WO2003013234A2 - Procede de criblage in vivo de l'activite biologique d'un composeinhibiteur de l'acetylcholinesterase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acetylcholinesterase - Google Patents

Procede de criblage in vivo de l'activite biologique d'un composeinhibiteur de l'acetylcholinesterase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acetylcholinesterase Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the field of analysis of the biological activity of acetylcholinesterase inhibitor compounds, and more particularly to the non-specific effects of acetylcholinesterase inhibitor compounds on cell targets other than this enzyme.
  • Acetylcholinesterase also known as AChE, is an enzyme classified according to the international nomenclature in E.C.3.1.1.7. AChE hydrolyzes the neurotransmitter acetylcholine which controls muscle contraction in the peripheral nervous system and also plays a crucial role in synaptic transmission in the central nervous system. In addition, AChE also has a non-enzymatic role in the growth of neurites and their differentiation. Inhibition of AChE activity leads to loss of motility.
  • AChE inhibiting property is used to block the transmission of neural signals at the level of cholinergic synapses and neuromuscular junctions, which has the effect of paralyzing the target organism, more specifically insects and parasites considered to be pests in agriculture.
  • Certain acetylcholinesterase inhibitors are also used as active principles of drugs used in human therapy, in particular in the treatment of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, or even to treat other pathologies such as myasthenia gravis. or some autoimmune diseases.
  • cholinesterase inhibitors The toxicity of cholinesterase inhibitors has already been tested on embryonic and adult fish, in particular for the compounds used as pesticides.
  • HANNEMAN et al. (1992) studied the activity of diisopropylfluorophosphate on zebrafish and showed that this compound altered somitogenesis.
  • Means allowing the implementation of a method for in vivo screening of the biological activity of an AChE inhibitor compound on one or more cellular targets other than this enzyme are provided for the first time by the present invention.
  • the subject of the invention is the use of a fish embryo of the species Danio rerio, in the genome of which at least one copy of the gene coding for acetylcholinesterase has been inactivated, in a method of screening in vivo for biological activity of a compound inhibiting acetylcholinesterase on one or more cellular targets other than acetylcholinesterase.
  • zebrafish embryos or adult zebrafish are brought into contact with acetylcholinesterase inhibiting compounds, the potentially deleterious effects of which are not specific for their action. on acetylcholinesterase.
  • the methods according to the invention can in no way be assimilated to treatment methods of a therapeutic or surgical nature, taking into account the objectives pursued.
  • the fish embryos or the adult fish used for the implementation of the various screening methods according to the invention are not reared pending their natural death. They are systematically sacrificed, sooner or later after their use in a screening process, and most of the time immediately at the end of the process.
  • the invention also relates to methods for screening in vivo the biological activity of an acetylcholinesterase inhibitor compound on one or more cellular targets other than AChE.
  • the invention also relates to a process for obtaining a fish embryo of the Danio rerio species from fish obtained according to the above process.
  • Figure 1 Schematic representation of a screening for lethal homozygous mutations.
  • the ENU was used to mutate the spermatogonia of the male to GO which was crossed with a wild female.
  • each fish has a unique combination of mutations.
  • the F1s are crossed in pairs and form F2 families. Crosses between F2 individuals make it possible to obtain homozygotes mutants in F3. Several mutations can be isolated from the same F2 family.
  • FIG. 2 The loss of AChE activity is linked to the AChE - / - mutation in vitro.
  • - ab AChE activity can be detected in vivo in the CNS (as in the tri-twin ganglia tg) and in the muscles (h hearf) and somites.
  • e) The specific AChE activity of embryos has been measured at several stages of development. These embryos come from crosses of heterozygous couples. ⁇ ⁇ of the embryos are immobile and no AChE activity is detected in the extracts of these embryos.
  • f) Adult fish have been genotyped by studying their progeny. The specific activity of heterozygotes (+/-) is half that of wild fish (+ / +).
  • Figure 3 Alignment of 41 amino acid sequences of acetylcholinesterase.
  • the upper line represents the amino acid sequence of the acetylcholinesterase of the AChE mutant according to the invention, for which the amino acid serine (S) in position 226 is replaced by the amino acid asparagine (N).
  • the second line represents the amino acid sequence of acetylcholinesterase from wild Danio rerio fish.
  • FIG. 4 Mutant embryos are capable of expressing a mini-gene coding for the wild form of AChE. Embryos from oviposition of AChE +/- parents were injected with the wild form, pC-AChE, or the mutant form, pC-S226N, and a plasmid encoding GFP. AChE activity was detected at 24 hours in embryos expressing GFP.
  • the recombinant wild AChE is expressed in numerous cells of various types (FIG. 4B) while no activity is detected after injection of pC-S226N (FIG. 4C).
  • Figure 5 The movement of AChE - / - embryos is altered at 48 hours.
  • FIG. 6 Muscle fibers are altered in AChE - / - mutant embryos.
  • FIG. 7 illustrates the map of the plasmid pc-ACHE, derived from the vector pcDNA3, into which is inserted a functional copy of the AChE gene from the fish Danio rerio.
  • FIG. 8 illustrates the map of the plasmid pc-5226N, derived from the vector pcDNA3, into which is inserted a copy of the inactivated gene of AChE according to the invention.
  • the applicant From the heterozygous mutants comprising a single inactivated copy of the AChE gene, the applicant has obtained reproducibly fish embryos of the Danio rerio homozygous species comprising the two copies of the gene encoding acetylcholinesterase in inactivated form. The acetylcholinesterase activity is undetectable in these homozygous mutants.
  • the inactivation of the two copies of the acetylcholinesterase gene does not prevent the production of viable embryos up to 9 days
  • the obtaining, in a reproducible manner, by the applicant for fish Danio rerio partially or totally devoid of catalytic activity acetylcholinesterase has made it possible to develop methods for screening for AChE inhibitor compounds in order to determine whether the compounds thus screened have effects non-specific on other cellular targets than AChE, and in particular deleterious non-specific effects on the development of embryos, and even more specifically on the development of the central nervous system or the peripheral nervous system.
  • a first object of the invention therefore consists in the use of a fish embryo of the species Danio rerio in the genome of which at least one copy of the gene encoding acetylcholinesterase has been inactivated, in a screening process in vivo the biological activity of an acetylcholinesterase inhibitor compound on one or more cellular targets other than acetylcholinesterase.
  • FIG. 1 A reproducible method for obtaining a fish of the species Danio rerio mutated in the gene coding for AChE is described in detail in example 1 and is illustrated by FIG. 1.
  • a wild male whose spermatogonia has been treated with a chemical mutagen is crossed with a wild female.
  • the chemical mutagen is ethyl-nitrosourea (ENU) which is known to induce numerous point mutations in all cells of the male and in particular the gametes.
  • the descendants of the F1 generation are crossed two by two in order to obtain descendants of the F2 generation which carry the mutations of the paternal genome and the mutations of the maternal genome, with a unique combination in each fish, according to the segregation of the chromosomes and recombinations during meiosis. Then, the F2 generation brothers and sisters are crossed with each other in order to obtain F3 generation descendants.
  • the F3 generation descendants are, for a quarter of the population, mutants homozygous for a given mutation which are produced each time a male and a female who have received the same mutation are crossed.
  • the F3 generation mutants were then successively selected according to two criteria, a phenotypic criterion and a biochemical criterion.
  • the phenotypic criterion consists in observing the mobility characteristics of the embryos, more specifically the qualitative test of the flight reflex in which the embryos are mechanically stimulated at the head-trunk junction, then the movement alterations detected after 48 hours of development.
  • the use of video recordings makes it possible to precisely identify the sequence of reflex movement after tactile stimulation in embryos and young larvae.
  • the biochemical criterion consists in the detection of acetylcholinesterase activity in embryos, which can be carried out according to the technique of KARNOVSKY et al. (1964), which consists of a coloring technique that is both simple and rapid.
  • the embryos can be observed under a binocular microscope without any other preparation, the presence of a brown coloration being indicative of the catalytic activity acetylcholinesterase.
  • a second method of inactivation of the gene encoding acetylcholinesterase consists in the use of an antisense polynucleotide having a sequence complementary to the messenger RNA constituting the expression product of the fish acetylcholinesterase gene Danio rerio.
  • nucleotide sequence of an antisense oligonucleotide according to the invention can be easily determined by a person skilled in the art from the nucleotide sequence of the fish acetylcholinesterase gene Danio rerio, the cloning of which is described by BERTRAND et al.
  • antisense polynucleotides For the construction of antisense polynucleotides and their use to inhibit the expression of a given gene, the skilled person may advantageously refer to the articles of SCZAKIEL et al. (1995) and de ROSSI et al. (1991) as well as the content of PCT applications No. WO 94/23 026, WO 95/04141, WO 92/18 522 as well as European patent application No. 0P 0 572 287.
  • the antisense poynucleotides must have a sufficient length and melting temperature to allow the formation of an intracellular duplex having sufficient stability to inhibit expression of mRNA in the duplex.
  • an antisense polynucleotide used according to the invention to inactivate the gene coding for fish acetylcholinesterase Danio rerio is an antisense DNA of the morpholino type as described in particular in US Pat. Nos. 5, 142,047 and 5,185,444.
  • an antisense DNA which can be used according to the invention is DNA of the morpholino type having the sequence SEQ ID No. 1.
  • a copy of the gene coding for fish acetylcholinesterase of the species Danio rerio is inactivated when the catalytic activity acetylcholinesterase found in the tissues of fish is reduced by approximately 50%, compared with the catalytic activity. found in wild Danio rerio fish.
  • the inactivation of a copy of the gene encoding AChE may consist of one or more substitutions, additions or deletions of nucleotides in the nucleotide sequence of the open reading frame of the gene, leading to the production of a modified polypeptide or truncated no longer possessing the catalytic activity of acetylcholinesterase, that is to say of a polypeptide incapable of hydrolyzing acetylcholine.
  • a copy of the gene encoding AChE is inactivated when one or more substitutions, additions or deletions of nucleotides have been artificially induced in the regulatory sequence upstream of the AChE gene or in the intronic sequences, in particular when the mutations are localized in intronic sequences involved in the process of splicing of the messenger pre-RNA.
  • a fish embryo of the Danio rerio species in a method for screening in vivo of the biological activity of an acetylcholinesterase inhibitor compound on one or more cellular targets other than acetylcholinesterase, the two copies of the gene encoding acetylcholinesterase have been inactivated.
  • biological activity of an inhibitor compound on one or more cellular targets other than AChE is essentially meant the non-specific effects of the inhibitor compounds, which are not due to an interaction between this compound and acetylcholinesterase, at least under its active form. It is therefore an in vivo screening of the non-specific biological activity of acetylcholinesterase of the inhibitory compounds, which necessarily implies that other cellular targets than acetylcholinesterase, in particular other proteins involved in various metabolic pathways be the target of the AChE inhibitors tested.
  • the AChE inhibitor compounds tested are pesticide or insecticide compounds as well as compounds of therapeutic interest useful for the treatment of certain diseases of the nervous system such as Alzheimer's disease or myasthenia gravis.
  • the inhibitor compounds are organophosphorus compounds. According to another preferred embodiment, the inhibitor compounds are compounds having at least one carbamate group.
  • Illustrative examples of such compounds are for example eserine, diisopropylfluorophosphate (DFP), chlorpyrifos sold by the company DURSBAN, 1,5-bis-dibromide (4- allylbimthylammoniumphenyl) -pentan-3-one (BW 284c51) or physostigmine.
  • DFP diisopropylfluorophosphate
  • BW 284c51 1,5-bis-dibromide (4- allylbimthylammoniumphenyl) -pentan-3-one
  • physostigmine physostigmine.
  • Other inhibitors which can be used according to the invention are described in particular on the ESTHER website devoted to cholinesterases (address: http://www.ensam.inra.fr/ cholinesterase) and more particularly in the section specifically devoted to inhibitor compounds (address : http: //www.ensam
  • a first in vivo screening method makes it possible to compare the development of a fish embryo of the Danio rerio species totally deficient in catalytically active acetylcholinesterase, depending on whether this embryo is brought into contact or not with the inhibitor compound to be tested.
  • the invention relates to a method for in vivo screening of the biological activity of an acetylcholinesterase inhibitor compound on one or more cellular targets other than acetylcholinesterase, characterized in that it comprises the following steps a) bringing into contact a fish embryo of the Danio rerio species, in the genome of which the two copies of the gene coding for acetylcholinesterase have been inactivated, with the inhibitor compound to be tested; b) compare the development characteristics of the embryo of step a) with the development characteristics of an identical control embryo, which has not been placed in the presence of the inhibitor compound.
  • the differences observed in the developmental characteristics of the embryo depending on whether or not it is brought into contact with the AChE inhibitor compound to be tested, if they exist, are significant. of an activity of the inhibitor compound tested which is non-specific for acetylcholinesterase. Such an AChE inhibitor compound is therefore highly likely to cause undesirable deleterious effects for the user.
  • a comparison is made of the development characteristics respectively of an embryo of the species Danio rerio in the genome of which a copy of the gene encoding AChE has been inactivated and of an embryo of the Danio rerio species of which the two copies of the gene encoding AChE are functional, the two types of embryo being brought into contact with the inhibitor compound to be tested.
  • the invention also relates to a process for screening in vivo the biological activity of an acetylcholinesterase inhibitor compound on one or more cellular targets other than acetylcholinesterase, characterized in that it comprises the steps following: a) contacting a fish embryo of the species Danio rerio, in the genome of which a copy of the gene coding for acetylcholinesterase has been inactivated, with the inhibitor compound to be tested; b) bringing into contact a fish embryo of the Danio rerio species whose two copies of the gene encoding acetylcholinesterase are functional with the inhibitor compound to be tested. c) compare the development characteristics of the embryo from step a) with those of the embryo from step b).
  • the development characteristics compared in the in vivo screening methods according to the invention include the mobility of the embryos, in particular the mobility characteristics of the flight reflex after mechanical stimulation at the head-trunk junction, which may be the case. if necessary analyzed using video recordings allowing precise identification of the sequence of reflex movement after tactile stimulation in embryos and larvae genes.
  • the developmental characteristics of the embryo which are compared in the above in vivo screening methods also include the observation of the morphological development of these embryos, including heartbeats, blood circulation, morphology of blood cells, the development of the fins, the shape of the head, the size of the eyes, the development of the jaw and the pharyngeal skeleton, the opening of the mouth (observation of the structure of the gill arches), the formation of the swim bladder, the pigmentation in particular at the level of the pigment cells derived from the neural crests.
  • the developmental features compared in the above in vivo screening methods also include the observation of the development of the central and peripheral nervous systems, the development of the posterior brain, in particular the closure of the neural tube, and in general all problems of differentiation of the structures of the central nervous system and the peripheral nervous system.
  • the development characteristics compared also include muscle development such as the development of somites, especially the terminal somites of the tail.
  • the fish used in a screening process according to the invention are sacrificed in the more or less long term after the test, and preferably immediately after the end of the test.
  • developmental features involving sacrifice and histological study of the embryo can also be compared according to the invention.
  • development characteristics include in particular the neuromuscular development characteristics, such as the disorganization of the muscle fibers, which can be demonstrated in particular on histological sections, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • developmental characteristics which can be compared in an in vivo screening method as defined above include the detection of the expression or the level of expression of genes of interest, for example genes involved in the characteristics of development mentioned above.
  • the determination of the development characteristics of the embryo is preferably carried out at predetermined time intervals, from the moment of fertilization of the egg.
  • the differences in development characteristics according to the type of embryo or according to the treatment of the embryo can be monitored continuously over time. It has been shown according to the invention that homozygous embryos comprising the two inactivated copies of the AChE gene were viable up to 9 days after fertilization of the egg.
  • the reflex response to tactical stimulation becomes very weak at 48 hours fertilization of the egg.
  • a unilateral contraction is observed, on the opposite side of the stimulation, which is followed by a brief period of alternating right / left beats, limited to the terminal part of the tail.
  • the screening methods according to the invention can also be characterized in that the determination of the development characteristics of the embryo is carried out up to 48 hours after fertilization of the egg.
  • the in vivo screening methods defined above have been implemented, by way of illustration, with two AChE inhibitor compounds, eserine and diisopropylfluorophosphate (DFP), respectively.
  • eserin For eserin, contacting wild embryos with a 10 "3 molar solution of eserin completely blocks the mobility of the two types of embryo at 18 hours after fertilization of the egg. Such a blocking of mobility is not observed in homozygous embryos for a mutation in the AChE gene, which is significant for an action of the non-specific eserin of AChE, which would also act on other cellular targets than this enzyme.
  • DFP is known to alter the development of somites 24 hours after fertilization of the egg, as described by HANNEMAN et al. (1992).
  • no alteration in the formation of somites was observed in embryos homozygous for a mutation in the AChE gene, which is indicative of non-specific activity of DFP on cellular targets other than l 'AChE itself.
  • fish of the Danio rerio species of the F2 generation which have a single inactivated copy of the gene encoding AchE, or else the part of the population of generation F3 fish which have a single inactivated gene copy, which develops into the adult stage, can be used in methods of screening for the non-specific effects of AchE inhibitor compounds related to overdoses.
  • These heterozygous fish for the inactivation of the AChE gene have an AChE activity quantitatively equal to 50% of the ACHE activity found in wild fish and can be used to test the non-specific effects of inhibitors of l 'AChE which are detected for high doses of inhibitor.
  • a subject of the invention is also a method of screening in vivo for the non-specific effect of overdose of an acetylcholinesterase inhibitor compound, on one or more cellular targets other than acetylcholinesterase, characterized in that it comprises the following stages: a) bringing an adult fish of the Danio rerio species into contact, in the genome of which a single copy of the gene coding for acetylcholinesterase has been inactivated, with the inhibitor compound to be tested, for example with a series of concentrations increasing of the inhibitor compound to be tested, b) comparing the characteristics of the fish treated in accordance with step a) with the characteristics of an adult fish of the species
  • Danio rerio in the genome of which the two copies of the gene encoding acetylcholinesterase are functional and which has been brought into contact with the inhibitor compound, for example with a series of increasing concentrations of the inhibitor compound to be tested.
  • the above screening method makes it possible to demonstrate, in vivo, the non-specific effects of acetylcholinesterase, linked to an overdose of an inhibiting compound, in particular a pesticidal inhibiting compound or an inhibiting compound. therapeutic interest.
  • the characteristics of the adult fish studied are chosen from morphological characteristics and mobility characteristics, in particular.
  • the deleterious effects of overdose can also be highlighted by evaluating the rate, for example the percentage, of mortality observed in fish (+/-) or (+ / +) treated with the inhibitor compound.
  • Another subject of the invention consists in a process for obtaining a fish of the species Danio rerio, or an embryo of fish of the species Danio rerio capable of being used for the implementation of a method for in vivo screening of the biological activity of an acetylcholinesterase inhibitor compound on one or more cellular targets other than acetylcholinesterase.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining a fish of the Danio rerio species in which at least one copy of the gene encoding actetylcholinesterase is inactivated, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing male fish of the Danio rerio species, of which the two copies of the gene encoding acetylcholinesterase are functional, into contact with a mutagenic compound, preferably ethyl nitrosourea; b) cross the male fish obtained in step a) with a wild Danio rerio female fish in which the two copies of the gene encoding acetylcholinesterase are functional, in order to obtain descendants of the F1 generation; c) cross between them males and females of the F1 generation in order to obtain descendants of the F2 generation; d) cross between them males and females of the F2 generation in order to obtain descendants of the F3 generation, some of which have the two copies of the
  • the invention also relates to a process for obtaining an embryo of the species Danio rerio in which at least one copy of the gene encoding acetylcholinesterase is inactivated, characterized in that it comprises the following steps: a) cross between them a male fish and a female fish obtained by the above process; b) recover the fertilized eggs.
  • a mutation on the two copies of the AChE gene leads to obtaining viable embryos up to 9 days old, but which quickly presents deficits in transmission neural signals.
  • the development of the zebrafish is extremely rapid. At the time 24 hours after fertilization, a basic plan of a fish is put in place. At the time 6 days after fertilization, most of the organs are completely differentiated. After 6 days, the fully differentiated larva only grows in size.
  • the viability of embryos homozygous for a mutation in the AChE gene is essential if they are to be used in an in vivo screening process for AChE inhibitor compounds including a step of studying or comparing the characteristics of development of it.
  • Another subject of the invention consists of a fish of the species Danio rerio in which a copy of the gene coding for acetylcholinesterase is inactivated, capable of being obtained by the above method.
  • It also relates to a fish embryo of the Danio re ⁇ o species of which at least one copy of the gene encoding acetylcholinesterase is inactivated, capable of being obtained by the above process.
  • this embryo is characterized in that the two copies of the gene encoding acetylcholinesterase are inactivated.
  • the invention also relates to a fish or a fish embryo of the species Danio rerio characterized in that one copy of the acetyl cholinesterase gene or both copies of this gene comprise the substitution of a nucleotide resulting in the production of a catalytically inactive acetylcholinesterase in which the amino acid serine at position 226 of the sequence of the enzyme is replaced by the amino acid asparagine.
  • the screening technique previously used by the NUSSLEIN-VOLHARDT group is based on the crossing of a male treated with HELD with a wild female ( Figure 1).
  • the chemical agent mutagene ENU induces numerous point mutations in all the cells of the male and in particular in the gametes.
  • all individuals carry several mutations.
  • the intersection of F1, two by two allows to define a founding couple and to obtain an F2 family.
  • individuals carry mutations in the paternal genome and maternal mutations, with a unique combination in each fish, depending on the segregation of the chromosomes and the recombinations during meiosis.
  • mutant heterozygous adults are crossed in each generation with wild fish of the same strain (ABO line) in order to avoid the problems associated with inbred crosses over three generations during screening.
  • ABO line wild fish of the same strain
  • the heterozygotes are identified again by crossing between brothers and sisters as in F3.
  • Crosses have the advantage of maintaining a constant genetic background in mutants and identical to the wild strain.
  • the swimming movement of embryos and larvae has been studied in detail.
  • the embryo shows spontaneous contractions from 17-18h of development. From 24 hours on, it responds to a stimulus with a sporadic reflex movement which becomes coordinated around 48 hours and allows escape (FELSENFELD et al., 1990; GRANATO et al. 1990).
  • the development of these movements follows the establishment of the central and peripheral nervous system (Saint-Amant and Drapeau, 2000).
  • the stimulation of sensory neurons, Mauthner's cells which triggers a signal that propagates along the network of backbones.
  • the stimulation on the ipsilateral side is simultaneously inhibited which allows a unilateral contraction moving the fish away from the source of stimulation. From 72 hours, the larvae swim freely and can move towards a target.
  • 105 families were created and 56 mutant lines were selected for the analysis.
  • the mutants were characterized, at 48 hours and 72 hours of development, morphologically, on their ability to move and respond to the tactile test and were classified into 4 groups.
  • the first family contains the immobile mutants, the second the mutants with reduced mobility. Mutants from these two groups may or may not have morphological defects. Embryos with neural tube necrosis are classified in the third group, and the remaining lines with a poorly defined phenotype constitute the last group.
  • complementation tests intra-family or with T ⁇ bingen screening mutants made it possible to identify different alleles for the same gene.
  • Mutants deficient in AChE activity were selected. In the embryos, the staining of the AChE activity by the karnovsky technique is simple, rapid and the colored embryos can be observed under a binocular microscope without any other preparation.
  • the detection of AChE is carried out after fixation for 6 to 8 hours.
  • the embryos are incubated for 4 to 6 hours in a solution whose final concentrations are: 60 mM sodium acetate pH 6.4, 5 mM sodium citrate, 4.7 mM CuSO4, 0.5 mM K3 (Fe (CN) 6) and 1.7 mM acetylthyiocholine.
  • the embryos are then rinsed in PBST (PBS, 0.1% Tween 20).
  • Protein extracts were prepared from embryos from an AChE +/- parent spawn. The embryos were sorted according to their mobility phenotype at 3 and 4 days. For the two phenotypes, the overall activity is measured from an extract of 10 embryos, and the experiment repeated in 4 independent ovipositions. The results presented in FIG. 2 show that no AChE activity is detected in the immobile embryos while it is present in the mobile embryos. Among the mobile embryos, composed of 1/3 of wild embryos and 2/3 of heterozygotes, no distinction of phenotype is visible. In parallel, the direction of AChE activity in whole immobile embryos confirms the absence of labeling previously observed. The rate of AChE activity in wild or heterozygous adults was then studied.
  • the AChE was thus quantified for 10 fish.
  • two couples contained at least one wild relative according to the result of the crosses.
  • According to the specific AChE activity measured we have defined two classes. Comparison with the result of crosses allowed us to deduce that heterozygous adults had half as much AChE activity as wild adults.
  • the average activity for the 8 adults +/- and the 2 adults + / + identified is indicated in Figure 2B.
  • An antisense RNA probe is produced from the cDNA encoding the incorporation of UTP nucleotide coupled to digoxigenin (DIG).
  • DIG digoxigenin
  • the embryos are fixed for 12-16 hours in 4% paraformaldehyde, rinsed in PBST. The embryos are then preincubated for 1 hour at 65 ° C. in the HYB buffer, then 1 ⁇ l of probe is added to 450 ⁇ l of HYB buffer and the embryos are incubated overnight.
  • the embryos are then incubated in the blocking solution for 3-4 hours at room temperature and the embryos are incubated overnight with the 1/4000 diluted anti-DIG antibodies.
  • the embryos are rinsed 6 times 15 minutes in PBST then 2 times 5 minutes in the staining buffer and revealed with NBT (3.5 ⁇ l / ml) and BCIP (3.5 ⁇ l / ml) in the staining buffer.
  • HYB buffer 50% formamide, 5XSSC, 500 mg / ml Yeast RNA, 0.1% Tween 20 TM, 9 mM citric acid.
  • Antibody blocking buffer 1 x PBS, 0.1% Tween 20 TM, 0.2% BSA, 1% DMSO.
  • Staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20.
  • Serine 226 is stored in all vertebrate and invertebrate cholinesterases.
  • the side chain of serine 226 points to serine 200 of the active site.
  • the S226N mutation modifies the steric hindrance but also the polarity of the side chain.
  • N226 could establish a hydrogen bond with glutamate 327 of the active site and thus cause the loss of activity. So far, no mutagenesis study has involved residue 226 in the activity of the enzyme. It would be interesting to replace polar serine with a non-polar residue of equivalent size such as leucine to verify the involvement of hydrogen bonds in the loss of catalytic activity.
  • the maps of the plasmids used are shown in Figures 7 and 8 respectively.
  • the AChE gene digested at the Seal and Xhal sites was introduced into the EcoRV and Xbal sites of the vector pcDNA3 (Invitrogen).
  • the EcorV and Seal sites are no longer functional. Expression is led by the CMV promoter.
  • Recombinant wild-type acetylcholinesterase can be produced in mutant embryos.
  • the cloning of the mutant AChE gene and its expression in vitro and in vivo confirmed the origin of the immobile phenotype as being a specific deficit in cholinesterase activity, linked to the mutation of serine 226 into asparagine.
  • the phenotype of the mutant homozygous embryos was then analyzed in more detail.
  • lactile stimulation for example during the removal of the chorion, the response of the wild embryos consists of one or two tail beats then a return to the relaxed state while the mutant embryos remain contracted as a result of the last beat and relax more slowly.
  • mutant embryos are never as large as those of wild embryos.
  • This phenotype becomes clearly visible from 30 hours and gradually increases: the beats are replaced by prolonged tetanic cramps which are followed by a period of complete inactivity (paralysis) even under stimulation.
  • a wild embryo subjected to tactile stimulation at the junction between the head and the trunk, is capable of developing a coordinated movement of flight by violent contraction of the trunk on the side opposite to the stimulation.
  • Slow motion video microscopy on wild embryos immobilized by the head and the anterior trunk, makes it possible to observe this reflex lateral contraction, followed by a swimming period (FIG. 5A).
  • the response is very weak: a unilateral contraction, on the side opposite the stimulation, is followed by a brief period of alternating right / left beats, limited to the terminal part of the tail (Figure 5A).
  • the response decreases over time and at 3 days most AChE - / - embryos are immobile and adopt an arched posture with the tail pointing dorsally along the axis of the embryo ( Figure 5B).
  • AChE activity probably increases the concentration of ACh in the synapses and causes, in the short term, tetanic contractions followed by periods of immobility. In the long term, a complete paralysis of the embryos is observed.
  • mutant embryos look normal. The heart beats and blood flows normally. No morphological difference was noted for the blood cells in wild or mutant embryos at 5 days of development. The fins develop normally for up to 3 days, however in mutants they gradually atrophy. Generally, with the exception of tetanus contractions, mutant homozygous embryos exhibit a wild phenotype until around 2 days when the muscles begin to degenerate.
  • Morpholino-type oligonucleotides are sold by the company GENETOOLS LLC. They were resuspended in solution and injected at a concentration of 1 mM as described by Nasevicius and EKKER (2001).
  • the sequence of the antisense oligonucleotide MO-ache is 5'-CTGAGGTCTTCATGGCTTCTTTTCA-3 '(SEQ ID No. 1) and that of the control oligonucleotide, MO-co is 5'-
  • the absence of BchE in zebrafish makes the AChE mutant model very unique and particularly useful for testing the effects of cholinesterase inhibitors.
  • the toxicity tests can be carried out by simple bath of the embryos and the analysis of the phenotype carried out under a binocular magnifier. Any abnormal phenotype induced in AChE embryos could be attributed to non-specific effects of the inhibitors since these embryos have no AChE activity.

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Abstract

Utilisation d'un embryon de poisson de l'espère Danio rerio, dans le génome duquel au moins une copie du géne codant l'acetylcholinesterase a été inactivée, dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acetylcholinesterase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase.

Description

Procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase
La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse de l'activité biologique des composés inhibiteurs de l'acétylcholinestérase, et plus particulièrement sur les effets non spécifiques des composés inhibiteurs de l'acétylcholinestérase sur d'autres cibles cellulaires que cette enzyme.
ART ANTERIEUR
L'acétylcholinestérase, aussi désignée AChE, est une enzyme classée selon la nomenclature internationale en E.C.3.1.1.7. L'AChE hydrolyse le neurotransmetteur acetylcholine qui contrôle la contraction du muscle dans le système nerveux périphérique et joue également un rôle crucial dans la transmission synaptique dans le système nerveux central. De plus, l'AChE aurait également un rôle non-enzymatique dans la croissance des neurites et leur différenciation. L'inhibition de l'activité AChE conduit à une perte de motilité.
De nombreux composés pesticides, tels que les composés organophosphorés et carbamates sont des inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (AChE). La propriété d'inhibition de l'AChE est utilisée afin de bloquer la transmission des signaux neuronaux aux niveaux des synapses cholinergiques et des jonctions neuromusculaires, ce qui a pour effet de paralyser l'organisme cible, plus spécifiquement les insectes et les parasites considérés comme nuisibles dans l'agriculture.
Certains inhibiteurs de l'acétylcholinestérase sont également utilisés comme principes actifs de médicaments utilisés en thérapie humaine, notamment dans le traitement des maladies neuro- dégénératives, telle que la maladie d'Alzheimer, ou encore pour traiter d'autres pathologies telles que la myasthénie gravis ou encore certaines maladies auto-immunes.
Il est généralement admis que les différents composés inhibiteurs de l'AChE actuellement commercialisés possèdent de nombreux effets non spécifiques indésirables, qui peuvent être extrêmement délétères pour les hommes ou les animaux mis en contact avec de tels composés. Parmi les effets délétères indésirables, on peut citer particulièrement leur pouvoir tératogène et plus généralement des dysfonctionnements au niveau du système nerveux central. II existe donc un besoin dans l'état de la technique pour un modèle expérimental in vivo permettant de tester les effets non spécifiques indésirables de composés inhibiteurs de l'AChE d'intérêt industriel, notamment des composés utilisés comme principes actifs de compositions pesticides, insecticides ou encore de compositions pharmaceutiques, afin de sélectionner, parmi ces composés, ceux pour lesquels les effets non spécifiques de l'AChE sont inexistants ou tout au moins le plus réduits possible. La mise au point d'un tel modèle expérimental in vivo serait de nature à permettre la commercialisation de composés inhibiteurs de l'AChE dont la mise en oeuvre est plus sûre et n'entraîne pas d'effets indésirables sur la santé de l'utilisateur.
La toxicité des inhibiteurs des cholinestérases a déjà été testée sur les poissons embryons et adultes, en particulier pour les composés utilisés comme pesticides.
Par exemple, HANNEMAN et al. (1992) a étudié l'activité du diisopropylfluorophosphate sur le poisson- zèbre et a montré que ce composé altérait la somitogénèse.
Toutefois, le modèle expérimental in vivo utilisé par HANNEMAN et al. (1992) ne permet pas de discriminer les effets spécifiques du DFP sur l'AChE des éventuels effets non spécifiques sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'AChE.
Des moyens permettant la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'AChE sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que cette enzyme sont fournis pour la première fois par la présente invention.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention a pour objet l'utilisation d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase.
Pour tous les procédés de criblage in vivo détaillés dans la présente description, des embryons de poisson-zèbre ou des poisson- zèbres adultes sont mis en contact avec des composés inhibiteurs de l'acétylcholinestérase dont on recherche les effets potentiellement délétères non spécifiques de leur action sur l'acétylcholinestérase. En d'autres termes, les procédés selon l'invention ne peuvent en aucun cas être assimilés à des procédés de traitement de nature thérapeutique ou chirurgicale, compte tenu des objectifs poursuivis. Dans tous les cas, les embryons de poissons ou les poissons adultes utilisés pour le mise en œuvre des divers procédés de criblage selon l'invention ne sont pas élevés dans l'attente de leur mort naturelle. Ils sont systématiquement sacrifiés, à plus ou moins longue échéance après leur utilisation dans un procédé de criblage, et la plupart du temps immédiatement à la fin du procédé. De plus, comme on le verra, certaines étapes des procédé de criblage décrits impliquent nécessairement le sacrifice du poisson ou de l'embryon de poisson, notamment à des fins de caractérisation histologique. L'invention est également relative à des procédés de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'AChE.
Elle concerne aussi un procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio, dans lequel au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact des poissons mâles de l'espèce Dat7/'o rerio, dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, avec un composé mutagène, de préférence l'éthyl- nitroso-urée ; b) croiser les poissons mâles obtenus à l'étape a) avec un poisson femelle Danio rerio sauvage dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, afin dobtenir des descendants de génération F1 ; c) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F1 afin d'obtenir des descendants de la génération F2 ; d) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F2 afin d'obtenir des descendants de la génération F3 dont certains d'entre eux possèdent les deux copies du gène codant l'acétylcholiestérase inactivées.
L'invention a également trait à un procédé d'obtention d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio à partir des poissons obtenus selon le procédé ci-dessus.
Elle est également relative à des poissons et des embryons de poissons de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant l'AChE est inactivée.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : représentation schématique d'un criblage pour des mutations homozygotes létales.
L'ENU a été utilisé pour muter les spermatogonies du mâle en GO qui a été croisé avec une femelle sauvage. Dans la génération F1 produite chaque poisson possède une combinaison unique de mutations. Les F1 sont croisés deux à deux et forment des familles F2. Les croisements entre individus F2 permettent d'obtenir des homozygotes mutants en F3. Plusieurs mutations peuvent être isolées à partir d'une même famille F2.
Figure 2 : La perte d'activité AChE est liée à la mutation AChE -/- in vitro. - ab : L'activité AChE peut être détectée in vivo dans le SNC (comme dans les ganglions tri-jumeaux tg) et dans les muscles (h hearf) et les somites. - çA - Dans les embryons -/- on ne détecte plus aucune activité. e) L'activité spécifique AChE d'embryons a été mesurée à plusieurs stades de développement. Ces embryons sont issus de croisements de couples d'hétérozygotes. Λλ des embryons sont immobiles et on ne détecte aucune activité AChE dans les extraits de ces embryons. f) Des poissons adultes ont été génotypes par étude de leur descendance. L'activité spécifique des hétérozygotes (+/-) correspond à la moitié de celle des poissons sauvages (+/+).
Figure 3 : Alignement de 41 séquences d'acides aminés d'acétylcholinestérase . La ligne supérieure représente la séquence en acides aminés de l'acétylcholinestérase du mutant AChE selon l'invention, pour lequel l'acide aminé serine (S) en position 226 est remplacé par l'acide aminé asparagine (N). La deuxième ligne représente la séquence en acides aminés de l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio sauvage.
Figure 4 : Les embryons mutants sont capables d'exprimer un mini-gène codant pour la forme sauvage d'AChE. Les embryons issus d'une ponte de parents AChE +/- ont été injectés avec la forme sauvage, pC-AChE, ou la forme mutante, pC- S226N, et un plasmide codant pour la GFP. L'activité AChE a été détectée à 24 heures dans les embryons exprimant la GFP.
L'absence d'activité selon le profil normal permet d'identifier le génotype des embryons (Figure 4A).
Chez les mutants, l'AChE sauvage recombinante est exprimée dans de nombreuses cellules de types variés (Figure 4B) alors qu'aucune activité n'est détectée après injection de pC-S226N (figure 4C).
Figure 5 : Le mouvement des embryons AChE -/- est altéré à 48 heures. A) La tête des embryons sauvages ou mutants est immobilisée dans de l'agarose et les mouvements de la queue sont enregistrés sous lumière stroboscopique. Après une stimulation latérale avec une aiguille, les embryons sauvages répondent par des mouvements amples et rapides qui durent plusieurs secondes. Dans les mêmes conditions, les mutants AChE ne présentent qu'un faible mouvement (tremblement) du bout de la queue et s'immobilisent rapidement en position contractée. B) Comparaison d'un embryon sauvage au repos et d'un embryon mutant AChE en état de crampe.
Figure 6 : Les fibres musculaires sont altérés dans les embryons mutants AChE -/-.
En microscopie photonique, en lumière polarisée, on observe une forte biréfringence dans les muscles de l'embryon sauvage (Figure 6 A) mais une biréfringence qui est très diminuée dans les mutants (Figure 6
B). En microscopie électronique, les myofibrilles sont présentes mais envahies par un sarcoplasme fortement vacuolisé dans le mutant (Figure 6 D) ? L'enveloppe nucléaire est distendue et fortement vacuolisée.
La figure 7 illustre la carte du plasmide pc-ACHE, dérivé du vecteur pcDNA3, dans lequel est inséré une copie fonctionnelle du gène de l'AChE du poisson Danio rerio.
La figure 8 illustre la carte du plasmide pc-5226N, dérivé du vecteur pcDNA3, dans lequel est inséré une copie du gène inactivé de l'AChE selon l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Par une technique de mutagenèse chimique de poissons de l'espèce Dat7/'o rerio (poisson-zèbre) suivie de la caractérisation des mutants ainsi produits, le demandeur a obtenu de manière reproductible des poissons de l'espèce Danio rerio, dans le génome desquels une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée.
A partir des mutants hétérozygotes comprenant une seule copie inactivée du gène de l'AChE, le demandeur a obtenu de manière reproductible des embryons de poissons de l'espèce Danio rerio homozygote comprenant les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sous forme inactivée. L'activité acetylcholinesterase est indétectable chez ces mutants homozygotes.
De manière tout à fait surprenante, l'inactivation des deux copies du gène acetylcholinesterase n'empêche pas la production d'embryons viables jusqu'à 9 jours L'obtention de manière reproductible par le demandeur de poisson Danio rerio partiellement ou totalement dépourvu d'activité catalytique acetylcholinesterase a permis la mise au point de procédés de criblage de composés inhibiteurs de l'AChE afin de déterminer si les composés ainsi criblés possédaient des effets non spécifiques sur d'autres cibles cellulaires que l'AChE, et en particulier des effets non spécifiques délétères sur le développement des embryons, et encore plus spécifiquement sur le développement du système nerveux central ou du système nerveux périphérique. Un premier objet de l'invention consiste donc en l'utilisation d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dans le génome duquel au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase.
Il est ainsi fourni pour la première fois selon l'invention des poissons de l'espèce Danio rerio dans le génome desquels une copie du gène codant l'AChE a été inactivée, et qui peuvent être obtenus de manière reproductible par l'homme du métier. II est aussi fourni selon l'invention des embryons de poissons de l'espèce Danio rerio dans le génome desquels les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont inactivées.
Procédés reproductibles d'obtention de poissons de l'espèce Danio rerio mutés sur le gène de l'AChE.
Procédé d'obtention par mutagenèse chimique.
Un procédé reproductible d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio mutée dans le gène codant l'AChE est décrit en détail à l'exemple 1 et est illustré par la figure 1.
Brièvement, un mâle sauvage dont les spermatogonies ont été traités par un agent mutagene chimique est croisé avec une femelle sauvage. De préférence, l'agent mutagene chimique est l'éthyl-nitroso-urée (ENU) qui est connu pour induire des mutations ponctuelles nombreuses dans toutes les cellules du mâle et notamment les gamètes.
Les descendants de la génération F1 sont croisés deux à deux afin d'obtenir des descendants de génération F2 qui portent les mutations du génome paternel et les mutations du génome maternel, avec une combinaison unique dans chaque poisson, en fonction de la ségrégation des chromosomes et des recombinaisons au cours de la méiose. Puis, les frères et soeurs de la génération F2 sont croisés entre eux afin d'obtenir des descendants de génération F3. Les descendants de génération F3 sont, pour un quart de la population, des mutants homozygotes pour une mutation donnée qui sont produits à chaque fois que l'on a croisé un mâle et une femelle ayant reçu la même mutation. Les mutants de la génération F3 ont ensuite été sélectionnés successivement selon deux critères, un critère phénotypique et un critère biochimique.
Le critère phénotypique consiste en l'observation des caractéristiques de mobilité des embryons, plus spécifiquement le test qualitatif du réflexe de fuite dans lequel les embryons sont stimulés mécaniquement à la jonction tête-tronc, puis les altérations du mouvement détectées après 48 heures de développement. L'utilisation d'enregistrements vidéo permet d'identifier précisément la séquence du mouvement réflexe après stimulation tactile chez les embryons et les jeunes larves.
Le critère biochimique consiste en la détection de l'activité acetylcholinesterase chez les embryons, qui peut être réalisée selon la technique de KARNOVSKY et al. (1964), qui consiste en une technique de coloration à la fois simple et rapide. Les embryons peuvent être observés sous loupe binoculaire sans autre préparation, la présence d'une coloration brune étant révélatrice de l'activité catalytique acetylcholinesterase.
Sur la totalité de la population d'embryons de la génération F3, vingt lignées présentaient un phénotype d'altération de la mobilité et ont ensuite été testées sur le critère biochimique d'activité de l'acétylcholinestérase.
Sur les vingt lignées testées, une seule lignée ne présentait aucune activité cholinestérasique pour environ un quart des embryons de la génération F3, dans cinq pontes de couples hétérozygotes indépendants.
Après amplification et séquençage du gène de l'acétylcholinestérase chez ces embryons, une mutation ponctuelle correspondant à la substitution d'un nucléotide dans le cadre ouvert de lecture du gène et conduisant à la production d'une acetylcholinesterase catalytiquement inactive a été caractérisée.
L'application des critères de sélection phénotypique et biochimique ci-dessus, après mutagenèse chimique, permet donc l'obtention reproductible de poissons de l'espèce Danio rerio dans le génome duquel une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée.
De plus, le croisement de poissons hétérozygotes pour une mutation dans le gène de l'acétylcholinestérase permet d'obtenir directement des descendants dont un quart de ceux-ci sont homozygotes pour la mutation.
Inactivation du gène codant l'acétylcholinestérase par des oligonucléotides antisens.
Un second procédé d'inactivation du gène codant l'acétylcholinestérase consiste en l'utilisation d'un polynucléotide antisens possédant une séquence complémentaire de l'ARN messager constituant le produit d'expression du gène de l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio.
La séquence nucléotidique d'un oligonucléotide antisens selon l'invention peut être aisément déterminée par l'homme du métier à partir de la séquence nucléotidique du gène de l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio, dont le clonage est décrit par BERTRAND et al.
(2001).
Pour la construction de polynucléotides antisens et leur utilisation pour inhiber l'expression d'un gène donné, l'homme du métier pourra se référer av avantageusement aux articles de SCZAKIEL et al. (1995) et de ROSSI et al. (1991 ) ainsi qu'au contenu des demandes PCT N°WO 94/23 026, WO 95/04141 , WO 92/18 522 ainsi qu'à la demande de brevet européen n ΕP 0 572 287. Les poynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisantes pour permettre la formation d'un duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm dans le duplex.
Préférentiellement, un polynucléotide antisens utilisé selon l'invention pour inactiver le gène codant l'acétylcholinestérase du poisson Danio rerio, est un ADN antisens de type morpholino tel que décrit notamment dans les brevets US N°5, 142,047 et 5,185,444.
De manière tout à fait préférée, un ADN antisens utilisable selon l'invention est l'ADN de type morpholino possédant la séquence SEQ ID N°1.
Selon l'invention, une copie du gène codant l'acétylcholinestérase du poisson de l'espèce Danio rerio est inactivée lorsque l'activité catalytique acetylcholinesterase retrouvée dans les tissus du poisson est réduite d'environ 50%, par rapport à l'activité catalytique retrouvée chez le poisson Danio rerio sauvage.
Ainsi, l'inactivation d'une copie du gène codant l'AChE peut consister en une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions de nucléotides dans la séquence nucléotidique du cadre ouvert de lecture du gène, conduisant à la production d'un polypeptide modifié ou tronqué ne possédant plus l'activité catalytique de l'acétylcholinestérase, c'est-à- dire d'un polypeptide incapable d'hydrolyser Pacétylcholine.
Selon un autre aspect, une copie du gène codant l'AChE est inactivée lorsqu'une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions de nucléotides ont été artificiellement induites dans la séquence régulatrice en amont du gène de l'AChE ou encore dans les séquences introniques, en particulier lorsque les mutations sont localisées dans des séquences introniques impliquées dans le processus d'épissage du pré-ARN messager.
Il a été montré selon l'invention que l'inactivation d'une seule copie du gène codant l'AChE conduisait à la production de 50% de l'acétylcholinestérase normalement produite chez le poisson sauvage possédant les deux copies fonctionnelles du gène.
Il a été également montré que les embryons de poissons Danio rerio dans lesquels les deux copies du gène de l'AChE ont été inactivées ne produisent plus d'acétylcholinestérase sous une forme catalytiquement active.
Selon un mode particulièrement préféré de l'utilisation d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées.
Par activité biologique d'un composé inhibiteur sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'AChE, on entend essentiellement les effets non spécifiques des composés inhibiteurs, qui ne sont pas dus à une interaction entre ce composé et l'acétylcholinestérase, du moins sous sa forme active. Il s'agit donc d'un criblage in vivo de l'activité biologique non spécifique de l'acétylcholinestérase des composés inhibiteurs, ce qui implique nécessairement que d'autres cibles cellulaires que l'acétylcholinestérase, en particulier d'autres protéines impliquées dans diverses voies métaboliques soit la cible des inhibiteurs d'AChE testés.
De préférence, les composés inhibiteurs de l'AChE testés sont des composés pesticides ou insecticides ainsi que des composés d'intérêt thérapeutique utiles pour le traitement de certaines maladies du système nerveux comme la maladie d'Alzheimer ou la myasthenia gravis..
Selon un autre mode de réalisation préféré, les composés inhibiteurs sont des composés organophosphorés . Selon un autre mode de réalisation préféré, les composés inhibiteurs sont des composés possédant au moins un groupement carbamate.
Des exemples illustratifs de tels composés sont par exemple l'ésérine, le diisopropylfluorophosphate (DFP), le chlorpyrifos commercialisé par la Société DURSBAN, le dibromure de 1 ,5-bis-(4- allylbimthylammoniumphenyl) -pentan-3-one (BW 284c51 ) ou physostigmine. D'autres inhibiteurs utilisables selon l'invention sont décrits notamment sur le site Web ESTHER consacré aux cholinestérases (adresse : http://www.ensam.inra.fr/ cholinesterase) et plus particulièrement dans la partie spécifiquement consacrée aux composés inhibiteurs (adresse:http://www.ensam. inra.fr/cholinesterase/ chem/ Inhibitors/index.html ») ou encore dans l'article de CHATONNET ét al. (1999).
Procédés de criblage selon l'invention
Afin de détecter l'activité biologique non spécifique de l'acétylcholinestérase de composés inhibiteurs de l'AChE, un premier procédé de criblage in vivo selon l'invention permet de comparer le développement d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio totalement déficient en acetylcholinesterase catalytiquement active, selon que cet embryon est mis en contact ou non avec le composé inhibiteur à tester.
Ainsi, l'invention est relative à un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées, avec le composé inhibiteur à tester ; b) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec les caractéristiques de développement d'un embryon témoin identique, qui n'a pas été mis en présence du composé inhibiteur . Selon le procédé de criblage in vivo ci-dessus, les différences observées dans les caractéristiques de développement de l'embryon selon qu'il est mis ou non en contact avec le composé inhibiteur de l'AChE à tester, si elles existent, sont significatives d'une activité du composé inhibiteur testé qui est non spécifique de l'acétylcholinestérase. Un tel composé inhibiteur de l'AChE est donc fortement susceptible de provoquer des effets délétères indésirables pour l'utilisateur.
Selon un second procédé de criblage in vivo conforme à l'invention, il est réalisé une comparaison des caractéristiques de développement respectivement d'un embryon de l'espèce Danio rerio dans le génome duquel une copie du gène codant l'AChE a été inactivée et d'un embryon de l'espèce Danio rerio dont les deux copies du gène codant l'AChE sont fonctionnelles, les deux types d'embryon étant mis en contact avec le composé inhibiteur à tester.
Les embryons dont une copie du gène codant l'AChE est inactivée sont viables et donnent naissance à des poissons adultes. Aussi, les tests peuvent aussi être réalisés à des stades ultérieurs du développement, par exemple au stade poisson adulte. Ainsi, l'invention est également relative à un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, avec le composé inhibiteur à tester ; b) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles avec le composé inhibiteur à tester. c) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec celles de l'embryon de l'étape b).
Selon le procédé ci-dessus, des différences dans les caractéristiques de développement des deux types d'embryons sont significatives d'une activité biologique du composé inhibiteur de l'AChE, qui est non spécifique de l'acétylcholinestérase. Ainsi, des composés inhibiteurs testés pour lesquels des différences dans les caractéristiques de développement sont observées sont susceptibles de provoquer des effets délétères indésirables sur la santé de l'utilisateur. De préférence, les caractéristiques de développement comparées dans les procédés de criblage in vivo selon l'invention incluent la mobilité des embryons, en particulier les caractéristiques de mobilité du réflexe de fuite après stimulation mécanique à la jonction tête-tronc, qui peuvent être le cas échéant analysées à l'aide d'enregistrements vidéo permettant d'identifier précisément la séquence du mouvement réflexe après stimulation tactile chez les embryons et les gènes larves.
Les caractéristiques de développement de l'embryon qui sont comparées dans les procédés de criblage in vivo ci-dessus incluent aussi l'observation du développement morphologique de ces embryons, comprenant les battements du coeur, la circulation du sang, la morphologie des cellules sanguines, le développement des nageoires, la forme de la tête, la taille des yeux, le développement de la mâchoire et du squelette pharyngé, l'ouverture de la bouche (observation de la structure des arches branchiales), la formation de la vessie natatoire, la pigmentation en particulier au niveau des cellules pigmentaires dérivées des crêtes neurales.
Les caractéristiques de développement comparées dans les procédés de criblage in vivo ci-dessus incluent aussi l'observation du développement du système nerveux central et du système nerveux périphérique, le développement du cerveau postérieur, en particulier la fermeture du tube neural, et en général tous les problèmes de différenciation des structures du système nerveux central et du système nerveux périphérique. Les caractéristiques de développement comparées incluent aussi le développement musculaire tel que le développement des somites, notamment les somites terminaux de la queue.
Selon l'invention, on privilégie la détection des caractéristiques de développement directement visibles par l'observation des embryons au moyen d'une loupe binoculaire ou d'un microscope, le cas échéant associé à un dispositif de capture et d'enregistrement vidéo.
Dans tous les cas, les poissons mis en oeuvre dans un procédé de criblage selon l'invention sont sacrifiés à plus ou moins long terme après le test, et préférentiellement immédiatement après la fin du test. Toutefois, des caractéristiques de développement impliquant le sacrifice et l'étude histologique de l'embryon peuvent être également comparées selon l'invention. De telles caractéristiques de développement incluent notamment les caractéristiques de développement neuro-musculaires, telles que la désorganisation des fibres musculaires, qui peut être mise en évidence notamment sur des coupes histologiques, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
D'autres caractéristiques de développement qui peuvent être comparées dans un procédé de criblage in vivo tel que défini ci-dessus incluent la détection de l'expression ou du niveau d'expression de gènes d'intérêt, par exemple des gènes impliqués dans les caractéristiques de développement citées ci-dessus.
Selon l'invention, la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée de préférence à des intervalles de temps prédéterminés, à partir de l'instant de fécondation de l'oeuf.
Selon une telle caractéristique, les différences de caractéristiques de développement selon le type d'embryon ou selon le traitement de l'embryon peuvent être suivies de manière continue dans le temps. II a été montré selon l'invention que des embryons homozygotes comprenant les deux copies inactivées du gène de l'AChE étaient viables jusqu'à 9 jours après fécondation de l'oeuf.
Chez les embryons homozygotes comportant les deux copies inactivées du gène de l'AChE, la réponse réflexe à une stimulation tactique devient très faible au temps 48 heures de fécondation de l'oeuf. Il est observé une contraction unilatérale, du côté opposé à la stimulation, qui est suivie d'une période brève de battements alternatifs droite/gauche, limitée à la partie terminale de la queue. Au temps 3 jours après fécondation de I' oeuf, la plupart des embryons homozygotes sont immobiles et adaptent une posture cambrée avec la queue pointant dorsalement en suivant l'axe de l'embryon. Au vu de ce qui précède, les procédés de criblage selon l'invention peuvent en outre être caractérisées en ce que la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée jusqu'au temps 48 heures suivant la fécondation de l'oeuf. Les procédés de criblage in vivo définis ci-dessus ont été mis en oeuvre, à titre illustratif, avec deux composés inhibiteurs de l'AChE , respectivement l'ésérine et le diisopropylfluorophosphate (DFP).
Pour l'ésérine, la mise en contact des embryons sauvages avec une solution à 10"3 molaire d'ésérine bloque complètement la mobilité des deux types d'embryon au temps 18 heures après fécondation de l'oeuf . Un tel blocage de la mobilité n'est pas observé chez les embryons homozygotes pour une mutation sur le gène de l'AChE, ce qui est significatif d'une action de l'ésérine non spécifique de l'AChE, qui agirait en conséquence également sur d'autres cibles cellulaires que cette enzyme.
De même, le DFP est connu pour altérer le développement des somites au temps 24 heures après fécondation de l'oeuf, comme cela est décrit par HANNEMAN et al. (1992). En revanche, aucune altération dans la formation des somites n'a été observée chez les embryons homozygotes pour une mutation sur le gène de l'AChE, ce qui est significatif d'une activité non spécifique du DFP sur d'autres cibles cellulaires que l'AChE elle-même.
D'autres résultats ont été obtenus avec les inhibiteurs d'AchE ésérine, tacrine, edrophonium et galanthine, en observant la biréfringence des embryons traités par ces inhibiteurs sans loupe à lumière polarisée, aux temps 48h et 72h après traitement.
Avec l'ésérine et la tacrine, on observe une altération du muscle de l'embryon moindre que celle observée chez le mutant -/-. Ces résultats montrent que ces deux inhibiteurs agissent aussi sur d'autres cibles cellulaires que l'AchE, car on ne reproduit pas les effets délétères provoqués par le seul blocage de l'AchE.
En revanche, avec les inhibiteurs d'AchE edrophonium et galanthine, les embryons +/+ traités possèdent le même phénotype que les embryons -/-, ce qui signifie que ces deux inhibiteurs n'interagissent vraisemblablement pas avec d'autres cibles cellulaires que l'AchE. Ces résultats sont en accord avec les activités de la tacrine observées par Canti étal (Canti C, Bodas E., Marsal J., Solsona C, Tacrine and physostigmine bloc nicotinic receptors in Xenopus oocytes injected with 13234
17
Torpédo electroplaque membranes, Eur. J. Pharmacol 1998 Dec.18 363 (2-3) : 197-202).
Ainsi, la mise en oeuvre des procédés de criblage in vivo de l'invention pour tester deux composés inhibiteurs de l'AChE a permis de mettre en évidence des effets non spécifiques de l'AChE, qui pourraient être fortement délétères pour l'utilisateur.
Selon un autre aspect de l'invention, les poissons de l'espèce Danio rerio de la génération F2, qui possèdent une seule copie inactivée du gène codant l'AchE, ou encore la partie de la population de poissons de la génération F3 qui possèdent une seule copie inactivée de gène, qui se développent jusqu'au stade adulte, peuvent être utilisés dans des procédés de criblage des effets non spécifiques de composés inhibiteurs de l'AchE liés à des surdosages. Ces poissons hétérozygotes pour l'inactivation du gène de l'AChE ont une activité de l'AChE quantitativement égale à 50% de l'activité ACHE retrouvée chez les poissons sauvages et peuvent être utilisés pour tester les effets non spécifiques d'inhibiteurs de l'AChE qui sont détectés pour de fortes doses d'inhibiteur.
L'invention a aussi pour objet un procédé de criblage in vivo de l'effet non spécifique de surdosage d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase, sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un poisson adulte de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une seule copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, avec le composé inhibiteur a tester, par exemple avec une série de concentrations croissantes du composé inhibiteur à tester, b) comparer les caractéristiques du poisson traité conformément à l'étape a) avec les caractéristiques d'un poisson adulte de l'espèce
Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles et qui a été mis en contact avec le composé inhibiteur, par exemple avec une série de concentrations croissantes du composé inhibiteur à tester. Le procédé de criblage ci-dessus permet de mettre en évidence, in vivo, les effets non spécifiques de l'acétylcholinestérase, liés à un surdosage d'un composé inhibiteur, notamment d'un composé inhibiteur pesticide ou d'un composé inhibiteur d'intérêt thérapeutique. Les caractéristiques du poisson adulte étudiées sont choisies parmi les caractéristiques morphologiques et les caractéristiques de mobilité, notamment.
Les effets délétères du surdosage peuvent également être mis en évidence par détection de l'expression ou du niveau d'expression de gènes d'intérêt.
Les effets délétères du surdosage peuvent être aussi mis en évidence en évaluant le taux, par exemple le pourcentage, de mortalité observé chez les poissons (+/-) ou (+/+) traités par le composé inhibiteur.
Procédé d'obtention d'un poisson ou d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio muté sur le gène de l'AChE.
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio , ou d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio susceptible d'être utilisé pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase.
L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio dans lequel au moins une copie du gène codant l'actétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact des poissons mâles de l'espèce Danio rerio, dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, avec un composé mutagene, de préférence l'éthyl- nitroso-urée ; b) croiser les poissons mâles obtenus à l'étape a) avec un poisson femelle Danio rerio sauvage dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, afin dobtenir des descendants de génération F1 ; c) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F1 afin d'obtenir des descendants de la génération F2 ; d) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F2 afin d'obtenir des descendants de la génération F3 dont certains d'entre eux possèdent les deux copies du gène codant l'acétylcholiestérase inactivées.
La description générale des différentes étapes du procédé ci- dessus a été déjà exposée précédemment par la présente description. La description détaillée d'un procédé d'obtention d'un poisson d'espèce Danio rerio tel que défini ci-dessus est aussi décrit en détail à l'exemple 1.
L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'un embryon de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) croiser entre eux un poisson mâle et un poisson femelle obtenus par le procédé ci-dessus ; b) récupérer les oeufs fécondés. De manière surprenante, il a été montré selon l'invention qu'une mutation sur les deux copies du gène de l'AChE conduit à l'obtention d'embryons viables jusqu'à 9 jours, mais qui présente rapidement des déficits dans la transmission des signaux neuronaux.
Le développement du poisson-zèbre est extrêmement rapide. Au temps 24 heures après fécondation, un plan de base d'un poisson est mis en place. Au temps 6 jours après la fécondation, la plupart des organes sont complètement différenciés. Après le temps 6 jours, la larve complètement différenciée ne fait plus que grandir en taille.
La viabilité des embryons homozygotes pour une mutation dans le gène de l'AChE est essentielle si l'on veut les utiliser dans un procédé de criblage in vivo de composés inhibiteurs de l'AChE incluant une étape d'étude ou de comparaison des caractéristiques de développement de celui-ci. En outre, il était essentiel, en vue de détecter les activités non spécifiques de l'AChE de composés inhibiteurs d'acétylcholinestérase, d'obtenir un modèle animal dans lequel l'absence d'activité catalytique AChE n'était pas compensée par l'activité d'autres enzymes, ce qui aurait été de nature à masquer totalement les effets non spécifiques des inhibiteurs de l'acétylcholinestérase.
Un autre objet de l'invention consiste en un poisson de l'espèce Danio rerio dont une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus.
Elle est également relative à un embryon de poisson de l'espèce Danio reήo dont au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de l'embryon de poisson Danio rerio ci-dessus, cet embryon est caractérisé en ce que les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont inactivées.
Selon l'invention, il a été obtenu des poissons de l'espèce Danio rerio dont l'inactivation du gène de l'AChE a été provoquée par la substitution d'un nucléotide dans le cadre ouvert de lecture du gène, résultant en la production d'une AChE catalytiquement inactive dont le résidu d'acide aminé serine en position 226 a été remplacé par un résidu d'acide aminé asparagine. En conséquence, l'invention est également relative à un poisson ou un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio caractérisé en ce qu'une copie du gène de l'acétyl cholinestérase ou les deux copies de ce gène comportent la substitution d'un nucléotide résultant en la production d'une acetylcholinesterase catalytiquement inactive dont l'acide aminé serine en position 226 de la séquence de l'enzyme est remplacé par l'acide aminé asparagine.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants :
EXEMPLES : EXEMPLE 1 :
Obtention de poissons Danio rerio mutés sur le gène de l'AChE . 1.1 Mutagenèse à TENU
La technique de criblage précédemment utilisée par le groupe de NUSSLEIN-VOLHARDT, est basée sur le croisement d'un mâle traité à TENU avec une femelle sauvage (figure 1 ). L'agent chimique mutagene ENU induit des mutations ponctuelles nombreuses dans toutes les cellules du mâle et notamment dans les gamètes. Dans le large stock F1 , tous les individus sont porteurs de plusieurs mutations. Le croisement de F1 , deux à deux permettent de définir un couple fondateur et d'obtenir une famille F2. Dans celle-ci les individus portent les mutations du génome paternel et les mutations maternelles, avec une combinaison unique dans chaque poisson, en fonction de la ségrégation des chromosomes et des recombinaisons au cours de la méïose. En recroisant les frères et s_urs F2, les mutants homozygotes (1/4 des embryons) apparaissent en F3 à chaque fois que l'on aura croisé un mâle t une femelle ayant reçu la même mutation (figure 1 ). A partir d'une même famille issue d'un couple fondateur plusieurs mutations récessives différentes pourront être isolées et donneront des phénotypes nouveaux dans les homozygotes F3.
Pour maintenir le stock des mutants, les adultes hétérozygotes mutants sont croisés à chaque génération avec des poissons sauvages de la même souche ( lignée ABO) afin d'éviter les problèmes liés aux croisements consanguins sur trois générations au cours du criblage. Dans le produit de ces croisements, les hétérozygotes sont identifiés à nouveau par croisement entre frères et soeurs comme dans la F3. Les croisements présentent l'avantage de maintenir un fond génétique constant chez les mutants et identique à la souche sauvage.
Critères de sélection des mutants
Le mouvement de nage des embryons et des larves (embryon de plus de 3 jours) a été étudié en détail . L'embryon montre des contractions spontanées dès 17-18h de développement. A partir de 24 heures il répond à un stimulus par un mouvement réflexe sporadique qui devient coordonné vers » 48 heures et permet la fuite (FELSENFELD et al., 1990 ; GRANATO et al. 1990). L'élaboration de ces mouvements suit la mise en place du système nerveux central et périphérique ( Saint- Amant et Drapeau, 2000). La stimulation des neurones sensoriels , les cellules de Mauthner, qui déclenche un signal qui se propage le long du réseau des faisceaux dorsaux. La stimulation du côté ipsilatéral est inhibée simultanément ce qui permet une contraction unilatérale éloignant le poisson de la source de stimulation. Dès 72 heures, la larve nage librement et peut se diriger vers une cible.
Pour sélectionner les mutants, la mobilité est étudiée de façon qualitative par le test du réflexe de fuite dans lequel les embryons sont stimulés mécaniquement à la jonction tête-tronc. Les altérations du mouvement peuvent ainsi être détectées après 48 heures de développement. L'utilisation d'enregistrements vidéo permet d'identifier précisément la séquence du mouvement réflexe après stimulation tactile chez les embryons et les jeunes larves.
Pour compléter ce criblage, les animaux présentant une nécrose localisée ou générale du tube neural ont été retenus. Ce critère permet de sélectionner les mutants dans lesquels les neurones, n'ayant pas atteint leur cible, dégénèrent. Ces observations ont été réalisées sous la loupe binoculaire.
105 familles ont été créées et 56 lignées mutantes ont été retenues pour l'analyse. Les mutants ont été caractérisés, à 48 heures et à 72 heures de développement, sur le plan morphologique, sur leur aptitude à bouger et à répondre au test tactile et ont été classés en 4 groupes. La première famille contient les mutants immobiles, la seconde les mutants ayant une mobilité réduite. Les mutants de ces deux groupes peuvent présenter ou non des défauts morphologiques. Les embryons présentant des nécroses du tube neural sont classés dans le troisième groupe, et les lignées restantes ayant un phénotype mal défini constituent le dernier groupe. Dans les quatre groupes phénotypiques, des tests de complémentations (intra-famille ou avec des mutants du criblage de Tϋbingen) ont permis d'identifier des allèles différents pour un même gène.
1.2 Détection de l'activité AChE dans les mutants, une technique simple et rapide de criblage.
Les mutants déficients en activité AChE ont été retenus. Dans les embryons la coloration de l'activité AChE par la technique de karnovsky est simple, rapide et les embryons colorés peuvent être observés sous loupe binoculaire sans autre préparation. Nous avons testé 20 lignées parmi les 35 entretenues couramment au laboratoire. Pour chaque lignée mutante, la moitié d'une ponte, issue de parents hétérozygotes a été utilisée pour détecter l'activité AChE à 24 heures de développement et l'autre moitié élevée pour vérifier le phénotype de mobilité des mutants à 48 heures et 72 heures.
Parmi les 20 lignées testées, 15 présentaient un phénotype normal de localisation et d'intensité du marquage de l'activité cholinestérasique.
Dans une lignée, classée dans le groupe phénotypique des mutants immobiles, aucune activité cholinestérasique n'a été détectée pour environ £ des embryons dans 5 pontes de couples hétérozygotes indépendants. Cette lignée a été baptisée AChE.
EXEMPLE 2 : Détection de l'activité enzymatique acetylcholinesterase chez le mutant AChE.
A. MATERIEL ET METHODES
La détection de l'AChE est réalisée après fixation pendant 6 à 8 heures. Les embryons sont incubés 4 à 6 heures dans une solution dont les concentrations finales sont : 60 mM sodium acétate pH 6.4, 5 mM sodium citrate, 4.7 mM CuSO4, 0.5 mM K3(Fe(CN)6)et 1.7 mM acétylthyiocholine. Les embryons sont ensuite rincés dans du PBST (PBS, 0.1 % Tween 20).
B. RESULTATS
B1. Origine de l'absence d'activité.
Déficit d'activité dans les embryons -/- et les adutes +/-.
Les premières observations montrent que VA des mutants AChE sont immobiles à partir de 3 jours et qu'ils meurent au gème jour environ. Les mutants possédant une mutation récessive létale, la lignée est entretenue à partir des individus hétérozygotes que l'on croise entre eux pour obtenir des embryons mutants homozygotes. Pour confirmer la relation entre l'absence d'activité AChE mise en évidence à 24 heures et le phénotype d'immobilité observé plus tardivement dans les embryons, nous avons mesuré l'activité cholinestérasique dans des extraits protéiques in vitro.
Des extraits protéiques ont été préparés à partir d'embryons d'une ponte de parents AChE +/-. Les embryons ont été triés selon leur phénotype de mobilité à 3 et 4 jours. Pour les deux phénotypes l'activité globale est mesurée à partir d'un extrait de 10 embryons, et l'expérience répétée dans 4 pontes indépendantes. Les résultats présentés dans la figure 2 montrent qu'aucune activité AChE n'est détectée dans les embryons immobiles alors qu'elle est présente dans les embryons mobiles. Parmi les embryons mobiles, composés d'1/3 d'embryons sauvages et de 2/3 d'hétérozygotes, aucune distinction de phénotype n'est visible. En parallèle, la direction de l'activité AChE dans les embryons entiers immobiles confirme l'absence de marquage précédemment observé. Le taux d'activité AChE dans les adultes sauvages ou hétérozygotes a ensuite été étudié. Pour distinguer leur génotype nous avons utilisé un test de croisement et observé leur descendance F1 ; seuls les couples hétérozygotes produisent des embryons immobiles -/-. Si les embryons F1 ont tous un phénotype sauvage, au moins un des deux parents est sauvage. Ensuite, pour chaque individu testé, l'activité spécifique de l'AChE a été mesurée dans un extrait protéique normalisé par rapport à la concentration protéique totale.
L'AChE a été ainsi quantifiée pour 10 poissons. Parmi ceux-ci, deux couples contenaient au moins un parent sauvage d'après le résultat des croisements. D'après l'activité spécifique AChE mesurée nous avons défini deux classes. La comparaison avec le résultat des croisements nous a permis de déduire que les adultes hétérozygotes possédaient moitié moins d'activité AChE que les adultes sauvages. L'activité moyenne pour les 8 adultes +/- et les 2 adultes +/+ identifiés est indiquée sur la figure 2B.
Ces résultats relient clairement l'absence d'activité AChE avec le phénotype d'immobilité dans les embryons mutants -/-. La transmission mendélienne du caractère « présence ou absence » d'activité AChE indique qu'un locus unique est à l'origine du phénotype. EXEMPLE 3
Expression de l'ARNm de l'acétylcholinestérase chez les mutants AChE
A. MATERIEL ET METHODES
Une sonde ARN antisens est réalisée à partir de l'ADNc codant avec incorporation de nucléotide UTP couplés à la digoxigenin(DIG).
Les embryons sont fixés durant 12-16 heures dans la paraformaldéhyde 4%, rincés dans le PBST. Les embryons sont ensuite préincubés 1 heure à 65°C dans le tampon HYB puis on ajoute 1 μl de sonde à 450 μl de tampon HYB et on incube les embryons durant la nuit.
Rinçages à 65°C :
2x30' 50% formamide — 50% 2xSSC — 0.1 % Tween 20™
1x15' 2XSSC — 0.1 % Tween 20™ 2x30' 0.2Xssc — 0.% Tween 20™
Puis on incube les embryons dans la solution de blocage pendant 3-4 heures à température ambiante et on incube les embryons durant la nuit avec les anticorps anti-DIG dilués 1/4000.
On rince les embryons 6 fois 15 minutes dans le PBST puis 2 fois 5 minutes dans le tampon de coloration et on révèle avec du NBT (3.5 μl/ml) et du BCIP (3.5 μl/ml) dans le tampon de coloration. Tampon HYB : 50% formamide, 5XSSC , 500 mg/ml Yeast RNA , 0.1% Tween 20™, 9 mM acide citrique.
Tampon blocage anticorps : 1 x PBS, 0.1% Tween 20™, 0,2% BSA , 1% DMSO.
Tampon de coloration : 100 mM Tris pH9,5 , 50 mM MgCl2 , 100 mM NaCI, 0.1 % Tween 20.
B. RESULTATS Les expériences d'hybridation in situ au stade 12 somites et à 24 heures ne montrent aucune différence de marquage des ARNm de l'AChE entre les embryons. Ceux-ci, observés sous loupe binoculaire ou au microscope, présentent un profil d'expression sauvage dans les différents tissus. Pour vérifier l'intégrité des transcrits (forme sauvage ou tronquée), il a été réalisé des transcriptions inverses avec un oligo-dT sur les ARNm extraits d'embryons immobiles (30 embryons âgés de 3 jours) et les PCRs suivantes à l'aide d'oligonucléotides couvrant toute la séquence de l'ADNc. Ces expériences ont montré que la totalité de l'ARNm AChE est présent dans les embryons mutants immobiles.
Le déficit d'activité dans les embryons AChE -/- ne semble pas dû à un défaut de régulation de la transcription, ni à une coupure ou à une instabilité des ARNm de l'AChE.
EXEMPLE 4 :
Caractérisation de la mutation sur les mutants AChE
Clonage de l'ADNc d'acétylcholinestérase dans les mutants Le produit des trois expériences de RT-PCRs indépendantes ont été séquences et la séquence protéique déduite comparée à la séquence sauvage. La seule variation identifiée correspond à la serine 226 de la protéine sauvage qui est transformée en asparagine. Nous avons donc vérifié, in vitro et in vivo, si la mutation S226N pouvait expliquer le phénotype du mutant AChE.
La serine 226 est conservée dans toutes les cholinestérases de vertébrés et d'invertébrés.
L'alignement de 250 séquences de protéines du bloc C , y compris les cholinestérases, des carboxylestérases et des protéines d'adhésion cellulaire (électrotactines), a révélé l'extrême conservation de la serine 226 . Un alignement de 41 de ces séquences est présenté à la figure 3.
Dans la structure 3D de la sous-unité d'AChE la chaîne latérale de la serine 226 pointe vers la serine 200 du site actif. La mutation S226N modifie l'encombrement stérique mais aussi la polarité de la chaîne latérale. D'après un modèle informatique en trois dimensions, N226 pourrait établir une liaison hydrogène avec le glutamate 327 du site actif et entraîner ainsi la perte de l'activité. Jusqu'à présent aucune étude de mutagenèse n'a impliqué le résidu 226 dans l'activité de l'enzyme. Il serait intéressant de remplacer la serine polaire par un résidu non polaire de taille équivalente telle que la leucine pour vérifier l'implication des liaisons hydrogènes dans la perte de l'activité catalytique.
EXEMPLE 5 : Expression d'une AChE active chez les mutants AChE A. MATERIELS ET METHODES
Les cartes des plasmides utilisés sont représentés respectivement dans les figures 7 et 8. Le gène de l'AChE digéré aux sites Seal et Xhal a été introduit dans les sites EcoRV et Xbal du vecteur pcDNA3 (Invitrogen). Les sites EcorV et Seal ne sont plus fonctionnels. L'expression est dirigée par le promoteur du CMV.
B . RESULTATS
L'acétylcholinestérase sauvage recombinante peut être produite dans les embryons mutants.
Pour vérifier la capacité des embryons AChE -/- à produire l'AChE, nous avons comparé l'activité de l'AChE sauvage ou mutante après injection des constructions pC-AChE et pC-S226N. Ces plasmides ont été co-injectés avec un plasmide codant pour la GFP dans les embryons d'une ponte de parents AChE hétérozygotes. La coloration de l'activité cholinestérasique à 24 heures permet d'une part, d'identifier le génotype des embryons (absence ou présence d'AChE endogène normale), et d'autre part de vérifier l'expression des constructions. Dans les embryons homozygotes -/- injectés avec l'AChE sauvage on détecte l'activité de l'enzyme dans de nombreux tissus (figure 4A). L'AChE wt est alors exprimée notamment dans les motoneurones, les neurones sensoriels et des fibres musculaires des mutants. Par contre, aucune activité n'a pu être visualisée dans les embryons injectés avec la construction S226N (figure 4B). Ce résultat indique que les embryons mutants sont capables d'exprimer la protéine d'AChE. L'expression d'enzyme sauvage dans les embryons mutants ne permet pas de restaurer le mouvement probablement en raison du faible nombre de cellules exprimant l'enzyme.
Le clonage du gène de l'AChE du mutant et son expression in vitro et in vivo ont confirmé l'origine du phénotype immobile comme étant un déficit spécifique en activité cholinestérasique, lié à la mutation de la serine 226 en asparagine. Le phénotype des embryons homozygotes mutants a alors été analysé plus en détail.
EXEMPLE 6 :
Caractérisation du phénotype du mutant AChE
6.1 Tétanie musculaire et paralysie progressive du tronc
Les mouvements des embryons, d'une ponte de parents hétérozygotes, ont été observés à différents stades sous loupe binoculaire. Nous avons noté une altération caractéristique du mouvement dans 22,7% ι_3,2 des embryons à 48 heures (n = 1346 embryons, sur 6 pontes indépendantes). A 17 heures, tous les embryons sont soumis à des contractions involontaires. Après 24 heures les embryons sont capables de mouvements réflexes brefs après stimulation et, une différence de comportement est visible à partir de 26 heures de développement. Lorsque les embryons sont soumis à une stimulation lactile, par exemple au cours du retrait du chorion, la réponse des embryons sauvages consiste en un ou deux battements de queue puis un retour à l'état relâché alors que les embryons mutants restent contractés à la suite du dernier battement et se relâchent plus lentement. De plus, es contractions des embryons mutants ne sont jamais aussi amples que celles des embryons sauvages. Ce phénotype devient clairement visible à partir de 30 heures et s'accentue progressivement : les battements sont remplacés par des crampes tétaniques prolongées qui sont suivies d'une période d'inactivité complète (paralysie) même sous stimulation.
A 48 heures un embryon sauvage soumis à une stimulation tactile, au niveau de la jonction entre la tête et le tronc, est capable d'élaborer un mouvement coordonné de fuite par contraction violente du tronc du côté opposé à la stimulation. La vidéo-microscopie au ralenti, sur des embryons sauvages immobilisés par la tête et le tronc antérieur, permet d'observer cette contraction latérale réflexe, suivie d'une période de nage (figure 5A). Dans les embryons homozygotes AChE , la réponse est très faible : une contraction unilatérale, du côté opposé à la stimulation, est suivie d'une période brève de battements alternatifs droite/gauche, limitée à la partie terminale de la queue (figure 5A) . La réponse diminue au cours du temps et à 3 jours la plupart des embryons AChE -/- sont immobiles et adoptent une posture cambrée avec la queue pointant dorsalement en suivant l'axe de l'embryon (figure 5B).
Dans les embryons mutants, comme dans les embryons sauvages traités aux inhibiteurs des cholinestérases (voir résultats, 2®me partie), le déficit en activité AChE entraîne probablement une augmentation de la concentration d'ACh aux synapses et provoque, à court terme, des contractions tétaniques suivies de périodes d'immobilité. A long terme, on observe une paralysie complète des embryons.
6.2 Description morphologique
Les embryons mutants de 24 heures ont à première vue un aspect normal. Le coeur bat et le sang circule normalement. Aucune différence morphologique n'a été notée pour les cellules sanguines dans les embryons sauvages ou mutants à 5 jours de développement. Les nageoires se développent de façon normale jusqu'à 3 jours cependant chez les mutants elles s'atrophient ensuite progressivement. De façon générale, à l'exception des contractions tétaniques, les embryons homozygotes mutants présentent un phénotype sauvage jusqu'à environ 2 jours où les muscles commencent à dégénérer.
Les résultats présentés à la Figure 6 montrent , en microscopie photonique, que la biréfringence des muscles est très diminuée chez les mutants ache-/- (Figure 6 B), par rapport aux poissons sauvages (Figure 6A). De plus, en microscopie électronique, on peut observer que, chez les mutants, les myofibrilles sont envahies par un sarcoplasme fortement vacuolisé et que l'enveloppe nucléaire est distendue et est fortement vacuolisée (Figure 6 D).
EXEMPLE 7 :
Inactivation du gène de l'AChE à l'aide d'ARN antisens
Les oligonucléotides de type morpholino sont commercialisés par la Société GENETOOLS LLC. Ils ont été resuspendus en solution et injectés à une concentration de 1 mM comme décrit par Nasevicius et EKKER (2001 ). La séquence de l'oligonucléotide antisens MO-ache est 5'-CTGAGGTCTTCATGGCTTCTTTTCA-3' (SEQ ID n°1 ) et celle de l'oligonucléotide témoin, MO-co est 5'-
CCATATCGGAGTATACGATCTCCAT-3' (SEQ ID N°2).
EXEMPLE 8
Procédés de criblage in vivo de l'activité non spécifique de composés inhibiteurs de l'AChE.
L'absence de BchE chez le poisson zèbre rend le modèle du mutant AChE tout à fait unique et particulièrement utile pour tester les effets des inhibiteurs des cholinestérases. Notamment il serait possible d'étudier le pouvoir tératogénique des composés organophosphorés et carbamates commerciaux utilisés comme insecticides et pesticides. Par cette approche, il est aussi possible de détecter d'autres cibles éventuelles des drogues anticholinestérasiques utilisées en thérapie humaine dans le traitement des maladies de neuro-dégénérescence du type de la maladie d'Alzheimer. Les tests de toxicité peuvent être effectués par simple bain des embryons et l'analyse du phénotype réalisé sous loupe binoculaire. Tout phénotype anormal induit dans les embryons AChE pourra être attribué à des effets non spécifiques des inhibiteurs puisque ces embryons n'ont pas d'activité AChE.
8.1 Mise en oeuyre d'un procédé de criblage selon l'invention avec l'ésérine
L'effet de l'ésérine sur les embryons d'une ponte de parents hétérozygotes mutants a été testé . A une concentration de 10"3 M, tous les embryons présentent le même phénotype : ils sont totalement immobiles et meurent à 4-5 jours de développement. Ce résultat montre que les effets de l'ésérine ne sont pas restreints à l'inhibition de l'AChE dans les embryons . Par exemple, in vitro, l'ésérine est capable de se lier au récepteur de l'acétylcholine sur deux sites d'affinité distincte. La liaison de l'ésérine sur le site de haute affinité (50 μM) permet une activation du récepteur et l'ouverture du canal, alors que la fixation sur le site de faible affinité (Kd de l'ordre du mM) agit comme un bloquant en se fixant sur le récepteur activé par l'Ach (OKONJO et al., 1991 ). L'immobilité complète des embryons AChE -/- en présence de fortes concentrations d'ésérine est donc un effet non spécifique de l'inhibition de l'AChE, probablement par désensibilisation et inactivation du récepteur.
8.2 Mise en oeuyre d'un procédé de criblage selon l'invention avec le DFP.
Chez les embryons de poissons Danio rerio sauvages, le DFP induit de graves altérations dans le développement des somites. En revanche, chez les mutants AChE , aucune altération détectable dans le développement des somites n'a été observée. Ces résultats montrent que les effets délétères du DFP ne sont pas spécifiques de son action inhibitrice sur l'AChE et que les effets indésirables du DFP se produisent sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase.
Des tests d'intoxication chronique peuvent être effectués, de façon identique, sur des poissons adultes hétérozygotes qui possèdent deux fois moins d'activité AChE que les poissons sauvages. Chez les adultes l'étude détaillée des différents tissus pourra révéler les effets périphériques des inhibiteurs.
D'autres résultats ont été obtenus en utilisant les inhibiteurs galanthamine (10"3M), tacrine (10"5M) et edrophonium (10"2M).
D'autres résultats ont été obtenus avec les inhibiteurs d'AchE ésérine, tacrine, edrophonium et galanthine, en observant la biréfringence des embryons traités par ces inhibiteurs sans loupe à lumière polarisée, aux temps 48h et 72h après traitement. Avec l'ésérine et la tacrine, on observe une altération du muscle de l'embryon moindre que celle observée chez le mutant -/-. Ces résultats montrent que ces deux inhibiteurs agissent aussi sur d'autres cibles cellulaires que l'AchE, car on ne reproduit pas les effets délétères provoqués par le seul blocage de l'AchE. En revanche, avec les inhibiteurs d'AchE edrophonium et galanthine, les embryons +/+ traités possèdent le même phénotype que les embryons -/-, ce qui signifie que ces deux inhibiteurs n'interagissent vraisemblablement pas avec d'autres cibles cellulaires que l'AchE. Ces résultats sont en accord avec les activités de la tacrine observées par Canti étal (Canti C, Bodas E., Marsal J., Solsona C, Tacrine and physostigmine block nicotinic receptors in Xenopus oocytes injected with Torpédo electroplaque membranes, Eur. J. Pharmacol 1998 Dec.18 363 (2-3) : 197-202).
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel au moins une copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, dans un procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les composés inhibiteurs sont des composés pesticides ou insecticides.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les composés inhibiteurs sont des composés organophosphorés ou des composés possédant au moins un groupement carbamate.
5. Procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase ont été inactivées, avec le composé inhibiteur à tester ; b) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec les caractéristiques de développement d'un embryon témoin identique, qui n'a pas été mis en présence du composé inhibiteur ;
6. Procédé de criblage in vivo de l'activité biologique d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une copie du gène codant acetylcholinesterase a été inactivée, avec le composé inhibiteur à tester ; b) mettre en contact un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont les deux copies du gène codant acetylcholinesterase sont fonctionnelles avec le composé inhibiteur à tester. c) comparer les caractéristiques de développement de l'embryon de l'étape a) avec celles de l'embryon de l'étape b).
7. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 6, caractérisé en ce que les caractéristiques de développement incluent le degré de mobilité, le développement des somites, les battements du coeur, la circulation du sang, la morphologie des cellules sanguines, le développement des nageoires, la forme de la tête, la taile des yeux, le développement de la mâchoire et du squelette pharyngé, l'ouverture de la bouche (observation de la structure des arches branchiales), la formation de la vessie natatoir, la pigmentation en particulier au niveau des cellules pigmentaires dérivées des crêtes neurales, le développement du système nerveux central et du système nerveux périphérique, le développement du cerveau postérieur, en paticulier la fermeture du tube neural, et en général tous les problèmes de différenciation des structures du système nerveux central et du système nerveux périphérique, ainsi que les caractéristiques du développement musculaire tel que le développement des somites, notamment des somites terminaux de la queue.
8. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée à des intervalles de temps prédéterminés, à partir de l'instant de fécondation de l'oeuf.
9. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la détermination des caractéristiques de développement de l'embryon est réalisée jusqu'au temps 48 heures suivant l'instant de fécondation de l'oeuf.
10. Procédé de criblage in vivo de l'effet non spécifique de surdosage d'un composé inhibiteur de l'acétylcholinestérase, sur une ou plusieurs cibles cellulaires autres que l'acétylcholinestérase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un poisson adulte de l'espèce Danio rerio, dans le génome duquel une seule copie du gène codant l'acétylcholinestérase a été inactivée, avec le composé inhibiteur a tester ; b) comparer les caractéristiques du poisson traité conformément à l'étape a) avec les caractéristiques d'un poisson adulte de l'espèce
Danio rerio, dans le génome duquel les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles et qui a été mis en contact avec le composé inhibiteur.
11. Procédé de criblage selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que les caractéristiques de développement de l'embryon ou les caractéristiques du poisson adulte incluent la détection de l'expression ou du niveau d'expression de gènes d'intérêt.
12. Procédé d'obtention d'un poisson de l'espèce Danio rerio, dans lequel au moins une copie du gène codant acetylcholinesterase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact des poissons mâles de l'espèce Danio rerio, dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, avec un composé mutagene, de préférence l'éthyl- nitroso-urée ; b) croiser les poissons mâles obtenus à l'étape a) avec un poisson femelle Danio rerio sauvage dont les deux copies du gène codant l'acétylcholinestérase sont fonctionnelles, afin dobtenir des descendants de génération F1 ; c) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F1 afin d'obtenir des descendants de la génération F2 ; d) croiser entre eux des mâles et des femelles de la génération F2 afin d'obtenir des descendants de la génération F3 dont certains d'entre eux possèdent les deux copies du gène codant l'acétylcholiestérase inactivées.
13. Procédé d'obtention d'un embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant acetylcholinesterase est inactivée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) croiser entre eux un poisson mâle et un poisson femelle obtenus par le procédé selon la revendication 12 ; b) récupérer les oeufs fécondés.
14. Poisson de l'espèce Danio rerio dont une copie du gène codant l'acteylcholineterase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 12.
15. Embryon de poisson de l'espèce Danio rerio dont au moins une copie du gène codant acetylcholinesterase est inactivée, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 13.
16. Embryon selon la revendication 15, caractérisé en ce que les deux copies du gène codant acetylcholinesterase sont inactivées.
17. Poisson selon la revendication 14 ou embryon selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'une copie du gène codant acetylcholinesterase ou les deux copies de ce gène comporte la substitution d'un nucléotide résultant en la production d'une acetylcholinesterase catalytiquement inactive dont le résidu d'acide aminé Serine en position 226 de la séquence de l'enzyme est remplacé par un résidu d'acide aminé Asparagine.
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