WO2003101188A1 - Modele animal a pathologie liee a un stress chronique et son procede de construction - Google Patents
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Classifications
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Definitions
- Patent application title Chronic stress disease model animal and method for producing the same
- the present invention provides a model animal for chronic stress disease obtained as a result of ingesting an animal with a lysine-deficient diet, a method for producing the model animal, a method for determining the effect of a drug on chronic stress disease using the model animal, Or screening method for developing a medicament for preventing and treating or treating chronic stress disease
- Drugs for treating stress-related diseases include anxiolytics (benzodiazepine derivatives, etc.), antidepressants (monoamine uptake inhibitors, tricyclics, etc.) for the purpose of alleviating psychological stressors, and digestion.
- anxiolytics benzodiazepine derivatives, etc.
- antidepressants monoamine uptake inhibitors, tricyclics, etc.
- Many drugs have been developed for vascular peristalsis and visceral pain.
- Lysine is one of the essential amino acids, and its deficiency and low 1 / have been reported to cause mental and physical disability (DA Levitsky and BJ St rupp, J. Nutr. 125 , 2212S-2220S, 1995, DA Levitsky and RH Barnes, Nature 225, 468-469, 1970, HP Chase et al., Nature 221, 554-555, 1969, PH Abelson, Science 164, 17, 1969).
- lysine itself enhances the effect of the anxiolytic diazepam in a convulsion model (Yung-Feng and G. Xue-Min, Neurochem. Res. 20, 931-937, 1995). Protection (G. Hong-Ping and K.
- the present invention aims to determine the therapeutic effect of a drug on chronic stress disease, or to develop a medicament for preventing and / or treating chronic stress disease.
- the purpose of this study is to provide a model animal that is necessary for screening drugs.
- Another object of the present invention is to provide a method for determining the effect of a drug on a chronic stress disease using the above model animal.
- Another object of the present invention is to provide a method for screening a compound effective for the prevention and / or treatment of a chronic stress disease using the above model animal.
- An object of the present invention is to provide a compound effective for preventing and / or treating a chronic stress disease obtained by using the compound.
- the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that deficiency of dietary lysine expresses a pathological condition similar to chronic stress-related disease, and completed the present invention. did.
- the present invention provides a chronic stress disorder disease model animal prepared by feeding an animal with a lysine-deficient diet.
- the present invention also provides a method for producing a chronic stress disease model animal, which comprises feeding the animal a lysine-deficient diet.
- the present invention also provides a method for judging the effect of a drug, comprising judging the effect of the drug on a chronic stress disease using the above model animal.
- the present invention also provides a method for screening a compound that is effective in preventing and / or treating chronic stress disease, characterized by using the above model animal.
- the present invention also provides a compound obtained by using the above screening method, which is effective for the prevention and / or treatment of a chronic stress disease.
- Figure 1 shows the blood corticosterone level, adrenal weight / body weight ratio of lysine-deficient rats, 6 is a graph showing measured ACTH levels in blood.
- Figure 2 is a graph showing the effect of dilatation in the colon on visceral perception threshold in lysine-deficient rats.
- - Figure 3 is a graph evaluating the effect of drugs used to treat irritable bowel syndrome on dysfunction in lysine-deficient rats.
- any animal may be used as long as it is subjected to dietary stress, and mammals such as mice, rats, gerbils, guinea pigs, egrets, bushes, cats, dogs, monkeys, etc. , And more preferably rodents, and more preferably, male Wistar rats of about 7 weeks of age.
- the chronic stress disease according to the present invention is a general term for diseases that develop due to chronic stress, and includes functional gastrointestinal diseases and diseases accompanied by similar conditions (anxiety disorder (panic disorder)).
- disorders and generalized anxiety disorders include somatoform disorders, dissociative disorders, neuropathy such as mood disorders, bulimia, anorexia nervosa, sleep disorders, glucoseuria gastroenteropathy, etc.
- neuropathy such as mood disorders, bulimia, anorexia nervosa, sleep disorders, glucoseuria gastroenteropathy, etc.
- gastrointestinal symptoms and functional gastrointestinal diseases are particularly preferred.
- Functional gastrointestinal disorders include, for example, irritable bowel syndrome, rumination syndrome, bulbar syndrome, functional heartburn, functional esophageal chest pain, functional gastrointestinal disorders, functional dysphagia, functional vomiting, and swallowing , Apnea, functional constipation, functional abdominal distension, functional abdominal pain syndrome, functional diarrhea, sphincter dysfunction, gallbladder dysfunction, levator ani muscle syndrome, functional fecal incontinence, pelvic floor coordination disorder, dissipative Anal pain, pediatric gastrointestinal dysfunction (pediatric reflux disease, childhood rumination syndrome, periodic vomiting syndrome, functional gastrointestinal disorders, irritable bowel syndrome, functional abdominal pain, paroxysmal abdominal pain, air swallowing, functional diarrhea, pediatric Dysfunction, functional constipation, functional stool storage, functional non-reserving stool incontinence, etc.) Among them, irritable bowel syndrome is particularly preferred.
- the model animal of the present invention is a chronic stress disease animal model animal.
- a chronic stress disease animal model animal As described in the literature of PBChappell et al. (J. Neuroscience, 6 (10): 2908-2914, 1986), an increase in blood ACTH and corticosterone levels was observed in an acute stress animal model. However, adrenal hypertrophy is not observed.
- the chronic stress model shows an increase in blood corticosterone level and adrenal hypertrophy, but no increase in blood ACTH level.
- a diet having a lysine content lower than that of a normal diet is 13.4 g / kg diet.
- the lysine-deficient diet used in the present invention preferably has a lysine content of 1 g / kg diet or less, more preferably 0.3 g / kg diet or less.
- a low lysine diet prepared by using wheat gluten having a low lysine content as a main raw material This includes 1/4 of the ideal demand for lysine, which can maintain weight gain in rats. In other words, it is preferable to feed less than 1/4 of the ideal demand.
- the model animal of the present invention has a pathological condition of chronic stress disease, particularly a pathological condition of functional gastrointestinal tract disease.
- the pathological condition include gastrointestinal organ unchanged, visceral hypersensitivity (JE Richter et al. Dig. Dis. Sci., 31: 131-138, 1986, WE Whitehead et al. Gastroenterology, 98: 1187-1192, 1990), gastrointestinal motility abnormalities (JE Kello et al. Gastroenterology, 98: 1208-1218, 1990), etc. It is preferable to have one, two or all of these, but it is not particularly limited to these.
- the lysine-deficient diet used is the lysine-deficient diet described above, and the period of ingestion of the lysine-deficient diet is not particularly limited, but it is preferable that the diet be continuously ingested. Ingest for 3 consecutive days Is more preferable, and it is still more preferable to make the ingestion continuously for 3 to 10 days.
- the evaluation method is based on the pathological condition of the model animal of the present invention as an index.
- the effect of the drug can be assessed, for example, for visceral hyperalgesia or gastrointestinal motility abnormalities.
- various methods used for measuring pain response using a balloon in animals can be used.
- there is a threshold measurement method using visual abdominal muscle contraction as an index but the method is not necessarily limited to this.
- a method for evaluating gastrointestinal motility abnormality a method for evaluating a defecation increase reaction is preferable, and various methods used for measuring intestinal transit ability in animals can be used. For example, there is a method using a carmine dye, but the method is not necessarily limited to ⁇ .
- the model animals used in these evaluation methods may be prepared by the above-described preparation method, and preferably, fasted on the day before the evaluation.
- model animals of the present invention to measure the effects of compounds on chronic stress diseases, particularly functional gastrointestinal diseases, and to prevent and / or treat or treat chronic stress diseases, particularly functional gastrointestinal diseases, Can be screened.
- screening is performed by determining the effect of the compound on visceral hypersensitivity and / or gastrointestinal motility abnormality in the model animal of the present invention.
- Compounds that reduce visceral hyperalgesia and gastrointestinal motility abnormalities in screening may be candidates for drugs for preventing and / or treating visceral hyperalgesia and gastrointestinal dysmotility associated with chronic stress diseases, particularly functional gastrointestinal diseases.
- a compound effective for the prevention and / or treatment of chronic stress-related diseases obtained by screening is used as a drug, it can be used as it is or as a drug known per se It is used as a pharmaceutical composition mixed with a chemically acceptable carrier, excipient and the like.
- the administration may be any of oral administration such as tablets, capsules, powders, granules and pills, and parenteral administration such as injections, syrups, ointments and suppositories. Dosage is
- the animal model for chronic stress disease of the present invention is an epoch-making model having a unique characteristic that expresses the same symptoms as chronic stress disease in humans. This is useful for determining the effect. Therefore, the present invention will dramatically advance the development of drugs for preventing and / or treating chronic stress diseases.
- Lysine content 0.3 g / kg diet or less 13.g / kg diet
- Rats 7 days after a low lysine diet tended to have increased levels of blood corticosterone, a commonly used indicator of stress exposure, compared to rats that continued to receive a normal diet. .
- rats aged 7 days on a low lysine diet had higher adrenal weight / weight compared to rats on a normal diet. The ratio increased.
- the blood ACTH level which is a regulator of corticosterone, was decreased compared to rats that continued to receive the normal diet.
- a rat fasted for one day was inserted non-invasively with a balloon catheter through the anus under mild ether anesthesia. Water was injected at a flow rate of 0.9 ml / min until the internal pressure of the Distension balloon reached 100 mmHg (cut off value), and the internal pressure of the Distension balloon at the time of visual abdominal muscle contraction was measured as the visceral perception threshold .
- the interval of stimulation into the abdominal cavity was set to 5 minutes, the visceral perception threshold was measured 5 to 8 times, and the value obtained by averaging three consecutively stable thresholds was measured as the visceral perception threshold.
- the statistical test used Student's t-te st.
- the results are shown in FIG.
- the visceral perception threshold of rats continuously fed a low lysine diet was 14.2 It was determined to be 3 ⁇ 2.17 mmHg, which was significantly lower than the visceral perception threshold (29.9 ⁇ 5.37 nnnHg) of rats continuously fed the Normal diet.
- Drugs and carmine pigment were orally administered to rats fasted for one day from the day before the start of the experiment (day 6 of the experimental diet), and the number of carmine pigment-containing feces was counted over time.
- the statistical test used Dunnett's test.
- Test drugs Diazepam (anxiolytic), Atropine (anticholinergic), Alosetron (serotonin 3 receptor antagonist: irritable bowel syndrome), Pinavepium (new evening Eve calcium antagonist: irritable bowel syndrome) ) And the results are shown in Fig. 3.
- Anxiolytics are prescribed for patients with irritable bowel syndrome because psychological stress worsens intestinal function.
- anticholinergic drugs suppress intestinal motility and secretion and have an antispasmodic action, so they are sometimes used for the treatment of irritable bowel syndrome.
- the animal model for a chronic stress disease of the present invention is an epoch-making model having characteristics unique to humans that exhibit the same symptoms as a chronic stress disease in humans.
- the operation of the present invention By using the product model, it is possible to efficiently determine the improvement effect of the drug on chronic stress disease. That is, according to the present invention, the development of a medicament for treating and / or preventing a chronic stress disease is dramatically advanced.
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Description
慢性ストレス性疾患モデル動物及びその作製方法 発明の背景
本発明は、 リジン欠乏食を動物に摂取させた結果得られる慢性ストレス性疾患 モデル動物、 該モデル動物の作製方法、 該モデル動物を用いて慢性ストレス性疾 患に対する薬物の効果を判定する方法、 または慢性ストレス性疾患を予防および Zまたは治療するための医薬品を開発することを目的とするスクリーニング方法
、 および該スクリーニングにより見出される化合物に関する。
近年、 生活の質の改善 （Quality of Life; Q0L) が医療現場で求められてきて いる。 過度な精神ストレスは、 個々人の病後、 日常生活の Q0Lのみならず、 社会 的生産性も低下させている。
ストレス性疾患を治療する医薬としては、 心理的ストレヅサ一の緩和を目的と した、 抗不安薬 （ベンゾジァゼピン誘導体など） 、 抗うつ薬 （モノアミン取り込 み阻害薬、 三環系薬剤など） や、 消化管蠕動運動異常、 内臓痛に対する薬剤の開 発が多くなされている。
これら Q0Lの改善を目的とした生活改善薬、 予防薬は近年待望され、 多くの企 業がその開発を試みているが、 安全かつ有効な治療薬の開発には至っていない。 これまで、 ストレス性疾患を模倣したモデル動物のうち、 機能性消化管疾患では Restraint Stressモデノレ (K. Miyata et al.， J. Pharmacol. Exp. Ther. 261, 2 97-303, 1992, G.J. Sanger et al.3 Br. J. Pharmacol. 130, 706-712,2000)、 Wrap Restraint Stressモデノレ (C.L. Williams et al. , Gastroenterology, 94, 611-621, 1988, C. Ito et al.， J. Pharmacol. Exp. Ther. 280， 67-72, 1997 )等が存在するが、 これらのモデルは急性のストレスを身体的に付カ卩することに
より発症させるため、 慢性的、 心因的であるはずのストレス性疾患に対する治療 薬を探索するモデルとしては満足なものではない。従って、 機能性消化管疾患の 一つである過敏性腸症候群を対象とした既存の治療薬 （Alosetron, Pinaverium など） は、 in vitro式験による評価が中心であり、 動物モデルでの試験報告が少 ないのが現状である。
一方、 リジンは必須アミノ酸の一つで、 その欠乏および低 1/、摂取が精神的およ び身体的障害を引き起こす可能性が報告されている（D.A. Levitsky and B.J. St rupp, J.Nutr. 125, 2212S-2220S, 1995, D.A. Levitsky and R.H. Barnes, Nat ure 225, 468-469, 1970, H.P. Chase et al.， Nature 221, 554-555, 1969， P. H. Abelson, Science 164, 17, 1969)。 また、 リジン自体がけいれんモデルにお いて抗不安薬であるジァゼパムの作用を増強すること（ Yung-Feng and G. Xue - Min, Neurochem. Res. 20, 931-937, 1995)、 虚血脳を保護すること（G. Hong- P ing and K. Bao-Shan, Life Sciences, 65, 19-25, 1999)、 更に、 脳に非常に高 い濃度で存在 (Q.R. Smith, J. Nutr. 130, 1016S-1022S, 2000)している。 これ らのことより、 リジン欠乏および低い摂取が精神的な負担、 即ち、 ストレス状態 を生じさせる可能性が考えられる。 また、 リジンを含む必須アミノ酸の欠乏によ る症状 （例えば、 体重減少など） はその欠乏の開始後数日で認められることより 、 その欠乏状態による症状の変化は急激に生じるものではない。 しかしながら、 このリジン欠乏によるストレス状態の時間的変ィ匕およびその成立後の内臓痛およ び消化管に対する作用を検討した報告がない。 またリジン欠乏食を摂取すること により、 慢性ストレス性疾患が発症することも知られていない。 発明の開示
本発明は、 慢性ストレス性疾患に対する薬物の治療効果を判定する目的、 また は慢性ストレス性疾患を予防および Zまたは治療するための医薬品を開発する目
的で薬剤のスクリ一ニングを行う際に必要なモデル動物を提供することを目的と する。
本発明は、 又、 上記モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患に対する薬物の効 果を判定する方法を提供することを目的とする。
本発明は、 又、 上記モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患の予防および/ま たは治療に有効な化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする 本発明は、 又、 上記スクリーニング方法を用いて得られた慢性ストレス性疾患 の予防および/または治療に有効な化合物を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行ってきた結果、 食餌中 のリジンを欠乏させることにより、 慢性ストレス性疾患と同様の病態が発現する ことを見出して本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 動物にリジン欠乏食を摂取させることにより作成した慢 性ストレス性疾患モデル動物を提供する。
本発明は、 又、 動物にリジン欠乏食を摂取させることを特徴とする慢性ストレ ス性疾患モデル動物の作製方法を提供する。
本発明は、 又、 上記モデル動物を用いて慢性ストレス性疾患に対する薬物の効 果を判定することを特徴とする薬物の効果判定方法を提供する。
本発明は、 又、 上記モデル動物を用いることを特徴とする慢性ストレス性疾患 の予防および/または治療に有効な化合物のスクリーニング方法を提供する。 本発明は、 又、 上記スクリーニング方法を用いて得られる、 慢性ストレス性疾 患の予防および/または治療に有効な化合物提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 リジン欠乏ラヅ トの血中コルチコステロン量、 副腎重量 /体重比、
及び血中 ACTH量を測定したグラフである。
図 2は、 リジン欠乏ラヅトにおいて、 結腸内バルーン拡張による内臓知覚閾値 への影響を測定したグラフである。 - 図 3は、 リジン欠乏ラヅトの便通異常に対する、 過敏性腸症候群治療に用いら れる薬物の作用を評価したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられる動物としては、 食餌によるストレスを受ける動物であれば いかなる動物でも良いが、 マウス、 ラヅト、 スナネズミ、 モルモット、 ゥサギ、 ブ夕、 ネコ、 ィヌ、 サルなどの哺乳動物 （ただしヒトを除く） が好ましく、 さら に好ましくはげつ歯類、 さらに好ましくは週令が約 7週の Wistar系雄性ラヅトが 用いられる。
本発明における慢性ストレス性疾患とは、 ストレスを慢性的に受けることによ つて発症する疾患の総称であり、 その中には機能性消化管疾患および類似の病態 を伴う疾患 （不安性障害 （パニック障害および全般性不安障害） 、 身体表現性障 害、 解離性障害、 気分障害などの神経症、 過食症、 神経性拒食症、 睡眠障害、 糖 尿病性胃腸症など） 、 腹部外科手術後の消化器症状などがあり、 特に機能性消化 管疾患が好ましい。機能性消化管疾患としては、 例えば、 過敏性腸症候群、 反芻 症候群、 球症候群、 機能性胸焼症、 食道起因性胸痛症、 機能性胃腸障害、 機能性 嚥下困難症、 機能性嘔吐、 嚥下症、 呑気症、 機能性便秘、 機能性腹部膨満、 機能 性腹痛症候群、 機能性下痢、 ォッジ括約筋機能異常、 胆嚢機能異常症、 肛門挙筋 症候群、 機能性便失禁、 骨盤底協調運動障害、 消散性肛門痛、 小児消化管機能障 害 (小児逆流症、 小児反芻症候群、 周期性嘔吐症候群、 機能性胃腸障害、 過敏性 腸症候群、 機能性腹痛、 発作性腹痛、 空気嚥下症、 機能性下痢、 小児排便困難症 、 機能性便秘、 機能性便貯留、 機能性非貯留型便失禁など） などが知られており
、 それらのうちで特に過敏性腸症候群が好ましい。
本発明のモデル動物が、 慢性ストレス性疾患モデル動物であることを確認する ことに、 特に困難はない。 例えば P.B.Chappellらの文献 （J. Neuroscience, 6 ( 10) : 2908-2914, 1986) 中に記載されているように、 急性ストレス動物モデルで は血中 ACTH量、 コルチコステロン量の増加が認められるが、 副腎肥大は認められ ない。 一方で、 慢性ストレスモデルでは血中コルチコステロン量の増加および副 腎肥大が認められるが、 血中 ACTH量の増加は認められないということを確認すれ ばよい。
本発明に用いられるリジン欠乏食としては、 通常の食餌におけるリジン含量よ りも少ないリジン含量である食餌、 具体的には、 通常食のリジン含有量が 13.4g/ kg dietである。 これに対して、 本発明で用いるリジン欠乏食としては、 リジン 含有量が 1 g /kg diet以下であるのが好ましく、 0.3g/kg diet以下であるのがよ り好ましい。 リジン含有量の少ない小麦グルテンを主原料とすることで調整した 低リジン食を使用することが好ましい。 これはリジンの理想要求量の 1/4を含み 、 なおラヅトの体重増加を維持できるものである。 つまり、 理想要求量の 1 / 4 以下の量の餌を与えるのが好ましい。
本発明のモデル動物は、 慢性ストレス性疾患の病態、 特に機能性消化管疾患の 病態を有するが、 その病態としては、 例えば消化管器質的無変化、 内臓痛過敏 ( J.E. Richter et al. Dig. Dis. Sci. , 31 : 131-138， 1986、 W.E. Whitehead et al. Gastroenterology, 98: 1187-1192, 1990) 、 消化管運動異常 (J.E. Kello et al . Gastroenterology, 98: 1208-1218， 1990) などがあり、 これらの 1つ 、 2つ又は全部を有するのがよいが、 特にこれらに限定されるものではない。 本発明の慢性ストレス性疾患モデル動物の作製において、 用いるリジン欠乏食 は上記記載のリジン欠乏食であり、 リジン欠乏食を摂取させる期間は、 特に制限 は無いが、 連続摂取させることが好ましく、 少なくとも 3日間連続摂取させるこ
とがより好ましく、 3〜1 0日間連続摂取させることが更に好ましい。
本発明のモデル動物を用いて、 慢性ストレス性疾患、 特に機能性消化管疾患に 対する薬物の効果を判定する際には、 その評価方法は、 本発明のモデル動物が有 する病態を指標にすれば良く、 例えば内臓痛過敏または消化管運動異常に関して 薬物の効果を評価すればよい。
内臓痛過敏の評価方法としては、 動物におけるバルーンを用いた痛み反応の測 定に用いられる種々の方法が利用できる。例えば、 目視による腹筋収縮を指標と した閾値測定法があるが、 必ずしもこれに限定されるものではない。
消化管運動異常の評価方法としては、 排便増加反応を評価する方法が好ましく 、 動物における腸管輸送能の測定に用いられる種々の方法が利用できる。 例えば 、 カルミン色素を用いる方法があるが、 必ずしもこれに限定されるものではない ο
これらの評価方法において用いられるモデル動物は、 上記作製方法で作製され れば良いが、 好ましくは評価前日は絶食処理されることが好ましい。
また、 本発明に示すモデル動物を用いて慢性ストレス性疾患、 特に機能性消化 管疾患に対する化合物の効果の測定および慢性ストレス性疾患、 特に機能性消化 管疾患を予防および Zまたは治療するための医薬品のスクリーニングを行いうる 。 具体的には、 化合物を経口、 皮下、 静脈内、 局所などに投与した後、 本発明の モデル動物において内臓痛過敏および/または消化管運動異常に対する化合物の 影響を判定することでスクリーニングを実施しうる。 スクリーニングにおいて内 臓痛過敏および消化管運動異常を軽減した化合物は慢性ストレス性疾患、 特に機 能性消化管疾患に伴う内臓痛過敏および消化管運動異常の予防および/または治 療薬の候補となりうる。
スクリーニングにより得られた慢性ストレス性疾患の予防および Zまたは治療 に有効な化合物を薬剤として使用する場合、 そのままもしくはそれ自体公知の薬
学的に許容されうる担体、 賦形剤などと混合した医薬組成物として使用に供され る。 投与は、 錠剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒剤、 丸剤などの経口投与、 注射剤、 シロップ剤、 軟膏剤、 坐剤などの非経口投与のいずれであっても良い。投与量は
、 投与対象、 投与ルート、 症状などによって異なるが、 1日 0 . 0 0 1 m g〜5 g程度、 好ましくは 0 . 0 l mg〜2 g程度であり、 これを 1日 1〜数回に分け て投与することができる。
本発明の慢性ストレス性疾患モデル動物は、 ヒトにおける慢性ストレス性疾患 と同様の症状を発現する他にはない特徴を持つ画期的なモデルであり、 ヒトにお ける慢性ストレス性疾患に対する薬物の効果の判定に有用である。 従って、 本発 明により、 慢性ストレス性疾患の予防および/または治療のための医薬品の開発 が飛躍的に進歩する。
以下、 実施例によって本発明を詳細に説明する。
実施例 1
低リジン食、 リジン含有食の調製
低リジン食及びリジン含有食として、 表 1の組成のものを調製し、 以下の実施 例で使用した。
低リジン食 （組成比％) リジン含有食 （繊比 %)
Corn starch 20. 16 19. 89
Gulten Mix 28. 07 28. 07
Pre Mix45 45 45
Vitamin E 0. 01 0. 01
Corn Oil 5 5
し - lysine 0 1. 35
L-glutamine 1. 76 0. 68
Total 100 100
リジン含量 0. 3 g /kg diet以下 13. g /kg diet
実施例 2
リジン欠乏ラットにおけるストレス指標の測定
ラヅ ト （日本チャールズリバ一、 Wistar系雄性、 5 W) に、 低リジン食 （n=18 ) 又はリジン含有食 （Normal食； n=18) を与え、 7日経過した後、 採血を行い、 遠心分離 (3000 rpm、 15 min)で血清および血漿を得た。 血漿中の ACTH量は MA固 相法にて、 血清中のコルチコステロン量は RIA硫安塩析法にて測定した。 同時に 、 ラットの副腎を摘出し、 副腎重量 I体重比を測定した。 統計検定は、 Student ，s t - testを用いた。
結果を図 1に示した。低リジン食を与えて 7日経過したラットは、 Normal食を与 え続けたラットと比べて、 ストレス暴露に由来する指標としてよく用いられてい る血中コルチコステロン量が増加する傾向を示した。 同様に、 低リジン食を与え て 7日経過したラヅトは、 Normal食を与え続けたラットと比べて副腎重量 /体重
比が増加した。 一方、 コルチコステロンの調節因子である血中 ACTH量は、 Normal 食を与え続けたラットと比べて減少していた。
実施例 3
リジン欠乏ラッ卜における消化管部位の器質的変化の有無
ラヅト （日本チャールズリバ一、 Wistar系雄性、 5 W) に、 低リジン食 （n=3〜 4) 又はリジン含有食 （Normal食； IF3〜4) を与えた。 実験食を与えて 9日経過し たラツトを軽度のエーテル麻酔下にて、 胃、 回腸、 および結腸部位を摘出し、 実 体顕微鏡下にて粘膜の器質的変化の有無を観察するとともに、 即座に 4%ホルムァ ルデヒド I 10%メタノールにて固定した。 これらをパラフィン包埋し、 スライド グラス上に作製した切片を HE染色し、 顕微鏡下にて観察した。
低リジン食を与えて 9日経過したラットから摘出した胃、 回腸、 結腸標本の肉 眼所見、 HE染色組織所見において、 Normal食を与え続けたラットと同様に異変は 認められず、 炎症性細胞の浸潤および粘膜の損傷も観察されなかった。
実施例 4
リジン欠乏ラヅ卜における絶食ストレス負荷後の内臓知覚過敏状態の形成 ラヅト （日本チャールズリバ一、 Wistar系雄性、 5 W) に、 低リジン食 （n=10 ) 又はリジン含有食 （Normal食； IF8) を与え、 7日以上経過したラヅトを用い た。 一日絶食させたラヅトを軽度のェ一テル麻酔下に、 肛門から非侵襲的にバル —ンカテーテルを挿入した。 Distensionバル一ンの内圧が 100 mmHg (cut off値 ) に達するまで、 水を流速 0.9 ml/minで注入し、 目視による腹筋収縮が認められ た時点の Distensionバルーンの内圧を内臓知覚閾値として測定した。腹腔内への 刺激の間隔は 5分とし、 内臓知覚閾値を 5〜8回測定し、 連続して安定した 3回分の 閾値を平均した値を内臓知覚閾値として測定した。統計検定は、 Student' s t-te stを用いた。
結果を図 2に示した。低リジン食を与え続けたラヅトの内臓知覚閾値は、 14.2
3±2.17 mmHgと求められ、 Normal食を与え続けたラヅトの内臓知覚閾値 （29.9 ±5.37 nnnHg) と比べて有意に低下することが確認された。
実施例 5
リジン欠乏ラットにおける便通異常に対する薬物の効果の検討
ラヅト （日本チャールズリバ一、 Wistar系雄性、 5W) に、 低リジン食 （n=10 )又はリジン含有食 （Normal食； IFIO) を与え、 7日経過したラットを用いた。 実験開始前日 （実験食開始 6日目） から一日絶食させたラットに薬物およびカル ミン色素を経口投与し、 カルミン色素含有糞個数を経時的に累積測定した。 統計 検定は、 Dunnettの検定を用いた。
被験薬物として Diazepam (抗不安薬） 、 Atropine (抗コリン薬） 、 Alosetron (セロトニン 3受容体拮抗薬：過敏性腸症候群治療薬） 、 Pinavepium (新しい夕 イブのカルシウム拮抗薬：過敏性腸症候群治療薬） を用い、 その結果をそれぞれ 図 3に示した。 抗不安薬は、 心理的ストレスが腸機能を悪化させることから、 過 敏性腸症候群患者に処方される。 また、 抗コリン薬は、 腸管運動と分泌を抑制し 、 鎮けい作用を有することから過敏性腸症候群治療に使用されることがある。 本 モデルでも、 臨床で過敏性腸症候群治療に用いられている、 機序の異なる 4薬物 の全てにおいて、 低リジン食を与えて 7日経過した活動期ラットの粪排泄の促進 を有意に抑制して、 Normal食を与え続けたラットの糞排泄状態に回復させた。 従って、 これらの薬物に対する本モデルでの結果とヒトにおける過敏性腸症候 群に伴う消化管運動異常に対する薬物の作用が類似しており、 本モデルがヒ卜に おける過敏性腸症候群を含む機能性消化管疾患に伴う消化管運動異常のモデルお よびその病態に対する薬物の効果を判定.するモデルとして有用であることが判つ た。
本発明の慢性ストレス性疾患の動物モデルはヒ卜における慢性ストレス疾患と 同様の症状を発現する他にはない特徴をもつ画期的なモデルである。 本発明の動
物モデルを用いることにより、 慢性ストレス性疾患に対する薬剤の改善効果を効 率良く判定することが可能になる。 すなわち、 本発明により、 慢性ストレス性疾 患の治療および Zまたは予防のための医薬品の開発が飛躍的に進歩する。
Claims
1. 動物にリジン欠乏食を摂取させることにより作成した慢性ストレス性疾患モ デル動物。
2. 動物がげつ歯類である請求項 1記載のモデル動物。
3. げっ歯類がラットである請求項 2記載のモデル動物。
4. 慢性ストレス性疾患が機能性消化管疾患である請求項 1〜 3のいずれか 1項 記載のモデル動物。
5. 消化管器質的無変化、 内臓痛過敏及び消化管運動異常からなる群から選ばれ る少なくとも 1つを有する請求項 1〜4のいずれか 1項記載のモデル動物。
6. 動物にリジン欠乏食を摂取させることを特徴とする慢性ストレス性疾患モデ ル動物の作製方法。
7. リジン欠乏食がリジン含有量 1 g/kg diet以下のものである請求項 6記載の 作製方法。
8. リジン欠乏食がリジン含有量 0.3g/kg diet以下のものである請求項 6記載の 作製方法。
9. 動物のリジン要求量の 1 / 4以下の量でリジン欠乏食を摂取させる請求項 6 記載の作製方法。
10. リジン欠乏食がグルテンを主原料とするものである請求項 8記載の作製方 法。
11. リジン欠乏食を少なくとも 3日間連続摂取させる請求項 6〜1 0のいずれ か 1項記載の作製方法。
12. リジン欠乏食を 3〜 1 0日間連続摂取させる請求項 1 1記載の作製方法。
13. 請求項 1〜 5のいずれか 1項記載のモデル動物を用いて慢性ストレス性疾 患に対する薬物の効果を判定することを特徴とする薬物の効果判定方法。
14. 請求項 1〜 5のいずれか 1項記載のモデル動物を用いることを特徴とする 慢性ストレス性疾患の予防および/または治療に有効な化合物のスクリーニング 方法。
15. 請求項 1 4記載の方法を用いて得られる、 慢性ストレス性疾患の予防およ び/または治療に有効な化合物。
3
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