添加による粘液分泌の増加  Increased mucus secretion by addition of IL-113 in rat airway epithelial cell lines
実施例 1で得られた NIM-1細胞を 96穴コラーゲンコートプレートにゥエルあた り 4 X 104個播種した。 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換し ながら培養を継続し、 コンフルェントになった細胞にマウス IL- 13を終濃度 lOng/mlで添加し、 さらに 2日間培養した。 PBSで洗浄後、 DMEM/F12培地に交換し 37°C、 20分間反応を 3回行った。 その後、 0¾^¾1 12培地に希釈した終濃度10 ¾1の ィオノマイシンを添加し、 37°Cで 30分間反応させた。 反応後、 分泌された粘液を 含む上清を新たな 96穴プレートに移し、 37 で 2時間吸着させた。 上清中の粘液 をプレートに吸着させた後、 0. 3% BSAおよび 0. 05 % Tween20 (ICN社製） を含む PBS溶液で洗浄後、 3% BSAで 37°C、 2時間のブロッキングを行った。 その後、 粘 '液を認識するために、 ピオチン化した Ul ex Europaeus Lec t in I (UEA- 1、 和光純 薬社製） を 37 、 1時間反応させ、 その検出用に HRP標識したストレプトアビジン 4 × 10 4 NIM-1 cells obtained in Example 1 were seeded on a 96-well collagen-coated plate per well. Culture was continued while replacing the medium with fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days, and mouse IL-13 was added to the confluent cells at a final concentration of lOng / ml, followed by culturing for 2 days. After washing with PBS, the medium was replaced with DMEM / F12 medium, and the reaction was performed three times at 37 ° C for 20 minutes. Thereafter, ionomycin having a final concentration of 10 し た 1 diluted in 0¾ ¾ 12 12 medium was added and reacted at 37 ° C for 30 minutes. After the reaction, the supernatant containing the secreted mucus was transferred to a new 96-well plate and adsorbed at 37 for 2 hours. After the mucus in the supernatant was adsorbed to the plate, the plate was washed with a PBS solution containing 0.3% BSA and 0.05% Tween20 (ICN), and then blocked with 3% BSA at 37 ° C for 2 hours. went. After that, in order to recognize the mucus, a biotinylated Ulex Europaeus Lectin I (UEA-1, manufactured by Wako Pure Chemical) was reacted for 37 hours for 1 hour, and HRP-labeled streptavidin was detected for the detection.
(ベクターラボラトリーズ社製） を室温で 1時間反応させた。 0. 3% BSAおよび 0. 05 % Tween20を含む PBS溶液で洗浄後、 TMB Mi crowel l Peroxi dase Subs t rate (K P L社製） にて 3分間発色反応を行い、 TMB Stop Solut ion (KPL社製） で反 応停止後、 吸光光度計にて 450nmの吸光度を測定した。 ムチン濃度はコント口一 ルとして使用したブタ胃ムチン （シグマ社製） の吸光度をもとに検量線を作成し て算出した。 (Manufactured by Vector Laboratories) at room temperature for 1 hour. After washing with a PBS solution containing 0.3% BSA and 0.05% Tween20, a color reaction is performed for 3 minutes using a TMB Micloel Peroxidase Substrate (manufactured by KPL), and a TMB Stop Solution (manufactured by KPL) is performed. After stopping the reaction at), the absorbance at 450 nm was measured with an absorptiometer. The mucin concentration was calculated by creating a calibration curve based on the absorbance of porcine gastric mucin (manufactured by Sigma) used as a control.
その結果、 IL- 13を添加して培養した NIM- 1細胞において、 ィオノマイシン剌激 による粘液分泌の増加が観察された （図 3 ) 。 実施例 6 As a result, NIM-1 cells cultured with IL-13 were stimulated with ionomycin. Increased mucus secretion was observed (Fig. 3). Example 6
ラット C L C A 1遺伝子の発現を指標としたスクリーニング  Screening using rat CLC A1 gene expression as an index
実施例 1で得られた NIM- 1細胞を 96穴プレートにゥエルあたり 2 X 104個播種し、 2日ごとに新鮮改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しながら、 4日間培養する。 そのプレートに新鮮培地、 または新鮮培地で一定濃度に希釈した試験化合物を 1 ゥエルあたり 10 1添加し、 37°Cで 10分間反応する。 その後、 マウス IL- 13を終濃 度 10ng/mlで添加し、 さらに 1日間培養し、 実施例 3に記載の方法に従い、 細胞中 の全 RNAを RNeasy 96 Ki t (QIAGEN社製） を用いて抽出する。 これらの全 RNAを出 発材料として TaqMan Gold RT-PCR Ki t (アプライドバイオシステムズ社製） を用 いて逆転写反応により cDNAを合成する。 その一部を用いて ABI PRISM 7700シーク エンスディテクター (アプライドバイオシステムズ社製) を用いた TaqMan PCR法 により、 CLCA1遺伝子コピー数を測定する。 試験化合物無添加の状態で、 IL-13添 加時の CLCA1発現量を 100%、 IL- 13無添加時の CLCA1発現量を 0%として、 CLCA1発 現の阻害度を評価し、 CLCA1発現阻害作用を有する化合物を選択する。 実施例 7 The NIM-1 cells obtained in Example 1 are seeded in a 96-well plate at 2 × 10 4 cells / well, and cultured for 4 days while replacing the medium with fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days. To the plate, add 10 1 of fresh medium or a test compound diluted to a certain concentration with fresh medium per well, and incubate at 37 ° C for 10 minutes. Thereafter, mouse IL-13 was added at a final concentration of 10 ng / ml, and the cells were further cultured for 1 day. According to the method described in Example 3, the total RNA in the cells was analyzed using RNeasy 96 Kit (manufactured by QIAGEN). Extract. Using these total RNAs as starting materials, cDNA is synthesized by reverse transcription using TaqMan Gold RT-PCR Kit (manufactured by Applied Biosystems). Using a part thereof, the copy number of the CLCA1 gene is measured by the TaqMan PCR method using ABI PRISM 7700 Sequence Detector (manufactured by Applied Biosystems). In the absence of the test compound, the degree of inhibition of CLCA1 expression was evaluated, assuming that the expression level of CLCA1 when IL-13 was added was 100% and the expression level of CLCA1 when IL-13 was not added was 0%. A compound having an action is selected. Example 7
C a 2 +依存性 C 1一チャネル活性を指標としたスクリーニング Screening using C a2 + -dependent C1 channel activity as an index
実施例 4で示した FLIPR Membrane Potent i al Assay ki tを使用して Ca2+依存性 CI—チャネル活性を指標としたスクリーニングを行う。 Using the FLIPR Membrane Potential Assay Kit shown in Example 4, screening is performed using Ca 2+ -dependent CI-channel activity as an index.
実施例 1で得られた NIM- 1細胞を 96穴ブラッククリアポトムプレートにゥエル あたり 4xl 04個播種する。 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換, しながら培養を継続し、 コンフルェントになった細胞にマウス IL- 13を終濃度 10ng/mlで添加し、 さらに 2日間培養する。 Co即 onent Bで希釈した Co即 onent Aを 1ゥエルあたり 75 1添加し、 37°Cで 20分間反応する。 そのプレートに Component B、 または Component Bで一定濃度に希釈した試験化合物を 1ゥエルあたり 25 I添 加し、 37°Cで 10分間反応する。 その後、 プレートを FLIPRにセットし、 Component Bまたは終濃度 2 Mのィオノマイシンを含む Component Bを 1ゥエルあたり 50 1添 加する。 添加後の蛍光変化を CI—チャネル活性として観察する。 試験化合物無添 加の状態で、 ィオノマイシン刺激時の CI—チャネル活性を 100%、 ィオノマイシン 無刺激時の CI—チャネル活性を 0%として、 C1—チャネル活性を評価し、 C1—イオン チャネル阻害作用を有する化合物を選択する。 実施例 8 Obtained in Example 1 NIM- 1 cells are seeded 4XL 0 4 per Ueru to 96 black clear Po Tom plates. Culture is continued while changing the medium for fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days, and mouse IL-13 is added to the confluent cells at a final concentration of 10 ng / ml, followed by culturing for 2 days. Add Co Immediate Onent A diluted with Co Immediate Onent B at 75 1 / well, and react at 37 ° C for 20 minutes. To the plate, add Component B or a test compound diluted to a certain concentration with Component B, add 25 I per well, and react at 37 ° C for 10 minutes. Then, set the plate on the FLIPR and add Component B or Component B containing 2 M ionomycin at a final concentration of 50 1 / well. Add. The change in fluorescence after addition is observed as CI-channel activity. C1-channel activity was evaluated in the absence of the test compound, with CI-channel activity when stimulated with ionomycin set to 100% and CI-channel activity when not stimulated with ionomycin set to 0%. Is selected. Example 8
粘液分泌を指標としたスクリ一エング  Screening based on mucus secretion
実施例 5で示した粘液分泌活性を指標としたスクリ一二ングを行う。  Screening is performed using the mucus secretion activity shown in Example 5 as an index.
実施例 1で得られた NIM- 1細胞を 96穴コラーゲンコートプレートにゥエルあた り 4xl04個播種する。 2日ごとに新鮮な改変ラット気道上皮細胞用培地に交換しな がら培養を継続し、 コンフルェントになった細胞にマウス I L-13を終濃度 1 Ong/m 1 で添加し、 さらに 2日間培養する。 PBSで洗浄後、 DMEM/F12培地に交換し 37° (：、 20 分間反応を 3回行う。 培地を除去後、 新たな DMEM/F12培地または DMEM/F12培地で 一定濃度に希釈した試験化合物を 1ゥエルあたり 100 1添加し、 37°Cで 10分間反 応する。 その後、 DMEM/F12培地またはDMEM/F12培地に希釈した終濃度10 Mのィ オノマイシンを 1ゥエルあたり 100 1添加し、 37°Cで 30分間反応させる。 反応後、 分泌された粘液を含む上清を回収し、 新たな 96穴プレートに 37°Cで 2時間吸着さ せる。 0. 3 % BSAおよび 0. 05 % Tween20を含む PBS溶液で洗浄後、 3 % BSAで 37 、 2時間のブロッキングを行う。 その後、 ピオチン化した UEA- 1を 37°C、 1時間反応 させ、 その検出用に HRP標識したストレプトアビジンを室温で 1時間反応させる。 0. 3% BSAおよび 0. 05 % Tween20を含む PBS溶液で洗浄後、 TMB Mi crowel l The NIM-1 cells obtained in Example 1 are seeded on a 96-well collagen-coated plate at 4 × 10 4 per well. Culture is continued while replacing the medium for fresh modified rat respiratory epithelial cells every two days, and mouse IL-13 is added to the confluent cells at a final concentration of 1 Ong / m1 and cultured for 2 days. I do. After washing with PBS, replace the medium with DMEM / F12 medium and perform the reaction 3 times at 37 ° (:, 20 minutes. After removing the medium, dilute the test compound diluted to a certain concentration with fresh DMEM / F12 medium or DMEM / F12 medium. Add 100 1 per well and incubate for 10 minutes at 37 ° C. Then add 100 1 per well of DMEM / F12 medium or 10 M ionomycin diluted to DMEM / F12 medium, and add 37 ° C. Incubate for 30 minutes at C. After the reaction, collect the supernatant containing the secreted mucus and allow it to adhere to a new 96-well plate at 37 ° C for 2 hours 0.3% BSA and 0.05% Tween20 After washing with PBS solution, block with 3% BSA at 37 ° C for 2 hours, then react with biotinylated UEA-1 at 37 ° C for 1 hour, and add HRP-labeled streptavidin at room temperature for detection. After incubating for 1 hour, wash with PBS solution containing 0.3% BSA and 0.05% Tween20.
Peroxi dase Subs t rateにて 3分間発色反応を行い、 TMB Stop So lut i onで反応停止 後、 吸光光度計にて 450腹の吸光度を測定する。 コントロールとして使用したブ 夕胃ムチンの吸光度をもとに検量線を作成し、 ムチン濃度を算出する。 試験化合 物無添加の状態で、 ィオノマイシン刺激時のムチン濃度を 100%、 ィオノマイシ ン無刺激時のムチン濃度を 0%として、 粘液分泌活性を評価し、 粘液分泌阻害作 用を有する化合物を選択する。 実施例 9 ラット C L C A 1遺伝子の発現を指標としたスクリ一二ング Perform a color development reaction for 3 minutes at the Peroxidase Substrate, stop the reaction with TMB Stop Solution, and measure the absorbance of 450 belly with an absorptiometer. Create a calibration curve based on the absorbance of the mucin used as a control and calculate the mucin concentration. In the absence of the test compound, the mucin secretion activity is evaluated with the mucin concentration stimulated with ionomycin at 100% and the mucin concentration stimulated with ionomycin at 0%, and a compound having a mucus secretion inhibitory action is selected. . Example 9 Screening using expression of rat CLCA1 gene as an index
ラット気道上皮細胞株 (SP0C1) (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 14巻、 146頁、 1996年） を 96穴コラーゲンプレート （ベ クトン ·ディキンソン社製） に 1X104 cells/wellで播種し 4日間培養した。 培養 4日目に、 リコンビナントマウス IL-13 (R&D社製） および、 各種濃度 （1、 10およ び 100/zM) のワートマンニン （Wort maim in) (CALBI0CHEM社製） を添加し、 さら に 24時間培養した。 なお、 ヮ一トマンニンを添加していない細胞をコントロール とした。 A rat airway epithelial cell line (SP0C1) (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, vol. 14, p. 146, 1996) was seeded at 1 × 10 4 cells / well on a 96-well collagen plate (manufactured by Becton Dickinson). Cultured for days. On day 4 of the culture, recombinant mouse IL-13 (R & D) and various concentrations (1, 10, and 100 / zM) of wort mannin (CALBI0CHEM) were added, followed by 24 additional days. Cultured for hours. The cells to which no mannin was added were used as controls.
細胞を PBSで洗浄し、 50 l/wellの Lysis Buffer (Quant iGene High Volume Kit, Bayer社製） を加え、 37 で 30分間静置し細胞を溶解した。 各穴に 100^1の Probe Reagent (Quant iGene High Volume Kit, Bayer社製） をカロえてピぺッティ ングにより攪拌した後、 100 lをサンプリングして bDNA Capture Plate  The cells were washed with PBS, 50 l / well of Lysis Buffer (QuantiGene High Volume Kit, manufactured by Bayer) was added, and the mixture was left standing at 37 for 30 minutes to lyse the cells. After mixing 100 μl of Probe Reagent (QuantiGene High Volume Kit, Bayer) into each hole and stirring by pipetting, sample 100 l and bDNA Capture Plate
(Quant iGene High Volume Kit, Bayer社製） に添加し、 53°Cで 16〜24時間反応 させた。 Wash Buffer (Quant iGene High Volume Kit、 Bayer社製） でプレー卜を 2回洗、净後、 100 x 1の Amplifer Working Reagent (Quant iGene High Volume Kit, Bayer社製） を加え、 46°Cで 2時間反応させた。 さらに、 Wash Bufferでプレート を 2回洗浄後、 Label Working Reagent (Quant iGene High Volume Kit, Bayer社 製） を 100 tl/well添加し、 46 で 2時間反応させた。 プレートを室温に戻し Wash Bufferでプレートを 2回洗浄後、 Substrate Working Reagent (Quant iGene High Volume Kit, Bayer社製） を 100M 1/wel 1添加し、 46 で 1時間反応させた。 プレ ートを室温に戻した後、 プレー卜リーダーで発光強度を測定した。 ラット CLCA1 の発現量に比例して発光強度が増加するので、 発光強度を測定することによりラ ット CLCA1の mRNAを定量することができる。 ワートマンニンを添加していないコ ントロール細胞では、 IL- 13によりラット CLCA1が発現誘導され発光強度が増加す る。  (QuantiGene High Volume Kit, Bayer) and reacted at 53 ° C for 16 to 24 hours. Wash the plate twice with Wash Buffer (QuantiGene High Volume Kit, Bayer), add 100x1 Amplifer Working Reagent (QuantiGene High Volume Kit, Bayer) and wash at 46 ° C. Allowed to react for hours. Further, the plate was washed twice with Wash Buffer, 100 tl / well of Label Working Reagent (QuantiGene High Volume Kit, manufactured by Bayer) was added, and the mixture was reacted at 46 for 2 hours. After returning the plate to room temperature, the plate was washed twice with Wash Buffer, and then Substrate Working Reagent (QuantiGene High Volume Kit, manufactured by Bayer) was added at 100 M 1 / wel 1 and reacted at 46 for 1 hour. After returning the plate to room temperature, the luminescence intensity was measured with a plate reader. Since the luminescence intensity increases in proportion to the expression level of rat CLCA1, the mRNA of rat CLCA1 can be quantified by measuring the luminescence intensity. In control cells to which no wortmannin is added, expression of rat CLCA1 is induced by IL-13, and luminescence intensity is increased.
結果を図 4に示す。  Fig. 4 shows the results.
これより、 ワートマンニンは濃度依存的にラット CLCA1の発現を抑制すること がわかる。  This indicates that wortmannin suppresses rat CLCA1 expression in a concentration-dependent manner.
よって、 上記スクリーニングを用いて、 CLCA1の発現を抑制する化合物を選択 することができる。 産業上の利用可能性 Therefore, a compound that suppresses CLCA1 expression was selected using the above-mentioned screening. can do. Industrial applicability
本発明の上皮気道細胞株は、 長期間、 安定に本発明で用いられるタンパク質を 高発現する。 従って、 本発明の上皮気道細胞株や、 上皮気道細胞株 Aおよびサイ トカインを用いることにより、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物また はその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩が、 効率よくスクリー ニングでき、 上記化合物またはその塩は、 例えば、 肺 ·気道の炎症を伴う肺-胸 部疾患や呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気腫） 、 び まん性汎細気管支炎、 気管支喘息、 嚢胞性線維症、 過敏性肺炎、 肺線維症など〕 、 炎症性腸疾患、 アレルギー性結膜炎、 鼻炎 （例、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 急 性鼻炎、 慢性鼻炎、 肥厚性鼻炎、 萎縮性鼻炎、 乾燥性前鼻炎、 血管運動性鼻炎、 壊疽性鼻炎、 副鼻腔炎など） などの予防 ·治療剤として有用である。  The epithelial airway cell line of the present invention stably expresses the protein used in the present invention for a long period of time. Therefore, by using the epithelial airway cell line of the present invention, the epithelial airway cell line A and the cytokine, the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention, and the gene expression of the protein of the present invention are inhibited. A compound or a salt thereof, a compound or a salt thereof that inhibits the production of the protein of the present invention, can be efficiently screened. Diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease (eg, chronic bronchitis, emphysema), diffuse panbronchiolitis, bronchial asthma, cystic fibrosis, irritable pneumonia, pulmonary fibrosis, etc.), inflammatory bowel disease, Allergic conjunctivitis, rhinitis (eg, allergic rhinitis, hay fever, acute rhinitis, chronic rhinitis, hypertrophic rhinitis, atrophic rhinitis, dry pronasitis, vasomotor rhinitis, gangrene It is useful as an agent for preventing and treating rhinitis, sinusitis, etc.

Claims

請求 の 範囲 The scope of the claims
1. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する気道上皮細胞 株。 1. An airway epithelial cell line that expresses a calcium-dependent chloride channel protein.
2. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配列 番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 5 0、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分べプチドまたはその塩である請求項 1記載の気道上皮細胞株。 2. Calcium-gated chloride channel proteins are: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 2. The respiratory epithelial cell line according to claim 1, which is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
3. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配列 番号： 22、 配列番号： 26、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 5 0、 配列番号： 51、 配列番号： 52または配列番号： 53で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項 1記載の気道上皮細胞株。 3. Calcium-dependent chloride channel proteins are: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 2. The airway epithelial cell line according to claim 1, which is a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
4. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配列 番号： 22または配列番号： 50で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質も しくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 1記載の気道上皮細胞株。 4. The calcium-dependent chloride channel protein according to claim 1, which is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50, or a partial peptide or a salt thereof. Respiratory epithelial cell line.
5. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を高発現する請求項 1記 載の気道上皮細胞株。 5. The airway epithelial cell line according to claim 1, which highly expresses a calcium-dependent chloride channel protein.
6. 粘液を分泌する能力を有する請求項 1記載の気道上皮細胞株。 6. The airway epithelial cell line according to claim 1, which has an ability to secrete mucus.
7. 粘液が MUC 2タンパク質および （または） MUC 5 ACタンパク質であ る請求項 6記載の気道上皮細胞株。  7. The airway epithelial cell line according to claim 6, wherein the mucus is a MUC2 protein and / or a MUC5AC protein.
8. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有する 気道上皮細胞株に、 サイト力インを接触させることを特徴とする、 請求項 1記載 の気道上皮細胞株の製造法。  8. The method for producing an airway epithelial cell line according to claim 1, wherein a cytodynamic cell line having an ability to express a calcium-dependent chloride channel protein is contacted with cytokin.
9. サイトカインが I L一 13である請求項 8記載の製造法。  9. The method according to claim 8, wherein the cytokine is IL-13.
10. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株が、 N IM— l (FERM BP— 8091) で標示される細 胞である請求項8記載の製造法。 10. The method according to claim 8 , wherein the airway epithelial cell line having the ability to express a calcium-dependent chloride channel protein is a cell represented by NIM-I (FERM BP-8091).
1 1 . N I M- 1 ( F E RM B P— 8 0 9 1 ) で標示される細胞。 1 1. Cells marked with NIM-1 (FERMBP-8091).
1 2 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、 カルシウム依 存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスク リーニング方法。  12. Screening of a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a calcium-dependent chloride channel protein, characterized by using an airway epithelial cell line and a cytokine capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein. Method.
1 3 . 請求項 1記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする、 カルシウム 依存性クロライドチャネルタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のス クリーニング方法。  13. A method for screening a compound that inhibits the activity of a calcium-dependent chloride channel protein or a salt thereof, comprising using the airway epithelial cell line according to claim 1.
1 4. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配 列番号： 2 2または配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩である請求項 1 2または請求項 1 3記載のスクリーニング方法。  1 4. A protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50, wherein the calcium-dependent chloride channel protein is 14. The screening method according to claim 12, which is a partial peptide or a salt thereof.
1 5 . カルシウム依存性クロライドチャネル夕ンパク質の活性が、 クロライド チャネル様活性または粘液分泌活性である請求項 1 2または請求項 1 3記載のス クリーニング方法。  15. The screening method according to claim 12 or claim 13, wherein the activity of the calcium-dependent chloride channel protein is a chloride channel-like activity or a mucus secretion activity.
1 6 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株およびサイトカインまたは請求項 1記載の気道上皮細胞株を含 有することを特徴とする、 カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質の活 性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。  16. An activity of a calcium-dependent chloride channel protein, comprising an airway epithelial cell line and a cytokine capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein or a respiratory epithelial cell line according to claim 1. A kit for screening for a compound or a salt thereof that inhibits sexuality.
1 7 . 請求項 1 2もしくは請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。 17. A compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to claim 12 or claim 13 or the screening kit according to claim 16.
1 8 . カルシウム依存性クロライドチャネルダンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株およびサイトカインを用いることを特徴とする、 カルシウム依 存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその 塩のスクリーニング方法。 18. A compound or a compound thereof that inhibits expression of a calcium-dependent chloride channel protein gene, characterized by using an airway epithelial cell line and a cytokine capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein. Salt screening method.
1 9 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配 列 号： 2 2または配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩である請求項 1 8記載のスクリーニング方法。 19. A calcium-dependent chloride channel protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50, or a protein thereof. 19. The screening method according to claim 18, which is a partial peptide or a salt thereof.
2 0 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株およびサイトカインを含有することを特徴とする、 カルシウム 依存性クロライドチャネルタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニング用キット。 20. A compound or a salt thereof that inhibits the expression of a calcium-dependent chloride channel protein gene, characterized by containing an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a cytokine. Screening kit.
2 1 . 請求項 1 8記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。  21. A compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to claim 18 or the screening kit according to claim 20.
2 2 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す ' る気道上皮細胞株およびサイト力インを用いることを特徴とする、 カルシウム依 存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスク リーニング方法。  2 2. A compound or salt thereof that inhibits the production of a calcium-dependent chloride channel protein, characterized by using an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein and a cytokinin. Screening method.
2 3 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質が、 配列番号： 1、 配 列番号： 2 2または配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩である請求項 2 2記載のスグリーニング方法。  23. A protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 50, or a calcium-dependent chloride channel protein, The screening method according to claim 22, which is a partial peptide or a salt thereof.
2 4. カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株およびサイト力インを含有することを特徴とする、 カルシウム 依存性クロライドチャネルタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のス クリーニング用キッ卜。  2 4. An airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein, and a compound or a salt thereof that inhibits the production of a calcium-dependent chloride channel protein, which comprises a cytokinin. Screening kit.
2 5 . 請求項 2 2記載のスクリーニング方法または請求項 2 4記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。  25. A compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to claim 22 or the screening kit according to claim 24.
2 6 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株が、 N I M— 1 ( F E RM B P— 8 0 9 1 ) で標示される細 胞である請求項 1 2、 請求項 1 8または請求項 2 2記載のスクリーニング方法。  26. The airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein is a cell indicated by NIM-1 (FERM BP-8091). The screening method according to claim 18 or claim 22.
2 7 . 請求項 1 7、 請求項 2 1または請求項 2 5記載の化合物またはその塩を 含有してなる医薬。  27. A medicament comprising the compound according to claim 17, 21 or 25 or a salt thereof.
2 8 . 呼吸器疾患の予防 ·治療剤である請求項 2 7記載の医薬。  28. The medicament according to claim 27, which is an agent for preventing or treating respiratory diseases.
2 9 . 呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患または気管支喘息である請求項 2 8記載 の医薬。  29. The medicament according to claim 28, wherein the respiratory disease is chronic obstructive pulmonary disease or bronchial asthma.
3 0 . 鼻炎の予防 ·治療剤である請求項 2 7記載の医薬。 30. The medicament according to claim 27, which is a prophylactic / therapeutic agent for rhinitis.
3 1 . カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質を発現する能力を有す る気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予防 ·治療 剤のスクリーニング方法。 31. A method for screening a preventive or therapeutic agent for respiratory disease or rhinitis, which comprises using an airway epithelial cell line capable of expressing a calcium-dependent chloride channel protein.
3 2 . 請求項 1記載の気道上皮細胞株を用いることを特徴とする呼吸器疾患ま たは鼻炎の予防 ·治療剤のスクリーニング方法。  32. A method for screening an agent for preventing or treating respiratory disease or rhinitis, which comprises using the airway epithelial cell line according to claim 1.
3 3 . 請求項 1 1記載の細胞および I L一 1 3を用いることを特徴とする呼吸 器疾患または鼻炎の予防 ·治療剤のスクリ一ニング方法。  33. A method for screening a preventive / therapeutic agent for respiratory disease or rhinitis, comprising using the cell according to claim 11 and IL-11.
3 4. 哺乳動物に対し、 請求項 1 7、 請求項 2 1または請求項 2 5記載の化合 物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする呼吸器疾患または鼻炎の予 防 ·治療方法。  3 4. Prevention and treatment of respiratory disease or rhinitis, characterized by administering to a mammal an effective amount of the compound of claim 17, claim 21 or claim 25 or a salt thereof. Method.
3 5 . 呼吸器疾患または鼻炎の予防 ·治療剤の製造のための、 請求項 1 7、 請 求項 2 1または請求項 2 5記載の化合物またはその塩の使用。  35. Use of the compound according to claim 17, claim 21, or claim 25 or a salt thereof for the manufacture of a prophylactic or therapeutic agent for respiratory disease or rhinitis.
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