WO2003091304A2 - Supports solides fonctionnalises par des dendrimeres phosphores, leur procede de preparation et applications - Google Patents

Supports solides fonctionnalises par des dendrimeres phosphores, leur procede de preparation et applications Download PDF

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Julien Leclaire
Geneviève PRATVIEL
Anne-Marie Caminade
Jean Francois
Jean-Pierre Majoral
Bernard Meunier
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Centre National De La Recherche Scientifique
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Definitions

  • the present invention relates to solid supports functionalized by phosphorous dendrimers, to their preparation process, to their use for the preparation of biochips and to the applications of these biochips, in particular for the immobilization of macromolecules, in particular of biological macromolecules such as nucleic acids, lipids, proteins (peptides, enzymes, antibodies, ...) or their molecular partners.
  • the attachment of the probes to the surface of a solid support must guarantee the integrity of the sequence and the stability of the deposit.
  • the results must be reproducible from one support to another.
  • the probes must be spaced from the surface of the solid support in order not to disturb the hybridization with the target nucleic acids. This makes it possible to approach hybridization conditions in solution by mimicking 3-dimensional hybridization rather than 2-dimensional conventionally obtained by the glass slide technique. A spacer of at least forty atoms (4-5 nm) is necessary to avoid steric constraints between the DNA and the surface of the support.
  • Biochips and in particular nucleic acid biochips, can be manufactured either by in situ synthesis or by immobilization of probes.
  • the probes are oligonucleotides which are synthesized step by step directly on the support and which have a size generally between 20 and 30 bases. This manufacturing process provides access to high density chips (McGall et al, J. Am. Chem. Soc,
  • the probes are presynthesized and then immobilized on the support. Two types of interactions with the surface can then come into play.
  • the probe nucleic acid can be maintained on the surface by electrostatic interactions between the negatively charged backbone phosphate groups and the modified surface of the positively charged support.
  • this type of biochip can be obtained by covering the surface with poly-L-lysine or by silanization with an amino-silane (Zammatteo et al, Anal. Biochem., 2000, 280, 143- 150; Eisen et al, Methods in Enzymol, 1999, 303, 179-205).
  • this type of immobilization the probe is generally lying on the support, which can cause accessibility problems during the hybridization step.
  • this mode of ionic interactions is not sufficiently stable to allow reuse of the biochip.
  • the probe nucleic acid can also be grafted onto the support by means of covalent interactions. Generally the connections between the probes and the support are established by one of the 3 'or 5' ends of the nucleic acid allowing accessibility of the probe over its entire length, hence a better quality of the response in terms of hybridization. Several combinations of functionalization of the support and of the nucleic acids can be encountered.
  • the support can, for example, comprise nucleophilic functions such as -NH 2 or -SH functions and the nucleic acid to be grafted then comprises an electrophilic function such as for example a -CHO, -NCS, -NHS or even - COOR, and vice versa.
  • the support and the nucleic acid can be nucleophilic and a di-electrophilic spacer will allow coupling between the two entities.
  • the support and the probe can be electrophilic and the coupling will be carried out using a di-nucleophilic spacer.
  • biochips currently produced are, for the most part, produced using glass as a support.
  • the present invention therefore has as its first object a solid support characterized in that it comprises at least one surface covalently functionalized by phosphorous dendrimers having a central core which contains at least two functional groups and comprising at their periphery several capable functions to allow the fixing of said dendrimers on said surface as well as the fixing or the in situ synthesis of molecules of interest, said dendrimers having a size between 1 and 20 nra.
  • Dendrimers are polymers, isomolecular with a branched and defined structure, formed of a central nucleus (heart) from which ramifications are created or grafted. These ramifications are multifunctional, that is to say that they carry, in particular at the periphery, several functional chemical groups, identical or different, chosen according to the properties which it is desired to confer on the dendrimer. Each new generation is obtained by introducing a new level of ramifications. The set of branch junctions located at an equal distance from the heart corresponds to one generation. A schematic representation of a generation 4 dendrimer, obtained from a trifunctional core, is given in Figure 1 attached.
  • dendrimers which can be used according to the invention, preference is given to those which consist of: - a central layer in the form of a central core P 0 , possibly phosphorous, comprising from 2 to 12 functionalized groups,
  • each of said intermediate layers consisting of Pi units corresponding to the following formula (I):
  • L is an oxygen, phosphorus, sulfur or nitrogen atom
  • M represents one of the following groups: “an aromatic group di-, tri- or tetrasubstituted by alkyl groups, alkoxy groups, unsaturated groups of the C 1 -C 12 olefinic, azo, acetylenic type, all of these groups may or may not incorporate phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms, or "an alkyl or alkoxy group comprising several substituents as defined when M is an aromatic group
  • Ri and R 2 which may be the same or different, represent a hydrogen atom or one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, with or without phosphorus atoms , oxygen, sulfur, nitrogen or halogens with R 2 being most often different from Ri, n is an integer between 1 and 11,
  • E is an oxygen, sulfur or nitrogen atom, said nitrogen atom being able to be linked to an alkyl, alkoxy or aryl group, all these groups being able to incorporate or not atoms of phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogens,
  • W represents one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, all these groups whether or not containing phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms,
  • X represents an aldehyde, thiol, amino, epoxide, carboxylic acid, alcohol, phenol group, and more generally any group comprising or not phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur, carbon or carbon atoms. halogen.
  • the central nucleus P 0 of these dendrimers is selected from the group consisting of the group of general formula Illa:
  • R 5 represents a sulfur, oxygen or nitrogen atom.
  • the dendrimers are chosen from the compounds in which the group of formula (I) above represents the following group:
  • R 2 represents a C 12 alkyl radical and more particularly a methyl radical
  • group of formula (II) represents one of the following two groups:
  • FIGS. 2 and 3 respectively represent the structure of a generation 4 dendrimer with aldehyde endings and the structure of a generation 3 dendrimer with thiol endings.
  • solid supports which can be functionalized in accordance with the invention, mention may in particular be made of supports comprising at least one silicon surface such as glass blades, beads and capillaries, silicon, plastic supports and metal supports such as for example gold studs.
  • the dendrimers used in accordance with the invention can be synthesized in a manner known to those skilled in the art, by repeating the same reaction sequence allowing a new generation to be obtained at the end of each synthesis cycle and therefore d 'an increasing number of branches and peripheral functions all identical (Tomalia DA, Ang. Chem. Int. Ed., 1990, 29, 138; Launay et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1994, 33, 1589 and J. Organomet. Chem., 1997, 529, 51).
  • these dendrimers can be constructed step by step from a central core having at least two functional groups such as for example hexachlorocyclotriphosphazene: N 3 P 3 C1 6 , which has six functional groups.
  • these dendrimers are generally constructed by the repetition of two stages starting from the heart.
  • the first step is the substitution of the chlorine atoms in basic medium by a difunctional compound having an alcohol function and an aldehyde function, for example 4-hydroxybenzaldehyde.
  • the second step creates the branching points and consists of a condensation reaction with a compound having two types of functions: an NH 2 group and at least one PC1 2 group such as for example the compound H 2 NNMeP (S) Cl 2 .
  • the first two steps of the method of synthesis from the hexafunctional core are represented on the synthesis diagram A represented in FIG. 4 appended.
  • Table I below indicates the number of terminal functions present at the periphery of dendrimers of different generations obtained from the N 3 P 3 core as well as their size in Angstroms:
  • the present invention also relates to a process for preparing a solid support in accordance with the invention (dendrilame), characterized in that it comprises a step of forming a covalent bond between phosphorous dendrimers having a central nucleus which contains at least two functional groups, said dendrimers comprising at their periphery several functions capable of allowing their fixation on said surface and the fixation or in situ synthesis of molecules of interest, and the surface functionalized or not of a solid support to obtain a solid support functionalized covalently by said dendrimers.
  • the dendrimers comprise at their periphery functions allowing direct attachment thereof via a covalent bond of the latter on the surface not previously functionalized of said solid support. This is the case, in particular, when the dendrimers have thiol functions at their periphery and the solid support comprises a gold surface.
  • the method according to the invention is then characterized by the fact that it comprises the following steps: a) the functionalization of at least one surface of a solid support by functions capable of allowing the fixation of phosphorous dendrimers having a central nucleus which contains at least two functional groups, said dendrimers comprising at their periphery several functions capable of allowing their fixation on said surface thus functionalized and the fixation or in situ synthesis of molecules of interest; b) the possible preactivation of the support functions to obtain an activated functionalized surface, c) the formation of a covalent bond between said dendrimers and said functionalized and optionally activated surface, to obtain a solid support covalently functionalized by said dendrimers.
  • step a) of functionalization of the surface of the solid support is carried out by silanization using a silanization reagent comprising functions capable of fixing the dendrimers, such as for example amino groups.
  • the silanization step can be carried out using an amine silanization reagent such as for example 3-aminopropyltriethoxysilane (Sigma), aminopropyldiethoxymethylsilane or even aminopropylmonoethoxydimethylsilane.
  • an amine silanization reagent such as for example 3-aminopropyltriethoxysilane (Sigma), aminopropyldiethoxymethylsilane or even aminopropylmonoethoxydimethylsilane.
  • the step of direct covalent fixing of the dendrimers (case of the first variant) and step a) of silanization of the surface of the support (case of the second variant) are preceded by '' a step of cleaning the surface of the support in basic, acidic and / or oxidizing medium.
  • the optional pre-activation step b) is used to reactivate if necessary the amino functions fixed on the support at the end of the silanization step. Indeed, even short storage of amino solid supports can lead to protonation of the NH 2 groups. It is therefore often preferable to reactivate the amino functions in basic medium before reacting the dendrimers.
  • steps b) and c) are shown in Diagram C below: FIGURE C
  • this pre-activation step is carried out by treatment of the support using an alkalizing agent such as for example potassium hydroxide, for a period of between 2 and 20 minutes approximately .
  • an alkalizing agent such as for example potassium hydroxide
  • the step of covalent fixing of the dendrimers consists in:
  • a solvent such as, for example, dichloromethane or tetrahydrofuran
  • the supports in accordance with the invention are preferably rinsed and then dried.
  • the rinsing step is preferably carried out using an organic solvent such as dichloromethane or tetrahydrofuran and then using a lower alcohol such as ethanol.
  • the drying of the dendrilames can for example be carried out with compressed air, under a stream of nitrogen or alternatively by centrifugation.
  • the dendrilams thus obtained can then be stored and / or directly used for the immobilization and / or the in situ synthesis of molecules, in particular of biological molecules.
  • the dendrilams conforming to the invention can in particular be stored for at least two months, without any alteration of the functions located at the periphery of the dendrimers occurring.
  • the present invention therefore also relates to the use of a solid support functionalized with phosphorous dendrimers in accordance with the invention
  • nucleic acid molecules as a support for the immobilization and / or the in situ synthesis of molecules of interest such as for example nucleic acid molecules
  • the invention also relates to a biochip characterized in that it consists of a solid support comprising at least one surface functionalized by phosphorous dendrimers on which molecules of interest are covalently attached such as nucleic acids (oligonucleotides, PCR products ...), lipids, proteins (peptides, enzymes, antibodies, ...) or their molecular partners.
  • biochips are called “dendripuces”.
  • dendripuces have a very low background noise and a high signal intensity, for example after hybridization of nucleic acids with fluorescent targets.
  • These "dendripuces” have the advantage of being reusable without significant loss of signal but above all without increasing background noise. This results in a significant reduction in analysis costs and makes it possible to obtain reliable statistical data for a given analysis.
  • These dendripuces are more obtained in few synthesis steps (three to five); these take place under non-binding operating conditions, in a controlled and reproducible manner.
  • these dendripuces have the advantage of having multiple anchoring points on the surface on the one hand and on the molecules of interest on the other hand, the whole guaranteeing excellent stability of the whole support-dendrimers-molecules of interest.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of a dendripuce as defined above, characterized in that it consists in bringing into contact a solid support having at least one surface functionalized by phosphorous dendrimers comprising their periphery of functions capable of allowing the covalent attachment of molecules of interest with a buffer solution containing molecules of interest previously functionalized by, or already comprising, one or more groups capable of forming a covalent bond with said peripheral functions of dendrimers.
  • the molecules of interest are preferably previously functionalized with, or already contain, one or more amino functions, or are previously functionalized by one or more oxyamine (-ONH 2 ) or hydrazine (-NH-NH 2 ) functions, and more generally by any function capable of reacting with an aldehyde function.
  • the molecules of interest are deposited on the "dendrilames" using, for example, the 0.3 M phosphate buffer, pH 9.
  • this step is followed by a reduction in the imine functions present between the nucleic acids and the dendrimers on the one hand and between the dendrimers and the support on the other hand (see Diagram D below).
  • This reduction step also makes it possible to reduce the residual aldehyde functions into alcohol, making the surface hydrophilic.
  • alcohols cannot cause a non-specific reaction with the labeled targets (no increase in background noise). DIAGRAM D
  • the molecules of interest are preferably previously functionalized by, or already contain, one or more thiol functions (to allow creation of a disulfide bridge), or are previously functionalized by one or more iodoacetamido functions (-NHCO-CH 2 -I), and more generally, by any function capable of reacting with a thiol function.
  • This type of functionalization is particularly suitable for solid supports comprising a surface of the silicon or gold type. In the case of a disulfide bond established between the support and the nucleic probes, the surface can be regenerated by a reduction step. The thiol surface thus obtained can be again "recharged” with other oligonucleotide sequences or with proteins.
  • the molecules of interest are previously functionalized with, or already contain one or more aldehyde, ⁇ -oxoaldehyde, -COOR functions, -NCS, -NHS, and more generally, by any function capable of reacting with an amino function.
  • the molecules of interest are previously functionalized with, or already contain one or more amino functions, and more generally, by any function capable of reacting with an epoxy function.
  • the reaction for covalent attachment of the molecules of interest to the dendrilams is preferably carried out at a temperature of between 4 and 50 ° C. approximately, for a duration of between 2 and 24 hours approximately.
  • the dendripuces thus obtained can advantageously be used as a miniaturized diagnostic tool, depending on the nature of the molecules of interest fixed, as DNA chips for example for carrying out hybridization reactions with complementary targets, as peptides, polypeptides or proteins for example for the detection of antigen-antibody type responses by the use of labeled, fluorescent, radioactive or chemically labeled reagents.
  • the dendripuces in accordance with the present invention can also be used as polypeptide chips for the screening of molecules and for the analysis of the relationships between molecules, of ligand-receptor type.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to two examples of the preparation of glass dendrilams functionalized with dendrimers of different generations and with aldehyde ends, at a example of preparation of biochips from these dendrilams, to an example of immobilization of nucleic acid molecules on biochips in accordance with the invention, to an example of synthesis of a generation 3 dendrimer with thiol ends and to an example of preparation of dendrilames with generation 3 dendrimers with thiol ends, as well as in FIGS. 1 to 7 in which:
  • FIG. 1 shows a schematic view of a dendrimer of generation 4, obtained from a trifunctional core
  • FIG. 2 shows the formula of a generation 4 phosphorus dendrimer comprising terminal peripheral aldehyde functions
  • FIG. 3 shows the formula of a generation 3 phosphorus dendrimer with thiol terminal peripheral functions
  • FIG. 4 is a synthetic diagram A showing the first two steps of the process for preparing a dendrimer with phosphorus core
  • FIG. 5 represents the images of the fluorescence signals obtained after 10 cycles of hybridization / dehybridization on dendripuces in accordance with the invention
  • FIG. 6 shows the images of the fluorescence signals obtained after 10 cycles of hybridization / dehybridization on dendripuces according to the invention as a function of the concentration of target oligonucleotides
  • FIG. 7 represents the images of the fluorescence signals obtained during a study concerning the search for mutations on oligonucleotides.
  • EXAMPLE 1 PREPARATION OF A SOLID SUPPORT CONSISTING OF A BLADE OF GLASS FUNCTIONALIZED BY PHOSPHORIC DENDRIMERS WITH ALDEHYDE ENDS ("DENDRILAMES") 1) First step: Pre-activation of glass slides
  • dendrimers three different types were used: - G3 dendrimers: Third generation dendrimers comprising a phosphorus core of formula (IIIa) as described above and comprising at their periphery 48 aldehyde functions;
  • - G5 dendrimers Fifth generation dendrimers comprising a phosphorus core of formula (IIIa) as described above and comprising at their periphery 192 aldehyde functions;
  • the pre-activated slides are immersed in a solution of 0.1% G3, G4 or G5 dendrimers in dichloromethane. They are stirred for 6 hours at room temperature (30 rotations / min). They are then rinsed with dichloromethane (2 washes of 5 minutes each) then with ethanol (1 wash of 5 minutes) and are finally dried under a stream of nitrogen.
  • silanized slides are placed in an aqueous solution of potassium hydroxide (8%) for 5 minutes, with stirring at room temperature. They are then rinsed with milliQ water (3 washes of 5 minutes each) before being dried under a stream of nitrogen. 4) Fourth step: Functionalization with dendrimers
  • the pre-activated slides are placed in a solution of dendrimers
  • Oligonucleotide ON1 35 mer-amine having the following sequence SEQ ID No. 1: 5 ' -GTG-ATC-GTT-GTA-TCG-AGG-AAT-ACT-CCG-ATA-CCA-
  • This oligonucleotide which is modified at its 5 ′ end by an arm with
  • Oligonucleotide ON2 35 mer-oxyamine having the sequence SEQ ID No. 1 described above and modified in position 5 'with a - H 2 NO- (CH 2 ) 6 -.
  • the sequence SEQ ID No. 1 of the oligonucleotides ON1 and ON2 corresponds to a part of the GPH1 gene from the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • oligonucleotide deposits were carried out using the Eurogridder® robot (Eurogentec, Seraing, Belgium) and were spaced 200 ⁇ m apart. b) Deposits on dendrilames
  • the dendrilames DL-A-G3, DL-A-G4, DL-A-G5 and DL-B-G4 are used as prepared above in Examples 1 and 2.
  • the ONl oligonucleotides are deposited in a 0.3 M phosphate buffer (pH 9) containing increasing amounts of dimethyl sulfoxide (DMSO) (0; 10; 20; 30; 40 or 50%, v / v) using the Eurogridder® robot (Eurogentec, Belgium).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the volumes deposited are 2 ⁇ l and the concentrations vary from 1 ⁇ M to 10 ⁇ m (1; 2; 5 and 10 ⁇ M). After deposition, the slides are left overnight at room temperature.
  • the ONl oligonucleotides are deposited in the 0.3 M phosphate buffer (pH 9) using the deposition robot.
  • the volumes deposited are 2 ⁇ l and the concentration is 10 ⁇ M.
  • the slides are left overnight at room temperature. They are then immersed in an aqueous solution of sodium borohydride (NaBH 4 , 3.5 mg / ml) (step of reduction of imine functions) and are stirred for 3 hours at room temperature. They are rinsed with MilliQ water (3 washes of 5 minutes each) and are dried under a stream of nitrogen or by centrifugation. DP1-B-G4 dendripuces are obtained.
  • the ON2 oligonucleotides were also deposited on the dendrilams prepared in Example 2. To do this, the ON2 oligonucleotides are deposited in water
  • the volumes deposited are 0.2 ⁇ l and the concentrations vary from 1 ⁇ M to 10 ⁇ M (1 ⁇ M, 5 ⁇ M and 10 ⁇ M).
  • the ONl oligonucleotides were deposited in the 0.3 M phosphate buffer under the same conditions of volume and concentration.
  • the slides are left for 7 hours at room temperature. They are then immersed in an aqueous solution of sodium borohydride.de (NaBH 4 ,
  • dendripuces we thus obtain different kinds of biochips corresponding to dendrilames on which oligonucleotides have been fixed ("dendripuces"). These dendripuces can then be used in hybridization reactions.
  • Hybridizations are carried out by adding the necessary volume of labeled targets (from 2 ⁇ l to 40 ⁇ l depending on the surface to be covered) on the deposition area of each dendripuce.
  • Different concentrations of targets to be detected 200 nM, 100 nM, 20 nM, 10 nM, 2 nM and 1 nM were prepared and used during the hybridization stages in order to assess the detection sensitivity of dendripuces conforming to the Invention.
  • the dendripuces are placed in a 50 ml bottle tube filled with the dehybridization buffer described above. The whole is placed for 5 minutes at 95 ° C. The slide is then rinsed three times with milliQ water and dried by centrifugation or under a stream of nitrogen. The slide is then scanned to ensure that dehybridization has taken place. It is thus ready to be used again for another hybridization.
  • the oligonucleotide ON1 as described above (10 ⁇ M, 2 ⁇ l) is deposited on the dendrilam DL-A-G3, DL-A-G4 or DL-A-G5 prepared according to example 1.
  • the deposits are made in four different places on the same dendrilame.
  • the hybridizations are carried out using four oligonucleotides of 15 bases functionalized at their 5 ′ ends with a fluorophore Cy5 and which contain in the middle of the sequence the four possible bases T, A, G or C (Eurogentec).
  • the sequences of these oligonucleotides are as follows: - "15mer Cy5 T" (complementary): 5 ' - Cy5— AAT GGT ATC GGA GTA 3' (SEQ ID N ° 2)
  • Hybridization buffer SSC 6x, SDS 0.2%, Denhartd 5x solution, salmon DNA 10 ⁇ g, pH 7 containing the oligonucleotide 15mer Cy5 T, A, G or C at a concentration of 200 nM.
  • wash buffer wash 1: SSC 2x, 0.1% SDS, pH 7 wash 2: SSC 0.2x.
  • the oligonucleotide ON1 was deposited in five different places on the dendripuces DP1-A-G3, DP1-A-G4 and DP1-A-G5 as prepared in Example 3 above.
  • the generation 3 dendrimer with NH ends (Me) obtained in step 1) above (1 g) is dissolved in 2.5 ml of ⁇ -thiobutyrolactone in a Schlenk tube. The mixture is stirred for 3 days at 50-55 ° C under autogenous pressure. After cooling, the reaction crude is washed with 3 ⁇ 50 ml of diethyl ether to give a generation 3 dendrimer having 48 thiol functions at its periphery.
  • This dendrimer which is shown in Figure 3 attached, can then be used for the manufacture of dendrilames according to the invention. Note: this procedure is general and makes it possible to obtain dendrimers with thiol ends of all generations (Schmid et al, Chem. Eur. J., 2000, 6, 1693).
  • the grafting of the G3-thiol dendrimers is non-selective (fixation both on gold and on the SiO 2 support).
  • the G3-thiol dendrimers are grafted selectively on the gold studs. Silicon / gold blades are thus obtained, the surface of which is functionalized with generation 3 thiol-dendrimers (dendrilames: DL-C-G3 '). These dendrilames can then be used for the immobilization of molecules of interest.

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Abstract

La présente invention est relative à des supports solides fonctionnalisés par des dendrimères phosphorés, à leur procédé de préparation, à leur utilisation pour la préparation de biopuces et aux applications de ces biopuces, en particulier pour l'immobilisation de molécules d'intérêt, notamment de molécules biologiques d'intérêt telles que des acides nucléiques, des polypeptides, des lipides et des protéines.

Description

SUPPORTS SOLIDES FONCTIONNALISÉS PAR DES DENDRIMÈRES PHOSPHORES, LEUR PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET APPLICATIONS
La présente Invention est relative à des supports solides fonctionnalisés par des dendrimères phosphores, à leur procédé de préparation, à leur utilisation pour la préparation de biopuces et aux applications de ces biopuces, en particulier pour l'immobilisation de macromolécules, notamment de macromolécules biologiques telles que des acides nucléiques, des lipides, des protéines (peptides, enzymes, anticorps, ...) ou leurs partenaires moléculaires.
Le développement exponentiel de la génomique et de la pharmacogénomique lié au séquençage non seulement du génome humain, mais également à celui d'animaux, de bactéries, de virus, de plantes, etc.. amène les laboratoires de recherche académiques ou industriels à consommer de manière massive des biopuces fiables, faciles à fabriquer.
Or, dans ce cadre particulier, il est primordial de pouvoir disposer de supports solides fonctionnalisés présentant un certain nombre de qualités.
Ces supports doivent en particulier permettre l'immobilisation reproductible de molécules d'intérêt, dans la mesure où une immobilisation reproductible est conditionnelle d'une détection elle-même reproductible.
Ces supports doivent également permettre l'immobilisation des molécules d'intérêt de façon sensible. La sensibilité d'un support solide fonctionnalisé dépend du taux d'immobilisation et de la méthode de détection d'un signal, mais aussi et surtout du niveau du bruit de fond (signal non spécifique). Une diminution du bruit de fond améliore le rapport signal/bruit. En effet, dans un dispositif dans lequel on détecte la présence d'espèces biologiques au voisinage de la surface, le bruit de fond vient essentiellement de l'adsorption non spécifique de molécules y compris de molécules biologiques d'intérêt marquées et qu'il convient par conséquent de limiter. L'idéal est donc d'obtenir un support qui possède un bruit de fond très bas et une intensité de détection du signal élevée. D'autre part, et notamment dans le cas particulier des réactions d'hybridation mettant en œuvre des acides nucléiques, l'accrochage des sondes sur la surface d'un support solide doit garantir l'intégrité de la séquence et la stabilité du dépôt. Après l'étape d'hybridation les résultats doivent être reproductibles d'un support à l'autre. A cet effet, les sondes doivent être espacées de la surface du support solide afin de ne pas perturber l'hybridation avec les acides nucléiques cibles. Ceci permet de s'approcher des conditions d'hybridation en solution en mimant une hybridation en 3 dimensions plutôt qu'en 2 dimensions classiquement obtenues par la technique lame de verre. Un espaceur d'au moins une quarantaine d'atomes (4-5 nm) est nécessaire pour éviter les contraintes stériques entre l'ADN et la surface du support.
Par ailleurs, il est important de pouvoir disposer de supports solides fonctionnalisés réutilisables. La possibilité de pouvoir disposer d'un support réutilisable est d'un grand intérêt car elle autorise l'analyse de plusieurs échantillons biologiques avec un seul et même dispositif, ce qui permet d'effectuer des comparaisons quantitatives. De plus, les supports réutilisables autorisent la réalisation de plusieurs mesures sur un même échantillon et permettent ainsi l'amélioration des résultats d'un point de vue statistique.
A l'heure actuelle, différents types de procédés de préparation des biopuces ont déjà été proposés. Les biopuces, et en particulier les biopuces à acides nucléiques, peuvent être fabriquées soit par synthèse in situ soit par immobilisation de sondes.
Dans le premier cas (synthèse in situ), les sondes sont des oligonucléotides qui sont synthétisés étape par étape directement sur le support et qui ont une taille généralement comprise entre 20 et 30 bases. Ce procédé de fabrication permet d'avoir accès à des puces à haute densité (McGall et al, J. Am. Chem. Soc,
1997, 119, 5081-5090).
Dans le deuxième cas (immobilisation de sondes), les sondes sont présynthétisées puis immobilisées sur le support. Deux types d'interactions avec la surface peuvent alors entrer enjeu. L'acide nucléique sonde peut être maintenu sur la surface par des interactions électrostatiques entre les groupements phosphates du squelette chargés négativement et la surface modifiée du support chargée positivement. A titre d'exemple, ce type de biopuce peut être obtenu par recouvrement de la surface avec de la poly-L-lysine ou par silanisation avec un amino-silane (Zammatteo et al, Anal. Biochem., 2000, 280, 143-150 ; Eisen et al, Methods in Enzymol, 1999, 303, 179- 205). Dans ce type d'immobilisation, la sonde est généralement couchée sur le support ce qui peut entraîner des problèmes d'accessibilité lors de l'étape d'hybridation. De plus, ce mode d'interactions ioniques n'est pas suffisamment stable pour permettre une réutilisation de la biopuce.
L'acide nucléique sonde peut également être greffé sur le support par le biais d'interactions covalentes. Généralement les liaisons entre les sondes et le support sont établies par une des extrémités 3' ou 5' de l'acide nucléique permettant une accessibilité de la sonde sur toute sa longueur d'où une meilleure qualité de la réponse en terme d'hybridation. Plusieurs combinaisons de fonctionnalisation du support et des acides nucléiques peuvent être rencontrées. Le support peut, par exemple, comporter des fonctions nucléophiles telles que des fonctions -NH2 ou -SH et l'acide nucléique à greffer comporte alors une fonction électrophile telle que par exemple une fonction -CHO, -NCS, -NHS ou encore -COOR, et inversement. Selon une autre variante, le support et l'acide nucléique peuvent être nucléophiles et un espaceur di-électrophile permettra le couplage entre les deux entités. Enfin le support et la sonde peuvent être électrophiles et le couplage sera réalisé grâce à un espaceur di-nucléophile.
Les biopuces fabriquées actuellement sont, pour une très grande majorité, réalisées en utilisant le verre comme support.
Les plus utilisées possèdent des surfaces fonctionnalisées avec un espaceur terminé par une fonction -NH . Leur efficacité en terme d'accrochage et d'hybridation a été confirmée mais aucune réutilisation de ce type de lame n'est possible, les interactions entre les sondes et le support étant de type ionique. D'autres lames comportant à leur surface des fonctions aldéhyde sont commercialisées. Ces fonctions sont introduites par utilisation d'un silane- aldéhyde, espaceur simple, qui ne présente qu'une seule fonction d'ancrage par molécule que ce soit du côté du support ou du côté des acides nucléiques. Or il a été montré que l'ancrage par plusieurs points sur la surface est important (Zhao et a , Nucl. Acids Res., 2001, 29, 955-959 ; demande internationale WO 01/51689) puisqu'il permet d'assurer une augmentation des sites de fixation des sondes sur le support ce qui entraîne une meilleure réponse en terme d'hybridation.
Une autre façon d'obtenir une meilleure sensibilité de détection est notamment reportée dans les travaux de M. Beier et J.D. Hoheisel, Nucl. Acids Res., 1999, 27, 1970-1977. Les auteurs ont construit, sur une lame de verre, des molécules ramifiées à six branches dans le but d'augmenter la densité de sondes. La nature de ces espaceurs ramifiés permet aussi de moduler la nature hydrophile ou hydrophobe de la surface. Leur procédé de préparation inclut au total huit étapes de synthèse, à partir d'une lame aminée, pour obtenir la biopuce ce qui limite fortement leur développement industriel. De plus, les molécules ramifiées sont générées in situ de façon non contrôlable, et leur structure n'est pas définie, ce qui ne permet pas de garantir une homogénéité de la surface de la biopuce ainsi obtenue. Tous les liens étant covalents, les auteurs ont montré, que leurs biopuces pouvaient être réutilisées. Il est à noter que la réutilisation des biopuces est courante dans le cas d'un support en Nylon® et a été plus récemment décrite avec du plastique (voir demande internationale WO 00/55627).
Enfin, des travaux récents (Benters et al, Chembiochem., 2001, 2, 686-694) décrivent l'utilisation de dendrimères aminés "PAMAM® starbust" pour la fabrication de biopuces, en sept étapes de synthèse exigeantes en terme de conditions opératoires, et dont certaines ne peuvent être contrôlées puisqu'elles sont réalisées directement sur le verre, pour l'obtention d'un support qui n'est pas stable dans le temps. En effet, l'utilisation de ces biopuces inclut une étape d'activation préalable de la couche de dendrimères avant de réaliser le couplage avec les oligonucléotides. Cette étape génère une surface réactive qui n'est pas stable dans le temps puisque les auteurs indiquent que les sondes doivent être greffées immédiatement après l'activation. Ceci limite fortement la commercialisation de ce type de support. Le développement exponentiel de la génomique et de la pharmacogénomique lié au séquençage non seulement du génome humain, mais également à celui d'animaux, de bactéries, de virus, de plantes, etc.. amène les laboratoires de recherche académiques ou industriels à consommer de manière massive des biopuces fiables, faciles à fabriquer. La réutilisation est un critère supplémentaire qui permet de valider de manière statistique les essais biologiques. C'est donc afin de remédier à l'ensemble de ces inconvénients et de pourvoir à des biopuces réutilisables pouvant être fabriquées à moindre coût, en peu d'étapes, de manière contrôlée et reproductible et présentant une excellente stabilité et une très bonne sensibilité de détection, que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'Invention.
La présente Invention a donc pour premier objet un support solide caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une surface fonctionnalisée de façon covalente par des dendrimères phosphores possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels et comportant à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre la fixation desdits dendrimères sur ladite surface ainsi que la fixation ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt, lesdits dendrimères ayant une taille comprise entre 1 et 20 nra.
Dans la suite de la description, de tels supports solides fonctionnalisés par des dendrimères phosphores sont appelés « dendrilames ».
Les dendrimères sont des polymères, isomoléculaires à structure ramifiée et définie, formés d'un noyau central (coeur) à partir duquel sont créées ou greffées des ramifications. Ces ramifications sont multifonctionnelles, c'est-à-dire qu'elles portent, en particulier en périphérie, plusieurs groupements chimiques fonctionnels, identiques ou différents, choisis selon les propriétés que l'on souhaite conférer au dendrimère. Chaque nouvelle génération est obtenue par introduction d'un nouveau niveau de ramifications. L'ensemble des points de jonctions des branches situés à une égale distance du cœur correspond à une génération. Une représentation schématique d'un dendrimère de génération 4, obtenu à partir d'un cœur trifonctionnel, est donnée sur la figure 1 annexée.
Parmi les dendrimères pouvant être utilisés selon l'Invention, on préfère ceux qui sont constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central P0, éventuellement phosphore, comprenant de 2 à 12 groupements fonctionnalisés,
- de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités Pi répondant à la formule (I) suivante :
L M C=N N P (|)
«1 R2 E
dans laquelle :
L est un atome d'oxygène, de phosphore, de soufre ou d'azote, M représente l'un des groupes suivants : « un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en C1-C12, azoïque, acétylénique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou « un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituants tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de Ri, n est un nombre entier compris entre 1 et 11 ,
E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
- une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule II suivante :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle :
W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
X représente un groupement aldéhyde, thiol, aminé, époxyde, acide carboxylique, alcool, phénol, et de manière plus générale tout groupement comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre, de carbone ou d'halogène.
De façon préférentielle, le noyau central P0 de ces dendrimères est sélectionné dans le groupe constitué par le groupement de formule générale Illa :
Figure imgf000008_0002
et le groupement de formule générale Illb
/
R§=P (Illb)
dans lequel R5 représente un atome de soufre, d'oxygène ou d'azote.
Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, les dendrimères sont choisis parmi les composés dans lesquels le groupe de formule (I) ci-dessus représente le groupe suivant :
Figure imgf000009_0001
dans lequel R2 représente un radical alkyle en -C12 et plus particulièrement un radical méthyle ; et le groupe de formule (II) représente l'un des deux groupes suivants :
Figure imgf000009_0002
et dans lesquels le nombre de générations varie de préférence entre 1 et 6.
Des exemples de tels dendrimères sont donnés sur les figures 2 et 3 annexées qui représentent respectivement la structure d'un dendrimère de génération 4 à terminaisons aldéhyde et la structure d'un dendrimère de génération 3 à terminaisons thiol.
Parmi les supports solides pouvant être fonctionnalisés conformément à l'Invention, on peut en particulier citer les supports comportant au moins une surface siliciée telle que les lames, les billes et les capillaires en verre, les supports en silicium, en plastique et les supports métalliques tels que par exemple les plots d'or.
Les dendrimères utilisés conformément à l'Invention peuvent être synthétisés de façon connue de l'Homme du métier, par répétition d'une même séquence réactionnelle permettant l'obtention d'une nouvelle génération à la fin de chaque cycle de synthèse et par conséquent d'un nombre croissant de branches et de fonctions périphériques toutes identiques (Tomalia D.A., Ang. Chem. Int. Ed., 1990, 29, 138 ; Launay ét al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1994, 33, 1589 et J. Organomet. Chem., 1997, 529, 51).
En particulier, ces dendrimères peuvent être construits étape par étape à partir d'un noyau central possédant au moins deux groupements fonctionnels tel que par exemple l'hexachlorocyclotriphosphazène : N3P3C16, qui possède six groupements fonctionnels.
De façon plus précise, ces dendrimères sont généralement construits par la répétition de deux étapes à partir du cœur. La première étape est la substitution des atomes de chlore en milieu basique par un composé difonctionnel ayant une fonction alcool et une fonction aldéhyde, par exemple le 4-hydroxybenzaldéhyde. La deuxième étape crée les points de ramification et consiste en une réaction de condensation avec un composé ayant deux types de fonctions : un groupement NH2 et au moins un groupement PC12 comme par exemple le composé H2NNMeP(S)Cl2. Les deux premières étapes de la méthode de synthèse à partir du cœur hexafonctionnel sont représentées sur le schéma de synthèse A représenté sur la figure 4 annexée.
Une suite itérative des étapes de synthèse permet de construire des dendrimères de génération croissante.
Le tableau I ci-après indique le nombre de fonctions terminales présentes à la périphérie des dendrimères de différentes générations obtenus à partir du cœur N3P3 ainsi que leur taille en Angstroms :
Tableau I
Figure imgf000010_0001
La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un support solide conforme à l'Invention (dendrilame), caractérisé par le fait qu'il comprend une étape de formation d'une liaison covalente entre des dendrimères phosphores possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels, lesdits dendrimères comportant à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre leur fixation sur ladite surface et la fixation ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt, et la surface fonctionnalisée ou non d'un support solide pour obtenir un support solide fonctionnalisé de façon covalente par lesdits dendrimères.
Selon une première forme de réalisation du procédé conforme à l'Invention, les dendrimères comportent à leur périphérie des fonctions permettant l'accrochage direct par l'intermédiaire d'une liaison covalente de ces derniers sur la surface non préalablement fonctionnalisée dudit support solide. C'est le cas, en particulier, lorsque les dendrimères comportent à leur périphérie des fonctions thiol et que le support solide comprend une surface d'or.
Selon une seconde forme de réalisation du procédé conforme à l'Invention, et lorsque la surface du support solide utilisé ne comprend pas de fonctions compatibles avec les fonctions périphériques du dendrimères utilisé, il est alors nécessaire de fonctionnaliser préalablement ladite surface au moyen de fonctions aptes à permettre la fixation covalente desdits dendrimères.
Selon cette seconde variante, le procédé conforme à l'Invention est alors caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : a) la fonctionnalisation d'au moins une surface d'un support solide par des fonctions aptes à permettre la fixation de dendrimères phosphores possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels, lesdits dendrimères comportant à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre leur fixation sur ladite surface ainsi fonctionnalisée et la fixation ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt ; b) la préactivation éventuelle des fonctions du support pour obtenir une surface fonctionnalisée activée, c) la formation d'une liaison covalente entre lesdits dendrimères et ladite surface fonctionnalisée et éventuellement activée, pour obtenir un support solide fonctionnalisé de façon covalente par lesdits dendrimères.
Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, l'étape a) de fonctionnalisation de la surface du support solide est réalisée par silanisation au moyen d'un réactif de silanisation comportant des fonctions aptes à fixer les dendrimères, telles que par exemple des groupements aminé.
A titre d'exemple, l'étape de silanisation peut être réalisée en utilisant un réactif de silanisation aminé tel que par exemple le 3-aminopropyltriéthoxysilane (Sigma), l'aminopropyldiéthoxyméthylsilane ou bien encore l'aminopropylmonoéthoxydiméthylsilane.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, l'étape de fixation covalente directe des dendrimères (cas de la première variante) et l'étape a) de silanisation de la surface du support (cas de la deuxième variante) sont précédées d'une étape de nettoyage de la surface du support en milieu basique, acide et/ou oxydant.
Dans le cas particulier de la deuxième variante du procédé conforme à l'Invention, ces deux étapes de lavage et de silanisation sont résumées sur le schéma de synthèse B ci-dessous :
SCHEMA B
Figure imgf000012_0001
OEt
I
Et0_ Si\_^\^--NH2
OEt L'étape b) optionnelle de préactivation sert à réactiver si nécessaire les fonctions aminé fixées sur le support à l'issue de l'étape de silanisation. En effet, le stockage, même court, des supports solides aminés peut entraîner une protonation des groupements NH2. Il est donc souvent préférable de réactiver les fonctions aminé en milieu basique avant de faire réagir les dendrimères. Dans ce cas particulier, les étapes b) et c) sont représentés sur le Schéma C ci-après : SCHÉMA C
b) Préactivation
Figure imgf000013_0001
c) Fonctionnalisation avec les dendrimères
Figure imgf000013_0003
CH2CI2, 7 heures
Figure imgf000013_0004
Figure imgf000013_0002
Selon une forme de réalisation avantageuse du procédé conforme à l'Invention, cette étape de préactivation est réalisée par traitement du support à l'aide d'un agent alcalinisant tel que par exemple la potasse, pendant une durée comprise entre 2 et 20 minutes environ.
Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, l'étape de fixation covalente des dendrimères, consiste à :
- préparer une solution desdits dendrimères dans un solvant, tel que par exemple le dichlorométhane ou le tetrahydrofurane,
- mettre ladite solution de dendrimères en contact avec la surface éventuellement fonctionnalisée et éventuellement activée, pendant une durée comprise entre 10 minutes et 24 heures environ, de préférence entre 2 et 8 heures environ, à une température de préférence comprise entre 4 et 50°C environ. A l'issue de l'étape de fixation covalente des dendrimères, les supports conformes à l'Invention (dendrilames) sont de préférence rincés puis séchés.
L'étape de rinçage est de préférence réalisée à l'aide d'un solvant organique tel que le dichlorométhane ou le tetrahydrofurane puis à l'aide d'un alcool inférieur tel que l'éthanol.
Le séchage des dendrilames peut par exemple être effectué à l'air comprimé, sous courant d'azote ou bien encore par centrifugation.
Les dendrilames ainsi obtenues peuvent ensuite être stockées et/ou directement utilisées pour l'immobilisation et/ou la synthèse in situ de molécules, en particulier de molécules biologiques.
Les dendrilames conformes à l'Invention peuvent en particulier être stockées pendant au moins deux mois, sans qu'aucune altération des fonctions situées à la périphérie des dendrimères ne se produise.
La présente Invention a donc également pour objet l'utilisation d'un support solide fonctionnalisé par des dendrimères phosphores conformes à l'Invention
(dendrilames), comme support pour l'immobilisation et/ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt telles que par exemple des molécules d'acide nucléique
(oligonucléotides, produits PCR...), des lipides, des protéines (peptides, enzymes, anticorps, ...) ou leurs partenaires moléculaires. L'Invention a aussi pour objet une biopuce caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par des dendrimères phosphores sur lesquels sont fixées de façon covalente des molécules d'intérêt telles que des acides nucléiques (oligonucléotides, produits PCR...), des lipides, des protéines (peptides, enzymes, anticorps, ...) ou leurs partenaires moléculaires.
Selon l'Invention, de telles biopuces sont appelées « dendripuces ».
De telles dendripuces possèdent un bruit de fond très bas et une intensité de signal élevée par exemple après hybridation d'acides nucléiques avec des cibles fluorescentes. Ces "dendripuces" présentent l'avantage d'être réutilisables sans perte significative du signal mais surtout sans augmentation du bruit de fond. Ceci entraîne une réduction significative des coûts d'analyse et permet d'obtenir des données statistiques fiables pour une analyse donnée. Ces dendripuces sont de plus obtenues en peu d'étapes de synthèse (trois à cinq) ; celles-ci se déroulant dans des conditions opératoires non contraignantes, de manière contrôlée et reproductible.
Par ailleurs, du fait de la structure même des dendrimères, ces dendripuces présentent l'avantage de posséder de multiples points d'ancrage sur la surface d'une part et sur les molécules d'intérêt d'autre part, le tout garantissant une excellente stabilité de l'ensemble support-dendrimères-molécules d'intérêt.
Un autre objet de l'Invention est un procédé de préparation d'une dendripuce telle que définie ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en contact un support solide ayant au moins une surface fonctionnalisée par des dendrimères phosphores comportant à leur périphérie des fonctions aptes à permettre la fixation covalente de molécules d'intérêt avec une solution tampon renfermant des molécules d'intérêt préalablement fonctionnalisées par, ou comportant déjà, un ou plusieurs groupements aptes à former une liaison covalente avec lesdites fonctions périphériques des dendrimères. Selon une première forme de réalisation de ce procédé, et lorsque les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions aldéhydes, alors les molécules d'intérêt sont de préférence préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions aminé, ou sont préalablement fonctionnalisées par une ou plusieurs fonctions oxyamine (-ONH2) ou hydrazine (-NH-NH2), et de manière plus générale par toute fonction susceptible de réagir avec une fonction aldéhyde.
Aussi, dans ce cas, les molécules d'intérêt (acides nucléiques aminés, oligonucléotides de tailles variables ou produits PCR), sont déposés sur les "dendrilames" en utilisant, par exemple, le tampon phosphate 0,3 M, pH 9. Lorsque les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions aminé, cette étape est suivie d'une réduction des fonctions imines présentes entre les acides nucléiques et les dendrimères d'une part et entre les dendrimères et le support d'autre part (voir Schéma D ci-après). Cette étape de réduction permet également de réduire les fonctions aldéhydes résiduelles en alcool rendant la surface hydrophile. De plus, les alcools ne peuvent pas entraîner de réaction non spécifique avec les cibles marquées (pas d'augmentation du bruit de fond). SCHEMA D
Figure imgf000016_0001
Selon une deuxième forme de réalisation de ce procédé, et lorsque les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions thiol, alors les molécules d'intérêt sont de préférence préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions thiol (pour permettre la création d'un pont disulfure), ou sont préalablement fonctionnalisées par une ou plusieurs fonctions iodoacétamido (-NHCO-CH2-I), et de manière plus générale, par toute fonction susceptible de réagir avec une fonction thiol. Ce type de fonctionnalisation est particulièrement adapté aux supports solides comportant une surface de type silicium ou en or. Dans le cas d'un lien disulfure établi entre le support et les sondes nucléiques, la surface peut être régénérée par une étape de réduction. La surface thiol ainsi obtenue peut être à nouveau "rechargée" avec d'autres séquences oligonucléotidiques ou avec des protéines.
Selon une troisième forme de réalisation de ce procédé, et lorsque les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions aminés, alors les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà une ou plusieurs fonctions aldéhyde, α-oxoaldéhyde, -COOR, -NCS, -NHS, et de manière plus générale, par toute fonction capable de réagir avec une fonction aminé.
Selon une quatrième forme de réalisation de ce procédé, et lorsque les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions époxyde, alors les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà une ou plusieurs fonctions aminé, et de manière plus générale, par toute fonction capable de réagir avec une fonction époxyde.
Selon le procédé de préparation des dendripuces conforme à l'Invention, la réaction de fixation covalente des molécules d'intérêt sur les dendrilames est de préférence réalisée à une température comprise entre 4 et 50°C environ, pendant une durée comprise entre 2 et 24 heures environ.
Les dendripuces ainsi obtenues peuvent avantageusement être utilisées en tant qu'outil de diagnostic miniaturisé, en fonction de la nature des molécules d'intérêt fixées, comme puces à ADN par exemple pour réaliser des réactions d'hybridation avec des cibles complémentaires, comme puces à peptides, à polypeptides ou à protéines par exemple pour la détection de réponses de type antigène-anticorps par l'utilisation de réactifs marqués, fluorescents, radioactifs ou marqués chimiquement.
Les dendripuces conformes à la présente Invention peuvent également être utilisées comme puces à polypeptides pour le criblage de molécules et pour l'analyse des relations entre molécules, de type ligand-récepteur.
De telles dendripuces présentent en particulier l'avantage d'être réutilisables.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à deux exemples de préparation de dendrilames en verre fonctionnalisées par des dendrimères de différentes générations et à extrémités aldéhyde, à un exemple de préparation de biopuces à partir de ces dendrilames, à un exemple d'immobilisation de molécules d'acide nucléique sur des biopuces conformes à l'Invention, à un exemple de synthèse d'un dendrimère de génération 3 et à extrémités thiol et à un exemple de préparation de dendrilames avec des dendrimères de génération 3 à extrémités thiol, ainsi qu'aux figures 1 à 7 dans lesquelles :
- la figure 1 représente une vue schématique d'un dendrimère de génération 4, obtenu à partir d'un cœur trifonctionnel ;
- la figure 2 représente la formule d'un dendrimère phosphore de génération 4 comportant des fonctions périphériques terminales aldéhydes ;
- la figure 3 représente la formule d'un dendrimère phosphore de génération 3 à fonctions périphériques terminales thiol ;
- la figure 4 est un schéma de synthèse A représentant les deux premières étapes du procédé de préparation d'un dendrimère à cœur phosphore ;
- la figure 5 représente les images des signaux de fluorescence obtenus après 10 cycles d'hybridation/déshybridation sur des dendripuces conformes à l'Invention ;
- la figure 6 représente les images des signaux de fluorescence obtenus après 10 cycles d'hybridation/déshybridation sur des dendripuces conformes à l'Invention en fonction de la concentration en oligonucléotides cibles ;
- la figure 7 représente les images des signaux de fluorescence obtenus lors d'une étude concernant la recherche de mutations sur des oligonucléotides.
EXEMPLE 1 : PRÉPARATION D'UN SUPPORT SOLIDE CONSTITUE PAR UNE LAME DE VERRE FONCTIONNALISÉE PAR DES DENDRIMÈRES PHOSPHORES A EXTRÉMITÉS ALDÉHYDE ("DENDRILAMES") 1) Première étape : Préactivation des lames de verre
Des lames de verre commerciales, fonctionnalisées par des groupements aminé (CORNING®-CMT-GAPS Amino-Silane Coated Slides) sont immergées dans une solution de aqueuse de potasse (8 %) pendant 20 minutes sous agitation à l'aide d'un agitateur orbital à une vitesse de 30 rotations par minute (Heidolph Instruments Polymax 1040). Les lames sont ensuite abondamment rincées avec de l'eau milliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) et sont enfin séchées sous courant d'azote.
2) Deuxième étape : Préparation des "dendrilames"
Dans cet exemple, trois types de dendrimères différents ont été utilisés : - Dendrimères G3 : Dendrimères de troisième génération comportant un cœur phosphore de formule (Illa) telle que décrite ci-dessus et comportant à leur périphérie 48 fonctions aldéhydes ;
- Dendrimères G4 : Dendrimères de quatrième génération comportant un cœur phosphore de formule (Illa) telle que décrite ci-dessus et comportant à leur périphérie 96 fonctions aldéhydes ;
- Dendrimères G5 : Dendrimères de cinquième génération comportant un cœur phosphore de formule (Illa) telle que décrite ci-dessus et comportant à leur périphérie 192 fonctions aldéhydes ; Les lames préactivées sont immergées dans une solution de dendrimères G3, G4 ou G5 à 0,1% dans du dichlorométhane. Elles sont agitées pendant 6 heures à température ambiante (30 rotations/mn). Elles sont ensuite rincées avec du dichlorométhane (2 lavages de 5 minutes chacun) puis avec de l'éthanol (1 lavage de 5 minutes) et sont enfin séchées sous courant d'azote. On obtient ainsi des lames de verre dont la surface est fonctionnalisée par des dendrimères de G3, G4 ou G5 (dendrilames : DL-A-G3 ; DL-A-G4 et DL-A-G5). Ces dendrilames peuvent ensuite être utilisées pour l'immobilisation de molécules d'intérêt. EXEMPLE 2 : PRÉPARATION D'UN SUPPORT SOLIDE CONSTITUÉ PAR UNE LAME DE VERRE FONCTIONNALISÉE PAR DES DENDRIMÈRES PHOSPHORES A EXTRÉMITÉS ALDÉHYDE ("DENDRILAMES")
1) Première étape : Nettoyage des lames de verre
Des lames de verre commerciales (Gold-Seal-Microslides®, Polylabo) sont placées sur un portoir et celui-ci est immergé dans une solution alcaline de lavage constituée de 50 g de soude dans 200 ml d'eau milliQ et de 300 ml d'éthanol à 95%. Les lames sont agitées pendant 2 heures à température ambiante. Elles sont ensuite abondamment rincées avec de l'eau milliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) et séchées sous courant d'azote ou par centrifugation.
2) Deuxième étape : Silanisation Les lames de verre ainsi nettoyées sont immergées dans une solution de 3-aminopropyltriéthoxysilane (GAPS, Aldrich) à 10 % dans l'éthanol à 95 % et sont placées sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Elles sont ensuite laissées pendant 30 minutes à l'air libre, rincées avec de l'éthanol à 95 % (2 lavages de
5 minutes chacun) puis avec de l'eau milliQ (1 lavage de 5 minutes et 1 lavage de 2 minutes avec sonication) avant d'être séchées sous courant d'azote. Elles sont ensuite placées pendant 3 heures à une température de 120°C. 3) Troisième étape : Préactivation
Les lames silanisées sont placées dans une solution aqueuse de potasse (8 %) pendant 5 minutes, sous agitation à température ambiante. Elles sont ensuite rincées avec de l'eau milliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) avant d'être séchées sous courant d'azote. 4) Quatrième étape : Fonctionnalisation avec les dendrimères
Les lames préactivées sont placées dans une solution de dendrimères
G4 tel que décrit ci-dessus à l'exemple 1 (0,1 % dans du dichlorométhane) pendant 7 heures sous agitation à température ambiante. Elles sont ensuite lavées avec du dichlorométhane (2 lavages de 5 minutes chacun) puis avec de l'éthanol (1 lavage de 5 minutes) avant d'être séchées sous courant d'azote.
On obtient ainsi un support solide fonctionnalisé par des dendrimères phosphores à fonctions aldéhydes (dendrilame : DL-B-G4). Cette dendrilame peut ensuite être utilisée pour l'immobilisation de molécules d'intérêt. EXEMPLE 3 : PRÉPARATION DE BIOPUCES A PARTIR DES DENDRILAMES PRÉPARÉES AUX EXEMPLES 1 ET 2 : "DENDRIPUCES"
1) Dépôt des oligonucléotides a) Oligonucléotides utilisés
Oligonucléotide ON1 : 35 mer-amine ayant la séquence SEQ ID N°l suivante : 5' -GTG-ATC-GTT-GTA-TCG-AGG-AAT-ACT-CCG-ATA-CCA-
TT -3 , modifié en position 5' par un groupement - NH2-(CH2)6-.
Cet oligonucléotide, qui est modifié à son extrémité 5' par un bras à
6 carbones terminé par une fonction aminé (Eurogentec, Belgique), permet la réaction avec les fonctions aldéhydes présentes sur la dendrilame telle que décrite ci-dessus aux exemples 1 et 2.
Oligonucléotide ON2 : 35 mer-oxyamine ayant la séquence SEQ ID N°l décrite ci-dessus et modifié en position 5' par un - H2NO-(CH2)6-. La séquence SEQ ID N°l des oligonucléotides ONl et ON2 correspond à une partie du gène GPH1 de la levure Saccharomyces cerevisiae.
Les dépôts des oligonucléotides ont été effectués en utilisant le robot Eurogridder® (Eurogentec, Seraing, Belgique) et ont été espacés de 200 μm. b) Dépôts sur les dendrilames
On utilise les dendrilames DL-A-G3, DL-A-G4, DL-A-G5 et DL-B- G4 telles que préparées ci-dessus aux exemples 1 et 2.
Sur les dendrilames DL-A-G3, DL-A-G4, DL-A-G5 préparées à l'exemple 1, les oligonucléotides ONl sont déposés dans un tampon phosphate 0,3 M (pH 9) contenant des quantités croissantes de diméthylsulfoxide (DMSO) (0 ; 10 ; 20 ; 30 ; 40 ou 50 %, v/v) en utilisant le robot Eurogridder® (Eurogentec, Belgique). Les volumes déposés sont de 2 ni et les concentrations varient de lμM à 10 μm (1 ; 2 ; 5 et 10 μM). Après dépôt les lames sont laissées pendant une nuit à température ambiante. Elles sont ensuite immergées dans une solution aqueuse de borohydrure de sodium (NaBH4, 3,5 mg/mL) (étape de réduction des fonctions imines) et sont agitées pendant 3 heures à température ambiante. Elles sont rincées avec de l'eau MilliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) et sont séchées sous courant d'azote ou par centrifugation. On obtient les dendripuces (DP) suivantes DP1-A-G3 ; DP1-A-G4 et DP1-A-G5.
Sur les dendrilames DL-B-G4 préparées à l'exemple 2, les oligonucléotides ONl sont déposés dans le tampon phosphate 0,3 M (pH 9) en utilisant le robot de dépôt. Les volumes déposés sont de 2 ni et la concentration est de 10 μM. Après dépôt les lames sont laissées pendant une nuit à une température ambiante. Elles sont ensuite immergées dans une solution aqueuse de borohydrure de sodium (NaBH4, 3,5 mg/mL) (étape de réduction des fonctions imines) et sont agitées pendant 3 heures à température ambiante. Elles sont rincées avec de l'eau MilliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) et sont séchées sous courant d'azote ou par centrifugation. On obtient des dendripuces DP1-B-G4.
Les oligonucléotides ON2 ont également été déposés sur les dendrilames préparées à l'exemple 2. Pour ce faire, les oligonucléotides ON2 sont déposés dans l'eau
MilliQ. Les volumes déposés sont de 0,2 μl et les concentrations varient de 1 μM à 10 μM (1 μM, 5 μM et 10 μM). Sur la même lame les oligonucléotides ONl ont été déposés dans le tampon phosphate 0,3 M dans les mêmes conditions de volume et de concentration. Les lames sont laissées pendant 7 heures à température ambiante. Elles sont ensuite immergées dans une solution aqueuse de borohydrure.de sodium (NaBH4,
3,5 mg/mL) et sont agitées pendant 3 heures à température ambiante. Elles sont ensuite rincées avec de l'eau MilliQ (1 lavage de 5 minutes), avec une solution aqueuse de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,2 % (1 lavage de 5 minutes) et à nouveau avec de l'eau (5minutes). Elles sont enfin séchées sous courant d'azote. On obtient des dendripuces DP2-B-G4.
On obtient ainsi différentes sortes de biopuces correspondant à des dendrilames sur lesquelles ont été fixés des oligonucléotides ("dendripuces"). Ces dendripuces peuvent ensuite être utilisées dans des réactions d'hybridation.
EXEMPLE 4 : HYBRIDATION
1) Matériel et méthodes
1-a) Tampons utilisés Les différents tampons utilisés lors des étapes d'hybridation sont reportés ci-dessous ; ils ont été préparés à partir des différentes solutions commerciales suivantes :
- 20 x SSC (citrate de sodium 0,3 M ; NaCl 3 M, pH environ 7 ; Sigma)
- 20 x SSPE (Tampon Phosphate 0,2 M, 2,98 M NaCl, 0,02 M EDTA, pH environ 7,4 ; Sigma),
- 50 x Solution de Denhardt (Sigma),
- ADN saumon (9,9 mg/mL, Sigma).
Tampon d'hybridation : SSPE 2 x, SDS 0,1% [ON cible] = 200 nM, pH 7,4
Avec comme oligonucléotides cibles : ON-Cy5 : 5' - Cy5 — AAT GGT ATC GGA GTA - 3'
ON-Cy3 : 5' - Cy3 — AAT GGT ATC GGA GTA - 3' La séquence de ces oligonucléotides cibles correspond à la séquence SEQ ID N°2.
Tampon de lavage : SSPE 2x, SDS 0,1%, pH 7,4 : Tampon de déshvbridation : 2,5 raM Na2HPO4, 0,1% SDS 1-b) Etape d'hybridation
Les hybridations sont réalisées en ajoutant le volume nécessaire de cibles marquées (de 2 μl à 40 μl suivant la surface à couvrir) sur la zone de dépôt de chaque dendripuce. Différentes concentrations de cibles à détecter : 200 nM, 100 nM, 20 nM, 10 nM, 2 nM et 1 nM ont été préparées et utilisées au cours des étapes d'hybridation afin d'évaluer la sensibilité de détection des dendripuces conformes à l'Invention.
La goutte est alors recouverte d'une lamelle et l'ensemble est placé dans une chambre d'hybridation (« CMT-Hybridization Chamber » vendue par la société Corning). Les lames sont laissées pendant 15 minutes à température ambiante et sont ensuite lavées en utilisant le tampon de lavage pendant 5 minutes à température ambiante. Elles sont enfin séchées sous courant d'azote. 1-c) Lecture des lames La lecture des lames est réalisée en utilisant un scanner Axon équipé de deux lasers permettant une lecture à des longueurs d'ondes d'excitation de 532 nm et de 635 nm (Cy3 et Cy5 respectivement). La fluorescence émise par les fluorochromes après excitation est détectée par un tube photo-multiplicateur (PMT). Classiquement le PMT a une valeur comprise entre 450 et 600. Le résultat est obtenu sous forme d'un fichier image avec une résolution de 10 μm/pixel. L'analyse informatique des fichiers images et la quantification de l'intensité de fluorescence ont été réalisées en utilisant le logiciel Genepix®. 1-d) Etape de déshybridation
Lorsque la lecture des lames est terminée, on procède à la déshybridation des lames.
Pour ce faire, les dendripuces sont placées dans un tube Flacon de 50 ml rempli avec le tampon de déshybridation décrit ci-dessus. L'ensemble est placé pendant 5 minutes à 95°C. La lame est alors rincée trois fois avec de l'eau milliQ et séchée par centrifugation ou sous courant d'azote. La lame est ensuite scannée afin de s'assurer que la déshybridation a bien eu lieu. Elle est ainsi prête pour être à nouveau utilisée pour une autre hybridation. 1-e) Etude de mutations
Dépôts :
L'oligonucléotide ONl tel que décrit ci-dessus (10 μM, 2 ni) est déposé sur les dendrilames DL-A-G3, DL-A-G4 ou DL-A-G5 préparées selon l'exemple 1. Les dépôts sont effectués en quatre endroits différents sur la même dendrilame. Les hybridations sont effectuées en utilisant quatre oligonucléotides de 15 bases fonctionnalisés à leurs extrémités 5' par un fluorophore Cy5 et qui contiennent en milieu de séquence les quatre bases possibles T, A, G ou C (Eurogentec). Les séquences de ces oligonucléotides sont les suivantes : -"15mer Cy5 T" (complémentaire) : 5' - Cy5— AAT GGT ATC GGA GTA 3' (SEQ ID N°2)
- " 15mer Cy5 A" : 5' - Cy5— AAT GGT AAC GGA GTA 3' (SEQ ID N°3)
- " 15mer Cy5 G" : 5' - Cy5— AAT GGT AGC GGA GTA 3' (SEQ ID N°4)
- " 15mer Cy5 C" : 5' - Cy5— AAT GGT ACC GGA GTA 3' (SEQ ID N°5) Hybridations
- Tampon d'hybridation : SSC 6x, SDS 0,2%, solution de Denhartd 5x, ADN saumon 10 μg, pH 7 contenant l'oligonucléotide 15mer Cy5 T, A, G ou C à une concentration de 200 nM.
- Tampon de lavage : lavage 1 : SSC 2x, 0,1% SDS, pH 7 lavage 2 : SSC 0,2x.
On dépose 5 μl de chacune des solutions d'hybridation sur chaque zone de dépôt constituée d'oligonucléotide ONl. On recouvre chaque zone d'une lamelle (sans que les lamelles ne se touchent). On place la lame dans une chambre d'hybridation (Corning) que l'on plonge dans un bain à 42°C pendant une heure. Les lames sont ensuite lavées avec le tampon de lavage 1 pendant 5 minutes à température ambiante ou à 50°C puis avec le tampon de lavage 2 pendant 5 minutes à 50°C. Elles sont enfin séchées sous courant d'azote. 2) Résultats
2-a) Réutilisation des dendripuces et sensibilité de la détection en fonction de la nature du tampon de dépôt, de la concentration en ON et de la nature des dendrimères Sur les dendripuces DP1-A-G3, DP1-A-G4 et DP1-A-G5, et pour chaque concentration testée de cibles à détecter, les étapes d'hybridation, de lecture des lames et de déshybridation ont été effectuées 7 fois avec l'ON 15-mer Cy5 (200 nM), afin de démontrer le caractère réutilisable des dendripuces conformes à l'Invention, ainsi que la sensibilité et la reproductibilité des résultats obtenus. Les valeurs d'intensité de fluorescence sont regroupées dans les Tableaux II à IV ci-après ; le PMT a valeur de 600 et les dépôts ont été réalisés en triplicata pour chaque tampon :
TABLEAU II
Figure imgf000026_0001
TABLEAU III
Figure imgf000027_0001
TABLEAU IV
Figure imgf000028_0001
Ces résultats montrent que les rapports signal/bruit sont pratiquement constants entre la première et la septième hybridation. Ces résultats démontrent que les dendripuces conformes à l'Invention peuvent être réutilisées sans diminution du rapport signal/bruit. De plus, ces résultats montrent que les rapports signal/bruit obtenus avec les différentes concentrations de tampon sont très proches et donc significatifs de la reproductibilité et de la sensibilité des mesures.
De la même manière, 10 cycles d'hybridation et de déshybridation ont été réalisés sur les dendripuces DP1-B-G4 telles que préparées ci-dessus à l'exemple 2.
Les résultats obtenus, sous la forme d'images des signaux de fluorescence, sont représentés sur la figure 5.
Ces résultats montrent que le rapport signal/bruit après la première hybridation (65000/200) est le même après la dixième hybridation et donc significatif du caractère réutilisable des dendripuces conformes à la présente Invention. 2-b) Réutilisation des dendripuces et sensibilité de la détection en fonction de la concentration en ON cible et de la nature des dendrimères
L'oligonucléotide ONl a été déposé en cinq endroits différents sur les dendripuces DP1-A-G3, DP1-A-G4 et DP1-A-G5 telles que préparées à l'exemple 3 ci-dessus.
Les solutions d'hybridation suivantes contenant des concentrations décroissantes en ON-Cy5 cible ont été utilisées afin d'évaluer la sensibilité des dendripuces conformes à l'Invention : - SSPE 2x, SDS 0,1%, [ON- Cy5] = 200 nM
- SSPE 2x, SDS 0,1%, [ON-Cy5] = 100 nM
- SSPE 2x, SDS 0,1%, [ON-Cy5] = 20 nM
- SSPE 2x, SDS 0,1%, [ON-Cy5] = 10 nM
- SSPE 2x, SDS 0,1%, [ON-Cy5] = 2 nM - SSPE 2x, SDS 0,1%, [ON-Cy5] = 1 nM
2 μl de chacune de ces solutions d'hybridation ont ensuite été déposés sur les dendripuces et laissés incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Les dendripuces ont ensuite été lavées avec le tampon SSPE 2x, SDS 0,1% pendant 5 minutes à température ambiante avant d'être séchées sous courant d'azote ou par centrifugation. 10 cycles d'hybridation/déshybridation ont ainsi été effectués.
Les images obtenues sont représentées sur la figure 6. Ces résultats montrent que pour une concentration en ON-Cy5 cible variant entre 200 nM et 10 nM, et même après 10 cycles d'hybridation/déshybridation, on obtient un rapport signal/bruit constant de 65000/200. Pour une concentration en ON-Cy5 cible inférieure, c'est-à-dire de 2nM ou de lnM, on obtient des rapports signal/bruit respectivement de 50000/200 et de 40000/200 significatifs de la très bonne sensibilité de détection des dendripuces conformes à l'Invention et de la reproductibilité des résultats qu'elles permettent d'obtenir lorsqu'elles sont réutilisées plusieurs fois. 2-b) Détection de mutations Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 7 annexée sur laquelle on peut voir que seul l'oligonucléotide parfaitement complémentaire conduit à l'obtention d'un signal de fluorescence alors qu'aucun signal de fluorescence n'est obtenu avec les oligonucléotides contenant une mutation en milieu de chaîne. Les dendripuces conformes à l'Invention permettent donc de détecter des mutations. EXEMPLE 5 : SYNTHÈSE D'UN DENDRIMÈRE DE GÉNÉRATION 3 A EXTRÉMITÉS THIOLS
1) Première étape : Synthèse d'un dendrimère de génération 3 à extrémités NH(Me)
A une solution de dendrimère de génération 3 (cœur N P , Launay et al, pré-cité) à extrémités aldéhydes (650 mg) dans le dichlorométhane est ajoutée, à la seringue, un léger excès de monométhylhydrazine (224 μl). Après quatre heures d'agitation à température ambiante le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite puis le dendrimère de génération 3 à extrémités NH(Me) est précipité en utilisant du diéthyléther (3x15 ml). La poudre blanche résultante est lavée plusieurs fois avec ce solvant avant d'être séchée sous pression réduite.
2) Deuxième étape : Synthèse d'un dendrimère de génération 3 à extrémités thiols
Le dendrimère de génération 3 à extrémités NH(Me) obtenu à l'étape 1) ci-dessus (1 g) est dissous dans 2,5 ml de γ-thiobutyrolactone dans un tube de Schlenk. Le mélange est maintenu sous agitation pendant 3 jours à 50-55°C sous pression autogène. Après refroidissement, le brut réactionnel est lavé avec 3x50 ml de diéthyléther pour donner un dendrimère de génération 3 possédant 48 fonctions thiols à sa périphérie.
Ce dendrimère, qui est représenté sur la figure 3 annexée, peut ensuite être utilisé pour la fabrication des dendrilames conformes à l'Invention. Remarque : cette procédure est générale et permet d'obtenir des dendrimères à extrémités thiols de toutes les générations (Schmid et al, Chem. Eur. J., 2000, 6, 1693).
EXEMPLE 6 : PRÉPARATION DE "DENDRILAMES"
FONCTIONNALISÉES PAR DES DENDRIMÈRES A EXTRÉMITÉS THIOLS Des lames en SiÛ2, Siθ2 silanisées ou SiNx sur lesquelles sont fixés des plots d'or (10 μm à 500 μm ) sont préalablement lavées avec de l'éthanol à 95 % et séchées à l'air comprimé. Elles sont ensuite plongées pour des durées variables (15 minutes, 1 heure, 2 heures et 12 heures) dans une solution constituée de 100 μg de dendrimères de génération 3 à extrémités thiols tel que préparé ci-dessus à l'exemple 5 dissous dans 5 ml de THF distillé. Les lames sont ensuite lavées avec du THF distillé (± ultrasons) puis avec de l'éthanol avant d'être séchées à l'air comprimé. Le résultat du greffage (non représenté) est observé par microscopie à force atomique (AFM). Dans le cas des plots d'or sur support Siθ2, le greffage des dendrimères G3-thiols est non sélectif (fixation à la fois sur l'or et sur le support SiO2). Dans le cas des supports SiÛ2 silanisés ou SiNx, le greffage des dendrimères G3-thiols se fait sélectivement sur les plots d'or. On obtient ainsi des lames en silicium/or dont la surface est fonctionnalisée par des dendrimères-thiol de génération 3 (dendrilames : DL-C-G3'). Ces dendrilames peuvent ensuite être utilisées pour l'immobilisation de molécules d'intérêt.

Claims

REVENDICATIONS
1. Support solide caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une surface fonctionnalisée de façon covalente par des dendrimères phosphores possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels et comportant à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre la fixation desdits dendrimères sur ladite surface ainsi que la fixation ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt, lesdits dendrimères ayant une taille comprise entre 1 et 20 nm.
2. Support solide selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les dendrimères sont choisis parmi ceux qui sont constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central P0, éventuellement phosphore, comprenant de 2 à 12 groupements fonctionnalisés,
- de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités Pi répondant à la formule (I) suivante :
Figure imgf000032_0001
dans laquelle :
L est un atome d'oxygène, de phosphore, de soufre ou d'azote,
M représente l'un des groupes suivants :
• un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en C1-C12, azoïques, acétylénique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou
• un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituants tels que définis lorsque M est un groupe aromatique,
Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de Ri, n est un nombre entier compris entre 1 et 11 ,
E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
- une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule II suivante :
Figure imgf000033_0001
dans laquelle : W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
X représente un groupement aldéhyde, thiol, aminé, époxyde, acide carboxylique, alcool ou phénol.
3. Support solide selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le noyau central P0 est sélectionné dans le groupe constitué par le groupement de formule générale Illa :
Figure imgf000033_0002
et le groupement de formule générale Illb
R5-=P — (Illb) dans lequel R5 représente un atome de soufre, d'oxygène ou d'azote.
4. Support selon la revendication 2 ou 3, caractérisé par le fait que les dendrimères sont choisis parmi les composés dans lesquels le groupe de formule (I) représente le groupe suivant :
Figure imgf000034_0001
dans lequel R2 représente un radical alkyle en C1-C12 et plus particulièrement un radical méthyle ; et le groupe de formule (II) représente l'un des deux groupes suivants :
Figure imgf000034_0002
et dans lesquels le nombre de générations varie de préférence entre 1 et 6.
5. Support solide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les supports comportant au moins une surface siliciée telle que les lames, les billes et les capillaires en verre, les supports en silicium, en plastique et les supports métalliques.
6. Procédé de préparation d'un support solide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il comprend une étape de formation d'une liaison covalente entre des dendrimères phosphores possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels, lesdits dendrimères comportant à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre leur fixation sur ladite surface et la fixation ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt, et la surface fonctionnalisée ou non d'un support solide pour obtenir un support solide fonctionnalisé de façon covalente par lesdits dendrimères.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que les dendrimères comportent à leur périphérie des fonctions permettant l'accrochage direct par l'intermédiaire d'une liaison covalente de ces derniers sur la surface non préalablement fonctionnalisée dudit support solide.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que les dendrimères comportent à leur périphérie des fonctions thiol et que le support solide comprend une surface d'or.
9. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la surface du support solide utilisé ne comprend pas de fonctions compatibles avec les fonctions périphériques du dendrimère utilisé, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : a) la fonctionnalisation d'au moins une surface d'un support solide par des fonctions aptes à permettre la fixation de dendrimères phosphores possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels, lesdits dendrimères comportant à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre leur fixation sur ladite surface ainsi fonctionnalisée et la fixation ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt ; b) la préactivation éventuelle des fonctions du support pour obtenir une surface fonctionnalisée activée, c) la formation d'une liaison covalente entre lesdits dendrimères et ladite surface fonctionnalisée et éventuellement activée, pour obtenir un support solide fonctionnalisé de façon covalente par lesdits dendrimères.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'étape a) de fonctionnalisation de la surface du support solide est réalisée par silanisation au moyen d'un réactif de silanisation comportant des fonctions aptes à fixer les dendrimères, telles que par exemple des groupements aminé.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé par le fait que le réactif de silanisation est aminé.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait que l'étape de préactivation est réalisée par traitement du support à l'aide d'un agent alcalinisant, pendant une durée comprise entre 2 et 20 minutes.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé par le fait que l'étape de fixation covalente des dendrimères, consiste à : - préparer une solution desdits dendrimères dans un solvant, - mettre ladite solution de dendrimères en contact avec la surface éventuellement fonctionnalisée et éventuellement activée, pendant une durée comprise entre 10 minutes et 24 heures.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 13, caractérisé par le fait qu'à l'issue de l'étape de fixation covalente des dendrimères, les supports sont rincés puis séchés.
15. Utilisation d'un support solide fonctionnalisé par des dendrimères phosphores tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, comme support pour l'immobilisation et/ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée par le fait que les molécules d'intérêt sont des molécules d'acide nucléique, des lipides, des protéines ou leurs partenaires moléculaires.
17. Biopuce ou dendripuce caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par des dendrimères phosphores et tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 5, sur lesquels sont fixées, de façon covalente, des molécules d'intérêt.
18. Biopuce selon la revendication 17, caractérisée par le fait qu'elle est réutilisable.
19. Procédé de préparation d'une biopuce telle que définie à la revendication 17 ou 18, caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en contact un support solide ayant au moins une surface fonctionnalisée par des dendrimères phosphores et comportant à leur périphérie des fonctions aptes à permettre la fixation covalente de molécules d'intérêt avec une solution tampon renfermant des molécules d'intérêt préalablement fonctionnalisées par, ou comportant déjà, un ou plusieurs groupements aptes à former une liaison covalente avec lesdites fonctions périphériques des dendrimères.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions aldéhydes, et que les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions aminé, ou sont préalablement fonctionnalisées par une ou plusieurs fonctions oxyamine (-ONH2) ou hydrazine (-NH-NH2).
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions aminé et que l'étape de fixation des molécules d'intérêt est suivie d'une étape de réduction des fonctions imines.
22. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions thiol, et que les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions thiol ou sont préalablement fonctionnalisées par une ou plusieurs fonctions iodoacétamido (-NHCO-CH2-I).
23. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions aminés, et que les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions aldéhyde, α-oxoaldéhyde, -COOR, -NCS ou -NHS.
24. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions époxyde, et que les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions aminé.
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 24, caractérisé par le fait que la réaction de fixation covalente des molécules d'intérêt sur les dendrilames est réalisée à une température comprise entre 4 et 50°C, pendant une durée comprise entre 2 et 24 heures.
26. Utilisation d'une dendripuce selon la revendication 17 ou 18 comme puces à ADN, à peptides, à polypeptides ou à protéines.
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