WO2003080846A1 - Procede de production de vecteurs lentiviraux a haut titre - Google Patents

Procede de production de vecteurs lentiviraux a haut titre Download PDF

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WO2003080846A1
WO2003080846A1 PCT/FR2003/000916 FR0300916W WO03080846A1 WO 2003080846 A1 WO2003080846 A1 WO 2003080846A1 FR 0300916 W FR0300916 W FR 0300916W WO 03080846 A1 WO03080846 A1 WO 03080846A1
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vector
lentiviral
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PCT/FR2003/000916
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Philippe Moullier
Didier Negre
François-Loîc COSSET
Sylvie Saleun
Ghislaine Duisit
Original Assignee
Universite De Nantes
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing high titer lentiviral vectors, and for establishing cell lines highly producing lentiviral particles in a stable or transient manner. It also relates to a kit allowing lentiviral packaging, as well as to a kit for establishing a lentivirus producing line.
  • Lentiviral vectors currently appear to be particularly interesting vectors for gene therapy, due to their ability to infect quiescent cells and to integrate into the cell genome. Indeed, one of the objectives of gene transfer therapy is the stable modification of the target cells, preferably by administration of the vector in vivo.
  • lentiviral vectors present additional difficulties compared to the production of retroviral vectors such as those derived from Moloney virus, due to the cytotoxic and cytostatic properties of certain lentiviral proteins.
  • retroviral vectors such as those derived from Moloney virus
  • packaging lines for the production of lentiviral vectors have been described.
  • the recombinant lentiviral genome is integrated by transduction of packaging cells with transiently produced vectors. Under these conditions, preparations for securities of the order of 10 6 transduction units (TU) / ml were obtained, corresponding to 1-2.5 TU / cell.
  • TU transduction units
  • the present invention aims to provide tools to those skilled in the art for obtaining rapid and high-yield production of lentiviral particles carrying a transgene of interest and under satisfactory safety conditions.
  • the terms used will have the following definitions:
  • a “vector” designates a composition or a molecule capable of transfecting, transducing or infecting a cell, thus allowing said cell to express sequences carried by the vector.
  • a vector comprises a nucleic acid (generally DNA or RNA) and, where appropriate, elements intended to facilitate the entry of the nucleic acid into the cell, such as a viral particle, polycationic lipids, etc. Throughout the text, and in order to lighten the latter, it is understood that when it comes to the viral vector, it will be necessary to understand both the nucleic acid carrying viral sequences, which can be administered by transfection to the cell. target, as the recombinant virus containing a genome carrying the same sequences, capable of transducing the target cell.
  • the "transfer” of a nucleic acid sequence into a cell collectively refers to the transfection, transduction, and infection of said cell.
  • transfection when the vector does not contain a viral particle (for example, when the vector is a plasmid).
  • transduction is used to denote gene transfer by a defective or non-defective viral particle, while the term “infection” is normally reserved for cases where the virus transduces the cell and replicates without the help of auxiliary vectors.
  • the term “infection” will sometimes be used to describe the transduction of cells by a non-replicating recombinant virus. Similarly, it will be said that a virus is “infectious” since it is capable of transducing the target cells, even when this virus is defective and that it does not lead to an infection proper.
  • transgene designates any sequence coding for a structural protein or an enzymatic protein or combination of genes the expression of which is sought in a target cell for any reason whatsoever.
  • transgene can also denote a non-coding sequence, for example an antisense sequence of a gene whose expression is desired to be reduced, or a sequence whose transcription will lead to the synthesis of a ribozyme.
  • a "defective virus, or a” defective viral particle is a virus or viral particle incapable of autonomous replication in its natural host. Thereafter, when the context makes it obvious that a virus or a viral particle is defective, this term will be omitted (for example, a defective recombinant adenovirus, intended to transfer a gene into a cell, could be qualified as “recombinant adenovirus” or even simply as “adenovirus”).
  • the cells “COS” designate here the cell lines obtained by transformation of monkey kidney cells by a mutant SV-40 defective, and available in many laboratories and cell culture collections. This term notably designates the COS-1 and COS-7 lines, but also, by extension, any line derived from COS cells by subcloning, possibly after integration of exogenous sequences into their genome.
  • the present invention relates firstly to methods for producing lentiviral vectors, in particular vectors derived from SIV or HIV, as well as to methods for establishing a cell line capable of producing high titer lentiviral particles and under satisfactory security conditions.
  • transient production which is more flexible and faster, allowing the day after transfection of the target cells with the plasmids carrying the packaging functions and the vector, to collect a supernatant.
  • this approach makes it possible to achieve titers only of the order of 10 5 infectious particles per ml.
  • the inventors have therefore sought to provide a system which makes it possible, on the one hand, to quickly select a good producer cell line and, on the other hand, to produce defective lentiviral particles with high titer carrying the transgene and without the emergence of virus competent for the replication, and this:
  • lentiviral vectors the technology for producing retroviral vectors mediated by adenovirus, described in (Duisit, Salvetti et al. 1999) and in the patent application 99923697.9 mentioned above (Example 1). In doing so, they demonstrated that the VERO and COS cell lines were particularly capable of producing recombinant lentiviral particles at high titers ( Figure 2).
  • transduction of these cells by a set of adenoviral vectors carrying on the one hand, the genome of a lentiviral vector and, on the other hand, the lentiviral functions necessary for the packaging and the sequence of a glycoprotein d the viral envelope (env) made it possible to obtain titers close to 10 7 transduction units (TU) / ml, before concentration of the supernatant.
  • COS and VERO cells also have the advantage of being acceptable in terms of biosafety with a view to clinical production of vectors for gene therapy. Also provided are methods of producing stable cell lines derived from COS and VERO cells and capable of producing lentiviral vectors at high titers. The producer cells obtained also form part of the invention. Detailed description of the invention ( Figure 3):
  • the invention relates to a method for producing recombinant lentiviruses carrying genes of interest, in a capacity equal to or greater than
  • a variant of the above method comprises the following steps:
  • step (iii) culture of these cells in a medium suitable for the production of recombinant lentivirus.
  • This variant in fact corresponds to the first method described above, in which steps (a) and (c) are combined, or in which the line selected in step (a) stably expresses gag-pol, env and rev, and step (c) is removed.
  • the gag-pol and rev sequences are SIV sequences.
  • it may be sequences of other lentiviruses, for example human (HIV), equine (EIAV), goat (CAEV), sheep (WM), cattle (BIV), or feline (IVF) lentiviruses.
  • the vectors or the viruses of step (c) are recombinant adenoviruses.
  • adenovirus of adenoviral vector
  • the functional equivalents of these viruses or of these vectors can be understood in the same way.
  • any other non-integrative virus must be considered as a functional equivalent of such a virus.
  • any virus capable of infecting a target cell with a low multiplicity of infection and capable of expressing, in said target cell, one or more sequences carried by its genome must be considered as a functional equivalent of the adenovirus.
  • baculovirus or baculoviral vectors could be used in the same way as adenoviruses.
  • An adenovirus or adenoviral vector carrying lentiviral sequences are called adeno-lentivirus or adenolentiviral vector.
  • adeno-lentiviruses usable in the methods of the invention will always be selected by: - the titration of the lentiviral supernatants obtained after infection of the producer cells, and its optimization as a function of the multiplicity of adenoviral infections;
  • the invention therefore also relates to a method as described above, in which the viruses and / or vectors used in step (c) are devoid of the tat sequence.
  • step (b) an additional adatovirus expressing tat will be used for production (FIG. 2).
  • VSV-G vesicular stomatitis virus
  • GLV vesicular stomatitis virus
  • RD 114 the envelope glycoprotein of the gibbon leukemia virus
  • the inventors have also constructed lentiviral vectors using the hemagglutinin of avian flow plate virus (FPV) as an envelope protein.
  • FPV hemagglutinin of avian flow plate virus
  • a person skilled in the art can, as for retroviral vectors in general, modify the envelope by insertion of specific ligands of certain cell types (Martin, Kupsch et al. 1998). To infect only target cells, it is also possible to restrict viral tropism by mutating the envelope glycoproteins in areas essential for binding to the cell membrane (Gordon and Anderson 1994).
  • the gag-pol, rev and env sequences introduced in step (c) are carried by at least two different viral constructs and / or vectors.
  • This separation of the different sequences has advantages both in terms of security (to avoid the appearance, by recombination, of particles competent for replication, or RCR), and in terms of the flexibility of the system. Indeed, if env is carried by a separate vector, it is possible to vary the tropism of the retrovirus produced by the cells by varying the origin of the env gene introduced, which is longer to implement when the different functions are carried by the same vector.
  • gag-pol sequence is present either alone or in the same vector as tat. It is also possible to include env and rev in the same vector, or on the contrary to place them in two distinct vectors.
  • the lentiviral vector, in step (b), can also be carried by a recombinant adenovirus. It includes the elements necessary in cis for a lentiviral vector, that is to say regulatory sequences including the LTR, the packaging sequence ⁇ or a functional equivalent, the cPPT (central polypurine tract) and the RRE sequence (rev response element), or functional equivalents of these sequences.
  • the U3 region of the 5 'LTR is preferably replaced by the CMV promoter. It is also possible to delete all or part of the promoter and activator functions of the U3 domain of the LTR 3 '.
  • steps b) and c) can be simultaneous or successive (FIG. 3).
  • the vectors carrying the genome of the lentivector, on the one hand, and the sequences necessary for its packaging, on the other hand, can be transferred simultaneously.
  • the COS or VERO cells are first transfected or transduced by the vector carrying the lentiviral vector (step (b)). Then, after a fortnight, after stable integration of said vector into the cell genome, the cells are infected or transfected with the recombinant adenoviruses or the vectors carrying the structural genes of the lentivirus (step (c)). In this implementation of the method of the invention, step (b) precedes step (c).
  • step (c) it may be advantageous for at least part of step (c) to precede step (b).
  • part or all of the sequences necessary for packaging is integrated into the genome of COS or VERO cells, preferably under the control of inducible promoters.
  • the production of the vectors will then be carried out by the transfer into these cells of the lentiviral vector, the induction of the promoters directing the expression of the integrated sequences and, if necessary, the contribution of the functions necessary for the packaging and not yet integrated in the cell.
  • steps (b) and (c) are broken down as follows:
  • Steps (b) and (c2) can be simultaneous or successive.
  • gag-pol is under the control of the CMV promoter and rev under the control of the HMG promoter.
  • the transgene is under the control of the promoter EF1 ⁇ .
  • the present invention also relates to a process for obtaining a cell line capable of producing lentiviral particles, at a titer greater than 5.10 6 IU / ml and comprising the steps of:
  • the gag-pol, and rev sequences are SIV sequences.
  • the vectors or the viruses of step (c) are recombinant adenoviruses.
  • the viruses and / or vectors used in step (c) are preferably devoid of the tat sequence.
  • step (c) does not involve adenovirus
  • a vector or virus carries the sequence tat.
  • Methods for obtaining cells producing preferred lentiviral vectors according to the invention use, as an env sequence, the G protein gene of VSV-G or amphotropic envelopes "10 A1" or "4070A", or the hemagglutinin of the virus avian flow plate virus (FPV).
  • gag-pol, rev and env sequences are preferably carried by at least two different viral constructs or vectors in step (c) of the processes for obtaining vector producer cells.
  • lentiviral lentiviral
  • the present invention also relates to a method as described above, for the establishment of a stable line producing lentiviral vectors, characterized in that at least part of the gag-pol, rev and env sequences are integrated into the cell genome during step (c).
  • the invention also relates to cell lines producing lentiviral vectors and derived from COS or VERO cells.
  • a particular cell line of the invention comprises gag-pol, and rev sequences of SIV and an env sequence of enveloped virus envelope glycoprotein. It is preferably capable of producing lentiviral particles at a titer equal to or greater than 5.10 6 IU / ml.
  • a cell line obtained by steps (a) and (c) of the methods for obtaining described producer lines is an integral part of the present invention.
  • a particular line is obtained by steps (a) and (d) described above. It is therefore a line derived from COS or VERO cells and comprising the gag-pol and rev sequences of SIV integrated into its genome.
  • the cytotoxic or cytostatic sequences necessary for the packaging of the vectors are preferably placed under the control of inducible or repressible promoters.
  • inducible promoter is preferred, since it does not require the systematic addition of the repressor to the culture medium when the cells are cultured.
  • inducible promoters which can be used, mention may be made of tet / ON or ecdysome-dependent systems.
  • the env sequence is placed under the control of an inducible promoter.
  • kits for the production of lentiviral particles carrying a transgene comprising at least: (a) one or more containers containing cells derived from COS or VERO comprising gag-pol and rev sequences of SIV,
  • c one or more receptacles containing a lentiviral vector comprising multiple restriction sites allowing the insertion of a transgene, an encapsidation sequence, an RRE sequence and a cPPT sequence, and lacking the genes of the lentivirus structure, said vector being carried by a plasmid or inserted into the genome of a viral vector,
  • a container containing a plasmid or control viral vector carrying a lentiviral vector, containing at least one reporter gene where appropriate, a container containing a plasmid or control viral vector carrying a lentiviral vector, containing at least one reporter gene.
  • the invention also relates to a kit for the production of lentiviral particles carrying a transgene, comprising at least:
  • a receptacles containing a lentiviral vector comprising multiple restriction sites allowing the insertion of a transgene, an encapsidation sequence, an RRE sequence and a cPPT sequence, and lacking the genes of the lentivirus structure, said vector being carried by a plasmid or inserted into the genome of a viral vector, (d) where appropriate, a container containing a plasmid or control viral vector carrying a lentiviral vector, containing at least one reporter gene.
  • Figure 1 represents the adeno-lentiviral constructions produced.
  • Figure 2 describes the protocol used to titrate lentiviral particles in culture supernatants.
  • FIG. 3 schematically illustrates some examples of production methods according to the invention.
  • FIG. 4 represents a gel of silver nitrate for studying the purity of the lentiviral supernatants before (lines 3 and 9) and after ultracentrifugation (lines 1, 2, 6, 7 and 8). A size marker is found on line 5.
  • the lentiviral productions were obtained on cells 293 (lines 1, 2, 3) and VERO (lines 6, 7, 8, 9). At equal amounts of virions (eg 10 5 infectious particles), lentivirus preparations are purer when produced from VERO cells.
  • Cells Hep3B (ATCC HB-8064), HepG2, A549 (ATCC CCL185), HeLa (ATCC CCL2), HT1080 (ATCC CCL121), 293 (ATCC CRL 1573), TE671 (ATCC CRL8805), sMAGI, COS-7 (ATCC CRL 1651), VERO (ATCC CCL-81), NIH-3T3 (CRL-1658), C2C12 (CRL-1772) are grown in DMEM medium (Dulbecco's modofied Eagle's medium), supplemented with 10% fetal calf serum (SVF ). DMEM medium (Dulbecco's modofied Eagle's medium), supplemented with 10% fetal calf serum (SVF ). plasmids
  • the expression units X-Rev and VSV-GiresRev were subcloned into the shuttle plasmid pShuttle constructed for the production of recombinant adenoviruses (He, Zhou et al. 1998).
  • the expression units SIV8, SIV15, Tat and RMES4SA-EF ⁇ / GFP which contained an internal PacI site were subcloned into a modified plasmid pShuttle-Swa.
  • Recombinant adenoviral genomes were obtained using the system
  • the adenoviruses deleted from the E1 and E3 regions were amplified in 293 cells and purified twice by ultracentrifugation on a cesium chloride gradient. The stocks were titrated using a Replication Center Assay, or RCA.
  • the protocol, initially described for the production of vectors derived from AAV (Salvetti, Oreve et al. 1998), has been modified to quantify infectious adenoviral particles. 293 cells were seeded at 8x104 cells per well in 48-well plates. The following day, they were infected with successive dilutions of vectors. The cells were trypsinized 36 hours later and filtered through a Zetaprobe membrane (Biorad).
  • the filters were then soaked in a solution of 0.5M NaOH and 1.5M NaCl for 5 minutes, then neutralized in a solution of 1M Tris-HCl pH 7.0, 2X SSC, and finally incubated with a nucleic probe labeled with fluorescein and hybridizing to the gene for DBP (DNA Binding Protein).
  • the amount of infectious virus particles was determined by counting the number of spots (corresponding to individual viral replication events in infected 293 cells).
  • SIV vector production from mammalian cell lines Cells were seeded at 4x10 5 cells / well in 6-well plates. The following day, they were infected with recombinant adenoviruses at different multiplicity of infection (MOIs) for 2 hours in 1 ml of DMEM medium supplemented with 2% fetal calf serum (FCS). The cells were then rinsed once with PBS and left in 2 ml of DMEM plus 10% of SVF for 24 hours, after which the supernatants were replaced with 2 ml of fresh medium containing 10% of SVF. Twelve hours later, the supernatants were collected, filtered at 0.45 ⁇ m and titrated for the presence of infectious lentiviral particles.
  • MOIs multiplicity of infection
  • FCS fetal calf serum
  • the HT1080 target cells are infected with successive dilutions of supernatants in the presence of polybrene 8 ⁇ g / ml. Positive cells expressing the transgene are detected by fluorescence 5 days after lentiviral infection and counted. The number of cells transduced for a given dilution corresponds to the number of infectious particles present in the initial supernatant.
  • Tat is not essential for the production of SIV vector by this system, while the production of infectious vectors from stable A549 producing cells or from transfected 293 cells is strictly dependent on Tat .
  • VERO Production tests were carried out on a culture dish 150 mm in diameter (6.10 6 cells). The 293 were transfected according to the classic production protocol. VEROs were infected with the adenoviruses AdSIV15 (moi 25), AdG-Rev (50), and AdEFsGFP (150). The cells were kept in culture for three days. The supernatants containing the lentiviral vectors were harvested 48h and 72h post-infection / transfection and titrated on HT1080 cells.
  • the level of purity of the two productions was analyzed by staining with silver nitrate. For an equivalent number of infectious particles (10 5 ), protein contamination is undetectable in the viral stock produced on VERO.

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Abstract

L'invention décrit des procédés de production de lentivirus recombinants porteurs de gènes d'intérêt à un titre égal ou supérieur à 5.10<6> UI/mI, à partir de cellules COS ou VERO ou de lignées dérivées de cellules COS ou VERO, ainsi que des procédés d'obtention de cellules hautement productrices de vecteurs lentiviraux. Certaines mises en oeuvre des procédés de production de l'invention impliquent la transduction de cellules COS ou VERO par des vecteurs adénoviraux portant les séquences gag-pol et rev de SIV, un vecteur porteur d'une séquence env, et un vecteur portant le génome du vecteur lentiviral.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE VECTEURS LENTIVIRAUX A HAUT
TITRE
La présente invention concerne un procédé pour produire des vecteurs lentiviraux à des titres élevés, et pour établir des lignées cellulaires hautement productrices de particules lentivirales de manière stable ou transitoire. Elle porte également sur une trousse permettant l'encapsidation lentivirale, ainsi que sur une trousse pour l'établissement d'une lignée productrice de lentivirus. Les vecteurs lentiviraux apparaissent actuellement comme des vecteurs particulièrement intéressants pour la thérapie génique, de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes et à s'intégrer dans le génome cellulaire. En effet, un des objectifs de la thérapie par transfert de gène est la modification stable des cellules cibles, de préférence par administration du vecteur in vivo.
La production des vecteurs rétroviraux en général présente un certain nombre de difficultés, qui ont été décrites en détail, ainsi que diverses voies explorées pour les contourner, dans la demande européenne n°99923697.9, déposée le 8 juin 1999 au nom de l'Université de Nantes.
La production des vecteurs lentiviraux présente des difficultés supplémentaires par rapport à la production de vecteurs rétroviraux tels que ceux dérivés du virus de Moloney, du fait de propriétés cytotoxiques et cytostatiques de certaines protéines lentivirales. Plusieurs lignées d'encapsidation pour la production de vecteurs lentiviraux ont été décrites.
Elles reposent sur l'expression des gènes transcomplémentants sous le contrôle de promoteurs inductibles (Kaul, Yu et al. 1998; Kafri, van Praag et al. 1999; Farson, Witt et al. 2001 ; Pacchia, Adelson et al.2001).
En général, le génome lentiviral recombinant est intégré par transduction des cellules d'encapsidation avec des vecteurs produits en transitoire. Dans ces conditions, des préparations à des titres de l'ordre de 106 unités de transduction (TU) / ml ont été obtenues, correspondant à 1- 2,5 TU/ cellule.
Toutefois, de telles lignées cellulaires semblent instables en culture à long terme, et cela malgré l'utilisation de systèmes inductibles. Elles sont de plus inadaptées à la production de vecteurs dits "auto- inactivants" (self-inactivating, ou SIN), dans lesquels des fonctions promotrice et activatrice du domaine U3 du LTR 3' sont délétées. Enfin, l'établissement de telles lignées et leur caractérisation est un travail long et fastidieux, peu adapté aux utilisations ponctuelles ou sur cellules primaires, en recherche comme en clinique.
La production de vecteurs lentiviraux défectifs dans des systèmes transitoires garde donc toute sa pertinence, tant pour l'obtention des vecteurs lentiviraux eux-mêmes que pour l'optimisation de certains paramètres des vecteurs et de leur production, en vue d'un développement ultérieur rationnel de nouvelles lignées stables d'encapsidation.
La présente invention vise à fournir des outils à l'homme du métier pour obtenir une production rapide et à haut rendement de particules lentivirales porteuses d'un transgène d'intérêt et dans des conditions de sécurité satisfaisantes. Dans l'ensemble du texte qui suit, les termes utilisés auront les définitions suivantes :
Un "vecteur" désigne une composition ou une molécule capable de transfecter, transduire ou infecter une cellule, permettant ainsi à ladite cellule d'exprimer des séquences portées par le vecteur. Un vecteur comprend un acide nucléique (généralement, ADN ou ARN) et, le cas échéant, des éléments destinés à faciliter l'entrée de l'acide nucléique dans la cellule, tels qu'une particule virale, des lipides polycationiques, etc. Dans l'ensemble du texte, et afin d'alléger ce dernier, il est entendu que quand il sera question de vecteur viral, il faudra comprendre tant l'acide nucléique porteur de séquences virales, administrable par transfection à la cellule cible, que le virus recombinant contenant un génome porteur des mêmes séquences, capable de transduire la cellule cible.
Le "transfert" d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule désigne collectivement la transfection, la transduction, et l'infection de ladite cellule. On parlera de "transfection" lorsque le vecteur ne comprend pas de particule virale (par exemple, lorsque le vecteur est un plasmide). Le terme "transduction" est utilisé pour désigner le transfert de gène par une particule virale défective ou non, tandis que le terme "infection" est normalement réservé pour les cas où le virus transduit la cellule et s'y réplique sans l'aide de vecteurs auxiliaires. Par un abus de langage, le terme "infection" sera parfois utilisé pour décrire la transduction de cellules par un virus recombinant non réplicatif. De même, on dira qu'un virus est "infectieux" dès lors qu'il est capable de transduire les cellules cibles, même lorsque ce virus est défectif et qu'il ne conduit pas à une infection proprement dite.
On désigne par "transgène" toute séquence codant pour une protéine de structure ou une protéine enzymatique ou combinaison de gènes dont l'expression est recherchée dans une cellule cible pour quelque raison que ce soit. Le terme "transgène" peut également désigner une séquence non codante, par exemple une séquence antisens d'un gène dont on souhaite diminuer l'expression, ou une séquence dont la transcription conduira à la synthèse d'un ribozyme.
Un "virus défectif, ou une "particule virale défective" est un virus ou une particule virale incapable de réplication autonome dans son hôte naturel. Dans la suite, lorsque le contexte rend évident qu'un virus ou une particule virale est défectif, ce terme sera omis (par exemple, un adénovirus recombinant défectif, destiné à transférer un gène dans une cellule, pourra être qualifié d'"adénovirus recombinant" ou même simplement d'"adénovirus"). Les cellules "COS" désignent ici les lignées cellulaires obtenues par transformation de cellules de rein de singe par un mutant défectif du virus SV-40, et disponibles dans de nombreux laboratoires et collections de cultures cellulaires. Ce terme désigne notamment les lignées COS-1 et COS-7, mais aussi, par extension, toute lignée dérivée de cellules COS par sous-clonage, éventuellement après intégration de séquences exogènes dans leur génome.
De même, on appellera cellules "VERO" tant la lignée de départ, initiée en 1962 à partir de cellules de rein de singe, que les différentes lignées qui peuvent en être dérivées par sous-clonage, éventuellement après intégration de séquences exogènes dans leur génome.
La présente invention porte en premier lieu sur des procédés de production de vecteurs lentiviraux, en particulier de vecteurs dérivés de SIV ou HIV, ainsi que sur des procédés pour l'établissement d'une lignée cellulaire apte à produire des particules lentivirales à haut titre et dans des conditions de sécurité satisfaisante.
Le rationnel des procédés de l'invention est le suivant : Les systèmes de production classiques passent par la sélection de lignées cellulaires exprimant de façon stable le vecteur et les fonctions d'encapsidation. Cette méthode peut durer plusieurs mois, et nécessite l'analyse de nombreux clones pour isoler les producteurs efficaces. Si elle permet l'obtention de surnageants de culture infectieux à un titre raisonnable (106 particules infectieuses par ml), elle restreint néanmoins l'établissement de producteurs aux lignées cellulaires transformées. Elle est donc peu adaptée aux utilisations ponctuelles ou sur des cellules primaires, que ce soit en recherche ou en clinique.
Un autre système de production utilisé est la production en transitoire, qui est plus souple et plus rapide, en permettant dès le lendemain de la transfection des cellules cibles avec les plasmides portant les fonctions d'encapsidation et le vecteur, de recueillir un surnageant. Mais cette approche permet d'atteindre des titres seulement de l'ordre de 105 particules infectieuses par ml. Les inventeurs ont donc cherché à fournir un système permettant, d'une part de sélectionner rapidement une lignée cellulaire bonne productrice et, d'autre part, de produire des particules lentivirales défectives à haut titre porteuses du transgène et sans émergence de virus compétent pour la réplication, et ce :
- soit en travaillant à partir d'une population cellulaire ou un clone exprimant le vecteur lentiviral en transitoire ;
- soit une population cellulaire ou un clone l'exprimant de façon stable. Pour cela, les inventeurs ont cherché à adapter aux vecteurs lentiviraux la technologie de production de vecteurs rétroviraux médiée par adénovirus, décrite dans (Duisit, Salvetti et al. 1999) et dans la demande de brevet 99923697.9 mentionnée plus haut (exemple 1 ). Ce faisant, ils ont mis en évidence que les lignées cellulaires VERO et COS étaient particulièrement aptes à produire des particules lentivirales recombinantes à des titres élevés (figure 2). En effet, la transduction de ces cellules par un ensemble de vecteurs adénoviraux portant d'une part, le génome d'une vecteur lentiviral et, d'autre part, les fonctions lentivirales nécessaires à l'encapsidation et la séquence d'une glycoprotéine d'enveloppe virale (env), a permis d'obtenir des titres proches de 107 unités de transduction (TU)/ml, avant concentration du surnageant.
Les cellules COS et VERO présentent de plus l'intérêt d'être acceptables sur le plan de la bio-sécurite en vue d'une production clinique de vecteurs pour la thérapie génique. L'invention porte également sur des procédés de production de lignées cellulaires stables dérivées des cellules COS et VERO et capables de produire des vecteurs lentiviraux à des titres élevés. Les cellules productrices obtenues font également partie de l'invention. Description détaillée de l'invention (figure 3) :
L'invention porte sur un procédé de production de lentivirus recombinants porteurs de gènes d'intérêt, à un titre égal ou supérieur à
5.106 Ul/ml, comprenant les étapes de : (a) sélection d'une lignée cellulaire parmi les cellules COS, les cellules VERO, et les cellules dérivées de COS ou VERO,
(b) transfection par un vecteur lentiviral porteur d'un gène d'intérêt, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ou transduction par une particule virale dont le génome est porteur des mêmes séquences que ledit vecteur,
(c) transduction de ladite lignée par au moins un virus défectif dépourvu de séquence psi de lentivirus et porteur de séquences lentivirales gag-pol, et rev, et d'une séquence env de glycoprotéine d'enveloppe, et/ou transfection par au moins un vecteur porteur des mêmes séquences,
(d) culture de ces cellules dans un milieu approprié à la récolte des particules rétrovirales porteuses du transgène.
Une variante du procédé ci-dessus comporte les étapes suivantes :
(i) sélection de lignée COS ou VERO exprimant de façon stable gag-pol, env et rev ou transduction des lignées COS ou VERO avec des adénovirus portant gag-pol, env et rev,
(ii) transduction des cellules de la lignée sélectionnée par des adénovirus portant le vecteur lentiviral d'intérêt, ou par un lentivirus recombinant à amplifier, ou transfection par un plasmide portant ledit vecteur,
(iii) culture de ces cellules dans un milieu approprié pour la production de lentivirus recombinant. Cette variante correspond en fait au premier procédé décrit ci- dessus, dans lequel les étapes (a) et (c) sont confondues, ou dans lequel la lignée sélectionnée à l'étape (a) exprime de façon stable gag-pol, env et rev, et l'étape (c) est supprimée.
Dans une mise en oeuvre préférée des procédés ci-dessus, les séquences gag-pol et rev sont des séquences de SIV. Alternativement, il peut s'agir de séquences d'autres lentivirus, par exemple de lentivirus humains (HIV), équins (EIAV), caprins (CAEV), ovins (MW), bovins (BIV), ou félins (FIV).
Dans un procédé préféré selon l'invention, les vecteurs ou les virus de l'étape (c) sont des adénovirus recombinants. Dans l'ensemble du texte, il est bien entendu que, à chaque fois qu'il sera question d'adénovirus, de vecteur adenoviral, il pourra être entendu de la même façon les équivalents fonctionnels de ces virus ou de ces vecteurs. En particulier, tout autre virus non intégratif doit être considéré comme un équivalent fonctionnel d'un tel virus. L'homme du métier comprendra que tout virus capable d'infecter une cellule cible avec une multiplicité d'infection faible et capable d'exprimer, dans ladite cellule cible, une ou plusieurs séquences portées par son génome doit être considéré comme équivalent fonctionnel de l'adénovirus. Par exemple, le baculovirus ou les vecteurs baculoviraux pourront être utilisés de la même façon que les adénovirus.
Un adénovirus ou vecteur adenoviral porteur de séquences lentivirales sont appelés adéno-lentivirus ou vecteur adénolentiviral.
Les adéno-lentivirus recombinants utilisables dans les procédés de l'invention seront toujours sélectionnés par : - la titration des surnageants lentiviraux obtenus après infection des cellules productrices, et son optimisation en fonction de la multiplicité d'infections adénovirales ;
- l'absence de lentivirus et d'adénovirus "helper" dans le surnageant de production (avec un seuil de détection de 102 particules virales). Les inventeurs ont par ailleurs mis en évidence que la production de vecteurs SIV en apportant certaines fonctions lentivirales par des adénovirus recombinants, ne nécessitait pas l'expression de la séquence tat, pourtant indispensable pour obtenir des vecteurs infectieux à partir de cellules productrices stables A549 ou de cellules 293 transfectées. L'invention porte donc également sur un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les virus et/ou vecteurs utilisés à l'étape (c) sont dépourvus de la séquence tat.
Alternativement, et notamment lorsqu'un lentivirus est utilisé à l'étape (b), un adénovirus supplémentaire exprimant tat sera utilisé pour la production (figure 2).
L'homme du métier dispose d'une grande liberté pour choisir la séquence env pour mettre en œuvre les procédés de l'invention, suivant l'application à laquelle il destine les vecteurs lentiviraux qu'il cherche à produire. A titre d'exemples, on peut citer la glycoprotéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G), les enveloppes amphotropes "10A1" ou "4070A", la glycoprotéine d'enveloppe du virus de la leucémie du gibbon (GaLV), ou du virus de chat (RD 114). Les inventeurs ont également construit des vecteurs lentiviraux en utilisant comme protéine d'enveloppe l'hémagglutinine du virus aviaire flow plaque virus (FPV). Malgré une faible homologie de séquence, les virus chimériques associant gag-pol, d'une part, et env, d'autre part, d'origines différentes, restent parfaitement infectieux.
Par ailleurs, pour pallier le manque de tissu-spécificité des vecteurs lentiviraux, l'homme du métier peut, comme pour les vecteurs rétroviraux en général, modifier l'enveloppe par insertion de ligands spécifiques de certains types cellulaires (Martin, Kupsch et al. 1998). Pour n'infecter que les cellules cibles, il est aussi possible de restreindre le tropisme viral en mutant les glycoprotéines d'enveloppe dans les domaines essentiels pour la liaison à la membrane cellulaire (Gordon et Anderson 1994). Dans une mise en œuvre préférée des procédés de l'invention, les séquences gag-pol, rev et env introduites à l'étape (c) sont portés par au moins deux constructions virales et/ou vecteurs différentes. Cette séparation des différentes séquences présente des intérêts tant sur le plan de la sécurité (pour éviter l'apparition, par recombinaison, de particules compétentes pour la réplication, ou RCR), que sur le plan de la flexibilité du système. En effet, si env est porté par un vecteur séparé, il est possible de faire varier le tropisme du rétrovirus produit par les cellules en faisant varier l'origine du gène env introduit, ce qui est plus long à mettre en œuvre quand les différentes fonctions sont portées par le même vecteur.
Différents vecteurs adénoviraux utilisables pour mettre en œuvre les procédés de l'invention sont présentés dans les exemples ci-dessous. Par exemple, la séquence gag-pol est présente soit seule, soit dans le même vecteur que tat. Il est également possible d'inclure env et rev dans le même vecteur, ou au contraire de les placer dans deux vecteurs distincts.
Le vecteur lentiviral, à l'étape (b), peut également être porté par un adénovirus recombinant. Il comprend les éléments nécessaires en cis pour un vecteur lentiviral, c'est-à-dire des séquences régulatrices incluant le LTR, la séquence d'encapsidation Ψ ou un équivalent fonctionnel, le cPPT (central polypurine tract) et la séquence RRE (rev response élément), ou des équivalents fonctionnels de ces séquences. La région U3 du LTR 5' est de préférence remplacée par le promoteur CMV. Il est également possible de déléter tout ou partie des fonctions promotrice et activatrice du domaine U3 du LTR 3'. La rétro-transcription, lors de la transduction de cellules cibles, introduira la délétion des régions promotrices dans le LTR 5', empêchant une réplication ultérieure et éliminant les risques et inconvénients liés à la présence de U3 dans le génome cellulaire. Des séquences régulatrices favorisant l'expression du transgène in vivo, telles que le motif WPRE et les séquences "insulatrices" de type hs4, peuvent être également incluses dans le vecteur lentiviral. I i 1 1 » •» *** ,. »„ _ - _
10
Dans le procédé ci-dessus, les étapes b) et c) peuvent être simultanées ou successives (figure 3).
En effet, si l'on cherche à avoir un système de production transitoire de particules lentivirales, les vecteurs portant le génome du lentivecteur, d'une part, et les séquences nécessaires à son encapsidation, d'autre part, peuvent être transférés simultanément.
On peut également mettre au point différents systèmes d'expression stable en effectuant successivement les étapes (b) et (c), dans un ordre différent suivant le résultat souhaité. Ainsi, dans une mise en œuvre particulière de l'invention, les cellules COS ou VERO sont d'abord transfectées ou transduites par le vecteur porteur du vecteur lentiviral (étape (b)). Ensuite, après une quinzaine de jours, après intégration stable dudit vecteur dans le génome cellulaire, les cellules sont infectées ou transfectées par les adénovirus recombinants ou les vecteurs porteurs des gènes de structure du lentivirus (étape (c)). Dans cette mise en œuvre du procédé de l'invention, l'étape (b) précède l'étape (c).
Alternativement, il peut être avantageux qu'une partie au moins de l'étape (c) précède l'étape (b). Dans cette mise en œuvre du procédé de l'invention, une partie ou la totalité des séquences nécessaires à l'encapsidation est intégrée dans le génome des cellules COS ou VERO, de préférence sous le contrôle de promoteurs inductibles. La production des vecteurs sera ensuite effectuée par le transfert dans ces cellules du vecteur lentiviral, l'induction des promoteurs dirigeant l'expression des séquences intégrées et, le cas échéant, l'apport des fonctions nécessaires à l'encapsidation et non encore intégrées dans la cellule.
Dans un exemple de mise en œuvre du procédé ci-dessus, les étapes (b) et (c) se décomposent comme suit :
(d) Intégration dans le génome des cellules COS ou VERO des séquences gag-pol et rev de SIV ; le cas échéant, sélection et caractérisation d'un clone, (b) transfert du vecteur SIV dans les cellules obtenues en (d ), par exemple par transduction par des particules produites en transitoire,
(c2) induction de l'expression de gag-pol et rev et transduction par un vecteur adenoviral portant la séquence env.
Un tel procédé permet de combiner les avantages d'une production en lignée stable et la souplesse du système de production en transitoire, puisque la lignée cellulaire obtenue à l'issue de (d ) permet de produire des vecteurs dans lesquels ont peut choisir le transgène et la protéine d'enveloppe. Les étapes (b) et (c2) peuvent être simultanées ou successives.
Dans une mise en œuvre particulière des procédés de l'invention, illustrée dans les exemples, gag-pol est sous le contrôle du promoteur du CMV et rev sous le contrôle du promoteur HMG. Dans une autre mise en œuvre des procédés de l'invention illustrée dans les exemples, le transgène est sous le contrôle du promoteur EF1α.
La présente invention porte également sur un procédé d'obtention d'une lignée cellulaire apte à produire des particules lentivirales, à un titre supérieur à 5.106 Ul/ml et comprenant les étapes de :
(a) sélection d'une lignée cellulaire parmi les cellules COS, les cellules VERO, et les cellules dérivées de COS ou VERO,
(b) transfection par un vecteur lentiviral porteur d'un transgène, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ou transduction par une particule virale dont le génome est porteur des . séquences équivalentes,
(c) transduction de ladite lignée par au moins un virus recombinant dépourvu de séquence d'encapsidation de lentivirus et porteur de séquences lentivirales gag-pol, et rev, et d'une séquence env de glycoprotéine d'enveloppe de virus enveloppé, et/ou transfection par au moins un vecteur, viral ou non viral, porteur des mêmes séquences, et (d) criblage des lignées productrices au titre recherché,
- sur la base du titre lentiviral obtenu dans le surnageant cellulaire, et/ou
- sur la base de l'absence de virus auxiliaire dans le surnageant.
Dans une mise en œuvre préférée de ce procédé, les séquences gag-pol, et rev sont des séquences de SIV. Selon une autre mise en œuvre du procédé ci-dessus, les vecteurs ou les virus de l'étape (c) sont des adénovirus recombinants. Dans ce cas, les virus et/ou vecteurs utilisés à l'étape (c) sont préférentiellement dépourvus de la séquence tat.
Alternativement, et notamment lorsque l'étape (c) n'implique pas d'adénovirus, un vecteur ou virus porte la séquence tat.
Dans les procédés d'obtention de cellules productrices de vecteurs lentiviraux, l'homme du métier dispose de la même liberté quant au choix de la séquence env que dans les procédés de production de vecteurs lentiviraux vus plus haut. Des procédés d'obtention de cellules productrices de vecteurs lentiviraux préférés selon l'invention utilisent comme séquence env le gène de la protéine G de VSV-G ou des enveloppes amphotropes "10 A1" ou "4070A", ou de l'hémagglutinine du virus aviaire flow plaque virus (FPV).
De même, et pour les raisons explicitées plus haut, les séquences gag-pol, rev et env sont préférentiellement portées par au moins deux constructions virales et ou vecteurs différentes dans l'étape (c) des procédés d'obtention de cellules productrices de vecteurs lentiviraux.
La présente invention concerne aussi un procédé tel que décrit ci-dessus, pour l'établissement d'une lignée stable productrice de vecteurs lentiviraux, caractérisé en ce qu'une partie au moins des séquences gag-pol, rev et env est intégrée dans le génome cellulaire au cours de l'étape (c).
L'invention porte également sur des lignées cellulaires productrices de vecteurs lentiviraux et dérivées de cellules COS ou VERO.
Une lignée cellulaire particulière de l'invention comporte des séquences gag-pol, et rev de SIV et une séquence env de glycoprotéine d'enveloppe de virus enveloppé. Elle est de préférence capable de produire des particules lentivirales à un titre égal ou supérieur à 5.106 Ul/ml. Une lignée cellulaire obtenue par les étapes (a) et (c) des procédés d'obtention de lignées productrices décrits est partie intégrante de la présente invention. Une lignée particulière est obtenue par les étapes (a) et (d) décrites ci-dessus. Il s'agit donc d'une lignée dérivée de cellules COS ou VERO et comportant les séquences gag-pol, et rev de SIV intégrées dans son génome.
Dans les lignées cellulaires stables de l'invention, les séquences cytotoxiques ou cytostatiques nécessaires à l'encapsidation des vecteurs (env, rev et tat) sont préférentiellement placées sous le contrôle de promoteurs inductibles ou repressibles. L'utilisation de promoteur inductibles est préférée, car elle ne nécessite pas l'ajout systématique du répresseur au milieu de culture lorsqu'on cultive les cellules. A titre d'exemples de promoteurs inductibles utilisables, on peut citer les systèmes tet/ON ou ecdysomes-dépendants.
Dans une réalisation préférée des lignées celulaires de l'invention, la séquence env est placée sous le contrôle d'un promoteur inductible.
Un autre aspect de l'invention porte sur une trousse pour la production de particules lentivirales porteuses d'un transgène, comprenant au moins : (a) un ou plusieurs récipients contenant des cellules dérivées de COS ou VERO comportant des séquences gag-pol et rev de SIV,
(b) un ou plusieurs récipients contenant un virus non rétroviral ou un plasmide porteur d'un gène env,
(c) un ou plusieurs récipients contenant un vecteur lentiviral comportant des sites multiples de restriction permettant l'insertion d'un transgène, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ledit vecteur étant porté par un plasmide ou inséré dans le génome d'un vecteur viral,
(d) le cas échéant, un récipient contenant un plasmide ou vecteur viral contrôle porteur d'un vecteur lentiviral, contenant au moins un gène rapporteur.
L'invention porte également sur une trousse pour la production de particules lentivirales porteuses d'un transgène, comprenant au moins :
(a) un ou plusieurs récipients contenant des cellules dérivées de COS ou VERO comportant des séquences gag-pol et rev de
SIV, et une séquence env,
(b) le cas échéant, une ou plusieurs ampoules contenant l'inducteur,
(c) un ou plusieurs récipients contenant un vecteur lentiviral comportant des sites multiples de restriction permettant l'insertion d'un transgène, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ledit vecteur étant porté par un plasmide ou inséré dans le génome d'un vecteur viral, (d) le cas échéant, un récipient contenant un plasmide ou vecteur viral contrôle porteur d'un vecteur lentiviral, contenant au moins un gène rapporteur.
Les matériels et méthodes, protocoles et exemples ci-après pourront, sans être limitatifs, montrer la performance des procédés de l'invention.
Légendes des figures La figure 1 représente les constructions adéno-lentivirales réalisées.
Le figure 2 décrit le protocole utilisé pour titrer les particules lentivirales dans les surnageants de culture.
La figure 3 illustre schématiquement quelques exemples de procédés de production selon l'invention.
La figure 4 représente un gel de nitrate d'argent pour étudier la pureté des surnageants lentiviraux avant (lignes 3 et 9) et après ultracentrifugation (lignes 1 , 2, 6, 7 et 8). Un marqueur de taille se trouve à la ligne 5. Les productions lentivirales ont été obtenues sur des cellules 293 (lignes 1 , 2, 3) et VERO (lignes 6, 7, 8, 9). A quantités de virions égales (par exemple 105 particules infectieuses), les préparations de lentivirus sont plus pures lorsqu'ils sont produits à partir de cellules VERO.
Matériels et Méthodes Lignées cellulaires
Les cellules Hep3B (ATCC HB-8064), HepG2, A549 (ATCC CCL185), HeLa (ATCC CCL2), HT1080 (ATCC CCL121 ), 293 (ATCC CRL 1573), TE671 (ATCC CRL8805), sMAGI, COS-7 (ATCC CRL 1651), VERO (ATCC CCL-81 ), NIH-3T3 (CRL-1658), C2C12 (CRL-1772) sont cultivées en milieu DMEM (Dulbecco's modofied Eagle's médium), complété avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF). Plasmides
Le clone moléculaire BK28 de SIVmac251 (numéro d'accession GenBank M19499) a été utilisé pour réaliser les constructions
SIV pour l'encapsidation (voir la figure 1). Les plasmides pVSV-G, pX-Rev et pSIVδ, pSIV15 ont été décrits précédemment (Mangeot, Nègre et al.
2000; Nègre, Mangeot et al. 2000; Mangeot, Duperrier et al. 2002).
Le vecteur pRMES4SA-Efs/GFP est dérivé de pRMES4 (Nègre, Mangeot et al. 2000).
Génération d'adénovirus recombinants Les unités d'expression X-Rev et VSV-GiresRev ont été sous- clonées dans le plasmide navette pShuttle construit pour la production d'adénovirus recombinants (He, Zhou et al. 1998). Les unités d'expression SIV8, SIV15, Tat et RMES4SA-EFα/GFP qui contenaient un site interne Pacl ont été sous-clonées dans un plasmide modifié pShuttle-Swa. Les génomes adénoviraux recombinants ont été obtenus en utilisant le système
AdEasy décrit par He et al, supra. Les adénovirus délétés des régions E1 et E3 ont été amplifiés dans des cellules 293 et purifiés deux fois par ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium. Les stocks ont été titrés en utilisant un essai de centre de réplication (Réplication Center Assay, ou RCA). Le protocole, décrit initialement pour la production de vecteurs dérivés d'AAV (Salvetti, Oreve et al. 1998), a été modifié pour quantifier les particules adénovirales infectieuses. Des cellules 293 ont été ensemencées à 8x104 cellules par puits dans des plaques à 48 puits. Le lendemain, elles ont été infectées avec des dilutions successives de vecteurs. Les cellules ont été trypsinées 36 heures plus tard et filtrées à travers une membrane Zetaprobe (Biorad). Les filtres ont ensuite été trempés dans une solution de 0,5M NaOH et 1,5M NaCI pendant 5 minutes, puis neutralisés dans une solution de 1M Tris-HCI pH 7,0, 2X SSC, et finalement incubés avec une sonde nucléique marquée à la fluorescéine et hybridant au gène de la DBP (DNA Binding Protein). La quantité de particules virales infectieuses a été déterminée en comptant le nombre de spots (correspondant à des événements individuels de réplication virale dans les cellules 293 infectées).
Production de vecteur SIV à partir de lignées cellulaires de mammifères Les cellules ont été ensemencées à 4x105 cellules /puits dans des plaques à 6 puits. Le lendemain, elles ont été infectées avec les adénovirus recombinants à différentes multiplicités d'infection (MOIs) pendant 2 heures dans 1 ml de milieu DMEM supplémenté avec 2% de sérum de veau fœtal (SVF). Les cellules ont ensuite été rincées une fois au PBS et laissées dans 2 ml de DMEM plus 10% de SVF penadant 24 heures, après quoi les surnageants ont été remplacés par 2 ml de milieu frais contenant 10% de SVF. Douze heures plus tard, les surnageants ont été collectés, filtrés à 0,45 μm et titrés pour la présence de particules lentivirales infectieuses. Les cellules cibles HT1080 sont infectées avec des dilutions successives de surnageants en présence de polybrène 8 μg/ml. Les cellules positives exprimant le transgène sont détectées par fluorescence 5 jours après l'infection lentivirale et comptées. Le nombre de cellules transduites pour une dilution donnée correspond au nombre de particules infectieuses présentes dans le surnageant initial.
Exemple 1 : Production de vecteurs lentiviraux par infection en transitoire de cellules A549
Sur la base de travaux antérieurs (Duisit et al. 1999, Hum. Gène Ther. - 10 : 198-200), les inventeurs ont construit plusieurs vecteurs- adénoviraux défectifs pour la réplication, afin de délivrer un grand nombre de copies des gènes nécessaires à l'encapsidation des vecteurs lentiviraux.
Une partie de ces vecteurs est résumée dans le tableau 1 ci-dessous :
Figure imgf000019_0001
Dans un premier temps, le ratio optimal de Ad SIV15/AdG- Rev/Ad EFs GFP a été déterminé dans des expériences de production à petite échelle. Des cellules humaines A 549 ont été infectées avec différentes multiplicités d'infection (MOIs) de chaque adénovirus. Deux jours après l'infection, les vecteurs SIV relargués dans les surnageants de culture ont été titrés. Les productions de SIV dans ces expériences a permis d'obtenir des titres de 106 TU/ml maximum, ce qui correspond à 10 TU/cellule. L'expression de Gag-Pol, VSV-G et Rev était saturante MOI=100, puisqu'une augmentation de la multiplicité d'infection de AdSIVδ, AdVSV-G ou AdRev n'entraînait pas d'augmentation des titres de SIV produit.
Au contraire, les niveaux de transduction étaient corrélés à la quantité de AdEFs GFP utilisée.
Les inventeurs ont également observé que l'expression de Tat n'était pas indispensable à la production de vecteur SIV par ce système, alors que la production de vecteurs infectieux à partir de cellules productrices A549 stables ou de cellules 293 transfectées est strictement dépendante de Tat.
Exemple 2 : Production de vecteurs lentiviraux par infection en transitoire de cellules VERO/COS
La figure 4 illustre la production à grande échelle sur des cellules
VERO. Des essais de productions ont été réalisés sur une boîte de culture de 150 mm de diamètre (6.106 cellules). Les 293 ont été transfectées selon le protocole classique de production. Les VERO ont été infectées par les adénovirus AdSIV15 (moi 25), AdG-Rev (50), et AdEFsGFP (150). Les cellules ont été maintenues en culture pendant trois jours. Les surnageants contenant les vecteurs lentiviraux ont été récoltés 48h et 72h post-infection/transfection et titrés sur des cellules HT1080.
Figure imgf000020_0001
Le niveau de pureté des deux productions a été analysé par une coloration au nitrate d'argent. Pour un nombre équivalent de particules infectieuses (105), la contamination en protéines est indétectable dans le stock viral produit sur VERO.
BIBLIOGRAPHIE
(1) Duisit, G., A. Salvetti, et al. (1999). "Functional characterization of adenoviral/retroviral chimeric vectors and their use for efficient screening of retroviral producer cell lines." Hum Gène Ther 10(2): 189-200. (2) Farson, D., R. Witt, et al. (2001). "A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors." Hum Gène
Ther 12(8): 981-97. (%) Gordon, E. M. and W. F. Anderson (1994). "Gène therapy using retroviral vectors." Curr Opin Biotechnol 5(6): 611-6.
(4) He, T. C, S. Zhou, et al. (1998). "A simplified System for generating recombinant adenoviruses." Proc Natl Acad Sci U S A
95(5): 2509-14.
(5) Kafri, T., H. van Praag, et al. (1999). "A packaging cell line for lentivirus vectors." J Virol 73(1): 576-84.
(§) Kaul, M., H. Yu, et al. (1998). "Regulated lentiviral packaging cell line devoid of most viral cis- acting séquences." Virology 249(1):
167-74. (?) Mangeot, P. E., K. Duperrier, et al. (2002). "High Levels of Transduction of Human Dendritic Cells with Optimized SIV Vectors." Mol Ther 5(3): 283-90. (8) Mangeot, P. E., D. Nègre, et al. (2000). "Development of minimal lentivirus vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) and their use for gène transfer into human dendritic cells." J Virol 74(18): 8307-15. ) Martin, F., J. Kupsch, et al. (1998). "Retroviral vector targeting to melanoma cells by single-chain antibody incorporation in envelope." Hum Gène Ther 9(5): 737-46. (10) Nègre, D., P. E. Mangeot, et al. (2000). "Characterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells." Gène Ther 7(19): 1613-23. (11) Pacchia, A. L., M. E. Adelson, et al. (2001). "An inducible packaging cell System for safe, efficient lentiviral vector production in the absence of HIV-1 accessory proteins." Virology 282(1): 77-86.
(12) Salvetti, A., S. Oreve, et al. (1998). "Factors influencing recombinant adeno-associated virus production." Hum Gène
Ther 9(5): 695-706.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production de lentivirus recombinants porteurs de gènes d'intérêt à un titre égal ou supérieur à 5.106 Ul/ml, comprenant les étapes de :
(a) sélection d'une lignée cellulaire parmi les cellules COS, les cellules VERO, et les cellules dérivées de COS ou VERO,
(b) transfection par un vecteur lentiviral porteur d'un gène d'intérêt, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ou transduction par une particule virale dont le génome est porteur des mêmes séquences que ledit vecteur,
(c) transduction de ladite lignée par au moins un virus défectif dépourvu de séquence psi de lentivirus et porteur de séquences lentivirales gag-pol, et rev, et d'une séquence env de glycoprotéine d'enveloppe de virus enveloppé, et/ou transfection par au moins un vecteur porteur des mêmes séquences,
(d) culture de ces cellules dans un milieu approprié à la récolte des particules rétrovirales porteuses du transgène.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la lignée sélectionnée à l'étape (a) exprime de façon stable gag-pol, env et rev, et l'étape (c) est supprimée.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel gag- pol, et rev sont des séquences de SIV.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que les vecteurs ou les virus de l'étape (c) sont des adénovirus recombinants.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel les virus et/ou vecteurs utilisés à l'étape (c) sont dépourvus de la séquence tat.
6. Procédé selon les revendications 1 , 3 et 4, dans lequel à l'étape (c), un vecteur ou virus porte la séquence tat.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel env est le gène de la protéine G de VSV-G ou de l'enveloppe amphotrope "10 A1" ou "4070A", ou de l'hémagglutinine du virus aviaire flow plaque virus (FPV).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 7, caractérisé en ce que dans l'étape (c), gag-pol, rev et env sont portés par au moins deux constructions virales et/ou vecteurs différentes.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 8, caractérisé en ce que les étapes (b) et (c) sont simultanées.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 8, caractérisé en ce que l'étape (b) précède l'étape (c).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 8, caractérisé en ce qu'une partie au moins de l'étape (c) précède l'étape (b).
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 11, caractérisé en ce que gag-pol est sous le contrôle du promoteur du CMV et rev sous le contrôle du promoteur HMG.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le transgène est sous le contrôle du promoteur EF1α.
14. Procédé d'obtention d'une lignée cellulaire apte à produire des particules lentivirales, à un titre supérieur à 5.10e Ul/ml et comprenant les étapes de :
(a) sélection d'une lignée cellulaire parmi les cellules COS, les cellules VERO, et les cellules dérivées de COS ou VERO,
(b) transfection par un vecteur lentiviral porteur d'un transgène, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ou transduction par une particule virale dont le génome est porteur des séquences équivalentes,
(c) transduction de ladite lignée par au moins un virus recombinant dépourvu de séquence d'encapsidation de lentivirus et porteur de séquences lentivirales gag-pol, et rev, et d'une séquence env de glycoprotéine d'enveloppe de virus enveloppé, et/ou transfection par au moins un vecteur, viral ou non viral, porteur des mêmes séquences, et
(d) criblage des lignées productrices au titre recherché, - sur la base du titre lentiviral obtenu dans le surnageant cellulaire, et/ou
- sur la base de l'absence de virus auxiliaire dans le surnageant.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel les séquences gag-pol, et rev sont des séquences de SIV.
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que les vecteurs ou les virus de l'étape (c) sont des adénovirus recombinants.
17. Procédé selon la revendication 16,dans lequel les virus et/ou vecteurs utilisés à l'étape (c) sont dépourvus de la séquence tat.
18. Procédé selon les revendications 14 à 16, dans lequel à l'étape (c), un vecteur ou virus porte la séquence tat.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, dans lequel env est le gène de la protéine G de VSV-G ou de l'enveloppe amphotrope "10 A1" ou "4070A", ou de l'hémagglutinine du virus aviaire flow plaque virus (FPV).
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, caractérisé en ce que dans l'étape (c) gag-pol, rev et env sont portés par au moins deux constructions virales et/ou vecteurs différent(e)s.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, pour l'établissement d'une lignée stable productrice de vecteurs lentiviraux, caractérisé en ce qu'une partie au moins des séquences gag- pol, rev et env est intégrée dans le génome cellulaire au cours de l'étape (c).
22. Lignée cellulaire dérivée de cellules COS ou VERO, caractérisée en ce qu'elle comporte des séquences gag-pol, et rev de SIV et une séquence env de glycoprotéine d'enveloppe de virus enveloppé, et en ce qu'elle produit des particules lentivirales à un titre égal ou supérieur à
5.106 Ul/ml.
23. Lignée cellulaire caractérisée en ce qu'elle est obtenue par les étapes (a) et (c) du procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 20.
24. Lignée cellulaire selon la revendication 23 ou 24, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence env placée sous le contrôle d'un promoteur inductible.
25. Trousse pour la production de particules lentivirales porteuses d'un transgène, comprenant au moins :
(a) un ou plusieurs récipients contenant des cellules dérivées de COS ou VERO comportant des séquences gag-pol et rev de SIV, (b) un ou plusieurs récipients contenant un virus non retroviral ou un plasmide porteur d'un gène env,
(c) un ou plusieurs récipients contenant un vecteur lentiviral comportant des sites multiples de restriction permettant l'insertion d'un transgène, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ledit vecteur étant porté par un plasmide ou inséré dans le génome d'un vecteur viral,
(d) le cas échéant, un récipient contenant un plasmide ou vecteur viral contrôle porteur d'un vecteur lentiviral, contenant au moins un gène rapporteur.
26. Trousse pour la production de particules lentivirales porteuses d'un transgène, comprenant au moins :
(a) un ou plusieurs récipients contenant des cellules dérivées de COS ou VERO comportant des séquences gag-pol et rev de
SIV, et une séquence env,
(b) le cas échéant, une ou plusieurs ampoules contenant un inducteur,
(c) un ou plusieurs récipients contenant un vecteur lentiviral comportant des sites multiples de restriction permettant l'insertion d'un transgène, d'une séquence d'encapsidation, d'une séquence RRE et d'une séquence cPPT, et dépourvu des gènes de structure du lentivirus, ledit vecteur étant porté par un plasmide ou inséré dans le génome d'un vecteur viral,
(d) le cas échéant, un récipient contenant un plasmide ou vecteur viral contrôle porteur d'un vecteur lentiviral, contenant au moins un gène rapporteur.
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008156681A3 (fr) * 2007-06-14 2009-03-19 Yoshihiro Kawaoka Vecteurs d'adénovirus pour la production de virus de la grippe
US11802273B2 (en) 2014-06-20 2023-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US11851648B2 (en) 2019-02-08 2023-12-26 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
US12076387B2 (en) 2010-03-23 2024-09-03 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
US12122807B2 (en) 2019-05-01 2024-10-22 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
US12144857B2 (en) 2018-08-20 2024-11-19 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vectors for eliciting immune responses to non-dominant epitopes in the hemagglutinin (HA) protein
US12251436B2 (en) 2017-10-25 2025-03-18 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US12290562B2 (en) 2020-03-25 2025-05-06 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant multivalent influenza viruses
US12343390B2 (en) 2018-08-07 2025-07-01 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant biologically contained filovirus vaccine
US12365880B2 (en) 2023-08-03 2025-07-22 The University Of Tokyo Recombinant influenza viruses with stabilized NA

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055335A1 (fr) * 1999-03-16 2000-09-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vecteurs lentiviraux pseudotypes et utilisations de ces vecteurs
WO2000071678A1 (fr) * 1999-05-25 2000-11-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Lignees cellulaires inductibles d'empaquetage pour la production de vecteurs lentiviraux

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055335A1 (fr) * 1999-03-16 2000-09-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vecteurs lentiviraux pseudotypes et utilisations de ces vecteurs
WO2000071678A1 (fr) * 1999-05-25 2000-11-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Lignees cellulaires inductibles d'empaquetage pour la production de vecteurs lentiviraux

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUISIT G ET AL: "FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF ADENOVIRAL/RETROVIRAL CHIMERIC VECTORS AND THEIR USE FOR EFFICIENT SCREENING OF RETROVIRAL PRODUCER CELL LINES", HUMAN GENE THERAPY, XX, XX, vol. 10, no. 2, 20 January 1999 (1999-01-20), pages 189 - 200, XP000866146, ISSN: 1043-0342 *
NALDINI LUIGI: "Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.", CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 9, no. 5, October 1998 (1998-10-01), pages 457 - 463, XP002225175, ISSN: 0958-1669 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8043856B2 (en) 2007-06-14 2011-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Adenoviral vectors for influenza virus production
WO2008156681A3 (fr) * 2007-06-14 2009-03-19 Yoshihiro Kawaoka Vecteurs d'adénovirus pour la production de virus de la grippe
US12076387B2 (en) 2010-03-23 2024-09-03 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
US11802273B2 (en) 2014-06-20 2023-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US12251436B2 (en) 2017-10-25 2025-03-18 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US12343390B2 (en) 2018-08-07 2025-07-01 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant biologically contained filovirus vaccine
US12144857B2 (en) 2018-08-20 2024-11-19 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vectors for eliciting immune responses to non-dominant epitopes in the hemagglutinin (HA) protein
US12258557B2 (en) 2019-02-08 2025-03-25 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
US11851648B2 (en) 2019-02-08 2023-12-26 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
US12122807B2 (en) 2019-05-01 2024-10-22 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US12290562B2 (en) 2020-03-25 2025-05-06 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant multivalent influenza viruses
US12364748B2 (en) 2021-12-09 2025-07-22 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza B virus replication for vaccine development
US12365880B2 (en) 2023-08-03 2025-07-22 The University Of Tokyo Recombinant influenza viruses with stabilized NA

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