WO2003070934A1 - METHOD OF JUDGING GENOTYPE OF REGION AROUND PLANT sd-1 GENE AND METHOD OF EXAMINING SEMI-DWARF CHARACTERISTIC OF PLANT USING THE JUDGMENT METHOD - Google Patents

METHOD OF JUDGING GENOTYPE OF REGION AROUND PLANT sd-1 GENE AND METHOD OF EXAMINING SEMI-DWARF CHARACTERISTIC OF PLANT USING THE JUDGMENT METHOD Download PDF

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WO2003070934A1
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Yuzo Minobe
Lisa Monna
Noriyuki Kitazawa
Rika Yoshino
Junko Suzuki
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Plant Genome Center Co., Ltd.
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, and a method for testing a semi-dwarf trait in a plant using the method.
  • the present invention relates to a method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant and a method for examining the semi-dwarf trait of a plant using the method.
  • Semi-dwarfness is one of the most important traits of rice and other cereals.
  • the rice semi-dwarf gene sd-1 is well known as the "green revolution" gene and contributed to a significant increase in grain sales in the 1960s and 1970s, especially in Asia
  • sd-1 gene for breeding high-yielding varieties through genetic engineering. It has been rare.
  • chromosome 1 protein loci on chromosome 1 (Cho, YG, Eun, M. ⁇ ., Kim, ⁇ . ⁇ ., Chung, TY and Cha e, YA 1994, The semidwarf gene, sd-1; of rice (Oryza sativa L.). I. Linkage with the esterase locus, Estl-2, T eor. Ap l.
  • Positional cloning is a strategy for isolating and identifying genes using naturally occurring genetic recombination.
  • any observable trait encoded on the chromosome of a sexually reproducing species can be targeted for positional cloning.
  • An example of positional cloning of trait genes is described in Arabidopsis (LukowUz, W., Gillior, CS and Scible, WR 2000, Positiona 1 cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you, Plant Physiol , 123, 795-805.) And tomatoes (Alpert,.
  • An object of the present invention is to provide a method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant and a method for testing a semi-dwarf trait of a plant using the method.
  • the present inventors have developed a hybrid progeny of Sasanishiki (Japanese rice cultivar with normal plant height) and Habataki (Indian rice cultivar with semi-dwarf plant height caused by sd-1).
  • Sasanishiki Japanese rice cultivar with normal plant height
  • Habataki Indian rice cultivar with semi-dwarf plant height caused by sd-1).
  • rice semi-dwarf gene sd-1 was isolated and identified (Monna et al., DNA Research (2002) 9: 11-17).
  • many polymorphisms including single nucleotide substitution polymorphism between Sasanishiki and Habataki were found around sd-1 on rice chromosome 1.
  • markers were unified so that dienotyping could be performed by the CAPS or dCA PS method.
  • a model experiment for introducing a semi-dwarf trait into Koshihikari was performed. As a result, it was revealed that the semi-dwarf trait of rice can be examined by using the above-menti
  • the present invention relates to a method for determining the genotype of the plant sd-1 gene peripheral region and a method for examining the semi-dwarf trait of a plant using the method, more specifically,
  • step (c) hybridizing the DNA prepared in step (a) with the probe synthesized in step (b),
  • step (f) comparing the emission of the reporter fluorescence detected in step (e) with a control, (7) including the following steps (a) to (h), the determination method according to (1),
  • step (d) hybridizing the probe synthesized in step (c) with the DNA prepared in step (a),
  • step (e) cleaving the DNA hybridized in step (d) with a single-stranded DNA cleaving enzyme to release a part of the probe synthesized in step (b); (f) a step of hybridizing the probe released in step (e) with a detection probe,
  • step (g) enzymatically cleaving the DNA hybridized in step (f) and measuring the intensity of the fluorescence generated at that time;
  • step (h) comparing the fluorescence intensity measured in step (g) with a control
  • step (f) comparing the fluorescence intensity measured in step (e) with a control
  • step (c) a base site present in the peripheral region of the sd-1 gene, wherein the site is any one of (A) to (V) according to [1], or a base paired with a base at the site.
  • step (f) comparing the degree of polarization of the fluorescence measured in step (e) with a control
  • a base site present in the peripheral region of the sd-1 gene wherein the site is any one of (A) to (V) according to [1], or a base paired with a base at the site.
  • step (d) in the presence of a fluorescently labeled nucleotide, performing a single-base extension reaction on the DNA amplified in step (b) using the primer synthesized in step (c),
  • step (e) using a sequencer to determine the base species used in the reaction in step (d),
  • step (f) comparing the base species determined in step (e) with a control
  • step (c) applying the DNA amplified in step (b) to a mass spectrometer to measure the molecular weight
  • step (d) comparing the molecular weight measured in step (c) with a control
  • step (d) contacting the DNA of step (b) with the substrate of step (c),
  • step (f) comparing the intensity detected in step (e) with a control
  • step (d) providing a substrate on which the primer synthesized in step (c) is immobilized
  • step (e) contacting the DNA of step (b) with the substrate of step (d),
  • step (f) in the presence of fluorescently labeled nucleotides, converting the DNA amplified in step (b) into a type, and performing a single base extension reaction using the primer immobilized on a substrate in step (d),
  • a PCR primer for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant wherein the PCR primer is present in the region and is any of (A) to (V) according to [1].
  • a oligonucleotide for amplifying a DNA region containing a base site in a complementary strand that forms a base pair with a base in the site
  • (V) the sd-1 gene which hybridizes with a DNA region containing a base region in a complementary strand forming a base pair with a base at the base according to any one of (v) and having a chain length of at least 15 nucleotides;
  • An oligonucleotide for determining the genotype of the peripheral region
  • the plant is rice, the oligonucleotide according to (16) or (17),
  • a reagent for genotyping the region around the sd-1 gene of a plant comprising the oligonucleotide according to (16) or (17);
  • a reagent for testing a semi-dwarf trait of a plant comprising the oligonucleotide according to (16) or (17),
  • the present inventors have found a polymorphism present in a region around the sd-1 gene of a plant, and a polymorphism at a site described in any of the following (A) to (V). Furthermore, it was found that by detecting these polymorphisms, it was possible to inspect plants for the presence of semi-dwarf traits.
  • the present invention is based on these findings.
  • Z means between base sites.
  • 105 position 106 represents a polymorphic site characterized by a mutation (insertion mutation) in which a base is inserted between the 105th base and the 106th base.
  • the polymorphisms at the sites described in (A) to (V) above can specifically show the following mutations ( ⁇ ′) to (V ′).
  • the polymorphism at position 103 is c to t
  • the polymorphism at position 144 is c to t
  • the polymorphism at position 199 is g to a
  • the polymorphism at position 203 Is a mutation from t to c
  • the polymorphism at position 204 is a mutation from c to t
  • the polymorphism at position 347 is a mutation from c to a.
  • the polymorphism at position 2 is a to t
  • the polymorphism at position 59 is c to g
  • the polymorphism at position 10 is g to t
  • the polymorphism at position 151 is Type is t to g
  • polymorphism at position 304 is a to t
  • polymorphism at position 375 is a to t
  • polymorphism at position 439 is g to a
  • polymorphism at position 577 is c to t
  • polymorphism at position 604 The type is g to t
  • the polymorphism at position 614 is c to a
  • the polymorphism at position 616 is g to a
  • the polymorphism at position 1562 is from t to a
  • the polymorphism at positions 1675 to 1676 is from gg to ta
  • position 1732 The polymorphisms are c to t
  • the polymorphism at position 59 is c to
  • the type is a change from c to t.
  • the mutation from c to t at position 3104 is a mutation detected in cal rose76.
  • the polymorphism at position 105/106 is the insertion of agg between positions 105 and 106
  • the polymorphism at position 568 Z569 is tcagggcagagggt tt acat aaccacacggt t at c gtac
  • the polymorphism at positions 2125 and 2126 is a ca insertion mutation between positions 2125 and 2126.
  • the polymorphism at positions 2503 to 2885 is a deletion mutation of 383 bp from position 2503 to position 2885.
  • the polymorphism at position 58 is a mutation from a to g.
  • the polymorphism at position 78 is a to g
  • the polymorphism at position 331 is t to c
  • the polymorphism at position 337 is a to g
  • polymorphism at position 373 is a to g
  • polymorphism at position 405 is t to c
  • polymorphism at position 423 is g to a
  • polymorphism at position 481 is a to g
  • polymorphism at position 583 Is the mutation from g to t
  • the polymorphism at position 593 is from t to c
  • the polymorphism at position 661 is from c to g
  • the polymorphism at position 685 is from g to a
  • the polymorphism at position 701 is from a to g.
  • the polymorphism at positions 539 to 551 is a deletion mutation of cacctgtgatgat (SEQ ID NO: 28) from position 539 to position 551.
  • the polymorphism at position 351 is a mutation from a to g
  • the polymorphism at position 547 is a to c
  • the polymorphism at position 840 is a mutation from t to a.
  • the polymorphism at positions 201 to 213 is a deletion mutation of tgtgaaattcac (SEQ ID NO: 29) from position 201 to position 213.
  • the polymorphism at position 288 is a to g
  • the polymorphism at position 301 is from t to c
  • the polymorphism at position 525 to 560 is from atgaat from ttcattttaccaatatgacacc tacatgaaaa (SEQ ID NO: : Mutation to 30).
  • the polymorphism at positions 124 to 342 is a deletion mutation of 219b from position 124 to position 342.
  • ⁇ ′ In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, the polymorphism at position 223 is a mutation from c to g.
  • the polymorphism at position 224/225 is an insertion mutation of atcg between positions 224 and 225.
  • the polymorphism at position 210 is a mutation from a to a.
  • the polymorphism at position 380 is a mutation from a to g
  • the polymorphism at position 405 is a mutation from a to c.
  • the polymorphism at position 43 is from c to t
  • the polymorphism at position 84 is from c to t
  • the polymorphism at position 139 is from g to a
  • the polymorphism at position 143 is from t to c
  • the polymorphism at position 144 is t to t
  • the polymorphism at position 287 is a mutation from c to a.
  • the polymorphism at position 101 is from ⁇ to 161
  • the polymorphism at position 161 is from t to g
  • the polymorphism at position 196 is from t to c
  • the polymorphism at position 214 is a mutation from t to c
  • the polymorphism at position 670 is a mutation from g to c
  • the polymorphism at position 926 is a mutation from t to a. is there.
  • the polymorphism at position 194 is a mutation from g to a.
  • the polymorphism at position 170 is a mutation from c to a.
  • the present invention relates to a polymorphism present in the region around the sd-1 gene of a plant, wherein the site is any one of the above (A) to (V), or a complementary chain forming a base pair with a base at the site.
  • a method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant comprising the step of detecting a polymorphism at a site in the above.
  • examples of plants on which the above-described determination method can be performed include rice, wheat, corn, sorghum, corn, potato, lettuce, tomato, and the like. Not done.
  • Examples of the sd_l gene of the present invention include a rice sd-1 gene.
  • the nucleotide sequence of the gene is described in SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence encoded by the gene is described in SEQ ID NO: 24.
  • the sd-1 gene in the present invention also includes a homolog of the above gene.
  • a gene can be obtained by a method known to those skilled in the art, for example, hybridization technology (Southern, EM et. Al., Journal of Molecular Biology 98: 503, 1975) or polymerase chain reaction (PCR). Al., Science 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et. Al., Science 239: 487-491, 198 8) Is possible.
  • a hybridization technique using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 or a part thereof as a probe, or an oligonucleotide that specifically hybridizes to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 as a primer Depending on the PCR technique used, it is possible to isolate DNA having high homology with the above genes from the desired plant.
  • a hybridization reaction is usually performed under stringent conditions.
  • stringent hybridization conditions include 6 M urea, 0.4% SDS, 0.5 x SSC, or equivalent stringent hybridization conditions. More stringing Using highly enzymatic conditions, for example, 6M urea, 0.4% SDS, and O.lxSSC, higher homology can be expected to be isolated.
  • the sequence of the isolated DNA can be determined by a known method.
  • wordlength 3.
  • the analysis can be performed as described in Altschul et al. (Nuclei Acids. Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http: ⁇ ww. Ncbi. Nlm. Nih. Gov.
  • the region around the sd-1 gene means a DNA region of usually 3 cM, preferably 2 cM, more preferably lcM, most preferably 150 kb, on the 5 ′ side and 3 ′ side of the sd_l gene.
  • polymorphism is generally defined as a change in a certain base in one gene that is present at a frequency of 1% or more in a population. “Polymorphism” is not limited to this definition, and includes changes in bases less than ⁇ . Examples of the types of polymorphisms in the present invention include single nucleotide polymorphisms, polymorphisms in which one to several tens of bases (sometimes thousands of bases) are deleted or inserted, and the like. There are no restrictions. In a preferred embodiment of the genotyping method of the present invention, first, DNA is prepared from a test plant.
  • test plant examples include, but are not limited to, leaves, roots, seeds, calli, leaf sheaths, and cultured cells of the above-mentioned plants. Further, those skilled in the art can prepare DNA based on chromosomal DNA extracted from the above-mentioned test plant.
  • Amplify DNA containing bases in the strand examples include a PCR method, but are not particularly limited as long as the method can amplify DNA.
  • the base sequence of the amplified DNA is determined.
  • the DNA base sequence can be determined by a method known to those skilled in the art.
  • the determined DNA base sequence is then compared with a control.
  • the control in this method is usually a wild-type sd-1 gene, and those skilled in the art can obtain nucleotide sequence information of the wild-type sd-1 gene from various gene databases or literatures.
  • the genotyping method of the present invention can be performed by various methods capable of detecting a polymorphism, in addition to the method of directly determining the base sequence of DNA derived from a test plant as described above.
  • the genotyping method of the present invention can be performed by the following method.
  • DNA is prepared from the test plant.
  • the prepared DNA is cut with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments are separated according to their size.
  • the size of the detected DNA fragment is compared with a control.
  • DNA is prepared from a test plant.
  • a base site present in the region around the sd-1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
  • Amplify DNA containing is cut with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments are separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared with a control.
  • Examples of such a method include a method using a restriction enzyme fragment length polymorphism (Restriction Fragment Length Polymorph ism / RFLP) and a PCR-RFLP method.
  • a restriction enzyme fragment length polymorphism Restriction Fragment Length Polymorph ism / RFLP
  • PCR-RFLP method Specifically, when there is a mutation at the recognition site of the restriction enzyme, or when there is a base insertion or deletion in the DNA fragment generated by the restriction enzyme treatment, the size of the fragment generated after the restriction enzyme treatment is compared with that of the control. Change. By amplifying the portion containing this mutation by PCR and treating it with each restriction enzyme, these mutations can be detected as a difference in the mobility of the band after electrophoresis.
  • the presence or absence of the mutation can be detected by treating chromosomal DNA with these restriction enzymes, electrophoresing, and performing Southern blotting using the oligonucleotide of the present invention.
  • the restriction enzyme used can be appropriately selected by those skilled in the art according to each mutation.
  • DNA is prepared from a test plant.
  • the amplified DNA is dissociated into single strands.
  • the dissociated single-stranded DNA is separated on a nondenaturing gel. Compare the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with the control.
  • Examples of the method include a PCR-SSCP (Cloning and polymerase chain reaction-single-st rand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chro mo some) 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphi sm analysis of polymerase chain reaction products.Oncogene. 1991 Aug 1; 6 (8 ): 1313-1318, Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with po st Label ing., PC Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282.).
  • This method has advantages such as relatively simple operation and small amount of test sample, and is particularly suitable for screening a large number of DNA samples.
  • the principle is as follows. When a double-stranded DNA fragment is dissociated into single strands, each strand forms a unique higher-order structure depending on its base sequence. When this dissociated DM chain is electrophoresed in a polyacrylamide gel containing no denaturing agent, the single-stranded DNA with the same length and the same complementary length moves to a different position according to the difference in each higher-order structure. .
  • the substitution of a single base also changes the higher-order structure of the single-stranded DNA, indicating a different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting this change in mobility, it is possible to detect the presence of a mutation due to a point mutation, deletion, insertion or the like in the DNA fragment.
  • the DNA containing the base site in the strand is amplified by PCR or the like.
  • the range to be amplified is usually preferably about 200 to 400 bp.
  • PCR can be performed by those skilled in the art by appropriately selecting reaction conditions and the like.
  • the amplified DNA product can be labeled by using a primer labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin during PCR.
  • the amplified DNA product can be labeled by performing PCR by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin to the PCR reaction solution.
  • labeling can also be performed by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin to the amplified DNA fragment using Klenow enzyme after the PCR reaction.
  • the labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like, and electrophoresis is carried out using a polyacrylamide gel containing no denaturing agent such as urea.
  • the conditions for separating DNA fragments are improved. can do.
  • electrophoresis conditions vary depending on the properties of each DNA fragment.However, the reaction is usually carried out at room temperature (20 to 25 ° C), and when the desired separation cannot be obtained, the optimal mobility is obtained at a temperature of 4 to 30 ° C. Consider the temperature to be given. After electrophoresis, the mobility of the DNA fragments is detected by photoradiography using an X-ray film or a scanner that detects fluorescence and analyzed.
  • this band can be excised directly from the gel, re-amplified by PCR, and sequenced directly to confirm the presence of the mutation. Further, even when the labeled DNA is not used, the band can be detected by staining the gel after electrophoresis with ethidium ore silver staining.
  • DNA is prepared from a test plant (step (a)).
  • step (a) DNA is prepared from a test plant (step (a)).
  • step (b) Two types of probes, labeled with both reporter-fluorescence and quencher-fluorescence, are synthesized on an oligonucleotide complementary to the adjacent base sequence (step (b)).
  • the probe synthesized in the step (b) is hybridized with the DNA prepared in the step (a) (step (c)).
  • step (d) the base site existing in the peripheral region of the sd-1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or the base site in the complementary strand forming a base pair with the base in the site Amplify the containing DNA (step (d)).
  • Step (e) the emission of the repo overnight fluorescence detected in the step (e) is compared with a control (step (f)).
  • reporter fluorescence is labeled at the 5 'end of the probe.
  • examples of the reporter fluorescence include FA and VIC, but are not limited thereto.
  • quencher monofluorescence is labeled at the 3 'end of the probe. Book In the present invention, quencher fluorescence is not particularly limited as long as it is a substance capable of quenching reporter fluorescence.
  • a probe labeled with reporter fluorescence and quencher fluorescence is hybridized to the prepared DNA.
  • a base site present in the region around the sd-1 gene, the site according to any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Is amplified using a DNA polymerase having 5 'nuclease activity.
  • the reporter fluorescence and the quencher fluorescence labeled probe are cleaved at the repo overnight fluorescence labeled portion, and the reporter fluorescence is released.
  • Taq DNA polymerase is preferably exemplified as a DNA polymerase having 5 'nuclease activity, but is not limited thereto.
  • the released repo overnight fluorescence is then detected, and the emission of the repo overnight fluorescence is compared with a control.
  • DNA is prepared from a test plant (step (a)).
  • a probe is synthesized with a sequence complementary to the 3'-side nucleotide sequence containing, and a completely unrelated sequence (step (b)).
  • the base site existing in the region around the sd_l gene which is located at any one of the sites described in any one of the above (A) to (V), or 5% from the base site in the complementary strand forming a base pair with the base at the site.
  • 'Synthesize a probe whose terminal side is complementary is complementary
  • the probe synthesized in step (c) is hybridized with the DNA prepared in step (a) (step (d)).
  • the DNA hybridized in step (d) is cleaved with a single-stranded DNA-cleaving enzyme to release a part of the probe synthesized in step (b) (step (e)).
  • the single-stranded DNA cleavage enzyme is not particularly limited, and examples thereof include the following cleavase.
  • the probe released in step (e) is hybridized with the detection probe (step (f)).
  • the DNA hybridized in step (f) is cut enzymatically, and the intensity of the fluorescence generated at that time is measured. (Step (g)).
  • the fluorescence intensity measured in step (g) is compared with that of a control (step (h)).
  • Examples of the above method include the Invader method (SNP polymorphism strategy, Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, p94-105, Genome Research (2000) 10: 330-343) and the like.
  • a base site present in the region around the sd_l gene the site described in any one of (A) to (V) above, or a complementary strand forming a base pair with a base at the site A probe (probe A) having a sequence (flap) whose sequence is complementary to the type III sequence on the 3 'side and a sequence (flap) irrelevant to the type III sequence on the 5' side from the base site is synthesized.
  • a base site present in the region around the sd-1 gene the site described in any one of (A) to (V) above, or a complementary strand forming a base pair with a base at the site A probe (probe A) having a sequence (flap) whose sequence is complementary to the type III sequence on the
  • Probe B In the probe B, a base site present in the region around the sd_l gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. The base corresponding to is optional. Next, these probes are hybridized to the prepared type I DNA. Next, a base site existing in the region around the sd-1 gene,
  • the hybridized DNA is cleaved using an endonuclease (cl eavase) that cleaves the 3 ′ side of the base of probe A corresponding to the site. This releases the flap portion.
  • the released flap portion and the detection probe are hybridized.
  • the detection probe is generally called a fluorescence resonance energy trans fer (FRET) probe.
  • FRET fluorescence resonance energy trans fer
  • the 5 'side can complementarily bind by itself.
  • the 3 ′ side has a sequence complementary to the flap.
  • the 5' end is labeled with repo overnight fluorescence, and the 3 'side of the 5' end is quenched with fluorescence. Be labeled.
  • the base at the 3 'end of the released flap hybridizes to the FRET probe.
  • the reporter fluorescence of the probe invades the labeled complementary binding site, thereby generating a structure recognized by cleavase.
  • the repo overnight fluorescence released by cleavage of the repo overnight fluorescent label by cleavage is detected, and the measured fluorescence intensity is compared with that of a control.
  • DM is prepared from a test plant (step (a)).
  • a DNA comprising a base site present in the sd_l gene peripheral region, wherein the DNA comprises a site according to any one of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site.
  • the amplified DNA is dissociated into single strands (step (c)).
  • step (d) Next, of the dissociated single-stranded DNA, only one strand is separated (step (d)).
  • An extension reaction is performed one base at a time from the vicinity, pyrophosphoric acid generated at that time is enzymatically emitted, and the intensity of the emission is measured (step (e)).
  • the intensity of the fluorescence measured in step (e) is compared with that of a control (step)). Examples of such a method include the Pyrose quencing method (Anal. Biochem. (2000) 10: 103-110).
  • DNA is prepared from a test plant (step (a)).
  • Amplify the containing DNA step (b)).
  • a primer complementary to the sequence up to one base adjacent to the base site is synthesized (step (c)).
  • step (b) the DNA amplified in step (b) is converted into a type III, and a single base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c) (step (d)).
  • step (e) the degree of polarization of the fluorescence is measured (step (e)). Then, the process
  • the polarization degree of the fluorescence measured in (e) is compared with the control (step (f)).
  • Such methods include, for example, the AcycloPrime method (Chen, X., Levine, L., and Kwok, P.Y.
  • DNA is prepared from a test plant (step 1)
  • step (b) Amplify DNA containing the site described in any one of (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
  • a base site present in the region around the sdl gene which is a site described in any one of the above (A) to (V), or a base in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
  • a primer complementary to the sequence up to one base adjacent to the site is synthesized (step (c)).
  • step (c) the DNA amplified in step (b) is converted into a ⁇ form, and a single base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c) (step
  • step (d) the base species used in the reaction in step (d) is determined using a sequencer (step (e)).
  • the base species determined in step (e) is compared with a control (step (f)).
  • An example of such a method is the SNuPe method (Rapid Commun Mass Spectrom. (2000) 14: 950-959).
  • DNA is first prepared from a test plant (step
  • step (b) a base site present in the region around the sd-1 gene, which is described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand that forms a base pair with a base in the site.
  • step (b) a base site present in the region around the sd_1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
  • step (c) a substrate on which the primer synthesized in step (c) is immobilized is provided.
  • Step (d) a substrate on which the primer synthesized in step (c) is immobilized is provided.
  • step (d) the DNA of step (b) is brought into contact with the substrate of step (d) (step (e)).
  • step (d) a single-base extension reaction is performed using a primer immobilized on a substrate.
  • step (f) determine the base species used in the reaction in step) (step (g)). Examples of such a method include the Arrayed Primer Extension (APEX) method (Clinical Chemistry (2002) 48: 2051-205 4).
  • DNA is prepared from a test plant (step (a)).
  • step (a) the base site existing in the sd-1 gene peripheral region, the site described in any one of the above (A) to (V), or the base site in a complementary strand forming a base pair with the base in the site.
  • step (b) the DNA amplified in step (b) is applied to a mass spectrometer to measure the molecular weight (step (c)).
  • the molecular weight measured in step (c) is compared with a control (step (d)). Examples of such a method include the MALDI-TOF MS method (Trends Biotechnol (2000): 18: 77-84).
  • DNA is prepared from a test plant (step (a)).
  • Amplify the containing DNA step (b)).
  • a substrate having the nucleotide probe immobilized thereon is provided (step (c)).
  • substrate means a plate-like material to which nucleotides can be immobilized.
  • nucleotides include oligonucleotides and polynucleotides.
  • the substrate of the present invention is not particularly limited as long as nucleotides can be immobilized, but a substrate generally used in DNA array technology can be suitably used.
  • DNA arrays are composed of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Usually these DNAs are non-permeable s) Printed on the surface of the substrate.
  • the surface layer of the substrate is generally glass, but a permeable membrane such as a nitrocellulose membrane can be used.
  • an array based on oligonucleotides developed by Affymetrix can be exemplified.
  • the oligonucleotides are usually synthesized in situ (si. Eg, photolithographic technology (Affymetrix), and inkjet (Roset ta Informatics) technology for immobilizing chemicals.
  • the in situ synthesis method of oligonucleotides according to these methods is already known, and any of the techniques can be used for producing the substrate of the present invention.
  • the nucleotide probe to be immobilized on the substrate is a nucleotide probe capable of detecting a polymorphism at the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. If so, there is no particular limitation. That is, the probe specifically hybridizes with, for example, a DNA containing a site described in any one of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. Probe.
  • the nucleotide probe includes the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. It need not be perfectly complementary to DNA.
  • the length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is generally 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases, and more preferably 15 to 25 bases when the oligonucleotide is immobilized. You.
  • step (b) the DNA of step (b) is brought into contact with the substrate of step (c) (step (d)).
  • the DNA is hybridized to the nucleotide probe.
  • the reaction solution and reaction conditions for the hybridization Although it may fluctuate depending on various factors such as the length of the nucleotide probe to be immobilized on the DNA, it can be generally performed by a method well known to those skilled in the art.
  • step (e) the intensity of hybridization between the DNA and the nucleotide probe immobilized on the substrate is detected.
  • This detection can be performed, for example, by reading the fluorescent signal with a scanner or the like.
  • DNA arrays DNA fixed on a slide glass is generally called a probe, while labeled DNA in a solution is called a target. Therefore, the above-mentioned 'nucleotide immobilized on the substrate is referred to herein as a nucleotide probe.
  • the intensity detected in step (e) is then compared with a control (step (e)).
  • Examples of such a method include a DNA array method (SNP genetic polymorphism strategy, Kenichi Matsubara's Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, P128-135, Nature Genetics (1999) 22: 164-167) and the like.
  • SNP genetic polymorphism strategy Kenichi Matsubara's Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, P128-135, Nature Genetics (1999) 22: 164-167) and the like.
  • an allele-specific oligonucleotide (Allele Specific 01 igonucleotide / ASO) hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position.
  • an oligonucleotide containing a nucleotide sequence that is considered to have a mutation is prepared and hybridized with the DNA, the efficiency of octabridged formation is reduced in the presence of the mutation. It can be detected by the Southern plot method or a method utilizing the property of quenching by intercalating a special fluorescent reagent into the gap of the hybrid.
  • the present invention when a polymorphism is detected by the above genotyping method, it is determined that the plant has a semi-dwarf trait.
  • the present invention also provides a method for examining the semi-dwarf trait of such a plant.
  • the present invention also provides a PCR primer for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, wherein the primer is present in the region.
  • the present invention provides an oligonucleotide for amplifying a DNA region containing the site described above or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
  • an oligonucleotide designed to sandwich a site described in any of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site is used.
  • the design and synthesis of PCR primers can be generally performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the length of the PCR primer is not particularly limited, but is usually 15 bp to 100 bp, and preferably 17 bp to 30 bp.
  • the present invention provides a DNA comprising a site according to any one of the above (A) to (V), which is present in a region around the sd_l gene of a plant, or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
  • Oligonucleotides that hybridize with the region and have a chain length of at least 15 nucleotides for determining the genotype of the region around the sd-1 gene are provided.
  • the oligonucleotide is used as a probe.
  • the oligonucleotide specifically hybridizes to the site described in any one of the above (A) to (V) or a DNA region containing a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Things.
  • “specifically hybridizes” means under ordinary hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory). Press, New York, USA, 2nd edition 1989) means that no significant cross-hybridization with other DNA occurs.
  • the oligonucleotide contains a site described in any one of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. It need not be completely complementary to the DNA region.
  • the length of the oligonucleotide is not particularly limited as long as it is 15 nucleotides or more.
  • the oligonucleotide may be, for example, a commercially available oligonucleotide It can be produced by a machine. It can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the oligonucleotide is appropriately labeled before use. Labeling can be performed by phosphorylating the 5 'end of the oligonucleotide with 32 P using T4 polynucleotide kinase, or using a random hexamer using DNA polymerase such as Klenow enzyme.
  • a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin using an oligonucleotide or the like as a primer can be exemplified.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used as a reagent for genotyping the region around the sd-1 gene of a plant. Furthermore, it can be used as a reagent for testing semi-dwarf traits in plants. In the present invention, a reagent for genotyping the region around the sd-1 gene of such a plant or a reagent for testing semi-dwarf traits of a plant is provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a genetic map (schematic) of a region near the rice semi-dwarf gene sd-l.
  • the vertical line indicates a part of chromosome 1.
  • the horizontal line indicates the position of the set marker.
  • the numbers indicate the chain distance (unit: centimorgan). Arrows indicate the location of the sd-1 gene.
  • FIG. 2 shows a genetic map (details) and a physical map of a region near the rice semi-dwarf gene sd-1.
  • the horizontal line indicates a part of chromosome 1.
  • the vertical line and arrow indicate the position of the set marker.
  • the numbers shown below the horizontal lines in FIGS. A and c indicate the number of individuals that have undergone recombination within each interpal, as found from the segregation population of the number indicated by n.
  • Figure d shows the genotype of the recombinant individual used to identify the sd-1 gene, The genotype of the sd-1 gene determined by the growth length, and the genes predicted in the candidate region of the sd-1 gene and their positions are shown.
  • the present inventors used a positional progeny using a mating progeny population of Sasanishiki (a Japanese rice cultivar with normal plant height) and ⁇ bayuki (Indian rice cultivar with semi-dwarf plant height caused by sd-1).
  • Sasanishiki a Japanese rice cultivar with normal plant height
  • ⁇ bayuki Indian rice cultivar with semi-dwarf plant height caused by sd-1).
  • sd-1 gene was found to be a gene encoding gibberellin-20-oxidase (GA20-ox) (Monna et al., DNA Research (2002) 9: 11-17).
  • GA20-ox is an enzyme that catalyzes the oxidation and subsequent elimination of the C-20 position in the gibberellin (GA) biosynthetic pathway.
  • GA3 3-hydroxylase (catalyzes the final step of active GA synthesis) GA3ox) (Hedden, P. and Phillips AL 2000, Gibberellin metabolism: new insights revealed by the genes, Trends in Plant Science (review), 5 (12), 523-530.). Alrabidopsis (Coles, JP, Phillips, AL, Croker, J., Garcia-Lepe, R., Lewis, MJ and Hedden, P.
  • the present inventors found many polymorphisms including a single nucleotide substitution polymorphism between Sasanishiki and Habataki in the vicinity of sd-1 on rice chromosome 1. Issued. Specifically, the procedure was performed as follows.
  • Rice cultivars Sasanishiki and Yabataki were cultivated in the field or greenhouse, and DNA was extracted by CTAB method or simple extraction method. Rice genome sequence information published on the Rice Genome Research Program home page (http: http rgp. Dna.affrc.go.jp/) and DDBJ (http: ⁇ w.
  • the primer design support site Primer3 http://w-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgu
  • a primer was designed to amplify a fragment of an appropriate length from a rice genome DNA sequence (OSJNBa0029f02, 139043bp) registered under DDBJ accession number AC090974, and a rice genome base registered under AP003405.
  • genomic DNA of Sasanishiki and Habataki was type III, and PCR amplification was performed using AmliTaq Gold (Applied Biosystems) or HotStar Taq (QIAGEN). After performing agarose gel electrophoresis using a part of the reaction solution and confirming the amplified fragment, the remaining reaction solution was treated with ExoSAP-IT0JSB) to remove unreacted primers and dNTPs to create a rust-shaped sequence reaction. did. To this type II, one of the primers used for the first amplification was added again as a sequencing primer, and a cycle sequence reaction was performed using the DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBACE (Amersham Bioscience). A sample for the sequence was created. The sequence is MegaBACElOOO
  • Table 1 shows PCR markers, CAPS markers, dCAPS markers, and SNP markers (AcycloPrime-FP reaction (Chen, X., Levine, L., and A list of markers for use in Kwok, PY 1999, Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res., 9, 492-98.) Marker—Polymorphism Site Used Primer Pair Polymorphism
  • TCAGTTGCGGATTGATGCTAGCATCT 6F S 94, 1 TACTTCTCT-3 'Table 1 shows, from the left, the marker name (position is shown in Fig. 1 and Fig. 2), SNP site used, primer sequence, amplified fragment length, restriction enzyme (CAPS , DCAPS only) And how the polymorphism appears. H indicates Habataki and S indicates Sasanishiki.
  • Sasanishiki is a Japanese rice cultivar with a rather high plant height and has a normal Sd-1 gene. Therefore, it was expected that semi-dwarf trait could be imparted by introducing sd-1 into Sasanishiki.
  • the method of cultivating semi-dwarf varieties using the method of the present invention is based on crossing and backcrossing, and allows breeding to proceed while selecting only necessary individuals.
  • To provide a means of breeding semi-dwarf varieties quickly and without waste based on Another advantage is that varieties with the same or higher efficacy can be grown without using genetic recombination techniques.
  • Example 3 Usefulness test of DNA marker in major rice varieties It was presumed that the various DNA markers created in Example 1 could be widely used in rice varieties other than Habayuki and Sasanishiki used for the marker creation. Therefore, an experiment was conducted on main rice varieties in Japan to confirm the usefulness of the DNA marker of the present invention.
  • Genomic DNA was extracted and purified from the seedlings of each variety by a simple extraction method and subjected to genomic PCR type III. Specifically, sterilize the genomic DNA solution to 40 ng / ⁇ l.
  • the mixture was adjusted with Q water, added to the PCR solution (201), and PCR was performed.
  • Table 3 shows the conditions used for PCR for each marker.
  • Cycle reaction 1 94 ° C 30 seconds X. C 30 seconds 72 30 seconds
  • HotStarTaq The conditions when HotStarTaq is used are shown below.
  • the DNA marker according to the present invention can also be used for genotyping the sd_1 (Sd-1) gene and its peripheral region in many rice varieties including Habataki / Sasanishiki. Was done.
  • Table 4 shows the polymorphisms found in the main varieties.
  • SNPs single nucleotide substitution polymorphisms
  • RFLP and CAPS existing molecular genetic techniques
  • the differences in the nucleotide sequence found between the normal and semi-dwarf varieties around the semi-dwarf gene sd-1 were caused by crossing in the process of growing new varieties with semi-dwarf traits. This is useful for the purpose of examining to what extent a hybrid individual has a chromosomal fragment containing a gene that controls the semi-dwarf trait, and whether the chromosomal fragment is heterozygous or homozygous.
  • the test for semi-dwarfness requires measurement of the canopy length (the length from the root to the ankle) at the stage when rice heads and ripens and the ear drops, but polymorphism including SNPs is used.
  • the canopy length the length from the root to the ankle
  • polymorphism including SNPs is used.
  • dinotyping individuals can collect DNA in seedlings for testing, which saves time and reduces the area and labor required to cultivate unnecessary individuals.

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Abstract

By positional cloning with the use of a Sasanishiki-Habataki mating progeny population, a rice semi-dwarf gene sd-1 is isolated and identified. In this process, a large number of polymorphisms including single nucleotide polymorphisms between Sasanishiki and Habataki are found out around the sd-1 on the first chromosome in rice. Using some of the obtained polymorphisms, markers enabling genotyping are constructed by the CAPS or dCAPS method. As a result, the semi-dwarf characteristic of rice can be examined with the use of these markers.

Description

植物の s d— 1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法、 および該方法を用いた植物の半わい性形質の検査方法 技術分野  TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, and a method for testing a semi-dwarf trait in a plant using the method.
本発明は、 植物の sd- 1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方法を用 いた植物の半わい性形質の検査方法に関する。 背景技術  The present invention relates to a method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant and a method for examining the semi-dwarf trait of a plant using the method. Background art
半わい性はイネをはじめとする穀類の最も重要な形質の一つである。 イネの半 わい性遺伝子 sd-1は、 「緑の革命」 遺伝子としてよく知られており、 1960〜19 70年代の、 とくにアジア地域における穀物の著しい増収に貢献したものである Semi-dwarfness is one of the most important traits of rice and other cereals. The rice semi-dwarf gene sd-1 is well known as the "green revolution" gene and contributed to a significant increase in grain sales in the 1960s and 1970s, especially in Asia
(Fuisuhara, Y. and Kikuchi, F. 1997, Science of the Rice Plant, vol. 3.(Fuisuhara, Y. and Kikuchi, F. 1997, Science of the Rice Plant, vol. 3.
Matsuo, T. , Futsuhara, Y. , Kikuchi, F. & Yamaguchi, H. (eds.), pp. 300- 318. Food and Agriculture Policy Research Center, Tokyo. ) 。 元来、 中国の 品種である低脚鳥尖 Dee- Geo- Woo- Gen (DGWG) に由来するこの遺伝子は、 イネ品 種に短く、 太い茎をもたらし、 収穫量指数を増加させ、 冠水への抵抗性と窒素肥 料応答性を増し、 穂あるいは穀粒に負の影響を与えることなく収量を増加させる ことができる (Futsuhara, Y. and Kikuchi, F. 1997, Science of the Rice PI ant, vol. 3. Matsuo, T.， Futsuhara, Y.， Kikuchi, F. & Yamaguchi, H. (ed s.)， pp. 300-318. Food and Agriculture Policy Research Center, Tokyo.) 。 sd-1遺伝子の導入は従来の育種法により行われてきたが、 この遺伝子が非常 に重要であることから、 遺伝子工学を介した多収品種の育成のためにも該遺伝子 の同定が強く望まれてきた。 sd— 1遺伝子については、 第 1染色体のいくつかの タンパク質遺伝子座 （Cho， Y.G.， Eun, M. Υ. , Kim, Υ.Κ., Chung, T.Y. and Cha e, Y. A. 1994, The semidwarf gene, sd - 1， of rice (Oryza sativa L.) . I. Li nkage with the esterase locus, Estl-2, T eor. Ap l. Genet. , 89, 49-53. , Nakamura, A.， Hirano, H. and Kikuchi, F. 1991, A protein gene Srp(t) lin ked wi th a semidwarf ing gene sd-1 in rice, Japan. J. Breed. , 41, 517-52 1. , akamura, A. , Komatsu S. , Xia, B.-S. and Hirano, H. 1995, Linkage an alysis of the gene loci for seed glutelin (Glu-1), semidwarf ism (sd-1) a nd shattering habit (sh-2) in rice (Oryza sativa L. ) , Breeding Sci. , 45,Matsuo, T., Futsuhara, Y., Kikuchi, F. & Yamaguchi, H. (eds.), Pp. 300-318. Food and Agriculture Policy Research Center, Tokyo. Originally derived from the Chinese cultivar low-legged apex Dee-Geo-Woo-Gen (DGWG), this gene provides shorter and thicker stems to rice varieties, increases yield index and reduces flooding. Increases resistance and response to nitrogen fertilizer, and can increase yield without negatively affecting ears or grains (Futsuhara, Y. and Kikuchi, F. 1997, Science of the Rice PI ant, vol. 3. Matsuo, T., Futsuhara, Y., Kikuchi, F. & Yamaguchi, H. (ed s.), Pp. 300-318. Food and Agriculture Policy Research Center, Tokyo.). Although the introduction of the sd-1 gene has been carried out by the conventional breeding method, since this gene is very important, it is strongly desired to identify the gene for breeding high-yielding varieties through genetic engineering. It has been rare. For the sd-1 gene, several protein loci on chromosome 1 (Cho, YG, Eun, M. Υ., Kim, Υ.Κ., Chung, TY and Cha e, YA 1994, The semidwarf gene, sd-1; of rice (Oryza sativa L.). I. Linkage with the esterase locus, Estl-2, T eor. Ap l. Genet., 89, 49-53. , Nakamura, A., Hirano, H. and Kikuchi, F. 1991, A protein gene Srp (t) lin ked wi th a semidwarfing gene sd-1 in rice, Japan.J. Breed., 41, 517-52 1., akamura, A., Komatsu S., Xia, B.-S. and Hirano, H. 1995, Linkage an alysis of the gene loci for seed glutelin (Glu-1), semidwarf ism (sd-1) a nd shattering habit (sh-2) in rice (Oryza sativa L.), Breeding Sci., 45,
185-188. , Yokoo, . and Saito, S. 1986, Association between grain shatt ering and semi dwarf ness in rice, Rice Genetics Newsletter, 3, 63-65. ) お よびいくつかの分子マーカー （Cho， Y.G., Eun, M. Y. , McCouch, S.R. and C ae,185-188., Yokoo,. And Saito, S. 1986, Association between grain shattering and semi dwarfness in rice, Rice Genetics Newsletter, 3, 63-65.) And several molecular markers (Cho, YG, Eun, MY, McCouch, SR and C ae,
Y. A. 1994b, The semidwarf gene, sd-1, of rice (Oryza sativa L.) . II. Mo lecular map ing and marker assisted selection, Theor. Ap l. Genet. , 89, 54-59., Maeda, H. , Ishii, T. , Mori, H. , Kuroda, J. et al. 1997, High den sity molecular map of semidwarf ing gene, sd-1, in rice, Breeding Sci. , 4 7, 317-320., Ogi, Y. , Kato, H.， Maruyama, K.， Saito, A. and Kikuchi, F. 1993, Identification of RFLP markers closely linked to the semidwarf ing gene at the sd-1 locus in rice, Japan. J. Breed. , 43, 141-146.) に連鎖す ることが報告されている。 しかしながら、 これらの研究における遺伝解析の精度 は不十分であり、 本遺伝子の同定には到っていない。 YA 1994b, The semidwarf gene, sd-1, of rice (Oryza sativa L.). II.Molecular mapping and marker assisted selection, Theor.Apl.Genet., 89, 54-59., Maeda, H. , Ishii, T., Mori, H., Kuroda, J. et al. 1997, High density molecular map of semidwarfing gene, sd-1, in rice, Breeding Sci., 4 7, 317-320., Ogi , Y., Kato, H., Maruyama, K., Saito, A. and Kikuchi, F. 1993, Identification of RFLP markers closely linked to the semidwarfing gene at the sd-1 locus in rice, Japan. J. Breed , 43, 141-146.). However, the accuracy of the genetic analysis in these studies is insufficient, and the identification of this gene has not been completed.
ポジショナルクローニングは、 自然に起こる遺伝的組換えを利用して遺伝子の 単離 ·同定を行う戦略である。 有性生殖を行う生物種の染色体上にコードされて いる観察可能な形質であれば、 理論上全てポジショナルクローニングの対象とす ることができる。 形質遺伝子のポジショナルクローニングを行った例は、 ァラビ ドプシス (LukowUz, W., Gillior, C.S. and Sc eible, W. R. 2000， Positiona 1 cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you, Plant Physiol. , 123, 795-805.) 、 トマト (Alpert, . B. and Tanks ley S. D. 1996, High-resolution map ing and isolation of a yeas t artificial chromosome contig containing fw2.2: A major fruit weight qu anti tative trait locus in tomato, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 24, 15503- 15507.) 、 およびイネ （Takahashi Y.， Shomura A. , Sasaki T. and Yano M. 20 01, Hd6, a rice quantitative trait locus involved in photoperiod sensi ti vity, encodes the alpha subunit of protein kinase CK2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(14), 7922-7927., Yano, M. , Katayose, Y. , Ashikari, M. 2000， Hdl， a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS, Plan t Cell, 12, 2473-2483.) などの高等植物で報告がある。 Positional cloning is a strategy for isolating and identifying genes using naturally occurring genetic recombination. In theory, any observable trait encoded on the chromosome of a sexually reproducing species can be targeted for positional cloning. An example of positional cloning of trait genes is described in Arabidopsis (LukowUz, W., Gillior, CS and Scible, WR 2000, Positiona 1 cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you, Plant Physiol , 123, 795-805.) And tomatoes (Alpert,. and Tanks ley SD 1996, High-resolution map ing and isolation of a yeas t artificial chromosome contig containing fw2.2: A major fruit weight qu anti tative trait locus in tomato, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 24, 15503 -15507.), and rice (Takahashi Y., Shomura A., Sasaki T. and Yano M. 2001, Hd6, a rice quantitative trait locus involved in photoperiod sensi tiity, encodes the alpha subunit of protein kinase CK2, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 98 (14), 7922-7927., Yano, M., Katayose, Y., Ashikari, M. 2000, Hdl, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related. to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS, Plant Cell, 12, 2473-2483.).
ポジショナルクローニングには、 大規模な分離集団の解析が必須である。 近年、 cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) (Konieczny A. and Ausubel F. 1993, A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype - specif ic PCR-based markers, Plant J. , 4: 403-410. ) あるレは der ived - CAPS (dCAPS) (Neff M. M. , Neff J. D. , C ory J. and Pepper A.E. 1998， dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms： experimental applications in Arabidopsis thaliana geneti cs， Plant J., 14:387-392.) といった PCRを基盤としたマーカー技術の進展に より、 多数の植物個体を生育初期のうちに短期間で解析することが可能となった。 また、 イネに関して以下のような関連特許が知られている。  Analysis of large segregated populations is essential for positional cloning. Recently, there is a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) (Konieczny A. and Ausubel F. 1993, A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers, Plant J., 4: 403-410.) Derived-CAPS (dCAPS) (Neff MM, Neff JD, Cory J. and Pepper AE 1998, dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics, Plant J. , 14: 387-392.), It has become possible to analyze a large number of plant individuals in a short period of time in the early growth stage. The following related patents are known for rice.
• 「イネ雑種不稔座 S_ 5座近傍に位置する DNAマーカ一およびこれを用いた S- 5座の遺伝子型の判別方法」 （特開 2000-342267)  • “A DNA marker located near the S_5 locus in the rice hybrid sterility locus and a method for determining the genotype of the S-5 locus using the DNA marker” (JP-A-2000-342267)
• 「ィネ雑種不稔座近傍に位置する DNAマーカー及びこれを用いた雑種不稔座 の遺伝子型の判別方法」 （特開 2000-342266)  • “DNA marker located near rice hybrid sterility locus and method for determining genotype of hybrid sterility locus using the same” (JP-A-2000-342266)
• 「イネの穂いもち抵抗性を間接的に識別できる分子マーカ一」 （特開 2000-27 9170) • 「ィネの細胞質雄性不稔回復遺伝子近傍に位置する D NAマーカ一およびこれ を用いた細胞質雄性不稔回復遺伝子の判別方法」 （特開 2000-139465)• “A molecular marker that can indirectly identify rice blast resistance” (JP-A-2000-27 9170) • "A DNA marker located near the cytoplasmic male sterility recovery gene in rice and a method for determining the cytoplasmic male sterility recovery gene using the DNA marker" (JP-A-2000-139465)
• 「半矮性遺伝子の近傍に位置するマイクロサテライトマ一力一およびこれを用 いた半矮性遺伝子の検定方法」 （特開平 11-253167) • "Microsatellite markers located near the semi-dwarf gene and a method for assaying the semi-dwarf gene using the same" (JP-A-11-253167)
• 「イネのトビイロゥンカ抵抗性の検定方法、 D N A断片及び P C Rマ一力一」 (特開平 11- 206376)  • “Assay method for rice resistance to brown sparrows, DNA fragments and PCRs” (JP-A-11-206376)
• 「イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置する D N Aマーカーおよび D N A診断法」 （特開平 09-313187)  • "DNA marker and DNA diagnostic method located near rice cytoplasmic male sterility restoration gene" (JP-A-09-313187)
. 「イネのいもち病抵抗性遺伝子の核酸マーカーと、 この マーカーによって得 られるイネいもち病抵抗性遺伝子」 （特開平 07-163371)  "Nucleic acid marker of rice blast resistance gene and rice blast resistance gene obtained by using this marker" (JP-A-07-163371)
• 「イネのいもち病抵抗性遺伝子の核酸マ一カーと、 この マ一カーによって得 られるイネいもち病抵抗性遺伝子」 （特開平 07-163357)  • "Nucleic acid marker of rice blast resistance gene and rice blast resistance gene obtained by this marker" (JP-A-07-163357)
• 「イネの開穎角度に関与する染色体領域、 該領域を含む栽培イネ及び該領域の 識別法」 （特開 2000-270864)  • “Chromosomal region involved in rice sperm angle, cultivated rice including the region, and method for identifying the region” (JP-A-2000-270864)
• 「イネのツマグロョコバイ耐虫性を識別するための方法」 （特開平 11-10389 3)  • “A method for identifying insect resistance to rice leafhopper” (JP-A-11-103893)
• 「イネ縞葉枯病抵抗性を間接的に識別できる分子マーカー」 （特開平 11-0895 83)  • "Molecular markers that can indirectly identify resistance to rice stripe disease" (JP-A-11-089583)
• 「オリゴヌクレオチドを用いるイネ品種の識別方法」 （特開平 06-113852 ) • "Method of identifying rice varieties using oligonucleotides" (JP 06-113852A)
• 「オリゴヌクレオチドを用いるイネ品種の識別方法」 （特開平 06-113851) 発明の開示 • "Method for identifying rice varieties using oligonucleotides" (Japanese Patent Laid-Open No. 06-113851)
本発明の目的は、 植物の sd- 1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方 法を用いた植物の半わい性形質の検査方法を提供することにある。  An object of the present invention is to provide a method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant and a method for testing a semi-dwarf trait of a plant using the method.
本発明者らは、 ササニシキ （正常な草丈をもつ日本型イネ品種） 'ハバタキ (sd-1に起因する半わい性の草丈をもつインド型イネ品種） の交配後代集団を 用いたポジショナルクローニングにより、 イネの半わい性遺伝子 sd-1を単離 · 同定した （Monna et al., DNA Research (2002) 9: 11-17) 。 その過程で、 イネ 第 1染色体上の sd-1周辺部分に、 ササニシキ ·ハバタキ間での一塩基置換多型 を含む多型を多数見出した。 得られた多型のいくつかについて、 CAPSまたは dCA PS法でジエノタイピングが可能となるようマーカ一化を行った。 次いで、 コシ ヒカリに半わい性形質を導入するモデル実験を行った。 その結果、 該マ一力一を 用いることで、 ィネの半わい性形質を検査できることが明らかになつた。 The present inventors have developed a hybrid progeny of Sasanishiki (Japanese rice cultivar with normal plant height) and Habataki (Indian rice cultivar with semi-dwarf plant height caused by sd-1). By using positional cloning, rice semi-dwarf gene sd-1 was isolated and identified (Monna et al., DNA Research (2002) 9: 11-17). In the process, many polymorphisms including single nucleotide substitution polymorphism between Sasanishiki and Habataki were found around sd-1 on rice chromosome 1. For some of the obtained polymorphisms, markers were unified so that dienotyping could be performed by the CAPS or dCA PS method. Next, a model experiment for introducing a semi-dwarf trait into Koshihikari was performed. As a result, it was revealed that the semi-dwarf trait of rice can be examined by using the above-mentioned method.
即ち、 本発明は、 植物の sd- 1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定方法および該方 法を用いた植物の半わい性形質の検査方法に関し、 より具体的には、  That is, the present invention relates to a method for determining the genotype of the plant sd-1 gene peripheral region and a method for examining the semi-dwarf trait of a plant using the method, more specifically,
〔1〕 植物の s d— 1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、 以下の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相 補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、 植物の s d— 1遺伝子周辺領域 の遺伝子型判定方法、  [1] A polymorphism present in the region around the sd-1 gene of a plant, wherein the site is any one of the following (A) to (V), or a complementary chain forming a base pair with a base at the site: A method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, comprising the step of detecting a polymorphism at a site in
(A) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 1 0 3位、 144位、 1 9 9位、 20 3 位、 204位、 または、 347位、  (A) SEQ ID NO: 103, 144, 199, 203, 204, or 347 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
(B) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 2位、 5 9位、 1 0 5Z1 0 6位、 1 1 0位、 1 5 1位、 3 04位、 3 7 5位、 43 9位、 568/56 9位、 5 77位、 604位、 6 1 4位、 6 1 6位、 1 5 6 2位、 1 6 7 5〜 1 6 7 6位、 1 732 位、 1 852位、 1 8 78位、 1 9 3 5位、 2 1 2 1位、 2 1 2 5/2 1 26位、 2 50 3〜 28 8 5位、 または、 3 1 04位、  (B) SEQ ID NO: 2, 2, 59, 105, 106, 110, 151, 304, 375, 439, 439 of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 568/56 9th place, 577th place, 604th place, 614th place, 616th place, 1566th place, 16675-16-16766th place, 1732th place, 1852th place, 18th place 78th place, 1 9 3 5th place, 2 1 2 1st place, 2 1 2 5/2 1 26th place, 2 50 3 ~ 28 8 5th place, or 3 104th place,
(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 58位、  (C) position 58 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
(D) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 86位、 または、 2 7 7〜3 0 6位、 (D) position 86 or 277 to 306 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4,
(E) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 7 8位、 3 3 1位、 33 7位、 3 64位、 3 7 3位、 40 5位、 42 3位、 48 1位、 5 3 9〜5 5 1位、 58 3位、 5 9 3位、 66 1位、 6 8 5位、 または、 7 0 1位、 (F) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 201〜213位、 351位、 547位、 または、 840位、 (E) positions 78, 331, 337, 364, 373, 405, 423, 481, 533 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 ~ 5 5 1st, 58 3rd, 59 3rd, 66 1st, 685th, or 70 1st, (F) positions 201 to 213, 351, 547, or 840 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6,
(G) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 103位、 221位、 または、 264位、 (G) position 103, position 221 or position 264 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7,
(H) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 59位、 (H) position 59 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8,
( I ) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 288位、 301位、 または、 525〜 (I) position 288, position 301, or 525- of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9;
560位、 560th,
( J ) 配列番号： 10に記載の塩基配列の 124〜 342位、  (J) positions 124 to 342 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10,
(K) 配列番号： 11に記載の塩基配列の 223位、 または、 224/225位、 (K) position 223 or 224/225 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11,
(L) 配列番号： 12に記載の塩基配列の 314位、 (L) SEQ ID NO: 314 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12,
(M) 配列番号： 13に記載の塩基配列の 320位、  (M) position 320 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13,
(N) 配列番号： 14に記載の塩基配列の 70位、 137位、 170位、 または、 (N) position 70, position 137, position 170 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14, or
691位、 691st,
(0) 配列番号： 15に記載の塩基配列の 210位、  (0) SEQ ID NO: Position 210 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15,
(P) 配列番号： 16に記載の塩基配列の 380位、 または、 405位、  (P) position 380 or position 405 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16;
(Q) 配列番号： 17に記載の塩基配列の 43位、 84位、 139位、 143位、 1 4位、 または、 287位、  (Q) SEQ ID NO: 17, positions 43, 84, 139, 143, 14 or 287 of the base sequence described in SEQ ID NO: 17,
(R) 配列番号： 18に記載の塩基配列の 101位、 161位、 196位、 また は、 653位、  (R) positions 101, 161, 196, or 653 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
(S) 配列番号： 19に記載の塩基配列の 319Z320位、  (S) SEQ ID NO: 19, position 319Z320 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19,
(T) 配列番号： 20に記載の塩基配列の 214位、 670位、 または、 926 位、  (T) position 214, 670 or 926 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 20,
(U) 配列番号： 21に記載の塩基配列の 194位、  (U) position 194 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21,
(V) 配列番号： 22に記載の塩基配列の 170位、  (V) position 170 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22,
〔2〕 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、  [2] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (c):
(a) 被検植物体から DN Aを調製する工程、 (b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程、 (a) preparing a DNA from a test plant, (b) a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a base paired with a site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Amplifying DNA containing a base site in the strand,
(c) 増幅した DNAの塩基配列を決定する工程、  (c) determining the base sequence of the amplified DNA,
〔3〕 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [3] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (d):
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
(b) 調製した DNAを制限酵素により切断する工程、  (b) cutting the prepared DNA with a restriction enzyme,
(c) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程、  (c) separating a DNA fragment according to its size,
(d) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程、  (d) comparing the size of the detected DNA fragment with a control,
〔4〕 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [4] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (e):
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む D N Aを増幅する工程、  (b) a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a base paired with a site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Amplifying DNA containing a base site in the strand,
(c) 増幅した DNAを制限酵素により切断する工程、  (c) cutting the amplified DNA with a restriction enzyme,
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程、  (d) separating a DNA fragment according to its size,
(e) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程、  (e) comparing the size of the detected DNA fragment with a control,
〔5〕 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [5] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (e):
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程、  (b) a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a base paired with a site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Amplifying DNA containing a base site in the strand,
(c) 増幅した DNAを一本鎖に解離させる工程、  (c) dissociating the amplified DNA into single strands,
(d) 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程、  (d) separating the dissociated single-stranded DNA on a non-denaturing gel,
( e ) 分離した一本鎖 D N Aのゲル上での移動度を対照と比較する工程、 〔6〕 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 (a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (e) a step of comparing the mobility of the separated single-stranded DNA on a gel with a control, (6) the method of (1), comprising the following steps (a) to (f): (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d_l遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチ ドに、 レポ一夕一蛍光とクェンチヤ一蛍光の 2つを標識したプローブを 2種類合 成する工程、  (b) a base site present in the region around the s d_l gene, wherein the site according to any one of (A) to (V) according to [1], or a complementary strand forming a base pair with a base at the site; A step of synthesizing two types of probes labeled with two repo overnight and quencher monofluorescents on an oligonucleotide complementary to a base sequence including a base site in the above,
(c) 工程 （a) で調製した DNAに、 工程 （b) で合成したプローブをハイブ リダィズさせる工程、  (c) hybridizing the DNA prepared in step (a) with the probe synthesized in step (b),
(d) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む D N Aを増幅する工程、  (d) a base site present in the region around the sd-1 gene, wherein the base forms a base pair with the base according to any one of (A) to (V) described in [1] or Amplifying DNA containing a base site in the strand,
(e) レポーター蛍光の発光を検出する工程、  (e) detecting the emission of reporter fluorescence,
(f) 工程 （e) で検出したレポ一ター蛍光の発光を対照と比較する工程、 〔7〕 以下の （a) 〜 （h) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、  (f) comparing the emission of the reporter fluorescence detected in step (e) with a control, (7) including the following steps (a) to (h), the determination method according to (1),
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、  (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔 1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む 3 '側塩基配列と相補的な配列、 および全く 無関係な配列を合わせたプローブを合成する工程、  (b) a base site present in the peripheral region of the sd-1 gene, wherein the base forms a base pair with a base according to any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; A step of synthesizing a probe that combines a sequence complementary to the 3′-side nucleotide sequence including the nucleotide site in the strand, and a completely unrelated sequence,
( c ) s d- 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔 1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位から 5 '末端側が相補的なプローブを合成する工程、 (c) a base site present in the region around the sd-1 gene, which forms a base pair with the site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; A step of synthesizing a probe whose 5 ′ end is complementary to the base site in the complementary strand,
(d) 工程 （c) で合成したプローブと工程 （a) で調製した DNAとハイプリ ダイズさせる工程、 (d) hybridizing the probe synthesized in step (c) with the DNA prepared in step (a),
(e) 工程 （d) でハイブリダィズした DNAを一本鎖 DNA切断酵素で切断し、 工程 （b) で合成したプローブの一部を遊離させる工程、 (f ) 工程 (e) で遊離したプローブと、 検出用プローブとをハイブリダィズさ せる工程、 (e) cleaving the DNA hybridized in step (d) with a single-stranded DNA cleaving enzyme to release a part of the probe synthesized in step (b); (f) a step of hybridizing the probe released in step (e) with a detection probe,
(g) 工程 （f) でハイブリダィズした DNAを酵素的に切断し、 その際に発生 する蛍光の強度を測定する工程、  (g) enzymatically cleaving the DNA hybridized in step (f) and measuring the intensity of the fluorescence generated at that time;
(h) 工程 （g) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程、  (h) comparing the fluorescence intensity measured in step (g) with a control,
〔8〕 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [8] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (f):
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する工程、  (b) a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a base paired with a site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Amplifying a DNA containing a base site in the strand,
(c) 増幅した DNAを一本鎖に解離させる工程、  (c) dissociating the amplified DNA into single strands,
(d) 解離させた一本鎖 DNAのうち、 片鎖のみを分離する工程、  (d) separating only one strand of the dissociated single-stranded DNA,
(e) s d- 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔 1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の近傍より 1塩基ずつ伸長反応を行い、 その際に生 成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、 発光の強度を測定する工程、  (e) a base site present in the region around the sd-1 gene, which forms a base pair with the site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Performing an elongation reaction one base at a time from the vicinity of the base site in the complementary strand, enzymatically emitting pyrophosphate generated at that time, and measuring the emission intensity;
(f ) 工程 （e) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程、  (f) comparing the fluorescence intensity measured in step (e) with a control,
〔9〕 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [9] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (f):
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
( b ) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であつて、 〔 1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程、  (b) a base site present in the region surrounding the sd-1 gene, which is a site described in any one of (A) to (V) described in [1], or a base paired with a base at the site. Amplifying DNA containing a base site in the strand,
(c) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマ—を合成 する工程、 (d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマ一を用いて一塩基伸長反応を行う工程、(c) a base site present in the peripheral region of the sd-1 gene, wherein the site is any one of (A) to (V) according to [1], or a base paired with a base at the site. Synthesizing a primer complementary to the sequence up to one base next to the base site in the strand, (d) in the presence of a fluorescently labeled nucleotide, performing a single-base extension reaction using the primer synthesized in step (c) with the DNA amplified in step (b)
(e) 蛍光の偏光度を測定する工程、 (e) measuring the degree of polarization of the fluorescence,
(f ) 工程 （e) で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程、  (f) comparing the degree of polarization of the fluorescence measured in step (e) with a control,
〔10〕 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [10] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (f):
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程、  (b) a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a base paired with a site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Amplifying DNA containing a base site in the strand,
(c) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマ一を合成 する工程、  (c) a base site present in the peripheral region of the sd-1 gene, wherein the site is any one of (A) to (V) according to [1], or a base paired with a base at the site. Synthesizing a primer complementary to the sequence up to one base next to the base site in the strand,
(d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程、 (d) in the presence of a fluorescently labeled nucleotide, performing a single-base extension reaction on the DNA amplified in step (b) using the primer synthesized in step (c),
(e) シーケンサーを利用して、 工程 （d) で反応に使われた塩基種を判定する 工程、 (e) using a sequencer to determine the base species used in the reaction in step (d),
(f ) 工程 （e) で判定された塩基種を対照と比較する工程、  (f) comparing the base species determined in step (e) with a control,
〔11〕 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [11] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (d):
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程、  (b) a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a base paired with a site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Amplifying DNA containing a base site in the strand,
(c) 工程 （b) で増幅した DNAを質量分析器にかけ、 分子量を測定する工程、 (c) applying the DNA amplified in step (b) to a mass spectrometer to measure the molecular weight,
(d) 工程 （c) で測定した分子量を対照と比較する工程、 (d) comparing the molecular weight measured in step (c) with a control,
〔12〕 以下の （a) 〜 （O の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 (a) 被検植物体から DNAを調製する工程、 [12] The determination method according to [1], including the following steps (a) to (O), (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する工程、  (b) a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a base paired with a site described in any one of (A) to (V) described in [1] or a base in the site; Amplifying a DNA containing a base site in the strand,
( c ) ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程、  (c) providing a substrate having nucleotide probes immobilized thereon,
(d) 工程 （b) の DNAと工程 （c) の基板を接触させる工程、  (d) contacting the DNA of step (b) with the substrate of step (c),
( e ) 該 D N Aと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダィズ の強度を検出する工程、  (e) detecting the intensity of hybridization between the DNA and the nucleotide probe immobilized on the substrate,
(f ) 工程 (e) で検出された強度を対照と比較する工程、  (f) comparing the intensity detected in step (e) with a control,
〔13〕 以下の （a) 〜 （g) の工程を含む、 〔1〕 に記載の判定方法、 [13] The determination method according to [1], comprising the following steps (a) to (g):
( a ) 被検植物体から DNAを調製する工程、 (a) preparing DNA from a test plant,
(b) s d_l遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程、  (b) a base site present in the region around the s d_l gene, wherein the site according to any one of (A) to (V) according to [1], or a complementary strand forming a base pair with a base at the site; Amplifying the DNA containing the base site in
(c ) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 〔 1〕 に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成 する工程、  (c) a base site present in the region around the sd-1 gene, wherein the base forms a base pair with the base described in any one of (A) to (V) described in [1], or Synthesizing a primer complementary to the sequence up to one base next to the base site in the strand,
(d) 工程 （c) で合成したプライマーが固定された基板を提供する工程、 (d) providing a substrate on which the primer synthesized in step (c) is immobilized,
(e) 工程 （b) の DNAと工程 （d) の基板を接触させる工程、 (e) contacting the DNA of step (b) with the substrate of step (d),
(f ) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを鎵 型とし、 工程 （d) で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う 工程、  (f) in the presence of fluorescently labeled nucleotides, converting the DNA amplified in step (b) into a type, and performing a single base extension reaction using the primer immobilized on a substrate in step (d),
(g) スキャナ一を用いて、 工程 （f) で反応に使われた塩基種を判定する工程、 〔14〕 植物がイネである、 〔1〕 〜 〔13〕 のいずれかに記載の判定方法、 〔1 5〕 植物の半わい性形質の検査方法であって、 〔1〕 〜 〔1 4〕 のいずれ かに記載の判定方法により多型が検出された場合に、 植物が半わい性形質を有す るものと判定される方法、 (g) using a scanner to determine the base species used in the reaction in step (f), [14] the method according to any one of [1] to [13], wherein the plant is rice; , (15) A method for examining a semi-dwarf trait of a plant, wherein when the polymorphism is detected by the determination method according to any of (1) to (14), the plant has the semi-dwarf trait. Method to be determined to have,
〔1 6〕 植物の s d— 1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するための P C Rプ ライマ一であって、 該領域に存在する、 〔1〕 に記載の （A) 〜 （V) のいずれ かに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基 部位を含む D N A領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド、  [16] A PCR primer for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, wherein the PCR primer is present in the region and is any of (A) to (V) according to [1]. Or a oligonucleotide for amplifying a DNA region containing a base site in a complementary strand that forms a base pair with a base in the site,
〔1 7〕 植物の s d _ 1遺伝子周辺領域に存在する、 〔 1〕 に記載の （A) 〜 [17] the present invention according to [1], which is present in the region around the sd_1 gene of the plant.
(V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補 鎖における塩基部位を含む D NA領域とハイブリダィズし、 少なくとも 1 5ヌク レオチドの鎖長を有する、 s d— 1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するための オリゴヌクレオチド、 (V) the sd-1 gene, which hybridizes with a DNA region containing a base region in a complementary strand forming a base pair with a base at the base according to any one of (v) and having a chain length of at least 15 nucleotides; An oligonucleotide for determining the genotype of the peripheral region,
〔1 8〕 植物がイネである、 〔1 6〕 または 〔1 7〕 に記載のオリゴヌクレオ チド、  (18) the plant is rice, the oligonucleotide according to (16) or (17),
〔1 9〕 〔1 6〕 または 〔1 7〕 に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 植物の s d— 1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬、  (19) a reagent for genotyping the region around the sd-1 gene of a plant, comprising the oligonucleotide according to (16) or (17);
〔2 0〕 〔1 6〕 または 〔1 7〕 に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 植物の 半わい性形質検査用試薬、  (20) a reagent for testing a semi-dwarf trait of a plant, comprising the oligonucleotide according to (16) or (17),
〔2 1〕 植物がイネである、 〔1 9〕 または 〔2 0〕 に記載の試薬、 を提供す るものである。  [21] The reagent according to [19] or [20], wherein the plant is rice.
本発明者らは、 植物の sd-1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、 下記の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位の多型を見出した。 さらに、 これらの多 型を検出することにより、 植物について半わい性形質の有無を検査することが可 能であることを見出した。 本発明は、 これらの知見に基づいたものである。  The present inventors have found a polymorphism present in a region around the sd-1 gene of a plant, and a polymorphism at a site described in any of the following (A) to (V). Furthermore, it was found that by detecting these polymorphisms, it was possible to inspect plants for the presence of semi-dwarf traits. The present invention is based on these findings.
(A) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 103位、 144位、 199位、 203位、 204位、 または、 347位。 ( B ) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 2位、 59位、 105 106位、 110位、 151 位、 304位、 375位、 439位、 568Z569位、 577位、 604位、 614位、 616位、 156 2位、 1675〜1676位、 1732位、 1852位、 1878位、 1935位、 2121位、 2125/212 6位、 2503〜2885位、 または、 3104位。 (A) Positions 103, 144, 199, 203, 204, or 347 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1. (B) positions 2, 59, 105, 106, 110, 151, 304, 375, 439, 568Z569, 577, 604, 614 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 616, 156 2nd, 1675-1676, 1732, 1852, 1878, 1935, 2121, 2125/212 6th, 2503-2885, or 3104.
(C ) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 58位。  (C) Position 58 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(D ) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 86位、 または、 277〜306位。  (D) position 86 or positions 277 to 306 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
( E ) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 78位、 331位、 337位、 364位、 373位、 405位、 423位、 481位、 539〜551位、 583位、 593位、 661位、 685位、 または、 701位。  (E) positions 78, 331, 337, 364, 373, 405, 423, 481, 539-551, 583, 593, and 661 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 , 685 or 701.
( F ) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 201〜213位、 351位、 547位、 または、 840位。 ■  (F) positions 201 to 213, 351, 547, or 840 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. ■
( G) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 103位、 221位、 または、 264位。  (G) position 103, position 221 or position 264 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
(H) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 59位。  (H) position 59 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
( I ) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 288位、 301位、 または、 525〜560位。 ( J ) 配列番号： 1 0に記載の塩基配列の 124〜342位。  (I) Positions 288, 301, or 525 to 560 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9. (J) positions 124-342 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
(K) 配列番号： 1 1に記載の塩基配列の 223位、 または、 224/225位。  (K) position 223 or position 224/225 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11;
( L ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列の 314位。  (L) position 314 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
(M) 配列番号： 1 3に記載の塩基配列の 320位。  (M) position 320 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.
(N) 配列番号： 1 4に記載の塩基配列の 70位、 137位、 170位、 または、 691 位。  (N) position 70, position 137, position 170 or position 691 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14;
(0) 配列番号： 1 5に記載の塩基配列の 210位。  (0) position 210 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15
( P ) 配列番号： 1 6に記載の塩基配列の 380位、 または、 405位。  (P) position 380 or position 405 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
(Q) 配列番号： 1 7に記載の塩基配列の 43位、 84位、 139位、 143位、 144位、 または、 287位。  (Q) positions 43, 84, 139, 143, 144, or 287 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17;
( R ) 配列番号： 1 8に記載の塩基配列の 101位、 161位、 196位、 または、 653 位。 ( S ) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列の 319Z320位。 (R) position 101, position 161, position 196 or position 653 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18. (S) position 319Z320 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
(T) 配列番号： 2 0に記載の塩基配列の 214位、 670位、 または、 926位。 (T) position 214, position 670 or position 926 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20;
(U) 配列番号： 2 1に記載の塩基配列の 194位。 (U) position 194 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21
(V) 配列番号： 2 2に記載の塩基配列の 170位。  (V) position 170 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 22
本発明において、 「Z」 は、 塩基部位と塩基部位との間を意味する。 例えば、 上記において 「105 106位」 とは、 105番目の塩基と 106番目の塩基との間に塩 基が挿入されるような変異 （挿入変異） を特徴とする多型部位を表す。  In the present invention, “Z” means between base sites. For example, in the above, “105 position 106” represents a polymorphic site characterized by a mutation (insertion mutation) in which a base is inserted between the 105th base and the 106th base.
本発明の好ましい態様として、 上記の （A) 〜 （V) に記載の部位の多型は、 具体的には、 下記 （Α' ) 〜 （V' ) のような変異を示すことができる。  As a preferred embodiment of the present invention, the polymorphisms at the sites described in (A) to (V) above can specifically show the following mutations (Α ′) to (V ′).
(Α ' ) 配列番号： 1に記載の塩基配列において、 103位の多型は cから t、 144 位の多型は cから t、 199位の多型は gから a、 203位の多型は tから c、 204位 の多型は cから t、 347位の多型は cから aへの変異である。  (Α ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the polymorphism at position 103 is c to t, the polymorphism at position 144 is c to t, the polymorphism at position 199 is g to a, and the polymorphism at position 203 Is a mutation from t to c, the polymorphism at position 204 is a mutation from c to t, and the polymorphism at position 347 is a mutation from c to a.
( Β ' ) 配列番号： 2に記載の塩基配列において、 2位の多型は aから t、 59位 の多型は cから g、 1 10位の多型は gから t、 151位の多型は tから g、 304位の 多型は aから t、 375位の多型は aから t、 439位の多型は gから a、 577位の多 型は cから t、 604位の多型は gから t、 614位の多型は cから a、 616位の多型 は gから a、 1562位の多型は tから a、 1675〜1676位の多型は ggから t a、 1732 位の多型は cから t、 1852位の多型は aから g、 1878位の多型は gから a、 1935 位の多型は tから 2121位の多型は cから g、 3104位の多型は cから tへの変 異である。 なお、 3104位の cから tへの変異は、 cal rose76において検出される 変異である。 また、 105/106位の多型は 105位と 106位の間の aggの揷入、 568 Z569位の多型は 568位と 569位の間の tcagggcagagggt t t acat aaccacacggt t at c gtac (配列番号： 2 5 ) の揷入、 2125 2126位の多型は 2125位と 2126位の間 の caの挿入変異である。 さらに、 2503〜2885位の多型は 2503位から 2885位ま での 383 bpの欠失変異である。 (C ) 配列番号： 3に記載の塩基配列において、 58位の多型は aから gへの 変異である。 (Β ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, the polymorphism at position 2 is a to t, the polymorphism at position 59 is c to g, the polymorphism at position 10 is g to t, and the polymorphism at position 151 is Type is t to g, polymorphism at position 304 is a to t, polymorphism at position 375 is a to t, polymorphism at position 439 is g to a, polymorphism at position 577 is c to t, polymorphism at position 604 The type is g to t, the polymorphism at position 614 is c to a, the polymorphism at position 616 is g to a, the polymorphism at position 1562 is from t to a, the polymorphism at positions 1675 to 1676 is from gg to ta, position 1732 The polymorphisms are c to t, the polymorphism at position 1852 is a to g, the polymorphism at position 1878 is g to a, the polymorphism at position 1935 is from c to g for the polymorphism at position 2121, and the polymorphism at position 3104. The type is a change from c to t. The mutation from c to t at position 3104 is a mutation detected in cal rose76. In addition, the polymorphism at position 105/106 is the insertion of agg between positions 105 and 106, and the polymorphism at position 568 Z569 is tcagggcagagggt tt acat aaccacacggt t at c gtac (SEQ ID NO: The polymorphism at positions 2125 and 2126 is a ca insertion mutation between positions 2125 and 2126. Furthermore, the polymorphism at positions 2503 to 2885 is a deletion mutation of 383 bp from position 2503 to position 2885. (C) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, the polymorphism at position 58 is a mutation from a to g.
(D' ) 配列番号： 4に記載の塩基配列において、 86位の多型はじから t、 277 〜306位の多型は cUUttctttttttttctUtUtttttt (配列番号： 26) から cct ttttcttttctttctttctttttttt (配列番号： 2 7) への変異である。  (D ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, the polymorphism at position 86 is t, and the polymorphism at positions 277-306 is from cUUttctttttttttctUtUtttttt (SEQ ID NO: 26) to cct ttttcttttctttctttctttttttt (SEQ ID NO: 27). Is a mutation.
(Ε' ) 配列番号： 5に記載の塩基配列において、 78位の多型は aから g、 331 位の多型は tから c、 337位の多型は aから g、 364位の多型は cから t、 373位 の多型は aから g、 405位の多型は tから c、 423位の多型は gから a、 481位の 多型は aから g、 583位の多型は gから t、 593位の多型は tから c、 661位の多 型は cから g、 685位の多型は gから a、 701位の多型は aから gへの変異である。 また、 539〜551位の多型は 539位から 551位までの cacctgtgatgat (配列番号： 28) の欠失変異である。  (Ε ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, the polymorphism at position 78 is a to g, the polymorphism at position 331 is t to c, the polymorphism at position 337 is a to g, and the polymorphism at position 364. Is c to t, polymorphism at position 373 is a to g, polymorphism at position 405 is t to c, polymorphism at position 423 is g to a, polymorphism at position 481 is a to g, polymorphism at position 583 Is the mutation from g to t, the polymorphism at position 593 is from t to c, the polymorphism at position 661 is from c to g, the polymorphism at position 685 is from g to a, and the polymorphism at position 701 is from a to g. The polymorphism at positions 539 to 551 is a deletion mutation of cacctgtgatgat (SEQ ID NO: 28) from position 539 to position 551.
(F' ) 配列番号： 6に記載の塩基配列において、 351位の多型は aから g、 547 位の多型は aから c、 840位の多型は tから aへの変異である。 201〜213位の多 型は 201位から 213位までの tgtgaaaattcac (配列番号： 2 9) の欠失変異であ る。  (F ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, the polymorphism at position 351 is a mutation from a to g, the polymorphism at position 547 is a to c, and the polymorphism at position 840 is a mutation from t to a. The polymorphism at positions 201 to 213 is a deletion mutation of tgtgaaaattcac (SEQ ID NO: 29) from position 201 to position 213.
(G' ) 配列番号： 7に記載の塩基配列において、 103位の多型は aから t、 221 位の多型は tから g、 264位の多型は aから gへの変異である。  (G ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, the polymorphism at position 103 is a to t, the polymorphism at position 221 is a mutation from t to g, and the polymorphism at position 264 is a mutation from a to g.
(Η' ) 配列番号： 8に記載の塩基配列において、 59位の多型は cから tへの 変異である。  (Η ′) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, the polymorphism at position 59 is a mutation from c to t.
( I ' ) 配列番号： 9に記載の塩基配列において、 288位の多型は aから g、 301 位の多型は tから c、 525〜560位の多型は atgaatから ttcattttaccaatatgacacc tacatgaaaa (配列番号： 30) への変異である。  (I ′) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, the polymorphism at position 288 is a to g, the polymorphism at position 301 is from t to c, and the polymorphism at position 525 to 560 is from atgaat from ttcattttaccaatatgacacc tacatgaaaa (SEQ ID NO: : Mutation to 30).
(J ' ) 配列番号： 1 0に記載の塩基配列において、 124〜342位の多型は 124 位から 342位までの 219 b の欠失変異である。 (Κ ' ) 配列番号： 1 1に記載の塩基配列において、 223位の多型は cから gへ の変異である。 また、 224/225位の多型は 224位と 225位の間の atcgの挿入変 異である。 (J ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, the polymorphism at positions 124 to 342 is a deletion mutation of 219b from position 124 to position 342. (Κ ′) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, the polymorphism at position 223 is a mutation from c to g. The polymorphism at position 224/225 is an insertion mutation of atcg between positions 224 and 225.
( L， ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列において、 314位の多型は tから gへ の変異である。  (L,) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, the polymorphism at position 314 is a mutation from t to g.
(Μ ' ) 配列番号： 1 3に記載の塩基配列において、 320位の多型は tから gへ の変異である。  (Μ ′) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, the polymorphism at position 320 is a mutation from t to g.
(Ν ' ) 配列番号： 1 4に記載の塩基配列において、 70位の多型は cから t、 13 7位の多型は gから t、 170位の多型は gから t、 691位の多型は tから cへの変 異である。  (Ν ′) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, the polymorphism at position 70 is c to t, the polymorphism at position 137 is g to t, the polymorphism at position 170 is g to t, Polymorphism is a mutation from t to c.
(〇， ) 配列番号： 1 5に記載の塩基配列において、 210位の多型は aからじへ の変異である。  (〇,) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, the polymorphism at position 210 is a mutation from a to a.
( Ρ ' ) 配列番号： 1 6に記載の塩基配列において、 380位の多型は aから g、 4 05位の多型は aから cへの変異である。  (Ρ ′) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, the polymorphism at position 380 is a mutation from a to g, and the polymorphism at position 405 is a mutation from a to c.
(Q， ) 配列番号： 1 7に記載の塩基配列において、 43位の多型は cから t、 84 位の多型は cから t、 139位の多型は gから a、 143位の多型は tから c、 144位 の多型はじから t、 287位の多型は cから aへの変異である。  (Q,) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, the polymorphism at position 43 is from c to t, the polymorphism at position 84 is from c to t, the polymorphism at position 139 is from g to a, and the polymorphism at position 143. The type is t to c, the polymorphism at position 144 is t to t, and the polymorphism at position 287 is a mutation from c to a.
( R ' ) 配列番号： 1 8に記載の塩基配列において、 101位の多型は〖から 1 61位の多型は tから g、 196位の多型は tから c、 653位の多型は aから gへの 変異である。  (R ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, the polymorphism at position 101 is from 〖to 161, the polymorphism at position 161 is from t to g, the polymorphism at position 196 is from t to c, and the polymorphism at position 653. Is the mutation from a to g.
( S ' ) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列において、 319/320位の多型は 319 位と 320位の間の gの揷入変異である。  (S ′) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19, the polymorphism at positions 319/320 is an insertion mutation of g between positions 319 and 320.
(Τ ' ) 配列番号： 2 0に記載の塩基配列において、 214位の多型は tから c、 6 70位の多型は gから c、 926位の多型は tから aへの変異である。  (Τ ') In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20, the polymorphism at position 214 is a mutation from t to c, the polymorphism at position 670 is a mutation from g to c, and the polymorphism at position 926 is a mutation from t to a. is there.
(U， ) 配列番号： 2 1に記載の塩基配列において、 194位の多型は gから aへ の変異である。 (V ) 配列番号： 2 2に記載の塩基配列において、 170位の多型は cから aへ の変異である。 (U,) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, the polymorphism at position 194 is a mutation from g to a. (V) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22, the polymorphism at position 170 is a mutation from c to a.
本発明は、 植物の sd-1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、 上記 （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相 補鎖における部位の多型を検出する工程を含む、 植物の sd- 1遺伝子周辺領域の 遺伝子型判定方法を提供する。  The present invention relates to a polymorphism present in the region around the sd-1 gene of a plant, wherein the site is any one of the above (A) to (V), or a complementary chain forming a base pair with a base at the site. A method for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, comprising the step of detecting a polymorphism at a site in the above.
本発明において、 上記判定方法を実施することができる植物としては、 例えば、 イネ、 コムギ、 ォォムギ、 ソルガム、 トウモロコシ、 ジャガイモ、 レタス、 トマ ト等を例示することができるが、 これらの植物に特に制限されない。  In the present invention, examples of plants on which the above-described determination method can be performed include rice, wheat, corn, sorghum, corn, potato, lettuce, tomato, and the like. Not done.
本発明の sd_l遺伝子としては、 例えば、 イネ sd-1遺伝子を挙げることができ る。 該遺伝子の塩基配列を配列番号： 2 3に、 該遺伝子によってコードされるァ ミノ酸配列を配列番号： 2 4に記載する。  Examples of the sd_l gene of the present invention include a rice sd-1 gene. The nucleotide sequence of the gene is described in SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence encoded by the gene is described in SEQ ID NO: 24.
また、 本発明における sd-1遺伝子には、 上記遺伝子のホモログも含まれる。 このような遺伝子は、 当業者においては公知の方法、 例えば、 ハイブリダィゼー シヨン技術 (Southern, E. M. et . al . , Journal of Mo l ecul ar Biology 98 : 50 3, 1975) やポリメラ一ゼ連鎖反応 （PCR) 技術 （Saiki , R. K. et . al . , Sc ienc e 230 : 1350-1354, 1985、 Saiki, R. K. e t . al . , Sc i ence 239 : 487-491, 198 8) を利用して、 同定することが可能である。 例えば、 配列番号： 2 3に記載の 塩基配列、 もしくはその一部をプローブとして用いるハイブリダィゼ一ション技 術、 または配列番号： 2 3に記載の塩基配列に特異的にハイブリダィズするオリ ゴヌクレオチドをプライマーとして用いる PCR技術により、 所望の植物から上記 の遺伝子と高い相同性を有する DNAを単離することが可能である。  The sd-1 gene in the present invention also includes a homolog of the above gene. Such a gene can be obtained by a method known to those skilled in the art, for example, hybridization technology (Southern, EM et. Al., Journal of Molecular Biology 98: 503, 1975) or polymerase chain reaction (PCR). Al., Science 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et. Al., Science 239: 487-491, 198 8) Is possible. For example, a hybridization technique using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 or a part thereof as a probe, or an oligonucleotide that specifically hybridizes to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 as a primer Depending on the PCR technique used, it is possible to isolate DNA having high homology with the above genes from the desired plant.
このような DNAを単離するためには、 通常ストリンジェントな条件下でハイブ リダイゼーシヨン反応を行う。 ストリンジェントなハイブリダイゼーシヨン条件 としては、 6M尿素、 0. 4%SDS、 0. 5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェ ンシ一のハイプリダイゼーション条件を例示することができる。 よりストリンジ エンシーの高い条件、 例えば 6M尿素、 0.4%SDS、 O.lxSSCの条件を用いれば、 よ り相同性の高い DNAの単離を期待することができる。 単離した DNAの配列の決定 は、 公知の方法で行うことができる。 In order to isolate such DNA, a hybridization reaction is usually performed under stringent conditions. Examples of stringent hybridization conditions include 6 M urea, 0.4% SDS, 0.5 x SSC, or equivalent stringent hybridization conditions. More stringing Using highly enzymatic conditions, for example, 6M urea, 0.4% SDS, and O.lxSSC, higher homology can be expected to be isolated. The sequence of the isolated DNA can be determined by a known method.
単離された DNAが、 sd- 1遺伝子であるかは、 通常、 配列の相同性から判定す る。 配列の相同性は、 BLASTn (核酸レベル） や BLASTx (アミノ酸レベル） のプ ログラム（Altschul, S. F. et. al., J. Mol. Biol.215: 403-410, 1990)を利用 して決定することができる。 該プログラムは、 Karl in and Altschulによるアル ゴリズム BLAST(Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268, 1990、 Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993)に基づいている。 BLASTnによって塩 基配列を解析する場合には、 パラメータ一は例えば score = 100、 wordlength = 12とする。 また、 BLASTxによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一 夕一は例えば score = 50、 wordlength = 3とする。 また、 Gapped BLASTプログ ラムを用いて、 アミノ酸配列を解析する場合は、 Altschul ら （Nuclei Acids. Res. 25: 3389-3402, 1997) に記載されているように行うことができる。 BLAST と Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフォルトパラ メーターを用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 ww. ncbi. nlm. nih. gov. 。  Whether the isolated DNA is the sd-1 gene is usually determined from sequence homology. Sequence homology should be determined using the BLASTn (nucleic acid level) and BLASTx (amino acid level) programs (Altschul, SF et. Al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Can be. The program is based on the algorithm BLAST by Karl in and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). ing. When a base sequence is analyzed by BLASTn, one parameter is, for example, score = 100 and wordlength = 12. In the case of analyzing an amino acid sequence by BLASTx, each parameter is, for example, score = 50 and wordlength = 3. When the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, the analysis can be performed as described in Altschul et al. (Nuclei Acids. Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http: 〃 ww. Ncbi. Nlm. Nih. Gov.
本発明において、 sd- 1遺伝子周辺領域とは、 上記 sd_l遺伝子の 5'側および 3 '側の、 通常 3cM、 好ましくは 2cM、 より好ましくは lcM、 最も好ましくは 150kb の DNA領域を意味する。  In the present invention, the region around the sd-1 gene means a DNA region of usually 3 cM, preferably 2 cM, more preferably lcM, most preferably 150 kb, on the 5 ′ side and 3 ′ side of the sd_l gene.
本発明において、 多型とは、 遺伝学的には、 母集団中 1%以上の頻度で存在し ている 1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、 本発明におけ る 「多型」 は、 この定義に制限されず、 ^未満の塩基の変化も 「多型」 に含む。 本発明における多型の種類としては、 例えば、 一塩基多型、 一から数十塩基 （時 には数千塩基） が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられるが、 これらに特 に制限はされない。 本発明の遺伝子型判定方法の好ましい態様においては、 まず、 被検植物体から DNA を調製する。 本発明において、 被検植物体としては、 例えば、 上記植物の葉、 根、 種子、 カルス、 葉鞘、 培養細胞等を挙げることができるが、 これらに限定さ れない。 また、 当業者であれば、 DNAを上記被検植物体から抽出した染色体 DNA を基に調製することができる。 In the present invention, polymorphism is generally defined as a change in a certain base in one gene that is present at a frequency of 1% or more in a population. “Polymorphism” is not limited to this definition, and includes changes in bases less than ^. Examples of the types of polymorphisms in the present invention include single nucleotide polymorphisms, polymorphisms in which one to several tens of bases (sometimes thousands of bases) are deleted or inserted, and the like. There are no restrictions. In a preferred embodiment of the genotyping method of the present invention, first, DNA is prepared from a test plant. In the present invention, examples of the test plant include, but are not limited to, leaves, roots, seeds, calli, leaf sheaths, and cultured cells of the above-mentioned plants. Further, those skilled in the art can prepare DNA based on chromosomal DNA extracted from the above-mentioned test plant.
本方法においては、 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であつ て、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基 と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する。 本発明において、 DNAの増幅方法としては、 PCR法が挙げられるが、 DNAを増幅できる方法であれ ば特に制限されない。  In the present method, then, a base site present in the region around the sd-1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a complementation forming a base pair with a base in the site. Amplify DNA containing bases in the strand. In the present invention, examples of a method for amplifying DNA include a PCR method, but are not particularly limited as long as the method can amplify DNA.
本方法においては、 次いで、 増幅した DNAの塩基配列を決定する。 DNAの塩基 配列の決定は、 当業者に公知の方法で行うことができる。  Next, in this method, the base sequence of the amplified DNA is determined. The DNA base sequence can be determined by a method known to those skilled in the art.
本方法においては、 次いで、 決定した DNAの塩基配列を、 対照と比較する。 本 方法における対照とは、 通常、 野生型 sd- 1遺伝子であり、 当業者においては、 各種遺伝子データベースまたは文献等から野生型 sd-1遺伝子の塩基配列情報を 取得することができる。  In this method, the determined DNA base sequence is then compared with a control. The control in this method is usually a wild-type sd-1 gene, and those skilled in the art can obtain nucleotide sequence information of the wild-type sd-1 gene from various gene databases or literatures.
本発明の遺伝子型判定方法は、 上記の如く直接被検植物体由来の DNAの塩基配 列を決定する方法以外に、 多型の検出が可能な種々の方法によって行うことがで きる。 例えば、 本発明の遺伝子型判定方法は、 以下のような方法によって行うこ とも可能である。  The genotyping method of the present invention can be performed by various methods capable of detecting a polymorphism, in addition to the method of directly determining the base sequence of DNA derived from a test plant as described above. For example, the genotyping method of the present invention can be performed by the following method.
まず、 被検植物体から DNAを調製する。 次いで、 調製した DNAを制限酵素によ り切断する。 次いで、 DNA断片をその大きさに応じて分離する。 次いで、 検出さ れた DNA断片の大きさを対照と比較する。 また、 他の一つの態様においては、 ま ず、 被検植物体から DNAを調製する。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する 塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または、 該 部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する。 さらに、 増幅した DNAを制限酵素により切断する。 次いで、 DNA断片をその大き さに応じて分離する。 次いで、 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する。 このような方法としては、 例えば、 制限酵素断片長多型 （Restriction Fragme nt Length Polymorph ism/RFLP) を利用した方法や PCR-RFLP法等が挙げられる。 具体的には、 制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、 あるいは制限酵素処理 によって生じる DNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、 制限酵素処理後に 生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。 この変異を含む部分を PCR法に よって増幅し、 それぞれの制限酵素で処理することによって、 これらの変異を電 気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。 あるいは、 染色体 DNAをこれらの制限酵素によって処理し、 電気泳動した後、 本発明のオリゴヌク レオチドを用いてサザンブロッティングを行うことにより、 変異の有無を検出す ることができる。 用いられる制限酵素は、 それぞれの変異に応じて当業者におい ては適宜選択することができる。 First, DNA is prepared from the test plant. Next, the prepared DNA is cut with a restriction enzyme. Next, the DNA fragments are separated according to their size. Next, the size of the detected DNA fragment is compared with a control. In another embodiment, first, DNA is prepared from a test plant. Next, a base site present in the region around the sd-1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Amplify DNA containing Furthermore, the amplified DNA is cut with a restriction enzyme. Next, the DNA fragments are separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared with a control. Examples of such a method include a method using a restriction enzyme fragment length polymorphism (Restriction Fragment Length Polymorph ism / RFLP) and a PCR-RFLP method. Specifically, when there is a mutation at the recognition site of the restriction enzyme, or when there is a base insertion or deletion in the DNA fragment generated by the restriction enzyme treatment, the size of the fragment generated after the restriction enzyme treatment is compared with that of the control. Change. By amplifying the portion containing this mutation by PCR and treating it with each restriction enzyme, these mutations can be detected as a difference in the mobility of the band after electrophoresis. Alternatively, the presence or absence of the mutation can be detected by treating chromosomal DNA with these restriction enzymes, electrophoresing, and performing Southern blotting using the oligonucleotide of the present invention. The restriction enzyme used can be appropriately selected by those skilled in the art according to each mutation.
さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DNAを調製する。 次いで、 sd - 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のい ずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における 塩基部位を含む DNAを増幅する。 さらに、 増幅した DNAを一本鎖に解離させる。 次いで、 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する。 分離した一本鎖 DNA のゲル上での移動度を対照と比較する。  In still another method, first, DNA is prepared from a test plant. Next, a base site present in the sd-1 gene peripheral region, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Amplify DNA containing In addition, the amplified DNA is dissociated into single strands. Next, the dissociated single-stranded DNA is separated on a nondenaturing gel. Compare the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with the control.
該方法としては、 例えば PCR-SSCP(singl e- strand conformation polymorphis m、 一本鎖高次構造多型)法 (Cloning and polymerase chain reaction - single - st rand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chro mo some 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1)： 139-146.、 Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphi sm analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1； 6(8): 1313-1318·、 Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with po s t label ing. , PC Methods Appl. 1995 Apr 1 ; 4 (5)： 275 - 282. )が挙げられる。 この方法は操作が比較的簡便であり、 また被検試料の量も少なくて済む等の利点 を有するため、 特に多数の DNA試料をスクリーニングするのに好適である。 その 原理は次の通りである。 二本鎖 DNA断片を一本鎖に解離すると、 各鎖はその塩基 配列に依存した独自の高次構造を形成する。 この解離した DM鎖を、 変性剤を含 まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、 それぞれの高次構造の差に 応じて、 相補的な同じ鎖長の一本鎖 DNAが異なる位置に移動する。 一塩基の置換 によってもこの一本鎖 DNAの高次構造は変化し、 ポリアクリルアミドゲル電気泳 動において異なる移動度を示す。 従って、 この移動度の変化を検出することによ り DNA断片に点突然変異や欠失、 あるいは挿入等による変異が存在することを検 出することができる。 Examples of the method include a PCR-SSCP (Cloning and polymerase chain reaction-single-st rand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chro mo some) 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphi sm analysis of polymerase chain reaction products.Oncogene. 1991 Aug 1; 6 (8 ): 1313-1318, Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with po st Label ing., PC Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282.). This method has advantages such as relatively simple operation and small amount of test sample, and is particularly suitable for screening a large number of DNA samples. The principle is as follows. When a double-stranded DNA fragment is dissociated into single strands, each strand forms a unique higher-order structure depending on its base sequence. When this dissociated DM chain is electrophoresed in a polyacrylamide gel containing no denaturing agent, the single-stranded DNA with the same length and the same complementary length moves to a different position according to the difference in each higher-order structure. . The substitution of a single base also changes the higher-order structure of the single-stranded DNA, indicating a different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting this change in mobility, it is possible to detect the presence of a mutation due to a point mutation, deletion, insertion or the like in the DNA fragment.
具体的には、 まず、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記 の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対 をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを PCR法等によって増幅する。 増幅さ れる範囲としては、 通常 200〜400bp程度の長さが好ましい。 PCRは、 当業者に おいては反応条件等を適宜選択して行うことができる。 PCRの際に、 32P等のァ イソト一プ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識したプライマ一を用いる ことにより、 増幅 DNA産物を標識することができる。 あるいは PCR反応液に32 P 等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識された基質塩基を 加えて PCRを行うことにより、 増幅 DNA産物を標識することも可能である。 さら に、 PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、 32P等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識された基質塩基を、 増幅 DNA断片に付加すること によっても標識を行うことができる。 こうして得られた標識 DNA断片を、 熱を加 えること等により変性させ、 尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲ ルによって電気泳動を行う。 この際、 ポリアクリルアミドゲルに適量 （5から 1 0%程度） のグリセロールを添加することにより、 DNA断片の分離の条件を改善 することができる。 また、 泳動条件は各 DNA断片の性質により変動するが、 通常、 室温 （20から 25°C) で行い、 好ましい分離が得られないときには 4から 30°Cま での温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。 電気泳動後、 DNA断片の移 動度を、 X線フィルムを用いたォ一トラジオグラフィーや、 蛍光を検出するスキ ャナ一等で検出し、 解析を行う。 移動度に差があるバンドが検出された場合、 こ のバンドを直接ゲルから切り出し、 PCRによって再度増幅し、 それを直接シーク ェンシングすることにより、 変異の存在を確認することができる。 また、 標識し た DNAを使わない場合においても、 電気泳動後のゲルをェチジゥムブ口マイドゃ 銀染色法などによつて染色することによって、 バンドを検出することができる。 さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DNAを調製する （工程 ( a ) ) 。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチ ドに、 レポ一タ一蛍光とクェンチヤ一蛍光の 2つを標識したプローブを 2種類合 成する （工程 （b ) ) 。 次いで、 工程 （a ) で調製した DNAに、 工程 （b ) で合 成したプローブをハイブリダィズさせる （工程 （c ) ) 。 次いで、 sd- 1遺伝子 周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載 の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含 む DNAを増幅する （工程 （d ) ) 。 次いで、 レポ一夕一蛍光の発光を検出するSpecifically, first, a base site present in the region around the sd-1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a complement forming a base pair with a base in the site. The DNA containing the base site in the strand is amplified by PCR or the like. The range to be amplified is usually preferably about 200 to 400 bp. PCR can be performed by those skilled in the art by appropriately selecting reaction conditions and the like. The amplified DNA product can be labeled by using a primer labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin during PCR. Alternatively, the amplified DNA product can be labeled by performing PCR by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin to the PCR reaction solution. Furthermore, labeling can also be performed by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin to the amplified DNA fragment using Klenow enzyme after the PCR reaction. The labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like, and electrophoresis is carried out using a polyacrylamide gel containing no denaturing agent such as urea. At this time, by adding an appropriate amount (about 5 to 10%) of glycerol to the polyacrylamide gel, the conditions for separating DNA fragments are improved. can do. In addition, electrophoresis conditions vary depending on the properties of each DNA fragment.However, the reaction is usually carried out at room temperature (20 to 25 ° C), and when the desired separation cannot be obtained, the optimal mobility is obtained at a temperature of 4 to 30 ° C. Consider the temperature to be given. After electrophoresis, the mobility of the DNA fragments is detected by photoradiography using an X-ray film or a scanner that detects fluorescence and analyzed. If a band with a difference in mobility is detected, this band can be excised directly from the gel, re-amplified by PCR, and sequenced directly to confirm the presence of the mutation. Further, even when the labeled DNA is not used, the band can be detected by staining the gel after electrophoresis with ethidium ore silver staining. In still another method, first, DNA is prepared from a test plant (step (a)). Next, the base site existing in the sd-1 gene peripheral region, the site described in any one of the above (A) to (V), or the base site in a complementary strand forming a base pair with the base in the site. Two types of probes, labeled with both reporter-fluorescence and quencher-fluorescence, are synthesized on an oligonucleotide complementary to the adjacent base sequence (step (b)). Next, the probe synthesized in the step (b) is hybridized with the DNA prepared in the step (a) (step (c)). Next, the base site existing in the peripheral region of the sd-1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or the base site in the complementary strand forming a base pair with the base in the site Amplify the containing DNA (step (d)). Next, detect the fluorescence emission of the repo overnight
(工程 （e ) ) 。 次いで、 工程 （e ) で検出したレポ一夕一蛍光の発光を対照と 比較する （工程 （f ) ) 。 (Step (e)). Next, the emission of the repo overnight fluorescence detected in the step (e) is compared with a control (step (f)).
上記方法としては、 TaqMan PCR法 （SNP遺伝子多型の戦略、 松原謙一 ·榊佳之 、 中山書店、 p94- 105、 Genet Anal . (1999) 14 : 143-149) 等を挙げることができ る。 具体的には、 まず、 プローブの 5'末端にレポ一ター蛍光を標識する。 本発明 において、 レポーター蛍光としては、 FAや VI Cなどが例示できるが、 これらに限 定されない。 さらに、 上記プローブの 3'末端にクェンチヤ一蛍光を標識する。 本 発明において、 クェンチヤ一蛍光としては、 レポーター蛍光を消光できる物質で あれば特に制限されない。 次いで、 レポーター蛍光とクェンチヤ一蛍光を標識し たプローブを、 調製した DNAにハイブリダィズさせる。 次いで、 sd-1遺伝子周辺 領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部 位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを、 5'ヌクレア一ゼ活性を有する DNAポリメラ一ゼを用いて増幅する。 その結果 、 レポーター蛍光とクェンチヤ一蛍光を標識したプローブのレポ一夕一蛍光標識 部分が切断され、 レポーター蛍光が遊離する。 本発明において、 5'ヌクレアーゼ 活性を有する DNAポリメラーゼとしては、 好適には TaqDNAポリメラーゼが例示で きるが、 これに限定されるものではない。 本方法においては、 次いで、 遊離した レポ一夕一蛍光を検出し、 さらに、 該レポ一夕一蛍光の発光を対照と比較する。 さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DNAを調製する （工程 （a ) ) 。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相 補鎖における塩基部位を含む 3'側塩基配列と相補的な配列、 および全く無関係な 配列を合わせたプローブを合成する （工程 （b ) ) 。 次いで、 sd_l遺伝子周辺領 域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位 、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位から 5'末端 側が相補的なプローブを合成する （工程 （c ) ) 。 次いで、 工程 （c ) で合成し たプローブと工程 （a ) で調製した DNAとハイブリダィズさせる （工程 （d ) ) 。 次いで、 工程 （d ) でハイブリダィズした DNAを一本鎖 DNA切断酵素で切断し、 工程 （b ) で合成したプローブの一部を遊離させる （工程 （e ) ) 。 本発明にお いて、 一本鎖 DNA切断酵素としては、 特に制限はなく、 例えば下記の c l eavaseが 例示できる。 本方法においては、 次いで、 工程 （e ) で遊離したプローブと、 検 出用プローブとをハイブリダィズさせる （工程 （f ) ) 。 次いで、 工程 （f ) で ハイブリダィズした DNAを酵素的に切断し、 その際に発生する蛍光の強度を測定 する （工程 （g ) ) 。 次いで、 工程 （g) で測定した蛍光の強度を対照と比較す る （工程 （h ) ) 。 Examples of the above method include the TaqMan PCR method (SNP polymorphism strategy, Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, p94-105, Genet Anal. (1999) 14: 143-149) and the like. Specifically, first, reporter fluorescence is labeled at the 5 'end of the probe. In the present invention, examples of the reporter fluorescence include FA and VIC, but are not limited thereto. Further, quencher monofluorescence is labeled at the 3 'end of the probe. Book In the present invention, quencher fluorescence is not particularly limited as long as it is a substance capable of quenching reporter fluorescence. Next, a probe labeled with reporter fluorescence and quencher fluorescence is hybridized to the prepared DNA. Next, a base site present in the region around the sd-1 gene, the site according to any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Is amplified using a DNA polymerase having 5 'nuclease activity. As a result, the reporter fluorescence and the quencher fluorescence labeled probe are cleaved at the repo overnight fluorescence labeled portion, and the reporter fluorescence is released. In the present invention, Taq DNA polymerase is preferably exemplified as a DNA polymerase having 5 'nuclease activity, but is not limited thereto. In the method, the released repo overnight fluorescence is then detected, and the emission of the repo overnight fluorescence is compared with a control. In still another method, first, DNA is prepared from a test plant (step (a)). Next, a base site present in the peripheral region of the sd-1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary chain forming a base pair with a base in the site. A probe is synthesized with a sequence complementary to the 3'-side nucleotide sequence containing, and a completely unrelated sequence (step (b)). Next, the base site existing in the region around the sd_l gene, which is located at any one of the sites described in any one of the above (A) to (V), or 5% from the base site in the complementary strand forming a base pair with the base at the site. 'Synthesize a probe whose terminal side is complementary (step (c)). Next, the probe synthesized in step (c) is hybridized with the DNA prepared in step (a) (step (d)). Next, the DNA hybridized in step (d) is cleaved with a single-stranded DNA-cleaving enzyme to release a part of the probe synthesized in step (b) (step (e)). In the present invention, the single-stranded DNA cleavage enzyme is not particularly limited, and examples thereof include the following cleavase. Next, in the present method, the probe released in step (e) is hybridized with the detection probe (step (f)). Next, the DNA hybridized in step (f) is cut enzymatically, and the intensity of the fluorescence generated at that time is measured. (Step (g)). Next, the fluorescence intensity measured in step (g) is compared with that of a control (step (h)).
上記方法としては、 例えば、 Invader法 （SNP遺伝子多型の戦略、 松原謙一 · 榊佳之、 中山書店、 p94- 105、 Genome Research (2000) 10 : 330-343) 等が挙げら れる。 具体的には、 まず、 sd_l遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩 基対をなす相補鎖における塩基部位から 3'側が铸型と相補的な配列であり、 5' 側が铸型配列と無関係な配列 （フラップ） を有するプローブ （プローブ A) を合 成する。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の  Examples of the above method include the Invader method (SNP polymorphism strategy, Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, p94-105, Genome Research (2000) 10: 330-343) and the like. Specifically, first, a base site present in the region around the sd_l gene, the site described in any one of (A) to (V) above, or a complementary strand forming a base pair with a base at the site A probe (probe A) having a sequence (flap) whose sequence is complementary to the type III sequence on the 3 'side and a sequence (flap) irrelevant to the type III sequence on the 5' side from the base site is synthesized. Next, a base site present in the region around the sd-1 gene,
(A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位から 5'側が铸型と相補的な配列を有するプローブ The probe according to any one of (A) to (V), or a sequence having a sequence complementary to 铸 -type on the 5 ′ side from the base site in the complementary strand forming a base pair with the base in the site.
(プローブ B) を合成する。 プローブ Bにおいては、 sd_l遺伝子周辺領域に存在 する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または 該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位に対応する塩基は任 意でよい。 次いで、 これらプローブを調製した铸型 DNAにハイプリダイズさせる。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 (Probe B). In the probe B, a base site present in the region around the sd_l gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. The base corresponding to is optional. Next, these probes are hybridized to the prepared type I DNA. Next, a base site existing in the region around the sd-1 gene,
(V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補 鎖における塩基部位に対応するプロ一ブ Bの塩基が侵入することで、 5'末端がフ ラップ状になっている部分を認識して、 該部位に対応するプローブ Aの塩基の 3 '側を切断するエンドヌクレア一ゼ （c l eavase) を用いてハイブリダィズした DN Aを切断する。 これにより、 フラップ部分が遊離する。 次いで、 遊離したフラッ プ部分と検出用プローブをハイブリダィズさせる。 該検出用プローブは、 一般的 に f luorescence resonance energy trans fer (FRET) プロ一ブとよば、れる。 該 プローブにおいて、 5'側は自身で相補的に結合できる。 また、 3'側はフラップと 相補的な配列を有している。 また、 自身で相補的に結合できる 5'側において、 5 '末端にはレポ一夕一蛍光が標識され、 該 5'末端の 3'側にはクェンチヤ一蛍光が 標識されている。 遊離したフラップの 3'末端の塩基が、 FRETプローブにハイブ リダイズする結果、 該プローブのレポーター蛍光が標識された相補結合部位に侵 入することで、 cleavaseが認識する構造が生成される。 本方法においては、 cle avaseによるレポ一夕一蛍光標識部分の切断によって遊離したレポ一夕一蛍光を 検出し、 さらに、 測定した蛍光の強度を対照と比較する。 The base of probe B corresponding to the site described in any of (V) or the base site in the complementary strand forming a base pair with the base at the site enters, resulting in a flap at the 5 ′ end. The hybridized DNA is cleaved using an endonuclease (cl eavase) that cleaves the 3 ′ side of the base of probe A corresponding to the site. This releases the flap portion. Next, the released flap portion and the detection probe are hybridized. The detection probe is generally called a fluorescence resonance energy trans fer (FRET) probe. In the probe, the 5 'side can complementarily bind by itself. The 3 ′ side has a sequence complementary to the flap. In addition, on the 5 'side, which can bind complementarily by itself, the 5' end is labeled with repo overnight fluorescence, and the 3 'side of the 5' end is quenched with fluorescence. Be labeled. The base at the 3 'end of the released flap hybridizes to the FRET probe. As a result, the reporter fluorescence of the probe invades the labeled complementary binding site, thereby generating a structure recognized by cleavase. In this method, the repo overnight fluorescence released by cleavage of the repo overnight fluorescent label by cleavage is detected, and the measured fluorescence intensity is compared with that of a control.
さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DMを調製する （工程 ( a ) ) 。 次いで、 sd_l遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する （工程 （b ) ) 。 次いで、 増 幅した DNAを一本鎖に解離させる （工程 （c ) ) 。 次いで、 解離させた一本鎖 D NAのうち、 片鎖のみを分離する （工程 （d ) ) 。 次いで、 sd- 1遺伝子周辺領域 に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位の近傍より 1 塩基ずつ伸長反応を行い、 その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、 発光の強度を測定する （工程 （e ) ) 。 次いで、 工程 （e ) で測定した蛍光の強 度を対照と比較する （工程 ） ） 。 このような方法としては、 例えば、 Pyrose quencing法 (Anal. Biochem. (2000) 10 : 103-110) 等が挙げられる。  In still another method, first, DM is prepared from a test plant (step (a)). Next, a DNA comprising a base site present in the sd_l gene peripheral region, wherein the DNA comprises a site according to any one of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. (Step (b)). Next, the amplified DNA is dissociated into single strands (step (c)). Next, of the dissociated single-stranded DNA, only one strand is separated (step (d)). Next, a base site present in the sd-1 gene peripheral region, the site according to any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. An extension reaction is performed one base at a time from the vicinity, pyrophosphoric acid generated at that time is enzymatically emitted, and the intensity of the emission is measured (step (e)). Next, the intensity of the fluorescence measured in step (e) is compared with that of a control (step)). Examples of such a method include the Pyrose quencing method (Anal. Biochem. (2000) 10: 103-110).
さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DNAを調製する （工程 ( a ) ) 。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する （工程 （b ) ) 。 次いで、 s d - 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいず れかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩 基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する （工程 （c ) ) 。 次いで、 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b ) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c ) で合成したプライマ一を用いて一塩基伸長反応を行う （工程 (d) ) 。 次いで、 蛍光の偏光度を測定する （工程 （e) ) 。 次いで、 工程In still another method, first, DNA is prepared from a test plant (step (a)). Next, the base site existing in the sd-1 gene peripheral region, the site described in any one of the above (A) to (V), or the base site in a complementary strand forming a base pair with the base in the site. Amplify the containing DNA (step (b)). Next, a base site present in the sd-1 gene peripheral region, wherein the base is a site described in any one of the above (A) to (V), or a salt in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. A primer complementary to the sequence up to one base adjacent to the base site is synthesized (step (c)). Next, in the presence of the fluorescently labeled nucleotide, the DNA amplified in step (b) is converted into a type III, and a single base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c) (step (d)). Next, the degree of polarization of the fluorescence is measured (step (e)). Then, the process
(e) で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する （工程 （f) ) 。 このような方 法としては、 例えば、 AcycloPrime 法 (Chen, X., Levine, L. , and Kwok, P. Y.The polarization degree of the fluorescence measured in (e) is compared with the control (step (f)). Such methods include, for example, the AcycloPrime method (Chen, X., Levine, L., and Kwok, P.Y.
1999, Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, G enome Res., 9， 492-98.) 等が挙げられる。 1999, Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res., 9, 492-98.).
さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DNAを調製する （工程 In still another method, first, DNA is prepared from a test plant (step
(a) ) 。 次いで、 sd_l遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の(a)). Next, a base site present in the region around the sd_l gene,
(A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する （工程 （b) ) 。 次いで、 s d-l遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) のいず れかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩 基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成する （工程 （c) ) 。 次いで、 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマ一を用いて一塩基伸長反応を行う （工程Amplify DNA containing the site described in any one of (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site (step (b)). Next, a base site present in the region around the sdl gene, which is a site described in any one of the above (A) to (V), or a base in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. A primer complementary to the sequence up to one base adjacent to the site is synthesized (step (c)). Next, in the presence of the fluorescently labeled nucleotide, the DNA amplified in step (b) is converted into a 铸 form, and a single base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c) (step
(d) ) 。 次いで、 シーケンサーを利用して、 工程 （d) で反応に使われた塩基 種を判定する （工程 （e) ) 。 次いで、 工程 （e) で判定された塩基種を対照と 比較する （工程 （f) ) 。 このような方法として、 例えば、 SNuPe法 (Rapid Com mun Mass Spectrom. (2000) 14:950 - 959)等が挙げられる。 (d)). Next, the base species used in the reaction in step (d) is determined using a sequencer (step (e)). Next, the base species determined in step (e) is compared with a control (step (f)). An example of such a method is the SNuPe method (Rapid Commun Mass Spectrom. (2000) 14: 950-959).
さらに別の方法においては、 まず被検植物体から DN Aを調製する （工程 In yet another method, DNA is first prepared from a test plant (step
(a) ) 。 次いで、 s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記 の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対 をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する （工程 （b) ) 。 次いで、 s d_ 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の （A) 〜 （V) の いずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖におけ る塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマ一を合成する （工程 (a)). Next, a base site present in the region around the sd-1 gene, which is described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand that forms a base pair with a base in the site. Amplify the containing DNA (step (b)). Next, a base site present in the region around the sd_1 gene, the site described in any one of the above (A) to (V), or a base in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Synthesize a primer that is complementary to the sequence up to one base adjacent to the site (step
(c) ) 。 次いで、 工程 （c) で合成したプライマーが固定された基板を提供す る （工程 （d) ) 。 次いで、 工程 （b) の DNAと工程 （d) の基板を接触させる (工程 （e) ) 。 次いで、 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で 増幅した DNAを錡型とし、 工程 （d) で基板に固定したプライマーを用いて一 塩基伸長反応を行う （工程 （f) ) 、 次いで、 スキャナ一を用いて、 工程 ） で反応に使われた塩基種を判定する （工程 （g) ) 。 このような方法としては、 Arrayed Primer Extension (APEX)法（Clinical Chemistry (2002) 48:2051-205 4)などが挙げられる。 (c)). Next, a substrate on which the primer synthesized in step (c) is immobilized is provided. (Step (d)). Next, the DNA of step (b) is brought into contact with the substrate of step (d) (step (e)). Next, in the presence of the fluorescently labeled nucleotide, the DNA amplified in step (b) is converted into a type III, and in step (d), a single-base extension reaction is performed using a primer immobilized on a substrate (step (f)). Using a scanner, determine the base species used in the reaction in step) (step (g)). Examples of such a method include the Arrayed Primer Extension (APEX) method (Clinical Chemistry (2002) 48: 2051-205 4).
さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DNAを調製する （工程 (a) ) 。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する （工程 （b) ) 。 次いで、 ェ 程 （b) で増幅した DNAを質量分析器にかけ、 分子量を測定する （工程 （c) ) 。 次いで、 工程 （c) で測定した分子量を対照と比較する （工程 （d) ) 。 このよ うな方法としては、 例えば、 MALDI- TOF MS法（Trends Biotechnol (2000) :18:7 7 - 84)等が挙げられる。  In still another method, first, DNA is prepared from a test plant (step (a)). Next, the base site existing in the sd-1 gene peripheral region, the site described in any one of the above (A) to (V), or the base site in a complementary strand forming a base pair with the base in the site. Amplify the containing DNA (step (b)). Next, the DNA amplified in step (b) is applied to a mass spectrometer to measure the molecular weight (step (c)). Next, the molecular weight measured in step (c) is compared with a control (step (d)). Examples of such a method include the MALDI-TOF MS method (Trends Biotechnol (2000): 18: 77-84).
さらに別の方法においては、 まず、 被検植物体から DNAを調製する （工程 (a) ) 。 次いで、 sd-1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 上記の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する （工程 （b) ) 。 次いで、 ヌ クレオチドプローブが固定された基板を提供する （工程 （c) ) 。  In still another method, first, DNA is prepared from a test plant (step (a)). Next, the base site existing in the sd-1 gene peripheral region, the site described in any one of the above (A) to (V), or the base site in a complementary strand forming a base pair with the base in the site. Amplify the containing DNA (step (b)). Next, a substrate having the nucleotide probe immobilized thereon is provided (step (c)).
本発明において 「基板」 とは、 ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材 料を意味する。 本発明においてヌクレオチドには、 オリゴヌクレオチドおよびポ リヌクレオチドが含まれる。 本発明の基板は、 ヌクレオチドを固定することが可 能であれば特に制限はないが、 一般に DNAアレイ技術で使用される基板を好適に 用いることができる。 一般に DNAアレイは、 高密度に基板にプリントされた何千 ものヌクレオチドで構成されている。 通常これらの DNAは非透過性 (non- porou s)の基板の表層にプリントされる。 基板の表層は、 一般的にはガラスであるが、 透過性 (po r ous)の膜、 例えばニトロセルロースメンブレンを使用することができ る。 In the present invention, “substrate” means a plate-like material to which nucleotides can be immobilized. In the present invention, nucleotides include oligonucleotides and polynucleotides. The substrate of the present invention is not particularly limited as long as nucleotides can be immobilized, but a substrate generally used in DNA array technology can be suitably used. Generally, DNA arrays are composed of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Usually these DNAs are non-permeable s) Printed on the surface of the substrate. The surface layer of the substrate is generally glass, but a permeable membrane such as a nitrocellulose membrane can be used.
本発明において、 ヌクレオチドの固定 （アレイ） 方法として、 Af fyme t r ix社 開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。 オリゴヌクレ ォチドのアレイにおいて、 オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ si で 合成される。 例えば、 photo l i thographicの技術 (Af fymet r ix社) 、 および化学 物質を固定させるためのインクジェット （Roset ta Inpharmat ics社） 技術等に よるオリゴヌクレオチドのィンサイチュ合成法が既に知られており、 いずれの技 術も本発明の基板の作製に利用することができる。  In the present invention, as a method for immobilizing (arraying) nucleotides, an array based on oligonucleotides developed by Affymetrix can be exemplified. In an oligonucleotide array, the oligonucleotides are usually synthesized in situ (si. Eg, photolithographic technology (Affymetrix), and inkjet (Roset ta Informatics) technology for immobilizing chemicals. The in situ synthesis method of oligonucleotides according to these methods is already known, and any of the techniques can be used for producing the substrate of the present invention.
基板に固定するヌクレオチドプローブは、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに 記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位 の多型を検出することができるものであれば、 特に制限されない。 即ち該プロー ブは、 例えば、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位に おける塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAと特異的にハイブ リダイズするようなプローブである。 特異的なハイプリダイズが可能であれば、 ヌクレオチドプローブは、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 また は該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNAに対し、 完全に相補的である必要はない。 本発明において基板に結合させるヌクレオチド プロ一ブの長さは、 オリゴヌクレオチドを固定する場合は、 通常 10〜100ベース であり、 好ましくは 10〜50ベースであり、 さらに好ましくは 15〜25ベースであ る。  The nucleotide probe to be immobilized on the substrate is a nucleotide probe capable of detecting a polymorphism at the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. If so, there is no particular limitation. That is, the probe specifically hybridizes with, for example, a DNA containing a site described in any one of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base at the site. Probe. If specific hybridization is possible, the nucleotide probe includes the site described in any one of the above (A) to (V), or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. It need not be perfectly complementary to DNA. In the present invention, the length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is generally 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases, and more preferably 15 to 25 bases when the oligonucleotide is immobilized. You.
本方法においては、 次いで、 工程 （b ) の DNAと工程 （c ) の基板を接触させ る （工程 （d ) ) 。 本工程により、 上記ヌクレオチドプローブに対し、 DNAをハ イブリダィズさせる。 ハイブリダィゼ一シヨンの反応液および反応条件は、 基板 に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、 一般的 に当業者に周知の方法により行うことができる。 Next, in this method, the DNA of step (b) is brought into contact with the substrate of step (c) (step (d)). In this step, the DNA is hybridized to the nucleotide probe. The reaction solution and reaction conditions for the hybridization Although it may fluctuate depending on various factors such as the length of the nucleotide probe to be immobilized on the DNA, it can be generally performed by a method well known to those skilled in the art.
本方法においては、 次いで、 該 DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプロ一 ブとのハイブリダィズの強度を検出する （工程 （e ) ) 。 この検出は、 例えば、 蛍光シグナルをスキヤナ一等によって読み取ることによって行うことができる。 尚、 DNAアレイにおいては、 一般的にスライドガラスに固定した DNAをプロ一ブ といい、 一方溶液中のラベルした DNAをターゲットという。 従って、 基板に固定 された上記'ヌクレオチドを、 本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。 本方法においては、 次いで、 工程 （e ) で検出された強度を対照と比較する （ェ 程 ） ） 。  Next, in this method, the intensity of hybridization between the DNA and the nucleotide probe immobilized on the substrate is detected (step (e)). This detection can be performed, for example, by reading the fluorescent signal with a scanner or the like. In DNA arrays, DNA fixed on a slide glass is generally called a probe, while labeled DNA in a solution is called a target. Therefore, the above-mentioned 'nucleotide immobilized on the substrate is referred to herein as a nucleotide probe. In the present method, the intensity detected in step (e) is then compared with a control (step (e)).
このような方法としては、 例えば、 DNAアレイ法 （SNP遺伝子多型の戦略、 松 原謙一'榊佳之、 中山書店、 P128 - 135、 Nature Genet i cs (1999) 22 : 164-167) 等 が挙げられる。  Examples of such a method include a DNA array method (SNP genetic polymorphism strategy, Kenichi Matsubara's Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, P128-135, Nature Genetics (1999) 22: 164-167) and the like. Can be
上記の方法以外にも、 特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的ォ リゴヌクレオチド (Al l ele Spec i f i c 01 igonuc l eot ide/ASO) ハイブリダィゼー ション法が利用できる。 変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌク レオチドを作製し、 これと DNAでハイブリダィゼ一シヨンを行わせると、 変異が 存在する場合、 八イブリツド形成の効率が低下する。 それをサザンプロット法や、 特殊な蛍光試薬がハイプリッドのギャップにインタ一カレ一ションすることによ り消光する性質を利用した方法等により検出することができる。  In addition to the above-mentioned method, an allele-specific oligonucleotide (Allele Specific 01 igonucleotide / ASO) hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position. When an oligonucleotide containing a nucleotide sequence that is considered to have a mutation is prepared and hybridized with the DNA, the efficiency of octabridged formation is reduced in the presence of the mutation. It can be detected by the Southern plot method or a method utilizing the property of quenching by intercalating a special fluorescent reagent into the gap of the hybrid.
本発明においては、 上記の遺伝子型判定方法により多型が検出された場合に、 植物が半わい性形質を有するものと判定される。 本発明は、 このような植物の半 わい性形質の検査方法も提供する。  In the present invention, when a polymorphism is detected by the above genotyping method, it is determined that the plant has a semi-dwarf trait. The present invention also provides a method for examining the semi-dwarf trait of such a plant.
また、 本発明は、 植物の sd-1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するための PC Rプライマーであって、 該領域に存在する、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに 記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位 を含む DNA領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドを提供する。 The present invention also provides a PCR primer for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, wherein the primer is present in the region. The present invention provides an oligonucleotide for amplifying a DNA region containing the site described above or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
このようなオリゴヌクレオチドとしては、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに 記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位 を挟むように設計されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。 PCRプライマーの設 計および合成については、 一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。 また、 PCRプライマーの長さは、 特に制限はないが、 通常 15bp〜100bpであり、 好ましくは 17bp〜30bpである。  As such an oligonucleotide, an oligonucleotide designed to sandwich a site described in any of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site is used. No. The design and synthesis of PCR primers can be generally performed by methods well known to those skilled in the art. The length of the PCR primer is not particularly limited, but is usually 15 bp to 100 bp, and preferably 17 bp to 30 bp.
さらに本発明は、 植物の sd_l遺伝子周辺領域に存在する、 上記の （A) 〜 (V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補 鎖における塩基部位を含む DNA領域とハイプリダイズし、 少なくとも 15ヌクレ ォチドの鎖長を有する、 sd-1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するためのオリ ゴヌクレオチドを提供する。 本発明においては、 該オリゴヌクレオチドをプロ一 ブとして使用する。  Further, the present invention provides a DNA comprising a site according to any one of the above (A) to (V), which is present in a region around the sd_l gene of a plant, or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Oligonucleotides that hybridize with the region and have a chain length of at least 15 nucleotides for determining the genotype of the region around the sd-1 gene are provided. In the present invention, the oligonucleotide is used as a probe.
該オリゴヌクレオチドは、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 ま たは該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNA領域 に特異的に八イブリダィズするものである。 ここで 「特異的にハイブリダィズす る」 とは、 通常のハイブリダィゼーシヨン条件下、 好ましくはストリンジェント なハイブリダィゼ一シヨン条件下 （例えば、 サムブルックら， Mo lecul ar Cl oning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA，第 2版 1989に記載の条 件） において、 他の DNAとクロスハイブリダィゼ一シヨンを有意に生じないこと を意味する。 特異的なハイブリダィズが可能であれば、 該オリゴヌクレオチドは、 上記の （A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩 基対をなす相補鎖における塩基部位を含む DNA領域に対し、 完全に相補的である 必要はない。 該オリゴヌクレオチドの長さは、 15ヌクレオチド以上であれば、 特に制限はない。 該オリゴヌクレオチドは、 例えば市販のオリゴヌクレオチド合 成機により作製することができる。 また、 制限酵素処理等によって取得される二 本鎖 DNA断片として作製することもできる。 The oligonucleotide specifically hybridizes to the site described in any one of the above (A) to (V) or a DNA region containing a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. Things. Here, “specifically hybridizes” means under ordinary hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory). Press, New York, USA, 2nd edition 1989) means that no significant cross-hybridization with other DNA occurs. If specific hybridization is possible, the oligonucleotide contains a site described in any one of the above (A) to (V) or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site. It need not be completely complementary to the DNA region. The length of the oligonucleotide is not particularly limited as long as it is 15 nucleotides or more. The oligonucleotide may be, for example, a commercially available oligonucleotide It can be produced by a machine. It can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
また、 該オリゴヌクレオチドは、 適宜標識して用いることが好ましい。 標識す る方法としては、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、 オリゴヌクレオチド の 5'端を32 Pでリン酸化することにより標識する方法、 およびクレノウ酵素等の DNAポリメラ一ゼを用い、 ランダムへキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマ —として32 P等のアイソトープ、 蛍光色素、 またはピオチン等によって標識され た基質塩基を取り込ませる方法 （ランダムプライム法等） を例示することができ る。 It is preferable that the oligonucleotide is appropriately labeled before use. Labeling can be performed by phosphorylating the 5 'end of the oligonucleotide with 32 P using T4 polynucleotide kinase, or using a random hexamer using DNA polymerase such as Klenow enzyme. A method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin using an oligonucleotide or the like as a primer (random prime method, etc.) can be exemplified.
本発明のオリゴヌクレオチドは、 植物の sd- 1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定 用試薬として使用することができる。 さらに、 植物の半わい性形質検査用試薬と しても使用することができる。 本発明においては、 このような植物の sd-1遺伝 子周辺領域の遺伝子型判定用試薬または植物の半わい性形質検査用試薬を提供す る。 図面の簡単な説明  The oligonucleotide of the present invention can be used as a reagent for genotyping the region around the sd-1 gene of a plant. Furthermore, it can be used as a reagent for testing semi-dwarf traits in plants. In the present invention, a reagent for genotyping the region around the sd-1 gene of such a plant or a reagent for testing semi-dwarf traits of a plant is provided. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 イネ半わい性遺伝子 sd-l近傍領域の遺伝地図 （概略） を示す図であ る。 縦線は第 1染色体の一部を示す。 横線は設定されたマーカーの位置を示す。 数字は連鎖距離 （単位はセンチモルガン） を示す。 矢印で sd- 1遺伝子の位置を 示す。  FIG. 1 is a diagram showing a genetic map (schematic) of a region near the rice semi-dwarf gene sd-l. The vertical line indicates a part of chromosome 1. The horizontal line indicates the position of the set marker. The numbers indicate the chain distance (unit: centimorgan). Arrows indicate the location of the sd-1 gene.
図 2は、 イネ半わい性遺伝子 sd-1近傍領域の遺伝地図 （詳細） および物理地 図を示す図である。 横線は第 1染色体の一部を示す。 縦線、 および矢印は設定さ れたマ一カーの位置を示す。 図 aおよび cにおいて横線の下に表示される数字は、 nで示される個体数の分離集団より見出された、 各ィンターパル内で組換えを生 じた個体数を示す。 図 dは sd- 1遺伝子の同定に用いた組換え個体の遺伝子型、 かん長により判定した sd- 1遺伝子のジエノタイプ、 および sd-1遺伝子の候補領 域内に予測された遺伝子とその位置を示す。 発明を実施するための最良の形態 FIG. 2 shows a genetic map (details) and a physical map of a region near the rice semi-dwarf gene sd-1. The horizontal line indicates a part of chromosome 1. The vertical line and arrow indicate the position of the set marker. The numbers shown below the horizontal lines in FIGS. A and c indicate the number of individuals that have undergone recombination within each interpal, as found from the segregation population of the number indicated by n. Figure d shows the genotype of the recombinant individual used to identify the sd-1 gene, The genotype of the sd-1 gene determined by the growth length, and the genes predicted in the candidate region of the sd-1 gene and their positions are shown. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではない。  Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[実施例 1 ] sd- 1遺伝子周辺の多型の同定 [Example 1] Identification of polymorphism around sd-1 gene
本発明者らは、 ササニシキ （正常な草丈をもつ日本型イネ品種） ·Λバ夕キ (sd-1に起因する半わい性の草丈をもつインド型イネ品種） の交配後代集団を 用いたポジショナルクローニングにより、 イネの半わい性遺伝子 sd-1の単離 · 同定を試みた。 その結果、 sd- 1遺伝子は、 ジベレリン- 20-ォキシダーゼ （GA20 - ox) をコードしている遺伝子であることが判明した （Monna et al.， DNA Res ear ch (2002) 9: 11-17) 。 GA20- oxとは、 ジベレリン （GA) の生合成経路において C-20位の酸化とそれに続く脱離を触媒する酵素であり、 活性型 GA合成の最終段 階を触媒する GA3]3- hydroxylase(GA3ox)に基質を供給する酵素である （Hedden， P. and Phillips A. L. 2000, Gibberellin metabolism: new insights reveale d by the genes, Trends in Plant Science (review), 5 (12), 523-530. ) 。 す でに、 ァラビドプシス （Coles, J.P.， Phillips, A.L. , Croker, J., Garcia- Le pe, R. , Lewis, M.J. and Hedden, P. 1999， Moddi f icat ion of gibberellin pr oduction and lant development in Arabidopsis by sense and ant isense exp ression of gibberel lin 20-oxidase genes, Plant J.， 17(5), 547-556. ) 、 So lanum dulcamara (Curtis, I.S. Ward, D.A. , Thomas, S.G. , Phillips, A.L. et al. 2000, Induction of dwarfism in transgenic So lanum dulcamara by ov erexpression of a gibberellin 20-oxidase cDNA from pumpkin, Plant J. , 23 (3)， 329-338.) 、 ジャガイモ （Carrera, E. , Bou, J. , Garcia - Martinez, J.L. and Prat, S. 2000, Changes in GA 20-oxidase gene expression strongly af feet stem length, tuber induction and tuber yield of potato plants, Plan t J. , 22 (3), 247-256.) 、 およびレタス (Niki, T. Nishijima, T.， Nakayama,The present inventors used a positional progeny using a mating progeny population of Sasanishiki (a Japanese rice cultivar with normal plant height) and Λbayuki (Indian rice cultivar with semi-dwarf plant height caused by sd-1). By cloning, we attempted to isolate and identify rice semi-dwarf gene sd-1. As a result, the sd-1 gene was found to be a gene encoding gibberellin-20-oxidase (GA20-ox) (Monna et al., DNA Research (2002) 9: 11-17). . GA20-ox is an enzyme that catalyzes the oxidation and subsequent elimination of the C-20 position in the gibberellin (GA) biosynthetic pathway. GA3] 3-hydroxylase (catalyzes the final step of active GA synthesis) GA3ox) (Hedden, P. and Phillips AL 2000, Gibberellin metabolism: new insights revealed by the genes, Trends in Plant Science (review), 5 (12), 523-530.). Alrabidopsis (Coles, JP, Phillips, AL, Croker, J., Garcia-Lepe, R., Lewis, MJ and Hedden, P. 1999, Moddi ficat ion of gibberellin pr oduction and lant development in Arabidopsis by sense and ant isense exp ression of gibberel lin 20-oxidase genes, Plant J., 17 (5), 547-556.), So lanum dulcamara (Curtis, IS Ward, DA, Thomas, SG, Phillips, AL et al 2000, Induction of dwarfism in transgenic So lanum dulcamara by overexpression of a gibberellin 20-oxidase cDNA from pumpkin, Plant J., 23 (3), 329-338.), Potato (Carrera, E., Bou, J. , Garcia-Martinez, JL and Prat, S. 2000, Changes in GA 20-oxidase gene expression strongly af feet stem length, tuber induction and tuber yield of potato plants, Plan t J., 22 (3), 247-256.), and lettuce (Niki , T. Nishijima, T., Nakayama,
M. et al. 2001, Production of dwarf lettuce by over-expressing a pumpki n gibberellin 20-oxidase gene, Plant Physiol., 42(7)， 694-702.) において、 GA20-ox遺伝子のアンチセンス導入または過剰発現によって半わい性植物を作出 することに成功したという報告がなされている。 従って、 イネの sd- 1座に存在 する GA20-OX遺伝子およびその変異型遺伝子は、 収量が低いが商品価値の高い既 存の品種への高収量性付与に、 直接利用することができると考えられる。 M. et al. 2001, Production of dwarf lettuce by over-expressing a pumpkin gibberellin 20-oxidase gene, Plant Physiol., 42 (7), 694-702.) It has been reported that semi-dwarf plants were successfully produced by expression. Therefore, the GA20-OX gene and its mutant gene present at the sd-1 locus of rice can be directly used for imparting high yield to existing varieties with low yield but high commercial value. Can be
本発明者らは、 sd- 1遺伝子を単離 ·同定する過程で、 イネ第 1染色体上の sd- 1周辺部分に、 ササニシキ ·ハバタキ間での一塩基置換多型を含む多型を多数見 出した。 具体的には、 下記のようにして行った。  In the process of isolating and identifying the sd-1 gene, the present inventors found many polymorphisms including a single nucleotide substitution polymorphism between Sasanishiki and Habataki in the vicinity of sd-1 on rice chromosome 1. Issued. Specifically, the procedure was performed as follows.
イネ品種ササニシキおよび八バタキを圃場または温室で栽培し、 CTAB法また は簡易抽出法により DNAを抽出した。 Rice Genome Research Programのホーム ページ （http：〃 rgp. dna.affrc.go.jp/) 上で公開されているイネゲノムシ一ケ ンス情報、 および DDBJ (http：〃 w . ddbj.nig.ac.jp/) に登録されているシ一 ケンスデータを利用し、 プライマ一設計支援サイト Primer3 (http://w -genom e. wi. mi t. edu/cgi-bin/primer/primer3_www. cgu で、 ケノム腿から適当な長 さの断片を増幅するプライマ一を設計した。 具体的には、 DDBJのァクセッショ ンナンバー AC090974で登録されているイネゲノム DNA塩基配列 （OSJNBa0029f02、 139043bp) 、 AP003405で登録されているイネゲノム塩基配列 （B1027B04、 16803 3bp) 、 AU058082で登録されているイネ cDNA塩基配列 E30867、 AU101358で登録 されているイネ cDNA塩基配列 E11764、 AIJ095374で登録されているイネ cDNA塩 基配列 E61578、 D25461で登録されているイネゲノム DNA塩基配列 L543、 D47675, AU089730で登録されているイネ cDNA塩基配列 S13312、 D46277で登録されてい るイネ cDNA塩基配列 S10846、 AU089695, AU089696で登録されているイネ cDNA 塩基配列 C1439、 八11101337で登録されてぃるィネ 0 塩基配列511055、 D47784 で登録されているイネ cDNA塩基配列 S13471、 C22379, C22380で登録されている イネ cDNA塩基配列 C12740をもとに、 500〜1000bpを増幅する PCRプライマーを 多数設定した。 設計したプライマーを用いて、 ササニシキおよびハバタキのゲノ ム DNAを铸型として、 Am liTaq Gold (Applied Biosystems) または HotStar Ta q (QIAGEN)を用いて PCR増幅を行った。 反応液の一部を用いてァガロースゲル電 気泳動を行い増幅断片を確認した後、 残りの反応液を ExoSAP- IT0JSB)処理して 未反応のプライマ一と dNTPを取り除き、 シークェンス反応の銹型を作成した。 この铸型に対して、 最初の増幅に用いたプライマーの片方をシーケンス用ブラ イマ一として再度添加し、 DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBACE (アマシャムバイオサイエンス）を用いてサイクルシークェンス反 応を行い、 シークェンス用サンプルを作成した。 シーケンスは、 MegaBACElOOORice cultivars Sasanishiki and Yabataki were cultivated in the field or greenhouse, and DNA was extracted by CTAB method or simple extraction method. Rice genome sequence information published on the Rice Genome Research Program home page (http: http rgp. Dna.affrc.go.jp/) and DDBJ (http: 〃 w. Ddbj.nig.ac.jp/ Using the sequence data registered in), the primer design support site Primer3 (http://w-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgu) A primer was designed to amplify a fragment of an appropriate length from a rice genome DNA sequence (OSJNBa0029f02, 139043bp) registered under DDBJ accession number AC090974, and a rice genome base registered under AP003405. Sequence (B1027B04, 16803 3bp), rice cDNA nucleotide sequence E30867 registered in AU058082, rice cDNA nucleotide sequence E11764 registered in AU101358, rice cDNA nucleotide sequence E61578 registered in AIJ095374, registered under E61578, D25461 Rice genomic DNA base sequence L543, D Rice cDNA nucleotide sequence registered under 47675, AU089730 S13312, rice cDNA nucleotide sequence registered under D46277 Rice cDNA nucleotide sequence registered under S10846, AU089695, AU089696 Base sequence C1439, rice registered at 811101337 0 Base sequence 511055, rice registered at D47784 Rice cDNA base sequence S13471, rice cDNA registered at C22379, C22380 Based on rice cDNA base sequence C12740, 500 A number of PCR primers that amplify ~ 1000 bp were set. Using the designed primers, genomic DNA of Sasanishiki and Habataki was type III, and PCR amplification was performed using AmliTaq Gold (Applied Biosystems) or HotStar Taq (QIAGEN). After performing agarose gel electrophoresis using a part of the reaction solution and confirming the amplified fragment, the remaining reaction solution was treated with ExoSAP-IT0JSB) to remove unreacted primers and dNTPs to create a rust-shaped sequence reaction. did. To this type II, one of the primers used for the first amplification was added again as a sequencing primer, and a cycle sequence reaction was performed using the DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBACE (Amersham Bioscience). A sample for the sequence was created. The sequence is MegaBACElOOO
(アマシャムバイオサイエンス） を用いて行った。 得られたシーケンスデ一夕を ハバタキ ·ササニシキで比較し、 一塩基置換多型を含む多型を検索した。 同一品 種、 同一プライマ一対に対し少なくとも 4回のシーケンスを行い、 確実であるも ののみを多型と判定した。 得られた多型のいくつかについて、 CAPSまたは dCAPS 法でジエノタイピングが可能となるようマーカ一化を行った （図 1および 2) 。 表 1に、 本発明により見出された SNP部位を利用した PCRマーカー、 CAPSマ一 力一、 dCAPSマ一カー、 および SNPマーカー （AcycloPrime-FP反応 （Chen, X. , Levine, L. , and Kwok, P. Y. 1999, Fluorescence Polarization in Homogeneo us Nucleic Acid Analysis, Genome Res., 9， 492-98.) に使用するためのマー カー） の一覧を示す。 マ-力— 利用した多型部位 プライマ一ペア 多型 (Amersham Biosciences). The obtained sequence data was compared between Habataki and Sasanishiki to search for polymorphisms including single nucleotide substitution polymorphisms. Sequences were performed at least four times for the same kind and the same primer pair, and only those that were reliable were judged to be polymorphisms. Some of the obtained polymorphisms were unified with markers to enable dienotyping by the CAPS or dCAPS method (Figures 1 and 2). Table 1 shows PCR markers, CAPS markers, dCAPS markers, and SNP markers (AcycloPrime-FP reaction (Chen, X., Levine, L., and A list of markers for use in Kwok, PY 1999, Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res., 9, 492-98.) Marker—Polymorphism Site Used Primer Pair Polymorphism
配列番号 ¾¾bp) 画素  (SEQ ID NO: bp) Pixel
S10846 CAPS 列番号 22の 170位 5 ' -CTCGTAGATGGCTCCGTTTC-3 ' 31 378 H=378  S10846 CAPS Column No. 22 position 170 5'-CTCGTAGATGGCTCCGTTTC-3 '31 378 H = 378
5， -AACAGCTCCCAAAATGTTTAGC-3 32 S=206, 172  5, -AACAGCTCCCAAAATGTTTAGC-3 32 S = 206, 172
C1439 CAPS 配列番号 20の 926位 5 1 -ATGGCTGTACCGTCTCCTTG-3 ' 33 352 Ah I H=150, "9, 83 C1439 CAPS SEQ ID NO: 926 position 5 1 -ATGGCTGTACCGTCTCCTTG-3 '33 352 Ah IH = 150, "9, 83
5， -CAGTGCAATTAATTCCTTTGCT-3 34 S=Z02, 150 5, -CAGTGCAATTAATTCCTTTGCT-3 34 S = Z02, 150
E11055 dCAPS 配列番号 ί 9の 319/320位 E11055 dCAPS SEQ ID NO: position 319/320 of 9
TTTGTCATTTCTACATAAAACATAGA 35 152 H=152  TTTGTCATTTCTACATAAAACATAGA 35 152 H = 152
CTATTGAATT-31 CTATTGAATT-3 1
5 ' -TTGGGTGGCTCTGATGAGGA-3， 36 S=120, 32 5 '-TTGGGTGGCTCTGATGAGGA-3, 36 S = 120, 32
S13471 CAPS 配列番号 18の 653位 51 - CCACATACTCACTTCTGCTT-3 ' 1 985 Hha I H-519, 3, 7o S13471 CAPS SEQ ID NO: 18 position 653 5 1 -CCACATACTCACTTCTGCTT-3'1 985 Hha I H-519, 3, 7o
5， -AGGCACTACAACAATGGCAC-3 , 38 S=5I9 4fifi 5, -AGGCACTACAACAATGGCAC-3, 38 S = 5I9 4fifi
E30867 CAPS 配列番号 Uの 223位 5 ' -GGCAACGGTACCCGACGTA-3 ' 39 μ=287 H=219, 6リ8リ E30867 CAPS SEQ ID NO: 223 position 5 '-GGCAACGGTACCCGACGTA-3' 39 μ = 287 H = 219, 6 8
51 -TTGTAACTCTCCCCTGCGTTT-3 ' 40 ク A3 S=283 5 1 -TTGTAACTCTCCCCTGCGTTT-3 '40 A3 S = 283
E61578 dCAPS S列番号〗 4の 691位 5 ? -E61578 dCAPS S column number〗 4 691 position 5 ? -
GATCTTCTGGCAGCATTCTCCATAAG u-oc on GATCTTCTGGCAGCATTCTCCATAAG u-oc on
ATAGCACTG-31 ATAGCACTG-3 1
5 ' -TAT6ACCCTGACCCATGAGC-31 42 S=115 a codominant 配列番号 9の 525— 560位 5'-TAT6ACCCTGACCCATGAGC-3 1 42 S = 115 a codominant 525-position 560 of SEQ ID NO: 9
-GAGAGAGGAGGCTGATGTGG- 43 S: approx. 500 H>Sは β of product] PCR marker  -GAGAGAGGAGGCTGATGTGG- 43 S: approx. 500 H> S is β of product] PCR marker
5 ' -TGGTCTCTCCTCATGCTTCA-31 44 5 '-TGGTCTCTCCTCATGCTTCA-3 1 44
b CAPS 列番号 Πの 139,143,144位 5 ' -AGTGTTGGCACATGCAGCTA-3， 5 ccom  b CAPS column number 139 139,143,144 position 5 '-AGTGTTGGCACATGCAGCTA-3, 5 ccom
5 1 -CfiATGAGGTGGTTCCTTGCT-3 ' ノ 5 1 -CfiATGAGGTGGTTCCTTGCT-3 '
c codominant 配列番号 10の 124— 342位 CAATCATCCAACTGCACCAA-3 ' 47 S« annrnv 、リ  c codominant SEQ ID NO: 124—342 position 342 CAATCATCCAACTGCACCAA-3 '47 S «annrnv
PCR marker  PCR marker
ATCCCTTTCAGGGACC TC-3 , 48  ATCCCTTTCAGGGACC TC-3, 48
dominant TGTTGGGTTGAAAGCCCATT-31 49 792 H: not amplified PCR marker dominant TGTTGGGTTGAAAGCCCATT-3 1 49 792 H: not amplified PCR marker
-ACACTCGAAGGCGAGCTTTG-3 , 50 S: amplified -ACACTCGAAGGCGAGCTTTG-3, 50 S: amplified
CAPS 配列番号 2の 1732位 -TTAGATTCCGCATCGTCCTT-3 ' 51 Ase\ CAPS SEQ ID NO: 2 position 1732 -TTAGATTCCGCATCGTCCTT-3 '51 Ase \
-GTGTTGAGCGGGAGTGAGTT-3 * 52 S=744  -GTGTTGAGCGGGAGTGAGTT-3 * 52 S = 744
GAPS 配列番号 6の 351位 -C AATGACCCTTCGGTTGCTG- 31 53 H=824 Msp\ H=519, 305 GAPS SEQ ID NO: 6 position 351 -C AATGACCCTTCGGTTGCTG- 3 1 53 H = 824 Msp \ H = 519, 305
-TGGCTGCTGCTCTGCTTACC- 3 ' 54 S-836 S-oJb g CAPS 配列番号 7の 221位 -CCCTCGTGATAAGCGCGATA-31 55 788 Rsa\ H=281, 220, 210.77 -TGGCTGCTGCTCTGCTTACC- 3'54 S-836 S-oJb g CAPS Position 221 of SEQ ID NO: 7 -CCCTCGTGATAAGCGCGATA-3 1 55 788 Rsa \ H = 281, 220, 210.77
-AGGAAATGCGCAACATGCAG-3 ' 56 S=430, 281, 77 h codominant S列番号 2の 56B位 -GACTCAACAGGCCCTCCAAA-3 ' 57 H=843 H=843  -AGGAAATGCGCAACATGCAG-3 '56 S = 430, 281, 77 h codominant S 56B position in column number 2 -GACTCAACAGGCCCTCCAAA-3 '57 H = 843 H = 843
PCR marker  PCR marker
-CCACGCGGTTATTGCAAGTT- 3 ' 58 S=800 S=800  -CCACGCGGTTATTGCAAGTT- 3 '58 S = 800 S = 800
CAPS S列番号 5の 583位 -CGATGCGTCCAGTTGAGGAA-3 ' 59 H=800 Dra\ H=556, 244  CAPS S column number 583rd position -CGATGCGTCCAGTTGAGGAA-3 '59 H = 800 Dra \ H = 556, 244
-CTGCTATGCCGCAGCCTTCT- 3 ' 60 $=813 S=813  -CTGCTATGCCGCAGCCTTCT- 3 '60 $ = 813 S = 813
SNP marker配列番号 4の 86位 890 H: actcctaa(T) tgtgat  SNP marker SEQ ID NO: 86 position 890 H: actcctaa (T) tgtgat
5， -GAAACGGAACGAACAGAAGC-3 ' 61  5, -GAAACGGAACGAACAGAAGC-3'61
(T/G)  (T / G)
5 ' -ACAAAAACCATCCGGGATTT- 31 ' 62 S: actcctaa(C)ttgtgat SNP Primer : 5 5 '-ACAAAAACCATCCGGGATTT- 3 1' 62 S : actcctaa (C) ttgtgat SNP Primer: 5
63  63
TACATCAGAGCTACTCCTAA-3 ' d TACATCAGAGCTACTCCTAA-3 ' d
k codominant 配列番号 2の 2503— 2885位 H=223  k codominant SEQ ID NO: 2503—position 2885 H = 223
5 H=223  5 H = 223
1 -AGCTGGACATGCCCGTGGTC-3 ' 64  1 -AGCTGGACATGCCCGTGGTC-3 '64
PCR marker  PCR marker
5 ' -TTGAGCTGCTGTCCGCGAAG-3 ' 65 S=606 S=606  5 '-TTGAGCTGCTGTCCGCGAAG-3' 65 S = 606 S = 606
S13312 dCAPS S列番号 16の 405位 5  S13312 dCAPS S column number 16, position 405 5
66 135  66 135
TCCAGGTTTTGATCTGATTGGTGA- Ear\ H=135  TCCAGGTTTTGATCTGATTGGTGA- Ear \ H = 135
5  Five
TCAGTTGCGGATTGATGCTAGCATCT 6フ S=94, 1 TACTTCTCT-3' 表 1は、 左から、 マーカー名 （図 1および図 2に位置を示す） 、 利用した SNP 部位、 プライマ一配列、 増幅断片長、 制限酵素 （CAPS、 dCAPSの場合のみ） 、 お よび多型の出方を示す。 なお、 Hはハバタキ、 Sはササニシキを示す。 TCAGTTGCGGATTGATGCTAGCATCT 6F S = 94, 1 TACTTCTCT-3 'Table 1 shows, from the left, the marker name (position is shown in Fig. 1 and Fig. 2), SNP site used, primer sequence, amplified fragment length, restriction enzyme (CAPS , DCAPS only) And how the polymorphism appears. H indicates Habataki and S indicates Sasanishiki.
[実施例 2 ] 半わい性形質と s d— 1遺伝子周辺の多型の関連 [Example 2] Relationship between semidwarf trait and polymorphism around sd-1 gene
本発明による DNAマーカ一 （表 1 ) を用いて、 ササニシキに半わい性形質を導 入するモデル実験を行った。 ササニシキは、 やや高い草丈を持つ日本型イネ品種 であり、 正常型 Sd-1遺伝子を持っている。 従って、 このササニシキに s d— 1 を導入すれば半わい性形質を付与することが可能であると予想された。  Using the DNA marker according to the present invention (Table 1), a model experiment for introducing a semi-dwarf trait to Sasanishiki was performed. Sasanishiki is a Japanese rice cultivar with a rather high plant height and has a normal Sd-1 gene. Therefore, it was expected that semi-dwarf trait could be imparted by introducing sd-1 into Sasanishiki.
まず、 ササニシキと s d— 1を持つ半わい性品種 IR24を交配し、 F1を得た。 さらに、 この F1にササニシキを交配し BC1F1世代を得た。 BC1F1は、 理論上染 色体全領域の 2分の 1がササニシキホモ型であり、 2分の 1がササニシキと IR24 のへテロ型になっている。 この BC1F1個体群の中から、 CAPSマーカー S10846お よび dCAPSマ一力一 S13312を用いて、 s d— 1を含む両マーカー間がヘテロ型に なっている個体を選抜し、 さらにササニシキとの交配 （戻し交配） を行い、 BC2F 1世代を得た （ヘテロの領域は全染色体の 4分の 1である） 。 なお、 両マーカ一 間で起こる組換えを考慮して、 s d— 1遺伝子近傍に設定したマーカ一 bおよび iを用いて、 確実に s d— 1領域がヘテロであることの確認も行った。 同様にし て s d—1領域がヘテロである個体を選抜し、 さらにササニシキとの交配を重ね た。 BC1F1から BC2F1→BC3F1→BC4F1と戻し交配を繰り返すごとに、 IR24の持つ 特徴的な形質は失われ、 ササニシキに近い形質を持った個体群となった。 これは、 S10846/S13312のマーカー間の染色体領域がササニシキと IR24のへテロ型に維 持されたまま、 他の染色体領域がササニシキのホモ型に徐々に置換されていって いるためであると推測された。 BC5F1世代では IR24の染色体をへテロで有する 領域は理論上全体の 32分の 1となり、 遺伝的背景はほとんどササニシキと同一 で、 かつ目的の染色体領域のみに IR24型の染色体が導入された準同質遺伝子系 統に近い系統が得られていると推測された。 実際、 BC5F1の自殖種子を展開栽培 したところ、 草型以外ササニシキと区別のつかない個体群が得られた。 これらの個体から、 幼苗期のうちにゲノム DNAを抽出し、 マーカ一 eで s d— 1 (Sd-1) 領域における遺伝子型を決定したところ、 s d— 1 / s d— 1ホモ、 s d— 1 /S d— 1ヘテロ、 Sd— 1/S d— 1ホモの 3つに分類された。 そして、 各 個体を出穂 ·登熟するまで育成を続けてかん長を測定したところ、 s d— 1 / s d— 1ホモとなっている個体群ではササニシキに比べて明らかに平均かん長が短 縮していることが明らかとなった。 よって、 上記に示したように、 本発明による マーカ一を用いた選抜 ·交配を繰り返すことで、 s d— 1由来の半わい性形質を 獲得した限りなくササニシキに近い品種が育成できることが確認された。 First, Sasanishiki was crossed with a semi-dwarf variety IR24 having sd-1 to obtain F1. Furthermore, Sasanishiki was crossed to this F1 to obtain BC1F1 generation. In BC1F1, theoretically, one half of the entire chromosome region is homozygous for Sasanishiki, and one half is heterotype of Sasanishiki and IR24. From the BC1F1 population, individuals using the CAPS marker S10846 and dCAPS marker I S13312 were selected for heterozygosity between both markers including sd-1 and crossed with Sasanishiki (returned). Crossing) to obtain one BC2F generation (the heterozygous region is one quarter of all chromosomes). In consideration of the recombination occurring between the two markers, it was confirmed that the sd-1 region was definitely heterozygous using the markers b and i set near the sd-1 gene. Similarly, individuals with heterozygous sd-1 regions were selected and crossed with Sasanishiki again. Each time backcrossing from BC1F1 to BC2F1 → BC3F1 → BC4F1 was repeated, the characteristic traits of IR24 were lost and the population became a population with traits similar to Sasanishiki. This is presumed to be due to the fact that the chromosomal region between the S10846 / S13312 markers is maintained in the heterozygous form of Sasanishiki and IR24, while the other chromosomal regions are gradually replaced by homozygous Sasanishiki. Was done. In the BC5F1 generation, the region containing the heterologous IR24 chromosome is theoretically 1/32 of the entire region, the genetic background is almost the same as that of Sasanishiki, and the chromosome of the IR24 type is introduced only into the target chromosome region. It was presumed that a strain close to the genetic line was obtained. In fact, when BC5F1 self-propagated seeds were expanded and cultivated, a population was obtained that was indistinguishable from Sasanishiki, except for the plant type. From these individuals, genomic DNA was extracted during the seedling stage, and the genotype in the sd-1 (Sd-1) region was determined using marker e. As a result, sd-1 / sd-1 homozygous, sd-1 / S d-1 heterozygous and Sd-1 / S d-1 homo. Then, the growth of each individual was continued until heading and ripening, and the growth was measured. In the population of sd-1 / sd-1 homozygotes, the average growth was clearly shorter than that of Sasanishiki. It became clear that. Therefore, as described above, it was confirmed that by repeating the selection and crossing using the marker according to the present invention, it is possible to cultivate a variety close to Sasanishiki without obtaining the semi-dwarf trait derived from sd-1. .
さらに、 得られた個体の中で、 s d— 1遺伝子周辺の出来るだけ狭い領域のみ が IR24ホモ型であり、 その他の領域がササニシキホモ型に置換されている個体 (系統） を選抜するために、 本発明のマーカーを用いて s d _ 1周辺の遺伝子型 を調査した。 その結果、 表 2に示すような遺伝子型を有する個体が 1個体得られ た （この個体を仮に PGCササニシキとする） 。  Furthermore, in order to select individuals (strains) in which only the narrowest region around the sd-1 gene was IR24 homozygous and the other regions were replaced with Sasanishiki homozygous, among the obtained individuals, The genotype around sd_1 was investigated using the marker of the present invention. As a result, one individual having a genotype as shown in Table 2 was obtained (this individual is assumed to be PGC Sasanishiki).
この結果より、 本発明のマーカ一を用いることにより、 s d— 1遺伝子のみを 含む非常に限定された染色体領域のみが IR24型である個体を選抜することが可 能であることが示された。 これは、 目的形質の非常に近傍に位置する遺伝子に起 因する望ましくない形質が、 強い連鎖のために戻し交配を繰り返しても取り除く ことができない現象 （いわゆる 「連鎖のひきずり」 ） を防ぐために非常に有効で ある。  From these results, it was shown that by using the marker of the present invention, it is possible to select an individual having only a very limited chromosomal region containing only the sd-1 gene and having the IR24 type. This is done to prevent unwanted traits caused by genes located very close to the target trait, which cannot be removed by repeated backcrossing due to strong linkage (so-called “linkage dragging”). It is effective for
表 2 Table 2
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000039_0001
PGCササニシキの育成にあたっては、 s d— 1周辺の遺伝子型をモニタリング しながら世代を進めたが、 染色体の他の部分について IR24の染色体領域がどの 程度残っているのかが不明である。 そこで、 他の染色体領域にほぼ均等に設定さ れた 100箇所の SNPマーカ一を用いて PGCササニシキのグラフィカルジェノ夕ィ プを確認した結果、 PGCササニシキは検査した全ての SNP位置においてササニシ キホモ型の染色体を有することが確認された。 すなわち、 PGCササニシキは、 s d— 1遺伝子を含む非常に限定された染色体領域のみが IR24型であり、 その他 の染色体領域はササニシキ由来のものである、 言い換えれば、 ササニシキに半わ. い性遺伝子のみを導入した品種である。 In breeding PGC Sasanishiki, we proceeded with generations while monitoring the genotype around sd-1, but it is unclear how much of the chromosome region of IR24 remains in other parts of the chromosome. Therefore, it is almost equally set to other chromosomal regions. As a result of confirming the graphical genomic information of PGC Sasanishiki using the 100 SNP markers obtained, it was confirmed that PGC Sasanishiki had Sasanishiki homo-type chromosomes at all the SNP positions examined. That is, in PGC Sasanishiki, only a very limited chromosomal region including the sd-1 gene is of type IR24, and the other chromosomal regions are derived from Sasanishiki, in other words, only sexual genes that are half as small as Sasanishiki. It is a variety that introduced.
ササニシキのように草丈が高く倒伏に弱い優良品種に半わい性形質を導入する ためには、 IR24のような半わい性の系統と交配し、 戻し交配を繰り返し、 得ら れた個体を自殖して得られた種子から莫大な数の植物体を育成し、 半わい性であ つてかつササニシキ並の品質 ·食味を有するものを選抜するという、 多大な労力 と長い期間を要する作業が必要であった。 最近の研究成果により、 半わい性遺伝 子 s d— 1が単離同定され、 半わい性はジベレリン合成系の酵素である GA20ォ キシダ -ゼの機能欠損に起因することがわかったことから、 原品種のもつ S d— 1 遺伝子をアンチセンス遺伝子の導入により機能阻害する方法も可能である。 しか し、 アンチセンス導入では、 内性遺伝子を完全に破壊することはできないため、 将来も機能阻害効果が続くことは保証できない。 また遺伝子組換植物を食用に栽 培することに対する農家や消費者の反発は大きく、 品種として受け入れられる可 能性が低いため、 現在のところ現実的な方法とはいえない。  In order to introduce a semi-dwarf trait to a superior cultivar such as Sasanishiki with high plant height and weakness to lodging, it is crossed with a semi-dwarf line such as IR24, repeated backcrossing and selfing the obtained individual A huge amount of labor and a long period of time are required to grow an enormous number of plants from the seeds obtained in this way and select those that are semi-dwarf and have the same quality and taste as Sasanishiki. there were. Recent research results have isolated and identified the semi-dwarf gene sd-1, and found that semi-dwarfness was caused by a defective function of GA20 oxidase, a gibberellin-synthesizing enzyme. It is also possible to inhibit the function of the S d-1 gene of the cultivar by introducing an antisense gene. However, the introduction of antisense does not completely destroy the endogenous gene, and thus cannot guarantee that the function-inhibiting effect will continue in the future. At the same time, farmers and consumers are strongly opposed to cultivating genetically modified plants for food, and are unlikely to be accepted as varieties.
それに対して、 本発明の方法を用いて半わい性品種を育成する方法は、 交配 · 戻し交配を基盤としつつ、 必要な個体のみを選抜しながら育成を進めることがで きるため、 科学的根拠に基づいた、 無駄なく迅速な半わい性品種育種の手段を提 供する。 さらに、 遺伝子組換えの手法を用いることなく、 それと同等以上の効力 をもつ品種を育成できるという優位性がある。  On the other hand, the method of cultivating semi-dwarf varieties using the method of the present invention is based on crossing and backcrossing, and allows breeding to proceed while selecting only necessary individuals. To provide a means of breeding semi-dwarf varieties quickly and without waste based on Another advantage is that varieties with the same or higher efficacy can be grown without using genetic recombination techniques.
[実施例 3 ] 主要ィネ品種での DNAマ一カーの有用性検定 実施例 1において作成した各種 DNAマーカーは、 マーカ一作成に用いたハバ夕 キおよびササニシキ以外のイネ品種においても広く利用することが可能であると 推測された。 そこで、 日本国での主要イネ品種に対して、 本発明の DNAマーカ一 の有用性を確認する実験を行つた。 [Example 3] Usefulness test of DNA marker in major rice varieties It was presumed that the various DNA markers created in Example 1 could be widely used in rice varieties other than Habayuki and Sasanishiki used for the marker creation. Therefore, an experiment was conducted on main rice varieties in Japan to confirm the usefulness of the DNA marker of the present invention.
用いた品種は以下の 2 3品種である。 日本晴、 ハツシモ、 むつほまれ、 ゆきの 精、 きらら 3 9 7、 つがるロマン、 五百万石、 森のくまさん、 ゆめあかり、 ハナ ェチゼン、 コシヒカリ、 月の光、 あきたこまち、 朝の光、 あいちのかおり、 祭り 晴、 ヒノヒカリ、 夢つくし、 ひとめぼれ、 まなむすめ、 ふさおとめ、 どんとこい、 キヌヒカリ。  The following varieties were used. Nipponbare, Hatsimo, Mutsu Homare, Yukino No Se, Kirara 397, Tsuruga Roman, 500 Hyakumangoku, Forest Bear, Yume Akari, Hanaechizen, Koshihikari, Moonlight, Akitakomachi, Morning Light, Aichi Kaori , Festival, Haruhi, Hinohikari, Dream Tsukushi, Hitomeboru, Learn daughter, Fusaotome, Dontokoi, Kinuhikari.
各品種の幼苗から簡易抽出法でゲノム DNAを抽出 ·精製し、 ゲノミック PCRの 錄型に供した。 具体的には、 ゲノム DNA溶液を 40ng/^ lになるように滅菌ミリ Genomic DNA was extracted and purified from the seedlings of each variety by a simple extraction method and subjected to genomic PCR type III. Specifically, sterilize the genomic DNA solution to 40 ng / ^ l.
Q水で調整し、 それを 2 0 1の PCR溶液に l 1添加して、 PCRを行った。 各 マーカ一の PCRに用いた条件を表 3に示す。 The mixture was adjusted with Q water, added to the PCR solution (201), and PCR was performed. Table 3 shows the conditions used for PCR for each marker.
Ampl iTaq Go ldを用いた場合の条件を以下に示す。  The conditions when using Ampl iTaq Gold are shown below.
プレヒ一ト 95°C 10分  Preheat 95 ° C 10 minutes
サイクル反応 ① 94°C30秒 X。C30秒 72 30秒  Cycle reaction ① 94 ° C 30 seconds X. C 30 seconds 72 30 seconds
② 94で 30秒 XX： 30秒 72^ 1分  ② 94 seconds for 30 seconds XX: 30 seconds 72 ^ 1 minute
③ 94°C30秒 rci分 72°C 1分  ③ 94 ° C 30 sec rci min 72 ° C 1 min
最終伸長反応 72^ 7分  Final extension reaction 72 ^ 7 minutes
HotStarTaqを用いた場合の条件を以下に示す。 The conditions when HotStarTaq is used are shown below.
プレヒート 95 15分  Preheat 95 15 minutes
サイクル反応 ④ 94°C30秒 X°C30秒 72で 1分  Cycling reaction ④ 94 ° C 30 seconds X ° C 30 seconds 72 minutes 1 minute
⑤ 94 30秒 Xで 1分 72°C 1分  ⑤ 94 30 seconds X at 1 minute 72 ° C 1 minute
最終伸長反応 72°C 10分 表 Final extension reaction 72 ° C 10 minutes table
Taq polymerase* MgCl2 PCR温度条件 *2 ァニーリン Taq polymerase * MgCl 2 PCR temperature condition * 2 aniline
1 f欽遍  1 f Kinen
グ温度 (X)  Temperature (X)
度） サイクル サイクル数 l U04D Amrv 11 αη Γη 1 H cm Degree) cycle cycle number l U04D Amrv 11 αη Γη 1 H cm
1 , 0腿 00 し ③ 35 pi AQQ Δτηηΐ i Tan Pn 1 H Do し ③ 35 pi 1 ncc  1, 0 thigh 00 ③ 35 pi AQQ Δτηηΐ i Tan Pn 1 H Do ③ 35 pi 1 ncc
に UJI1 0 ( し ① 40  To UJI1 0 (I ① 40
C 0^71 C 0 ^ 71
/ Λiτlηlipη 1 i il Tl aor (t Γ uπU ΐ rr  / Λiτlηlipη 1 i il Tl aor (t Γ uπU ΐ rr
I U 丄 · OHmM ουし ③ 35 cOUoD I rillip i l l dL uU 1 U 1 · Oill 00 し ② 35 βθΐ ϋ 1 O Amnl 1 a Γπ 1 A 1 · OillM 00 し ③ 40 IU 丄 · OH m M ου ③ 35 cOUoD I rillip ill dL uU 1 U 1 · Oill 00 ② 35 βθΐ ϋ 1 O Amnl 1 a Γπ 1 A1 · OillM 00 ③ 40
ΛΙΙΐρ ί丄丄 d J 丄 I 1 , 01腿 Do し ③ 35ΛΙΙΐρ ί 丄 丄 d J 丄 I 1, 01 Thigh Do ③ 35
D Anrnl i Ta
Figure imgf000042_0001
1. ΰ匪 β DΠU。し . ③ 35D Anrnl i Ta
Figure imgf000042_0001
1. Marauder β DΠU. ③ 35
C Ml l 11 Q O iu 1. OillM 00 し ③ 45C Ml l 11 Q O iu 1. OillM 00 ③ 45
0 1 an Pn H 0 1 an Pn H
Mi 11 laQ 01 IU 1. OlU D し ③ 35 g%  Mi 11 laQ 01 IU 1. OlU D ③ 35 g%
u Λ AΠmΙn 1Ι l a  u Λ AΠmΙn 1Ι l a
1丄 a l π H  1 丄 a l π H
IrO 11 U L, 0醒 DU し ② 35 IrO 11 U L, 0 awakening DU then ② 35
I f Am 1 i Tan π 1 H 1. 011腿 DU し ③ 40 i Ailmlinp 11 i11 a a n ( Γlπ) 11 Λ CmJ I f Am 1 i Tan π 1 H 1.011 thigh DU ③ 40 i Ailmlinp 11 i11 a a n (Γlπ) 11 Λ CmJ
8 U 1 · 01腿 οζ) し ③ 35 h Amp 1 iTaq Gold 2.5mM 64°C ③ 35 8 U 1 · 01 thigh οζ) ③ 35 h Amp 1 iTaq Gold 2.5mM 64 ° C ③ 35
I Am 1 iTaq Gold 1.5mM 60°C ③ 35 尸 HotStarTaq 1.5mM 55°C ⑤ 40 k HotStarTaq 1.5mM . 62°C ④ 40I Am 1 iTaq Gold 1.5mM 60 ° C ③ 35 HotStarTaq 1.5mM 55 ° C ⑤ 40k HotStarTaq 1.5mM .62 ° C ④ 40
S13312 Amp 1 iTaq Gold 1.5m 58°C ③ 35 表 3中、 *1は、 AmpUTaq Gol dがアプライドバイオシステムズ社、 HotStarTaq が QIAGEN社の製品であることを示す。 *2は、 PCRの温度条件が上記の条件を基 本とし、 サイクル条件、 サイクル数がマ一カーにより異なることを示す。 *3 は、 SNP pr imer を用いた反応が、 製造業者推奨の製品プロトコールに従ったもので あることを示す。 上記の条件は MJリサ一チ社製の PTC- 225 TETRADおよびァプラ ィドバイオシステムズ社製の GeneAmp PCR Sys tem 9700のサーマルサイクラ一で 至適化したものである。 S13312 Amp 1 iTaq Gold 1.5m 58 ° C ③ 35 In Table 3, * 1 indicates that AmpUTaq Gold is a product of Applied Biosystems and HotStarTaq is a product of QIAGEN. * 2 indicates that the PCR temperature conditions are based on the above conditions, and that the cycle conditions and number of cycles are different for each marker. * 3 indicates that the reaction using the SNP primer followed the product protocol recommended by the manufacturer. The above conditions were optimized with a thermal cycler of PTC-225 TETRAD manufactured by MJ Research and GeneAmp PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems.
PCR後のサンプルを各々 5 n 1分取し、 2 % (w/ v )ァガロースゲルで電気泳 動を行い増幅産物の有無を確認した。 優性マーカーに関しては、 この時点で適当 な濃度のゲルを用いて電気泳動を行い、 多型の検出を試みた。 CAPSおよび dCAPS マーカーは、 サンプル 1 0〜1 3 1を表 1に示した制限酵素で一晩処理した後、 適当な濃度のァガロースゲルあるいは Nus i eve GTGァガロースゲル （BMA社） を 用いて電気泳動を行って多型を検出した。 SNPマーカー jについては、 パーキン エルマ一社のァシクロプライム FPキットを用い、 添付のプロトコ一ルに従って 反応および検出を行った。  After the PCR, 5 n 1 samples of each sample were taken and subjected to electrophoresis on a 2% (w / v) agarose gel to confirm the presence or absence of amplification products. Regarding the dominant marker, electrophoresis was performed at this time using a gel having an appropriate concentration, and an attempt was made to detect a polymorphism. For the CAPS and dCAPS markers, samples 10 to 13 1 were treated with the restriction enzymes shown in Table 1 overnight, and then electrophoresed on agarose gel or Nusieve GTG agarose gel (BMA) at an appropriate concentration. Polymorphism was detected. The SNP marker j was reacted and detected using Percyclo-Elma's acycloprime FP kit according to the attached protocol.
その結果、 マーカー hにおける一部の品種を除き、 すべてのマ一カーにおいて ハバタキ/ササニシキ間で得られる多型と同様なバンドパターンによる多型が検 出された （表 4 ) 。 ほとんどの品種はササニシキ型の遺伝子型と判定されたが、 夢つくし、 どんとこい、 キヌヒカリにおいてはマーカ一 S10846以外でハバタキ 型の判定結果となった。 これは、 夢つくし、 どんとこいは親系統にキヌヒカリが 使われていることから、 キヌヒカリに導入された s d— 1を受け継いでいるため と考えられた。 以上の結果から、 本発明による DNAマーカーはハバタキ/ササニ シキを含む多くのイネ品種における s d _ 1 ( S d -1) 遺伝子およびその遺伝子 周辺領域の遺伝子型判定においても利用可能であることが確認された。 表 4に主 要品種で見られる多型について示す。  As a result, polymorphisms with the same band pattern as the polymorphism obtained between Habataki and Sasanishiki were detected in all the markers except for some varieties at marker h (Table 4). Most varieties were determined to be of the Sasanishiki genotype, but in the case of Yume-Tsukushi, Donkodoki, and Kinuhikari, the Habataki-type results were obtained with the exception of Marker-1 S10846. This was thought to be due to the inheritance of sd-1 introduced into Kinuhikari, because the parent strain used Kinuhikari for the dream. From the above results, it was confirmed that the DNA marker according to the present invention can also be used for genotyping the sd_1 (Sd-1) gene and its peripheral region in many rice varieties including Habataki / Sasanishiki. Was done. Table 4 shows the polymorphisms found in the main varieties.
表 4 コントロール 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 ハ 前 Table 4 Control 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 C
aa サ 曰 ノ\ む ゆ ぎ 五 森 ゆ ハ コ 月  aa sa says ゆ ゆ ゆ
小 ッ あ 朝 あ 祭 ヒ 歹 ひ ま ふ ど キ バ ソ 、 つ さ が ナ シ 1、 ノ と L , 禾重 白 JJ さ レジ  Small morning morning festival 歹 歹 歹 1 1 1 1 1 1 歹 1 JJ
タ ン ェ ヒ  Tanjehi
晴 ほ の ら る 万 < あ チ - 光 た 光 ち ヒ キ ン ま CO □ 力ι 晴 ヒ < め む お  ほ 万 万 万 万-□ □-CO
ま か の 力  Real power
キ 精 石 し ぼ 力  Ki crushed stone
CD ゼ 'J  CD ZE 'J
4レ マ /J、、 リ す と  4 rem / J
4し し、 IノI ン さ し J ン ま め め  4 、 I I I I
ん ち お  Nichio
マーカ一 y Marker y
S 10846 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S S S S S S s S 10846 H s s s s s s s s s s s s s s s S S S S S S S S S S S S S S s
C1439 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H HC1439 H s s s s s s s s s s s s s S S S S S S S S S H S S S H H
E1 1055 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H HE1 1055 H s s s s s s s s s s s S S S S S S S S S H S S S H H
S13471 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H HS13471 H s s s s s s s s s s s s S S S S S S S S S H S S S H H
E30867 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H HE30867 H s s s s s s s s s s s s s S S S S S S S S S H S S S H H
E61578 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H a H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H b H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H c H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H d H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H e H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H f H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H g H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H h H s s s s s s s s s s S S S S S S S S ND S S S ND NDE61578 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H a H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H b H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H c H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H d H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H e H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H f H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H g H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H h H s s s s s s s s s s S S S S S S S S ND S S S ND ND
I H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H j H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H k H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H HI H s s s s s s s s s s s S S S S S S S S S H S S S H H j H s s s s s s s s s s s s S S S S S S S S S S H S S S HH k H s s s s s s s s s s s S s
S13312 H s s s s s s s s s s S S S S S S S S H S S S H H S13312 H sssssssssss SSSSSSSSHSSSHH
表 4中、 「H」 はハバタキ型、 「S」 はササニシキ型の判定結果を示し、 ND は 増幅産物が得られなかつたことを示す。 産業上の利用の可能性 In Table 4, “H” indicates the determination result of Habataki type, “S” indicates the determination result of Sasanishiki type, and ND indicates that no amplification product was obtained. Industrial applicability
一塩基置換多型 （SNPs) を含む、 DNA上の塩基配列の差異は、 さまざまな SNPs 判定法のみならず、 RFLP法、 CAPS法など既存の分子遺伝学的手法を用いた遺伝 型判定法に利用可能である。 半わい性遺伝子 sd- 1周辺に、 正常型品種と半わい 性品種との間に見出された塩基配列上の差異は、 半わい性形質を有する新品種育 成の過程で、 交配により生じた雑種個体が半わい性形質を支配する遺伝子を含む 染色体断片をどの程度の範囲で有するか、 およびその染色体断片がヘテロである のかホモであるのか、 を調べる目的に有用である。 通常、 半わい性の検定は、 ィ ネが出穂 ·登熟し、 穂が垂れた段階でかん長 （根元から穂首までの長さ） を計測 する必要があるが、 SNPsを含む多型を用いたジヱノタイピングでは、 個体が幼 苗のうちに DNAを採取して検査が可能であるため、 時間が節約でき、 不要な個体 の栽培にかかる面積と労力を削減できる。 また、 かん長測定では困難であるへテ 口型の判定が、 当代個体で可能であるという利点もある。  Differences in nucleotide sequences on DNA, including single nucleotide substitution polymorphisms (SNPs), can be attributed not only to various SNPs determination methods, but also to genotyping methods using existing molecular genetic techniques such as RFLP and CAPS. Available. The differences in the nucleotide sequence found between the normal and semi-dwarf varieties around the semi-dwarf gene sd-1 were caused by crossing in the process of growing new varieties with semi-dwarf traits. This is useful for the purpose of examining to what extent a hybrid individual has a chromosomal fragment containing a gene that controls the semi-dwarf trait, and whether the chromosomal fragment is heterozygous or homozygous. Usually, the test for semi-dwarfness requires measurement of the canopy length (the length from the root to the ankle) at the stage when rice heads and ripens and the ear drops, but polymorphism including SNPs is used. In dinotyping, individuals can collect DNA in seedlings for testing, which saves time and reduces the area and labor required to cultivate unnecessary individuals. In addition, there is an advantage in that it is possible to judge the mouth type, which is difficult in the measurement of cannulation, with the current individual.

Claims

' 請求の範囲 ' The scope of the claims
1. 植物の s d— 1遺伝子周辺領域に存在する多型であって、 以下の （A) 〜 (V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補 鎖における部位の多型を検出する工程を含む、 植物の s d— 1遺伝子周辺領域の 遺伝子型判定方法。 1. A polymorphism present in the region around the sd-1 gene of a plant, wherein the site is any one of the following (A) to (V) or a site in a complementary strand that forms a base pair with a base in the site: A method for determining the genotype of the region around the sd-1 gene of a plant, comprising the step of detecting a polymorphism of the plant
(A) 配列番号： 1に記載の塩基配列の 103位、 144位、 199位、 203 位、 204位、 または、 347位。  (A) positions 103, 144, 199, 203, 204, or 347 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(B) 配列番号： 2に記載の塩基配列の 2位、 59位、 105 106位、 1 1 0位、 151位、 304位、 375位、 439位、 568Z569位、 577位、 604位、 6 14位、 616位、 1562位、 1675〜 1676位、 1732 位、 1852位、 1878位、 1935位、 2121位、 2125/2126位、 2503〜 2885位、 または、 3104位。  (B) positions 2, 59, 105, 106, 110, 151, 304, 375, 439, 568Z569, 577, 604, 6 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 14, 616, 1562, 1675-1676, 1732, 1852, 1878, 1935, 2121, 2125/2126, 2503-2885, or 3104.
(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列の 58位。  (C) position 58 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(D) 配列番号： 4に記載の塩基配列の 86位、 または、 277〜306位。 (D) position 86 or positions 277 to 306 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4.
(E) 配列番号： 5に記載の塩基配列の 78位、 331位、 337位、 364位、 373位、 405位、 423位、 481位、 539〜 551位、 583位、 59 3位、 661位、 685位、 または、 701位。 (E) positions 78, 331, 337, 364, 373, 405, 423, 481, 539-551, 583, 593, 661 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 Or 685 or 701.
(F) 配列番号： 6に記載の塩基配列の 201〜 213位、 351位、 547位、 または、 840位。  (F) positions 201 to 213, 351, 547 or 840 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
(G) 配列番号： 7に記載の塩基配列の 103位、 221位、 または、 264位。 (G) position 103, position 221 or position 264 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
(H) 配列番号： 8に記載の塩基配列の 59位。 (H) position 59 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
( I ) 配列番号： 9に記載の塩基配列の 288位、 301位、 または、 525〜 560位。  (I) Positions 288, 301 or 525 to 560 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
( J ) 配列番号： 10に記載の塩基配列の 124〜 342位。  (J) positions 124 to 342 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
(K) 配列番号： 11に記載の塩基配列の 223位、 または、 224Z225位。 (L) 配列番号： 12に記載の塩基配列の 314位。 (K) position 223 or position 224Z225 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; (L) position 314 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
(M) 配列番号： 13に記載の塩基配列の 320位。  (M) position 320 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.
(N) 配列番号： 14に記載の塩基配列の 70位、 137位、 170位、 または、 691位。  (N) position 70, position 137, position 170 or position 691 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
(O) 配列番号： 15に記載の塩基配列の 210位。  (O) position 210 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
(P) 配列番号： 16に記載の塩基配列の 380位、 または、 405位。  (P) position 380 or position 405 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
(Q) 配列番号： 17に記載の塩基配列の 43位、 84位、 139位、 143位、 144位、 または、 287位。  (Q) positions 43, 84, 139, 143, 144, or 287 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17;
(R) 配列番号： 18に記載の塩基配列の 101位、 161位、 196位、 また は、 653位。  (R) positions 101, 161, 196, or 653 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
(S) 配列番号： 19に記載の塩基配列の 319/320位。  (S) positions 319/320 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
(T) 配列番号： 20に記載の塩基配列の 214位、 670位、 または、 926 位。  (T) position 214, position 670 or position 926 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20;
(U) 配列番号： 21に記載の塩基配列の 194位。  (U) position 194 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21;
(V) 配列番号： 22に記載の塩基配列の 170位。  (V) position 170 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22.
2. 以下の （a) 〜 （c) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。  2. The method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (c).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程  (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Amplifying DNA containing bases in the strand
(c) 増幅した DNAの塩基配列を決定する工程  (c) determining the base sequence of the amplified DNA
3. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。  3. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (d).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程  (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) 調製した DNAを制限酵素により切断する工程  (b) cutting the prepared DNA with restriction enzymes
(c) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程  (c) a step of separating DNA fragments according to their size
(d) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程 (d) comparing the size of the detected DNA fragment with a control
4. 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。 4. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (e).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程  (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; For amplifying DNA containing bases in the strand
(c) 増幅した DNAを制限酵素により切断する工程  (c) cutting the amplified DNA with a restriction enzyme
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程  (d) a step of separating DNA fragments according to their size
(e) 検出された DNA断片の大きさを対照と比較する工程  (e) comparing the size of the detected DNA fragment with a control
5. 以下の （a) 〜 （e) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。  5. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (e).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程  (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; For amplifying DNA containing bases in the strand
(c) 増幅した DN Aを一本鎖に解離させる工程  (c) Step of dissociating amplified DNA into single strand
(d) 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程  (d) Separating the dissociated single-stranded DNA on a non-denaturing gel
( e ) 分離した一本鎖 D N Aのゲル上での移動度を対照と比較する工程  (e) comparing the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with a control
6. 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。  6. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (f).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程  (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む近傍の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチ ドに、 レポ一ター蛍光とクェンチヤ一蛍光の 2つを標識したプローブを 2種類合 成する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; A step of synthesizing two types of probes, labeled with both reporter fluorescence and quencher fluorescence, to an oligonucleotide complementary to a nearby base sequence including the base site in the strand
(c) 工程 （a) で調製した DNAに、 工程 （b) で合成したプロ一ブをハイブ リダィズさせる工程 (d) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程 (c) a step of hybridizing the probe synthesized in step (b) with the DNA prepared in step (a) (d) a base site present in the peripheral region of the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Amplifying DNA containing bases in the strand
(e) レポ一夕一蛍光の発光を検出する工程  (e) Step of detecting fluorescence emission of repo overnight
(f ) 工程 （e) で検出したレポ一夕一蛍光の発光を対照と比較する工程  (f) a step of comparing the emission of the repo overnight fluorescence detected in step (e) with a control
7. 以下の （a) 〜 （h) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。  7. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (h).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程  (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む 3 '側塩基配列と相補的な配列、 および全く 無関係な配列を合わせたプローブを合成する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Synthesizing a probe that combines a sequence complementary to the 3'-side nucleotide sequence including the nucleotide site in the strand, and a completely unrelated sequence
(c) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位から 5 '末端側が相補的なプローブを合成する工程 (c) a base site present in the region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Of synthesizing a probe whose 5 'end is complementary from the base site in the strand
(d) 工程 （c) で合成したプローブと工程 （a) で調製した DNAとハイプリ ダイズさせる工程 (d) Step of hybridizing the probe synthesized in step (c) with the DNA prepared in step (a)
(e) 工程 （d) でハイブリダィズした DNAを一本鎖 DNA切断酵素で切断し、 工程 （b) で合成したプローブの一部を遊離させる工程  (e) a step of cleaving the DNA hybridized in step (d) with a single-stranded DNA-cleaving enzyme and releasing a part of the probe synthesized in step (b)
(f ) 工程 （e) で遊離したプローブと、 検出用プローブとをハイブリダィズさ せる工程  (f) a step of hybridizing the probe released in step (e) with the detection probe
(g) 工程 （ί) でハイブリダィズした DNAを酵素的に切断し、 その際に発生 する蛍光の強度を測定する工程  (g) Step of enzymatically cleaving the DNA hybridized in step (ί) and measuring the intensity of the fluorescence generated at that time
(h) 工程 （g) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程  (h) comparing the fluorescence intensity measured in step (g) with the control
8. 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。  8. The method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (f).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程 (b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程 (a) Step of preparing DNA from test plant (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Amplifying DNA containing bases in the strand
(c) 増幅した DNAを一本鎖に解離させる工程  (c) Step of dissociating the amplified DNA into single strands
(d) 解離させた一本鎖 DNAのうち、 片鎖のみを分離する工程  (d) Step of separating only one strand of dissociated single-stranded DNA
( e ) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の近傍より 1塩基ずつ伸長反応を行い、 その際に生 成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、 発光の強度を測定する工程  (e) a base site present in the region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair at the site. A process in which an extension reaction is performed one base at a time from the vicinity of a base site in a chain, and pyrophosphoric acid generated at that time is enzymatically luminescent, and the luminescence intensity is measured.
(f) 工程 （e) で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程  (f) comparing the fluorescence intensity measured in step (e) with a control
9. 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。  9. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (f).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程  (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Amplifying DNA containing bases in the strand
(c) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成 する工程  (c) a base site present in the region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Synthesizing a primer complementary to the sequence up to one base next to the base site in the strand
(d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマ一を用いて一塩基伸長反応を行う工程 (d) In the presence of fluorescently labeled nucleotides, the DNA amplified in step (b) is transformed into a 铸 form, and a single-base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c).
(e) 蛍光の偏光度を測定する工程 (e) measuring the degree of polarization of fluorescence
(f ) 工程 （e) で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程  (f) comparing the degree of polarization of the fluorescence measured in step (e) with a control
10. 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。 (a) 被検植物体から DNAを調製する工程 (b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DN Aを増幅する工程 10. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (f). (a) Step of preparing DNA from test plant (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; For amplifying DNA containing bases in the strand
(c) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマーを合成 する工程  (c) a base site present in the region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Synthesizing a primer complementary to the sequence up to one base next to the base site in the strand
(d) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （c) で合成したプライマ一を用いて一塩基伸長反応を行う工程 (d) In the presence of fluorescently labeled nucleotides, the DNA amplified in step (b) is transformed into a 铸 form, and a single-base extension reaction is performed using the primer synthesized in step (c).
(e) シーケンサ一を利用して、 工程 （d) で反応に使われた塩基種を判定する 工程 (e) Using a sequencer to determine the type of base used in the reaction in step (d)
(f ) 工程 （e) で判定された塩基種を対照と比較する工程  (f) comparing the base species determined in step (e) with a control
11. 以下の （a) 〜 （d) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。 11. The method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (d).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程 (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Amplifying DNA containing bases in the strand
(c) 工程 （b) で増幅した DNAを質量分析器にかけ、 分子量を測定する工程 (c) Step of measuring the molecular weight by applying the DNA amplified in step (b) to a mass spectrometer
(d) 工程 （c) で測定した分子量を対照と比較する工程 (d) comparing the molecular weight measured in step (c) with the control
12. 以下の （a) 〜 （f) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。 12. The determination method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (f).
(a) 被検植物体から DNAを調製する工程 (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む D N Aを増幅する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Amplifying DNA containing bases in the strand
( c ) ヌクレオチドプロ一ブが固定された基板を提供する工程  (c) providing a substrate on which the nucleotide probe is immobilized;
(d) 工程 （b) の DNAと工程 （c) の基板を接触させる工程 (e) 該 DN Aと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダィズ の強度を検出する工程 (d) contacting the DNA of step (b) with the substrate of step (c) (e) a step of detecting the intensity of hybridization between the DNA and the nucleotide probe immobilized on the substrate
(f ) 工程 （e) で検出された強度を対照と比較する工程  (f) comparing the intensity detected in step (e) with a control
13. 以下の （a) 〜 （g) の工程を含む、 請求項 1に記載の判定方法。 13. The method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (g).
( a ) 被検植物体から DNAを調製する工程 (a) Step of preparing DNA from test plant
(b) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位を含む DNAを増幅する工程  (b) a base site present in a region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Amplifying DNA containing bases in the strand
(c) s d— 1遺伝子周辺領域に存在する塩基部位であって、 請求項 1に記載の (A) 〜 （V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対を なす相補鎖における塩基部位の 1塩基隣までの配列に相補的なプライマ一を合成 する工程  (c) a base site present in the region around the sd-1 gene, wherein the base according to any one of (A) to (V) according to claim 1 or a base forming a base pair with the base at the site; Synthesizing a primer that is complementary to the sequence up to one base next to the base site in the strand
(d) 工程 （c) で合成したプライマーが固定された基板を提供する工程 (d) Step of providing a substrate on which the primer synthesized in step (c) is immobilized
(e) 工程 （b) の DNAと工程 （d) の基板を接触させる工程 (e) contacting the DNA of step (b) with the substrate of step (d)
(f ) 蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、 工程 （b) で増幅した DNAを铸 型とし、 工程 （d) で基板に固定したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う 工程  (f) a step in which in the presence of a fluorescently labeled nucleotide, the DNA amplified in step (b) is converted into a type, and a single-base extension reaction is performed using the primer immobilized on a substrate in step (d)
(g) スキャナ一を用いて、 工程 （f) で反応に使われた塩基種を判定する工程 (g) Using a scanner to determine the type of base used in the reaction in step (f)
14. 植物がィネである、 請求項 1〜 13のいずれかに記載の判定方法。14. The method according to any one of claims 1 to 13, wherein the plant is rice.
15. 植物の半わい性形質の検査方法であって、 請求項 1〜14のいずれかに 記載の判定方法により多型が検出された場合に、 植物が半わい性形質を有するも のと判定される方法。 15. A method for testing a semi-dwarf trait of a plant, wherein when a polymorphism is detected by the determination method according to any one of claims 1 to 14, the plant is determined to have the semi-dwarf trait. How to be.
16. 植物の s d— 1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するための PC Rブラ イマ一であって、 該領域に存在する、 請求項 1に記載の （A) 〜 （V) のいずれ かに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補鎖における塩基 部位を含む DN A領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド。 16. A PCR primer for determining the genotype of a region around the sd-1 gene of a plant, which is located in the region, and is present in any one of (A) to (V) according to claim 1. An oligonucleotide for amplifying a DNA region including the site described above or a base site in a complementary strand forming a base pair with a base in the site.
1 7 . 植物の s d— 1遺伝子周辺領域に存在する、 請求項 1に記載の （A) 〜 (V) のいずれかに記載の部位、 または該部位における塩基と塩基対をなす相補 鎖における塩基部位を含む D NA領域とハイブリダィズし、 少なくとも 1 5ヌク レオチドの鎖長を有する、 s d— 1遺伝子周辺領域の遺伝子型を判定するための オリゴヌクレオチド。 17. The site according to any one of (A) to (V) according to claim 1, which is present in a region around the sd-1 gene of a plant, or a base in a complementary strand that forms a base pair with a base at the site. An oligonucleotide for hybridizing with a DNA region containing a site and having a chain length of at least 15 nucleotides for determining the genotype of a region around the sd-1 gene.
1 8 . 植物がイネである、 請求項 1 6または 1 7に記載のオリゴヌクレオチド。  18. The oligonucleotide according to claim 16 or 17, wherein the plant is rice.
1 9 . 請求項 1 6または 1 7に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 植物の s d 一 1遺伝子周辺領域の遺伝子型判定用試薬。 19. A reagent for genotyping the region around the sd-11 gene of a plant, comprising the oligonucleotide according to claim 16 or 17.
2 0 . 請求項 1 6または 1 7に記載のオリゴヌクレオチドを含む、 植物の半わ い性形質検査用試薬。  20. A reagent for testing a semi-warm trait of a plant, comprising the oligonucleotide according to claim 16 or 17.
2 1 . 植物がイネである、 請求項 1 9または 2 0に記載の試薬。  21. The reagent according to claim 19, wherein the plant is rice.
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