WO2003046052A1 - Sonde electroactive comportant un agent chelatant et un ion metallique - Google Patents

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WO2003046052A1
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    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
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    • H01B1/12—Conductors or conductive bodies characterised by the conductive materials; Selection of materials as conductors mainly consisting of other non-metallic substances organic substances
    • H01B1/122—Ionic conductors

Definitions

  • Electroactive probe comprising a chelating agent and a metal ion
  • the invention relates to organic electrodes produced from electroactive polymers to which anti-ligands are bound, intended to interact specifically with ligands.
  • the specific interaction of the anti-ligand with the ligand results in a substantial and selective variation in the electrochemical properties of the electroactive polymer, such as a decrease in the electroactivity of said polymer.
  • This variation which depends on the concentration of grafted ligand, is observed, possibly measured, and directly correlated to the amount of ligand grafted.
  • One of the essential applications of this technique therefore lies in the detection, identification, and possibly the assay, of a ligand, present in a biological sample.
  • the aforementioned variation is of potentiometric type, such as a variation of the oxidation potential of the electroactive polymer before and after interaction, or of amperometric type, such as a variation of the oxidation or reduction current of the polymer before and after hybridization , determined at a determined potential.
  • a polypyrrole consisting of monomers each consisting of a pyrrole nucleus covalently substituted on the carbon in position 3 of the pyrrole nucleus, by a probe polynucleotide.
  • the polypyrrole thus obtained is applied to the detection, and optionally the determination, of ligands, in vitro or in vivo. To precisely characterize the electrochemical response of the polymer, it must have a high electroactivity.
  • chelating agents such as NTA (nitrilotriacetate) or IDA (iminodiacetate)
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • IDA was loaded with metal ions, such as Zn 2+ , Cu 2+ or Ni 2+ and was used to purify proteins or peptides.
  • Metals have specific oxidation potentials, which are characteristic and allow their detection and metering by electrochemistry.
  • the conventional analysis by electrochemistry in solution of a medium containing metal ions makes it possible to detect quantities of ions of the order of 10 "5 moles per liter.
  • the detection limit of a complexing device is dependent on the amount of complexing agent used.
  • One of the possible solutions for lowering the detection limit consists in confining ionic species on the measurement electrode, by means of the fixing of chelating agents on the electrode. .
  • a first object of the invention is an electroactive complex, constituted by a homopolymer or electroactive copolymer polymer of at least two monomers, functionalized by a chelating agent complexed with a metal ion, an anti-ligand and a ligand having specifically interacted with said anti-ligand.
  • anti-ligand and "ligand” refer equally to biological molecules such as polynucleotides or peptides, but also to chemical molecules.
  • the anti-ligand is capable of interacting specifically with the ligand to form a ligand / anti-ligand conjugate.
  • conjugates mention may be made of any reversible peptide / antibody, antibody / hapten, hormone / receptor, polynucleotide / polynucleotide, polynucleotide / nucleic acid and the like pair.
  • polynucleotide designates a sequence of at least five nucleotides (deoxyribonucleotides or ribonucleotides), natural or modified, capable of hybridizing, under suitable conditions of hybridization, with a polynucleotide less partially complementary.
  • modified nucleotides is meant, for example, a nucleotide comprising a modified base and / or comprising a modification at the level of the intemucleotide bond and / or at the level of the skeleton.
  • modified bases examples include pinosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine and bromo-5-deoxyuridine.
  • modified intemucleotide bond mention may be made of the phosphorothioate, H-phosphonate and alkyl-phosphonate bonds.
  • the alpha-oligonucleotides such as those described in FR-A-2 607 507 and the PNAs which are the subject of the article by M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992) 114, 1895-1897, are examples of polynucleotides consisting of nucleotides whose skeleton is modified.
  • peptide means in particular any chain of at least two amino acids, such as protein, protein fragment, oligopeptide, which has been extracted, separated, isolated or synthesized, such as a peptide obtained by chemical synthesis or by expression in a recombinant organism.
  • adrenocorticotropic hormones or their fragments angiotensin analogs and their inhibitors, natriuretic peptides, bradykinin and its peptide derivatives, chemotactic peptides, dynorphin and its derivatives, endorphins and their derivatives, encephalins and their derivatives, enzyme inhibitors, fibronectin fragments and their derivatives, gastrointestinal peptides, peptides opioids, oxytocin, vasopressin, vasotocin and their derivatives, protein kinases.
  • antibody defines any monoclonal or polyclonal antibody, any fragment of said antibody such as the Fab, Fab'2 or Fc fragments, as well as any antibody obtained by genetic modification or recombination.
  • graft refers to designate a relationship between two entities, without defining their chemical nature. It can thus be a weak bond or a covalent bond.
  • a linking group according to the invention connects, by covalent bond, two chemical entities, after interaction of said two entities, at least one having been previously activated or activatable, with a view to this interaction, by an activated or activatable group.
  • the linking group can therefore result from the reaction of said activated or activatable group of one entity to a reactive function of the other entity, and vice versa, or of the reaction of said activated or activatable group of one entity to another. said group activated or activatable by the other entity.
  • activated group is meant a group allowing, through it, the interaction of the entity on which it is fixed with another entity.
  • it may be an activated ester group such as the group -CO- [O-N-phthalimide].
  • activatable group includes a group which can be transformed into an activated group, for example under certain reaction conditions or during contact with an activated group capable of interacting with it.
  • the electroactive polymer of the invention is any electroactive polymer in water.
  • the metal ions as contained in the complex of the invention are ions capable of keeping a few sites available for complexing with the anti-ligand after their complexing with a chelating agent. These available sites are neutralized by water if there is no subsequent complexing, for example with said anti-ligand. Examples of metal ions that may be mentioned include cobalt, nickel, copper and mercury.
  • the chelating agents used in the invention are chelating agents which complex with the metal ion so that the complexation leaves ion coordination sites available for further complexation, in the present case with an anti-ligand.
  • NTA is a tetradentate chelating agent which is suitable for the purposes of the invention. Its complexation with a metal ion, such as copper or nickel, causes the occupation of four of the six coordination sites of said ion, which leaves two sites available for interacting with an antiligand. NTA binds metal ions more stably than other resins available for chelation.
  • IDA IDA
  • the chelating agent is also linked to the conductive polymer. This link is a link via a link group as defined above, and this covalently.
  • the ligand and the anti-ligand are biological or chemical molecules, as indicated above. They can be marked with a tracer capable of directly or indirectly generating a signal, according to techniques widely known to those skilled in the art, insofar as a detection complementary to the electrochemical detection is desired.
  • the anti-ligand can be linked to the metal ion via a binding intermediate whose property is to improve the binding of the anti-ligand to the metal ion.
  • a binding intermediate is histidine or one of its polymer derivatives such as polyhistidine.
  • the electroactive polymer is chosen from polypyrrole, polyacetylene, polyazine, poly (p-phenylene), poly (p-phenylene vinylene), polypyrene, polythiophene, polyethylenedioxythiophene, polyfuran, polyselenophene, polypyridazine, polycarbazole, polyaniline, double-stranded polynucleotides and / or the chelating agent is chosen from NTA and IDA and / or the metal ion is chosen from copper and mercury cations and / or the ligand and anti-ligand are biological molecules chosen in particular from polynucleotides and the polypeptides and / or the anti-ligand is linked to histidine or one of its polymer derivatives.
  • the electroactive polymer is a polypyrrole consisting of at least two monomers each consisting of a pyrrole nucleus.
  • the polypyrrole is a copolymer and comprises a monomer whose pyrrole nucleus is substituted by a group -CH 2 -COOH or -CH 2 -CH 2 OH.
  • Another object of the invention is an electroactive probe, consisting of a homopolymer or electroactive copolymer of at least two monomers, functionalized by a chelating agent complexed with a metal ion, and an anti-ligand capable of interacting specifically with a ligand.
  • the electroactive probe of the invention has the characteristics of polymer, metal ion, chelating agent and anti-ligand as indicated above for the complex of the invention.
  • the electropolymerization step is carried out using techniques well known to those skilled in the art. For example, it can be carried out by subjecting the monomers to variations in electrical potential sufficient to cause polymerization by successive oxidation and reduction; or by polymerization with current (chronopotentiometry) or potential (chronoamperometry) imposed.
  • the probes of the invention can be prepared by a process comprising the following steps: (a) there is available a homopolymer or copolymer polymer consisting of at least two monomers, at least one of which is substituted with an activated group,
  • a chelating agent is available in aqueous solution, and (c) the homopolymer or copolymer polymer is functionalized by the chelating agent by hydrolysis, d) the functionalized polymer is complexed with the chelating agent by contact with an aqueous solution of metal ions e) the anti-ligand is grafted by contact with the complexed polymer functionalized with the chelating agent and complexed with a metal ion by contact with an anti-ligand solution.
  • the polymer is a polypyrrole consisting of at least two pyrrole monomers, at least one of which is substituted in position 3 with an activated ester group.
  • the probes of the invention present diagnostic applications.
  • the invention also relates to a method for detecting a ligand in a biological sample, according to which said probe is brought into contact, under reaction conditions suitable for the specific ligand / anti-ligand interaction, and evidence or quantifying a potential difference or a current variation between the probe before contacting and the probe after contacting.
  • reaction conditions depend on the type of reaction involved.
  • the specific ligand / anti-ligand interaction is a hybridization.
  • Reaction conditions suitable for hybridization are widely known to those skilled in the art.
  • the specific ligand / anti-ligand interaction is that of, for example, an antigen-antibody reaction.
  • the conditions suitable for such detection are also widely known to those skilled in the art.
  • the anti-ligand is linked to histidine or one of its polymer derivatives.
  • the present invention also relates to an electrode of which all or part of the surface is coated with a probe defined above.
  • an electrode can be obtained by any conventional technique well known to those skilled in the art.
  • this preparation can be carried out by depositing a polymer of the invention on the surface of a platinum, gold, chromium or titanium electrode coated with gold, vitreous carbon or d a conductive oxide such as tin oxide or a mixed oxide of indium and tin.
  • Example 1 preparation of films based on electroconductive polymers.
  • the synthesis of the 3-carboxymethylpyrrole-NHP monomer was carried out by esterifying the carboxylic group of 3-pyrrole-acetic acid with N-hydroxyphthalimide and dicyclocarboxydiimide as catalyst, in chloroform as solvent, at room temperature.
  • the reaction scheme is presented below.
  • a solution of 0.1 M 3-carboxymethylpyrrole-NHP monomer is prepared in anhydrous acetonitrile freshly distilled in the presence of an electrolyte (LiC0 4 , 0.5 M).
  • This monomer is polymerized in a four-compartment cell, using a 0.7 cm 2 platinum electrode, a platinum auxiliary electrode and a saturated calomel electrode as reference electrode, with the controlled potential of 0.9 V to obtain Poly (3 carboxymethylpyrrole-NHP) film.
  • the film obtained is washed with acetone and dried.
  • the electroactivity is then measured in an acetonitrile medium containing 0.1 M LiCI0 4 as electrolyte after purging with argon to remove oxygen.
  • the cyclic voltammetry is recorded at the speed of 20 mV / s as shown in FIG. 1.
  • the electrode is washed with acetone and dried.
  • the electrode obtained is washed with ultrapure water, dried and the electroactivity is checked in an aqueous medium containing 0.5 M NaCl.
  • the electrochemical analysis is shown in Figure 2.
  • the electrochemical signal is stable and reversible in an aqueous medium.
  • Poly (3-carboxymethylpyrrole-NHP) films of different thicknesses were prepared and the films obtained were grafted with NTA.
  • the electrochemical response recorded in an aqueous medium in the presence of 0.5 M NaCl confirms the presence of an electrochemically active film in an aqueous medium.
  • the comparison of the charge of Poly (3-carboxymethylpyrrole-NHP) deposited at the start on the electrode and the calculated charge of NTA grafted on the film suggests that the grafting yield of NTA or IDA on the film of 100 %.
  • the quantity of NTA or IDA grafted onto the poly (3-carboxy) pyrrole film depends on the quantity of 3-carboxymethylpyrrole-NHP units present on the electrodes, as illustrated by the curves of Figure 3.
  • Example 3 Complexation of Poly (3-carboxymethylpyrrole-NTA) film with copper on electrode.
  • the electrode comprising the poly (3-carboxymethylpyrrole-NTA) film was electrochemically analyzed in an aqueous medium, washed with deionized water, dried and then it is immersed in an aqueous solution of CuCl 2 in the presence of NaCl 0, 5 M, at room temperature for 3 hours. The electrode is then rinsed in deionized water, dried and analyzed electrochemically in an aqueous solution containing 0.5M NaCl.
  • the electrodes comprising a polypyrrole-NTA / Cu 2+ film are washed with water, then dried and immersed in a PBS buffer solution of polyhistidine with a molecular weight of 6300 g in an equimolecular amount with the amount of copper complexed on the film of Polypyrrole- NTA containing NaCl for one hour at room temperature. After washing with a buffer solution, they are dried and then analyzed electrochemically in an aqueous solution containing 0.5 M of NaCl. It can be seen in the voltammogram illustrated by the curves in FIG. 5 that the copper signals are always present. Demonstration of the reversibility of grafting:
  • the electrodes comprising grafted polyhistidine obtained previously are treated by immersion in an aqueous solution of EDTA at room temperature for 15 minutes, rinsed and then dried.
  • the immobilized protein RH24 is a protein modified by the addition of 6 amino acids Histidine in the N-terminal position of the protein P24 naturally synthesized by Escherichia Coli with a theoretical molecular mass of 26,950 g.
  • the grafting is carried out by incubating 5 nmole of antigen for 3 hours at room temperature on the Cu 2+ / Polypyrrole-NTA film. They are then analyzed electrochemically in an aqueous solution containing 0.5 M NaCl.
  • the cyclic voltammetry is recorded at the speed of 20Mv / s. On the voltammogram represented in FIG. 7, a decrease in the signal linked to the complexation of the antigen is observed.
  • Example 6 Detection of an Antibody on a polypyrrole-NTA film complexed by Cu 2+ ions on which an antigen is immobilized.
  • Detection is carried out by immersion of the electrode comprising a polypyrrole-NTA film complexed by Cu 2+ ions on which an antigen is immobilized in a solution of 0.6 nmole of Antibody specific for the Antigen.

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Abstract

Sonde électroactive, constituée par un polymíre homopolymíre ou copolymíre électroactif d'au moins deux monomíres, fonctionnalisé par un agent chélatant complexé avec un ion métallique, un anti-ligand suceptible de réagir spécifiquement avec un ligand, procédé de préparation d'une telle sonde et procédé de détection d'un ligand dans un échantillon biologique la mettant en oeuvre.

Description

Sonde electroactive comportant un agent chélatant et un ion métallique
L'invention a trait aux électrodes organiques élaborées à partir de polymères électroactifs sur lesquels sont liés des anti-ligands destinés à interagir spécifiquement avec des ligands.
Dans les électrodes décrites dans l'art antérieur l'interaction spécifique de l'anti-ligand avec le ligand entraîne une variation sensible et sélective des propriétés électrochimiques du polymère électroactif, telle qu'une diminution de l'électroactivité dudit polymère. Cette variation, qui dépend de la concentration en ligand greffé, est observée, éventuellement mesurée, et directement corrélée à la quantité de ligand greffé. Une des applications essentielles de cette technique réside donc dans la détection, l'identification, et éventuellement le dosage, d'un ligand, présent dans un échantillon biologique.
La variation précitée est de type potentiométrique, telle qu'une variation du potentiel d'oxydation du polymère électroactif avant et après interaction, ou de type ampérométrique, telle qu'une variation du courant d'oxydation ou de réduction du polymère avant et après hybridation, déterminé à un potentiel déterminé.
Selon le document WO-A-95/29199, on connaît un polypyrrole, constitué par des monomères consistant chacun en un noyau pyrrole substitué de manière covalente sur le carbone en position 3 du noyau pyrrole, par un polynucléotide sonde.
Le polypyrrole ainsi obtenu est appliqué à la détection, et éventuellement le dosage, de ligands, in vitro ou in vivo. Pour caractériser précisément la réponse électrochimique du polymère, celui-ci doit présenter une forte électroactivité.
La capacité à lier des métaux d'agents chélatants tels que NTA (nitrilotriacétate) ou IDA (iminodiacétate) a déjà été étudiée avec des métaux bi- ou trivalents. Par exemple la chromatographie d'affinité par métal immobilisé (IMAC) a été utilisée pour purifier des protéines (Porath et al. (1975), Nature 258, 598-599) en utilisant l'IDA comme agent chélatant. L'IDA a été chargé avec des ions métalliques, tels que Zn2+, Cu2+ ou Ni2+ et a été utilisé pour purifier des protéines ou des peptides.
Les métaux ont des potentiels d'oxydation spécifiques, qui sont caractéristiques et permettent leur détection et leur dosage par électrochimie. Cependant l'analyse classique par électrochimie en solution d'un milieu contenant des ions métalliques permet de détecter des quantités d'ions de l'ordre de 10"5 moles par litre. Par ailleurs la limite de détection d'un dispositif de complexation est dépendante de la quantité d'agent complexant utilisé. Une des solutions possibles pour abaisser la limite de détection consiste en le confinement d'espèces ioniques sur l'électrode de mesure, par l'intermédiaire de la fixation d'agents chélatants sur l'électrode.
La fixation d'agents chélatants en grand nombre sur une électrode n'est cependant pas aisée, car les agents chélatants classiques comme l'EDTA, ne peuvent pas être déposés sur des électrodes en couche supérieures à des couches monomoléculaires, sous peine d'empêcher la conduction du courant et de nuire à la sensibilité et la fiabilité de la détection car seuls des dépôts de quelques Angstrόms sont conducteurs et ils ne permettent donc pas le confinement recherché. La Demanderesse a trouvé de façon surprenante que l'utilisation d'un polymère conducteur comme support de ces agents chélatants permet de conserver, même pour des dépôts relativement importants, de l'ordre de la centaine de micromètres, la continuité de la conduction et donc d'abaisser la limite de détection à des seuils de l'ordre de 10"9 à 10"10 molécules par cm2. Cette continuité de détection est obtenue grâce à la structure tridimensionnelle des polymères conducteurs sur lesquels, sont fixés les agents chélatants.
Ces polymères conducteurs sur lesquels sont fixés des agents chélatants lorsque des ions métalliques sont complexés permettent donc d'obtenir des réponses électrochimiques facilement caractérisables.
Ainsi, un premier objet de l'invention est un complexe électroactif, constitué par un polymère homopolymère ou copolymère électroactif d'au moins deux monomères, fonctionnalisé par un agent chélatant complexé avec un ion métallique, un anti-ligand et un ligand ayant spécifiquement interagi avec ledit anti-ligand.
Avant de détailler l'invention, certains termes employés dans la description et les revendications sont ci-après définis.
Les termes « anti-ligand » et « ligand » font indifféremment référence à des molécules biologiques telles que des polynucléotides ou des peptides, mais aussi à des molécules chimiques. L'anti-ligand est susceptible d'interagir spécifiquement avec le ligand pour former un conjugué ligand / anti-ligand. A titre d'exemples de conjugués, on peut citer tout couple réversible peptide / anticorps, anticorps / haptène, hormone / récepteur, polynucléotide / polynucléotide, polynucléotide / acide nucléique et analogues.
Le terme « polynucléotide » tel qu'employé selon l'invention désigne un enchaînement d'au moins cinq nucleotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides), naturels ou modifiés, susceptible de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un polynucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucleotides modifiés, on entend par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison intemucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de bases modifiées, on peut citer Pinosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthyIamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6- purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison intemucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, H-phosphonate et alkyl-phosphonate. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507 et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992) 114, 1895-1897, sont des exemples de polynucléotides constitués de nucleotides dont le squelette est modifié.
Le terme « peptide » signifie notamment tout enchaînement d'au moins deux acides aminés, tels que protéine, fragment de protéine, oligopeptide, qui a été extrait, séparé, isolé ou synthétisé, comme un peptide obtenu par synthèse chimique ou par expression dans un organisme recombinant. Sont inclus aussi, tout peptide dans la séquence duquel un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un ou plusieurs acides aminés de la série D, et vice-versa ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH est remplacée par une liaison NH-CO ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH est remplacée par une liaison NH-CO, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu'il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs dites liaisons CO-NH, étant soit conservée, soit inversée par rapport aux résidus aminoacyles constituant un peptide de référence (ou immunorétroïdes) ; et tout mimotope.
Pour illustrer les diverses classes des peptides concernés, on peut mentionner les hormones adrénocorticotropiques ou leurs fragments, les analogues d'angiotensine et leurs inhibiteurs, les peptides natriurétiques, la bradykinine et ses dérivés peptidiques, les peptides chimiotactiques, la dynorphine et ses dérivés, les endorphines et leurs dérivés, les encéphalines et leurs dérivés, les inhibiteurs d'enzymes, les fragments de fibronectine et leurs dérivés, les peptides gastro-intestinaux, les peptide opioïdes, l'oxytocine, la vasopressine, la vasotocine et leurs dérivés, les protéines kinase.
Le terme « anticorps » définit tout anticorps monoclonal ou polyclonal, tout fragment dudit anticorps tel que les fragments Fab, Fab'2 ou Fc, ainsi que tout anticorps obtenu par modification ou recombinaison génétique. Les termes « greffer », « lier » et « fixer » en l'absence de toute indication, sont indifféremment employés dans le présent texte pour désigner une relation entre deux entités, sans en définir la nature chimique. Il peut ainsi s'agir d'une liaison faible ou d'une liaison covalente.
Un groupe de liaison selon l'invention relie, par liaison covalente, deux entités chimiques, après interaction desdites deux entités, l'une au moins ayant été au préalable activée ou activable, en vue de cette interaction, par un groupe activé ou activable. Le groupe de liaison peut donc résulter de la réaction dudit groupe activé ou activable d'une entité sur une fonction réactive de l'autre entité, et vice-versa, ou de la réaction dudit groupe activé ou activable d'une entité sur un autre dit groupe activé ou activable de l'autre entité.
Par groupe activé, on entend un groupe permettant, par son intermédiaire, l'interaction de l'entité sur lequel il est fixé avec une autre entité. A titre d'exemple, il peut s'agir d'un groupe ester activé tel que le groupe -CO- [O-N-phtalimide]. Par groupe activable, on comprend un groupe qui peut être transformé en un groupe activé, par exemple dans certaines conditions réactionnelles ou lors de la mise en contact avec un groupe activé susceptible d'interagir avec lui.
Le polymère électroactif de l'invention est tout polymère électroactif dans l'eau.
Les ions métalliques tels que contenus dans le complexe de l'invention sont des ions capables de garder quelques sites disponibles pour une complexation à l'anti-ligand après leur complexation avec un agent chélatant. Ces sites disponibles sont neutralisés par l'eau s'il n'y a pas de complexation ultérieure par exemple avec ledit anti-ligand. A titre d'exemples d'ion métallique, on peut citer le cobalt, le nickel, le cuivre et le mercure.
Les agents chélatants utilisés dans l'invention sont des agents chélatants se complexant avec l'ion métallique de telle sorte que la complexation laisse des sites de coordination de l'ion disponibles pour une complexation ulltérieure, dans le cas présent avec un anti-ligand.
Ainsi, le NTA est un agent chélatant tétradentate qui convient aux fins de l'invention. Sa complexation avec un ion métallique, tel que le cuivre ou le nickel, entraîne l'occupation de quatre des six sites de coordination dudit ion, ce qui laisse deux sites disponibles pour interagir avec un antiligand. Le NTA lie les ions métalliques de manière plus stable que d'autres résines disponibles pour la chélation.
Un autre exemple d'agent chélatant convenant aux fins de l'invention est l'IDA, lequel possède trois sites disponibles pour la chélation. Outre sa liaison avec l'ion métallique, l'agent chélatant est également lié au polymère conducteur. Cette liaison est une liaison par l'intermédiaire d'un groupe de liaison tel que défini précédemment, et ce de manière covalente.
Le ligand et l'anti-ligand sont des molécules biologiques ou chimiques, comme indiqué précédemment. Ils peuvent être marqués par un traceur susceptible de générer directement ou indirectement un signal, selon des techniques largement connues de l'homme du métier, dans la mesure où on souhaite une détection complémentaire à la détection électrochimique.
L'anti-ligand peut être lié à l'ion métallique via un intermédiaire de liaison dont la propriété est d'améliorer la liaison de l'anti-ligand à l'ion métallique. Un exemple de tel intermédiaire est l'histidine ou un de ses dérivés polymères tels que la polyhistidine.
Le complexe de l'invention tel que défini précédemment répond avantageusement aux caractéristiques suivantes considérées seules ou en combinaison.
Le polymère électroactif est choisi parmi le polypyrrole, le polyacétylène, la polyazine, le poly(p-phénylène), le poly(p-phénylène vinylène), le polypyrène, le polythiophène, le polyéthylènedioxythiophène, le polyfurane, le polysélénophène, la polypyridazine, le polycarbazole, la polyaniline, les polynucléotides bicaténaires et/ou l'agent chélatant est choisi parmi le NTA et l'IDA et/ou, l'ion métallique est choisi parmi les cations de cuivre et de mercure et/ou le ligand et l'anti-ligand sont des molécules biologiques notamment choisies parmi les polynucléotides et les polypeptides et/ou l'anti-ligand est lié à l'histidine ou un de ses dérivés polymeres.Selon un complexe préféré de l'invention, le polymère électroactif est un polypyrrole constitué d'au moins deux monomères consistant chacun en un noyau pyrrole. Selon un mode de réalisation de ce complexe préféré, le polypyrrole est un copolymère et comprend un monomère dont le noyau pyrrole est substitué par un groupe -CH2-COOH ou -CH2-CH2OH.
Un autre objet de l'invention est une sonde electroactive, constituée par un polymère homopolymère ou copolymère électroactif d'au moins deux monomères, fonctionnalisé par un agent chélatant complexé avec un ion métallique, et un anti-ligand susceptible d'interagir spécifiquement avec un ligand. La sonde electroactive de l'invention possède les caractéristiques de polymère, ion métallique, agent chélatant et anti-ligand telles qu'indiquées précédemment pour le complexe de l'invention.
L'étape d'électropolymérisation est réalisée en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, elle peut être conduite en soumettant les monomères à des variations de potentiel électrique suffisantes pour provoquer la polymérisation par une oxydation et une réduction successives ; ou bien par polymérisation à courant (chronopotentiométrie) ou à potentiel (chronoampérométrie) imposés.
Les sondes de l'invention peuvent être préparées par un procédé comprenant les étapes suivantes : (a) on dispose d'un polymère homopolymère ou copolymère constitué par au moins deux monomères, dont au moins un est substitué avec un groupe activé,
(b) on dispose d'agent chélatant en solution aqueuse, et (c) on fonctionnalise le polymère homopolymère ou copolymère, par l'agent chélatant par hydrolyse, d) on complexe le polymère fonctionnalisé avec l'agent chélatant par contact avec une solution aqueuse d'ions métalliques e) on greffe l'anti-ligand par contact du polymère complexé fonctionnalisé avec l'agent chélatant et complexé avec un ion métallique par contact avec une solution d'anti-ligand.
Ce procédé constitue un autre objet de l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, le polymère est un polypyrrole constitué par au moins deux monomères pyrrole dont au moins un est substitué en position 3 avec un groupe ester activé. Les sondes de l'invention présentent des applications diagnostiques. Aussi, l'invention concerne encore un procédé de détection d'un ligand dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact ladite sonde, dans des conditions de réaction appropriées pour l'interaction spécifique ligand/anti-ligand, et on met en évidence ou on quantifie une différence de potentiel ou une variation de courant entre la sonde avant mise en contact et la sonde après mise en contact.
Les conditions de réaction appropriées dépendent du type de réaction concernée.
Ainsi, dans le cadre d'une détection d'un polynucléotide cible, l'interaction spécifique ligand/anti-ligand est une hybridation. Les conditions de réaction appropriées pour une hybridation sont largement connues de l'homme du métier.
Dans le cadre d'une détection d'un ligand protéique, l'interaction spécifique ligand/anti-ligand est celle par exemple d'une réaction antigène- anticorps. Les conditions appropriées pour une telle détection sont également largement connues de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation, l'anti-ligand est lié à l'histidine ou un de ses dérivés polymères.
La présente invention a aussi pour objet une électrode dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde définie précédemment. Une telle électrode peut être obtenue par toute technique classique bien connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, il peut être procédé à cette préparation en déposant un polymère de l'invention à la surface d'une électrode de platine, d'or, de chrome ou de titane recouvert d'or, de carbone vitreux ou d'un oxyde conducteur tel que l'oxyde d'étain ou un oxyde mixte d'étain et d'indium. Les différents objets de l'invention sont illustrés dans les exemples suivants qui font référence aux figures 1 à 8 annexées et desquels ressortiront leurs caractéristiques préférentielles et avantages.
Exemple 1 : préparation de films à base de polymères électroconducteurs.
Des monomères de pyrrole fonctionnalisés en position 3 par une N- hydroxyphthalimide (NHP) ont été synthétisés et ensuite polymérisés pour obtenir un film polymère Poly(3-(carboxymethylpyrrole)-NHP) portant des groupements ester actifs.
Synthèse du monomère :
La synthèse du monomère 3-carboxymethylpyrrole-NHP a été exécutée en estérifiant le groupement carboxylique de l'acide 3-pyrrole- acétique avec de la N-hydroxyphthalimide et du dicyclocarboxydiimide comme catalyseur, dans du chloroforme comme solvant, à température ambiante. Le schéma réactionnel est présenté ci-dessous.
Figure imgf000010_0001
Synthèse du polymère
Une solution de monomère 3-carboxymethylpyrrole-NHP 0,1 M est préparée dans de l'acétonitrile anhydre fraîchement distillé en présence d'un électrolyte (LiC04, 0,5 M). Ce monomère est polymérisé dans une cellule à quatre compartiments, en utilisant une électrode de platine de 0,7 cm2, une électrode auxiliaire de platine et une électrode de calomel saturée comme électrode de référence, au potentiel contrôlé de 0,9 V pour obtenir le film de Poly(3 carboxymethylpyrrole-NHP). Le film obtenu est lavé avec de l'acétone et séché. L'électroactivité est ensuite mesurée dans un milieu d'acétonitrile contenant LiCI04 0,1 M comme électrolyte après purge avec de l'argon pour enlever l'oxygène. La voltamétrie cyclique est enregistrée à la vitesse de 20 mV/s comme représentée à la figure 1. On obtient un signal électrochimique stable et réversible avec un pic d'oxydation Eox = 317 mV/SCE et confirmation de l'activité électrochimique en milieu organique. Après analyse, l'électrode est lavée avec de l'acétone et séchée.
Exemple 2 : greffage de l'acide imino-diacétique (IDA) ou de l'acide N-(5-amino-1 -carboxypentyl) imino-diacétique (NTA) sur des films polymères de Poly(3-carboxymethylpyrrole-NHP) conducteurs. Une fois le film de Poly(3-carboxymethylpyrrole-NHP) formé et analysé comme décrit dans l'exemple 1 , l'électrode est immergée dans une solution aqueuse saturée de NTA ou IDA, à température ambiante pendant 12 heures, lavée avec l'eau ultra pure, séchée. La synthèse de Poly(3- carboxymethylpyrrole-IDA) ou de Poly(3-carboxymethylpyrrole-NTA) est représentée ci-dessous :
Figure imgf000011_0001
PyHHP Poi ^y-NHP) My(Py-NTA)
L'électrode obtenue est lavée avec de l'eau ultra pure, séchée et l'électroactivité est contrôlée dans un milieu aqueux contenant du NaCl, 0,5M. L'analyse électrochimique est représentée à la figure 2. Le signal électrochimique est stable et réversible en milieu aqueux.
Des films de Poly(3-carboxymethylpyrrole-NHP) de différentes épaisseurs ont été préparés et les films obtenus ont été greffés avec le NTA. La réponse électrochimique enregistrée en milieu aqueux en présence de NaCI, 0,5 M confirme la présence d'un film électrochimiquement actif en milieu aqueux. La comparaison de la charge de Poly(3-carboxymethylpyrrole-NHP) déposée au début sur l'électrode et la charge calculée de NTA greffé sur le film, suggère que le rendement de greffage du NTA ou de l'IDA sur le film de 100 %. En d'autres termes, la quantité de NTA ou d'IDA greffée sur le film de poly(3-carboxy)pyrrole dépend de la quantité d'unités de 3- carboxymethylpyrrole-NHP présentes sur les électrodes, comme illustré par les courbes de la figure 3.
Exemple 3 ; Complexation du film de Poly(3- carboxymethylpyrrole-NTA) avec le cuivre sur électrode.
Figure imgf000012_0001
Poly (Py-NTÂ) Poty Py-NTA-Cii)
L'électrode comportant le film de poly(3-carboxymethylpyrrole-NTA) a été électrochimiquement analysée en milieu aqueux, lavée avec de l'eau déionisée, séchée et elle est ensuite immergée dans une solution aqueuse de CuCI2 en présence de NaCI 0,5 M, à température ambiante pendant 3 heures. L'électrode est ensuite rincée dans l'eau déionisée, séchée et analysée électrochimiquement dans une solution aqueuse contenant du NaCI 0,5M. La disparition du signal électrochimique du Poly(3-carboxymethylpyrrole- NTA) et l'apparition d'un pic caractéristique de l'oxydation de Cu+ en Cu2+ à - 0,2 V-0,35 V, qui est stable mais non réversible et électroactif en milieu aqueux, confirme la complexation du cuivre avec le PoIy(3- carboxymethylpyrrole-NTA) (figure 4).
Exemple 4 : Greffage de la Polyhistidine sur les films de polypyrrole-NTA/Cu2+
Les électrodes comportant un film polypyrrole-NTA/Cu2+ sont lavées avec de l'eau, puis séchées et immergées dans une solution tampon PBS de polyhistidine de poids moléculaire de 6300 g en quantité équimoléculaire avec la quantité de cuivre complexé sur le film de Polypyrrole- NTA contenant du NaCI pendant une heure à température ambiante. Après lavage avec une solution tampon, elles sont séchées puis analysées électrochimiquement dans une solution aqueuse contenant 0,5 M DE NaCI. On observe sur le voltamogramme illustré par les courbes de la figure 5 que les signaux du cuivre sont toujours présents. Mise en évidence de la réversibilité du greffage :
Figure imgf000013_0001
Les électrodes comportant de la polyhistidine greffée obtenues précédemment sont traitées par immersion dans une solution aqueuse d'EDTA à température ambiante pendant 15 minutes, rincées puis séchées.
Elles sont ensuite analysées électrochimiquement dans une solution aqueuse contenant 0,5 M de NaCI.
On observe sur le voltamogramme illustré par les courbes de la figure 6 la disparition du pic caractéristique du Cuivre ce qui signifie que l'EDTA a déplacé le Cuivre du complexe avec le NTA du film. On peut conclure que la complexation et la décomplexation du cuivre sur un film de polypyrrole-NTA est un phénomène réversible.
Exemple 5 : Immobilisation d'un antigène sur un film de polypyrrole-NTA complexé par des ions Cu2+ : La protéine immobilisée RH24 est une protéine modifiée par addition de 6 amino- acides Histidine en position N-terminale de la protéine P24 naturellement synthétisée par Escherichia Coli de masse moléculaire théorique de 26950 g.
Le greffage est effectué par incubation de 5 nmole d'antigène pendant 3 heures à température ambiante sur le film Cu2+/Polypyrrole-NTA. Elles sont ensuite analysées électrochimiquement dans une solution aqueuse contenant 0,5 M de NaCI.
La voltamétrie cyclique est enregistrée à la vitesse de 20Mv/s. Sur le voltamogramme représenté à la figure 7 on observe une décroissance du signal lié à la complexation de l'antigène.
Exemple 6 : Détection d'un Anticorps sur un film de polypyrrole-NTA complexé par des ions Cu2+ sur lequel est immobilisé un antigène.
La détection est effectuée par immersion de l'électrode comportant un film de polypyrrole-NTA complexé par des ions Cu2+ sur lequel est immobilisé un antigène dans une solution de 0,6 nmole d'Anticorps spécifique de l'Antigène.
Elles sont ensuite analysées électrochimiquement dans une solution aqueuse contenant 0,5 M de NaCI. La voltamétrie cyclique est enregistrée à la vitesse de 20Mv/s.
Sur le voltamogramme représenté à la figure 8 on observe une modification du signal lié au couplage antigène/anticorps.

Claims

REVENDICATIONS
1. Complexe électroactif, constitué par un polymère homopolymère ou copolymère électroactif d'au moins deux monomères, fonctionnalisé par un agent chélatant complexé avec un ion métallique, un anti-ligand et un ligand ayant spécifiquement interagi avec ledit anti-ligand.
2. Complexe selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le polymère électroactif est choisi parmi le polypyrrole, le polyacétylène, la polyazine, le poly(p-phénylène), le poly(p-phénylène vinylène), le polypyrène, le polythiophène, le polyéthylènedioxythiophène, le polyfurane, le polysélénophène, la polypyridazine, le polycarbazole, la polyaniline, les polynucléotides bicaténaires.
3. Complexe selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le l'agent chélatant est choisi parmi le NTA (nitrilotriacétate), l'IDA (iminodiacétate).
4. Complexe selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ion métallique est choisi parmi les cations de cuivre ou de mercure.
5. Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ligand et l'anti-ligand sont des molécules biologiques notamment choisies parmi les polynucléotides et les polypeptides.
6. Complexe selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'antiligandest lié à l'histidine ou un de ses dérivés polymères .
7. Complexe selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polypyrrole est un copolymère et comprend un monomère dont le noyau pyrrole est substitué par un groupe -CH2-COOH ou -CH2-CH2OH.
8. Sonde electroactive, constituée par un polymère homopolymère ou copolymère électroactif d'au moins deux monomères, fonctionnalisé par un agent chélatant complexé avec un ion métallique, et un anti-ligand susceptible d'interagir spécifiquement avec un ligand .
9. Sonde electroactive selon la revendication 8, caractérisée en ce que le polymère électroactif est choisi parmi le polypyrrole, le polyacétylène, la polyazine, le poly(p-phénylène), le poly(p-phénylène vinylène), le polypyrène, le polythiophène, le polyéthylènedioxythiophène, le polyfurane, le polysélénophène, la polypyridazine, le polycarbazole, la polyaniline, les polynucléotides bicaténaires.
10. Sonde electroactive selon l'une quelconque des revendication précédentes, caractérisée en ce que le l'agent chélatant est choisi parmi le NTA (nitrilotriacétate), l'IDA (iminodiacétate).
11. Sonde electroactive selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'ion métallique est choisi parmi les cations de cuivre ou de mercure.
12. Sonde electroactive selon l'une quleconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'anti-ligand est unemolécule biologique notamment choisie parmi les polynucléotides et les polypeptides.
13. Sonde electroactive selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'anti-ligand est lié à l'histidine ou un de ses dérivés polymères .
14. Sonde electroactive selon la revendication 9, caractérisée en ce que le polypyrrole est un copolymère et comprend un monomère dont le noyau pyrrole est substitué par un groupe -CH2-COOH ou -CH2-CH2OH.
15. Procédé pour préparer une sonde telle que définie dans l'une quelconque des revendications 8 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) On dispose d'un polymère homopolymère ou copolymère constitué par au moins deux monomères, dont au moins un est substitué par un groupe activé,
(b) On dispose d'agent chélatant en solution aqueuse, et (c) On fonctionnalise le polymère homopolymère ou copolymèrepar l'agent chélatant par hydrolyse, d) on complexe le polymère fonctionnalisé avec l'agent chélatant par contact avec une solution aqueuse d'ions métalliques e) on greffe l'anti-ligand par contact du polymère complexé fonctionnalisé avec l'agent chélatant et complexé avec un ion métallique par contact avec une solution d'anti-ligand.
16. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le polymère est un polypyrrole constitué par au moins deux monomères pyrrole dont au moins un est substitué sur le carbone en position 3 par un groupe activé.
17. Procédé de détection d'un ligand dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact une sonde selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, dans des conditions de réaction appropriées pour l'interaction spécifique anti-ligand / ligand, et en ce qu'on met en évidence ou on quantifie une différence de potentiel ou une variation de courant entre la sonde avant mise en contact et la sonde après mise en contact.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'antiligand est lié à l'histidine ou un de ses dérivés polymères .
19. Electrode dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 8 à 14.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114152655B (zh) * 2021-12-31 2023-11-14 常州大学 用于谷氨酸对映体手性识别的聚苯乙烯与L-Phe复合物修饰电极及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000031750A1 (fr) * 1998-11-19 2000-06-02 Bio Merieux Polymeres conjugues fonctionnalises capables d'electroconductivite et d'electroactivite, et utilisations de ces polymeres
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Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210217A (en) * 1987-10-29 1993-05-11 Miles Inc. Substituted bithiophenes and dithienylpyrroles
FR2707642B1 (fr) * 1993-07-16 1995-10-13 Electricite De France Dérivés de polyéthers et d'hétérocycles pentacycliques, leurs polymères et leurs applications, notamment à la complexation d'ions métalliques.
FR2720832A1 (fr) * 1994-04-22 1995-12-08 Francis Garnier Electrodes et membranes électroactives à base de peptides bioactifs, pour la reconnaissance, l'extraction ou le relargage d'espèces biologiquement actives.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000031750A1 (fr) * 1998-11-19 2000-06-02 Bio Merieux Polymeres conjugues fonctionnalises capables d'electroconductivite et d'electroactivite, et utilisations de ces polymeres
FR2808024A1 (fr) * 2000-04-21 2001-10-26 Bio Merieux Complexe electroactif, sonde electroactive et procede de preparation

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