WO2003061710A1 - Agent regulant l'induction de l'apoptose par p73 - Google Patents

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WO2003061710A1
WO2003061710A1 PCT/JP2003/000605 JP0300605W WO03061710A1 WO 2003061710 A1 WO2003061710 A1 WO 2003061710A1 JP 0300605 W JP0300605 W JP 0300605W WO 03061710 A1 WO03061710 A1 WO 03061710A1
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δνρ73
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apoptosis
gene
promoter
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PCT/JP2003/000605
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Akira Nakagawara
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Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
Chiba-Prefecture
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to an apoptosis regulator for tumor cells, in particular! A) Apoptosis induction modulator of 73 or p53, and method of screening for apoptosis modulator.
  • the p73 gene was reported as a gene with high homology to the tumor suppressor p53 gene (Kaghad et al.). However, unlike p53: p73 is expressed as a multiple spliced form. Both p73 ⁇ and p7333 conserve the transcriptional activity control domain, DNA binding domain, and complex forming domain (Kaghad et al., De Laurenzi et al., De laurenzi and Catani et al.) Present in ⁇ 53. Reply By overexpressing the p73 gene, for example,!) the gene induced by 53, p21 gene expression induction was observed.
  • p73 like p53, was a transcriptional regulator and showed suppression of tumor cell growth (Kaghad et al., Jost et al.). Both p73 and p53 are thought to have sequence-specific transactivation functions, and have been recognized to recognize and bind to the p53 response element in the promoter region of each target gene. However, the exact mechanism remained poorly understood. ,: The p73 gene is a chromosome 1 p3 that is frequently deleted heterozygously in various human cancers.
  • the p73 gene does not show the high-frequency mutations found in the p53 gene (Ikawa et al.). It is thought to be regulated by a different mechanism (Lissy et al., Marin et al., Higashino et al., Steegenga et al. Haupt, Zeng et al.
  • ⁇ 73 which lacks the N-terminal transactivation domain.
  • ⁇ 73 inhibits apoptosis by blocking the apoptosis-inducing activity of mouse 53 sympathetic nerve cells (Pozniak et al.).
  • ⁇ 73 which is regarded as a sever suppressor
  • ⁇ 73 is regulated by a complex mechanism, and the involvement of ⁇ 73 is suspected, but it has not been well understood until now. Elucidating the apoptosis-inducing activity of the 73 protein, including its mechanism, and finding drugs that enhance it will lead to the development of new antitumor agents.
  • An object of the present invention is to elucidate the interaction between ⁇ 73 and ⁇ 73 at the gene and protein levels. Furthermore, the present invention provides: a modulator of 73 or ⁇ 53, a potentiosis induction regulator, a method for increasing apoptosis of tumor cells using the regulator, and a method for screening the regulator. The purpose is to provide.
  • neuroblastoma cells human neuroblastoma cells
  • ⁇ 53 and ⁇ 73 were induced, and in addition, expression of ⁇ 73 was induced.
  • a sequence to which the ⁇ 73 gene specifically binds was present in the promoter region of ⁇ 73, and identified the sequence.
  • overexpression of ⁇ 73 inhibited ⁇ 73-induced apoptosis, and clarified the function of ⁇ 73 as an autoregulator of ⁇ 73.
  • ⁇ 73 forms a hetero-oligomer with ⁇ 73 and its It is thought to inhibit lance activation and apoptosis-inducing activity.
  • the balance of ⁇ > 73 and ⁇ 73 at the intracellular level will control the: 73-induced apoptosis of tumor cells.
  • an apoptosis-inducing modulator of 73 or ⁇ 53 a method of increasing apoptosis of tumor cells using the modulator.
  • a transcriptional activity regulator of ⁇ 53 and ⁇ 73 comprising the ⁇ 73 gene and ⁇ 73 ⁇ 73 gene, a screening method for the regulator, and the like.
  • the present invention relates to the following (1) to (7).
  • a regulator of apoptosis induction of ⁇ 73 which comprises utilizing hetero-oligomer formation with ⁇ 73.
  • An apoptosis-inducing regulator comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • An apoptotic cis induction regulator comprising a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. ...,-, ..., ...
  • a transcriptional activity regulator of ⁇ 53 and ⁇ 73 comprising the ⁇ 73 gene and ⁇ 73 gene.
  • a method for screening an apoptosis-regulating agent in tumor cells using a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • An agent for regulating apoptosis of tumor cells which can be obtained by the method of stalling according to (6).
  • FIG. 1 is a graph showing cisplatin-induced dose-dependent SH-SY5Y cell apoptosis.
  • FIG. 2 is an immunoplot diagram of a cisplatin-treated product of SH-SY5Y cells.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing the results of analysis of RA from the cisplatin-treated SH-SY5Y cells by semi-quantitative RT-PCR.
  • Figure 4 shows a Western blot of SH-SY5Y cells infected with recombinant adenovirus expressing lacZ (Ad-lacZ), p53 (Ad-p53), or HA-p73a (Ad-p73 ⁇ ).
  • Ad-lacZ recombinant adenovirus expressing lacZ
  • Ad-p53 p53
  • Ad-p73 ⁇ HA-p73a
  • FIG. 3 is a Northern blot diagram.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of analyzing the RNA from the product by semi-quantitative RT-PCR.
  • FIG. 7 is a graph showing the result of measuring the expression ability of the ⁇ 73 promoter using luciferase-reporter assay.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence of the ⁇ 73 promoter region.
  • Figure 9 shows the transfection of SA0S-2 cells with pGL2- ⁇ 73 ⁇ (-100) and one of various expression plasmids ( ⁇ 53, ⁇ _ ⁇ 63 ⁇ , HA- ⁇ 73 ⁇ ;, HA- ⁇ 73] 3).
  • 4 is a graph showing the results of measuring the expression ability of the ⁇ 73 promoter portion using a luciferase ⁇ reporter assay.
  • FIG. 10 shows that SA0S-2 cells were transformed with pGL2- ⁇ 73 ⁇ (-76 / _57) and various expression plasmids ( ⁇ 53,
  • FIG. 4 is a graph showing the results of co-transfecting with ⁇ - ⁇ 63 ⁇ HA- ⁇ 73 ⁇ , ⁇ _ ⁇ 73; 3), and measuring the expression ability of the ⁇ 73 promoter portion by luciferase reporter assay.
  • Figure 1 1 is to delta New [rho 73 promoter by electrophoretic mobility Shifutoatsusi, is an electrophoretogram showing the results of testing the binding reaction competing DM to antagonistically bind to Ro73.
  • FIG. 12 is an electrophoretic diagram showing the result of electrophoretic mobility shift assay similar to FIG.
  • Figure 15 shows that SA0S-2 cells were transfected with one or two of the various active plasmids ( ⁇ 53, ⁇ 73, ⁇ 73] 3, ⁇ 73, and ⁇ 73] 3) and expressed the MDM2 promoter.
  • 4 is a graph showing the results obtained by measuring the activity with a luciferase / reporter assay.
  • Figure 16 shows that SA0S-2 cells were transfected with one or two of various expression plasmids ( ⁇ 53, ⁇ 73, ⁇ 73 ⁇ , ⁇ 73, and ⁇ 73; 3), and the expression ability of Bax promoter was changed to luciferase. It is a graph which shows the result of having measured in Sai.
  • FIG. 1 SK - N-BE cells expressing p73 a (Ad-p73 a) with increasing amounts of ⁇ N P 73 a (Ad- ⁇ Np73 a), a result of the co-infected with Sokae adenovirus, 4 is a graph showing changes in cell apoptosis.
  • FIG. 20 is a diagram schematically showing the interaction and correlation at the cellular level of the tumor-related gene that forms the basis of the present invention.
  • nucleic acid refers to a polynucleotide that is, for example, DNA or RNA, or an active DNA or RNA derived therefrom, and preferably refers to DNA or RNA. Particularly preferred nucleic acids have the DNA sequences disclosed herein or have sequences complementary thereto.
  • antagonistically binding nucleic acid refers to a nucleic acid that competitively binds to the target element (nucleic acid or protein) of the binding sequence, and in a broad sense, a so-called antisense nucleic acid Also includes RNAi (RNA interference molecules).
  • hybridizing refers to stringent conditions that distinguish relevant nucleotide sequences from unrelated nucleotide sequences (Maniatis et al., Molecular Cloning—AL aboratory M. an ⁇ a 1, Old S Spring Harbor L aboratory
  • examples of such stringent conditions include: (1) low ion intensity and high temperature for washing (eg, at 50.C, 0.015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, 1% SDS buffer), or (2) a denaturing agent such as formamide (eg, 50% formamide, 0.1% serum anolevumin at 42 ° C, 0.1%) during hybridization. It uses 1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 5 OmM sodium phosphate buffer (pH 6.5), 750 mM sodium chloride, and 75 mM sodium citrate. Another example is 50% formamide at 42 ° C, 5 x SSC, 5 OmM sodium phosphate (pH 6.8)
  • the present inventors have found that tumor cells undergo apoptosis in a dose-dependent manner when scleroderma cells are treated with cisbratin, a drug that inhibits DNA. At that time, it was confirmed by Western plotting that: 53 and p73 ⁇ protein were produced.
  • the tumor cells are preferably neuroblastoma cells, but are not limited thereto, and may be other central and peripheral nervous system tumor cells.
  • the Western blot suggested production of ⁇ ⁇ 73 ⁇ protein, which was confirmed by RT-PCR using ⁇ 73-specific primers. That is, cisplatin induces ⁇ 73 and ⁇ 73 in tumor cells at both mRN ⁇ ⁇ ⁇ and protein levels.
  • the present inventors have proposed that P53 or! ) When infected with an adenovirus vector expressing any of the 73 ⁇ genes, it was found that expression of ⁇ 73 ⁇ was observed in the case of the ⁇ 73a gene. The expression was confirmed by Western plot, or Northern plots using ⁇ 73 specific probes, or RT-PCR using ⁇ 73 specific primers as described above. That is, ⁇ 73 3 induces the expression of ⁇ 73. Further, unlike ⁇ 73, ⁇ 53 does not cause up-regulation of ⁇ ⁇ 73 ⁇ .
  • the present inventors obtained the ⁇ 73 promoter full-length DNA and determined the base sequence of the ⁇ 73 specific sequence. Successive deletion analysis of the promoter region revealed that the nucleotide sequence was at positions 176 to 157 (SEQ ID NO: 1). Also, in a similar expression test using tumor cells as described above, transactivation of the ⁇ 73 promoter could be triggered by ⁇ 73 (or ⁇ 73) as expected, but not by ⁇ 53. found. In addition, from the results of the competition Atsushi test, it was confirmed that the nucleotide sequence region was involved in binding to ⁇ 73, and was a: ⁇ 73-specific sequence.
  • the present inventors have found that when tumor cells are co-infected with an adenovirus vector expressing the ⁇ 73 ⁇ gene and the ⁇ 73 gene, the apoptosis of the tumor cells is suppressed in a dose-dependent manner.
  • cisplatin-induced apoptosis of tumor cells was suppressed by infection with an adenovirus vector expressing the ⁇ 73 gene. Therefore, ⁇ 73 ⁇ apoptosis-inducing activity is regulated by ⁇ 73 at the cellular level.
  • .DELTA..nu 73 gene (hereinafter, the present invention referred .DELTA..nu [rho 73 gene according to) with [rho 73 apoptosis-inducing regulatory function according to the present invention and it proteins which are Yotsute code (hereinafter, referred Derutanyuro 73 proteins according to the present invention )
  • a ⁇ 73 gene having a function of regulating ⁇ 73 apoptosis induction and a protein encoded thereby.
  • This regulatory function has been disclosed by the present invention in the promoter region upstream of the p73 gene! 7) It is governed by a base sequence capable of specific binding. As a result of promoting or suppressing its binding, these genes and proteins regulate tumor cell apoptosis through a quantitative balance of p73 and its antagonist, ⁇ 73.
  • the ⁇ ; ⁇ 73 gene can be used for treatment and prevention of abnormal expression of the ⁇ 73 protein.
  • the base sequence to be selected for the regulation of apoptosis is an upstream of the ANp73 gene, preferably a ⁇ 73 promoter region, and more preferably a ⁇ 73 specific binding sequence is present in the region. .
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence capable of specific binding is the DNA of SEQ ID NO: 1.
  • DN ⁇ having the nucleotide sequence can be easily obtained by chemical synthesis using an automatic DNA synthesizer.
  • the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 73 gene of the present invention is ligated to an appropriate vector ′ promoter, introduced into host cells, and the protein encoded by the gene is produced, extracted, and purified to obtain the protein of the present invention. Can be obtained. These operations are well known to those skilled in the art.
  • the ⁇ 73 gene of the present invention is inserted into an appropriate viral vector, introduced into a tumor cell, and under the transcriptional control of an appropriate promoter, the ⁇ 73 of the present invention is inserted into an appropriate viral vector. It can also express proteins and have the effect of regulating apoptosis of tumor cells. Further, the gene to be expressed does not necessarily have to encode the ⁇ 73 protein.
  • RNA transcript antisense or RNAi
  • RNAi a nucleotide sequence capable of specifically binding to ⁇ 73 mRNA
  • the effect of regulating apoptosis of tumor cells includes the effect of desensitizing cisplatin-resistant tumor cells to cisplatin.
  • the release of resistance includes the effect of releasing the acquisition of non-MDR-type drug resistance.
  • Suitable vector examples include MoMLV Betaco, Herpathvirus vector, Adenowinores vector, AAV vector, HIV vector, SIV vector, Sendai Examples include, but are not limited to, viral vectors.
  • Non-viral vectors can also be used, such as ribosomes, complexes of calcium phosphate with nucleic acids (introduced genes), cationic lipid complexes, Sendai virus ribosomes, and polymer carriers with polythione as the main chain. And the like.
  • methods such as electoral poration and gene gun can also be used for gene transfer into cells.
  • the promoter used for gene expression mounted on the vector is not particularly limited as long as it can express the ⁇ 73 gene of the present invention in a host cell such as a tumor cell.
  • adenovirus cytomegavirus, HIV virus, simian virus 40, rous sarcoma virus, herpes simplex virus, mouse leukemia virus, simvis virus, hepatitis ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, papilloma virus
  • Promoters derived from viruses such as human T-cell leukemia virus, influenza virus, Japanese encephalitis virus, JC virus, parvovirus B19, poliovirus, albumin, SR o ;, mammals derived from heat shock proteins, erosion factors, etc.
  • Promoters such as the CAG promoter, and promoters whose expression is induced by tetracycline, steroids, and the like.
  • a lac promoter or other expression motor that can be expressed in E. coli can be used.
  • the ⁇ 73 protein according to the present invention can also be performed by a method known to those skilled in the art. For example, there are a method of homogenizing a host cell, a method of lysing a cell membrane using a surfactant such as SDS or an enzyme, a method of sonication, and a method of repeating freezing and thawing.
  • a surfactant such as SDS or an enzyme
  • a method of sonication a method of repeating freezing and thawing.
  • the amino acid chain length of the ⁇ 73 protein according to the present invention is relatively short, it can be produced by chemical synthesis using an automatic peptide synthesizer in addition to the above-described gene recombination technique.
  • the ⁇ 73 protein of the present invention obtained by any of the methods can be purified by a conventional method. For example, general biochemical methods such as ultracentrifugation, density gradient centrifugation, column separation using ion exchange columns, abundity columns, reverse phase columns, and
  • the ⁇ 73 promoter region in particular: binds to the site capable of specifically binding ⁇ 73 (the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) antagonistically, Use nucleic acids (DNA) whose activity can be controlled.
  • DNA according to the present invention In order to introduce such DN ⁇ (hereinafter, referred to as DNA according to the present invention) into tumor cells, it is preferable to administer to a patient as a nucleic acid pharmaceutical composition.
  • This uses gene therapy techniques. That is, the DNA according to the present invention is introduced as a therapeutic gene into a gene transfer vector and delivered to a target tumor cell. Suitable recombinant vectors used for this purpose overlap with the vectors that can be transfected into mammalian cells (especially human cells) among the vectors listed above. Among the promoters that can be used in the same manner, those that can be used for gene expression in mammalian cells (particularly human cells) overlap with those listed.
  • the desired gene therapy composition can be prepared by dissolving the recombinant vector into which the therapeutic gene has been incorporated in an appropriate solvent such as water, physiological saline, or an isotonic buffer. :
  • Ribozyme RNAi can also be used because it is thought to regulate ⁇ Np73 gene expression.
  • the screening method of the present invention a method for screening a tumor cell apoptosis regulator using a nucleic acid having a base sequence capable of specifically binding p73 (hereinafter, referred to as the screening method of the present invention) Is provided.
  • the test substance of interest includes not only a protein that binds to the ⁇ 73 promoter or a protein that regulates its activity or a DNA that encodes the protein, but also a compound that regulates its activity. Is also included.
  • the compound may be synthetic or natural, low or high molecular, organic or inorganic.
  • the screening method of the present invention can be performed by various techniques known to those skilled in the art.
  • test substance when the test substance is a non-protein, the test substance is contacted with a cell (yeast or animal cell, etc.) having a reporter gene (eg, luciferase gene) linked downstream of the ⁇ 73 promoter.
  • the reporter determines whether to modulate one activity. Based on the reporter activity, select a candidate compound that controls (especially suppresses) the ⁇ 73 promoter activity.
  • a gene library DN1 is further introduced into a cell having a vector in which a reporter gene (for example, a luciferase gene) is linked downstream of the ⁇ 73 promoter.
  • a reporter gene for example, a luciferase gene
  • a clone which induces or preferably suppresses the expression of the gene is selected. Sequence the DNA contained in the clone and identify the protein it encodes.
  • the ⁇ p73 promoter DNA is biotinylated and adsorbed to beads or the like to which streptavidin is bound. This and the nuclear extract of the cells are incubated, and a protein that specifically binds to the DNA is selected by affinity purification. After labeling the ⁇ 73 promoter DNA and incubating the DNA with the nuclear extract of the cells, electrophoretic mobility shift assay (also called gel shift assay) is performed. If protein binding is observed after polyacrylamide gel electrophoresis, the band of the DII / protein complex has shifted from the DNA-only band, which is cut out of the gel and the protein is extracted. Thus, a protein that specifically binds to the DNA can be selected.
  • electrophoretic mobility shift assay also called gel shift assay
  • the protein is expressed in E. coli into which the gene library has been introduced. Is transferred to a filter.
  • the ⁇ 73 promoter DNA is used as a labeled probe and plotted on this filter.
  • a clone expressing a protein that binds to the probe is selected.
  • the DNA contained in the clone is sequenced and the protein encoded by it is identified.
  • the protein identified as a regulator of tumor cell apoptosis identified by the above-mentioned screening method can be indirectly administered orally or parenterally to patients (or warm-blooded animals) with a fllit ulcer.
  • the apoptosis regulator can act on tumor cells.
  • the apoptosis-modulating agent is prepared as a pharmaceutical composition. This involves mixing an effective amount of the apoptosis modulator with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent to give a suitable dosage form.
  • Suitable dosage forms for administration include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, capsules, suppositories, injections, and the like.
  • the apoptosis-regulating agent of the present invention can be applied to various tumors of warm-blooded animals including humans, and a typical example thereof is neuroblastoma.
  • Human neuroblastoma cells (SH-SY5Y, SK-N-AS, and SK-N-BE strains) were heat-inactivated with 50 ⁇ g / ml Kanamycin and 10% (v / v) The cells were cultured in RPMI-1640 medium containing fetal serum.
  • SA0S-2 cells were transfected with LipofectAMlNE (GIBC0 / BRL) according to the manufacturer's protocol. 293 and C0S7 cells were transfected with FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals).
  • RNA isolation and RT-PCR analysis Total RNA was prepared using Trizol reagent (GIBC0 / BRL) or RNeasy Mini Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's protocol.
  • Trizol reagent GIBC0 / BRL
  • RNeasy Mini Kit QIAGEN
  • the cDNA was amplified in a 20 ⁇ l PCR reaction containing 100 1 of each dNTP, lx PCR buffer, each of the M primers, and 0.2 units of rTaq or LA-Taq DNA polymerase (TAKARA).
  • the PCR primers were 5'-TGGCTTACCCATACGATGTTC-3, (sense strand) (SEQ ID NO: 2) and 5'-GTGCTGGACTGCTGGAAAGT-3 '(antisense strand) (SEQ ID NO: 3) for HA-p73; In contrast, 5'-TCTGGAACCAGACAGCACCT-3 '(sense strand) (SEQ ID NO: 4)
  • 5'-GTGCTGGACTGCTGGAAAGT-3 '(antisense strand) SEQ ID NO: 5
  • the primers used were 5, -GGATTCAGCCAGTTGACAGAACTA-3 '(sense strand) (SEQ ID NO: 10) and 5'-GTGCTGGACTGCTGGAAAGT-3' (antisense strand) (SEQ ID NO: 11). Its sense oligonucleotide primers were designed based on the same sequence found in common with human delta Nyuro73 genomic sequence and murine ⁇ ⁇ ⁇ 73 cDNA (accession number Y19235). Subclone the amplified product into pGEM-T Easy vector (Promega), pGEM- ⁇ 73 was obtained. The identity of this construct was confirmed in the DNA sequence.
  • pGEM-ANp73 was partially digested with Nanrl, blunt-ended, and further digested with Nanrl.
  • the restriction enzyme digested fragments of the NH 2 -terminal region PCDNA3- HA- ⁇ 73 ⁇ or pcDNA3-HA-p73 enzymatically modified Kpnl- subcloned into Nanrl site of their respective pcDNA3- ⁇ ⁇ 73 monument and pc ⁇ A3- ⁇ ⁇ 73] 3.
  • adenovirus expression downy click terpolymer is, P cDNA3-p53, pcDNA3- ⁇ _ ⁇ 73 ⁇ , pcDNA3- HA- ⁇ 73] 3, or derived from pcDNA3- ⁇ 73 ⁇ Hindlll - Xbal restriction enzyme digest fragments Kurenoufuragu placements And inserted into the enzymatically modified Notl site of the shuttle vector PHMCMV6 (Ozaki et al.). Each shuttle vector was digested with ⁇ -Ceul and PI-Seel and ligated to the same restriction sites of the adenovirus expression vector pAdHM4. Each of these thread-recombinant adenovirus constructs was digested with Pacl and transfected into 293 cells to produce recombinant adenovirus bodies.
  • EBC buffer 50 raM Tris-HCl pH 8.0 / 120 mM NaCl / 0.5% Nonidet P-40
  • pheninolemethinoles / Refoni / Left mouth lid 1 mM pheninolemethinoles / Refoni / Left mouth lid .
  • the membrane filter was incubated with a goat anti-mouse secondary antibody conjugated to horseradish oxidase for 1 hour at room temperature. Bound secondary antibody was detected by enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's protocol. (Immunoprecipitation method)
  • the ⁇ 73 promoter region containing ⁇ 73 exon 3 was combined with the PAC clone (dJ363Hll) and the primers 5′-CCAGGGAGGATCTGTAGCTG-3 ′ (sense strand) (SEQ ID NO: 12) and 5′-TGAACCCTACACTGCAGCAA-3 ′ (antisense strand) (SEQ ID NO: 13). ) And amplified by RT-PCR.
  • the amplified PCR product (2.9 Kb) was directly cloned into pGEM-T Easy vector (Promega) to obtain pGEM_ANp73. The sequence of this construct was confirmed by DNA sequence. 'To generate a series of 5-deletion constructs.
  • Electrophoretic mobility shift assays were performed as previously reported (Ozaki et al.). Briefly, double-stranded oligonucleotides were 32 P labeled using T4 polynucleotide kinase.
  • SH-SY5Y and SK-N-BE cells were inoculated into 96 ⁇ l plates (5 ⁇ 10 3 and 2 ⁇ 10 4 cells / plate, respectively). Transfer those cells to Ad-lacZ or Was infected with Ad_p73o; at a prescribed M0I for a prescribed time. Cell viability was measured by MTT Atsey.
  • (2_ (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium mononatridium salt is used as a substrate. Used as
  • Neuroblastoma SH-SY5Y cells were cultured for 24 hours in the presence of cisplatin (0, 5, 10, 25 ⁇ concentration). ⁇ According to Atsushi, when the number of surviving cells was calculated, the number of surviving cells was reduced depending on the dose of cisplatin. The data is shown in Figure 1 and is the average (Sat standard deviation) of three experiments. At the same time, the number of cells having the amount of sub-G1 DNA was also counted. These data are also shown in FIG.
  • SH-SY5Y cells were cultured in the presence of cisplatin (at a concentration of 0, 10, 25 ⁇ ) for 36 hours.
  • Total cell protein 40 ⁇ g was extracted from each culture.
  • the expression levels of p73o! or p53 were determined for each by immunoplot analysis (above) using p73-specific antibodies (Ab-1) or p53-specific antibodies (DO-1). The result is shown in figure 2. Size markers are shown on the left side of the figure. "*" Mark, Ro73omikuron that is recognized by Ro73 alpha specific antibody; a fast band mobility than is consistent with ⁇ 73 predicted molecular weight of flight (62KDaPozniak et al).
  • SH-SY5Y cells were cultured for 24 hours in the presence of cisplatin (at concentrations of 0, 1, 2, 5, 10, and 25 ⁇ ). After culture, total RNA was prepared and semi-quantitative RT-PCR was performed (above). The PCR reaction solution was electrophoresed on a 2.5% agarose gel. The results are shown in Figure 3. In the figure, the expression of GAPDH is shown as a control. From the results in FIG. 3, it can be seen that the expression of ⁇ Np73a increases depending on the dose of cisplatin.
  • SH-SY5Y cells were infected with a recombinant adenovirus expressing lacZ (Ad-lacZ), p53 (Ad-p53), or HA-p73a (Ad-p73a) (MIO: 10). 36 hours after infection, whole cells A lysate (40 / ig) was prepared, and a ⁇ -est blot was performed using an anti- ⁇ 73 ⁇ antibody or an anti- ⁇ 53 antibody.
  • Fig. 4 shows the results.
  • lane 1 corresponds to Ad-lacZ
  • lane 2 corresponds to Ad-p53
  • lane 3 corresponds to Ad- ⁇ 73 ⁇ .
  • the expression of HA-p73a induces the expression of ⁇ 73 ⁇ 73, but the expression of ⁇ 53 does not induce the expression.
  • SH-SY5Y cells were infected with recombinant adenovirus expressing lacZ (Ad-lacZ), p53 (Ad-p53), or HA-p73a (Ad-p73a) (MI0: 10). . 24 hours after infection, to prepare a total RNA (20 g), this time using .DELTA..nu [rho 73 specific probe was performed Northern blot.
  • Fig. 5 shows the results of staining of bromide tube.
  • lane 1 corresponds to Ad-lacZ
  • lane 2 corresponds to Ad_p53
  • lane 3 corresponds to Ad_p73a.
  • induction of ⁇ 73 expression was confirmed.
  • PGL2-ANp73P (-1245), pGL2- ⁇ 73 ⁇ (- 1082), pGL2- ⁇ 73 ⁇ (- 911), pGL2-ANp73P (-786), pGL2-ANp73P (-619), pGL2- ⁇ 73 ⁇ (-203), pGL2 -ANp73P (-184), pGL2- ⁇ 73 ⁇ (-100), pGL2- ⁇ Np73P (-80), pGL2- ⁇ p73P (-76), pGL2- ⁇ Np73P (-71), pGL2- ⁇ Np73P (-66) , PGL2- ⁇ Np73P (-63) and pGL2_ANp73P (+ l) were made as described above.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence of one region of the ⁇ 73 promoter.
  • the putative ⁇ 73 binding site is underlined and the putative TATA element is boxed.
  • the figure further shows a sequence comparison between the consensus p53 target sequence and the putative P-73 binding sequence.
  • R represents purine
  • Y represents pyrimidine
  • W represents adenine or thymidine. The two mismatches are indicated by small letters (c, g).
  • this 20 bp sequence (5′-GGGCAAGCTGAGGCCTGCCC-3 ′) (SEQ ID NO: 1) was placed above the noresif erase plasmid pGL2 promoter. It was subcloned into the basin, to obtain a P GL2- a Np73P (-76 / -57 ).
  • Oligonucleotide fragments of 61bp including the p73-specific binding sequence (5, -GTGCGGTCCAACACATCACCGGGCAAGCTGAGGCCTGCCCCGGACTTGGATGAATACTCAT-3 ') was labeled (SEQ ID NO 13) [ ⁇ 32 ⁇ ] ⁇ , and in vitro translational Chillon [rho 53 (FIG. 11 Lane 2), HA-p73a (lanes 3-7), ⁇ - ⁇ 73 ⁇ (lanes 8-12), and unprogrammed reticulocyte lysate (lane 1). Figure 11 shows the results.
  • lanes 4 and 9 are the results of binding reactions that contained a 10-fold molar excess of sequence-specific competitor DNA.
  • Lanes 5 and 10 are the results of binding reactions that contained a 10-fold molar excess of rooster S row non-specific competitor DNA.
  • the non-sequence-specific non-competitive DNAs include only the 5'- or 3'-terminal portion of the ⁇ 73-specific binding sequence, and are C1 and C3 shown in FIG. 12 described later.
  • An anti-1-IA antibody was added to the reaction mixture to supershift the protein DN ⁇ complex (lanes 6 and 11). Pre-immune serum was used as a negative control (lanes 7 and 12).
  • the protein DNA complex and the supershifted complex are indicated by arrowheads (filled or blank), respectively. Both p73 and ⁇ 73] 3 specifically bound to the oligonucleotide fragment.
  • 293 cells were transiently transfected with one or two of the various plasmids ( ⁇ - ⁇ 73 ⁇ , ⁇ - ⁇ 73 ⁇ , FLAG- ⁇ 73, and FLAG- ⁇ 73).
  • Whole cell lysates were immunoprecipitated with anti-antibody (above).
  • the precipitated protein was subjected to immunoplot analysis with anti-FLAGAG2 antibody.
  • C0S7 cells were transiently transfected with one or two of the various expression plasmids (p53, FLAG- ⁇ 73 and FLAG- ⁇ 73) 3). Forty-eight hours after transfection, whole cell lysates were prepared, immunoprecipitated with anti-p53 (D0-1 / Pabl801), followed by immunoplot analysis with anti-FLAG M2 antibody. The results are shown in FIG. In the figure, ⁇ ⁇ 73 ⁇ and ⁇ ⁇ 73 ⁇ are indicated by arrowheads (painted or blank), respectively. ⁇ 53 also became clear that interacts with ⁇ 73 ⁇ and ⁇ 73) 3.
  • SA0S-2 cells were co-transformed with various expression plasmids ( ⁇ 53, ⁇ 73 ⁇ , ⁇ 73 / 3, ⁇ 73, and ⁇ 73) and a reporter plasmid containing the Bax promoter. 48 hours after transfection, luciferase assay was performed. The results are shown in FIG. Data represent the mean (standard deviation). MDM2 promoter driven to ⁇ 73 ⁇ or ⁇ 73] 3 from the data in Figure 15 and Figure 16 And that the transcriptional activity of the Bax promoter is reduced by ⁇ Np73a or ⁇ 73 ⁇ .
  • SA0S-2 cells were co-transfected with one or two of the various expression plasmids (p53, p73a p73 j3, ⁇ 73 ⁇ , and ⁇ 73 ⁇ 73) 3) and a reporter plasmid containing the ⁇ 73 promoter. Forty-eight hours after transfection, the cells were luciferase-assayed. The results are shown in FIG. Data represent mean values (standard deviation). Derutanyuro73 promoter activity when coexpressed with ⁇ 73 ⁇ or ⁇ 73] 3 with .DELTA..nu [rho 73 flight or ⁇ 73] 3, it can be seen that significantly reduced.
  • SK- ⁇ -BE cells (2 ⁇ 10 4 / wenore) were co-infected with Ad-p73o! ( ⁇ 0 ⁇ : 10) and Ad— ⁇ 73 ⁇ ; (0, 1, 2, 5, 10, 20 M0I). Forty-eight hours after infection, the number of surviving cells was determined using a viable assay. The results are shown in FIG. The graph represents the percentage of viable cells relative to the control lacZ infection (mean of six tests (Sat standard deviation)). It can be seen that increasing the level of ⁇ ⁇ 73 ⁇ reduces apoptosis induced by . ⁇ 73.
  • SH-SY5Y cells (5 ⁇ 10 3 / ⁇ ell) were infected with Ad-lacZ or Ad- ⁇ 73 ⁇ ( ⁇ : 10). Six hours after infection, the cells were treated with cisplatin (0, 5, 10, 25 ⁇ concentrations) for 24 hours. The number of surviving cells was determined by viability assay. The results are shown in FIG. The graph shows the average value (Sat standard deviation value) of 6 tests. In addition, the cells infected with Ad-lacZ or Ad- ⁇ Np73a (both M0I: 10) and treated with 25 ⁇ M cisplatin for 24 hours and photographed are shown in the figure. SH- cell Shisuburachin induced Apoptosis one cis revealed to be inhibited by .DELTA..nu [rho 73 uninfected.
  • the function of the ⁇ 73 promoter has been elucidated, and it has become possible to regulate the ⁇ 73 apoptotic activity by controlling the activity of the promoter.
  • apoptosis of tumor cells can be promoted and an antitumor effect can be achieved.
  • the present invention has made it possible to screen an apoptosis regulator for tumor cells caused by ⁇ 73.
  • Such modulators of apoptosis are useful for chemotherapy, including gene therapy of tumors, especially malignancies.

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Description

明細書
P 7 3のアポトーシス誘導調節剤
技術分野
本発明は、 腫瘍細胞のアポトーシス調節剤、 特に！） 7 3または p 5 3のアポト 一シス誘導調節剤、 およびアポトーシス調節剤のスクリ一二ング方法に関する。 背景技術
p 7 3遺伝子は腫瘍サプレッサーである p 5 3遺伝子と高い相同性を有する遺 伝子として報告された（Kaghadら）。 し力 し、 p 5 3と異なり： p 7 3は、 多重のス プライシング形として発現される。それら p 7 3 α と p 7 3 3 には共に ρ 5 3に 存在する転写活性調節ドメイン、 D N A結合ドメイン、 複合体形成ドメイン (Kaghadら、 De Laurenzi ら、 De laurenziおよび Cataniら）カ保存されてレヽる。 p 7 3遺伝子を過剰発現させることにより、 例えば!） 5 3により誘導される遺伝 子、 p 2 1遺伝子の発現誘導が観察された。 また、 p 7 3は p 5 3と同様に転写 調節因子として、腫瘍細胞の増殖抑制を示した（Kaghadら、 Jostら）。 p 7 3と p 5 3とは両者ともに配列特異的なトランス活性化機能を有すると考えられ、 それ ぞれの標的遺伝子のプロモーター領域内の p 5 3応答配列を認識し、 結合すると されてきたが、 正確なメカニズムは、 よく理解されていないままであった,。,: p 7 3遺伝子は、 ヒトの各種癌でヘテロ接合性の欠失頻度の高い染色体 1 p 3
6 . 2— 3領域に位置し、 その産物は細胞周期の停止やアポトーシスを誘導する ので、 : 5 3と同様に腫瘍サプレッサーと考えられていた（Kaghadら、 Schwabら）。 し力 しながら、 p 7 3遺伝子は、 p 5 3遺伝子に見られるような高頻度の変異を 示さないことや（Ikawa ら）、 その他諸々の証左から p 7 3の機能は p 5 3の機能 とは異なるメカェズムにより調節されると考えられている（Lissyら、 Marinら、 Higashinoら、 Steegengaらヽ Hauptり、 Zengら 。
ところで、 乳癌、 卵巣癌を含むヒト新生物で正常細胞に比べて、 高レベルの p
7 3が発現する（Zaikaら、 Chenら）。 さらに、 E 2 F— 1、 c一 m y cや E 1 A 等の細胞性またはウィルス性癌遺伝子産物の過剰発現は、 P 7 3の発現を誘導す ることが報告されてきた（Lissyら、 Irwinら、 Stieweら、 Zaikaら）。したがって、 p 73は、腫瘍サプレッサーなのか、または癌遺伝子なのか疑問視もされてきた。
p 73蛋白には、 N—末端のトランス活性化ドメインを欠く ΔΝρ 7 3を含め て、 いくつかの変異体が存在する。 最近、 Pozniakらは、 ΔΝρ 73がマウス'交 感神経細胞で； 5 3のアポトーシス誘導活性をブロックすることによって、 アポ トーシスを阻害することを見出した（Pozniak ら）。 これらの知見から、 ΔΝρ 7 3は、 p 7 3と同様に細胞のアポトーシスに関わる重要な調節因子であることが 示唆されてきた。
上記のように、 重瘍サプレッサーとされる ρ 7 3の機能は、 複雑なメカニズム によって調節され、 それに ΔΝρ 73の関与が疑われるが、今までよくは理解さ れていなかった。 ； 7 3蛋白のアポトーシス誘導活性をそのメカニズムを含めて 明らかにし、 それを増強する薬剤を見出すことは、 新たな抗腫瘍剤の開発につな がる。
発明の開示
本発明は、 ρ 7 3と ΔΝρ 7 3との相互作用を遺伝子、蛋白レベルで解明する ことを課題の 1つとした。.さ,らに、 本発明は、 ： 73または ρ 5 3のァ,ポトーシ ス誘導調節剤、 該調節剤を用いて腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる方法、 お よび該調節剤のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
本発明者らは、 ヒト神経芽細胞腫細胞 （以下、 単に神経芽細胞腫細胞という） をシスプラチンで処理したところ、 ρ 5 3と ρ 73が誘導され、加えて ΔΝρ 7 3の発現が誘導されることを見出した。 さらに、 この ΔΝρ 7 3のプロモーター 領域内に Ρ 7 3遺伝子が特異的に結合する配列が存在することを見出し、 その配 列を特定した。 ΔΝρ 73の過剰発現によって、 ρ 7 3に誘導されるアポトーシ スが阻害されることをも見出し、 ρ 73の自己調節因子としての ΔΝρ 73の機 能を明らかにした。 ΔΝρ 7 3は、 ρ 7 3とへテロオリゴマーを形成し、 そのト ランス活性化とアポトーシス誘導活性を阻害すると考えられる。 そこで、 ί> 73 と ΔΝρ 73の細胞内レベルでのバランスによって、腫瘍細胞の: 73誘導性ァ ポトーシスが制御されることになる。 このように、 p 73と ΔΝρ 73の相互作 用の分子メカニズムを確立することによって、 I) 73または ρ 53のアポトーシ ス誘導調節剤、 該調節剤を用いて腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる方法、 ρ 73遺伝子おょぴ ΔΝρ 73遺伝子からなる ρ 53および ρ 73の転写活性調 節剤、 および前記調節剤のスクリーニング方法等を提供することが本発明によつ て可能となった。
すなわち、 本発明は以下の（1)〜（7)に記載されるものに関する。
(1) ΔΝρ 73とのへテロオリゴマー形成を利用することよりなる、 ρ 73のァ ポトーシス誘導調節剤。
(2) ΔΝρ 73とのへテロオリゴマー形成を利用することよりなる、 ρ 53のァ ポトーシス誘導調節剤。
(3) 配列番号 1に記載の塩基配列を利用することよりなるアポトーシス誘導調 節剤。
(4) 配列番号 1に記載の塩基配列にハイブリダイズする塩基配列を含む核酸か らなるアポ.ト.一シス誘導調節剤。 ., - . . . ... , . , ,
(5) ρ 73遺伝子および ΔΝρ 73遺伝子からなる ρ 53および ρ 73の転写 活性調節剤。
(6) 配列番号 1に記載の塩基配列を有する核酸を使用する、腫瘍細胞におけるァ ポトーシス調節剤のスクリ一ユング方法。
(7) (6)に記載のスタリーニング方法によって得ることができる腫瘍細胞のアポ トーシス調節剤。
図面の簡単な説明
図 1は、 シスプラチン誘導性の用量依存的 SH- SY5Y細胞アポトーシスを示すグ ラフである。 図 2は、 SH- SY5Y細胞のシスプラチン処理物の免疫プロット図である。
図 3は、 SH-SY5Y細胞のシスプラチン処理物からの R Aを半定量的 RT- PCRで解 析した結果を示す電気泳動図である。
図 4 は、 SH- SY5Y 細胞 を lacZ (Ad- lacZ) 、 p53 (Ad-p53) 、 ま た は HA-p73 a (Ad- p73 α )を発現する組換えアデノウィルスで感染させた産物のウェス タンブロット図である。
図 5 は、 SH- SY5Y 細胞 を lacZ (Ad- lacZ) 、 P53 (Ad-p53) 、 ま た は HA-p73 a (Ad- P73 α )を発現する組換えアデノウィルスで感染させた産物のノーザ ンブロット図である。
図 6は、 SH_SY5Y、SK-N-AS、SK-N-BE細胞をそれぞれ lacZ (Ad_lacZ)、p53 (Ad- p53)、 または HA- ρ73 α (Ad- p73 c を発現する組換えアデノウィルスで感染させた産物 からの RNAを半定量的 RT- PCRで解析した結果を示す電気泳動図である。
図 7は、 Δ Νρ73プロモーターの発現能をルシフェラーゼ -リポーターアツセィ で測定した結果を示すグラフである。
図 8は、 Δ Νρ73プロモーター領域の塩基配列を示す。
図 9は、 SA0S- 2 細胞を pGL2- Δ Νρ73Ρ (- 100)と各種発現プラスミ ド（ρ53、 ΗΑ_ρ63 γ、 HA- ρ73 ο;、 HA - ρ73 ]3 )の 1種と共トランスフエ,クトざせ、 Δ Νρ73プロ モーター部分の発現能をルシフェラーゼ■ リポーターアツセィで測定した結果を 示すグラフである。
図 1 0は、 SA0S- 2細胞を pGL2- Δ Νρ73Ρ (- 76/_57)と各種発現プラスミド（ρ53、
ΗΑ-ρ63 γ HA - ρ73 α、 ΗΑ_ρ73 ;3 )の一種と共トランスフエクトさせ、 Δ Νρ73 プロ モーター部分の発現能をルシフェラーゼ · リポーターアツセィで測定した結果を 示すグラフである。
図 1 1は、電気泳動移動度シフトアツセィによって Δ ΝΡ73プロモーターに対し て、 Ρ73 と拮抗的に結合する競合 DMの結合反応を試験した結果を示す電気泳動 図である。 図 1 2は、 図 1 1と同様な電気泳動移動度シフトアツセィの結果を示す電気泳 動図である。
図 1 3は、 293細胞を各種発現プラスミ ド（HA-p73 a、 ΗΑ-ρ73 β、 FLAG- ΔΝρ73 a、 およぴ FLAG- ΔΝρ73/3)の 1種または 2種でトランスフエクトした産物の免疫ブロ ット図である。
図 1 4は、 C0S7 細胞を各種発現プラスミ ド（p53、 FLAG- ΔΝρ73ひ 、 および FLAG- ΔΝΡ73]3)の 1種または 2種でトランスフエクトした産物の免疫プロット図 である。
図 1 5は、 SA0S - 2 細胞を各種努現プラスミ ド（ρ53、 ρ73ひ、 ρ73 ]3、 ΔΝρ73ひ、 およぴ ΔΝρ73]3)の 1種または 2種でトランスフェクトさせ、 MDM2プロモーター の発現能をルシフヱラーゼ · リポーターアツセィで測定した結果を示すグラフで ある。
図 1 6は、 SA0S- 2細胞を各種発現プラスミド（ρ53、 ρ73 、 ρ73 β , ΔΝρ73ひ、 および ΔΝρ73;3)の 1種または 2種でトランスフエクトさせ、 Baxプロモーターの 発現能をルシフェラーゼ . リポーターアツセィで測定した結果を示すグラフであ る。
図 1 7は、 SA0S-2 細胞,を各種発現プラスミド. (ρ53、 ρ73 «、 ,ρ73 β Ν ΔΝρ73α.Ν および ΔΝρ73 )の 1種または 2種でトランスフエクトさせ、 ΔΝρ73プロモータ 一の発現能をルシフェラーゼ■ リポーターアツセィで測定した結果を示すグラフ である。
図 1 8は、 SK - N- BE細胞を p73 a (Ad-p73 a )と増加量の Δ NP73 a (Ad- Δ Np73 a ) を発現する,祖換えアデノウィルスで共感染させた結果、 細胞アポトーシスの変化 を示すグラフである。
図 1 9は、 SK- N - BE細胞を ΔΝρ73α (Ad- ΔΝρ73ひ）を発現する組換えアデノウイ ルスで感染させ、 さらに産物をシスプラチンの可変濃度で処理した結果、 シスプ ラチン誘導性の細胞ァポトーシスの変化を示すグラフである。 図 20は、 本発明の基礎となる腫瘍関連遺伝子の細胞レベルでの相互作用、 相 関関係を模式的に表示した図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について好適な実施の形態を参照して、 詳細に説明する。
本明細書で使用する 「核酸」 という用語は、 例えば DNAまたは RNA、 或い はそれらから誘導される活性な D N Aまたは R N Aであるポリヌクレオチドを指 し、 好ましくは DNAまたは RNAを意味する。 特に好ましい核酸は、 本明細書 中に開示される DNA配列を有するか、 もしくはそれに相補的な配列を有する。 本明細書で使用する 「拮抗的に結合する核酸」 とは、 結合する配列の本来の標 的エレメント （核酸またはタンパク質） と競合的に結合する核酸を指し、 広い意 味では、 いわゆるアンチセンス核酸 RNA i (RNA干渉分子） 類も包含する。 本明細書で使用する 「ハイプリダイズ」 とは、 当業者が理解するように関連す る塩基配列を無関係な塩基配列と区別するストリンジェントな条件 (Ma n i a t i sら， Mo l e c u l a r C l o n i n g— A L a b o r a t o r y M a n μ a 1 , C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y
P r e s s , N ew Yo r k, USA, 9. 4 7- 9. 62および 1 1. Λ 5— 1.1. 6 1, 1 9 8 9を参照.） において、 核酸間.で.の.ハイ.プリッド形成を 指す。 すなわち、 このようなストリンジェントな条件の例は、 （1) 洗浄に低ィォ ン強度と高温 （例えば 50。Cで、 0. 0 1 5M塩化ナトリゥム、 0. 00 1 5M クェン酸ナトリウム、 0. 1 %SD S緩衝液） を使用するか、 （2) ハイブリッド 形成中にホルムアミ ドなどの変性剤（例えば 4 2°Cで、 50%ホルムアミ ド、 0. 1 %ゥシ血清ァノレブミン、 0. 1 %フィコール、 0. 1 %ポリビニルピロリ ドン、 5 OmMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6. 5)、 75 0 mM塩化ナトリウム、 7 5 mMクェン酸ナトリウム） を使用するものである。 もう一つの例は、 4 2°Cで 50%ホルムアミ ド、 5 xS S C、 5 OmMリン酸ナトリウム （p H6. 8)、 0.
1%ピロリン酸ナトリウム、 5 Xデンハート液、 超音波処理したサケ精子 DNA (5 Oyg/m 1 0. 1 % S D Sおよび 1 0 %デキス トラン硫酸を使用し、 洗 浄を 0. 2x S S Cおよび 0. 1 %SD S中 4 2°Cで行うものである。 当業者は、 明瞭で検出可能なハイプリッド形成シグナルを得るのに適したストリンジェント な条件を容易に決定、 または変更できる。
腫瘍細胞での 7 3および ΔΝΤ3 7 3の発現
本発明者らは、 重瘍細胞を D N A阻害性の薬剤であるシスブラチンで処理する と、 該腫瘍細胞は用量依存的にアポトーシスを起こすことを認めた。 その際、 ： 5 3と p 7 3 α 蛋白が生成することがウェスタンプロットにより確かめられた。 前記腫瘍細胞は、 好ましくは神経芽細胞腫細胞であるが、 これに限定されず、 他 の中枢および周辺神経系腫瘍細胞等であってもよい。 さらに、 前記ウェスタンプ 口ットにおいて、 Δ Νρ 7 3 α蛋白の生成が示唆され、これは ΔΝρ 7 3特異的 プライマーを用いる、 RT— P CRで確認された。 すなわち、 シスプラチンは、 腫瘍細胞で mRN Αレベルと蛋白レベルの両方で ρ 7 3 ひ と ΔΝ ρ 7 3 ひ を誘 導する。
ρ 7 3と ΔΝρ 7 3の関係
また、 本発明者らは、 fl重瘍細胞を用いて、 P 5 3または！） 7 3 α のいずれかの ■ 遺^ ¾子を発現するアデノウィルスベクターで感染させたところ Ρ 7 3 a遺伝子 の場合、 ΔΝ ρ 7 3 α の発現が認められることを見出した。 前記発現は、 ウェス タンプロットにより、または ΔΝρ 7 3特異的プローブを用いるノーザンプロッ トで、或いは上記のように ΔΝρ 7 3特異的プライマーを用いる RT— P CRで 確認、された。 すなわち、 ρ 7 3 ο; は ΔΝρ 7 3 の発現を誘導する。 また、 ρ 5 3は ρ 7 3 ひ と異なり ΔΝ ρ 7 3 αのアップレギュレーションを起こさない。
ΔΝρ 7 3内の 7 3特異的配列
さらに、 本発明者らは、 ΔΝ ρ 7 3プロモーター全長 DNAを得て、 ρ 7 3特 異的配列の塩基配列を決定した。 該プロモーター領域の連続的な欠失解析は、 そ の塩基配列の位置が一7 6〜一 5 7位（配列番号 1 )であることを明らかにした。 また、 腫瘍細胞を用いる上記と同様の発現試験において、 ΔΝρ 73プロモータ 一のトランス活性化は、 予想通り： ρ 73ひ （または ρ 73 ） よって引き起こさ れるが、 ρ 5 3によっては引き起こされないことが判明した。 加えて、 競合アツ セィ試験の結果から、 前記塩基配列領域が ρ 73との結合に関与しており、 ： ρ 7 3特異的配列であることが確認された。
u 73と ΔΝρ 73との相互作用
また、本発明者らは、腫瘍細胞を用いて！） 7 3 (ひ もしくは ） 遺伝子および ΔΝ ρ 73 (α もしくは ] 3 )遺伝子を発現するアデノウイルスベクターで共感染 させると、 ΔΝρ 7 3の両イソフォームが！） 7 3 αおよび！） 7 3 β と相互作用す ることを見出した。 さらに、 レポーター遺伝子を用いるアツセィから ΔΝρ 73 の両イソフォームは、 ； 5 3および p 73 (a もしくは 3) の転写活性を抑制す ることが明らかにされた。 加えて、 ΔΝρ 73のプロモーター活性が J) 73 (a もしくは ]3) によって抑制されることも明らかにされた。従って、 p 73と ΔΝ p 73は、転写活性の調節においてネガティブな自己調節ループを形成している。
ΔΝρ 73による 73アポトーシス誘導調節
さらに、 本発明者らは、 腫瘍細胞を ρ 7 3 α遺伝子および ΔΝρ 7 3 ひ 遺伝 子を発現するアデノウィルスベクターで共感染させると、 該腫瘍細胞:のアポトー シスが用量依存的に抑制されることを見出した。 加えて、 シスプラチン誘導性の 腫瘍細胞のアポトーシスが ΔΝρ 73ひ 遺伝子を発現するアデノウイルスべク ターによる感染で抑制されることも見出された。 従って、 ρ 73 αアポトーシス 誘導活性は、 細胞レベルで ΔΝρ 73ひによって調節される。
本発明に係る Ρ 73アポトーシス誘導調節機能を有する ΔΝ 73遺伝子（以 下、 本発明に係る ΔΝ Ρ 73遺伝子という） およびそれによつてコードされるタ ンパク質 （以下、 本発明に係る ΔΝρ 73タンパク質という）
上記で説明したように、 本発明に従えば: ρ 73アポトーシス誘導調節機能を有 する ΔΝρ 73遺伝子およびそれによつてコードされるタンパク質が提供され る。 この調節機能は、 p 7 3遺伝子の上流のプロモーター領域中、 本発明により 開示された！） 7 3特異的結合可能な塩基配列の支配を受けている。 その結合を促 進または抑制する結果、 これらの遺伝子およびタンパク質は、 p 7 3とこれに拮 抗する Δ Ν ρ 7 3の量的バランスを通じて腫瘍細胞のアポトーシスを調節する。 また、 Δ Ν ;ρ 7 3遺伝子は、 ρ 7 3蛋白の発現異常症の治療、 予防に用いること ができる。 前記アポトーシス調節に選択されるべき塩基配列としては、 前記 A N p 7 3遺伝子の上流、好ましくは Δ Ν ρ 7 3プロモーター領域からなり、 さらに 好ましくは該領域に ρ 7 3特異的結合配列が存在する。 特に好ましくは、 その塩 基配列が配列番号 1に示されるものである。 最も好ましくは、 前記特異的結合可 能な配列が配列番号 1に記載の D NAである。 該塩基配列を有する D N Αは、 D N A自動合成機を使用して、 化学合成によって容易に得られる。
本発明に係る Δ Ν ρ 7 3遺伝子を適当なベクター 'プロモーターに連結し、 宿 主細胞に導入して、 それがコードするタンパク質を産生させ、 抽出、 精製するこ とで本発明に係るタンパク質を入手することができる。 これらの操作は、 当業者 には周知である。 また、本発明に係る Δ Ν ρ 7 3遺伝子を適当なウィルス性のベ クタ一に挿入し、 これを腫瘍細胞に導入し、 適当なプロモーターの転写制御下に 本発明に係る Δ Ν ρ 7 3タンパク質を発現させ、腫瘍細胞のアポトーシスの調節 効果をあげることもできる。 また、発現させる遺伝子は必ずしも Δ Ν ρ 7 3タン パク質をコードしている必要はない。例えば、 Δ Ν ρ 7 3の mRNAに特異的結合可 能な塩基配列を含む R N A転写物 （アンチセンスまたは RNAi) を過剰に発現する ことにより腫瘍細胞のアポトーシスの調節効果を得ることができる。 前記腫瘍細 胞のアポトーシスの調節効果には、 シスプラチン耐性腫瘍細胞のシスプラチン耐 性解除する効果が含まれる。 前記耐性解除は、 非 MDR型薬剤耐性の獲得を解除す る効果を含む。
前記適当なベクターとしては、 MoMLVベタクー、 ヘルパスウィルスベクター、 アデノウイノレスベクター、 AAVベクター、 HIVベクター、 SIVベクター、 センダイ ウィルスベクター等が挙げられるが、 これらに限定されない。 また、 非ウィルス 性ベクターも使用可能であり、 リボゾーム、 リン酸カルシュゥムと核酸 （導入遺 伝子） との複合体、 カチオン脂質複合体、 センダイウィルスリボゾーム、 ポリ力 チオンを主鎖とする高分子キャリア一等が挙げられる。 さらに、 エレクト口ポー レーシヨン、 遺伝子銃等の方法も細胞への遺伝子導入に使用可能である。
前記べクターに搭載された遺伝子発現に使用されるプロモーターは、 腫瘍細胞 等の宿主細胞内で本発明に係る Δ Ν ρ 7 3遺伝子を発現させることができるも のであれば、特に制限されない。例えば、アデノウィルス、サイトメガウィルス、 HIV ウィルス、 シミアンウィルス 4 0、 ラウス肉腫ウィルス、 単純ヘルパスウイ ルス、 マウス白血病ウィルス、 シンビスウィルス、 Α型肝炎ウィルス、 B型肝炎 ウィルス、 C型肝炎ウィルス、パピローマウィルス、 ヒ ト T細胞白血病ウィルス、 ィンフルェンザウィルス、日本脳炎ウィルス、 JCウィルス、パルボアウィルス B19、 ポリオウイルス等のウィルス由来のプロモーター、 アルブミン、 S R o;、 熱ショ ック蛋白、 エロゲーシヨン因子等の哺乳類由来のプロモーター、 CAG プロモータ 一等のキメラ型プロモーター、 テトラサイクリン、 ステロイ ド等によって発現が 誘導されるプロモーターが挙げられる。 また、 lac プロモーター等、 大腸菌内で 発現可能なプ.口モー-ターも使用できる。
本発明に係る Δ Ν ρ 7 3タンパク質を単離する必要がある場合、これも当業者 に公知の方法で行うことができる。 例えば、 宿主細胞をホモジナイズする方法、 S D S等の界面活性剤や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、 超音波処理、 凍 結 ·融解を繰り返す方法等がある。 本発明に係る Δ Ν ρ 7 3タンパク質のァミノ 酸鎖長が比較的短い場合、 上記の遺伝子組替え手法以外に、 ペプチド自動合成機 を用いた化学合成により製造することも可能である。 いずれの方法で得られる本 発明に係る Δ Ν ρ 7 3タンパク質も、 常法により精製できる。 例えば、 超遠心や 密度勾配遠心、 イオン交換カラムやアブイ二ティーカラム、 逆相カラム等を利用 したカラム分離、 ポリアクリルアミド等を用いたゲル分離等、 一般的な生化学的 手法が精製に利用できる。
上記で説明したように、本発明に従えば腫瘍細胞で Δ N p 7 3プロモーター活 性を制御することにより、 ： 7 3アポトーシス誘導活性を調節して、 該腫瘍細胞 のアポトーシスを増大させる方法が提供される。 この目的のために、 前記 Δ Ν ρ 7 3プロモーター領域、 特に： ρ 7 3特異的に結合可能な部位 （配列番号 1に記載 の塩基配列） に拮抗的に結合し、 Δ Ν ρ 7 3プロモーター活性を制御できる核酸 (D NA) を使用する。
このような D N Α (以下、 本発明に係る D NAという） を腫瘍細胞に導入する には、 核酸医薬組成物として、 患者に投与することが好ましい。 これには、 遺伝 子治療手法を用いる。 すなわち、 本発明に係る D N Aを治療遺伝子として、 遺伝 子導入べクタ一（gene transfer vector)に揷入し、 標的腫瘍細胞までデリバリー する。 この目的で用いる適当な糸且換えベクターは、 上記の列挙されたベクターの 内、 哺乳類細胞 （特に、 ヒト細胞） に遺伝子導入可能なベクターと重複する。 同 様に使用可能なプロモーターも列挙したものの内、哺乳類細胞 （特に、 ヒト細胞） で遺伝子発現が可能なプロモーターと重複する。 治療遺伝子を組み込んだ組換え ベクターを水、 生理食塩水、 等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解して、 目的 とする遺伝子治療用組成物が調製できる。：
Δ Ν ρ 7 3プロモーター活性を制御するのに、 必ずしも本発明に係る D NAを 用いる必要はない。 リボザィムゃ RNAi等も Δ N p 7 3遺伝子発現を制御すると 考えられるので、 使用可能である。 これら D NA、 R NA、 さらにそれによつて コードされるタンパク質等は、 本発明のアポトーシス調節剤を構成する。
P 7 3特異的に結合可能な塩基配列を有する核酸を使用した、 腫瘍細胞のアポ ト一シス調節剤のスクリーニング方法
上記で説明したように、 本発明に従えば p 7 3特異的結合可能な塩基配列を有 する核酸を使用した、 腫瘍細胞のアポトーシス調節剤のスクリーニング方法 （以 下、 本発明のスクリーニング方法という） が提供される。 本発明のスクリーニング方法において、 対象となる被検物質とは、 ΔΝρ 7 3 プロモーターに結合する、 或いはその活性を調節するタンパク質またはそれをコ ードする DNAのみならず、 その活性を調節する化合物をも包含する。 その化合 物は、合成か天然か、低分子か高分子か、有機物か無機物かであるかを問わない。 本発明のスクリーニング方法は、 当業者には公知である数々の手法によって実 施できる。 例えば、 被検物質が非タンパク質である場合、 ΔΝρ 73プロモータ 一の下流にレポーター遺伝子 （例えば、 ルシフェラーゼ遺伝子） を連結したベタ ターを有する細胞 （酵母または動物細胞等） と該被検物質を接触させ、 レポータ 一活性を調節するか否かを判定する。 レポーター活性を基に ΔΝρ 7 3プロモー ター活性を制御 （特に、 抑制する） する候補化合物を選択する。
被検物質として、 遺伝子ライプラリーから選択する場合、 ΔΝρ 7 3プロモー ターの下流にレポーター遺伝子 （例えば、 ルシフェラーゼ遺伝子） を連結したベ クタ一を有する細胞にさらに遺伝子ライブラリ一 DN Αを導入して、 レポーター 遺伝子の発現を誘導または、 好ましくは抑制するクローンを選択する。 そのクロ —ンに含まれる DNAをシークェンスし、 それがコードするタンパク質を同定す る。
. また、 ΔΝ p 7 3プロモータ DNAをピオチン化し、 これをストレプトアビ ジンを結合させたビーズ等に吸着させる。 これと細胞の核抽出液をィンキュベー トして、 前記 DNAに特異的に結合するタンパク質をァフイエティ精製により選 択する。 さらに、 ΔΝρ 7 3プロモーター DNAを標識し、 これと細胞の核抽出 液をィンキュベートした後に、 電気泳動移動度シフトアツセィ （ゲルシフトアツ セィともいう） を行う。 ポリアクリロアミ ドゲル電気泳動後、 タンパク質の結合 が見られた場合には、 D Ν Α/タンパク質複合体のバンドが DNAのみのバンド に対してシフトしており、 これをゲルから切り出しタンパク質を抽出する。 かく して、 前記 DN Αに特異的に結合するタンパク質を選択することができる。
さらに、 遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌にタンパク質を発現させ、 これ をフィルターに転写する。 Δ Ν ρ 7 3プロモーター D NAを標識したプローブと して用い、 このフィルターにプロットする。 前記プローブと結合するタンパク質 を発現するクローンを選択する。 そのクローンに含まれる D NAをシークェンス し、 それがコードするタンパク質を同定する。
上記のスクリ一ユング方法で同定された腫瘍細胞のアポトーシス調節剤である タンパク質は、 flit瘍を有する患者 （または温血動物） に経口的に、 または非経口 的に投与することにより、 間接的に該アポトーシス調節剤を腫瘍細胞に作用させ ることができる。 この目的で、 アポトーシス調節剤を薬学的組成物として調製す る。 これは、 有効量の該アポトーシス調節剤を薬学的に許容される担体、 もしく は希釈剤と混合して、 適当な剤形とする。 投与に適した剤形は、 錠剤、 丸剤、 散 剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 カプセル剤、 坐剤、 注射剤等である。
本発明のアポトーシス調節剤は、 ヒ トを含む温血動物の各種腫瘍に対して、 適 用可能であり、 例えば神経芽細胞腫がその典型である。
(実施例）
以下、 実施例を挙げて、 本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。
(細胞の培養およびトランスフエクシヨン、 もしくは感染） ... ·
ヒト神経芽細胞腫細胞（SH-SY5Y株、 SK- N- AS株、および SK-N- BE株）を 50 μ g/ml 力ナマイシンと 10% (v/v)熱不活性化したゥシ胎児血清を含む RPMI- 1640培地で培 養した。ヒト骨肉種 SA0S- 2細胞、腎胚細胞 293細胞、および C0S7細胞を 10% (v/v) 熱不活性化したゥシ胎児血清と抗生物質を含むダルべッコ改変ィーグル培地 (DMEM)で培養した。 培養物を 5% C02を含む湿潤大気中、 37°Cで維持した。 SA0S - 2 細胞を製造業者のプロ トコルに従い、 LipofectAMlNE (GIBC0/BRL)でトランスフエ クトした。 293および C0S7細胞を FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals)で トランスフエタ トした。
(RNAの単離と RT- PCR解析） 製造業者のプロトコルに従い、 Trizol試薬（GIBC0/BRL)または RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を使用して、 トータル RNAを調製した。 ランダムプライマーと Moloney murine leukemia virus-reverse transcriptase (superscript H, GIBCO/BRL) ¾r含 む 20 μ 1 cDNA合成反応液中、 42°Cで 1時間、 続いて 70°C、 15分間の変性、 さら に急冷によって、 cDNAをテンプレートとして調製した。 100 1の各 dNTP、 lx PCR バッファー、 Mの各プライマ一、 および 0. 2単位の rTaqまたは LA- Taq DNA ポリメラーゼ（TAKARA)を含む 20 μ 1 PCR反応液中、 cDNAを増幅した。 PCRプライ マーは、 HA- p 73 に対して、 5' - TGGCTTACCCATACGATGTTC- 3， （センス鎖）（配列番号 2)と 5' -GTGCTGGACTGCTGGAAAGT-3 ' (アンチセンス鎖）（配列番号 3)； p73に対して、 5' -TCTGGAACCAGACAGCACCT-3' ( セ ン ス 鎖 ）（ 配 列 番 号 4) と
5' -GTGCTGGACTGCTGGAAAGT-3' (アンチセンス鎖）（配列番号 5)； Δ Νρ 73に対して、 5' -CGCCTACCATGCTGTACGTC-3' ( セ ン ス 鎖 ） ）（ 配 列 番 号 6) と 5' -GTGCTGGACTGCTGGAAAGT-3' (アンチセンス鎖）（配列番号 7)； GAPDH に対して、 5， - ACCTGACCTGCCGTCTAGAA- 3，（ セ ン ス 鎖 ）（ 配 列 番 号 8) と 5， -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (ァンチセンス鎖）（配列番号 9)であつた。
(プラスミドおよびアデノウィルス媒介遺伝子導入）
へマドグルチュン（HA) -タグされた p73 aまたは p73 ;3をコ一.ドする哺乳動物発 現プラスミドは、 M. Kaghadから寄贈された。 また、 HA- ρ63 γ の発現プラスミド は S. Ikawaから寄贈された。 Δ Νρ73の腿 2末端領域をコードする 494-bpの cDNA を SH - SY5Y細胞に由来するトータル RNAを用いて、 RT - PCRにより増幅した。 前記 細胞は、 Ad_p73 a によって感染させた。 使用 したプライマーは、 5， -GGATTCAGCCAGTTGACAGAACTA-3' ( セ ン ス 鎖）（配列番 号 10) お よ び 5' -GTGCTGGACTGCTGGAAAGT-3' (アンチセンス鎖）（配列番号 11)であった。そのセン スオリゴヌクレオチドプライマーは、 ヒ ト Δ Νρ73 ゲノム配列とマウス Δ ΝΡ73 cDNA (受け入れ番号 Y19235)とに共通して見出される同様の配列に基づいて設計 された。 増幅した産物を pGEM- T Easy vector (Promega)にサブクローンして、 pGEM- ΔΝρ73を得た。 この構築体のアイデンティティ一は、 DNAシークェンスで確 認した。 pGEM- ANp73を部分的に Nanrlで消化し、 平滑末端化して、 Nanrlでさら に完全に消化し。 NH2末端領域の制限酵素消化断片を PCDNA3- HA- Ρ73 α または pcDNA3-HA-p73 の酵素的に修飾した Kpnl- Nanrl部位にサブクローンして、それ ぞれ pcDNA3- Δ Νρ73ひ および pc丽 A3 - ΔΝΡ73 ]3 を得た。 アデノウイルス発現べク ターの構築のためには、 PcDNA3-p53、 pcDNA3- ΗΑ_ρ73 α、 pcDNA3- HA- ρ73 ]3、 また は pcDNA3- ΔΝρ73 αに由来する Hindlll - Xbal制限酵素消化断片をクレノウフラグ メントで補填して、シャトルベクター PHMCMV6 (Ozaki ら）の酵素的に修飾した Notl 部位に揷入した。各シャトルベクターを Ι-Ceulおよび PI- Seelで消化して、アデ ノウィルス発現ベクター pAdHM4の同一の制限酵素部位に連結した。 これらの糸且換 えアデノウィルス構築体の各々を Paclで消化し、 293細胞にトランスフエク トし て、 組換えアデノウイルス体を生成させた。
(免疫分析）
1 mMフエニノレメチノレス/レホニ/レフ口リ ドを含む EBCバッファー（50 raM Tris-HCl pH 8. 0/120 mM NaCl/0. 5% Nonidet P-40)中で、 細胞を溶解させた。 その溶解物を
4°C、 15分間、 14， OOOrpmで遠心分離して、清澄化した。タンパク質濃度は、 Bradford の手順で決定した。 免疫ブロット分析のために、 タンパク質を SDSポ.リアミ ドゲ ル電気泳動して、 分離し-トロセルロース膜にトランスファーした。 その膜フィ ルターを TBST (10 raM Tris-HCl pH 8. 0/150 raM NaCl/0. 1% T een 20)中の 5%粉末 ミルクで 1時間、室温でブロックした。その後、モノクローナル抗 HA (12CA5, Roche Molecular Biocnemicals) ^L体、モノクローナノレ p73 K (Ab - 1， Oncogene Research Products)抗体、またはモノクローナル抗 p53 (DO- 1， Oncogene Research Products) 抗体と 1時間、 室温でインキュベートした。 膜フィルターをホースラデイシュぺ ルォキシダーゼにコンジュゲートされたャギ抗マウス二次抗体と 1時間、 室温で インキュベートした。 結合した二次抗体を製造者のプロトコルに従って、 増強さ れた化学発光（ECL， Amersham Pharmacia Biotech)によって検出した。 (免疫沈降法）
293細胞または C0S7細胞を上記の発現プラスミド 2 i gでトランスフエタトし た。 トランスフエクシヨンの 48時間後、 細胞を EBCバッファ一 400 μ 1中で細胞 溶解し、 短時間超音波処理し、 4°C、 15分間、 14，000rPmで遠心分離して、 細胞残 滓を取り除いた。 清澄化の後で、 全細胞溶解物 400 ix g をポリクローナル抗 HA (Medical and Biological Laboratories)抗体、 またはポリクローナノレ抗 p53 (D0-1および PAW801, Oncogene Research Products)抗体の混合物とインキュ ペートすることによって、 免疫沈降を実施した。 免疫複合体をプロテイン Aまた はプロテイン Gセファローズ'ビーズと沈殿させた。 その免疫沈降物を EBCバッ ファーで 3回洗浄した。
(ΔΝρ73プロモーター領域のクローニング）
ΔΝρ73ェキソン 3，を含む ΔΝρ73プロモーター領域を PACクローン（dJ363Hll) とプライマー 5' -CCAGGGAGGATCTGTAGCTG-3' (センス鎖）（配列番号 12)および 5' -TGAACCCTACACTGCAGCAA-3' (アンチセンス鎖）（配列番号 13)を用いて、 RT - PCR により増幅した。 増幅した PCR産物（2.9 Kb)を pGEM-T Easy vector (Promega)に 直接クローニングして、 pGEM_ANp73を得た。 この構築物の配列は、 DNAシークェ ンスで確認した。'一連の 5 欠失構築体を生成させる.ために、 その 2.9,Kb断片を pGL2 -べ一シックノレシフェラーゼ■レポーター（Promega)の酵素的に修飾した Xhol 位にサブクローユングして、 pGL2- Δ Np73PFを得た。 pGL2- Δ Np73PFを Smal、 Ncol、 または Stulで消化し、 平滑末端化し、 自己連結させて、 pGL2- ΔΝΡ73Ρ(_1082)、 pGL2-ANp73P(-911),または pGL2_ANp73P(- 63)をそれぞれ生成させた。さらに、 PGL2-ANp73PFを部分的に Apalで消化し、 制限酵素消化断片の各々を回収して、 平滑末端化し、 自己連結させて、 pGL2- ANp73PF(- 1245)、 pGL2- ANP73PF(-786)、 GL2-ANp73P (-619)、および PGL2- ΔΝρ73Ρ(- 203)を生成させた。 ΔΝρ73Ρ (- 184)、 ΔΝρ73Ρ (-100)、 ΔΝρ73Ρ(-80)、 ΔΝρ73Ρ(- 76)、 ΔΝρ73Ρ(- 71)、 ΔΝρ73Ρ(- 66)、 または ΔΝρ73Ρ(+1)を生成させるために、 pGEM - ΔΝρ73Ρをテンプレートとして用 レ、、 対応する領域を PCRで増幅した。 得られた PCR産物を PGL2 -ベーシックノレシ フェラーゼ'レポーターの Smal位にサブクローエングして、これらの構築体の塩 基配列をシークェンスで確認した。
(電気泳動移動度シフトアツセィ）
製造者の指示書に従い、 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System
(Pr omega)を用いて、 p73 α、 p73 3、 または p53をインビトロで生成させた。 電気 泳動移動度シフトアツセィは、 以前に報告されたように（Ozaki ら）実施した。 簡 単には、 2本鎖ォリゴヌクレオチドを T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、 32P 標識した。 網状赤血球溶解液 4 1、 12. 5 raM Tris-HCl (pH7. 5)、 50 niM KC1、 3. 125 raM MgCl2、 0. 25 mM EDTA、 0. 5 mM DTTヽ 5%グリセロール、 100 μ g/mlポリ（dl - dC) を含む反応液中、 室温で DNA タンパク質結合を実施した。 その反応混合物を lxTris-ホゥ酸塩- EDTAバッファ一中、 5%ポリアタリルァミドゲル上、室温で分離 した。
(ノレシフェラーゼ■ レポ一ターアツセィ）
/レシフェラーゼ ' レポーターアツセィのために、 SA0S- 2細胞 （p53のホモ接合 欠失）をトランスフエクシヨンの 24時間前に 12ゥエルプレート（5xl04細胞/ゥェ , · ノレ）に 3重に接種した。 ΔΝΡ73 α· .または ΔΝρ73 ]3 の存在、.或いは不在下、 200 ng のレポータープラスミ ド、 20 ngの pRL-TKをコ一ドする Renillaルシフェラーゼ cDNA、 200 ngの発現プラスミド（ρ53、 ρ73 α または ρ73 ]3 )で細胞を共トランスフ ェクトさせた。 トランスフエタトされた DNAの全量を pcDNA3 (Invitrogen)で一定 量に保つた。 トランスフエクシヨンの 48時間後、ルシフェラーゼ活性を二重ルシ フェラーゼ'レポ一ターアツセィシステム（Promega)によって測定した。 トランス フエクション率を Renillaルシフェラーゼ活性に対して標準化した。
(MTT生存アツセィ)
ウィルス感染の 24時間前に、 SH- SY5Yおよび SK- N- BE細胞を 96ゥエルプレー ト（5xl03、 2xl04細胞/ゥエルでそれぞれ）に接種した。 それら細胞を Ad- lacZまた は Ad_p73o; を用いて、 所定の M0Iで、 所定時間、 感染させた。 細胞生存率を MTT アツセィによって測定した。 ここで、 （2_(2-メトキシ- 4-ニトロフエ二ル)- 3- (4- 二トロフエニル） -5- (2， 4-ジスルホフェニル） - 2H -テトラゾリゥムモノナトリゥム 塩を基質として使用した。
(実施例 1 ) 神経芽細胞腫細胞でのシスプラチンによる P 7 3および ΔΝρ 7
3の発現誘導
神経芽細胞腫 SH-SY5Y細胞をシスプラチンの存在下 (0， 5, 10, 25 μΜの濃度）、 24時間培養した。 ΜΤΤアツセィにより、 生存細胞数を求めると、 シスプラチンの 用量に依存して、 生存細胞の減少が認められた。 データーを図 1に示すが、 これ は 3回の実験の平均値（土標準偏差）である。 同時に、 sub- G1 DNA量を有する細胞 の数も計数した。 これらのデーターも図 1に示す。
次に、 SH- SY5Y細胞をシスプラチンの存在下（0, 10, 25 μΜの濃度）、 36時間 培養した。 各培養物から全細胞タンパク質 (40 ^g)を抽出した。 p73o!または p53 の発現レベルを各々について、 p73ひ 特異的抗体（Ab- 1)または p53 特異的抗体 (DO- 1)を使用する免疫プロット分析 （上記） によって決定した。 結果を図 2に示 す。 サイズマーカーを図の左側に示す。 「*」 印は、 ρ73α特異的抗体で認識され る ρ73ο; より移動度の早いバンドであり、 ΔΝρ73ひ の推定分子量（62kDaPozniak ら）と一致する。
そこで、 同様に SH- SY5Y細胞をシスプラチンの存在下（0, 1, 2， 5, 10， 25 μΜ の濃度）、 24時間培養した。 培養後、 トータル RNAを調製して、 半定量的 RT- PCR を実施した （上記）。 PCRの反応液を 2.5%ァガロースゲル上で電気泳動した。 結果 を図 3に示す。図中、 GAPDHの発現が対照として示されている。図 3の結果から、 Δ Np73 aの発現がシスプラチンの用量に依存して増加することが分かる。
(実施例 2 ) υ 73 による ΔΝΡ 7 3の発現誘導
SH-SY5Y細胞を lacZ (Ad-lacZ)、 p53 (Ad-p53)、または HA- p73 a (Ad-p73 a )を発 現する組換えアデノウイルスで感染させた（MIO: 10)。 感染の 36時間後、 全細胞 溶解物 (40 /ig)を調製し、 抗 ρ73α抗体、 または抗 ρ53抗体を用いて、 ゥエスタ ンブロットを行った。 結果を図 4に示す。 図中、 レーン 1は、 Ad- lacZ に、 レー ン 2は、 Ad - p53に、 レーン 3は、 Ad - ρ73α に対応する。 図から明らかなように、 HA-p73 a の発現は、 ΔΝρ73の発現を誘導するが、 ρ53の発現は、 発現誘導を起こ さない。
同様に、 SH- SY5Y 細胞 を lacZ(Ad- lacZ) 、 p53(Ad- p53) 、 ま た は HA-p73 a (Ad- p73 a )を発現する組換えアデノウィルスで感染させた（MI0: 10)。感 染の 24時間後、 トータル RNA(20 g)を調製し、 今度は ΔΝΡ73特異的プローブ を用いて、 ノーザンブロットを行った。 臭化工チジゥムの染色の結果を図 5に示 す。図中、 レーン 1は、 Ad- lacZに、レーン 2は、 Ad_p53に、レーン 3は、 Ad_p73 a に対応する。 ここでも、 レーン 3で ΔΝρ73の発現の誘導が確認された。
さらに、 前記のアデノウィルスに感染した（MI0: 10) SH-SY5Y、 SK_N-AS、 または SK - N- BE細胞からトータル腿を調製し、 RT- PCR (上記） を行った。 結果を図 6 に示す。 図中、 GAPDH の発現が対照として示されている。 やはり、 上記と同様な 結果が得られ、 ρ73ο;または ρ73]3 による ΔΝρ73の発現の誘導が明らかである。 すべての試験結果は、 ρ73α力 S ΔΝρ73αのアップレギュレーションを起こすこ とを示している。 ，.. ，， ，. ，
(実施例 3 ) ΔΝρ73プロモーター領域内の ρ73特異的結合配列の同定
(ノレシフェラーゼ . リポーターアツセィ）
アツセィ用の各種ルシフェラーゼリポーター構築体、 pGL2_ANp73P (- 2600)、
PGL2-ANp73P(-1245) 、 pGL2- ΔΝρ73Ρ(- 1082) 、 pGL2- ΔΝρ73Ρ (- 911) 、 pGL2-ANp73P (-786) 、 pGL2-ANp73P (-619) 、 pGL2- ΔΝρ73Ρ (-203) 、 pGL2-ANp73P (-184) 、 pGL2- ΔΝρ73Ρ(- 100) 、 pGL2- Δ Np73P (-80) 、 pGL2- Δ p73P (- 76)、 pGL2- Δ Np73P (-71)、 pGL2- Δ Np73P (-66)、 pGL2- Δ Np73P (-63) および pGL2_ANp73P(+l)を上記のように作製した。 これらの構築体の各々をルシ フェラーゼ ' リポーターアツセィ （上記） に使用し、 P73a と共発現させた。 ァ ッセィの結果を図 7に示す。 データーは、 少なくとも 3回の試験の平均値 （標準 偏差） である。 ェキソン 3，から上流 2. 6 kb配列を含む pGL2- Δ Νρ73Ρ (- 2600)は、 プロモーターのないベクターと比較して、 ルシフェラーゼの発現において約 90 倍の増加を示した。 この結果から、 -71 位までの欠失は、 ルシフェラーゼ活性を 著しく失活させることが明らかとなった。
図 8は、 Δ Νρ73プロモータ一領域の塩基配列を示す。 推定 ρ73結合部位には、 下線が施され、推定 TATAエレメントは囲まれている。図にはさらにコンセンサス p53標的配列と推定 P-73結合配列の配列比較が示されている。図中、 Rはプリン、 Yはピリミジン、そして Wはアデニンかチミジンを表す。 2個のミスマッチは、小 文字（c, g)で示されている。
推定 P73結合部位が Δ Νρ73プロモーターの活性化に不可欠であると考えられた ので、 この 20bpの配列（5' -GGGCAAGCTGAGGCCTGCCC-3' ) (配列番号 1)を前記ノレシフ エラーゼプラスミ ド pGL2 プロモーターの上流域にサブクローニングして、 PGL2- A Np73P (-76/-57) を得た。 200 ng の レポー タ ープラ ス ミ ド pGL2- A Np73P (- 100)、 または pGL2_ A Np73P (- 76/- 57)、 20 ngの pRL- TKをコード する Renil laルシフェラーゼ cDNA、 100 n の発現プラスミド（p53、p63 y、HA- p73 または HA- ρ73 β )で SA0S - 2細胞を共トランスフエクトさせた. 上記）。 -ル,、ンフ.ェ ラーゼ活性を測定したデーターを図 9 (pGL2 - Δ Νρ73Ρ (-100) )および図 10 (pGL2_ A NP73P (- 76/- 57) )に示す。 データーは、 平均値 （標準偏差） である。 図 に示す結果は、 予想通り p73 a および ρ73 β が pGL2_ Δ Νρ73Ρ (-7Θ/-57)のルシフ エラーゼ発現において著しい増加をもたらしたことを示している。 ともに、 ρ53 および ρ63 γ は、 増加の程度が低い。 従って、 Δ Νρ73プロモーターの ρ73特異的 活性化にこの 20bpの配列からなる P73結合エレメントが関与していることが分か つた。
(電気泳動移動度アツセィ）
配列特異的な競合 DMおよび配列非特異的な競合 DNAを用いて、さらに前記 p73 特異的結合配列をプロックし、 該配列で表される p73結合エレメントの関与を確 認した。この p73特異的結合配列を含む 61bpのオリゴヌクレオチドフラグメント (5， -GTGCGGTCCAACACATCACCGGGCAAGCTGAGGCCTGCCCCGGACTTGGATGAATACTCAT-3' ) (配 列番号 13)を [ γ 32Ρ] ΑΤΡで標識して、 インビトロトランスレーシヨンした Ρ53 (図 11のレーン 2)、 HA-p73 a (レーン 3〜7)、 ΗΑ-ρ73 β (レーン 8〜12)、 プログラムさ れていない網状赤血球溶解液（レーン 1)と共にインキュベートした。 結果を図 11 に示す。図中、レーン 4およびレーン 9は、 10倍モル過剰の配列特異的な競合 DNA を含んでいた結合反応の結果である。 レーン 5およびレーン 10は、 10倍モル過 剰の酉 S列非特異的な競合 DNAを含んでいた結合反応の結果である。 配列非特異的 な競合 DNAとは、前記 ρ73特異的結合配列の 5' -または 3' -末端部分のみを含むも ので、後述の図 12に示す C1および C3である。タンパク質 D N Α複合体をスーパ ーシフトさせるために、 抗 1-IA抗体を反応混合物に加えた（レーン 6および 11)。 前免疫血清をネガティブコントロールに使用した（レーン 7および 12)。 タンパク 質 D NA複合体およびスーパーシフトした複合体をそれぞれ、 鏃印 （塗った、 ま たは空白） で示す。 p73ひ および ρ73 ]3 は、 共に前記オリゴヌクレオチドフラグ メントに特異的に結合した。
さらに、 インビトロ トランスレーションした ΗΑ-ρ73 ;3 (レーン 2〜10)またはプ ログラムされていない網状赤血球溶解液（レーン 1)を含む反応液を同様に、 電気 泳動移動度アツセィにかけた。結果を図 12に示す。使用した標識されていない競 合オリゴヌクレオチドの配列を図に下部に示し、 その内 p73特異的結合配列を下 線で表している。 競合ォリゴヌクレオチド (DNA)は、 1または 10倍過剰で使用し た。 図の上部に傾斜で表している。 また、 タンパク質 DNA複合体の位置を鏃印で 表している。図から明らかなように、 p73特異的結合配列を全て有する C2競合 DNA は、 P73 3 -DNA複合体形成において効率的に競合した。 しカゝし、 C1競合 DNAおよ ぴ C3競合 DNAでは、 競合が失われた。 P73 /3 でも同様な結果が得られた （図示せ ず)。 これらのデーターから Δ Νρ73プロモーター内のこの塩基配列に ρ73が結合する ことによって、 ΔΝΡ73の転写を活性化することが明らかとなつた。
(実施例 4 ) ρ73と ΔΝρ73との相互作用
293細胞を各種努現プラスミ ド（ΗΑ - ρ73α、 ΗΑ-ρ73 β , FLAG- ΔΝρ73 、 および FLAG- Δ Νρ73 ）の 1種または 2種で一過的にトランスフエクトした。 全細胞溶解 物を抗 ΗΑ抗体で免疫沈降させた （上記)。 沈殿したタンパク質を抗 FLAG Μ2抗体 で免疫プロット分析した。 結果を図 13に示す。 図中、 ΔΝρ73αおよび ΔΝρ73)3 は、 それぞれ鏃印 （塗った、 または空白） で示される。 ΔΝΡ73の両イソフォーム が p73(¾および ρ73/3 と相互作用することが明らかとなった。
C0S7細胞を各種発現プラスミ ド（p53、 FLAG - Νρ73および FLAG- Νρ73 )3 )の 1種ま たは 2種で一過的にトランスフエクトした。 トランスフエクシヨン 48時間後、全 細胞溶解物を調製し、 抗 p53(D0 - 1/Pabl801)と免疫沈降させ、 続いて抗- FLAG M2 抗体で免疫プロット分析した。結果を図 14に示す。図中、 ΔΝΡ73 αおよび ΔΝΡ73 β は、 それぞれ鏃印 （塗った、 または空白） で示される。 ρ53も ρ73αおよび Ρ73)3 と相互作用することが明らかとなった。
次に、 ρ73と ΔΝρ73の相互作用をルシフェラーゼ'レポーターアツセィ （上記） で確認した。 SA0S- 2細胞を各種発現プラスミド（ρ53、 ρ73α、 ρ73 ]3、 ΔΝρ73αΝ および ΔΝρ73;3)の 1種または 2種と、 MDM2プロモーターを含むレポータープラ スミ ドとともに共トランスフエタトした。 トランスフエクションの 48時間後、ノレ シフェラーゼアツセィにかけた。 結果を図 15に示す。 データーは、 平均値（標準 偏差） を表す。
同様に、 SA0S - 2細胞を各種発現プラスミド（ρ53、 ρ73α、 ρ73 /3、 ΔΝρ73ひ、 お よび ΔΝρ73 )と、 Baxプロモーターを含むレポータープラスミドとともに共トラ ンスフエタ トした。 トランスフエクションの 48時間後、ルシフェラーゼァッセィ にかけた。 結果を図 16に示す。 データーは、 平均値 （標準偏差） を表す。 図 15 およぴ図 16のデーターから ρ73α または ρ73]3 に誘導される MDM2プロモーター および Baxプロモータ一の転写活性は、 Δ Np73 a または Δ Νρ73 β によつて減少 させられることが分かる。
さらに、 SA0S- 2細胞を各種発現プラスミ ド（p53、 p73a p73 j3、 ΔΝρ73α、 お よび ΔΝρ73)3)の 1種または 2種と、 ΔΝρ73プロモーターを含むレポータープラ スミ ドとともに共トランスフエタ トした。 トランスフエクシヨンの 48時間後、ル シフェラーゼアツセィにかけた。 結果を図 17に示す。 データーは、平均値 （標準 偏差） を表す。 ΔΝρ73プロモーター活性は、 ΔΝΡ73ひ または ΔΝρ73]3 とともに ρ73α または ρ73]3 を共発現させると、 著しく減少することが分かる。
前記の結果は、 ρ73α タンパク質レベルを増加させると、 ΔΝρ73の発現レベル が用量依存的に減少する (データー示さず) という事実と一致する。
(実施例 5 ) ΔΝρ73による Ρ- 73またはシスプラチン誘導性アポトーシスの阻
SK - Ν - BE細胞（2χ104/ウエノレ）を Ad - p73o! (Μ0Ι:10)と Ad— ΔΝρ73ο; (0、 1、 2、 5、 10、 20 M0I)とで共感染させた。 感染 48時間後、 生存細胞数を ΜΤΤ生存アツセィ で測定した。 結果を図 18に示す。 グラフは、 対照の lacZによる感染と比較して の相対的な生存細胞の％ (6回の試験の平均値（土標準偏差値)）を表す。 ΔΝΡ73α のレベ^^が上昇すると、. ρ73ひ に誘発されるアポトーシスが減少することが分か る。
SH-SY5Y細胞（5χ103/ゥエル）を Ad-lacZまたは Ad - ΔΝρ73 α (ΜΟΙ: 10)で感染さ せた。 感染 6時間後、 その細胞をシスプラチン （0、 5、 10、 25μΜの濃度） で 24 時間、処理した。生存細胞数を ΜΤΤ生存アツセィで測定した。結果を図 19に示す。 グラフは、 6回の試験の平均値 （土標準偏差値） を表す。 さらに、 Ad - lacZまたは Ad - Δ Np73 a (共に M0I： 10)で感染させた細胞を 25 μ Mシスプラチンと処理 24時間 後、 写真撮影したものを図中に示す。 SH- 細胞のシスブラチン誘導性アポト 一シスが ΔΝΡ73ひ感染によって阻害されることが明らかとなった。
(引用文献） 1. Kaghad, M.， Bonnet, H.， Yang, A.， Creancier, L. , Biscan, J. C.， Valent, A.， Minty, A.， Chalon, P.， Lelias, J. M.， Dumont, X. , Ferrara, P. , MeKeon, F. & Caput, D. (1997) Cell 90, 809-8 19.
2. De Laurenzi, V.， Costanzo, A. , Barcaroli, D.， Terrinoni, A. , Falco, M.， Annicehiarico-Petruzzelli, M.， Leyrero, M. & Melino, G. (1998) J. Exp. Med.
188， 1763-1768.
3. De Laurenzi, V. , Catani, M. , Costanzo, A. , Terrinoni, A. , Corazzari, M.， Levrero, M. , Knight, R. & Melino, G. (1999) Cell Death Differ. 6, 389-390.
4. Jost, C.， Mann, M. & Kaelin, . Gつ Jr. (1997) Nature 389， 19 1-194. 5. Schwab, M.， Prarni, C. & Amleir, L. C. (1996) Genes Chromosomes Cancer 16,
211-229.
6. Ikawa, S. , Nakagawara, A. & Ikawa, Y (1999) Cell Death Dffer. 6, 1154 - 1161.
7. Lissy, N. A.， Davis, P. K.， Irwin, M.， Kaelin, W. G. ： & Dowdy, S. F. (2000) Nature 407, 642 - 645. 21.
8. Marin, M. C. , Jost, C. A.， Irwin, M. S.， DeCaprio, J. A.， Caput, D. & Kaelin,
W. G. Jr. (1998) Mci. Cell. Bid. 18， 6316-6324.
9. Higashino, F. , Pipas, J. M. & Shenk, T. (1998) . Proc.. Nati. Acad. Sci. USA 95, 15683-15687.
10. Steegenga, W. T.， Shyarts, A. , Riteco, N.， Bos, J. L. & Jochemsen, A. G. (1999) Mel. Cell. Bid. 19， 3 885—3894.
11. Haupt, Y. , Maya, R. , Kazaz, A. & Oren, M. (1997) Nature 387, 296-299.
12. Zeng, X. , Chen, L. , Jost, C. A. , Maya, R. , Keller, D. , Wang, X.， Kaelin, W. G. Jr.， Oren, M.， Chen, J. & Lu， H. (1999) Mel. Cell. Bid. 19, 3257-3266.
13. Zaika, A. I.， Kovalev, S. , Marchenko, N. & Moll, U. M. (1999) Cancer Res. 59, 3257-3263.
14. Chen, C. L.， Ip， S. M.， Cheng, D. , Wong, L. C. & Ngan， H. Y. (2000) Clin. Cancer Res. 6, 3910-3915.
15. Irwin, M.， Mar, M. C. , Phillips, A. C.， Seelan, R. S. , Smith, D. I. , Liu, W.， Flores, E, R. , Tsai, K. Y.， Jacks, T. , Vousden, K. H. & Kaclin, W. G. Jr. (2000) Nature 407, 645-648.
16. Stiewe, T. & Putzer, B. M. (2000) Nat. Genet. 26， 464-469.
17. Zaika, A. , Irwin, M. , Sansome, C. & Moll, U. M. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11310-11316.
18. Pozniak, C. D. , Radinovic, S.， Yang, A. , McKeon, F.， Kaplan, D. R. & Miller, F. D. (2000) Science 289, 304—306.
19. Ozaki, T.， Naka， M. , Takada, N.， Tada, M.， Sakiyama, S. & Nakagawara, A. (1999) Cancer Res. 59, 5902-5 907.
産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明に従えば、 Δ Ν ρ 7 3プロモーターの機能が解明 され、 該プロモーターの活性を制御することにより ρ 7 3アポトーシス活性を調 節できるようになった。 この; 7 3アポトーシス活性を利用して、 腫瘍細胞のァ ポトーシスを促進させ、 抗腫瘍効果を達成できる。
.また、 本発明により、 Ρ 7 3による腫瘍細胞のアポトーシス調節剤をスクリ一 ニングすることが可能となった。このようなアポトーシス調節剤は、腫瘍（特に、 悪性腫瘍） の遺伝子治療を含む化学療法に有用である。

Claims

請求の範囲
1. ΔΝρ 73とのへテロオリゴマー形成を利用することよりなる、 ρ 73の アポトーシス誘導調節剤。
2. ΔΝρ 73とのへテロオリゴマー形成を利用することよりなる、 ρ 53の アポトーシス誘導調節剤。
3. 配列番号 1に記載の塩基配列を利用することよりなるアポトーシス誘導調 節剤。
4. 配列番号 1に記載の塩基配列にハイブリダイズする塩基配列を含む核酸か らなるアポトーシス誘導調節剤。
5. ρ 73遺伝子および ΔΝρ 73遺伝子からなる ρ 53および ρ 73の転写 活性調節剤。
6. 配列番号 1に記載の塩基配列を有する核酸を使用する、 腫瘍細胞における アポトーシス調節剤のスクリーユング方法。
7. 請求項 6に記載のスクリーニング方法によって得ることができる腫瘍細胞 のアポトーシス調節剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1739186A1 (en) * 2004-03-26 2007-01-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Method of screening compound capable of accelerating or inhibiting apoptosis, apoptosis accelerator and apoptosis inhibitor

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WO2008045344A2 (en) * 2006-10-06 2008-04-17 The General Hospital Corporation Methods to determine responsiveness to cisplatin treatment

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOTTLIEB TANYA M. ET AL.: "p53 and apoptosis", SEMINARS IN CANCER BIOLOGY, vol. 8, 1998, pages 359 - 368, XP002968460 *
KAGHAD MOURAD ET AL.: "Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers", CELL, vol. 90, no. 4, 22 August 1997 (1997-08-22), pages 809 - 819, XP002934937 *
POZNIAC CHRISTINE D. ET AL.: "An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death", SCIENCE, vol. 289, no. 5477, 14 July 2000 (2000-07-14), pages 304 - 306, XP002243996 *
TAKADA NAOYUKI ET AL.: "Identification of a transactivation activity in the COOH-terminal region of p73 which is impaired in the naturally occurring mutants found in human neuroblastomas", CANCER RESEARCH, vol. 59, no. 12, 15 June 1999 (1999-06-15), pages 2810 - 2814, XP002968461 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1739186A1 (en) * 2004-03-26 2007-01-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Method of screening compound capable of accelerating or inhibiting apoptosis, apoptosis accelerator and apoptosis inhibitor
EP1739186A4 (en) * 2004-03-26 2008-03-12 Hisamitsu Pharmaceutical Co METHOD OF SCREENING A COMPOUND CAPABLE OF ACCELERATING OR INHIBITING APOPTOSIS, APOPTOSIS ACCELERATOR AND APOPTOSIS INHIBITOR

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