WO2003068950A1 - Inhibidores del activador tisular del plasminogeno (t-pa) con capacidad terapeutica - Google Patents

Inhibidores del activador tisular del plasminogeno (t-pa) con capacidad terapeutica Download PDF

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WO2003068950A1
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Rosanna Paciucci Barzanti
Victor Diaz Cortes
Timothy Thomson Okatsu
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
Hospital Vall D'hebron
Reventos Puigjaner
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Definitions

  • Inhibitors of tissue plasminogen activator (t-PA) with therapeutic capacity are provided.
  • the invention falls within the Medicine Area, in the pharmacological sector.
  • the object of the present invention is a method for inhibiting the expression and activity of the t-PA protein involved in tumors.
  • tissue plasminogen activator t-PA
  • u-PA urokinase
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • u-PA urokinase
  • Plasmin plays an important role in the invasive capacity of many types of neoplastic cells, being involved in the degradation of the extracellular matrix
  • HGF hepatocyte growth factor
  • TGF ⁇ tumor growth factor ⁇
  • VEGF vascular growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • IGFII growth factor II insulin-like
  • u-PAR The role in tumor growth and invasion of u-PA and its specific membrane receptor, u-PAR is well known [Ossowski L: Plasminogen activator dependent pathways in the dissemination of human tumor cells in the chick embryo. Cell 1988; 52: 321-328; Andreasen PA, Kjoller L, Christensen L, Duffy MJ: The urokinase-type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review.
  • tissue plasminogen activator tissue plasminogen activator
  • Expression levels of t-PA are increased in patients with familial adenomatous polyposis of the colon, but decrease in colon adenocarcinomas [Sier CF, Vloedgraven HJ, Griffioen G, Ganesh S, Nagengast FM, Lamers CB, Verspaget HW: Plasminogen activators and inhibitor type 1 in neoplastic colonic tissue from patients with familial adenomatous polyposis. Br J Cancer 1995; 71: 393-396].
  • pancreatic adenocarcinomas overexpression of t-PA is limited to carcinomatous cells, without this expression being observed in epithelial cells of pancreatitis areas or in cells of primary cultures of normal exocrine pancreas [Paciucci R, Tora M, Diaz VM, Real FX: The plasminogen activator system in pancreas cancer: role of t-PA in the invasive potential in vitro. Oncogene 1998; 16: 625-633].
  • pancreatic cancer pancreatic cancer
  • Pancreas -derived plasminogen activator inhibitor [US 6303338, 2001-10-16, Human Genome Sciences Inc]. It refers to a member of the serine protease inhibitors in particular the family of plasminogen activator inhibitor proteins and more specifically the pancreas derived plasminogen activator inhibitor protein.
  • the patent notes that plasminogen activator inhibitors play a large role in pathological processes including cancer.
  • the invention provides nucleic acid, polypeptides, vectors, host cells and recombinant methods for producing them.
  • the invention also relates to methods for the treatment of diseases such as breast cancer and diagnostic methods for detecting pathologies.
  • Patent: 84P2A9 A prostate and testis specific protein highly expressed in prostate cancer [WO 0155391, 2001-08-22, Urogenesys Inc.] describes a new gene designated 84P2A9 and the protein that encodes it. This gene is overexpressed in multiple cancers including pancreatic cancer. For the Both 84P2A9 provides a therapeutic target and cancer diagnosis.
  • the patent Reagents and methods useful for detecting diseases of the pancreas [W09931274, 1999-06-24, Abbott Lab.] Describes a set of contiguous and partially overlapping cDNA sequences and encoded polypeptides designated as PA153 and transcribed from tissue pancreatic. These sequences are useful for detection, diagnosis, prognostic and treatment, or to determine the predisposition to diseases of the pancreas such as pancreatic cancer.
  • This invention provides antibodies that specifically bind to the PA-153 polypeptide and agonists or inhibitors that prevent the action of the tissue-specific PA153 polypeptide and that are useful for the therapeutic treatment of pancreatic diseases such as tumors or metastases.
  • MTS gene refers to somatic mutations in the MTS gene, suppressor of multiple tumors (multiple tumor suppressor) in human cancer and its use in the diagnosis and prognosis of cancer. It also refers to germline mutations in the MTS gene and its use in the diagnosis of pancreatic cancer predisposition among other tumors. It also presents cancer therapy in which there is a mutation in the MTS gene as gene therapy, as well as screening of compounds for cancer therapy.
  • Peptide antagonists of the human urokinase receptor and method for selecting them [WO0001802, 2000-01-13, Holm Arne et al.] has developed a set of new binding inhibitors between the human urokinase plasminogen activator (uPA ) and its surface cell receptor (uPAR) . These inhibitors are peptides for use in therapy, particularly in the treatment of cancer. A method for selecting peptides that antagonize the binding has also been developed in the invention. Between uPA and u PAR.
  • Carboxylic acids derivatives their preparation and use in treating cancer [US 6,030,975, 2000-02-29, BASF Aktiengesellschaft] provides a method for the treatment of cancers in which endothelin, a vasoconstrictor peptide, is over-regulated in tumors of the prostate, lung, liver, breast, brain, stomach, colon, endometrium, testis, thyroid, pituitary, bladder, kidneys, pancreas and meninges. This method refers to the preparation and use in the treatment of cancer of carboxylic acid derivatives.
  • Plasmin-depletion therapy [WO9806264, 1998-02-19, Chung Myung Hee and Hoffmann Michael K] provides a method to increase the therapeutic effect of an anti-cancer agent by reducing the plasmin of the cell surface cancerous
  • the patent Enzyme producing plasma protein fragment having effect of inhibiting cancer metastasis and plasma protein fragment fragmented by the enzyme [EP1118660, 2001-07-25,
  • Juridical Foundation presents an aspartic enzyme that has a high homology with a precursor of cathepsin D and that can degrade plasma proteins, usually plasminogen, to produce fragments of plasma proteins that have inhibitory activity of metastasis and growth of cancer.
  • BSSP5 serine protease is provided for the treatment and diagnosis of cancer.
  • tissue plasminogen activator t-PA
  • serine protease a serine protease whose plasmin activating activity is important both in fibrinolysis and in the ability of some tumors to invade surrounding tissue.
  • t-PA (1) is necessary for optimal proliferation of tumor epithelial cells in vitro and in vivo, (2) is also necessary for the development of tumors in vivo, and (3) as well as to induce the neoangiogenesis associated with such tumors.
  • the expression of t-PA in cells derived from pancreatic adenocarcinomas can be effectively inhibited by genetic manipulation. This inhibition produces an inhibition of tumor growth in vitro and in vivo, inhibition of invasiveness and inhibition of tumor-associated angiogenesis in vivo.
  • the method for the inhibition of the expression of the t-PA protein and therefore for the inhibition of its biological activity is the object of the present invention and has been claimed.
  • An object of the present invention is a method of t-PA protein inhibition by the administration of t-PA inhibitor chemicals (reagents) identified according to a procedure consisting of the following parts: a) adding the candidate chemical to t-PA inhibitor to cells producing t-PA, b) determination of the enzymatic or biological activity of t-PA through its proliferative effect, in vitro invasion in constituted basal membranes, tumor formation, in vivo angiogenesis and tumor growth, c) identification of an activity inhibitor of the t-PA protein in case of a decrease in t-PA levels or any of the other parameters.
  • t-PA inhibitor chemicals reagents
  • Another object of the present invention is the identification of the dihydrochloric salt of 2,7-bis- (4-amidinobenzylidene) -cycloheptanone- (1) (Pefabloc / t-PA) as a direct inhibitor of t-protein activity PA (tumor proliferation, tissue invasion and angiogenesis).
  • Another specific object of the present invention is the use of these chemical substances (reagents) that inhibit this activity of the t-PA protein, among others the Pefabloc / t-PA salt, in the development of medicaments for the treatment of tumor diseases that They are in increments of that of t-PA activity.
  • Another specific object of the present invention is a method of identifying the t-PA inhibitory chemicals in which the t-PA producing cells that serve as the basis of the identification assay can be cells that naturally express t-PA (CAPAN-1 or SK-PC-1), cells genetically transformed to express stably and constitutively t-PA or optionally (PANC-1 / Tet-Off clone P21, P37 and P39).
  • Another specific object of the present invention is a method of identification of t-PA inhibitory chemicals in which the determination of enzymatic activity
  • the biological t-PA is performed by assessing, among others, the following cellular parameters: proliferative capacity, in vitro invasion capacity in constituted basal membranes, tumor formation and angiogenic capacity in vivo.
  • An object of the present invention is a method of inhibiting the t-PA protein by inhibiting its gene expression by antisense therapy [Dove A. Antisense and sensibility. Nature Biotechnology, 2002, vol 20, No. 2: 121-124].
  • This antisense therapy is performed by expression in t-PA producing cells of complementary sequences and inverse to the t-PA protein RNA.
  • a specific object of the present invention consists of oligodeoxynucleotides complementary to a region located around the translational site of t-PA mRNA, among others, SEQ ID N01.
  • oligodeoxynucleotides similar to those mentioned above such as: chemically modified oligodeoxynucleotides or with modifications (substitutions, deletions, etc.)
  • modifications substitutions, deletions, etc.
  • Oligodeoxyribonucleotide synthesis-phosphorothioate approach in Protocols for oligonucleotides and analogs (Agrawal S., ed.), Humana, Totowa, NJ, pp.
  • Another object of the present invention is a sequence complementary and inverse to the ribonucleotide sequence of the 5 'region of the t-PA mRNA, among others, SEQ ID N02.
  • Another specific object of the present invention are the genetic constructs, among which contain SEQ ID NO 3, which allow expression in mammalian cells of the above complementary and "anti-sense" sequences with respect to a specific region of t mRNA -PA and that suppress the endogenous expression of t-PA.
  • reagents by suppressing the expression of t-PA in said cells, also inhibit (1) their invasive capacity through membranes and proteins of the extracellular matrix, (2) their ability to proliferate in culture cell, under conditions limiting fetal bovine serum, (3) its ability to proliferate in xenotransplants in nude mice, (4) its ability to induce neoangiogenesis (generation of new blood vessels) in xenotransplants in nude mice, and (5) its capacity of inducing invasion and differentiation of human HUVEC endothelial cells in in vitro co-culture assays (Examples).
  • t-PA recombinant t-PA and the expression of t-PA RNA in cells that do not express it endogenously induce its proliferation, invasion and tumorigenic capacity. Therefore, these reagents (chemicals and t-PA inhibitory genetic constructs) may be efficient therapeutic tools for certain types of tumors, mainly, but not only, adenocarcinomas of the exocrine pancreas.
  • Another object of the present invention is the administration of t-PA anti-protein neutralizing antibodies that can be employed in a method to inhibit the protein.
  • t-PA antibodies can be used for the diagnosis of different types of cancer in immunohistochemical tests on any type of human tissues or cells or ELISA, RIA or equivalent tests, on organic fluids including serum, pancreatic juice and urine. Also the use of DNA or RNA probes for the specific detection of t-PA RNA can be used as a diagnostic method for different types of human tumors.
  • CECT CECT Type
  • CECT Chinese Type Culture Collection
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • pancreatic tumor epithelial cells of independent origins The mitogenic effect of t-PA on pancreatic cells has been demonstrated in this invention both in vivo and in vitro by different experimental approaches, complementary to each other, performed on pancreatic tumor epithelial cells of independent origins.
  • antisense oligonucleotides SEQ ID NO 1
  • SEQ ID NO 2 the complementary reverse sequence of t-PA RNA
  • plasmids for the expression of antisense RNA specific for t-PA pcDNA3.1-TPA-AS SEQ ID No 3 have been claimed in the present invention as a method for inhibit gene expression of t-PA in vitro and in vivo and thereby inhibit the proliferation of normal and tumor cells, invasion through basal membranes of normal and tumor cells, tumor formation, and tumor-induced angiogenesis, in the treatment of various types of cancer.
  • t-PA has to be enzymatically active, since the proliferation of cells expressing endogenous t-PA is drastically reduced in the presence of the Pefabloc / t inhibitor.
  • -PA used at concentrations at which t-PA is specifically inactivated but not u-PA or plasmin [Sezebecker J, Markwardt F: Inhibition of tissue-plasminogen activator by benzamidine derivatives. Fibrinolysis 1988; 2:49].
  • PANC-1 is responsible for a higher proliferative rate of these cells, in both cases proliferation is inhibited by incubation with Pefabloc / t-PA.
  • the process for inhibiting the enzymatic activity of t-PA by using Pefabloc / t-PA to prepare a medicament as an antitumor therapy has been claimed in the present invention.
  • tumors formed by PANC-1 P21 clones (derived from the PANC-l / Tet-Off cell line to which it has been transfected with plasmid pTRE-TPA containing the complete cDNA corresponding to the gene for t -PA human), in the absence of tetracycline (expressing state of t-PA) they grow faster (have a shorter latency time), and reach a larger size at a given time, than tumors formed by the same clones in mice treated with tetracycline (non-expressing state of t-PA).
  • the endogenous production of t-PA is necessary for optimal proliferative capacity of cells pancreatic cancer, both in vitro and in vivo.
  • t-PA be catalytically active, as demonstrated by proliferation inhibition experiments by adding to Pefabloc / t-PA cultures.
  • the second novel and relevant observation described in this study consists in demonstrating the need for the expression of t-PA for pancreatic tumor xenotransplants to induce a correct neoangiogenic network. In the process of tumor establishment, the growth of a tumor ultimately depends on the availability of an adequate vascular network.
  • t-PA has a large role in the acquisition of the tumor phenotype acting in early stages of tumor establishment, such as the growth and development of a vascular system. Therefore, it is possible that future therapeutic approaches that contemplate as a measure the inhibition of the expression and / or activity of t-PA associated with tumors, are useful approaches for the treatment of pancreatic cancer.
  • the aforementioned sequences and oligonucleotides directed to the inhibition of t-PA expression in tumor cells in vitro and in vivo, as well as plasmids for the expression of antisense RNA specific for tP A that suppresses the endogenous expression of t-PA, with utility for the development of vectors for tumor gene therapy.
  • Four cell lines (AS-2, AS-3, AS-7 and AS-29) derived from the RWP-1 human pancreas cancer line, in which it has been suppressed by transcripts, have also been developed in the present invention.
  • antisense endogenous expression of t-PA a plasmid called pcDNA3.1-TPA for endogenous expression of t-PA RNA and protein; pcDNA-tPA-AS for the endogenous expression of RNA complementary to the endogenous t-PA RNA; the BxPC-3 / TPA cell line derived from the BxPC-3 human pancreas cancer cell line that expresses high levels of t-PA; a plasmid called pTRE-TPA for the optional, tetracycline operon-dependent expression of t-PA in mammalian cells; the PANC-1 / Tet- cell line Off-TPA (clones P21, P37 and P39) in which the endogenous expression of t-PA is regulated based on the presence of tetracycline in the culture medium.
  • t-PA anti-protein neutralizing antibodies can be employed in a procedure to inhibit the protein. This procedure has been claimed in the present invention.
  • t-PA antibodies can be used in immunohistochemical assays on any type of human tissues or cells or ELISA, RIA or equivalent assays, on organic fluids including serum, pancreatic juice and urine. They can also be used as a diagnostic method for different types of human tumors, DNA or RNA probes for the specific detection of t-PA RNA.
  • FIG. 1 Endogenous t-PA is necessary for the proliferation of pancreatic cancer cells in serum poor medium.
  • Panel C In vivo growth of pancreatic tumor lines. SK-PC-1, CAPAN-1, RWP-1, BxPC-3 and PANC-1 cells were inoculated into the subcutis of nude mice. Tumor growth was determined weekly and tumor volume was calculated as described in Materials and Methods. The results obtained at 6 weeks (blank columns) and at 14 weeks (gray columns) after inoculation are shown.
  • Figure 2 Stable inhibition of t-PA expression in P-1 R cells by t-PA antisense transcripts. Effects on invasion and cell proliferation in vitro.
  • Panel A Northern blotting with total RNA (15 ⁇ g) extracted from RWP-1 control transfectants C-13, C-1, and antisense, AS-2, AS-3, AS-7, AS-9. The filters were sequentially hybridized with a probe for t-PA and another u-PA. The equivalence of membrane loading was checked by hybridization with a GAPDH probe.
  • Panel B Expression analysis by means of Western blotting sequential t-PA, PAI-1, and Annexin-II (ANN-II).
  • T-PA stimulates the growth of RWP-1 clones in semi-solid agar.
  • the cells (4000 / well) were seeded in 6-well plates in a 0.3% agar solution as described in Material and Methods. After 3 weeks the number of colonies was quantified.
  • Panel A Results corresponding to wells representative of the control transfectant clones (C-1, C-13, in the left panel) and of the antisense clones (AS-2, AS-3, in the right panel) ). The increase is 100 x.
  • Panel B Quantitative evaluation of colonies stained with MTT. Where indicated, the specific t-PA inhibitor Pefabloc / t-PA was added to C-13 cells
  • Figure 4 Inhibition of endogenous expression of t-PA in R-P-1 cells inhibits tumor growth and angiogenesis
  • Panel A Growth of inoculated RWP-1 cells in nude mice. Control clones (filled symbols: squares. Cl; triangles, C-13; diamonds, RWP-1 parental cells) and antisense clones (empty symbols: circles, AS-2; squares, AS-3; diamonds, AS-7 ; triangles, AS-29) were injected subcutaneously into nude mice (3 mice per clone). Each point is the average of the measurement of 6 tumors (tumor volume).
  • Panel B Panel B.
  • Ki67 proliferation antigen expression determined by immunohistochemistry in nuclei of tumors derived from parental cells and control C-13 (full columns) and clones AS-3 and AS-29 (empty columns). The results are expressed as the percentage of positive nuclei per total number of nuclei counted.
  • mitotic index of tumors determined by counting mitotic figures with the objective of maximum increase (400 x) of tumors derived from parental cells and C-13 control (full columns) and AS-3 clones and AS-29 (empty columns). A minimum of 20 fields per tumor was quantified.
  • Panel C Quantification of neoangiogenesis, performed as described in Materials and Methods.
  • Sections were analyzed (5 ⁇ m) of samples included in paraffin from tumors obtained in athymic mice derived from control clones C-13 (panel D and F) and clone AS-3 (panel E and G) by staining with hematoxylin-eosin.
  • HK Panels Tumor neoangiogenesis was estimated by immunohistochemical analysis with anti PECAM-1 / CD31 antibodies in cryostatic sections of tumors derived from control clones C-13 (H), parental cells RWP-1 (J), clone AS-3 (I), and clone AS-2 (K). The preparations were contracted with hematoxylin. The increases in D, E, H, I are 10; in F and G, 400 x, and in J and K, 200x.
  • t-PA stimulates proliferation in BxPC-3 and PANC-1 cells that do not express t.PA independently of plasmin generation.
  • Panel A Analysis of the expression of t-PA Western blotting in parental cells BxPC-3 (WT), the CIO and C12 control clones transfected with the empty vector, and cells transfected with t-PA (t-PAlO and t-PA12).
  • Panel B Analysis of cell proliferation, monitored over six days in 1% FBS by MTT. The results of the 6-day growth curve of the control clones and those expressing t-PA (blank columns) of them in the presence of Pefabloc / t-PA (10 ⁇ M) (black columns) are shown.
  • concentrations of plasminogen and plasmin inhibitors used have proven effective in inhibiting the invasion of pancreatic tumor cells (21,34). Each point represents the average of three determinations and the error bars represent the SEM
  • Panel A Western blotting analysis of PANC-1 / Tet-Off clones. Clones P21, P37 and P39 were grown in the presence or absence of tetracycline (2 ⁇ g / ml) in complete medium for 3 days. The analysis was carried out with an anti t-PA antibody, as described above. After dehibiting, the membrane was normalized with an anti-tubulin antibody. Panel B. Cell proliferation was monitored by MTT for six days at 10% FBS or 1% FBS in the presence or absence of tetracycline.
  • Example 1 Endogenous production of t-PA is necessary for the proliferation of pancreatic cancer cells in serum-poor medium.
  • pancreatic tumor cells In order to study whether what is required for the proliferation of pancreatic tumor cells depends, not only on protein levels, but on the enzymatic activity of t-PA, we treat different types of pancreatic cells with Pefabloc / t-PA , a synthetic benzamidine derivative that, at the concentrations used, with a maximum of 30 microM, inhibits the enzymatic activity of t-PA but not of u-PA or plasmin.
  • the SK-PC-1, and CAPAN-1 cell lines which express very high levels of t-PA (20 and 18 ng t-PA / 24 h / microg total protein, respectively), and RWP-1, which express levels Moderately high t-PA (5 ng / 24 h / microg), were grown in medium with 1% FBS, treated with Pefabloc / t-PA and analyzed for their growth rate.
  • growth inhibition was observed when dealing with Pefabloc / t-PA, this inhibition being dose-dependent and maximal (90%) at an inhibitor concentration of 30 microM (Figure IB).
  • the growth-inhibitory effect induced by Pefabloc / t-PA was not observed when the cells were grown in medium supplemented with 10% FBS. Therefore, the presence of proteolytically active t-PA is necessary for optimal In vitro proliferation of pancreatic cancer cells.
  • pancreatic carcinoma cells of different origin and expressing different levels of t-PA SK-PC-1, CAPAN-1, RWP- cells were injected into the subcutaneous mice 1, BxPC-3 and PANC-1. The last two cell lines do not express t-PA.
  • both SK-PC-1 and CAPAN-1 cells which express high levels of t-PA, formed visible tumors.
  • RWP-1 cells with moderate expression of t-PA, formed detectable tumors within 14 weeks of injection.
  • Example 2 Inhibition of cell proliferation of pancreatic cells by stable suppression of t-PA expression with antisense transcripts.
  • pcDNA3.1-TPA-AS plasmids which contain the sequence SEQ ID NO 3, claimed in the present invention, for the expression of antisense RNA, we have generated clones of the RWP-1 line in which it has been extinguished t-PA expression These clones, independently isolated, and called AS-2, AS-3, AS-7 and AS-29, have been claimed in the present invention.
  • tumors derived from AS clones contained numerous isolated endothelial cells, and only occasionally some apparently formed vessel, of length and width significantly less than those of control tumors ( Figure 4F and H).
  • MS microcapillaries
  • ECS endothelial cells
  • Figure 4K the total number of structures stained by the endothelial marker
  • Example 5 The induction by t-PA of the proliferation of BxPC-3 and PA C-1 cells is independent of plasmin activation.
  • t-PAlO and t-PA12 clones derived from BxPC-3 cells and expressing high levels of t-PA, show a significantly higher proliferation rate than the control clones (transfected with vector only) or parental cells, when they were grown in medium with low serum
  • pancreatic cell line PANC-1
  • PANC-1 pancreatic cell line
  • t-PA also responds to the addition of recombinant t-PA with increased proliferation
  • Figure 5C and D This mitogenic activity associated with the enzymatic activity of t-PA, since the addition of Pefabloc / t-PA, but not of plasmin inhibitors such as aprotinin or epsilon-aminocaproic acid, inhibits proliferation stimulated by t-PA.
  • the addition of plasmin does not induce proliferation in these assays (Figure 5D).
  • t-PA plays an essential role in the proliferative capacity of pancreatic cancer cells of different origin, which depends on their enzymatic activity but not on the presence of plasmin.
  • Example 6 The inducible overexpression of t-PA in PANC-1 cells stimulates its invasive capacity and proliferation in vitro and in vivo.
  • the experiments described above demonstrate the effects on the proliferation of endogenous expression of t-PA in pancreatic cells that do not normally express it. A problem inherent in such experiments is that they could be the result of drift or clonal variation, a consequence of the selection process followed. In order to definitively resolve this possibility, we have generated clones of
  • PANC-1 in which the expression of t-PA is optional, being under the control of the tetracycline operon (Tet-Off system), so that, in the absence of tetracycline, t-PA is expressed from the stably transfected construction in PANC-1 cells, while the addition of tetracycline to the medium represses said expression.
  • Tet-Off system tetracycline operon
  • plasminogen The addition of the main physiological substrate of t-PA, the plasminogen, produced a significant increase in the invasive capacity of the cells in the producing state of t-PA, but did not produce significant variations in the invasive capacity of the cells in the non-producing state of t-PA. That is, plasmin, which does not influence the induction of proliferation by t-PA, is important in the effect on invasion through basal membranes.
  • DMEM Dulbecco-modified Eagle medium
  • GEBCO-BRL heat-inactivated fetal bovine serum
  • Pefabloc / t-PA [dihydrochloric salt of 2,7-bis- (4-amidinobenzylidene) -cycloheptanone- (1)] was purchased from Pentapharm (Basel, Switzerland); Matrigel, by Becton Dickinson (Bedford, MA, USA); recombinant t-PA (Actilyse), by Boehringer Mannheim (Barcelona, Spain); Noble agar, from Difco (Detroit, MI, USA); neutralizing antibodies to t-PA and u-PA, from American Diagnostica (Greenwich, CT, USA); monoclonal anti-annexin II antibodies, from Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA); human anti-Ki67 rabbit antibody, from DAKO (Glostrup, Denmark); anti-PECAM-1 / CD31 rat monoclonal antibody, from Pharmingen (San Diego, CA, USA); DAKO peroxidase-conjugated anti-goat antibodies; goat anti-
  • Plasmid DNA was transfected into RWP-1 cells, which express approximately 5.1 ng of t-PA / 24 h / ⁇ g total protein, using cationic liposomes (Lipofectamine, GIBCO-BRL) and stable transfectants were selected in 10% FBS medium containing G418 (600 ⁇ g / ml) (GIBCO-BRL). A total of 38 clones were selected, discarding those with slow growth, and the remaining 33 clones were analyzed by ELISA and Western blotting to determine the levels of t-PA protein secreted to the culture medium.
  • oligonucleotides modified with phosphorothioate bonds at the four outer bases of each end (TIBMOLBIOMOL, Berlin, Germany), were transfected in combination with DOTAP (Boehringer-Mannhein, Mannheim, Germany) following previously described protocols [Rodr ⁇ guez M, Noé V, Alemany C, Miralles A, Bemi V, Caragol I, City C. Effects of antisense oligonucleotides directed toward dihydrofolate reductase RNA in mammalian cultured cells. Int. J. Cancer 1999, 81: 785-792].
  • the optimal ratio of concentrations of the transfection mixture was 2 ⁇ M oligonucleotides and 8 ⁇ M DOTAP in DMEM medium 1% FBS. Inhibition of t-PA expression of cells exposed to the transfection mixture for 72 h was confirmed by Western Blotting.
  • t-PA Overexpression of t-PA in cell lines that do not express t-PA.
  • the pcDNA3.1-TPA construct was generated, by inserting the complete human t-PA cDNA into the HindIII restriction target of the pcDNA3.1 vector (Invitrogen). This construct was transfected into BxPC-3 cells by combining with Lipofectamine (GIBCO-BRL), independent clones resistant to G418 (400 microg / ml) being selected. Transgene expression for t-PA in the clones was determined by Western blotting and ELISA.
  • PANC-1 / Tet-Off cells were first generated by a first transfection of the pTet-Off plasmid (Clontech, Palo Alto, CA) and selection of the transfectants in medium with G418 (400 ⁇ g / ml), and a subsequent selection of clones that showed the best tetracycline regulation of transiently transfected pTRE-Luc expression.
  • pTRE-tPA constructs were generated, inserting the complete t-PA cDNA into the BamHI restriction target of the pTRE vector (Clontech).
  • RNA analysis Total messenger RNA was obtained using the guanidinium-phenol-chloroform thiocyanate extraction protocol [Chomczynski P, Sacchi N: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162: 156-159].
  • Northern blot analysis of total RNA (15 ⁇ g) was carried out following well established protocols [Paciucci R, Berrozpe G, Tora M, Navarro E, Garc ⁇ a de Herreros A, Real FX: Isolation of tissue-type plasminogen activator, cathepsin H, and non-specific cross-reacting antigen from SK-PC-1 pancreas cancer cells using subtractive hybridization.
  • RNA was evaluated by staining with ethidium bromide and the filters were normalized by hybridization with a probe for glyceraldehyde phosphate dehydrogenase. Reverse transcription was carried out with 2 ⁇ g of total RNA using oligo-dT and M-MLVRT
  • Quantitative determinations were obtained using overnight labeled cells with [ 3 H] -thymidine (2 ⁇ Ci / 10 5 cells / ml), following the protocol described previously [Paciucci R, Tora M, Diaz VM, Real FX: The plasminogen activator system in pancreas cancer: role of t-PA in the invasive potential in vitro. Oncogene 1998; 16: 625-633].
  • the results were expressed as the percentage of cells marked on the lower surface of the filter, with respect to the total represented by the cells present in the upper and lower compartments. Growth tests on semi-solid agar. Anchor independent growth was evaluated following described procedures [Rizzino A: Soft agar growth assays for transforming growth factors and mitogenic peptides.
  • RWP-1 clones were grown in medium without G418 for 6 days, trypsinized when they reached 70% confluence, washed, and resuspended in sterile PBS. These cells, as well as SK-PC-1, CAPAN-1, BxPC-3 and PANC-1 (2 x 10 6 ) cells were inoculated subcutaneously in female Balb / c athymic mice (Criffa, Barcelona, Spain). Two injections were made per mouse, one in each thigh, and three mice were used per clone.
  • the mice were sacrificed, and the injection site was studied, as well as in the liver, lungs and lymph nodes.
  • the tissues were rapidly frozen in liquid nitrogen using OCT or fixed in formalin, embedded in paraffin, and fixed with hematoxylin-eosin.
  • the PANC-1 Tet-Off 21 clone (4 x 10 6 cells) was maintained in athymic mice, maintained in the presence (+ Tet) or in the absence of tetracycline (-Tet) and resuspended in 200 ⁇ l of Depleted Matrigel growth factors (Becton Dickinson).
  • the mice received tetracycline in the drinking water (2 mg / ml) changing every two days). Tumor mass was monitored every week and tumor volume was calculated as described above.
  • the Ki67 antigen was detected by indirect immunoperoxidase in 5 ⁇ m sections of samples fixed and included in paraffin, heat treated in citrate buffer to unmask the antigens. Endogenous peroxidase activity was blocked by incubating the sections in 3% H 2 0 2 , the sections were incubated with the primary antibody, washed, and then incubated with peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Ig (EnVision, DAKO) . Next, the sections were washed and the reaction was developed with diaminobenzidine, followed by counting with hematoxylin.
  • the Quantitative determinations of the positive nuclei for Ki67 were carried out by two independent researchers by counting the number of positive nuclei per total number of cells per field at large magnification (400 x magnification). A minimum of 700 total cores were counted for each sample.
  • the PECAM / CD31 antigen was detected in 10 ⁇ m cryostatic sections and the stained cells and capillaries were counted according to previously described methods [Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J: Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991; 324: 1-8].
  • the areas of greatest vascularization were chosen at low magnification (100 x), and the capillary counting was performed at 200 x in three selected fields. Three consecutive sections were used for quantitative determinations. The number of capillaries (microvessel score, MS) was calculated as the average of three counts performed in the three sections. Capillaries adjacent to normal tissue were excluded from the analysis. For the quantification of the capillaries, the vessels with a clearly defined lumen or vessels with a well defined linear shape, but not the individual endothelial cells were taken into account. Separately, we determined the number of cells (cell score, ECS) by counting individual endothelial cells in the same field in which the capillary count was performed. In all assays, control antibodies of the same isotype were used as the negative staining control.
  • ECS cell score

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Abstract

El activador tisular del plasminógeno (t-PA) es una serina proteasa sobreexpresada en varios tipos de tumores, incluyendo cáncer de páncreas, melanomas y neuroblastomas. En la presente invención han sido desarrollados inhibidores de la expresión y actividad del t-PA como agentes antitumorales.

Description

Inhibidores del activador tisular del plasminógeno (t-PA] con capacidad terapéutica.
Sector de la Técnica
La invención se encuadra dentro del Área de Medicina, en el sector farmacológico. El objeto de la presente invención es un procedimiento para inhibir la expresión y actividad de la proteína t-PA implicada en tumores.
Estado de la Técnica
El activador tisular del plasminógeno (t-PA) y la urokinasa (u-PA) son serina proteasas que activan proteolíticamente el zimógeno plasminógeno para dar lugar a la plasmina [Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J, Bronson R, De Vos R, van den Oord JJ, Collen D, Mulligan RC : Physiological conseguences of loss of plasminogen activator gene function in mice. Nature 1994; 36:419-424] . La plasmina juega un importante papel en la capacidad invasiva de muchos tipos de células neoplásicas, estando implicada en la degradación de la matriz extracelular
[Liotta LA, Rao CN, and Barsky SH: Tumor invasión and the extracellular matrix. Lab Invest, 1983; 49: 636-649], en la activación de diversas pro-metaloproteasas] [DeClerck YA, Imren S, Montgomery AM, Mueller BM, Reisfeld RA, Laug WE :
Proteases and protease inhibitors in tumor progression. Adv Exp Med Biol 1997; 425:89-97; Carmeliet P, Moons L, Lijnen R, Baes M, Lemaitre V, Tipping P, Drew A, Eeckhout Y, Shapiro S, Lupu F, Collen D: Urokinase-generated plasmin activates matrix metalloproteinases during aneurysm formation. Nature Genet 1997; 17:439-444], en el proceso metastásico [Daño K, Andreasen PA, Grondahl-Hansen J, Kristensen P, Nielsen LS, Skriver L: Plasminogen activators, tissue degradation, and cáncer. Adv Cáncer Res 1985; 44:139-266; Ossowski L: Plasminogen activator dependent pathways in the dissemination of human tumor cells in the chick embryo . Cell 1988; 52:321-328], y en la activación de factores de crecimiento latentes tales como el factor de crecimiento de hepatocitos (hepatocyte growth factor, HGF) o el factor β de crecimiento tumoral (tumor growth factor β, TGFβ) [Naldini L, Tamagnone L, Vigna E, Sachs M, Hartmann G, Birchmeier W, Daikuhara Y, Tsubouchi H, Blasi F, Comoglio P: Extracellular proteolytic cleavage by urokinase is required for activation of hepatocyte growth factor/scatter factor. Embo J 1992; 11:4825- 4833,-Mars WM, Zarnegar R, Michalopoulos GK: Activation of hepatocyte growth factor by the plasminogen activators uPA and tPA. Am J Pathol 1993; 143:949-958; Sato Y, Tsuboi R, Lyons R. Moses H, Rifkin DB : Characterization of the activation of latent TGF-beta by co-cultures of endothelial cells and pericytes or smooth muscle cells: a self- regulating syste . J Cell Biol 1990; 111:757-763] o en la liberación a partir de la matriz extracelular del factor de crecimiento vascular (VEGF) , el factor de crecimiento fibroblástico (FGF) , el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento II semejante a la insulina (IGFII) [Houck KA, Leung DW, Rowland AM, Winer J, Ferrara N: Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem 1992; 267:26031-26037; Flaumenhaft R, Moscatelli D, Saksela O, Rifkin DB : Role of extracellular matrix in the action of basic fibroblast growth factor: matrix as a source of growth factor for long-term stimulation of plasminogen activator production and DNA synthesis. J Cell Physiol 1989; 140:75-81; Menouny M, Binoux M, Babajko S: Role of insulin-like growth factor binding protein-2 and its limited proteolysis in neuroblastoma cell proliferation: modulation by transforming growth factor-beta and retinoic acid. Endocrinology 1997; 138:683-690].
Se conoce bien el papel en el crecimiento e invasión tumorales de u-PA y de su receptor específico de membrana, u-PAR [Ossowski L: Plasminogen activator dependent pathways in the dissemination of human tumor cells in the chick embryo. Cell 1988; 52:321-328; Andreasen PA, Kjoller L, Christensen L, Duffy MJ: The urokinase-type plasminogen activator system in cáncer metástasis: a review. Int J Cáncer 1997; 72 : 1-22 ; Shapiro RL, Duquette JG, Roses DF, Nunes I, Harris MN, Kamino H, Wilson EL, Rifkin DB : Induction of primary cutaneous melanocytic neoplasms in urokinase-type plasminogen activator (uPA) -deficient and wild-type mice : cellular blue nevi invade but do not progress to malignant melanoma in uPA-deficient animáis. Cáncer Res 1996;56:3597-3604; Sabapathy KT, Pepper MS, Kiefer F, Mohle-Steinlein U, Tacchini-Cottier F, Fetka I, Breier G, Risau W, Carmeliet P, Montesano R, Wagner EF : Polyoma middle T-induced vascular tumor formation: the role of the plasminogen activator/plasmin system. J Cell Biol
1997; 137:953-963]. Por el contrario, se conoce poco sobre el posible papel de t-PA en los procesos de progresión tumoral .
Muchos tumores expresan niveles elevados del activador tisular del plasminógeno (t-PA) . Los niveles de expresión de t-PA se encuentran aumentados en pacientes con poliposis adenomatosa familiar del colon, pero disminuyen en los adenocarcinomas de colon [Sier CF, Vloedgraven HJ, Griffioen G, Ganesh S, Nagengast FM, Lamers CB, Verspaget HW: Plasminogen activators and inhibitor type 1 in neoplastic colonic tissue from patients with familial adenomatous polyposis. Br J Cáncer 1995; 71:393-396]. En carcinomas de mama, las pacientes con niveles elevados de u-PA y bajos de t-PA presentan una mayor incidencia de recidiva que las pacientes con niveles bajos de u-PA y altos de t-PA [Kim SJ, Shiba E, Kobayashi T, Yayoi E, Furukawa J, Takatsuka Y, Shin E, Koyama H, Inaji H, Takai S: Prognostic impact of urokinase-type plasminogen activator (PA) , PA inhíbitor type-1, and tissue-type PA antigen levéis in node-negative breast cáncer: a prospective study on multicenter basis. Clin Cáncer Res 1998; 4:177-182]. En contraste con estos datos, se ha observado que en melanomas, neuroblastomas, leucemia mieloblástica aguda y en cáncer de páncreas, la presencia de niveles elevados de t-PA se asocia a una mayor capacidad invasiva o metastásica de los tumores [Wilson EL, Jacobs P, Dowdle EB: The secretion of plasminogen activators by human myeloid leukemic cells in vitro. Blood 1983; 61:568-574; Sugiura Y, Ma L, Sun B, Shimada H, Laug WE, Seeger RC, DeClerck YA: The plasminogen-plasminogen activator (PA) system in neuroblastoma: role of PA inhibitor-1 in metástasis. Cáncer Res 1999; 59:1327-1336; Paciucci R, Berrozpe G, Tora M, Navarro E, García de Herreros A, Real FX: Isolation of tissue-type plasminogen activator, cathepsin H, and non-specific cross-reacting antigen from SK-PC-1 páncreas cáncer cells using subtractive hybridization. FEBS Lett 1996; 385:72-76; Paciucci R, Tora M, Diaz VM, Real FX: The plasminogen activator system in páncreas cáncer: role of t-PA in the invasive potential in vitro. Oncogene 1998; 16:625-633; Tiberio A, Fariña AR, Tacconelli A, Cappabianca L, Gulino A, Mackay AR: Retinoic acid-enhanced invasión through reconstituted basement membrane by human SK-N-SH neuroblastoma cells involves membrane-associated tissue-type plasminogen activator. Int J Cáncer 1997; 73:740-748], lo que sugiere que t-PA contribuye a la progresión tumoral . En adenocarcinomas de páncreas, la sobreexpresión de t-PA se limita a las células carcinomatosas, sin que esta expresión se observe en células epiteliales de áreas de pancreatitis o en células de cultivos primarios de páncreas exocrino normal [Paciucci R, Tora M, Diaz VM, Real FX: The plasminogen activator system in páncreas cáncer: role of t-PA in the invasive potential in vitro. Oncogene 1998; 16:625-633] . Esta última observación, es decir, que en el páncreas la expresión de t-PA se asocia estrictamente al fenotipo tumoral, sugiere que las células tumorales del páncreas exocrino activan "de novo" la expresión de t-PA y que esta expresión podría tener importantes consecuencias para la progresión hacia la malignidad de estas neoplasias . La presente patente se refiere a las primeras evidencias conocidas sobre el papel directo de t-PA en la etiopatogenia de distintos tumores.
Las siguientes patentes están relacionadas con el cáncer de páncreas:
La patente: Páncreas -derived plasminogen activator inhibitor [US 6303338, 2001-10-16, Human Genome Sciences Inc] . Se refiere a un miembro de los inhibidores de serina proteasas en particular la familia de proteínas inhibidoras del activador de plasminógeno y más concretamente la proteína inhibidora del activador de plasminógeno derivado de páncreas. La patente señala que los inhibidores del activador de plasminógeno juegan un amplio papel en procesos patológicos entre ellos cáncer. En la invención se proporciona el ácido nucleico, polipéptidos, vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para producirlos. También se refiere la invención a métodos para el tratamiento de enfermedades como el cáncer de mama y métodos de diagnóstico para detectar patologías . La patente: 84P2A9 : A prostate and testis specific protein highly expressed in prostate cáncer [WO 0155391, 2001-08- 02, Urogenesys Inc.] describe un nuevo gen designado 84P2A9 y la proteína que lo codifica. Este gen se sobreexpresa en múltiples cánceres incluyendo cáncer de páncreas. Por lo tanto 84P2A9 proporciona una diana terapéutica y diagnóstico de cáncer.
La patente: Reagents and methods useful for detecting diseases of the páncreas [W09931274, 1999-06-24, Abbott Lab.] describe un conjunto de secuencias de cDNA contiguas y parcialmente superpuestas y los polipéptidos codificados designados como PA153 y transcritos a partir de tejido pancreático. Estas secuencias son útiles para la detección, diagnóstico, prognóstico y tratamiento, o para determinar la predisposición a enfermedades del páncreas como el cáncer de páncreas. Esta invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido PA-153 y agonistas o inhibidores que impiden la acción del polipéptido PA153 específico de tejido y que son útiles para el tratamiento terapéutico de enfermedades pancreáticas como tumores o metástasis.
La patente: MTS gene [US 6.218.146, 2001-04-17, Myriad Genetics, Inc.] se refiere a las mutaciones somáticas en el gen MTS, supresor de múltiples tumores (múltiple tumor suppressor) en cáncer humano y su uso en la diagnosis y prognosis del cáncer. También se refiere a mutaciones de la línea germinal en el gen MTS y su uso en el diagnóstico de la predisposición a cáncer de páncreas entre otros tumores. También presenta terapia de cáncer en los que existe una mutación en el gen MTS como terapia génica, así como cribaje de compuestos para terapia del cáncer. La patente: Peptide antagonists of the human urokinase receptor and method for selecting them [WO0001802, 2000-01- 13 , Holm Arne et al.] ha desarrollado un conjunto de nuevos inhibidores de la unión entre el activador plasminógeno de la urokinasa humana (uPA) y su receptor celular de superficie (uPAR) .Estos inhibidores son péptidos para emplearlos en terapia, en particular en el tratamiento del cáncer. También ha sido desarrollado en la invención un método para seleccionar péptidos que antagonicen la unión entre uPA y u PAR .
En la patente: Use of plasminogen activator inhibitor type 2 in the treatment of cáncer [WO9210206, 1992-06-25, Delta Biotechnology Ltd] se reivindica el uso del inhibidor del activador del plasminógeno tipo 2 a bajas concentraciones en el tratamiento del cáncer.
La patente: Carboxylic acids derivatives, their preparation and use in treating cáncer [US 6.030.975, 2000-02-29, BASF Aktiengesellschaft] proporciona un método para el tratamiento de cánceres en los que la endotelina, un péptido vasoconstrictor, está sobrerregulado en tumores de próstata, pulmón, hígado, mama, cerebro, estómago, colon, endometrio, testículo, tiroide, pituitaria, vejuga, ríñones, páncreas y meninges. Este método se refiere a la preparación y uso en el tratamiento del cáncer de derivados de ácido carboxílico.
La patente : Monoclonal antibody reactive with human páncreas cáncer tissue [EP0526888, 1993-02-10, Toray Industries] proporciona anticuerpos monoclonales específicos de cáncer humano de páncreas, estos anticuerpos son útiles para el diagnóstico y tratamiento del cáncer humano de páncreas .
La patente: Plasmin-depletion therapy [WO9806264, 1998-02- 19, Chung Myung Hee y Hoffmann Michael K] proporciona un método para incrementar el efecto terapéutico de un agente anti-cáncer mediante la reducción de la plasmina de la superficie de las células cancerosas.
La patente: Enzyme producing plasma protein fragment having effect of inhibiting cáncer metástasis and plasma protein fragment fragmented by the enzyme [EP1118660, 2001-07-25,
Juridical Foundation] presenta una enzima aspártica que tiene una alta homología con un precursor de la catepsina D y que puede degradar proteínas plasmáticas, normalmente plasminógeno, para producir fragmentos de proteínas plasmáticas que tienen actividad inhibitoria de la metástasis y crecimiento de cáncer.
En la patente: Novel serine protease BSSP5 [EP1142993, 2001-10-10, Fuso Pharmaceutical Ind.] se proporciona la serina proteasa BSSP5 para el tratamiento y diagnóstico de cáncer.
Descripción de la invención Breve descripción de la invención
Muchos tumores expresan niveles elevados del activador tisular del plasminógeno (t-PA) , una serina proteasa cuya actividad activadora de la plasmina es importante tanto en la fibrinolisis como en la capacidad de algunos tumores para invadir el tejido circundante.
En la presente invención ha sido demostrado que el t-PA: (1) es necesario para la proliferación óptima de células epiteliales tumorales in vitro e in vivo, (2) es también necesario para el desarrollo de tumores in vivo, y (3) así como para inducir la neoangiogénesis asociada a tales tumores . En la presente invención se ha determinado que la expresión de t-PA en células derivadas de adenocarcinomas pancreáticos puede ser inhibida eficazmente mediante manipulación genética. Esta inhibición produce una inhibición del crecimiento tumoral in vitro e in vivo, inhibición de la invasividad e inhibición de la angiogénesis asociada al tumor in vivo. El procedimiento para la inhibición de la expresión de la proteína t-PA y por ende para la inhibición de su actividad biológica (proliferación, invasión, angiogénesis) es el objeto de la presente invención y ha sido reivindicado.
La inhibición de la proteína t-PA se ha realizado mediante un procedimiento basado en reactivos y modelos celulares que han sido reivindicados en la presente invención. Un objeto de la presente invención es un procedimiento de inhibición de la proteína t-PA mediante la administración de sustancias químicas inhibidoras de t-PA (reactivos) identificados según un procedimiento que consta de las siguientes partes : a) adición de la sustancia química candidata a inhibidora de t-PA a células productoras de t-PA, b) determinación de la actividad enzimática o biológica de t-PA mediante su efecto proliferativo, invasión in vitro en membranas básales constituidas, formación de tumores, angiogénesis in vivo y crecimiento tumoral, c) identificación de un inhibidor de la actividad de la proteína t-PA en caso de una disminución de los niveles de t-PA o de cualquiera de los otros parámetros.
Otro objeto de la presente invención es la identificación de la sal dihidroclórica de 2 , 7-bis- (4-amidinobenzilideno) - cicloheptanona- (1) (Pefabloc/t-PA) como un inhibidor directo de la actividad de la proteína t-PA (proliferación tumoral, invasión tisular y angiogénesis) .
Otro objeto específico de la presente invención es el uso de estas sustancias químicas (reactivos) inhibitorias de esta actividad de la proteína t-PA, entre otras la sal Pefabloc/t-PA, en el desarrollo de medicamentos para el tratamiento de enfermedades tumorales que cursen con incrementos de la de la actividad de la t-PA. Otro objeto específico de la presente invención es un procedimiento de identificación de las sustancias químicas inhibitorias de t-PA en el que las células productoras de t-PA que sirven de base del ensayo de identificación pueden ser células que expresan de forma natural t-PA (CAPAN- 1 o SK-PC-1) , células transformadas genéticamente para expresar de forma estable y constitutiva t-PA o de forma facultativa (PANC-1/Tet-Off clon P21, P37 y P39) . Otro objeto específico de la presente invención es un procedimiento de identificación de las sustancias químicas inhibitorias de t-PA en el que la determinación de la actividad enzimática o biológica de t-PA se realiza valorando, entre otros, los siguientes parámetros celulares: capacidad proliferativa, capacidad de invasión in vitro en membranas básales constituidas, formación de tumores y capacidad angiogénica in vivo .
Un objeto de la presente invención es un procedimiento de inhibición de la proteína t-PA mediante la inhibición de su expresión génica mediante terapia antisense [Dove A. Antisense and sensibility. Nature Biotechnology, 2002, vol 20, N° 2:121-124] .
Esta terapia antisense se realiza mediante la expresión en células productoras de t-PA de secuencias complementarias e invers_as al ARN de la proteína t-PA. UN objeto específico de la presente invención consiste en oligodesoxinucleótidos complementarios a una región situada alrededor del lugar de inicio de la traducción del ARNm del t-PA, entre otros, la SEQ ID N01.
Otro objeto específico de la presente invención son oligodesoxinucleótidos similares a los mencionados anteriormente, como por ejemplo: oligodesoxinucleótidos modificados químicamente o con modificaciones (sustituciones, delecciones, etc.) [Cohén JS . Phosphorothioate oligonucleotides, en Antisense Research and applications (Crooke ST, Lebleu B. eds) , CRC, Boca Ratón, FL, pp. 205-222, 1993; Beaucage SL. Oligodeoxyribonucleotide synthesis-phosphorothioate approach, en Protocols for oligonucleotides and analogs (Agrawal S., ed.), Humana, Totowa, NJ, pp. 33-61, 1993; Metelev V., Lisziewicz J, Agrawal S. Study of antisense oligonucleotides phosphorothioate containing segments of oligodeoxynucleotides and 2 ' -O-methyloligoribonucleotides . Bioorg Med Chem Lett 4:2929-2934, 1994; Agrawal S., Temsamani J. Comparative pharmacokinetics of antisense oligonucleotides. En Methods in molecular medicine: antisense therapeutics . (Agrawal, S., ed.) Humana, Totowa, NJ, pp247-270, 1996] y que mantengan dicha actividad inhibitoria de la expresión de t-PA. Otro objeto de la presente invención es una secuencia complementaria e inversa a la secuencia de ribonucleótidos de la región 5' del ARNm de t-PA, entre otras, la SEQ ID N02.
Otro objeto específico de la presente invención son las construcciones genéticas, entre las que contienen la SEQ ID NO 3, que permiten la expresión en células de mamíferos de las anteriores secuencias complementarias y "anti-sentido" respecto a una región específica del ARNm del t-PA y que suprimen la expresión endógena de t-PA.
El manejo y la preparación de las herramientas de terapia génica así como las construcciones genéticas, vectores y células transformadas, anteriormente referidas se pueden realizar con las técnicas y métodos ya conocidos en el estado del arte y que están profusamente descritas en la literatura de dicho campo, sirva como ejemplo: Maniatis et al., Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Estos reactivos, al suprimir la expresión de t-PA en dichas células, inhiben también (1) su capacidad invasiva a través de membranas y proteínas de la matriz extracelular, (2) su capacidad de proliferar en cultivo celular, en condiciones limitantes de suero fetal bovino, (3) su capacidad de proliferar en xenotransplantes en ratones atímicos, (4) su capacidad de inducir neoangiogénesis (generación de nuevos vasos sanguíneos) en xenotransplantes en ratones atímicos, y (5) su capacidad de inducir invasión y diferenciación de células endoteliales humanas HUVEC en ensayos de co- cultivos in vitro (Ejemplos) .
Recíprocamente, tanto t-PA recombinante como la expresión de ARN de t-PA en células que no la expresan endógenamente induce su proliferación, la invasión y la capacidad tumorigénica . Por tanto, estos reactivos (sustancias químicas y construcciones genéticas inhibidoras de t-PA) pueden ser eficientes instrumentos terapéuticos de determinados tipos de tumores, principalmente, pero no sólo, los adenocarcinomas del páncreas exocrino. Otro objeto de la presente invención es la administración de anticuerpos neutralizantes anti-proteína t-PA que pueden ser empleados en un procedimiento para inhibir la proteína. Por otra parte anticuerpos t-PA pueden ser empleados para el diagnóstico de diferentes tipos de cáncer en ensayos inmunohistoquímicos sobre cualquier tipo de tejidos o células humanos o ensayos de ELISA, RÍA o equivalentes, sobre fluidos orgánicos incluyendo suero, jugo pancreático y orina. También el uso de sondas de ADN o ARN para la detección específica de ARN de t-PA pueden ser empleadas como método de diagnóstico de distintos tipos de tumores humanos .
Depósito de microorganismos:
Un cultivo de la bacteria derivada de Escherichia coli , portadora de un plásmido identificado como pcDNA3. lt-PA-AS ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos
Tipo (CECT) , Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, España, el 5 de febrero de 2002, correspondiéndole el número de depósito CECT 5987. Otro cultivo de la bacteria derivada de Escherichia coli , portadora de un plásmido identificado como pTRE-t-PA ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, España, el 5 de febrero de 2002, correspondiéndole el número de depósito CECT 5988. Descripción detallada de la invención
La siguiente descripción detallada así como los ejemplos se proporcionan como forma de ilustración de la invención y no deben ser entendidos como limitantes de la presente invención.
Hay abundantes evidencias de que el sistema de activación del plasminógeno juega un importante papel en la capacidad invasiva de las células tumorales. En esta invención se ha demostrado que el activador tisular del plasminógeno, t-PA, además de ser necesario para una óptima capacidad invasiva de células cancerosas pancreáticas, se requiere para su crecimiento in vitro e in vivo, y para la inducción de la angiogénesis asociada a los tumores in vivo. En esta invención se presenta un procedimiento para bloquear la actividad de células normales y tumorales inhibiendo la actividad de la proteína t-PA.
El efecto mitogénico de t-PA sobre las células pancreáticas ha sido demostrado en esta invención tanto in vivo como in vitro mediante diferentes abordajes experimentales, complementarios entre sí, realizados sobre células epiteliales tumorales pancreáticas de orígenes independientes .
Por un lado, la inhibición de la expresión del t-PA endógeno mediante oligonucleótidos antisentido en las células CAPAN-1 y SK-PC-1, que expresan t-PA a altos niveles, o mediante la expresión estable de ARN antisentido en las células RWP-1 causó una importante reducción de la tasa proliferativa, tanto en cultivos en plástico como en agar. La adición exógena de t-PA recombinante a las células así manipuladas restauró los niveles de proliferación con respecto a los de las células control, lo que indica que la supresión de la expresión exógena de t-PA es el único factor responsable de la inhibición de la proliferación de estas células. Estos oligonucleótidos antisentido (SEQ ID NO 1) , la secuencia inversa complementaria del ARN de t-PA (SEQ ID NO 2) o plásmidos para la expresión de ARN antisentido específico para t-PA pcDNA3.1-TPA-AS SEQ ID No 3, han sido reivindicados en la presente invención como procedimiento para inhibir la expresión génica de t-PA in vitro e in vivo y con ello inhibir la proliferación de células normales y tumorales, la invasión a través de membranas básales de células normales y tumorales, la formación de tumores, y la angiogénesis inducida por tumores, en el tratamiento de diversos tipos de cáncer.
Además, ha sido demostrado también que para llevar a cabo su actividad promitogénica, el t-PA tiene que ser activo enzimáticamente, ya que la proliferación de las células que expresan t-PA de forma endógena se reduce drásticamente en presencia del inhibidor Pefabloc/t-PA, usado a concentraciones a las que se inactiva específicamente la t- PA pero no la u-PA o la plasmina [Stürzebecker J, Markwardt F: Inhibition of tissue-plasminogen activator by benzamidine derivatives. Fibrinolysis 1988; 2: 49]. En otra serie de experimentos, complementarios a los anteriores, ha sido demostrado, por un lado, que la adición de t-PA recombinante es mitogénica para las células RWP-1 (de expresión moderada de t-PA) , BxPC-3 y PANC-1 (estas dos últimas negativas para t-PA) , y, por otro, que la expresión estable del cDNA completo de t-PA en las células BxPC-3 y
PANC-1 es responsable de una mayor tasa proliferativa de estas células, siendo en ambos casos inhibida la proliferación mediante incubación con Pefabloc/t-PA. El procedimiento para inhibir la actividad enzimática de t- PA mediante el uso de Pefabloc/t-PA para preparar un medicamento como terapia antitumoral ha sido reivindicado en la presente invención.
Otras sustancias químicas pueden tener la misma actividad que Pefabloc/t-PA. En esta invención se reivindica un procedimiento para bloquear la actividad de células normales y tumorales inhibiendo la síntesis de t-PA mediante la administración de sustancias químicas inhibidoras de t-PA que se identifican añadiendo la sustancia química candidata a inhibidora a líneas celulares productoras de t-PA y determinando la inhibición de la actividad enzimática de la proteína t-PA mediante proliferación celular, formación y crecimiento de tumores y angiogénesis asociada a tumores. Los datos, obtenidos in vitro, del efecto promitogénico de t-PA en células de cáncer de páncreas, se confirma ampliamente en los experimentos realizados in vivo: los clones RWP-1 AS producen tumores de tamaño significativamente inferior a los clones control. De forma recíproca, los tumores formados por los clones PANC-1 P21 (derivados de la línea celular PANC-l/Tet-Off a la que se ha transfectado con el plásmído pTRE-TPA que contiene el cDNA completo correspondiente al gen para el t-PA humano) , en ausencia de tetraciclina (estado expresor de t-PA) crecen más rápido (tienen un tiempo de latencia más corto) , y alcanzan un mayor tamaño a un tiempo dado, que los tumores formados por los mismos clones en ratones tratados con tetraciclina (estado no expresor de t-PA) . ' Resumiendo, la producción endógena de t-PA es necesaria para la capacidad proliferativa óptima de las células de cáncer de páncreas, tanto in vitro como in vivo. Para estimular el crecimiento se necesita que el t-PA se encuentre catalíticamente activo, como demuestran los experimentos de inhibición de la proliferación mediante la adición a los cultivos de Pefabloc/t-PA. La segunda observación novedosa y relevante que se describe en este estudio consiste en la demostración de la necesidad de la expresión de t-PA para que los xenotransplantes de células tumorales pancreáticas induzcan una correcta red neoangiogénica. En el proceso de establecimiento tumoral, el crecimiento de un tumor depende en último término de la disponibilidad de una red vascular adecuada. Estas observaciones son las primeras en demostrar in vivo que el t-PA producido por las células tumorales es necesario para una correcta angiogénesis en el lugar del crecimiento del tumor.
En conclusión, las observaciones aquí descritas permiten postular que t-PA tiene un amplio papel en la adquisición del fenotipo tumoral actuando en fases precoces del establecimiento de los tumores, como son el crecimiento y el desarrollo de un sistema vascular. Por ello, es posible que futuros abordajes terapéuticos que contemplen como medida la inhibición de la expresión y/o la actividad del t-PA asociado a tumores, sean abordajes útiles para el tratamiento del cáncer de páncreas . Como instrumentos útiles para estudios en cáncer y para el desarrollo de nuevos fármacos antitumorales, han sido desarrollados las anteriormente mencionadas secuencias y oligonucleótidos dirigidos a la inhibición de la expresión de t-PA en células tumorales in vitro e in vivo, así como los plásmidos para la expresión de ARN antisentido específico para t-P A que suprime la expresión endógena de t-PA, con utilidad para el desarrollo de vectores para la terapia génica de tumores. También han sido desarrollados en la presente invención: cuatro líneas celulares (AS-2, AS-3, AS-7 y AS-29) derivadas de la línea de cáncer de páncreas humano RWP-1, en las que se ha suprimido mediante transcritos "antisentido" la expresión endógena de t-PA; un plásmido denominado pcDNA3.1-TPA para la expresión endógena de ARN y proteína t-PA; pcDNA-tPA-AS para la expresión endógena de ARN complementario al ARN endógeno de t-PA; la línea celular BxPC-3/TPA derivada de la línea celular de cáncer de páncreas humano BxPC-3 que expresa altos niveles de t-PA; un plásmido denominado pTRE-TPA para la expresión facultativa, dependiente del operón de la tetraciclina, de t-PA en células de mamífero; la línea celular PANC-1 /Tet- Off-TPA (clones P21, P37 y P39)en la que la expresión endógena de t-PA se regula en función de la presencia de tetraciclina en el medio de cultivo.
La administración de anticuerpos neutralizantes anti- proteína t-PA pueden ser empleados en un procedimiento para inhibir la proteína. Este procedimiento ha sido reivindicado en la presente invención.
Como método de diagnóstico de diferentes tipos de cáncer pueden ser empleados anticuerpos t-PA en ensayos inmunohistoquímicos sobre cualquier tipo de tejidos o células humanos o ensayos de ELISA, RÍA o equivalentes, sobre fluidos orgánicos incluyendo suero, jugo pancreático y orina. También pueden ser empleadas como método de diagnóstico de distintos tipos de tumores humanos, sondas de ADN o ARN para la detección específica de ARN de t-PA.
Descripción de figuras y tablas
Figura 1. El t-PA endógeno es necesario para la proliferación de las células de cáncer de páncreas en medio pobre en suero. Panel A. Arriba : Expresión de t-PA (Western blotting) en células CAPAN-1 tratadas durante 72 h con diferentes concentraciones (μM) de los oligonucleótidos antisentido para t-PA (t-PA-AS) u oligonucleótidos control
(t-PA-sense) a una concentración fija de DOTAP (8μM) . Abajo: La proliferación de células CAPAN-1 no transfectadas
(CTL) , transfectadas con el vehículo de transfección (DOT, únicamente DOTAP) , o tratadas con el t-PA-AS 2 μM, o con el t-PA-sense 2 μM, más DOTAP, se monitorizaron mediante determinación con MTT cada dos días, realizando cambios de la mezcla de transfección a las 72 h. Se muestran los resultados obtenidos a días 4 y 6 de un experimento representativo, de tres realizados en replicas por quintuplicado. Panel B. Células tumorales CAPAN-1 y SKPC-1, que sobreexpresan t-PA, se sembraron a baja densidad (1,5 x 104/pocillo) en placas de 24 pocilios en DMEM + 10 % FBS y, después de 24 h (Día 1) , se cambiaron al 1 % FBS con o sin Pefabloc/t-PA (30 μM, Pef) . La proliferación celular se monitorizó por incorporación de MTT durante 8 días. Cada punto representa la media de 3 determinaciones. Panel C. Crecimiento in vivo de líneas tumorales de páncreas. Células SK-PC-1, CAPAN-1, RWP-1, BxPC-3 y PANC-1 fueron inoculadas en el subcutis de ratones atímicos. El crecimiento tumoral se determinó semanalmente y el volumen del tumor se calculó como se describe en Materiales y Métodos. Se muestra los resultados obtenidos a las 6 semanas (columnas en blanco) y a las 14 semanas (columnas en gris) después de la inoculación.
Figura 2. Inhibición estable de la expresión de t-PA en células R P-1 mediante transcritos t-PA antisentido. Efectos en la invasión y en la proliferación celular in vitro. Panel A. Northern blotting con ARN total (15 μg) extraído de los transfectantes RWP-1 control C-13, C-l, y antisense, AS-2, AS-3, AS-7, AS-9. Los filtros fueron hibridados secuencialmente con una sonda para t-PA y otra u-PA. La equivalencia de carga en la membrana se comprobó mediante hibridación con un sonda de GAPDH. Panel B. Análisis de la expresión mediante Western blotting secuenciales de t-PA, PAI-1, y Anexina-II (ANN-II) . Se cargaron cantidades equivalentes de lisados celulares totales (40 μg) de los transfectantes indicados, así como de las células parentales RWP-1 (WT) . Panel C, ensayo de invasión in vitro. Las células se cultivaron en filtros Transwell recubiertos de Matrigel durante 72 h. La determinación cuantitativa de las células que invaden el compartimento inferior se realizó con células marcadas con
[3H] -timidina (Materiales y Métodos) . Panel D.
Proliferación celular determinada mediante incorporación de MTT en las células indicadas. Las células se mantuvieron al 10% FBS (CTL10, representa la media de los resultados de C- 1, C-13 y las células parentales; AS 10, representa la media de los resultados de los clones AS-2, AS-3, AS-29) o al 1% FBS (CTL 1 y AS 1) . Panel E. Ensayos de incorporación de timidina. Las células se cultivaron en placas de 24 pocilios en DMEN + 10% FBS. Una vez adheridas, el medio se cambió a DMEN + 0,5% FBS. Después de 2 días, las células se trataron con t-PA activo recombinante y la incorporación de [3H] -timidina se determinó después de 22 h. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron dos veces. Las barras de error representan la S.E.M. Para el análisis estadístico, consultar el texto.]
Figura 3. T-PA estimula el crecimiento de los clones RWP-1 en agar semi-sólido. Las células (4000/pocillo) se sembraron en placas de 6 pocilios en una solución al 0,3 % de agar tal y como se describe en Material y Métodos . Después de 3 semanas se cuantificó el número de colonias. Panel A. Se resultados correspondientes a pocilios representativos de los clones transfectantes control (C- 1,C-13, en el panel de la izquierda) y de los clones antisense (AS-2,AS-3, en el panel de la derecha) . El aumento es 100 x. Panel B. Evaluación cuantitativa de las colonias teñidas con MTT. Donde se indique, se añadió a las células C-13 el inhibidor específico de t-PA Pefabloc/t-PA
(Pef, 10 μM) . Las barras de error representan la S.E.M. Se realizaron tres experimentos independientes, cada uno de ellos por triplicado. La variación entre los diferentes experimentos fue inferior al 10%. Para el análisis estadístico, consultar el texto.
Figura 4. La inhibición de la expresión endógena de t-PA en las células R P-1 inhibe el crecimiento tumoral y la angiogénesis. Panel A. Crecimiento de las células RWP-1 inoculadas en ratones atímicos. Los clones control (símbolos rellenos: cuadrados. C-l; triángulos, C-13; diamantes, RWP-1 células parentales) y los clones antisense (símbolos vacíos: círculos, AS-2; cuadrados, AS-3; diamantes, AS-7; triángulos, AS-29) se inyectaron subcutáneamente en ratones atímicos (3 ratones por clon) . Cada punto es la media de la medición de 6 tumores (volumen del tumor) . Panel B. Izquierda: Expresión del antígeno de proliferación Ki67 determinado por inmunohistoquímica en núcleos de los tumores derivados de las células parentales y control C-13 (columnas llenas) y de los clones AS-3 y AS- 29 (columnas vacías) . Los resultados se expresan como el porcentaje de los núcleos positivos por total de núcleos contados. Derecha : índice mitótico de los tumores, determinado mediante el contaje de las figuras mitótica con el objetivo de máximo aumento (400 x) de los tumores derivados de las células parentales y control C-13 (columnas llenas) y de los clones AS-3 y AS-29 (columnas vacías) . Se cuantificó un mínimo de 20 campos por tumor. Panel C. Cuantificación de la neoangiogénesis, realizada como se describe en Materiales y Métodos. Se realizaron las siguientes cuantificaciones : número de microvasos (MS) , como la media de los vasos contados obtenida en tres secciones; número de células endoteliales (ECS), consistente en las células endoteliales individuales; el número total de estructuras teñidas representa los vasos y las células endoteliales individuales por campo. Los resultados representan la media de las determinaciones independientes realizada por dos investigadores. Las barras de error representan la S.E.M. Para el análisis estadístico, consultar el texto. Paneles D-G: Análisis histológico en los tumores de los ratones desnudos derivados de las células RWP-1. Se analizaron secciones (5 μm) de muestras incluidas en parafina de los tumores obtenidos en los ratones atímicos derivados de los clones control C-13 (panel D y F) y del clon AS-3 (panel E y G) mediante tinción con hematoxilina-eosina. Paneles H-K: La neoangiogénesis de los tumores se estimó mediante análisis inmunohistoquímico con anticuerpos anti PECAM-1/CD31 en secciones criostáticas de los tumores derivados de los clones control C-13 (H) , células parentales RWP-1 (J) , el clon AS-3 (I) , y del clon AS-2 (K) . Las preparaciones se contratiñeron con hematoxilina. Los aumentos en D, E, H, I son lOOx; en F y G, 400 x, y en J y K, 200x.
Figura 5. t-PA estimula la proliferación en las células BxPC-3 y PANC-1 que no expresan t.PA de manera independiente de la generación de plasmina. Panel A. Análisis por de la expresión de t-PA Western blotting en las células parentales BxPC-3 (WT) , los clones control CÍO y C12 transfectados con el vector vacío, y las células transfectadas con t-PA (t-PAlO y t-PA12) . Panel B. Análisis de la proliferación celular, monitorizada a lo largo de seis días en 1% FBS por MTT. Se muestran los resultados de la curva de crecimiento a día 6 de los clones control y de los que expresan t-PA (columnas en blanco) , de los mismos en presencia de Pefabloc/t-PA (10 μM) (columnas en negro) , o en presencia de rt-PA (50 ng/ml) (columnas en gris) . La media de los valores de densidad óptica (+ SEM) de las determinaciones por triplicado se analizó respecto los valores de las células control (WT) . Lo que se muestra es un experimento representativo de tres realizados con resultados similares. Panel C. Ensayo de incorporación de [3H] - timidina en células PANC-1 tratadas con t-PA recombinante. Curva dosis repuesta. Panel D. Ensayo de incorporación de [3H] -timidina con células PANC-1 tratadas con t-PA (25 ng/ml) , Pefabloc/t-PA (Pef, 30 μM) , aprotinina (Ap, 100 μM) , ácido ε-aminocaproico (Ea, 10 mM) , plasminógeno (Plg, 2 μg/ml) , o plasmina (plm, 0,1 μM) . Las concentraciones de plasminógeno y de los inhibidores de plasmina utilizadas han resultado ser efectivas en la inhibición de la invasión de las células tumorales pancreáticas (21,34) . Cada punto representa la media de tres determinaciones y las barras de error representan la S.E.M.
Figura 6. La inducción endógena de t-PA en células PANC-1 estimula la invasión y el crecimiento in vitro e in vivo.
Panel A. Análisis por Western blotting de los clones PANC- 1/Tet-Off. Los clones P21, P37 y P39 se cultivaron en presencia o ausencia de tetraciclina (2 μg/ml) en medio completo durante 3 días. El análisis se llevó a cabo con un anticuerpo anti t-PA, tal y como se describe anteriormente. Después de deshibridar, la membrana se normalizó con una anticuerpo anti-tubulina. Panel B. La proliferación celular se monitorizó mediante MTT durante seis días al 10% FBS o al 1% FBS en presencia o en la ausencia de tetraciclina. Se muestran los resultados de los clones P21, P37 y P39 a día 6 de crecimiento al 1% FBS: células que producen t-PA (sin tetraciclina, columnas en gris) ,o células que no producen t-PA (con tetraciclina 2 μg/ml, columnas en blanco). Panel C. Ensayo de invasión in vitro. El clon P21 se cultivó sobre filtros Transwell recubiertos con Matrigel durante 72 h. Las determinaciones cuantitativas de las células que invaden el compartimento inferior (la figura insertada representan células teñidas con cristal violeta) se realizaron como se describe en Materiales y Métodos. Panel D. Células PANC-1 crecidas en ratones desnudos. El clon P21 cultivado en ausencia de tetraciclina, símbolos rellenos, o crecido en presencia de tetraciclina, símbolos vacíos, se inyectaron (4 x 10s células) subcutáneamente en ratones desnudos como se describe en Material y Métodos. Donde se indica, los ratones fueron tratados con tetraciclina en el agua de bebida (2 mg/ml) . El crecimiento tumoral (volumen) se determinó cada semana a partir de la segunda semana de inyección.
Ejemplos de realización de la invención
Ejemplo 1. La producción endógena de t-PA es necesaria para la proliferación de células de cáncer de páncreas en medio pobre en suero.
Para estudiar la función de t-PA en adenocarcinomas pancreáticos, inhibimos su expresión mediante la transfección en las líneas celulares CAPAN-1 y SK-PC-1, que expresan t-PA a altos niveles con un oligonucleótido complementario a la región 5' del ARN mensajero de t-PA que comprende el lugar de inicio de la traducción (oligonucleótido t-PA-AS SEQ ID NO 1) que ha sido reivindicado en la presente invención) .
Se demuestra mediante Western blotting que el tratamiento de células CAPAN-1 con t-PA-AS SEQ ID NO 1 a una concentración de 2 μM durante 72 horas causa una inhibición de los niveles de proteína t-PA de más del 90% (Figura 1A) . Como controles se usaron muestras correspondientes a las mismas células tratadas con el vector de transfección (DOTAP) , o el vector con oligonucleótidos cuya secuencia es en "sentido" (t-PA-S) , en las que no se observa una disminución apreciable de los niveles de t-PA (Figura 1A) . También se usaron otros controles, consistentes en el tratamiento con oligonucleótidos complementarios a otras regiones del ARN mensajero de t-PA, que no produjeron disminución alguna de los niveles de t-PA.
Analizamos a continuación el efecto sobre el crecimiento celular de la supresión de la expresión de t-PA en las células CAPAN-1 producida por el tratamiento con t-PA-AS SEQ NOl, utilizando la tinción con el colorante MTT que se incorpora en las células metabolicamente activas. Como controles se usaron células no transfectadas, tratadas únicamente con vehículo de transfección, o transfectadas con oligonucleótidos "sentido". Todas las células control habían crecido a tasas equivalentes, alcanzando la confluencia al sexto día (Figura 1A) . Por el contrario, las células tratadas con t-PA-AS SEQ NOl mostraron un crecimiento claramente más lento, con un descenso del 53% respecto a las células control al sexto día del tratamiento (Figura 1A) . Estos experimentos indican que la expresión endógena de t-PA es necesaria para la proliferación de las células de cáncer de páncreas. Con el fin de estudiar si lo que se requiere para la proliferación de las células tumorales pancreáticas depende, no sólo de los niveles de proteína, sino de la actividad enzimática de t-PA, tratamos distintos tipos de células pancreáticas con Pefabloc/t-PA, un derivado sintético de la benzamidina que, a las concentraciones empleadas, con un máximo de 30 microM, inhibe la actividad enzimática de t-PA pero no de u-PA o plasmina. Las líneas celulares SK-PC-1, y CAPAN-1, que expresan niveles muy altos de t-PA (20 y 18 ng t-PA/24 h/microg proteína total, respectivamente), y RWP-1, que expresan niveles moderadamente altos de t-PA (5 ng/24 h/microg) , fueron cultivados en medio con 1% de FBS, tratados con Pefabloc/t- PA y analizados en cuanto a su tasa de crecimiento. En todas las líneas celulares, se observó una inhibición del crecimiento al tratar con Pefabloc/t-PA, siendo esta inhibición dosis-dependiente y máxima (90%) a una concentración del inhibidor de 30 microM (Figura IB) . El efecto inhibidor del crecimiento inducido por Pefabloc/t-PA no se observó cuando las células se cultivaron en medio suplementado con el 10% de FBS. Por tanto, la presencia de t-PA proteolíticamente activa es necesaria para la óptima proliferación in vitro de las células de cáncer de páncreas .
Para determinar la capacidad de formación de tumores in vivo de células de carcinoma de páncreas de distinto origen y que expresan distintos niveles de t-PA, se inyectaron en el subcutis de ratones atímicos células SK-PC-1, CAPAN-1, RWP-1, BxPC-3 y PANC-1. Las dos últimas líneas celulares no expresan t-PA. A las 6 semanas de la inyección de 2 x 106 células, tanto las células SK-PC-1 como CAPAN-1, que expresan altos niveles de t-PA, formaron tumores visibles. Las células RWP-1, de expresión moderada de t-PA, formaron tumores detectables a las 14 semanas de la inyección. Las células BxPC-3 y PANC-1, negativas para t-PA, formaron pequeños tumores visibles únicamente a partir de 18 semanas. Por tanto, hay una relación inversa entre el tiempo de latencia para la formación de tumores en ratones atímicos y los niveles de t-PA producidos por diversas líneas de cáncer de páncreas. Esto sugiere que el t-PA producido por estas células es importante para su capacidad tumorigénica .
Ejemplo 2. Inhibición de la proliferación celular de células pancreáticas mediante supresión estable de la expresión de t-PA con transcritos antisentido. Mediante transfección estable de plásmidos pcDNA3.1-TPA-AS, que contienen la secuencia SEQ ID NO 3, reivindicados en la presente invención, para la expresión de ARN antisentido, hemos generado clones de la línea RWP-1 en la que se ha extinguido la expresión de t-PA. Estos clones, aislados independientemente, y llamados AS-2, AS-3, AS-7 y AS-29, han sido reivindicados en la presente invención.
Estos clones muestran una importante reducción de ARN mensajero de t-PA, así como de la correspondientes proteína, en comparación con la línea celular parental o con clones control en que se transfectaron únicamente con el vector sin inserto (Figuras 2A y 2B) . La supresión de la expresión se limita a t-PA, como se demuestra por la ausencia de cambios significativos en los niveles de expresión de otras proteínas, tales como u-PA, anexina II y PAI-1 (Figura 2B) .
Se comprobó si la supresión de la expresión de t-PA en los clones AS derivados de RWP-1 comprometía la capacidad invasiva de las células de cáncer de páncreas. Para ello, se realizaron tests de invasión in vitro a través de una membrana basal reconstituida (Matrigel) de tres clones AS y dos clones control (transfectados con el vector solo) . A las 72 horas de incubación, la capacidad invasiva de los clones AS-2, AS-3 y AS-29 mostró una reducción del 51, 62 y 42%, respectivamente, en comparación con la invasividad de las células parentales y del clon control C-13 (P = 0.02, comparando los clones AS como grupo y las células control también agrupadas) (Figura 2C) . Puesto que todos los clones producen niveles equivalentes del inhibidor fisiológico de t-PA, PAI-1, concluímos que la reducción de la capacidad invasiva de los clones AS se debe a la supresión de la expresión de t-PA endógeno.
Analizamos a continuación la capacidad proliferativa de los clones AS. Los clones control C-l y C-13 presentaron una tasa de crecimiento equivalente a la de las células parentales, tanto en 10% como en 1% de FBS (Figura 2D) . Por el contrario, los clones AS, que crecieron a tasas normales en 10% FBS, mostraron una inhibición casi total de su crecimiento en 1% FBS. Como comprobación de que este efecto depende exclusivamente de la falta de t-PA, se observó una recuperación total de las tasas de crecimiento en 1% FBS cuando se añadió t-PA recombinante (a una concentración de 50 ng/ml) a los clones AS (Figura 2E) . Estos resultados demuestran que la expresión de t-PA endógeno es crucial para el crecimiento de las células RWP-1 a bajas concentraciones de FBS. Ejemplo 3. La expresión de t-PA endógeno se requiere para el crecimiento en semisuspensión de células RWP-1.
Los anteriores experimentos de crecimiento tumoral en ratones atímicos sugerían que la tumorigenicidad de las células de cáncer de páncreas depende de la expresión de t- PA. Un ensayo in vitro que se correlaciona con la capacidad tumorigénica in vivo es el ensayo de crecimiento clonal en medio semisólido. En este tipo de ensayos, los clones AS-2, AS-3, AS-7 y AS-29 mostraron una capacidad de formación de colonias significativamente reducida respecto a las células parentales y a las células control Cl (Figura 3; P < 0.002, P < 0.04, P < 0.0001 y P < 0.01, respectivamente, al comparar con Cl) . La adición de t-PA recombinante al medio restableció la capacidad de formación de colonias de los clones AS en estos ensayos, hasta niveles equivalentes a los de las células control. Y, de forma recíproca, la adición del inhibidor Pefabloc/t-PA al medio produjo una inhibición significativa de la formación de colonias en las células control C-13 (P = 0.024) . Concluimos, por tanto, que las células RWP-1 necesitan t-PA enzimáticamente activo para el crecimiento en condiciones de ausencia de adhesión a un sustrato sólido, lo que apoya de nuevo la idea de que t-PA tiene un importante papel en la capacidad tumorigénica de estas células. Ejemplo 4. La expresión de t-PA endógeno es necesaria para la tumorigénesis y la inducción de neoangiogénesis de células R P-1 en ratones atímicos.
La dependencia, o no, de la expresión endógena de t-PA para la capacidad tumorigénica de las células RWP-1 se comprobó efectivamente mediante xenotransplantes en ratones atímicos tanto de células control como de clones AS . Los tumores que se originan a partir de la implantación de los clones AS-2, AS-3, AS-7 y AS-29 mostraron una tasa de crecimiento significativamente inferior respecto a los clones control, o a las células parentales (Figura 4) , de tal modo que a las 15 semanas de la implantación, los clones AS habían llegado a un crecimiento 5 veces inferior a las células control (Figura 41) . El análisis cinético llevado a cabo demostró que, en todos y cada uno de los tiempos, los volúmenes de los tumores que surgieron de los clones AS eran siempre significativamente inferiores a los de las células control (a la semana 7, P < 0.005 y a la semana 15, P < 0.001) . Los tumores que se formaron a partir de los clones control y de las células parentales RWP-1 mostraban un gran número de células atípicas, con núcleos grandes, pleomórficos e hipercromáticos, con formación de estructuras pseudoglandulares de fenotipo pobremente diferenciado (Figura 4A y C) . Por el contrario, los tumores formados a partir de los clones AS presentaban un aspecto más diferenciado (moderadamente diferenciado) , con estructuras glandulares de mayor tamaño y células de menor tamaño y más uniforme, con una menor proporción de núcleos pleomórficos (Figura 4B y D) . Se apreciaba también una mayor reacción desmoplástica en estos tumores que en los tumores formados a partir de las células control. En un análisis macroscópico de ratones sacrificados a las 15 semanas de las inoculaciones celulares, no se apreciaron diferencias entre ambos tipos de tumores en cuanto a microinvasión local o a metástasis a distancia.
Con el fin de determinar el estado proliferativo de estos tumores, se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico para la detección del antígeno asociado a proliferación Ki67. Como resultado de este análisis, se comprobó que la proporción de núcleos positivos para Ki67, es decir, de células en proliferación, era signficativamente inferior en los tumores derivados de los clones AS-3 (16 ± 5.7%) y AS- 29 (15 + 1.9%) que en los derivados de las células parentales (22 ± 3.4%) o de los clones control C-13 (26 + 3.0%) (P < 0.001 en una comparación entre clones AS agrupados y clones control agrupados) . Además de la detección de Ki67, se determinó el índice mitótico de estos tumores, encontrándose un índice significativamente superior en los tumores control que en los tumores derivados de los clones AS (P < 0.0001), lo que corrobora la relación directa entre expresión de t-PA y entrada de las células en ciclo celular y proliferación in vivo. Para analizar el proceso angiogénico en los tumores derivados de las células RWP-1 y células derivadas, se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico de la expresión del marcador específico de endotelios PECAM-1/CD31. Los tumores derivados de las células parentales o de los clones control presentaban una red angiogénica bien desarrollada, con un predominio de capilares de notable longitud y anchura, y con presencia de escasas células endoteliales aisladas (Figura 4E y G) . En contraste, los tumores derivados de los clones AS contenían numerosas células endoteliales aisladas, y sólo ocasionalmente algún vaso aparentemente formado, de longitud y anchura sensiblemente inferiores a los de los tumores control (Figura 4F y H) . Estas observaciones cualitativas fueron sometidas a un análisis cuantitativo, mediante el contaje por campos ópticos del número de microcapilares (MS) y de células endoteliales (ECS) , así como el número total de estructuras teñidas por el marcador endotelial (vasos más células aisladas) (Figura 4K) . De este análisis se dedujo que los tumores derivados de las células RWP-1 control, es decir, que expresan t-PA, contenían aproximadamente un número equivalente de vasos formados y de células aisladas, mientras que los tumores derivados de los clones AS contenían escasos vasos y numerosas células endoteliales aisladas. No se observó una diferencia significativa entre ambos tipos de tumores en cuanto al número total de estructuras endoteliales (MS sumado a ECS) . Estos resultados subrayan la importancia de la producción de t-PA por las células tumorales pancreáticas para que se dé un correcto desarrollo y maduración de la red angiogénica asociada a los tumores .
Ejemplo 5. La inducción por t-PA de la proliferación de las células BxPC-3 y PA C-1 es independiente de la activación de la plasmina.
Puesto que la supresión de la expresión de t-PA en células que la expresan endógenamente compromete su capacidad para proliferar, formar tumores y estimular angiogénesis, se quiso comprobar, en experimentos conceptualmente recíprocos, los efectos derivados de forzar la expresión endógena de t-PA en células que normalmente no la producen. Para ello, fueron transfectadas células BxPC-3 y PANC-1 para la integración estable y expresión constitutiva de t- PA, y seleccionados clones con alta expresión del transgen. Estos clones han sido reivindicados en la presente invención. Los clones t-PAlO y t-PA12, derivados de las células BxPC-3 y que expresan altos niveles de t-PA, muestran una tasa de proliferación significativamente superior a los clones control (transfectados con vector solo) o las células parentales, cuando se cultivaron en medio con bajo suero
(1% FBS) (Figura 5B, P < 0.001). Este efecto se inhibe por completo al añadir a los clones t-PAlO y t-PA12 el inhibidor de t-PA Pefabloc/t-PA, mientras que el tratamiento con este inhibidor de las células parentales o los clones control no afectó su tasa proliferativa, lo que demuestra que la adición del inhibidor es consecuencia de su acción específica sobre el t-PA, y no de efectos tóxicos inespecíficos .
Una línea celular pancreática independiente, PANC-1, también responde a la adición de t-PA recombinante con un incremento de la proliferación (Figura 5C y D) , estando esta actividad mitogénica asociada a la actividad enzimática de t-PA, ya que la adición de Pefabloc/t-PA, pero no de inhibidores de la plasmina como la aprotinina o el epsilon-aminocaproico, inhibe la proliferación estimulada por t-PA. Por otra parte, la adición de plasmina no induce proliferación en estos ensayos (Figura 5D) . Podemos concluir, por tanto, que t-PA juega un papel esencial en la capacidad proliferativa de células de cáncer de páncreas de distinto origen, que depende de su actividad enzimática pero no de la presencia de la plasmina.
Ejemplo 6. La sobreexpresión inducible de t-PA en células PANC-1 estimula su capacidad invasiva y su proliferación in vitro e in vivo. Los experimentos arriba descritos demuestran los efectos sobre la proliferación de expresión endógena de t-PA en células pancreáticas que normalmente no la expresan. Un problema inherente a tales experimentos es que podrían ser resultado de la deriva o variación clonal, consecuencia al proceso de selección seguido. Con el fin de resolver de modo definitivo esta posibilidad, hemos generado clones de
PANC-1 en los que la expresión de t-PA es facultativa, encontrándose bajo el control del operón de la tetraciclina (sistema Tet-Off) , de modo que, en ausencia de tetraciclina, t-PA se expresa desde la construcción transfectada establemente en las células PANC-1, mientras que la adición de tetraciclina al medio reprime dicha expresión. Tras dos transfecciones consecutivas, seleccionamos los clones P21, P37 y P39, como clones de PANC-1 en los que la expresión de t-PA se encuentra estrechamente regulada por el operón Tet, ya que la proteína se expresa a altos niveles en ausencia de tetraciclina, y es indetectable en presencia de este antibiótico (Figura 6A) . Por tanto, este sistema nos permite analizar los efectos de la presencia o ausencia de expresión endógena t-PA en un mismo clon celular. Estos clones celulares han sido reivindicados en la presente invención.
En ausencia de tetraciclina estos clones presentaban una tasa de crecimiento significativamente superior a los mismos clones en presencia del antibiótico, correlacionándose dicho crecimiento con los niveles de t-PA expresados (Figura 6B) . En concreto, las células P21 mostraron una tasa de crecimiento 2,5 veces superior al crecer sin tetraciclina que con tetraciclina. Estas diferencias se observaron únicamente en condiciones de crecimiento en bajo suero, pero no en presencia de 10% FBS. Estos datos confirman ampliamente las observaciones anteriores, en que se habían usado clones o líneas celulares independientes. Por otra parte, los clones PANC-1 P21 mostraron una capacidad invasiva signficativamente superior en condiciones de expresión de t-PA que en condiciones de supresión de la expresión de t-PA. La adición del principal sustrato fisiológico de t-PA, el plasminógeno, produjo un importante aumento de la capacidad invasiva de las células en estado productor de t-PA, pero no produjo variaciones significativas en la capacidad invasiva de las células en estado no productor de t-PA. Es decir, la plasmina, que no influye en la inducción de la proliferación por t-PA, es importante en el efecto sobre la invasión a través de membranas básales.
Asimismo, hemos usado el sistema de expresión inducible de t-PA en las células PANC-1 para analizar el efecto de la expresión endógena de t-PA sobre la tumorigénesis de estas células, mediante xenotransplante en ratones atímicos y monitorización del crecimiento de los tumores a lo largo de
8 semanas. Tal como cabía esperar, los tumores que se formaron en ratones a los que no se suministró tetraciclina
(es decir, con expresión de t-PA) mostraron una tasa de crecimiento significativamente mayor que los tumores de ratones a los que se suministró el antibiótico (Figura 6D) , de tal modo que a las 7 semanas de realizado el inoculo celular, los tumores del clon PANC-1 P21 de ratones a los que no se suministró tetraciclina (expresión de t-PA) habían alcanzado un tamaño 2.3 veces mayor que los tumores que se formaron con células del mismo clon en ratones tratados con tetraciclina (sin expresión de t-PA) .
Materiales y Métodos Cultivo celular y reactivos utilizados. Las células usadas en el estudio que se describe en esta invención se adquirieron a American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.) . Se crecieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, NY, EE.UU.) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor, al 10% (GIBCO-BRL) , en estufas de C02 5%-aire 95%, humedad 90%, a 37°C. Se adquiró Pefabloc/t-PA [sal dihidroclórica de 2 , 7-bis- (4-amidinobenzilideno) -cicloheptanona- (1) ] de Pentapharm (Basilea, Suiza) ; Matrigel, de Becton Dickinson (Bedford, MA, EE.UU.); t-PA recombinante (Actilyse) , de Boehringer Mannheim (Barcelona, España) ; agar Noble, de Difco (Detroit, MI, EE.UU.); anticuerpos neutralizantes para t-PA y u-PA, de American Diagnostica (Greenwich, CT, EE.UU.); anticuerpos monoclonales anti-anexina II, de Transduction Laboratories (Lexington, KY, EE.UU.); anticuerpo de conejo anti-Ki67 humano, de DAKO (Glostrup, Dinamarca) ; anticuerpo monoclonal de rata anti-PECAM- 1/CD31, de Pharmingen (San Diego, CA, EE.UU.); anticuerpos anti-cabra conjugados a peroxidasa, de DAKO; anticuerpos de ratón anti-inmunoglobulina de cabra marcados con biotina, de DAKO; kit de tinción por el sistema ABC, de Pierce
(Rockford, IL, EE.UU.); estreptavidina conjugada a peroxidasa, de Zymed (San Francisco, CA, EE.UU.). Los anticuerpos anti-PAI-1 (ESP-1) fueron cedidos por la Dra . N. Booth (Universidad de Aberdeen, Escocia) . Construcciones y transfecciones . Inhibición de la expresión de t-PA con secuencias antisentido. El cDNA codificante para t-PA [Collen D, Lijnen HR, Bulens F, Vandamme AM,
Tulinsky A, Nelles L. Biochemical and functional characterization of human tissue-type plasminogen activator variants with mutagenized kringle domains . J Biol Chem
1990;265:12184-12191] se utilizó para amplificar un fragmento de DNA de 440 pb que incluía el primer codón
(5' -TATCTAGACCCACCCCCTGCCTGGAAACTT-3' - cebador 5' y 5'- ATGGATCCGTGCCCCCGTTGAAACACCTTG-3' - cebador 3') y fue subclonado en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en orientación antisentido bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV) . El DNA plasmídico se transfectó en células RWP-1, que expresan aproximadamente 5,1 ng de t- PA/24 h/μg proteína total, mediante el uso de liposomas catiónicos (Lipofectamina, GIBCO-BRL) y los transfectantes estables se seleccionaron en medio al 10% FBS conteniendo G418 (600 μg/ml) (GIBCO-BRL) . Se seleccionaron un total de 38 clones, descartando aquellos con crecimiento lento, y los 33 clones restantes se analizaron por ELISA y Western blotting para determinar los niveles de proteína t-PA secretada al medio de cultivo. Cinco clones mostraron una reducción superior al 90% de la proteína secretada (<0,3 ng de t-PA/24 h /μg de proteína total) , 11 tuvieron un descenso en el t-PA secretado entre el 70 y el 90%, y 17 produjeron niveles de t-PA que no eran significativamente diferentes a los de las células parentales. Ta bién, se consiguió una inhibición específica de la expresión de t-PA mediante transfección de células CAPAN-1 con oligonucleótido antisentido dirigido contra la región 5' de la secuencia codificante para t-PA (t-PA-AS) SEQ Nol . Los oligonucleótidos, modificados con enlaces fosforotioato en las cuatro bases externas de cada extremo (TIBMOLBIOMOL, Berlín, Alemania) , fueron transfectados en combinación con DOTAP (Boehringer-Mannhein, Mannheim, Alemania) siguiendo protocolos previamente descritos [Rodríguez M, Noé V, Alemany C, Miralles A, Bemi V, Caragol I, Ciudad C. Effects of antisense oligonucleotides directed toward dihydrofolate reductase RNA in mammalian cultured cells. Int. J. Cáncer 1999, 81:785-792]. La relación óptima de concentraciones de la mezcla de transfección fue de 2 μM de oligonucleótidos y 8 μM de DOTAP en medio DMEM al 1% FBS. La inhibición de la expresión de t-PA de las células expuestas a la mezcla de transfección durante 72 h se confirmó por Western Blotting.
Sobreexpresión de t-PA en líneas celulares que no expresan t-PA. Para expresar t-PA de forma constitutiva en células BxPC-3, se generó la construcción pcDNA3.1-TPA, mediante la inserción del cDNA completo de t-PA humano en la diana de restricción HindIII del vector pcDNA3.1 (Invitrogen) . Esta construcción se transfectó en células BxPC-3 mediante la combinación con Lipofectamina (GIBCO-BRL) , siendo seleccionados clones independientes resistentes a G418 (400 microg/ml) . La expresión del transgén para t-PA en los clones se determinó mediante Western blotting y ELISA. Para conseguir una expresión regulada por tetraciclina se generaron en primer lugar células PANC-l/Tet-Off mediante una primera transfección del plásmido pTet-Off (Clontech, Palo Alto, CA) y selección de los transfectantes en medio con G418 (400 μg/ml) , y una selección subsiguiente de los clones que mostraron la mejor regulación por tetraciclina de la expresión de pTRE-Luc transfectada transitoriamente. En segundo lugar, se generaron construcciones pTRE-tPA, insertándose el cDNA completo de t-PA en la diana de restricción BamHI del vector pTRE (Clontech) . A continuación, se llevó a cabo una segunda co-transfección sobre las células PANC-l/Tet-Off con los plásmidos pTRE-tPA y pTK-Hygromicine (Clontech) , seleccionándose clones resistentes tanto a G418 como a higromicina (100 μg/ml) durante 3 semanas. De 45 clones seleccionados inicialmente, se escogieron 3 en los que se demostró, por Western blotting, una fuerte inducción de la expresión de t-PA en ausencia de tetraciclina y una completa supresión de la expresión de t-PA en presencia de tetraciclina. Estos clones se mantuvieron de forma rutinaria en medio conteniendo tetraciclina (2 μg/ml, Sigma Chemical, St . Luis, MO) , G418 (200 microg/ml) e higromicina (100 microg/ml.
Análisis del ARN. EL ARN mensajero total se obtuvo mediante el protocolo de extracción del tiocianato de guanidinio- fenol-cloroformo ácido [Chomczynski P, Sacchi N: Single- step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162:156-159]. El análisis por Northern blot del ARN total (15 μg) se llevó a cabo siguiendo protocolos bien establecidos [Paciucci R, Berrozpe G, Tora M, Navarro E, García de Herreros A, Real FX: Isolation of tissue-type plasminogen activator, cathepsin H, and non-specific cross- reacting antigen from SK-PC-1 páncreas cáncer cells using subtractive hybridization. FEBS Lett 1996; 385:72-76]. La calidad del ARN se evaluó mediante tinción con bromuro de etidio y los filtros se normalizaron mediante hibridación con una sonda para la gliceraldehído fosfato deshidrogenasa. La transcripción reversa se llevó a cabo con 2 μg de ARN total utilizando oligo-dT y M-MLVRT
(Promega, Madison, WI) . La amplificación de las reacciones se realizó con los cebadores T7 y SP6. Western blotting. Las células se lisaron en tampón de carga
Laemmli (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% [peso/vol] SDS, 10 %
[vol/vol] glicerol) hervidas a 85 °C y centrifugadas a
10.000 x g. El gel de electroforesis de proteína (40 μg) y la transferencia a nitrocelulosa se realizaron como se ha descrito anteriormente [Paciucci R, Tora M, Diaz VM, Real FX: The plasminogen activator system in páncreas cáncer: role of t-PA in the invasive potential in vitro. Oncogene 1998; 16:625-633]. Las membranas se bloquearon con 3% BSA en PBS/Tween-20 al 0,1%, incubadas con el anticuerpo primario y el antígeno se detectó con un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano. Después de lavar, la reacción se desarrolló con un substrato quimioluminiscente (ECL, Amersham, Buchinghamshire, Reino Unido) . Las membranas fueron desondadas a 50 °C de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para su uso en hibridaciones secuenciales .
Ensayos de proliferación celular. Las células (1,5 x 104/pocillo) se plaquearon en placas de 24 pocilios en medio completo y el medio de las réplicas se cambió al 1%
FBS a las 24 h. El medio se cambió cada dos días. El MTT
(bromuro de 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-yl] -2 , 5- difeniltetrazolio) (Sigma) (0,5 mg/ml) se añadió durante 3 h a 37 °C para determinaar el porcentaje de células viables. Después de solubilizar en isopropanol ácido (0,1 N HCl) se determinó la DO a 549-630 nm. La proliferación también se determinó mediante cuantificación de la proteína total, utilizando el método de Bradford (Bio-Rad, Richmond, VA. EE.UU.), y mediante contaje celular después de tripsinizar. Se determinó que el tratamiento de las células con Pefabloc/t-PA (10 o 30 μM) durante los períodos de tiempo indicados no era tóxico, al comprobar que los niveles liberados de lactato deshidrogenasa eran nulos (no mostrado) . Para determinar la tasa de síntesis de ADN, las células crecidas al 0,5% FBS durante 72 h fueron expuestas a las factores durante 22 h en presencia de 0,5 μCi de
[3H] -timidina (Amersham Pharmacia Biotech) /pocilio . El ADN marcado se precipitó con ácido tricloroacético al 15%
[Hiraki Y, Rosen OM, Birnbaum MJ: Growth factors rapidly induce expression of the glucose transporter gene. J Biol Chem 1988; 263:13655-13662]. El efecto de la adición del mitógeno se expresó como porcentaje de la incorporación de [3H] -timidina en células que crecían al 0,5% FBS. Ensayo de invasión in vitro. El potencial invasivo de las células tumorales en cultivo se evaluó utilizando filtros Transwell (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.) cubiertos de Matrigel. Las determinaciones cuantitativas se obtuvieron utilizando células marcadas durante toda la noche con [3H] - timidina (2 μCi/105 células/ml) , siguiendo el protocolo descrito anteriormente [Paciucci R, Tora M, Diaz VM, Real FX: The plasminogen activator system in páncreas cáncer: role of t-PA in the invasive potential in vitro. Oncogene 1998; 16:625-633]. Los resultados se expresaron como el porcentaje de células marcadas en la superficie inferior del filtro, respecto el total representado por las células presentes en los compartimentos superior e inferior. Ensayos de crecimiento en agar semisólido. El crecimiento independiente de anclaje se evaluó siguiendo procedimientos descritos [Rizzino A: Soft agar growth assays for transforming growth factors and mitogenic peptides. Methods Enzymol 1987; 146:341-352], Se sembraron varias diluciones de células (1, 4 o 103) en placas de 6 pocilios. Dos veces a la semana se añadió medio (100 μl/pocillo) para mantener constante la humedad. Después de tres semanas, se contaron las colonias de > 0,2 mm de diámetro que contenían aproximadamente 30-50 células, mediante tinción con MTT (0,5 mg/ml) durante 3 h a 37°C.
Ensayos tumorigénicos en ratones desnudos . Los clones RWP-1 se crecieron en medio sin G418 durante 6 días, se tripsinizaron cuando alcanzaron el 70% de confluencia, se lavaron, y fueron resuspendidos en PBS estéril. Estas células, así como las células SK-PC-1, CAPAN-1, BxPC-3 y PANC-1 (2 x 106) fueron inoculadas subcutáneamente en ratones hembras Balb/c atímicas (Criffa, Barcelona, España) . Se efectuaron dos inyecciones por ratón, una en cada muslo, y se utilizaron tres ratones por clon. El volumen del tumor se midió externamente con un pie de rey, una vez por semana y se calculó según la fórmula de un ovoide donde L equivale al eje medio largo y W equivale al eje medio ancho, siendo el volumen del tumor = 4/3π x L/2 (W/2)2. Quince semanas después de los xenotransplantes, los ratones fueron sacrificados, y se estudiaron tanto el lugar de la inyección, como en el hígado, pulmones y nodulos linfáticos. Los tejidos fueron congelados rápidamente en nitrógeno líquido utilizando OCT o fijados en formol, embebidos en parafina, y fijados con hematoxilina-eosina. Para disminuir la latencia en la formación de los tumores, se inoculó en ratones atímicos el clon PANC-1 Tet-Off 21 (4 x 106 células) , mantenido en presencia (+ Tet) o en ausencia de tetracicilina (-Tet) y resuspendidas en 200 μl de Matrigel deplecionada de factores de crecimiento (Becton Dickinson) . Cuando se indica en la descripción del experimento, los ratones recibieron tetraciclina en el agua de bebida (2 mg/ml) cambiándose cada dos días) . La masa tumoral se monitorizó cada semana y el volumen del tumor se calculó como se describe anteriormente.
Métodos inmunohistoquímicos. El antígeno Ki67 se detectó mediante inmunoperoxidasa indirecta en secciones de 5 μm de muestras fijadas e incluidas en parafina, tratadas con calor en tampón citrato para desenmascarar los antígenos. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó incubando las secciones en H202 al 3%, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario, se lavaron, y se incubaron a continuación con Ig de cabra anti-conejo conjugadas a peroxidasa (EnVision, DAKO) . A continuación, las secciones se lavaron y la reacción se reveló con diaminobencidina, seguida de contratinción con hematoxilina. Las determinaciones cuantitativas de los núcleos positivos para Ki67 se llevó a cabo por dos investigadores independientes mediante el contaje del número de núcleos positivos por número total de células por campo a gran aumento (aumento 400 x) . Se contaron un mínimo de 700 núcleos totales por cada muestra. El antígeno PECAM/CD31 se detectó en secciones criostáticas de 10 μm y las células teñidas y los capilares se contaron de acuerdo a métodos anteriormente descritos [Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J: Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991; 324:1-8]. Las áreas de mayor vascularización se escogieron a bajo aumento (100 x) , y el contaje de los capilares se realizó a 200 x en tres campos seleccionados. Se usaron tres secciones consecutivas para las determinaciones cuantitativas. El número de capilares (microvessel score, MS) se calculó como la media de tres contajes realizados en las tres secciones. Se excluyeron del análisis los capilares adyacentes al tejido normal. Para la cuantificación de los capilares, se tuvieron en cuenta los vasos con un lumen claramente definido o vasos con una forma lineal bien definida, pero no las células endoteliales individuales. Separadamente, determinamos el número de células (cell score, ECS) contando células endoteliales individuales en el mismo campo en el cual se realizaba el contaje de capilares. En todos los ensayos, como control negativo de tinción se utilizaron anticuerpos control del mismo isotipo.
Estadística. Los resultados están expresados como media + S.E.M y el test de la t de Student se utilizó en los análisis estadísticos. Se consideraron significativas las comparaciones p<0 , 05.

Claims

Reivindicaciones
1. Procedimiento para inhibir la actividad de células normales y tumorales caracterizado porque se inhibe la actividad de la proteína t-PA.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la inhibición de la actividad de la proteína t-PA se obtiene mediante la inhibición de la expresión génica de la proteína t-PA.
3. Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque la inhibición de la expresión génica de la proteína t-PA se realiza mediante la expresión de secuencias complementarias de ARN mensajero de la proteína t-PA.
4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque la secuencia complementaria es un oligodesoxinucleótido complementario a una región situada alrededor del lugar de inicio de la traducción del ARN mensajero de t-PA.
5. Procedimiento según la reivindicación 4 caracterizado porque el oligodesoxinucléotido tiene la secuencia SEQ
ID No 1.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 4 y 5 caracterizado porque el oligodesoxinucleótido presenta modificaciones químicas en cualquiera de, o en todos, los enlaces diéster entre dos nucleótidos cualesquiera de dicha secuencia.
7. Procedimiento según las reivindicaciones 4 y 5 caracterizado porque el oligodesoxinucleótido presenta sustituciones de sus nucleótidos por cualquier tipo de bases análogas.
8. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque la secuencia expresada es una secuencia de ribonucleótidos complementaria a la secuencia de ribonucleótidos de la región 5' del ARN mensajero de t- PA.
9. Procedimiento según la reivindicación 8 caracterizado porque la secuencia de ribonucleótidos de la región 5' del ARN mensajero del t-PA es la SEQ ID No 2.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 y 9 caracterizado porque la expresión de la secuencia complementaria se realiza mediante la transfección de las células con un vector que contenga un fragmento de ADN correspondiente a la secuencia inversa complementaria del ARN del t-PA (SEQ ID No 3) , entre otros, el pcDNA3.1-TPA-AS (CECT 5987).
11. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la inhibición de la actividad t-PA se obtiene mediante la administración de sustancias químicas inhibidoras de t-PA identificadas según el siguiente procedimiento: a) adición de la sustancia química candidata a inhibidora de t-PA a células productoras de t-PA, b) determinación de la actividad enzimática o biológica de t-PA mediante la valoración entre otros, de parámetros celulares: capacidad proliferativa, capacidad invasiva in vitro en membranas básales constituidas, capacidad formadora de tumores, capacidad angiogénica in vivo, capacidad de crecimiento tumoral, y señales intracelulares de t-PA, c) identificación de un inhibidor de la actividad de la proteína t-PA en caso de una disminución de los niveles de t-PA o de cualquiera de los otros parámetros.
12. Procedimiento según la reivindicación 11 caracterizado porque la célula productora de t-PA proviene de las líneas celulares CAPAN-1 o SK-PC-1.
13. Procedimiento según la reivindicación 11 caracterizado porque la célula productora de t-PA es una célula transformada genéticamente para que exprese de forma estable y constitutiva la proteína t-PA.
14. Procedimiento según la reivindicación 11 caracterizado porque la célula productora de t-PA es una célula transformada genéticamente para que exprese de forma facultativa la proteína t-PA.
15. Procedimiento según la reivindicación 14 caracterizado porque la célula productora de t-PA proviene de, entre otras, la línea celular de cáncer de páncreas humano PANC-1/Tet-Off clon P21, P37 y P39, transfectada con el plásmido pTRE-TPA (CECT 5988) .
16. Procedimiento según la reivindicación 11 caracterizado porque en los clones AS-2, AS-3, AS-7 y AS-29 derivados de la línea celular de cáncer de páncreas humano RWP-1 se ha extinguido la expresión de t-PA.
17. Procedimiento según la reivindicación 11 caracterizado porque una sustancia inhibidora de la actividad t-PA es
Pefabloc/t-PA sal dihidroclórica de 2,7-bis-(4- amidinobenzilideno) -cicloheptanona- (1) .
18. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la inhibición de la proteína t-PA se obtiene mediante la administración de anticuerpos neutralizantes de t-PA.
19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 18 caracterizado porque la inhibición de la actividad de células normales y tumorales se refiere, entre otras actividades celulares, a la capacidad proliferativa, a la capacidad de invasión de membranas básales, a la formación de tumores y a la capacidad de angiogénesis inducida por tumores.
20. Uso de un procedimiento según las reivindicaciones de 1 a la 19 para el tratamiento de patologías que cursan alteración de la expresión de t-PA.
21. Procedimiento para el diagnóstico de diferentes tipos de cáncer caracterizado por el uso de anticuerpos anti t-PA.
22. Procedimiento según la reivindicación 21 caracterizado porque los anticuerpos anti t-PA se emplean en ensayos inmunohistoquimíeos sobre cualquier tipo de tejidos o células humanas y en ensayos de ELISA, RÍA o equivalentes sobre cualquier tipo de fluidos orgánicos humanos, incluyendo plasma, suero, líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo, aspirados bronquiales, jugo pancreático y orina.
23. Procedimiento para el diagnóstico de diferentes tipos de cáncer caracterizado el uso de sondas de ADN o ARN para la detección específica de ARN de t-PA en ensayos en fase líquida o en fase sólida sobre muestras obtenidas a partir de cualquier tipo de tejidos o células humanos.
24. Clones PANC-1 Tet-Off aislados de la primera transfección con el plasmido pTet-Off (Clontech, Palo Alto, CA) resistentes a la G418 (Geneticina) para su uso con el sistema Tet-Off de Clontech de doble transfección.
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