WO2003087365A1 - Method of measuring human cyp3a inducibility - Google Patents

Method of measuring human cyp3a inducibility Download PDF

Info

Publication number
WO2003087365A1
WO2003087365A1 PCT/JP2003/004761 JP0304761W WO03087365A1 WO 2003087365 A1 WO2003087365 A1 WO 2003087365A1 JP 0304761 W JP0304761 W JP 0304761W WO 03087365 A1 WO03087365 A1 WO 03087365A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
human
gene
virus
cyp3a
measuring
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/004761
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasushi Yamazoe
Kiyoshi Nagata
Original Assignee
Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US10/510,237 priority Critical patent/US20050142064A1/en
Priority to DE60329746T priority patent/DE60329746D1/de
Priority to AT03717587T priority patent/ATE446507T1/de
Priority to EP03717587A priority patent/EP1496118B1/en
Priority to AU2003227500A priority patent/AU2003227500A1/en
Priority to CA002482841A priority patent/CA2482841A1/en
Application filed by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. filed Critical Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Publication of WO2003087365A1 publication Critical patent/WO2003087365A1/ja
Priority to US11/414,189 priority patent/US20060194248A1/en
Priority to US12/180,822 priority patent/US20090029351A1/en
Priority to US13/079,269 priority patent/US20110229875A1/en
Priority to US13/456,330 priority patent/US20120264112A1/en
Priority to US13/754,006 priority patent/US20130164735A1/en
Priority to US14/136,638 priority patent/US20140127706A1/en
Priority to US14/467,442 priority patent/US20140363810A1/en
Priority to US14/645,835 priority patent/US20150185203A1/en
Priority to US14/875,725 priority patent/US20160025706A1/en
Priority to US15/142,218 priority patent/US20160244848A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90245—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90245—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • G01N2333/90248—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one of the donors, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • G01N2333/90251—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one of the donors, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13 with a definite EC number (1.14.13.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a method and a reagent for simply and accurately measuring the ability to induce human CYP3A, which is a human drug metabolizing enzyme.
  • cytochrome P450 especially CYA
  • CYA cytochrome P450
  • CYP3A inducibility is a characteristic peculiar to a drug, and needs to be measured and evaluated for each drug.
  • the ability to induce CYP3A or CYP3A2, which is CYP3A in rats is measured instead of measuring the ability to induce human CYP3A.
  • the effects of enzymes on drugs differ between humans and animals such as rats, and the pharmacokinetics in humans could not be accurately evaluated.
  • an object of the present invention is to provide a method for simply and accurately measuring the ability to induce human CYP3A during drug administration. Disclosure of the invention
  • the present inventor measured the ability to induce human CYP3A in mice using a virus in which the repo allele gene and the human nuclear receptor PXR (Pregnane X Receptor) gene were incorporated into an adenovirus vector.
  • a virus in which the repo allele gene and the human nuclear receptor PXR (Pregnane X Receptor) gene were incorporated into an adenovirus vector.
  • PXR Pregnane X Receptor
  • the present invention relates to (A) an adenovirus vector, a detectable reporter gene and a human CYP3A gene, in a non-human animal to which a test drug has been administered or in a human cultured cell cultured in a test drug-containing medium.
  • the present invention provides a method for measuring human CYP3A inducibility upon administration of a test drug, which comprises measuring the expression level of a reporter gene in human cultured cells.
  • the present invention provides (a) introducing a plasmid vector into which a detectable reporter gene and at least three or more regions that bind to human PXR in the untranslated region of the human CYP3A gene are integrated.
  • a method for measuring the ability to induce human CYP3A upon administration of a test drug which comprises culturing the transformed human cultured cells in a medium containing the test drug and measuring the expression level of the reporter gene. It is.
  • the present invention provides (A) a virus comprising a detectable reporter gene and at least three or more human PXR-binding regions in the untranslated region of the human CYP3A gene incorporated into an adenovirus vector; ) Adenovirus vector is human It is intended to provide a reagent for measuring human CYP3A inducibility, which contains a virus incorporating the PXR gene.
  • the present invention provides (a) a DNA comprising a detectable repo overnight gene and at least three human PXR-binding regions in the untranslated region of the human CYP3A gene integrated into a plasmid vector.
  • An object of the present invention is to provide a reagent for measuring human CYP3A inducibility, which comprises a transformed human cultured cell introduced.
  • FIG. 1 is a diagram showing the procedure for producing the virus (A) (AdCYP3A4-362-7K) virus.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for producing the virus (B) (AdhPXR) virus.
  • FIG. 3 is a diagram showing a procedure for measuring reporter activity using cultured cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing a procedure for measuring reporter activity using real animals.
  • Figure 5 shows the effect of drugs on reporter activity when cultured cells were infected with the AdCYP3A4-362 virus (DMS0: dimethylsulfoxide, DEX: dexamethasone, RIF: rifampicin, CL0: clotrimazole, Concentration: 10 M).
  • FIG. 6 is a diagram showing the effect of a drug on reporter activity when virus (B) (AdhPXR) and virus (A) (AdCYP3A4-362_7K) are co-infected into cultured cells (DMS0: dimethyl sulfoxide, DEX: dexamethasone, RIF: rifampicin, CL0: clotrimazole, concentration: 10 ⁇ ).
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • DEX dexamethasone
  • RIF rifampicin
  • CL0 clotrimazole, concentration: 10 ⁇ ).
  • FIG. 7 is a diagram showing the effects of drugs on reporter and testosterone 6 / 3-hydroxylation activity in mouse liver to which AdCYP3A4_362 was administered (DEX: dexamethasone, RIF: rifampicin, CL0: clotrimazole, administration Amount: 100mg / kg / dayX3).
  • FIG. 8 is a diagram showing a comparison of the rate of transcription induction by the AdCYP3A4-362 virus (A) (AdCYP3A4-362-7K) when the virus (B) (AdhPXR) is co-administered to mice (CL0: clotrimazole) , Cont: control, dose: 100 mg / kg / day X3).
  • FIG. 9 is a diagram showing the humanization of mouse CYP3A induction by virus (B) (AdhPXR) administration (RIF: rifampicin, Cont: control, dose: 10011 ⁇ 2 / 1 ⁇ / (3).
  • FIG. 10 shows the effect of a drug on reporter activity expressed in the liver of mice to which virus (A) (AdCYP3A4-362-7K) and virus (B) (AdhPXR) were simultaneously administered (DEX: dexamethasone RIF: rifampicin, CL0: clotrimazole, Cont: control, dose: 100 mg / kg / dayX3).
  • FIG. 11 is a diagram showing a procedure for preparing a stable expression strain.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of a drug on the repo overnight activity when a transformed cell (stable expression strain) into which DNA (a) has been introduced.
  • a virus comprising a detectable repo overnight gene and at least three regions of the untranslated region of the human CYP3A gene that bind to human PXR in an adenovirus vector [virus (A)].
  • (B) A virus obtained by incorporating a human MR gene into an adenovirus vector [virus (B)].
  • the adenovirus vector used for the virus (A) and the virus (B) may be an adenovirus vector usually used as a vector for gene therapy, but may be a promoter for eukaryotic cells. Those which do not contain, for example, those in which the initial genes EIA and EIB genes are deleted are preferable.
  • Commercially available adenovirus vectors include Ad5dIX or AdEasy.
  • the detectable reporter gene used for the virus (A) may be any gene that encodes a detectable protein or enzyme.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • GUS i3-Glucuronidase
  • LUS Lus if erase
  • CAT Chloramphenicol acetyl transferase gene and the like.
  • Commercially available reporter genes include GFP, LUS, and CAT.
  • At least three or more of the regions that bind to human PXR in the untranslated region of the human CYP3A gene used in the virus (A) include the 7.7k (dNR-l) region and 362 ( There are three or more sites selected from the ER-6) region, the 7.6-7.4k (MIE) region, and the 7.3k region, and the 7.7k region, the 7.6-7.4k region, and the 362 region are particularly preferable. In the present invention, it is important to use three or more of the regions that bind to human PXR.If only one or two sites are used, the expression of the human CYP3A gene is not sufficient, and human CYP3A induction is not achieved. No ability to measure accurately.
  • human PXR is a Pregnane X Receptor gene, a kind of nuclear receptor, and is known to be involved in the expression of human CYP3A. However, it is not known that three or more sites in the untranslated region of the human CYP3A gene that bind to human PXR are important for human CYP3A expression.
  • human CYP3A examples include human CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, and CYP3A43.
  • CYP3A4 is the most important in drug metabolism, and CYP3A4 is preferable.
  • the virus (A) was prepared by preparing a reporter virus in which at least three or more of the regions that bind to human PXR, for example, the 7.7 k region, the ⁇ .6-7.4 k region, and the 362 region, were linked upstream of the LUC gene. This is performed by inserting this into the EIB gene region of the adenovirus vector.
  • the human PXR gene used for the virus (B) includes human PXR cDNA.
  • the virus (B) is prepared, for example, by inserting the human PXR gene prepared according to the method described in Molecular cloning (Maniatis et al.) Into the E ⁇ gene region of an adenovirus vector.
  • viruses (A) and virus (B) Is introduced into a non-human animal or a cultured human cell cultured in a medium containing the test drug.
  • both viruses need to be introduced so as to function at the same time.
  • these viruses may be introduced as a mixed solution, or one of the viruses may be introduced, and then the other virus may be introduced. Introduce both viruses so that they work at the same time.
  • non-human animal examples include a rat, a mouse, a guinea pig, a heron, a dog, a monkey, and the like, and a rat and a mouse are particularly preferable in terms of experimental operation.
  • Methods of administering the test drug to these non-human animals include intraperitoneal administration as well as clinical administration methods for the test drug.
  • the dose of the test drug may be determined in consideration of the clinical dose.
  • the means for introducing the viruses (A) and (B) into the human animal is preferably performed by intraperitoneal administration, intravenous administration, or the like.
  • human cultured cells examples include HepG2, LS174T, Hela, Caco_2, and the like. HepG2 and LS174T are particularly preferred.
  • the human cultured cells are used as they are or cultured in a medium containing a test drug.
  • the introduction of the viruses (A) and (B) into the human cultured cells is preferably performed by adding the virus to the medium.
  • the transformed human cultured cells used for measuring the human CYP3A inducibility of the present invention can be obtained by introducing the following DNA into human cultured cells.
  • DNA CDNA (a) comprising a plasmid vector and a detectable reporter gene and at least three or more regions that bind to human PXR in the untranslated region of the human CYP3A gene (a)].
  • a vector having a multiple cloning site for example, a vector containing a GFP gene such as pGL3 Basic Vector (Promega) or pDSRed 2-1 (Clont) ech).
  • DNA (a) is prepared by preparing a reporter vector linking at least three or more regions that bind to human PXR, for example, a 7.7 k region, a 7.6 to 7.4 k region, and a 362 region. This is performed by inserting the plasmid vector having the repo overnight gene into the Mlul-Hind III cleavage site region of the multicloning site.
  • plasmids having these regions and the repo all-in-one gene on a straight line were connected in tandem, more preferably 5 or more, particularly preferably 5 to 10
  • DNA is used.
  • this DNA (a) is introduced into cultured human cells.
  • the introduction method is preferably performed, for example, by the calcium phosphate method.
  • Examples of the human cultured cells used include HepG2, LS174T, Hela, Caco-2 and the like, and HepG2 and LS174T are particularly preferred.
  • the selection of the transformed cells carrying the DNA (a) may be determined by measuring the expression level of the reporter gene after subculture.
  • the transformed human cultured cell When using a transformed human cultured cell that retains DNA (a) even when subcultured as described above, the transformed human cultured cell is cultured in a drug-containing medium, and repo overnight-gene expression is performed. By measuring the amount, the ability to induce human CYP3A upon administration of the test drug can be measured.
  • the measurement of repo overnight gene expression in non-human animals can be performed, for example, by administering virus (A) and (B) and measuring repo overnight activity in organs such as liver and spleen 2 to 5 days later. Done.
  • the reporter activity of the liver is determined by homogenizing the excised liver and measuring the reporter activity of the centrifuged supernatant, for example, the fluorescence intensity, the enzyme activity of the reporter, and the like.
  • the expression level of the reporter gene in human cultured cells is measured, for example, by homogenizing the cultured cells 2 to 4 days after introduction of the virus (A) and (B), and measuring the reporter activity of the centrifuged supernatant.
  • human CYP3A-inducing ability can be evaluated by administration of the test drug.
  • an in vivo system using a non-human animal is particularly preferable.
  • the CYP3A4 gene upstream (-362 to +11) was isolated by PCR, treated with the restriction enzymes Bgl II and Hind III, and then promoted without the promoter luciferase.
  • PGL3-CYP3A4-362 inserted into Vector-1 pGU-Basic was prepared.
  • a cosmid vector having this insert and a restriction enzyme-treated adenovirus DNA-TPC were simultaneously introduced into 293 cells, and the desired virus (A) (AdCYP3A4-362-7K) was prepared by homologous recombination in the cells. ( Figure 1).
  • the AdCYP3A4-362 virus was produced, but does not contain the aforementioned -7836 bp to -7208 bp.
  • the hPXR gene was cloned from the human liver cDNA library by PCR and inserted into the Bam HI and Hind III sites of the plasmid pCMV4 containing the CMV promoter (pCMV4-hPXR).
  • the virus mentioned above was cloned from the human liver cDNA library by PCR and inserted into the Bam HI and Hind III sites of the plasmid pCMV4 containing the CMV promoter (pCMV4-hPXR).
  • Virus (B) (AdhPXR) was prepared by the same procedure as (A) (Fig. ⁇ ).
  • the experiment was performed as shown in FIG. That is, the cells were seeded on a 24-well plate at 2.0 ⁇ 10 5 per 1-well, the drug was treated the next day, and the virus was infected the next day, and the cells were collected 48 hours after the virus infection.
  • the collected cells are Reporter Lys is
  • the cells were lysed using Buf fer (RLB), and luciferase activity was measured using the cell lysate.
  • RLB Buf fer
  • the administration of the virus was initially studied by intravenous injection, but in some cases it died several hours after administration due to the toxicity of the virus. Therefore, the administration route was changed to intraperitoneal administration to avoid acute toxicity.
  • the drug was suspended in corn oil and administered intraperitoneally at a dose of 100 mg / kg three times the day before, four hours before, and the next day.
  • the animals were dissected 2 days after virus administration, the organs were excised, homogenized, stretched at 9000 X g, and the luciferase activity was measured using the supernatant (S-9) (Fig. 4).
  • FIG. 5 shows the induction of CYP3A4 by a drug in cultured cells using the AdCYP3A4-362 virus by luciferase activity.
  • Dexamethasone, rifampicin and mouth disol were dissolved in DMS0 and added to the medium at a concentration of 10 M. It is known that all of these drugs induce CYP3A4 when administered to humans. Among them, rifampicin has high species specificity and is known as a typical human CYP3A4 inducer.
  • Dexamethasone is known to induce strong CYP3A species in rats.
  • FIG. 6 shows the results of an in vitro reporter atssay performed using the virus (A) (AdCYP3A4-362-7K) under the same conditions as for the AdCYP3A4-362 virus.
  • Dexamethasone showed little induction, but clotrimazole showed a strong (21-fold) induction response, and rifampicin increased luciferase activity, which was not seen with AdCYP 3 A4-362 virus. (5x).
  • hR was overexpressed by virus (B) (AdhPXR)
  • luciferase activity was increased 10 to 30 times even in cells without drug treatment.
  • induction by drug treatment was enhanced, and luciferase activity was increased three-fold with dexamethasone, whereas rifampicin and clotrimazole were 15-fold and 60-fold, respectively, stronger than those without virus (B) (AdhPXR) infection. Transcription activated.
  • in vivo induction evaluation was examined using ddY male mice.
  • the drug was intraperitoneally administered at a dose of 100 mg / kg once a day for 3 days.
  • the AdCYP3A4-362 virus was first administered intraperitoneally, and two days later, liver weight, luciferase activity in the liver and testosterone 6-hydroxylation activity were measured.
  • Dexamethasone, rifampicin and mouth trimazole were used in suspension in corn oil. Luciferase activity in mouse liver S-9 was increased by administration of all inducers, and the increase in activity was about 5-fold for dexamethasone and rifampicin and about 9-fold for clotrimazole compared to controls.
  • virus (A) (AdCYP3A4-362-7K) and virus (B) (AdhPXR) were simultaneously administered, and the effects of induction by rifampicin and strong expression of PXR were examined.
  • AxCALacZ was administered as a control virus to the virus (B) (AdhPXR) non-administration group in order to adjust the amount of virus to be administered.
  • extremely high (approximately 320-fold) transcriptional activation was observed with the use of virus (B) (AdhPXR) in combination with the control virus group (approximately 9-fold) with rifampicin.
  • mice were co-infected with the virus (AdCYP3A4-362-7K) and virus (B) (AdhPXR), and the three inducers were used. Considered at the same time. The induction of rifampicin was slightly weaker than the other two, but both were strongly induced (Fig. 10).
  • the PCR method was used to amplify and isolate the 5, -flanking region of CYP3A4 from +15 to -362 bp and from -7208 bp to -783 ⁇ from human genomic DNA, and inserted it into the restriction enzyme site of the pGL3-basic vector shown in Figure 11.
  • pCYP3A4-362-7K was treated with restriction enzymes with BamHI to linearize it.
  • a plasmid BFP having a neomycin resistance gene was similarly treated with Bgl II.
  • PCYP3A4-362-7K and BFP were ligated at a ratio of 5: 1.
  • PCYP3A4-362-7K and BFP was transfected into HepG2 cells using the calcium phosphate method.
  • geneticin was used as a marker for selection of stable expression strains, but preliminary experiments were performed in advance to determine the optimal concentration of geneticin. Based on these results, selection was performed with a geneticin concentration of 900 xg / ml.
  • luciferase activity (without inducing agent treatment) was measured. At this point, 8 out of 48 colonies showed activity. Active colonies were passaged in a medium without geneticin using a 10 cm dish. Rifampicin and clotrimazole were treated as inducing agents, and luciferase activity was measured. We also made stocks of these cells.
  • the frozen cell lysate was lysed at room temperature and centrifuged at 4 ° C and 15,000 rpm for 5 minutes.
  • the supernatant 201 was assayed using a Luciferase assay system (Promega, 35 Calories, using a Turner Designs Luminometer Model TD-20 / 20 (Promega)).
  • the ability to induce human CYP3A when a test drug is administered to humans can be easily and accurately evaluated, so that the efficacy, occurrence of side effects, loss of drug efficacy, etc. of the drug can be accurately evaluated. it can.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Length Measuring Devices By Optical Means (AREA)

Description

明 細 書 ヒト CYP3A誘導能の測定法 技術分野
本発明は、 ヒト型薬物代謝酵素であるヒト CYP3Aの誘導能を簡便かつ正確に測 定する方法及び測定試薬に関する。 背景技術
ヒトに投与された種々の薬物は、 肝臓等において種々の代謝を受ける。 かかる 薬物代謝に関与する酵素のうちシトクロム P450、 特に CY Aは、 薬物の有効性、 副作用の発現、 薬効の消失に最も影響を与える酵素であり、 薬物投与時の CYP3A 誘導能の測定は医薬品開発上必須の項目となっている。 そして、 当該 CYP3A誘導 能は、 薬物固有の特性であり、 薬物毎に測定し評価する必要がある。
従来の CYP3A誘導能の測定手段としては、 ヒ卜 CYP3Aの誘導能を測定するのでな く、 ラットにおける CYP3Aである CYP3A1又は CYP3A2の誘導能を測定することによ り行われている。 しかし、 ヒトとラット等の動物では薬物に対する酵素の作用が 異なり、 ヒトにおける薬物動態が正確に評価できなかった。
従って本発明は、 薬物投与時のヒト CYP3A誘導能を簡便かつ正確に測定する方 法を提供することを目的とする。 発明の開示
そこで本発明者は、 アデノウイルスベクターにレポ一夕一遺伝子と、 ヒト核内 レセプター PXR (Pregnane X Receptor)遺伝子を組み込んだウィルスを用いてマウ スにおけるヒト CYP3A誘導能を測定したところ、 良好な測定系が構築できること を見出した。 そしてさらに研究を進めたところ、 （A) アデノウイルスベクター に、 レポーター遺伝子とヒト PXR結合領域の少なくとも 3ケ所以上とを組み込ん だウィルス、 及び （B ) アデノウイルスベクターにヒト PXR遺伝子を組み込んだ ウィルスの 2つのウィルスを導入したヒト培養細胞系（in vi tro)又は非ヒト動物 (in vivo)でレポーターアツセィを行えば、 従来法及び単一プラスミドを用いる 方法に比べて飛躍的に正確にヒト CYP3A誘導能が測定できることを見出した。 ま た、 （a ) プラスミドベクターに、 検出可能なレポ一ター遺伝子と、 ヒト CYP3A 遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上を組み 込んでなる DNAを導入したヒト培養細胞の中には、 継代培養してもその形質を保 持している形質転換細胞が存在し、 これを用いればインビト口におけるヒト CYP3A誘導能の測定が更に容易になることを見出し、 本発明を完成するに至つ た。 '
すなわち、 本発明は、 被検薬物を投与された非ヒト動物又は被検薬物含有培地 で培養されたヒト培養細胞に、 （A) アデノウイルスベクターに、 検出可能なレ ポーター遺伝子と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の 少なくとも 3ケ所以上を組み込んでなるウィルス、 及び (B) アデノウイルスべ クタ一にヒト PXR遺伝子を組み込んでなるウィルスを導入し、 当該非ヒト動物又 はヒト培養細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とす る、 被検薬物投与時のヒト CYP3A誘導能の測定法を提供するものである。
また本発明は、 （a ) プラスミドベクターに、 検出可能なレポ一ター遺伝子 と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒ卜 PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ 所以上を組み込んでなる DNAを導入してなる形質転換ヒト培養細胞を、 被検薬物 含有培地で培養し、 レポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、 被 検薬物投与時のヒト CYP3A誘導能の測定法を提供するものである。
また本発明は、 （A) アデノウイルスベクターに、 検出可能なレポーター遺伝 子と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3 ケ所以上を組み込んでなるウィルス、 及び (B) アデノウイルスベクタ一にヒト PXR遺伝子を組み込んでなるウイルスを含有することを特徴とするヒト CYP3A誘導 能測定試薬を提供するものである。
さらに本発明は、 （a) プラスミドベクタ一に、 検出可能なレポ一夕一遺伝子 と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ 所以上を組み込んでなる DNAを導入してなる形質転換ヒト培養細胞を含有するこ とを特徴とするヒト CYP3A誘導能測定試薬を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 ウィルス （A) (AdCYP3A4- 362- 7K)ウィルスの作製手順を示す図であ る。
図 2は、 ウィルス （B) (AdhPXR)ウィルスの作製手順を示す図である。
図 3は、 培養細胞を用いたレポ一ター活性測定の手順を示す図である。
図 4は、 実動物を用いたレポ一タ一活性測定の手順を示す図である。
図 5は、 培養細胞に AdCYP3A4- 362ウィルスを感染させた場合のレポーター活性 への薬物の影響を示す図である（DMS0:ジメチルスルホキシド、 DEX:デキサメサゾ ン、 RIF:リファンピシン、 CL0:クロトリマゾール、 濃度： 10 M)。
図 6は、 ウィルス （B) (AdhPXR)およびウィルス （A) (AdCYP3A4-362_7K)を 培養細胞に同時感染した場合のレポ一ター活性への薬物の影響を示す図である (DMS0:ジメチルスルホキシド、 DEX:デキサメサゾン、 RIF:リファンピシン、 CL0: クロトリマゾール、 濃度：10 Μ)。
図 7は、 AdCYP3A4_362を投与したマウス肝におけるレポ一ターおよびテストス テロン 6/3-水酸化活性への薬物の影響を示す図である（DEX:デキサメサゾン、 RIF:リファンピシン、 CL0:クロトリマゾール、 投与量： 100mg/kg/dayX3)。
図 8は、 ウィルス （B) (AdhPXR)をマウスに同時投与した場合の AdCYP3A4- 362 ウィルス （A) (AdCYP3A4- 362- 7K)による転写誘導率の比較を示す図である（CL0: クロトリマゾール、 Cont:コントロール、 投与量： 100mg/kg/dayX3)。 図 9は、 ウィルス （B) (AdhPXR)投与によるマウス CYP3A誘導のヒト化を示す 図である（RIF:リファンピシン、 Cont:コントロール、 投与量：1001½/1¾/(^ ズ 3)。
図 10は、 ウィルス (A) (AdCYP3A4-362- 7K)とウィルス (B) (AdhPXR)を同 時投与したマウスの肝に発現するレポーター活性への薬物の影響を示す図である (DEX:デキサメサゾン、 RIF:リファンピシン、 CL0:クロトリマゾ一ル、 Cont:コン トロール、 投与量： 100mg/kg/dayX3)。
図 1 1は、 安定発現株の作製手順を示す図である。
図 12は、 DNA (a) を導入した形質転換細胞 （安定発現株） を用いた場合の レポ一夕一活性への薬物の影響を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のヒト CYP3A誘導能測定法においては、 次の 2つのウィルスが用いられ る。
(A) アデノウイルスベクターに、 検出可能なレポ一夕一遺伝子と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上を 組み込んでなるウィルス 〔ウィルス （A) 〕 。
(B) アデノウイルスベクタ一にヒト MR遺伝子を組み込んでなるウィルス 〔ウィルス （B) 〕 。
ウィルス (A) 及びウィルス (B) に用いられるアデノウイルスベクターとし ては、 通常遺伝子治療用のベクタ一として用いられているアデノウイルスベクタ 一であってもよいが、 真核細胞のプロモータ一ゃェンハンサーを含まないもの、 例えば初期遺伝子 EIA · EIB遺伝子を欠損させたものが好ましい。 市販のアデノウ ィルスベクターとしては、 Ad5dIX又は AdEasyが挙げられる。
ウィルス （A) に用いられる検出可能なレポーター遺伝子としては、 検出可能 なタンパク又は酵素をコ一ドする遺伝子であればよく、 例えば GFP (Green Fluorescent Protein)遺伝子、 GUS ( i3— Glucur oni dase)遺伝子、 LUS (Lus if erase)遺伝子、 CAT (Chloramphenicol acetyl transferase)遺伝子等が挙 げられる。 市販のレポ一ター遺伝子としては GFP、 LUS、 CATが挙げられる。
ウィルス （A) に用いられるヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合 する領域の少なくとも 3ケ所以上としては、 ヒト CYP3A4遺伝子の非翻訳領域中の 7.7k(dNR-l)領域、 362 (ER- 6)領域、 7.6〜7.4k(MIE)領域及び、 7.3k領域から選ば れる 3ケ所以上が挙げられるが、 7.7k領域、 7· 6〜7.4k領域及び 362領域が特に好 ましい。 本発明においては、 このヒト PXRに結合する領域の 3ケ所以上を用いる ことが重要であり 1ケ所又は 2ケ所だけを用いた場合にはヒト CYP3A遺伝子の発 現が十分でなく、 ヒ卜 CYP3A誘導能が正確に測定できない。
ここでヒト PXRは核内レセプ夕一の一種 Pregnane X Receptor遺伝子であり、 ヒ ト CYP3Aの発現に関与することが知られている。 しかし、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻 訳領域中のヒト PXRに結合する領域の 3ケ所以上が、 ヒト CYP3Aの発現に重要であ ることは知られていない。
またヒト CYP3Aとしては、 ヒト CYP3A4、 CYP3A5, CYP3A7及び CYP3A43が挙げられ るが、 CYP3A4が薬物代謝上最も重要であり、 CYP3A4が好ましい。
ウィルス （A) の作製は、 ヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上、 例えば 7.7k領域、 Ί.6〜7.4k領域及び 362領域を LUC遺伝子の上流に連結したレポ 一ターウィルスを作製し、 これをアデノウイルスベクタ一の ΕΙΑ· EIB遺伝子領域 に揷入することにより行われる。
ウィルス （B) に用いられるヒト PXR遺伝子としては、 ヒト PXR cDNAが挙げら れる。
ウィルス (B) の作製は、 例えば Molecular cloning(Maniatisetal)記載の方 法に従って調製したヒト PXR遺伝子をアデノウイルスベクターの ΕΙΑ· EIB遺伝子 領域に挿入することにより行われる。
本発明においては、 これらのウィルス （A) 及びウィルス （B) は、 被検薬物 を投与された非ヒト動物、 又は被検薬物含有培地で培養されたヒト培養細胞に導 入する。 ここで両ウィルスは、 同時に機能するように導入する必要があるが、 こ れらのウィルスを混合液として導入してもよいし、 いずれか一方のウィルスを導 入し、 続いて他方のウィルスを導入して両ウィルスが同時に機能するようにして fcよい。
非ヒト動物としては、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ィヌ、 サル等が 挙げられるが、 実験操作の点からラット、 マウスが特に好ましい。 これらの非ヒ ト動物への被検薬物の投与方法は、 当該被検薬物の臨床における投与手段の他、 腹腔内投与が挙げられる。 また被検薬物の投与量は、 臨床投与量を考慮して決定 すればよい。 当該ヒト動物へのウィルス （A) 及び （B ) の導入手段としては、 腹腔内投与、 静脈投与等により行うのが好ましい。
ヒト培養細胞としては、 HepG2, LS174T, He l a, Caco_2等が挙げられるが、 Hep G2、 LS174Tが特に好ましい。 当該ヒト培養細胞は、 そのまま、 又は被検薬物を含 有する培地で培養したものが用いられる。 当該ヒト培養細胞へのウィルス （A) 及び （B ) の導入は、 培地にウィルスを添加する等により行うのが好ましい。 本発明のヒト CYP3A誘導能測定に用いられる形質転換ヒト培養細胞は、 ヒト培 養細胞に次の DNAを導入することにより得られる。
( a ) プラスミドベクターに、 検出可能なレポーター遺伝子と、 ヒト CYP3A遺 伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上を組み込 んでなる DNA CDNA ( a ) 〕 。
DNA ( a ) に用いられるプラスミドベクタ一としては、 マルチクローニングサ イトを有するベクター、 例えば pGL3 Bas i c Vec t or (pr omega社）、 pDSRed 2-1など の GFP遺伝子を含むベクタ一（C l ont ech社)等が挙げられる。
DNA ( a ) に用いられる検出可能なレポーター遺伝子、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻 訳領域中のヒト MRに結合する領域の少なくとも 3ケ所としては、 いずれも前記 ウィルス （A) に用いられるものが採用できる。 DNA ( a ) の作製は、 ヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上、 例えば 7. 7k領域、 7. 6〜7. 4k領域及び 362領域を連結したレポ一ターベクターを作製し、 これをレポ一夕一遺伝子を有するプラスミドベクターのマルチクローニングサイ トの Mlul-Hind I I I切断サイト領域に挿入することにより行われる。 より強い誘 導能を示すクローンを得るには、 これらの領域及びレポ一夕一遺伝子を直線上に 有するプラスミドをタンデムに複数個、 より好ましくは 5個以上、 特に好ましく は 5〜 10個連結した DNAを用いるのが好ましい。
本発明においては、 この DNA ( a ) をヒト培養細胞に導入する。 導入方法とし ては、 例えばリン酸カルシウム法により行うのが好ましい。
用いられるヒト培養細胞としては、 HepG2、 LS174T、 He la, Caco-2等が挙げら れるが、 HepG2、 LS174Tが特に好ましい。 DNA ( a ) を保持している形質転換細胞 の選択は、 継代培養した後のレポ一ター遺伝子発現量を測定すればよい。
このように継代培養しても DNA ( a ) を保持してなる形質転換ヒト培養細胞を 用いる場合には、 この形質転換ヒト培養細胞を薬物含有培地で培養し、 レポ一夕 —遺伝子の発現量を測定することにより、 被検薬物投与時のヒト CYP3A誘導能が 測定できる。
非ヒト動物におけるレポ一夕一遺伝子発現量の測定は、 例えばウィルス （A) 及び （B) 投与、 2〜5日後に肝臓、 脾臓等の臓器中のレポ一夕一活性を測定す ることにより行われる。 例えば肝臓のレポ一ター活性は、 摘出した肝臓をホモジ ネートし、 その遠心上清のレポ一ター活性、 例えば蛍光強度、 レポ一夕一酵素活 性等を測定することにより行われる。
ヒト培養細胞におけるレポーター遺伝子発現量の測定は、 例えばウィルス (A) 及び （B) 導入 2〜4日後に、 培養細胞をホモジネートし、 その遠心上清 のレポーター活性を測定することにより行われる。
得られたレポーター活性を、 被検薬物非投与群又は被検薬物非含有培地培養群 のそれと対比することにより、 被検薬物投与によりヒト CYP3A誘導能が評価でき る。 ウィルス （A) 及び （B) を用いる本発明測定系のうち、 非ヒト動物を使用 した in vivo系が特に好ましい。 実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明は何らこれに限定 されるものではない。
実施例 1
A. 実験方法
(1) ウィルス （A) の作製
本組換えアデノウイルスの作製にあたり、 まず、 CYP3A4遺伝子上流 (-362 to + 11)を PCR法により単離し、 制限酵素 Bgl II、 Hind IIIで処理した後に、 プロモー 夕一を持たないホ夕ルルシフェラーゼベクタ一 pGU- Basicに挿入した pGL3 - CYP3A4-362を作製した。 次に、 さらに CYP3A4遺伝子上流 dNR- 1および Maj or Inducible Element (MIE)を含む領域 (-7836 bp to -7208 bp)を PCRにより単離サ ブクローニングした後、 pGL3- CYP3A4- 362の Bgl IIおよび Xba Iサイトに揷入し、 PGL3-CYP3A4- 362- 7Kを作製した。 この pGL3- CYP3A4- 362を制限酵素 11111 Iで平滑に 切断して、 コスミドベクター pAxcwを Swa Iにより平滑に切断した部位に組み込ん だ。 このインサートを持つコスミドベクターと制限酵素処理済みアデノウイルス DNA- TPCを 293細胞へ同時に導入し、 細胞内での相同組換えにより、 目的のウィル ス (A) (AdCYP3A4- 362- 7K)を作製した（図 1)。 また、 AdCYP3A4- 362ウィルスも作 製したが、 これは先に述べた- 7836 bpから- 7208 bpを含まないウィルスである。
(2) ウィルス （B) の作製
hPXR遺伝子をヒト肝 cDNAライブラリ一から PCRによりクロ一ニングし、 CMVプロ モータ—をもつプラスミド pCMV4の Bam HI, Hind IIIサイトに揷入した（pCMV4 - hPXR) このプラスミドを Sea Iにより平滑に切断し、 以下、 前述のウィルス
(A) と同様の手順により、 ウィルス （B) (AdhPXR)の作製をおこなった（図 ΐ)。
( 3 ) in vi t roアツセィ
実験は図 3に示したようにおこなった。 すなわち、 細胞を 1ゥエルあたり 2. 0 X 105で 24ゥエルプレートに播き、 翌日に薬物処理、 翌々日にウィルス感染をおこ ない、 ウィルス感染 48時間後に細胞を回収した。 回収した細胞は Repor ter Lys i s
Buf fer (RLB)を用いて溶解し、 その細胞溶解液を用いてルシフェラーゼ活性の測 定をおこなった。
4 ) in vivoアツセィ
ウィルスの投与法は、 当初尾静注を検討したが、 ウィルスの毒性のために投与 後数時間で死亡するケースが見られた。 そのため投与経路を腹腔内投与に変更し 急性毒性を回避した。 薬物はコーン油に懸濁し、 100mg/kgの用量で腹腔内にウイ ルス投与前日、 4時間前、 翌日の 3回投与した。 動物をウィルス投与 2日後に解剖 して臓器を摘出し、 ホモジナイズ後 9000 X gにて延伸しその上清（S-9)を用いて ルシフェラーゼ活性の測定をおこなった（図 4)。
B . 実験結果
図 5に、 AdCYP3A4- 362ウィルスを用いて培養細胞での薬物による CYP3A4の誘導 をルシフェラ一ゼ活性で示した。 デキサメサゾン、 リフアンピシンおよびク口ト リマゾ一ルは DMS0に溶解し、 10 Mの濃度で培地に添加した。 これらの薬物をヒ トに投与した場合、 何れも CYP3A4の誘導を引き起こすことが知られているが、 中 でもリフアンピシンは種特異性が高く、 代表的なヒト型 CYP3A4誘導剤として知ら れている。 一方、 デキサメサゾンは、 ラットで強い CYP3A分子種の誘導を引き起 こすことが知られている。
ヒ卜肝ガン由来培養細胞ではルシフェラーゼ活性の上昇がク口トリマゾールぉ よびデキサメサゾン処理によって認められたが、 リフアンピシン処理ではその作 用は観察されなかった。 その上昇レベルはクロトリマゾ一ルで約 8倍、 デキサメ サゾンで約 2倍であった。 図 6に、 ウィルス （A) (AdCYP3A4- 362- 7K)を用いて、 AdCYP3A4- 362ウィルスと 同じ条件で行った in vi troレポーターアツセィの結果を示した。 デキサメサゾン ではほとんど誘導はみられなかったが、 クロトリマゾ一ルで強い（21倍)誘導応答 がみられ、 AdCYP 3 A4-362ウィルスではみられなかったリファンピシンによるルシ フェラ一ゼの活性上昇がみられた（5倍）。 これにウィルス （B) (AdhPXR)により h Rを強発現させたところ、 薬剤無処置の細胞でも 10〜30倍のルシフェラーゼ活 性の上昇がみられた。 さらに薬物処理による誘導も増強され、 デキサメサゾンで のルシフェラーゼ活性の上昇は 3倍であつたが、 リファンピシンとクロトリマゾ ールはそれぞれ 15倍、 60倍とウィルス （B) (AdhPXR)非感染群よりも強く転写活 性化された。
次に ddY系雄性マウスを用いて、 in vivoでの誘導評価検討を行った。 薬物は 100mg/kgの用量で 1日 1回 3日間腹腔内投与した。 2回目の薬物投与後 4時間に、 ま ず、 AdCYP3A4- 362ウィルスを腹腔内に投与し、 2日後に肝臓重量、 肝臓中のルシ フェラーゼ活性およびテストステロン 6 水酸化活性を測定した。 デキサメサゾ ン、 リフアンピシンおよびク口トリマゾールはコーン油に懸濁して使用した。 マ ウス肝臓 S- 9中のルシフェラ一ゼ活性が全ての誘導剤投与によって上昇し、 その 活性上昇はコントロールに対してデキサメサゾンおよびリファンピシンで約 5 倍、 クロトリマゾールでは約 9倍であった。 また、 肝臓の相対重量増加およびテ ストステロン 6 )3 -水酸ィヒ活性の上昇がいずれの誘導剤処理群においても認められ た。 誘導剤処理したマウス肝臓におけるテストステロン 63 -水酸化活性とルシフ エラ一ゼ活性上昇とはよく相関していた（図 7)。
培養細胞においてウィルス （A) (AdCYP 3A4- 362- 7K)とウィルス （B ) (AdhPXR)の共感染で薬物により誘導が認められていることから、 これを感染させ て AdCYP3A4- 362ウィルスとウィルス (A) (AdCYP3A4- 362- 7K)のクロトリマゾー ルによる誘導の強弱を検討したところ、 細胞での結果と同様にウィルス （A) (AdCYP3A4-362-7K)感染マウスでより高い転写活性化が認められ、 その誘導率は 細胞の場合よりも著しいものであった（1000倍）（図 8)。
次に、 ウィルス （A) (AdCYP3A4- 362-7K)とウィルス （B ) (AdhPXR)を同時に 投与して、 リファンピシンによる誘導と PXR強発現による影響を検討した。 ウイ ルス （B) (AdhPXR)非投与群には投与ウィルス量を合わせるために、 コントロー ルウイルスとして AxCALacZを投与した。 その結果リフアンピシンでコントロール ウィルス群 (約 9倍）に対し、 ウィルス （B) (AdhPXR)併用で非常に高い（約 320倍） 転写活性化がみられ、 ヒト PXRを発現させることによりマウス肝臓において、 リ フアンピシン投与によるヒト型の CYP3A4誘導を見ることが可能となつた（図 9)。 さらに、 デキサメサゾン、 リファンピシン、 クロトリマゾ一ルの誘導剤としての 作用を比較するために、 ウィルス（AdCYP3A4-362- 7K)とウィルス (B) (AdhPXR) をマウスに共感染させ、 3種の誘導剤を同時に検討した。 リファンピシンは他の 二つに比べその誘導は若干弱いものの、 何れも強い誘導がみられた（図 10)。 実施例 2
( 1 ) 安定発現株の単離
PCR法によりヒトゲノミツク DNAから CYP3A4の 5， -フランキング領域 +15から- 362 bpおよび- 7208bpから- 783 ρまでを増幅単離し、 図 11に示した pGL3- Bas i c vectorの制限酵素サイトに揷入して PCYP3A4-362-7Kを作成した。 pCYP3A4- 362- 7K を BamH Iで制限酵素処理を行い直線化した。 ネオマイシン耐性遺伝子を持つブラ スミド BFPを同様に Bgl I I処理した。 PCYP3A4- 362-7Kと BFPをそれぞれ 5 : 1の割合 でライゲ一ションした。 この PCYP3A4-362- 7Kと BFPのコンストラクトを HepG2細胞 にリン酸カルシウム法を用いてトランスフエクトした。 この際、 安定発現株のセ レクションのマ一カーとしてゲネチシンを用いたが、 このゲネチシンの最適濃度 を決定するためにあらかじめ予備実験を行つた。 この結果よりゲネチシンの濃度 を 900 x g/mlにしてセレクションを行った。 トランスフエクトしてから 14日後、 生成したコロニーを一つずつ 24ゥエルプレートに移し、 ゲネチシンのないメディ ゥム中で更に 1週間ィンキュベートした。 このコロニーを適量のメディゥムを入 れたエツペンドルフチューブにとり、 ピペッティングで懸濁し、 新しい 24ゥエル プレート 2枚に移した。 上記の 24ゥエルプレートがコンフレントになったところ でルシフェラーゼ活性 (誘導剤処理せず)を測定した。 この時点で活性が現れたの は 48コロニー中 8コロニーだった。 活性が現れたコロニーについて、 10cmデイツ シュを用いゲネチシンのないメディウム中で継代した。 リファンピシン、 クロト リマゾ一ルを誘導剤として処理し、 ルシフェラーゼ活性を測定した。 また、 これ らの細胞のストックも作成した。
(2) 細胞培養条件
24ゥエルプレートに l.OXlOVwellで細胞をまく。 翌日、 誘導剤の入ったメデ ィゥムに交換し、 更に 24時間インキュベートする。 誘導剤は DMS0にて希釈し、 最 終濃度が 10 Mとなるよう添加した後、 2日間培養しルシフエラーゼ活性を測定し た。
(3) 細胞の溶解
培地を取り除き、 PBSにて洗浄する。 適量の PBSを加え、 細胞を剥がして回収し た。 4^、 15,000rpmで 5分間遠心し、 上清を取り除いた後、 Reporter Lysis Buffer (Primega)を 100ml加え、 十分に攪拌した後、 - 80°Cで 6時間以上保存した。
(4) ルシフェラーゼ活性の測定
凍結した細胞溶解液を室温で溶解し、 4°C、 15，000rpmで 5分間遠心した。 上清 20 1に Luciferase assay system(Promega を 35 1カロえて Turner Des ingns Luminometer Model TD- 20/20 (Promega)を使用して行った。
測定条件 Delay t ime:3sec
Integrate t ime: 60sec
Sensitivity:60.1%
得られた値はタンパク定量 (Bradford法）を行い、 タンパク量で補正した。 結果 を図 12に示す。
その結果、 安定に継代培養できる形質転換細胞を用いて、 種々の薬物によるヒ ト CYP 3 A誘導能が i n v i t r oで測定できることがわかった。 産業上の利用可能性
本発明方法によれば、 ヒトに被検薬物を投与したときのヒト CYP3A誘導能が簡 便かつ正確に評価できることから、 当該薬物の有効性、 副作用の発現、 薬効の消 失等が正確に評価できる。

Claims

請求の範囲
1 . 被検薬物を投与された非ヒト動物又は被検薬物含有培地で培養されたヒト 培養細胞に、 （A) アデノウイルスベクターに、 検出可能なレポーター遺伝子 と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ 所以上を組み込んでなるウィルス、 及び ( B ) アデノウイルスベクターにヒ卜 PXR遺伝子を組み込んでなるウィルスを導入し、 当該非ヒト動物又はヒト培養細 胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、 被検薬物投 与時のヒト CYP3A誘導能の測定法。
2 . ( a ) プラスミドベクターに、 検出可能なレポーター遺伝子と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上を 組み込んでなる DNAを導入してなる形質転換ヒト培養細胞を、 被検薬物含有培地 で培養し、 レポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、 被検薬物投 与時のヒト CYP3A誘導能の測定法。
3 . (A) アデノウイルスベクタ一に、 検出可能なレポーター遺伝子と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上を 組み込んでなるウィルス、 及び （B ) アデノウイルスベクターにヒト PXR遺伝子 を組み込んでなるウィルスを含有することを特徴とするヒト CYP3A誘導能測定試
4 . ( a ) プラスミドベクターに、 検出可能なレポーター遺伝子と、 ヒト CYP3A遺伝子の非翻訳領域中のヒト PXRに結合する領域の少なくとも 3ケ所以上を 組み込んでなる DNAを導入してなる形質転換ヒト培養細胞を含有することを特徴 とするヒト CYP3A誘導能測定試薬。
PCT/JP2003/004761 2002-04-15 2003-04-15 Method of measuring human cyp3a inducibility WO2003087365A1 (en)

Priority Applications (16)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/510,237 US20050142064A1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 Method of measuring human cyp3a inducibility
DE60329746T DE60329746D1 (de) 2002-04-15 2003-04-15 Verfahren zur messung der induzierbarkeit von menschlichem cyp3a
AT03717587T ATE446507T1 (de) 2002-04-15 2003-04-15 Verfahren zur messung der induzierbarkeit von menschlichem cyp3a
EP03717587A EP1496118B1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 Method of measuring human cyp3a inducibility
AU2003227500A AU2003227500A1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 Method of measuring human cyp3a inducibility
CA002482841A CA2482841A1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 Method of measuring human cyp3a inducibility
US11/414,189 US20060194248A1 (en) 2002-04-15 2006-05-01 Method of measuring human CYP3A inducibility
US12/180,822 US20090029351A1 (en) 2002-04-15 2008-07-28 Method of measuring human cyp3a inducibility
US13/079,269 US20110229875A1 (en) 2002-04-15 2011-04-04 Method of measuring human cyp3a inducibility
US13/456,330 US20120264112A1 (en) 2002-04-15 2012-04-26 Method of measuring human cyp3a inducibility
US13/754,006 US20130164735A1 (en) 2002-04-15 2013-01-30 Method of measuring human cyp3a inducibility
US14/136,638 US20140127706A1 (en) 2002-04-15 2013-12-20 Method of measuring human cyp3a inducibility
US14/467,442 US20140363810A1 (en) 2002-04-15 2014-08-25 Method of measuring human cyp3a inducibility
US14/645,835 US20150185203A1 (en) 2002-04-15 2015-03-12 Method of measuring human cyp3a inducibility
US14/875,725 US20160025706A1 (en) 2002-04-15 2015-10-06 Method of measuring human cyp3a inducibility
US15/142,218 US20160244848A1 (en) 2002-04-15 2016-04-29 Method of measuring human cyp3a inducibility

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-112364 2002-04-15
JP2002112364A JP2003304896A (ja) 2002-04-15 2002-04-15 ヒトｃｙｐ３ａ誘導能の測定法

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/510,237 A-371-Of-International US20050142064A1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 Method of measuring human cyp3a inducibility
US11/414,189 Continuation US20060194248A1 (en) 2002-04-15 2006-05-01 Method of measuring human CYP3A inducibility

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003087365A1 true WO2003087365A1 (en) 2003-10-23

Family

ID=29243314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/004761 WO2003087365A1 (en) 2002-04-15 2003-04-15 Method of measuring human cyp3a inducibility

Country Status (8)

Country Link
US (11) US20050142064A1 (ja)
EP (1) EP1496118B1 (ja)
JP (1) JP2003304896A (ja)
AT (1) ATE446507T1 (ja)
AU (1) AU2003227500A1 (ja)
CA (1) CA2482841A1 (ja)
DE (1) DE60329746D1 (ja)
WO (1) WO2003087365A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006018270A1 (en) * 2004-08-20 2006-02-23 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Cytochrome p450 induction assay

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7759541B2 (en) 2004-12-13 2010-07-20 Iti Life Sciences Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity
US9237294B2 (en) 2010-03-05 2016-01-12 Sony Corporation Apparatus and method for replacing a broadcasted advertisement based on both heuristic information and attempts in altering the playback of the advertisement
US20150284812A1 (en) 2012-10-19 2015-10-08 National University Corporation Tottori University Method for evaluating both induction of drug-metabolizing enzyme and cytotoxicity, and vector and cell for use in said method

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001018013A1 (en) 1999-09-08 2001-03-15 Metabasis Therapeutics, Inc. Prodrugs for liver specific drug delivery
WO2001020025A2 (en) 1999-09-10 2001-03-22 Epidauros Biotechnologie Ag Polymorphisms in the human cyp3a4 and cyp3a7 genes and their use in diagnostic and therapeutic applications
WO2002008451A2 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Epidauros Biotechnologie Ag Assay for screening compounds for inducing drug metabolizing enzymes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001018013A1 (en) 1999-09-08 2001-03-15 Metabasis Therapeutics, Inc. Prodrugs for liver specific drug delivery
WO2001020025A2 (en) 1999-09-10 2001-03-22 Epidauros Biotechnologie Ag Polymorphisms in the human cyp3a4 and cyp3a7 genes and their use in diagnostic and therapeutic applications
WO2002008451A2 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Epidauros Biotechnologie Ag Assay for screening compounds for inducing drug metabolizing enzymes

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FURUKAWA M. ET AL., BIOCHEM., vol. 131, no. 1, January 2002 (2002-01-01), pages 71 - 78
FURUKAWA M. ET AL.: "Adenovirus vector-mediated reporter system for in vivo analyses of human CYP3A4 gene activation", J. BIOCHEM., vol. 131, no. 1, January 2002 (2002-01-01), TOKYO, pages 71 - 78, XP002969418 *
GOODWIN B. ET AL., MOL. PHARMACOL., vol. 56, no. 6, 1999, pages 1329 - 1339
GOODWIN B. ET AL.: "The orphan human pregnane X receptor mediates the transcriptional activation of CYP3A4 by rifampicin through a distal enhancer module", MOL. PHARMACOL., vol. 56, no. 6, 1999, pages 1329 - 1339, XP002227854 *
HOKOKUSHU, vol. 15, 2001, pages 108 - 109
NAGATA K. ET AL., XENOBIO. METABOL. AND DISPOS., vol. 16, no. 5, 2001, pages 485 - 490
NAGATA K. ET AL.: "Molecular mechanism of human CYP3A4 induction", XENOBIO. METABOL. AND DISPOS., vol. 16, no. 5, 2001, pages 485 - 490, XP002969417 *
PASCUSSI J.M. ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 260, no. 2, 1999, pages 3277 - 381
PASCUSSI J.M. ET AL.: "Evidence for the presence of a functional pregnane X receptor response element in the CYP3A7 promoter gene", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 260, no. 2, 1999, pages 3277 - 381, XP000907111 *
SAVAS U. ET AL.: "Drug Metabolism and Disposition;", THE BIOLOGICAL FATE OF CHEMICALS., vol. 28, no. 5, May 2000 (2000-05-01), pages 529 - 537
TAKESHITA A. ET AL., EUROPEAN JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY/EUROPEAN FEDERATION OF ENDOCRINE SOCIETIES, vol. 145, no. 4, October 2001 (2001-10-01), pages 513 - 517
YASUSHI YAMAZOE: "Yakubutsu taishano no kojinsa no gen'in to naru kakunai tensha chosetsukei no kaiseki to sono yosoku", UEHARA KINEN SEIMEI KAGAKU ZAIDAN KENKYU HOKOKUSHU, vol. 15, 2001, pages 108 - 109, XP002969416 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006018270A1 (en) * 2004-08-20 2006-02-23 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Cytochrome p450 induction assay

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003304896A (ja) 2003-10-28
US20090029351A1 (en) 2009-01-29
US20140127706A1 (en) 2014-05-08
CA2482841A1 (en) 2003-10-23
US20110229875A1 (en) 2011-09-22
US20050142064A1 (en) 2005-06-30
US20130164735A1 (en) 2013-06-27
ATE446507T1 (de) 2009-11-15
US20160244848A1 (en) 2016-08-25
US20140363810A1 (en) 2014-12-11
AU2003227500A1 (en) 2003-10-27
EP1496118A1 (en) 2005-01-12
EP1496118A4 (en) 2006-10-18
DE60329746D1 (de) 2009-12-03
US20060194248A1 (en) 2006-08-31
US20120264112A1 (en) 2012-10-18
EP1496118B1 (en) 2009-10-21
US20150185203A1 (en) 2015-07-02
US20160025706A1 (en) 2016-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6555674B2 (en) JeT promoter
Roy et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models
FR2737222A1 (fr) Nouveaux vecteurs viraux et lignee pour la therapie genique
US6653132B1 (en) IRES sequences with high translational efficiency and expression vectors containing the sequence
Morley et al. Transcriptional repression of a hormone-responsive promoter
WO2013142380A1 (en) Oncovector nucleic acid molecules and methods of use
Colinas et al. Extrachromosomal recombination in vaccinia-infected cells requires a functional DNA polymerase participating at a level other than DNA replication
US20160244848A1 (en) Method of measuring human cyp3a inducibility
Marden et al. Role of activator protein-1 in the down-regulation of the human CYP2J2 gene in hypoxia
May et al. Targeting gene expression to haemopoietic stem cells: a chromatin‐dependent upstream element mediates cell type‐specific expression of the stem cell antigen CD34.
Lu et al. Interleukin-12 p40 promoter activity is regulated by the reversible acetylation mediated by HDAC1 and p300
Kimchi-Sarfaty et al. In vitro-packaged SV40 pseudovirions as highly efficient vectors for gene transfer
Houglum et al. LAP (NF-IL6) transactivates the collagen alpha 1 (I) gene from a 5'regulatory region.
JP6787794B2 (ja) 細胞の増殖非依存的検出
Hakki et al. Resistance to maribavir is associated with the exclusion of pUL27 from nucleoli during human cytomegalovirus infection
AU726014B2 (en) Cell-based drug screens for regulators of gene expression
CA2341775A1 (fr) Systeme d'expression inductible
WO2002037077A2 (en) Screening methods based on transcriptional regulation analysis system using transformed cell lines
Taniguchi et al. Drug-induced down-regulation of topoisomerase I in human epidermoid cancer cells resistant to saintopin and camptothecins
US7863251B2 (en) Hepatic stellate cell specific promoter and uses thereof
AU2002230752B8 (en) Compositions and methods for the discovery and selection of biological information
WO2002034881A2 (en) Compositions and methods for the discovery and selection of biological information
AU2002230752A1 (en) Compositions and methods for the discovery and selection of biological information

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003717587

Country of ref document: EP

Ref document number: 10510237

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2482841

Country of ref document: CA

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003717587

Country of ref document: EP