WO2003066855A1

WO2003066855A1 - Gene rag-1 de porc et utilisation de celui-ci

Info

Publication number: WO2003066855A1
Application number: PCT/JP2003/001114
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Yasue; Satoshi Watanabe; Daisuke Honma; Yohtaroh Takagaki; Hiromi Hatsuse
Original assignee: National Institute Of Agrobiological Sciences
Priority date: 2002-02-04
Filing date: 2003-02-04
Publication date: 2003-08-14
Also published as: EP1475436A4; US20050155094A1; JP2003225089A; EP1475436A1

Description

明細書ブタ RAG-1遺伝子おょぴその利用技術分野

本発明は、ブタ RAG-1遺伝子およびその利用に関する。背景技術

脊椎動物において、外来の病原体と戦う主戦力は、獲得免疫系である。獲得免疫系は、生後に外来の異物（抗原）の刺激の結果、生体の免疫系が後天的に得るその抗原特異的な免疫状態であり、 T細胞の.抗原受容体又は B細胞が生産する免疫グロブリンが抗原を識別することが引き金となって開始される。 T細胞抗原受容体と免疫グロプリンは、胎性細胞のゲノム遺伝子が T細胞乃至 B細胞に分化する過程で遺伝子再構成して、その結果機能遺伝子になり、獲得免疫能を発揮する。この獲得免疫系発生での遺伝子再構成の発見により、利根川進博士が 1987年ノーベル生理学 ·医学賞を受賞した。

遺伝子再構成は、ゲノム遺伝子上の再構成シグナル配列を、 RAG-1蛋白質（再構成活性化遺伝子（Recombination Activating Gene) の 1型産物）と RAG- 2蛋白質との複合体が切断することで開始される。 RAG - 1遺伝子が無いと、 T細胞抗原受容体と免疫グロプリンが出来ないことが判明しており、獲得免疫の無い重症複合免疫不全症になることが知られている。実際、ノックアウト法により作出した RAG-1遺伝子欠損マウスでは、 T細胞抗原受容体と免疫グロブリンが出来ないことが知られている（Mombaerts, P. et al. , Cell, 1992， 68 (5) , 869-77. ) 。

このような獲得免疫が無いマウスを、異種移植用、再生医学用などに用いることが考えられるが、マウスはヒトと比べて臓器のサイズが小さく、さらに、マウスは生理学的にヒトとは大きく違う（例えば、マウスの寿命は約 2年であり、細胞の老化速度がヒト細胞に比べて速い）ので、異種移植用、再生医学用などに適さないという問題があった。発明の開示

本発明者らは、体液組成や生理機能がヒトに似ており、霊長類に比べ世代時間が短い動物であるブタは、異種移植用、再生医学用などに適するサイズの動物としても好適であると考えた。し力しながら、現在までに、 RAG-1遺伝子ノックァゥトブタに関する報告は皆無である。また、ノックアウトブタを作製するためにはブタ RAG-1遺伝子の同定が前提となるが、いまだブタ RAG-1蛋白質をコードする DNAが単離されたという報告もない。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その第一の目的は、ブタ RAG-1蛋白質をコードする DNAを提供することにある。さらに、本発明は、該 DNAを発現するベクター、該ベクターが導入された形質転換体、ブタ RAG - 1蛋白質およびその製法、並びに該蛋白質に結合する抗体を提供することを目的とする。

また、本発明は、ブタ RAG- 1遺伝子の機能が抑制されたブタを作製することを目的とする。さらに、該ブタの作製に利用されるベクターおよび細胞を提供することも本発明の目的である。

本発明者らは、まず、ブタゲノム DNAライブラリーのスクリーニングを行い、ブタ RAG - 1遺伝子を含む BACクローンを得た。この BACクローンより RAG-1遺伝子を含む領域をサブクローユングし、 3つのクローンを得た。これらのクローンのシークェンスによる塩基配列決定、制限酵素消化によるマッピングを行い、遺伝子地図を作製した。この情報をもとに RAG-1遺伝子をノックアウトするターグティングベクターを作製した。

具体的には、 RAG- 1遣伝子開始コドンの 5 ' 側直前にある ΚρηΙ認識部位からその下流約 1. 4kbの位置にある Hindi認識部位までをピューロマイシン耐性遺伝子に置換した。このピューロマイシン耐性遺伝子は、遺伝子導入の際の陽性選択に用いる。この置換により RAG- 1遺伝子は発現することが出来ない。相同組換え領域としては開始コドンの上流約 9.0kbに存在する Xhol認識部位から開始コドンの下流約 2.5kbの位置に存在する Xhol認識部位までとした。また、遺伝子導入の際の陰性選択用に DT- A遺伝子を結合した。作製したターゲテイングべクタ一を用いて、ブタの内因性 RAG- 1遺伝子の機能を抑制することにより、獲得免疫系の無いブタを作製することが可能である。

従って、本発明は、ブタ由来の RAG- 1蛋白質をコードする DNAおよびその利用、特に獲得免疫系の無いブタの作製のための利用に関し、より具体的には、〔1〕以下の（a) から（c) のいずれかに記載のブタ由来の DNA、

(a) 配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる DNA、

(b) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA、

(c) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、 DNA組み換え誘導活性を有する蛋白質をコードする DNA、

〔2〕〔1〕に記載の DNAを含むベクター、

〔3〕〔1〕に記載の DNAまたは〔2〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞、

〔4〕〔1〕に記載の DNAによりコードされる蛋白質、

〔5〕〔3〕に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、〔4〕に記載の蛋白質の製造方法、

〔6〕〔4〕に記載の蛋白質に結合する抗体、

〔7〕相同組み換えにより内因性のブタ RAG— 1遺伝子の機能を抑制する DN A配列を含むベクター、

〔8〕〔7〕に記載のベクターが導入されたブタ細胞、

〔9〕以下の（a) および（b) の工程を含む、内因性 RAG— 1遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法、

( a ) 〔8〕に記載の細胞の核を除核卵子に移植する工程

( b ) 工程（a ) で得られた除核卵子をブタに移植する工程

〔1 0〕〔8〕に記載の細胞をブタに移植する工程を含む、内因性 R A G— 1遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法を、

提供するものである。

本発明は、ブタ RAG - 1蛋白質をコードする DMを提供する。本発明において「 RAG-1蛋白質」とは、遺伝子再構成を開始するために必須な RAG蛋白質複合体のうち 1型産物を意味する。本発明において、 RAG-1蛋白質の活性は、 DNA組み換え誘導活性として測定することが可能である。 DNA組み換え誘導活性の測定は、公知の手法で行うことができる（AgawalA. , Eastmanq. M. and Schatz D. G. , 199 8, Nature, 394, 744-751. ) 。本発明において明らかにされた、ブタ RAG-lの遺伝子配列を配列番号： 1、 cDNA配列を配列番号： 2、これら DNAがコードする R AG - 1蛋白質のァミノ酸配列を配列番号： 3に示す。

本発明は、また、ブタ RAG- 1蛋白質の変異体をコードする DNAを包含する。このような蛋白質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法 (Hashiraoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 27ト 275、 Zoller, M J, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100， 468 - 500、 Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12， 9441一 9456、 Kramer W, and Fritz HJ (1987) Me thods. Enzymol. 154， 350—367、 Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82 , 488—492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) などを用いて、ブタ RAG- 1蛋白質（配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ブタ RAG- 1蛋白質のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、 50 アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 10 アミノ酸以内（例えば、 5アミノ酸以内）であると考えられる。

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましレ、。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C, E 、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、 A、 V、レ I、 P) 、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、 Τ、 Υ) 、硫黄原子含有側鎖を有するァミノ酸（C、 M) 、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、 N、 E、 Q) 、塩基含有側鎖を有するアミノ離（ K、 Η) 、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W) を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。

あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及びノ又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al. , Proc . Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、 Wang, A. et al. , Science 2 24, 1431-1433 、 Dalbadie - McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1982) 79, 6409—6413 ) 。

ブタ RAG - 1蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、ブタ RAG- 1蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合蛋白質を作製する方法は、ブタ RAG-1蛋白質（配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 ) をコードする DNAと他のぺプチド又は蛋白質をコードする DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチド又は蛋白質としては、特に限定されない。

ブタ RAG - 1蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、 FLAG ( Hopp, T. P. et al. , BioTechnology (1988) 6， 1204-1210 ) 、 6個の His (ヒスチジン）残基からなる 6 XHis、 10 XHis、インフルエンザ凝集素（HA) 、ヒト c-mycの断片、 VSV-GPの断片、 _P18HIVの断片、 T7- tag、 HSV-tag、 E- tag、 SV4 0T抗原の断片、 lck tag、 a - tubulinの断片、 B- tag、 Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、ブタ由来の RAG - 1蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、 GST (ダルタチオン一 S—トランスフエラーゼ）、 HA (インフルエンザ凝集素）、ィムノグロブリン定常領域、 ]3—ガラクトシダーゼ、 MBP (マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。市販されているこれらべプチドまたは蛋白質をコードする DNAを本発明の蛋白質をコードする DNAと融合させ、これにより調製された融合 DNAを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。

また、本発明は、上記 DNAを含むベクター、該ベクターが導入された形質転換体、上記 DNAによりコードされる蛋白質およびその製法、並びに該蛋白質に結合する抗体を提供する。

本発明のベクターとしては、当業者において一般的に使用されるものを用いることができる。例えば、形質転換における宿主として大腸菌を用いる場合には、例えば、大腸菌内で複製させるための「ori」、および形質転換された大腸菌を選抜するための遺伝子（例えば薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエ二コール等）耐性遺伝子）をベクター上に有することが望ましく、このようなベクターとして具体的には、 M13系ベクター、 pUC系べクタ一、 pBR322、 pBluescript, pCR- Script、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7等を挙げることができる。

RAG- 1蛋白質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば大腸菌での発現を目的とした場合は、 lacZプロモーター（Ward et. al. , Nature, 1989, 341, 544-54 6. ) 、 araBプロモーター（Better et. al. , Science, 1988, 240, 1041-1043. ) 、または T7プロモーター等を有するベクターを例示することができる。このようなベクターとしては、上記ベクターの他に pGEX- 5X- 1 (フアルマシア社製）、「QIAexpress systemj (キアゲン社製）、 pEGFP、および pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現する BL21が好ましい）等が挙げられる。また、発現ベクターには、ポリぺプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよレ、。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、例えば大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et. al. , J. Bacteriol. , 19 87, 169, 4379. ) 等を使用すればよい。

RAG- 1蛋白質を製造するための他のベクターとしては、例えば哺乳動物由来の発現ベクター（例えば pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、 pEGF-BOS (Nucleic Ac ids. Res. , 1990, 18 (17) , 5322.、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター

(例えば「Bac- to- BAC baculovairus expression systemj (ギブコ BRL社製）、 _PBacPAK8) 、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2) 、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば pHSV、 pMV、 pAdexLcw) 、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば pZIPneo) 、酵母由来の発現ベクター（例えば「Pichia Exp ression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVll 、 SP-Q01) 、枯草菌由来の発現ベクター（例えば pPL608、 pKTH50) 等が挙げられる。

CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（M ulligan et. al.， Nature, 1979， 277, 108. ) 、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 a プロモーター (Mizushima et. al. , Nucleic Acids Res. , 1990, 18, 5322. ) 、 CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば薬剤（ネオマイシン、 G418等）耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば pMAM 、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK- CMV、 pOPRSV、 pOP13等が挙げられる。

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する！） HFR遺伝子を有するベクター（例えば pCHOI等）を導入し、メトトレキセート（ MTX) により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点を持つベクター（pcD等）で形質転換する方法が挙げられるまた、複製開始点としては、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV) 等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のために、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH) 遺伝子、チミジンキナーゼ（TK) 遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr) 遺伝子等を含むことができる。

ベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、例えば大腸菌や種々の真核細胞等を用いることが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば CH0、 COS, 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeLa 、 Vero、両生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et. al. , Na ture 291： 358-340, 1981) 、あるいは昆虫細胞、例えば Sf9、 Sf21、 Tn5が知られている。 CH0細胞としては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞である dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 4216-4220. ) や CH0 K- 1 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1968, 60， 1275. ) を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。植物細胞としては、例えばニコチアナ ·タパカム（Nicotiana tabacum) 由来の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス（Saccha romyces) 為、例サッカロ ^セス 'セレヒ、、シェ (Saccharomyces cerevisiae ) 、糸状菌、例えばァスペルギルス（Aspergillus) 属、例えばァスペルギルス •二ガー（Aspergillus niger) が知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞としては、大腸菌（E. coli) 、例えば JM109、 DH5 a、 HB101、 XLlBlue、 BL21等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

また、宿主として動物を使用する場合、哺乳類動物、植物、昆虫が挙げられる。哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) ₀ また、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。さらに、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。

本発明の形質転換体を作製するためには、上記宿主に上記ベクターを導入する。そのための方法としては、大腸菌等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えば塩化カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法（Chu, G. et. al.， Nucl. A cid. Res. , 1987, 15, 1311-1326. )を用いることができる。また、培養細胞等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えばリン酸カルシウム法（Chen, C. and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. , 1987， 7, 2745-2752. )、 DEAEデキストラン法 (Lopata, M. A. et. al. , Nucl. Acid. Res. , 1984, 12， 5707—5717.、 Sussman ， D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. , 1985, 4, 1642-1643· )、力チォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、リポフエクチン法（Derijard, B. Cell, 1994， 7, 1025- 1037.、 Lamb, B. T. et. al. , N ature Genetics, 1993， 5， 22-30.、 Rabindran, S. K. et. al. , Science, 1993 ， 259， 230- 234. )等の方法を用いることが可能である。

さらに、動物に DNAを導入する場合、該 DNAを適当なベクター（例えばアデノウィルスベクター（例えば pAdexlcw) やレトロウイルスベクタ一（例えば pZIPne o)等が挙げられるが、これらに制限されない。 ) に組み込み、例えばレトロウイ - 1 o - ルス法、リボソーム法、カチォニックリボソーム法、アデノウイルス法等により生体内に導入することが可能である。また、昆虫にベクターを導入する場合、例えば目的の蛋白質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより行うことができる（Susumu, M. et. al. , Nature, 1985， 315， 592-594. ) 。また植物に DNAを導入する場合、例えば目的とする蛋白質をコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pMON 530に挿入し、このベクターをァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens) のようなバクテリアに導入する。このパクテリアをタバコ、例えばニコチアナ.タパ力ムに感染させることでベクターを導入することができる（Julian K. - Ma et. al. , Eur. J. Immunol. , 1994, 24， 131-138. ) 。

本発明の RAG- 1蛋白質は、例えば本発明の形質転換体を培養することにより生産させることが可能である。培養は公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養であれば、一般的に、培養液としては、 DMEM、 MEM 、 RPMI1640 、 IMDM等を使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS) 等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよレ、。培養時の _PHは、通常、約 6 〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

本発明の RAG-1蛋白質は、宿主細胞内または細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。蛋白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分離、精製することができる。または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製することが可能である。

クロマトグラフィーとしては、例えば後述する本発明の RAG-1蛋白質に対する抗体をカラムに固定したァフィ二ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲノレ濾過、逆相クロマトグラフィー

、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purificat ion and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ea Daniel R. Marsh ak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) 。これらのクロマ卜グラフィ一は、液相クロマトグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。これらの精製方法を用い、本発明の RA G-1蛋白質を高度に精製することもできる。

なお、蛋白質を精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えばトリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼ等が用いられる。

また、本発明の RAG- 1蛋白質をダルタチオン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組換え蛋白質として宿主細胞（例えば動物細胞や大腸菌等）内で発現させた場合には、発現させた組換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクター Xa等により切断し、除去することも可能である。

さらに、個体で蛋白質を産生させる系から蛋白質を回収することも可能である。個体で蛋白質を産生させる系としては、例えば動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とする DNAを導入し、動物または植物の体内で蛋白質を産生させた後に、蛋白質を回収する。

例えば目的とする DNAを、ャギ )3カゼィンのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジエニックャギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジ-ニックャギに使用してもよい（Ebert, K. M. et. al. , Bio/Technology, 1994, 12, 69 9-702. ) 。

また、昆虫を使用する場合は、例えば目的の蛋白質をコードする DNAを挿入したパキュロウィルスを感染させたカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる（Susumu, M. et. al. , Nature, 1985, 315, 592—594. ) 。

さらに、植物を使用する場合、例えば上記方法でベクターを導入したニコチアナ ·タパカム由来の細胞から当業者に周知の方法（Toki et. al. , Plant Physio 1, 1995, 100, 1503-1507. ) で再生させたタバコ（タバコの葉）より所望の蛋白質を得ることができる（Julian K. -C. Ma et. al.， Eur. J. Immunol. , 1994, 2 4, 131-138. ) 。

本発明の RAG- 1蛋白質に結合する抗体は、 RAG-1蛋白質の精製や検出に使用することが可能である。本発明の RAG-1蛋白質の精製や検出に用いる抗体は、公知の方法により作製することができる。抗体の形態には特に制限はない。ゥサギ等の免疫動物に抗原蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体おょぴモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組換えによるヒト型化抗体も含まれる。さらに、抗体は、 RAG- 1蛋白質に結合する限り、抗体断片や抗体修飾物であってよい。

抗体は、 RAG - 1蛋白質を感作抗原として使用し、取得することができる。感作抗原として使用される RAG - 1蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。また、蛋白質を発現する細胞またはその溶解物あるいは化学的に合成した RAG- 1蛋白質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットへモシァニン、ゥシ血清アルブミン、卵白アルブミン等のキヤリァ蛋白質と適宜結合させて抗原とすることができる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、モノクローナル抗体の作製においては細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウス等のげつ歯目、ゥサギ等のゥサギ目、ァカゲザル等の霊長目の動物が使用される。感作抗原を動物に免疫する方法は、当業者にとっては周知である。

ポリクローナル抗体を得る例としては、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクロ一ナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。

モノクローナル抗体を得る例としては、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えばミルスティンらの方法 (Galfre, G . and Milstein, C. , Methods Enzymol. , 1981, 73, 3-46. ) 等に準じて行うことができる。

次いで、周知の方法で細胞融合により得られたハイプリドーマから目的とする抗体を産生するハイブリドーマのクローユングを行い、クローユングされたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収する。

得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばァフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過

、塩析、透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies ： A La boratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory ， 1988) I これらに限定されるものではない。ァフィ二ティーク口マトグラフィ一に用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。例えばプロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D, P0R0S, Se pharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。

抗体の抗原結合活性を測定する方法としては、例えば吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme- linked immunosorbent assay； ELISA)、 EIA (酵素免疫測定法）、 RIA (放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。 E LISAを用いる場合、抗体を固相化したプレートに RAG- 1蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えばアル力リフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、 P-ニトロフエ二ル燐酸等の酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。プレートに添加する蛋白質としては、 RAG- 1蛋白質の断片等を使用してもよい。

また、本発明は、相同組み換えにより内因性のブタ RAG- 1遺伝子の機能を抑制する DNA配列を含むベクター（ターゲティングベクター）を提供する。該ベクタ一を用いることで、内在性の RAG - 1遺伝子の機能が抑制された（RAG-1遺伝子がノックアウトされた）ブタ個体を作出することが可能である。該ベクターによる RAG- 1遺伝子の機能の抑制は、 RAG- 1遺伝子の発現制御領域に変異を導入することにより、 RAG - 1遺伝子の発現を抑制することにより行うことができる。また、 RAG-1遺伝子のェキソン領域に変異を導入することにより、野生型の RAG-1蛋白質に比べ活性が抑制された RAG- 1蛋白質変異体を発現させることによって行ってもよい。 RAG- 1遺伝子の機能の「抑制」には、完全に抑制する場合および部分的に抑制する場合の双方が含まれる。相同組み換えにより内因性のブタ RAG- 1遺伝子の機能を抑制する DNA配列を含むベクターは、相同組み換えにより、内因性のブタ RAG- 1遺伝子に該遺伝子の機能を抑制する変異を導入可能なべクターであれば特に制限はない。このようなべクタ一としては、例えば、変異を有するブタ RAG- 1遺伝子の発現制御領域もしくはェキソン領域、および Zまたは、相同組換え領域を含むベクターが挙げられる。また、陽'性選択（DMが導入された細胞のみを選び出すための選択）に用いる遺伝子、または、陰性選択（非相同組換え体を取り除くための選択）に用いる遣伝子をさらに含むベクターであってもよい。また、 RAG -;！遺伝子部位の組換えを促進する酵素、例えば、 Cre - loxにおける Creをコードする配列をさらに含むベクタ一であってもよい。

変異の導入には、例えば、実施例に記載したように陽性選択に用いる遺伝子を使用することができるが、内因性 RAG- 1遺伝子の機能を抑制しうる限り、これに制限されない。陽性選択に用いる遺伝子としては、特に制限はなく、例えば、ピユーロマイシン耐性遺伝子、および、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる

。また、陰性選択に用いる遺伝子としては、チミジンキナーゼ遺伝子、および、ジフテリァ毒素遺伝子などが挙げられる。

また、本発明において、相同組換え領域とは、ゲノム DNAに、変異を有するブタ RAG-1遺伝子の発現制御領域またはェキソン領域を導入する際の相同組換えを媒介する DNA配列を意味する。よって、本発明における相同組換え領域は、相同組換えの媒介が可能な DNA配列であれば、特に制限はない。このような DNA配列の選択は、当業者であれば通常行いうることである。

また、本発明は、本発明のターゲテイングベクターが導入されたブタ細胞を提供する。該ブタ細胞としては、体細胞、受精卵などが挙げられるが、これらに制限されない。

本発明において、ターグティングベクターの上記細胞への導入方法としては、当業者に公知の方法によって行うことができる。具体的には、電気穿孔法（エレクトロポーレーシヨン法）を挙げることができる。例えば、 1 X 10⁷個の細胞と 5 OnMのターゲティングベクターを 500 /i lの HEPESバッファーに懸濁し、 4. Omraギャップのエレクトロポーレーション用キュべットに入れる。エレクトロポーレーターを用いて 250V、 960 /i F、抵抗無限大の設定（由来細胞により値変化あり）で 1パルス与えて細胞内に遺伝子を導入する。

さらに、本発明は、 RAG-1遺伝子がノックアウトされた（内在性の RAG-1遺伝子の機能が抑制された）ブタの製造方法を提供する。該方法としては、特に制限はなく、例えば、内在性の RAG- 1遺伝子の機能が抑制された体細胞の核を除核卵子に移植して、得られた除核卵子をブタに移植することで、ブタ個体を出産させる方法が挙げられる。また、別の態様としては、受精卵に本発明のターグティングベクターを直接注入し、得られた受精卵をブタに移植することで、ブタ個体を出産させる方法が挙げられる。図面の簡単な説明

図 1は、 RAG-1遺伝子がサブクローンされたベクターを示す図である。 Kは Kp nl、 Xは XhoI、 Sは Sacl、 Hは HincII、 Bは BamHI、 Nは Notlを示す。（a ) は Genomic DNA、 ( b ) は Ragl - BAC—SacI、 ( c ) は Rag卜 Clawn— genome— BamHI、 ( d ) は pBKS-RagKpを示す。

図 2は、 RAG-1遺伝子領域の遺伝子地図を示す図である。（1 ) の斜線で示したボックスは第一ェキソン、（2 ) の斜線で示したボックスは第二ェキソン、（ 1 ) と（2 ) の間の領域がイントロンを示す。（3 ) の太線はクローニングのために新規考案作製したプローブ（RAG-1小板橋プローブ）として用いた領域、（ 4 ) の太線は BACからサブクローユングのためにプローブ（イントロン 5 ' 上流プローブ）として用いた領域を示す。また、（A) ( B ) 間の領域は Clawn- gen ome-BamHIサブクローン部分、（C ) (D) 間の領域は BAC_SacIサブクローン部分を示す。 4

- 1 7 - 図 3は、ターゲテイングべクタ一、および、 RAG- 1遺伝子のターゲティング前後の RAG- 1遺伝子領域の遺伝子地図を示す図である。 Kは Kpnl、 Xは XhoI、 Sは Sacl、 Hは HincII、 Bは BamHI、 Salは Sall、 Nは Notlを示す。（a ) は Genomi c DNA、（b ) はターゲテイングベクター、（c ) はターゲットゲノムを示す。図 4は、 RAG- 1遺伝子ターゲテイングベクターの構築過程を示す図である。 K は Kpnl、 Xは XhoI、 Sは Sacl、 Hは HincII、 Bは BamHI、 Salは Sall、 Nは Notl を示す。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] ブタ RAG- 1遺伝子ノックアウト用ターゲティングベクターの作製

まず、ブタ RAG- 1の cDNAの単離を試みた。その際、既知の遺伝子を入手できなかった。また、既知のマウスとヒトのヌクレオチド配列情報を子細に検討したが、ブタ RAG- 1の cDNAの検索に他動物種のプローブでは、クロスハイブリダィゼーシヨンが出来ない可能性があると判断された。従って、ブタ mRNAより逆転写 PCRを行った。最初、ヒト RAG- 1遺伝子で用いられている既報の PCRプライマ一 (Chun et al.， Cell 64： 189-200 (1991) ) 4本を用いたが、 PCR産物はブタからは得られなかった。そこで、マウスとヒトのヌクレオチド配列の共通領域を手がかりに多数のプライマーを作成して試行錯誤した結果、 1161bp (9. 1kbpの添付ヌクレオチド配列の 7010bpから 8171bp) のヒト RAG-1の cDNAとヌクレオチド配列で 88%相同性のある cDNA断片がクローン化された。これをプローブとして、ブタの胸腺の cDNAライブラリーを検索して、全長の約 80%を力パーする cDN Aクローンを得た。尚、残りの cDNAヌクレオチド配列は、 5， RACE法と 3， RAC E法を用いた。このように、ブタ RAG- 1の cDNA領域を部分的にクローユングするのは非常に困難であった。

次に、この cDNAの情報をもとに、 PCRプライマーを設計した。作成した PCR プライマ一を用いて、ブタゲノム DNAライブラリーのスクリーニングを行い、ブタ RAG- 1遺伝子を含む BACクローン 578B12を得た。この BACクローンより RAG - 1遺伝子を含む領域をサブクローユングし、 3つのクローン（Ragl- BAC- Sacl約 6 • lkb、 Ragl-Clawn-genome-BamHI約 6. 0kb、 pBKS- RagKp約 12. 6kb) を得た（図 1 ) 。これらのクローンのシークェンスによる塩基配列決定（約 9. lkb) (配列番号： 1 ) 、制限酵素消化によるマッピングを行い、約 16kbの遺伝子地図を作製した（図 1および 2 ) 。この情報をもとに RAG - 1遺伝子をノックアウトするターゲテイングべクターを作製した。

このターゲテイングベクターでは、 RAG-1遺伝子開始コドンの 5' 側直前にある Kpnl認識部位からその下流約 ^ kbの位置にある HincII認識部位までをピュ一口マイシン耐性遺伝子に^してある（図 3 ) 。このピューロマイシン耐性遣伝子は、遺伝子導入の際の陽性選択に用いる。この置換により RAG- 1遺伝子は発現することが出来ない。相同組換え領域としては開始コドンの上流約 9. 0kbに存在する Xhol認識部位から開始コドンの下流約 2. 5kbの位置に存在する Xhol認識部位までとした。また、遺伝子導入の際の陰性選択用に DT- A遺伝子を結合してある（図 3 ) 。

まず 5' 側の相同組換え領域を含む pBKS- RagKpを Xhol消化後自己連結し、 _PB KS - RagXKを得た。また、 3' 側の相同組換え領域を含む Ragl- Clawn- genome- BamH Iを HincIIと Notlで消化して得られた約 2. 2kbの断片を、同じく HincIIと Not Iで消化した pBluescriptKS (-)に連結し、 pBKS - RagHNとした。このべクターを X hoiで部分消ィ匕して自己連結し、終止コドンを含む約 1. 2kbを除いた pBKS-RagHX を得た。この pBKS - RagHXを Xholで部分消化した約 4. Okbの断片と、ピューロマィシン耐性遺伝子を持つ pPGK- puroを Sailで消化した約 1. 7kbの断片を連結した。これによりピュー口マイシン耐'性遺伝子の向きが異なる 2種類のベタター、 pBKS-PuroF-RagHXと pBKS- PuroR - RagHXを得た。この 2つのべクターを Kpnlと Ν otlで消化した約 2. 7kbの断片と、先に得た pBKS - RagXKを Sail と Kpnlで消化して得た約 9. Okbの断片を、 DT-A遺伝子を持つベクタ一 pMClDTpAMCSを Notlと Sailで消化して得た約 4. 3kbの断片とともに連結し、 2種類のターゲティングべクタ一、 pTV - RaglpuroFと pTV- RaglpuroRを得た（図 4 ) 。産業上の利用の可能性

本発明のターグティングベクターを用いることにより、 T細胞抗原受容体と免疫グロブリンの無いブタが出来る。このことは、獲得免疫が無いブタが得られることであり、幾つかの重要な応用が可能となる。

( 1 ) 異種移植用ミニブタ

現在、脳死個体からの臓器移植は、技術の進歩により需要が臓器の供給の 5倍以上あり、ヒトの臓器の闇市場まで出来ている程、深刻な供給不足である。ヒトへの臓器移植用のヒト遺伝子を導入した改良ミニブタが既に欧米のベンチャー企業数社で開発され、ヒヒ等の霊長類への移植で数ケ月の移植状態持続に成功している。これらの異種移植用ミニブタでは、超急性血管性拒絶反応等比較的早期に生じる拒絶反応は無くなっているが、徐々に出てくる細胞性拒絶反応がまだ長期の移植持続で解明されなければならない。この細胞性拒絶反応は、移植を受けたレシピエントの獲得免疫系がどう移植臓器に反応するかと云う問題と、移植臓器に付着したブタ T細胞と B細胞が移植を受けたレシピエントの体内で増殖し、レシピエントを異物と認識したブタの免疫機能の暴走の問題との二つの側面を検討する必要がある。異種移植用ミニブタの RAG- 1をノックアウトして、 T細胞と B 細胞を無くしたブタでは、移植後のブタ獲得免疫系のレシピエントへの持ち込みが無くなる。このため、異種移植の成功率は飛躍的に向上すると期待される。

( 2 ) 再生医学用、ヒト臓器培養器としての RAG-1ノックアウト ·ブタ胸腺の無いヌードマウスは、 T細胞抗原受容体が無いので獲得免疫能が無く、ヒトの細胞や臓器に対する拒絶反応が失われている。そこで、現在、ヒトの鼻や耳介など形成外科の移植用器官の生育が、ヌードマウスで行われている。しかし、マウスでは、動物のサイズに限界があり、より大きな再生医学用臓器の作製は可能で無い。

家畜の中では、他の草食動物に比べ、雑食であるブタがより体液組成や生理機能がヒトに似ており、更に、霊長類に比べて動物の世代時間が短いので、再生医学用ヒト臓器培養母体として最も適切な動物である。 RAG-1ノックアウト ·ブタは、獲得免疫を失っているので、ヌードマウスの様に、ヒトの臓器を拒絶することはなく、栄養を補給して、臓器を培養作製できる。

( 3 ) ブタを用いたヒト獲得免疫能の開発

RAG- 1ノックアウト ·ブタにヒトの骨髄を導入すれば、自身の獲得免疫能がないので、ヒト獲得免疫能をブタ体内に構築できると予想される。獲得免疫能についてヒト-ブタ ·骨髄キメラ動物が出来れば、現在行われている組換え DNA手法によりマウスの抗体をヒト化する等の必要もなくなり、直接、ヒト抗体を産生するブタが作出可能となる。 T細胞についても、 T細胞抗原認識に主要な役割をする MHC (主要組織適合性抗原複合体）のクラス II分子が、ヒトとブタとで酷似しているので、ヒト体内で機能するヒト 'ヘルパー T細胞を産生出来る。例えば、エイズ感染患者は、エイズウイルスがヘルパー T細胞の CD4分子を介して感染してヘルパー T細胞を死滅させ、その結果獲得免疫能が失われて日和見感染で死亡する。力ヒトのエイズウイルス耐性 CD4分子が既に作製されており、自己のヘルパー T細胞をエイズウイルス耐性ィ匕後 RAG- 1ノックアウト 'ブタ体内で増殖させ、エイズ患者に戻せば、獲得免疫能力が回復できる。免疫不全患者や、老化による免疫能の低下は、 RAG-1ノックアウト ·ブタ体内で増殖させた自己の獲得免疫系細胞を注入する事により、免疫能や活力を回復できる。

Claims

請求の範囲 .

1. 以下の（a) から（c) のいずれかに記載のブタ由来の DNA。

( a ) 配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる D N A。

(b) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。

(c) 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、およびまたは挿入されたアミノ酸配列からなり、 DNA組み換え誘導活性を有する蛋白質をコードする DNA。

2. 請求項 1に記載の DNAを含むベクター。

3. 請求項 1に記載の D N Aまたは請求項 2に記載のベクターを保持する形質転換細胞。

4. 請求項 1に記載の DNAによりコードされる蛋白質。

5. 請求項 3に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、請求項 4に記載の蛋白質の製造方法。

6. 請求項 4に記載の蛋白質に結合する抗体。

7. 相同組み換えにより内因性のブタ RAG— 1遺伝子の機能を抑制する DN A配列を含むベクター。

8. 請求項 7に記載のベクターが導入されたブタ細胞。

9. 以下の（a) および（b) の工程を含む、内因性 RAG— 1遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法。

(a) 請求項 8に記載の細胞の核を除核卵子に移植する工程

(b) 工程（a) で得られた除核卵子をブタに移植する工程

10. 請求項 8に記載の細胞をブタに移植する工程を含む、内因性 RAG— 1 遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法。